ES2328304T3 - Gen implicado en el cadasil, metodo de diagnostico y aplicacion terapeutica. - Google Patents
Gen implicado en el cadasil, metodo de diagnostico y aplicacion terapeutica. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL GEN NOTCH Y A LA PROTEINA CORRESPONDIENTE QUE ESTAN IMPLICADOS EN EL CADASIL. LA INVENCION SE REFIERE PARTICULARMENTE A LOS PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACION DE LAS MUTACIONES EN ESTE GEN, ESTANDO ESTAS ULTIMAS ASOCIADAS A RIESGOS DE BROTE DE CADASIL. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A MODELOS Y PRODUCTOS QUE PERMITEN EL TRATAMIENTO DEL CADASIL Y DE LAS ENFERMEDADES RELACIONADAS.
Description
Gen implicado en el CADASIL, método de
diagnóstico y aplicación terapéutica.
La presente invención se refiere a la
demostración de la implicación de la proteína Notch3 en el CADASIL
permitiendo así la realización, en particular, de un diagnóstico de
una predisposición a ciertos trastornos neurológicos, en particular
al CADASIL, y de modelos que permiten ensayar las terapias posibles
para este tipo de patología.
El CADASIL o "Cerebral Autosomal Dominant
Arteriopathy with Subcortical Infarts and Leukoencephalopathy" se
ha identificado recientemente como una causa de ataques cerebrales
y de demencia cuyas características principales incluyen unos
infartos subcorticales recidivantes, unas migrañas y una demencia
vascular, en asociación con unas imágenes en IRM que objetivan unas
anomalías difusas de la sustancia blanca cerebral.
El examen anatomopatológico muestra múltiples
pequeños infartos cerebrales profundos, una leucoencefalopatía y
una angiopatía no aterosclerosa y no amiloide que implica
esencialmente a las pequeñas arterias cerebrales.
Tal como su nombre indica, CADASIL es una
enfermedad hereditaria de carácter autosómico dominante. Para más
información, se encontrará en particular un estudio del espectro
clínico de CADASIL en H. Chabriat et al., The Lancet, vol.
346, 7 de octubre de 1995.
Esta enfermedad altamente incapacitante y muy
frecuentemente letal probablemente no ha estado hasta ahora
diagnosticada ampliamente como tal; el estudio de un centenar de
familias desde 1993 muestra que la mayor parte del tiempo se daban
unos diagnósticos erróneos al paciente (esclerosis en placas,
enfermedad de Alzheimer, etc.). Los estudios actuales tenderían a
demostrar que se trata de una afección mucho más extendida de lo
que se imaginaba durante su demostración.
Los estudios que se realizan actualmente tienen
como objeto la puesta a punto de herramientas de diagnóstico de la
enfermedad y en particular, gracias a los modelos y a las
posibilidades ofrecidas por la ingeniería genética, la puesta a
punto de una terapia eventualmente de sustitución.
El gen implicado en CADASIL se ha localizado en
el cromosoma 19, y una localización más fina se menciona en
particular en dos solicitudes de patente de los mismos
inventores.
Se ha podido identificar ahora el gen implicado
en el CADASIL, que es el gen Notch3.
La demostración de la implicación de
Notch3 en el CADASIL se ha podido realizar teniendo en cuenta
unos marcos anteriores que habían sido mencionados, en particular
en las solicitudes de patente en cuestión, el primer intervalo
(tamaño 14 cM) era D19S221-D19S215 (primera
solicitud de patente), y después el segundo intervalo (tamaño 2 cM)
era D19S226-D19S199 (segunda solicitud de patente).
La región de interés se ha clonado en un "contig" (secuencia
nucleotídica continua) de BAC y de YAC, y su tamaño se ha estimado
en 800 kb. El análisis de esta región con la ayuda de enzimas de
restricción ha mostrado una densidad muy alta de los sitios Notl,
Eagl y Sacll, lo que sugiere la presencia de numerosos genes. Entre
los numerosos transcritos identificados por selección de ADNc, un
transcrito ha mostrado una homología muy alta con una secuencia
situada en el extremo 5' que codifica el gen Notch3 de
ratón. Como otros elementos de análisis parecían corroborar esta
presencia del gen Notch3 en esta situación, éste ha sido
considerado como un buen gen candidato por su posición en el
intervalo de interés.
Los estudios comparativos efectuados sobre las
familias CADASIL conocidas en comparación con unos sujetos sanos
han permitido identificar unas mutaciones sobre este gen
Notch3 en un gran número de sujetos CADASIL, mientras que
dichas mutaciones no se observaban en los sujetos sanos analizados.
Por último, como la cosegregación de estas mutaciones con el
fenotipo enfermo ha podido ser demostrada en el seno de las familias
afectadas, la implicación del gen Notch3 en CADASIL
resultaba indudable.
Todas las mutaciones puntuales observadas
conducen a la creación o a la desaparición de una cisteína en uno
de los dominios EGF de esta proteína. Una gran parte de estas
mutaciones se agrupan en los seis primeros EGF. La agrupación de
las mutaciones reviste una cierta importancia en términos de
diagnóstico en particular para la búsqueda "secuencial" de
estas mutaciones.
Por otro lado, todas estas mutaciones conducen a
la presencia de un número impar de cisteínas en uno de los EGF (o
bien siete, o bien cinco cisteínas) en lugar de las seis cisteínas
presentes normalmente. Estas mutaciones podrían así resultar en la
formación de puentes disulfuros aberrantes o bien en intra-, o bien
en intermolecular (y en este caso a la formación de homo o de
heterodímeros).
Es muy conocido el papel de una dimerización,
normal o anormal, en el funcionamiento de receptores, en particular
su activación.
Los genes Notch son conocidos desde hace
mucho tiempo, en particular en la drosofila, y es conocido su
equivalente en los vertebrados, en particular en el ratón. Su nombre
inglés "notch", es decir "muesca", proviene del hecho de
que ciertas mutaciones de este gen producen una muesca en las alas
de las moscas. El artículo de Spyros
Artavanis-Tskanas et al., Science 268, 225
(1995) así como las referencias que contiene indican que las
proteínas Notch están esencialmente implicadas, en particular en la
drosofila, en la especificación del destino celular durante el
desarrollo y, aunque la proteína esté todavía expresada en los
organismos adultos, sus funciones en estos últimos siguen siendo
desconocidas. Más precisamente, aparece que el producto del gen
Notch3, a continuación denominado "proteína Notch3", es
un receptor celular que manda una cascada de eventos celulares y
cuya mutación conduce necesariamente a unos desajustes más o menos
importantes en esta cascada, lo que puede conducir a numerosos
trastornos neurológicos diferentes, en particular
cerebro-vasculares.
Conviene recordar que, si en la continuación de
la descripción se hace referencia más particularmente a los
trastornos neurológicos, en particular a los trastornos de tipo
cerebrovascular y más particularmente al CADASIL, es probable,
teniendo en cuenta la función de receptor celular del producto del
gen Notch3, que una alteración de este receptor pueda
conducir a una desorganización de su interacción con diversos
ligandos pero también con las diferentes parejas implicadas en la
cascada de transducción. Se debe tener en cuenta, además, el hecho
de que la proteína Notch3 podría tener otras funciones que, de
momento, no han sido demostradas. En estas condiciones, es muy
probable que unas afecciones que presentan unas analogías con el
CADASIL puedan estar implicadas asimismo en casos de mutación en el
gen Notch3.
Entre las enfermedades en cuestión, se deben
citar las formas esporádicas de CADASIL, es decir, que intervienen
sin antecedentes familiares, pero como consecuencia de una
neomutación. Notch3 podría, por otro lado, estar implicado
en otras afecciones que se pueden clasificar en diferentes
grupos:
Se ha mostrado que por lo menos uno de los genes
implicados en la migraña hemipléjica familiar (MHF), forma
autosómica dominante de migraña con aura, estaba localizado en la
misma región del cromosoma 19 que el gen de CADASIL. Se debe
observar que más de 30% de los pacientes que padecen CADASIL,
afección caracterizada por la aparición repetida de accidentes
vasculares cerebrales y de una demencia vascular, padecían migraña
con aura. Ahora bien, esta última se observa sólo en
aproximadamente 5% de la población; es esta observación lo que ha
llevado a ensayar la implicación del gen de CADASIL en los
mecanismos de esta afección. La implicación de este gen en una
forma de migraña con o sin aura presentaría un interés diagnóstico y
terapéutico considerable debido a la frecuencia de la migraña con
aura y de la migraña sin aura en la población general.
Este grupo corresponde a un número muy
importante de pacientes en los servicios neurológicos, de siquiatría
y de medicina interna y es muy razonable pensar que Notch3 o
una pareja de esta vía de señalización pueda estar implicado en
estas afecciones por las razones indicadas anteriormente.
La situación es la misma que para la MHF. Se ha
localizado un gen responsable de esta afección en la misma región
del cromosoma 19 y Notch3 podría estar implicado en esta
afección.
Por otro lado, las mutaciones de este gen son
responsables de anomalías de desarrollo muy conocidas en otras
especies, así como de patologías de tipo neoplásico. Unos síndromes
de malformación y/o neoplásicos en los que se demostraría una
remodelación de la región que contiene este gen serían unos
candidatos principales para la búsqueda de una implicación de este
gen en su fisiopatología.
Estos trastornos se pueden reunir bajo el nombre
de "trastornos relacionados con el receptor Notch3".
En algunos casos, podría tratarse de trastornos
que tienen un origen multigénico pero en los que las modificaciones
de Notch3 contribuirían a la aparición de la patología o a su
agravación.
La presente invención describe una secuencia
nucleotídica aislada, caracterizada porque se selecciona de
entre:
- a)
- las secuencias que codifican para la proteína Notch3 humana y sus variantes alélicas,
- b)
- las secuencias que codifican para un fragmento de estas proteínas y que tienen por lo menos 10 bases,
- c)
- las secuencias genómicas Notch3 humano y sus alelos,
- d)
- las secuencias que presentan por lo menos 80%, preferentemente por lo menos 90%, de homología con las secuencias (a) y (c),
- e)
- los fragmentos de las secuencias (c) o (d) que tienen por lo menos 10 bases,
- f)
- las secuencias que se hibridan con una secuencia de (a) a (e).
Se debe entender que la presente invención no se
refiere a las secuencias nucleotídicas genómicas en su entorno
cromosómico natural, es decir, en el estado natural, sino que se
trata de secuencias que han sido aisladas, es decir que han sido
extraídas directa o indirectamente, por ejemplo mediante copia
(ADNc), habiendo sido su entorno por lo menos parcialmente
modificado.
Así, puede tratarse tanto de ADNc como de ADN
genómico parcialmente modificado o contenido en unas secuencias por
lo menos parcialmente diferentes de las secuencias que los contienen
naturalmente.
Estas secuencias se podrán calificar asimismo de
"no naturales".
Mediante la expresión "secuencia nucleica"
se entiende un fragmento de ADN y/o de ARN natural aislado, o
sintético, que designa una cadena precisa de nucleótidos,
modificados o no, que permite definir un fragmento, un segmento o
una región de un ácido nucleico.
Mediante la expresión "variante alélica" de
la proteína, se entiende designar el conjunto de las proteínas
mutadas y de los polimorfismos que pueden existir en el ser humano,
obtenidos en particular mediante truncamiento, sustitución,
deleción o adición de residuos de aminoácidos, así como las
variantes artificiales.
Los fragmentos de secuencias nucleicas pueden
codificar en particular para unos dominios de la proteína o bien
ser usados como sonda o como cebador en unos procedimientos de
detección o de identificación o de amplificación. Estos fragmentos
presentan un tamaño mínimo de 10 bases, y se preferirán unos
fragmentos de 20 bases, y preferentemente de 30 bases.
La homología es únicamente de tipo estático y
significa que las secuencias presentan como mínimo 80%, y
preferentemente 90%, de nucleótidos en común.
Las condiciones de hibridación deben permitir,
según la invención, asegurar por lo menos 95% de homología.
La figura 1 representa las secuencias de Notch3
tal como han sido secuenciadas sobre un genoma normal.
Las secuencias se identifican mediante unas
referencias que permiten situarlas unas con relación a otras gracias
a la figura 3.
En lo que se refiere a las observaciones
particulares sobre (a), (b), (c) y (d), se aplican las observaciones
anteriores.
La invención describe asimismo unos fragmentos
de estas secuencias, en particular unas secuencias que codifican
para unos polipéptidos que han guardado la totalidad o parte de la
actividad de la proteína Notch3.
Entre las secuencias particularmente
interesantes, se deben citar las que codifican para unos dominios o
unas combinaciones de dominios de la proteína Notch3, es decir, las
secuencias:
- \bullet
- repeticiones "EGF"
- \bullet
- repeticiones "Notch/lin 12"
- \bullet
- repeticiones "cdc10/SW16"
o la secuencia transmembranaria.
Entre las secuencias interesantes, figura en
particular la secuencia codificada por el segundo transcrito que se
describirá a continuación, teniendo dicho transcrito un tamaño
estimado entre 1,3 y 2,4 kb.
Estas secuencias se pueden identificar haciendo
referencia en particular a la figura 2 que esquematiza la
organización de Notch3.
Estas secuencias parciales se pueden usar para
numerosas aplicaciones, tal como se describirá a continuación, en
particular para efectuar unas construcciones proteicas de tipo Notch
o de tipos diferentes, pero asimismo para realizar, por ejemplo,
una proteínas de tipo Notch truncadas que servirán de cebo al
ligando de Notch3 o de agonista de la proteína.
Se puede prever asimismo usar estas secuencias
proteicas por sus efectos propios, y así los dominios EGF están
presentes en otras proteínas, en particular de otros receptores; se
podrá, por ejemplo, hacer referencia a Iain D. Campbell, Current
Biology, 3: 385-392 (1993) para otras aplicaciones
de las secuencias EGF en cuestión.
La presente invención se refiere a una secuencia
nucleotídica seleccionada de entre:
- a)
- las secuencias que codifican para un polipéptido que comprende los aminoácidos según la secuencia de la figura 1,
- b)
- la secuencia nucleica del ADNc representado en la figura 1 que codifica para el polipéptido Notch3,
caracterizada porque las secuencias tal como se
definen en a) o en b) comprenden por lo menos una mutación que
suprime una cisteína o, por el contrario, que la hace aparecer sobre
dicho polipéptido Notch3 en uno de estos dominios EGF.
La presente invención describe asimismo las
mutaciones que pueden intervenir en las secuencias promotoras y/o
reguladoras del gen Notch3 humano, las cuales pueden tener
unos efectos sobre la expresión de la proteína.
Unos ejemplos de dichas mutaciones se
describirán en la continuación de la descripción.
De manera general, la presente invención se
refiere tanto a la proteína Notch3 normal como a las proteínas
Notch3 mutadas, así como a sus fragmentos y a las secuencias de ADN
y de ARN correspondientes, es decir, los alelos.
Se debe observar que el estudio con
transferencia Northern de la expresión de este gen en unos tejidos
humanos muestra dos transcritos. Uno de un tamaño estimado en
7,5-9,5 kb está presente en todos los tejidos
ensayados; el otro, cuyo tamaño está comprendido entre 1,3 y 2,4
kb, se detecta sólo en ciertas partes del sistema nervioso central.
La presente invención se refiere a estos dos transcritos.
Entre los fragmentos nucleotídicos, se deben
citar las secuencias genómicas intrónicas del gen Notch3 y
más particularmente las secuencias de unión entre los intrones y los
exones, en particular tal como se han representado en la tabla A y,
por último, la presente invención se refiere al conjunto de los
cebadores que se pueden deducir de las secuencias nucleotídicas y
que pueden permitir demostrarlas usando un método de amplificación
tal como el método PCR, en particular los que figuran en la tabla
B.
La presente invención describe asimismo las
secuencias nucleotídicas que pueden comprender unos nucleótidos no
naturales, en particular unos nucleótidos azufrados por ejemplo, o
de estructura \alpha o \beta.
Por último, la presente invención describe tanto
las secuencias ADN como ARN, así como los ADN de doble hebra
correspondientes.
Tal como se describirá a continuación, para
ciertas aplicaciones puede ser necesario prever unas construcciones
mixtas, proteína/ADN/compuesto químico, en particular el uso de
agentes de intercalación por ejemplo; se debe entender que dichos
compuestos están cubiertos por la patente en tanto que comprenden
una secuencia según la invención.
La presente invención describe asimismo las
proteínas polipeptídicas o peptídicas que corresponden a las
secuencias mencionadas anteriormente, en forma no natural, es
decir, que no están consideradas en su entorno natural, sino que se
obtienen mediante purificación a partir de fuentes naturales, o bien
se obtienen mediante recombinación genética, tal como se describirá
a continuación.
La invención describe asimismo los mismos
polipéptidos o proteínas obtenidos mediante síntesis química y que
pueden comprender unos aminoácidos no naturales.
La presente invención describe las proteínas
recombinantes así obtenidas tanto en forma glicosilada como no
glicosilada y que pueden presentar o no la estructura terciaria
natural.
En particular, la presente invención describe
los fragmentos de Notch3 que presentan una actividad similar al
receptor total, en particular la o las partes solubles de dicho
receptor que corresponden en particular al dominio extracelular.
Éstos se podrán usar en particular como cebo en una terapia, tal
como se describirá a continuación.
La presente invención se refiere asimismo a unos
vectores de clonación y de expresión que comprenden una secuencia
nucleotídica según la invención.
Estos vectores de clonación y de expresión
podrán comprender unos elementos que aseguran la expresión de la
secuencia en una célula hospedante, en particular unas secuencias
promotoras y unas secuencias de regulación eficaces en dicha célula
(véase la referencia infra).
El vector en cuestión puede ser de replicación
autónoma o bien estar destinado a asegurar la integración de la
secuencia en el seno de los cromosomas de la célula hospedante.
En el caso de sistemas de replicación autónoma,
en función de la célula hospedante, procariota o eucariota, se
usarán preferentemente unos sistemas de tipo plasmídico o unos
sistemas víricos, pudiendo ser los virus vectores en particular
unos adenovirus, unos poxvirus o unos virus herpéticos. El experto
en la materia conoce las tecnologías que se pueden utilizar para
cada uno de estos virus (véase la referencia infra).
Cuando se desee la integración de la secuencia
en los cromosomas de la célula hospedante, se necesitará prever en
ambas partes de la secuencia nucleotídica a integrar una o más
secuencias que proceden de la célula hospedante con el fin de
asegurar la recombinación. Se trata en este caso asimismo de
procedimientos que se describen ampliamente en la técnica anterior.
Se podrán usar por ejemplo unos sistemas de tipo plasmídico o
vírico; dichos virus serán, por ejemplo, los retrovirus o los AAV
(Associations Adenovirus Virus).
La invención se refiere asimismo a las células
procariotas o eucariotas transformadas por un vector según la
invención con el fin de asegurar la expresión de una proteína
Notch3.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
presente invención se refiere asimismo a las proteínas, péptidos o
polipéptidos obtenidos mediante el cultivo de las células de la
invención así transformadas y la recuperación de la proteína
expresada, pudiendo dicha recuperación ser efectuada de manera
intracelular o bien de manera extracelular en el medio de cultivo
cuando el vector ha sido concebido para asegurar la excreción de la
proteína, por ejemplo a través de una secuencia "líder",
estando la proteína en forma de una pre-proteína o
prepro-proteína. Las construcciones que permiten la
secreción de las proteínas son conocidas, tanto para unos sistemas
procariotas como unos sistemas eucario-
tas.
tas.
Entre las células que se pueden utilizar para la
producción de estas proteínas, se deben citar, evidentemente, las
células bacterianas, pero también las células de levadura, al igual
que las células animales, en particular los cultivos de células de
mamífero pero también las células de insectos en las que se pueden
usar unos procedimientos que usan unos baculovirus por ejemplo
(véase la referencia infra).
Las células así obtenidas pueden permitir
preparar unas proteínas naturales o mutadas Notch3, pero también
unos fragmentos de estas proteínas, en particular unos polipéptidos
que pueden corresponder a los diferentes dominios en cuestión.
Pero las células transformadas tal como se han
descrito anteriormente podrán asimismo ser usadas a título de
modelo con el fin de estudiar las interacciones entre el gen Notch y
sus diferentes ligandos, así como su influencia sobre los productos
corriente abajo del receptor, pero sobre todo se podrán usar en una
aplicación para la selección de productos que interactúan con el
receptor Notch3, natural o mutado, a título de agonista o de
antagonista de este receptor.
Este tipo de modelo celular se puede realizar
usando unas técnicas de ingeniería genética. Se trata, según el
tipo de células que se desea usar, de clonar el gen en cuestión en
su forma normal o en su forma mutada en un vector de expresión, ya
se trate de un vector de replicación autónoma o de un vector de
integración, comprendiendo dicho vector el conjunto de los
elementos que permiten la expresión del gen en la célula en
cuestión, o presentando ésta el conjunto de los elementos que
permiten la expresión de la secuencia en cuestión.
Se obtienen así unas células eucariotas o
procariotas que expresan la o las proteínas Notch3 que, teniendo en
cuenta sus características, se situará como una proteína
transmembranaria cuya estructura fina se describirá en la
continuación de la descripción, pudiendo dichas células constituir
entonces unos modelos que permiten ensayar al mismo tiempo las
interacciones de diferentes ligandos con el producto de la proteína
Notch3 o ensayar unos productos químicos de síntesis que pueden
interactuar con el producto del gen Notch3 añadiéndolos al
medio de cultivo de dichas células.
Se debe observar en particular que los productos
en cuestión podrán ser unos agentes con actividad tanto antagonista
como agonista.
El uso de modelos celulares con vistas a ensayar
unos compuestos farmacéuticos es muy conocido, y no será necesario
describir con mayor detalle este tipo de modelo.
Otra aplicación potencial de la caracterización
de este gen es la posibilidad de identificar unos ligandos
potenciales de esta proteína, o bien porque tienen una secuencia
conservada con Notch3 humano, o bien porque interactúan con Notch3
(métodos de afinidad) o unas parejas de esta vía de
señalización.
Estos modelos pueden ser de tipo in
vitro, por ejemplo unos cultivos de células humanas, o bien en
cultivo normal, o bien eventualmente en forma de órgano aislado,
como, por ejemplo, ciertos tipos de vasos que se podrán transformar
con el fin de que expresen los fenotipos buscados.
La presente invención describe asimismo unos
organismos tales como los animales, en particular unos ratones, que
expresan el fenotipo correspondiente a Notch3 normal o mutado de
origen humano. En este caso también, estos animales se podrán usar
como animales modelos para ensayar la eficacia de ciertos productos
farmacéuticos.
La presente invención se refiere asimismo a los
productos obtenidos mediante la utilización de los modelos
celulares de la invención.
Es posible obtener, en función del tipo de
interacción determinada, unas composiciones terapéuticas
caracterizadas porque comprenden a título de principio activo un
compuesto con actividad pro-Notch3; podrá tratarse
en particular de la totalidad o parte de un polipéptido tal como se
ha descrito anteriormente o bien de un vector de expresión de estos
mismos polipéptidos, o también de compuestos químicos o biológicos
que tienen una actividad pro-Notch3, una actividad
de tipo Notch3 o que inducen la producción de Notch3 natural.
Será posible asimismo demostrar unas
composiciones terapéuticas en las que el principio activo tendrá una
acción anti-Notch3.
Podrá tratarse, en este caso también, de
proteínas modificadas descritas anteriormente que podrán desempeñar
la función de cebo, o bien de anticuerpos
anti-Notch3, en particular cuando estos anticuerpos
reconozcan los receptores mutados y en estas condiciones podrán
bloquear la actividad del receptor normal.
Podrá tratarse asimismo de productos químicos
que tienen una actividad anti-Notch3, o bien unos
antagonistas de Notch3.
En ciertos casos, el uso de algunos de los
dominios de Notch3 puede permitir un enfoque terapéutico que bloquea
la actividad del receptor Notch3 cuando éste está mutado usando
unos receptores solubles que servirán de cebo a los ligandos
naturales; en otros casos, será posible, expresando la totalidad del
receptor, asegurar una terapia de sustitución usando, o bien
directamente las proteínas o sus fragmentos, o bien expresando
directamente la proteína, en particular a través de la terapia
génica y usando los vectores que han sido descritos
anteriormente.
En el marco de la terapia génica, es posible
asimismo prever el uso de las secuencias de los genes o de los ADNc
descritos anteriormente "desnudos"; esta técnica ha sido
desarrollada en particular por la compañía Vical, y ha mostrado que
era posible, en estas condiciones, expresar la proteína en ciertos
tejidos sin recurrir al soporte de un vector vírico en
particular.
Siempre en el marco de la terapia génica, es
posible asimismo prever el uso de células transformadas ex
vivo, las cuales podrán ser reimplantadas a continuación, o bien
tal cual, o bien en el seno de sistemas de tipo organoide, tal como
se conoce asimismo en el estado de la técnica. Se puede prever
asimismo el uso de un agente que facilita el apuntado de tipo
celular determinado, la penetración en las células o el transporte
hacia el núcleo.
Entre los numerosos compuestos farmacéuticos que
se pueden utilizar, se deben citar más particularmente, además de
los ligandos del producto de Notch3, las secuencias sentido o
anti-sentido que interactúan con el gen
Notch3 normal o mutado, o bien que interactúan sobre la
regulación o la expresión de estos genes, pudiendo dichos productos
interactuar asimismo corriente abajo de los productos de expresión
inducidos por los receptores Notch3. Se deben citar además las
secuencias solubles que corresponden a Notch3.
Se deben mencionar asimismo los anticuerpos
monoclonales que bloquean los receptores Notch3, en particular los
receptores Notch3 mutados, y/o que bloquean los ligandos
correspondientes y/o los productos inducidos por dichos receptores
que pueden por lo tanto tener unas actividades pro o anti.
Conviene recordar que los anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el receptor Notch3 pueden, según el
epítopo reconocido, tener una actividad pro o
anti-Notch3, y ser utilizados en unas composiciones
terapéuticas.
Por último, la presente invención se refiere más
particularmente, tal como se ha mencionado anteriormente, a unos
métodos de diagnóstico de una predisposición a unas afecciones
neurológicas de tipo CADASIL, caracterizados porque se determina a
partir de una muestra biológica de dicho paciente la presencia de
una mutación que suprime una cisteína o que hace aparecer una
cisteína en uno de los dominios EGF del polipéptido Notch3 cuya
secuencia está representada en la figura 1, mediante el análisis de
la totalidad o parte de una secuencia nucleica que corresponde a
dicho gen, siendo la presencia de dicha por lo menos una mutación
indicativa de una predisposición de dicho paciente a dichas
afecciones.
Otros métodos de diagnóstico pueden permitir
caracterizar mediante anticuerpos el depósito previsto en la
membrana basal de las células musculares lisas vasculares, depósito
que podría estar constituido por la proteína Notch3 en sí o por uno
de sus productos de escisión.
Entre las mutaciones buscadas, se deben citar
más particularmente las mutaciones referenciadas en la tabla C y en
la figura 3.
Las secuencias de ácidos nucleicos podrán ser
tanto ADN genómico, como ADNc o ARNm.
Tal como se ha mencionado anteriormente, entre
los trastornos neurológicos que se pueden demostrar, se entienden
más particularmente los trastornos de tipo
cerebro-vascular, y en particular el CADASIL, pero
se ha proporcionado anteriormente la lista de ciertos trastornos
que podrían estar relacionados con una anomalía del receptor
Notch3; entre estas afecciones se debe citar muy particularmente la
implicación potencial de Notch3 en las migrañas con o sin aura y
las demencias de etiología desconocida actualmente.
Las herramientas basadas en la presente
invención pueden permitir un diagnóstico positivo y diferencial en
un enfermo considerado aisladamente o bien un diagnóstico
presintomático en un sujeto de riesgo (antecedentes familiares por
ejemplo); es posible asimismo prever un diagnóstico
ante-natal.
Además, la demostración de una mutación
específica puede permitir un diagnóstico evolutivo.
Los métodos que permiten demostrar la mutación
en un gen con relación al gen natural son, evidentemente, muy
numerosos, y se pueden realizar mediante el estudio del ADN
genómico, del ADNc y/o de la proteína. Se pueden dividir
esencialmente en dos grandes categorías: el primer tipo de método es
aquél en el que la presencia de una mutación se detecta mediante la
comparación de la secuencia mutada con la secuencia correspondiente
natural no mutada, y el segundo tipo, en el que la presencia de la
mutación se detecta de manera indirecta, por ejemplo, mediante la
demostración de desapareamientos debidos a la presencia de la
mutación.
En ambos casos, se preferirán en general los
métodos en los que la totalidad o parte de la secuencia que
corresponde a Notch3 está amplificada previamente a la demostración
de la mutación, pudiendo estos métodos de amplificación realizarse
mediante unos métodos denominados PCR (véase la referencia
infra) o de tipo PCR. Por "de tipo PCR" se entenderá
designar todos los métodos que usan unas reproducciones directas o
indirectas de las secuencias de ácidos nucleicos, o bien en los que
los sistemas de marcación han sido amplificados; estas técnicas son
evidentemente conocidas, y en general se trata de la amplificación
del ADN por la polimerasa; cuando la muestra de origen es un ARN,
conviene efectuar previamente una transcripción inversa; existen
actualmente numerosos procedimientos que permiten esta
amplificación, por ejemplo los métodos denominados NASBA, TMA bien
conocidos por el experto en la materia.
La tabla B proporciona las secuencias de los
cebadores PCR que permiten amplificar los exones así como las
temperaturas de las reacciones PCR.
Una metodología general de amplificación de las
secuencias se describirá en los ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de la secuenciación directa de la
mutación, se pueden usar diferentes métodos. Se citarán brevemente
las técnicas:
- 1)
- búsqueda de "Single Strand Conformation Polymorphisms" (SSCP) (véase la referencia infra) o electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE).
- 2)
- los métodos basados en una escisión de las regiones desapareadas (escisión enzimática mediante la S1 nucleasa, escisión química mediante diferentes compuestos tales como la piperidina o el tetraóxido de osmio, etc.
- 3)
- demostración de heterodúplex en electroforesis,
- 4)
- métodos basados en el uso en hibridación de sondas oligonucleotídicas específicas de alelos (ASO).
Se pueden usar otros métodos bien conocidos y
basados en las técnicas de hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros métodos bien conocidos y basados en las
técnicas de hibridación con la ayuda de sondas genómicas, de sondas
ADNc, de sondas oligonucleotídicas, de ribosondas, de sondas
denominadas de captura o de sondas denominadas de detección, se
pueden usar para la búsqueda de este tipo de remodelaciones.
Otro enfoque diagnostico que se puede utilizar
cuando se dispone del ADN de varios sujetos de una misma familia se
basa en el método de análisis de unión que permite calcular el
riesgo de que un sujeto que pertenece a una familia relacionada sea
portador o no del gen enfermo. Este análisis se puede realizar con
unos marcadores polimorfos situados en la proximidad inmediata del
gen, o unos marcadores polimorfos intragénicos.
Es importante recordar que, en las familias
CADASIL, la existencia de mutaciones en el gen Notch3
corresponde a unas mutaciones que cambian unos aminoácidos
esenciales por la función de la proteína para la cual codifica.
Por otro lado, en los ejemplos, se indican las
situaciones de las mutaciones actualmente detectadas, pero es
posible que existan otras mutaciones en el gen Notch3 que
todavía no hayan sido demostradas pero que deben conducir a los
mismos tipos de riesgos en el plano patológico.
En cualquier caso, las proteínas Notch3 mutadas
pueden presentar una antigenicidad diferente de la de la proteína
natural.
Es posible por lo tanto realizar un diagnóstico
o un pronóstico de una susceptibilidad a trastornos neurológicos,
en particular cerebro-vasculares de tipo CADASIL, y
a trastornos relacionados con el receptor Notch3, demostrando el
producto del gen mutado de Notch3, pudiendo este tipo de detección
realizarse, por ejemplo, con la ayuda de anticuerpos monoclonales o
policlonales. En estas condiciones, es posible demostrar y dosificar
el producto anormal del gen Notch3 mediante unos métodos
bien conocidos, RIA o ELISA por ejemplo; siendo estas tecnologías
conocidas, no se describirán con mayor detalle en la continuación de
la descripción. Unos anticuerpos dirigidos contra la proteína
normal podrían asimismo ser útiles si el depósito presente en las
arterias de la piel correspondiera a la proteína Notch3 o a uno de
sus productos de escisión.
La presente invención se refiere asimismo a un
método de diagnóstico in vitro de CADASIL que usa los
anticuerpos monoclonales o policlonales marcados y que corresponden
a la totalidad o parte de las proteínas mutadas sobre unas muestras
biológicas.
Así, parece que las agrupaciones granulares
presentes en las basales de las células musculares lisas vasculares
se deben a una acumulación de la proteína anormal y la búsqueda de
esta proteína con la ayuda de anticuerpos o bien en unas biopsias,
o bien in vivo, presenta un interés diagnóstico.
Las mutaciones del gen Notch3 pueden ser
responsables de diferentes modificaciones del producto de este gen,
modificaciones que se pueden utilizar para un enfoque diagnóstico.
Brevemente, la proteína puede estar truncada, disminuida o ausente;
sus propiedades, en particular de antigenicidad pueden ser
modificadas. Todas estas modificaciones se pueden usar en el
enfoque diagnóstico, gracias a varios métodos bien conocidos basados
en el uso de anticuerpos mono o policlonales que reconocen la
proteína normal o unas variantes mutadas a partir del estudio de
extractos proteicos o de cortes de tejidos (por ejemplo biopsias de
piel), o de estudios realizados in vivo (formación de
imágenes con la ayuda de anticuerpos acoplados a una molécula
detectable en una imagen de tipo PET-scan,
etc.).
Los anticuerpos policlonales o monoclonales se
pueden obtener mediante la reacción inmunológica de un organismo
humano o animal con un agente inmunógeno constituido por una
proteína o por un polipéptido susceptible de ser obtenido a partir
de células procariotas o eucariotas transformadas por un vector tal
como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, el agente
inmunógeno está constituido por un polipéptido específico de la
forma mutada de la proteína Notch cuya secuencia se selecciona de
entre las secuencias polipeptídicas que comprenden por lo menos una
mutación seleccionada de entre las mutaciones que corresponden a la
figura 3 o a la tabla C.
La presente invención describe por último unas
composiciones terapéuticas que comprenden a título de principio
activo un compuesto con actividad pro-Notch3, en
particular tal como se ha descrito anteriormente, así como unas
composiciones terapéuticas que comprenden a título de principio
activo un compuesto con actividad anti-Notch3.
Otras características y ventajas de la presente
invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la
lectura de los ejemplos siguientes, haciendo referencia a los
dibujos adjuntos, en los que:
\bullet la figura 1 reproduce la secuencia de
ADNc de Notch3 humano así como la secuencia proteica
correspondiente,
\bullet la figura 2 representa la estructura
general del producto del gen Notch3 así como las mutaciones
que se han demostrado mediante la alineación de los clones de ADNc
humanos con Notch3 de ratón,
- A-
- gen Notch3 de ratón con sus 34 dominios EGF, 3 repeticiones Notch/Lin12 y 6 repeticiones cdc10, así como el dominio transmembranario,
- B-
- abajo, 8 de los ADNc humanos con las identificaciones que corresponden a la figura 1, y arriba la alineación de ciertas secuencias genómicas con el ADNc de por lo menos 29 exones,
- los orígenes de los diferentes fragmentos aparecen en la parte inferior de la figura 4;
- los diferentes clones están disponibles comercialmente o por medio de bancos:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\bullet la figura 3 esquematiza la situación y
la naturaleza de las mutaciones implicadas en el CADASIL;
\bullet la figura 4 representa un análisis
"Northern blot", conteniendo las transferencias Northern 2
\mug por línea de ADN poli (A+) humano, desde la izquierda hacia
la derecha:
- -
- de diferentes tejidos de cerebros,
- -
- de diferentes órganos de adultos,
- -
- de diferentes órganos de fetos;
se hibridan con p28-20, una
sonda de ADNc de 1,45 kb humano Notch3, se detecta un transcrito de
7,5 a 9,5 kb en todos los tejidos, tanto los adultos como los
fetales, con la excepción del hígado, estando el transcrito
débilmente expresado en el tejido de cerebro en el centro y a la
derecha;
por el contrario, a la izquierda se observan no
sólo unos transcritos de todos los tejidos, sino también la
presencia de un transcrito comprendido entre 2,4 y 1,3 kb cuya
presencia no se ha mencionado nunca y cuya importancia puede ser
notable.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Después de la observaciones y del análisis que
se han resumido al principio de la descripción en lo que se refiere
a la localización del gen, se han usado unas sondas ADNc murino para
aislar el ADNc del gen Notch3 humano, y después unos clones
genómicos cuyas secuencias se podían alinear con el mismo y con las
secuencias del ADNc murino.
Unas informaciones complementarias sobre las
secuencias han sido obtenidas a partir de un fragmento de ADNc
(884Na4) obtenido mediante la selección de ADNc sobre YAC (884g1) y
de dos fragmentos genómicos (J431NH y J432NH) que han sido
obtenidos mediante sub-clonación de fragmentos
Notl-HindIII del BAC 13J4.
En el cribado del banco de datos de (dBest) con
todas las secuencias, se han podido identificar unos clones
adicionales (clones IMAGE, Genexpress).
La secuencia codificante del gen humano
Notch3, homóloga en gran medida al gen murino
correspondiente, está representada en la figura 1.
La tabla A esquematiza la estructura del gen
precisando la secuencia y la posición de las uniones
exón-intrón.
En esta tabla, el primer exón corresponde a una
secuencia cuyo extremo 5' no ha sido totalmente clonado, al igual
que para el exón 33.
Se debe observar que pueden existir unos ADNc
alternativos que corresponden al fenómeno conocido de corte y
empalme alternativo.
Esta secuencia contiene 34 dominios EGF, 3
repeticiones Notch/Lin12, así como 3 repeticiones de tipo anquirina
cdc10. Las proteínas humanas y murinas presentan 90,5% de identidad
sobre la secuencia disponible actualmente. Una sonda ADNc humana
parcial de 1,45 kb que contiene los dominios de tipo EGF revela un
transcrito ubiquitario en los tejidos fetales, así como en los
tejidos humanos adultos cuyo tamaño comprendido entre 7,5 y 9,5 kb
es similar al transcrito murino (figura 4).
Esta sonda revela otro transcrito en ciertas
sub-regiones del cerebro cuyo tamaño está estimado
entre 1,3 y 2,4 kb (figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Con el fin de estudiar la importancia de las
mutaciones en el gen Notch3 sobre el CADASIL, se ha estudiado
en primer lugar la eventual presencia de reorganizaciones de ADN
genómico importante, usando diferentes combinaciones de enzimas y
unas sondas Notch3.
No se ha podido demostrar ninguna reorganización
drástica en los pacientes CADASIL, por lo que se han buscado
después unas mutaciones puntuales.
Así, se han estudiado las mutaciones de la
secuencia codificante total del gen Notch3 en el ADN genómico
usando una combinación de método SSCP y de análisis heterodúplex en
51 pacientes CADASIL sin ninguna relación de parentesco, 28 de los
cuales pertenecen a unas familias para las cuales se ha demostrado
la evidencia de una relación con el cromosoma 19, y 33 presentan
unas lesiones ultraestructurales de la pared de las arteriolas de
la piel (presencia de depósitos granulares osmiófilos en la membrana
basal de las células musculares lisas vasculares).
Se han analizado todas las uniones de corte y
empalme, salvo 3. Además, se ha efectuado una secuenciación directa
de los productos de PCR del exón 4 y sus sitios de corte y empalme
sobre todos los pacientes.
Se han encontrado unas alteraciones que son
compatibles con unas mutaciones correspondientes en 42 pacientes
(82%), no siendo observadas dichas mutaciones en ninguno de los 200
cromosomas de control. Para 26 de los pacientes, ha sido posible
analizar uno o varios emparentados, afectados o no, y en cada caso
se ha establecido que la mutación segregaba con el fenotipo
CADASIL. Existen 29 mutaciones diferentes, de las cuales 20 se
describen por primera vez. Incluyen 24 mutaciones de falso sentido,
que aparecen en 40 pacientes, mutaciones que deben sustituir (16)
un aminoácido por una cisteína adicional o mutada (8) de uno de los
6 residuos de cisteína, que son los elementos clave de los dominios
EGF.
Dos mutaciones en el sitio de corte y empalme 5'
en los dos últimos pacientes deben afectar normalmente el corte y
empalme del exón 4. Las tres últimas mutaciones son unas mutaciones
de falso sentido que aparecen en 3 pacientes simultáneamente con
las mutaciones descritas anteriormente.
El paciente 21 presenta 2 mutaciones distintas
que cambian una arginina en cisteína en el codón 141 en el EGF 3 y
que cambia una glicina conservada en alanina en el codón 288 en el
EGF 7. El pedigrí de este paciente no estaba disponible, y por lo
tanto no se ha podido estudiar la cosegregación de estas dos
mutaciones.
El paciente 29 presenta una primera mutación en
el EGF 4 que cambia una arginina 182 en cisteína y una segunda que
cambia una alanina altamente conservada 1852 en treonina en el
dominio cdc10. Estas dos mutaciones segregan con la enfermedad.
El último paciente 55 es portador de dos
mutaciones distintas en los dominios EGF, que cambian una cisteína
(224) en un triptófano y una leucina no conservada (497) en un
residuo serina.
Aunque estas tres últimas mutaciones de falso
sentido no sean detectadas en los 200 cromosomas de control, puede
tratarse de polimorfismos raros teniendo en cuenta asimismo la
presencia de las mutaciones de falso sentido que mutan o crean unos
residuos cisteínas.
Se debe observar que la mayoría de estas 26
mutaciones que tienen un efecto patógeno reside exclusivamente en
las partes EGF. El 41% de estas mutaciones (11 de 26) que aparecen
en 25 pacientes están situadas en el exón 4 y 65% (17 de 26)
residen en los 6 primeros dominios EGF (véase en particular la
figura 3).
La figura 3 permite caracterizar las principales
mutaciones demostradas, indicando la nomenclatura seleccionada la
posición de la mutación así como las modificaciones correspondientes
de la proteína.
Tal como se ha mencionado anteriormente, el
hecho de que un gen Notch esté implicado en unos trastornos
neurológicos del adulto parece muy sorprendente puesto que Notch es
conocido principalmente por intervenir durante el desarrollo en la
drosofila. Ninguna de las familias de CADASIL estudiadas hasta ahora
presenta unas anomalías del desarrollo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los oligonucleótidos usados como cebadores han
sido sintetizados a partir de las secuencias de unión
intrón-exón (tabla B), de manera que se amplifican
unos fragmentos genómicos de aproximadamente 200 pb. Las secuencias
de los cebadores PCR se proporcionan a continuación (tabla A).
Los análisis se pueden realizar a partir de ADN
extraído de muestras sanguíneas o de cualquier otro tejido.
Las reacciones de amplificación se efectúan en
un volumen final de 25 \mul que contiene 100 ng de ADN genómico,
0,5 \mum de cada cebador, 150 \mug de una mezcla de 4dNTPs, la
Taq polimerasa 1XPCR de Cetus, 1 U de Taq polimerasa (BRL), y 1,5
\muCi \alphadCTP marcado con P33 según un protocolo que
comprende 30 ciclos idénticos (94ºC, 15 s; 65ºC, 15 s; 72ºC, 15
s).
Para algunos de los cebadores, se debe usar una
temperatura de "annealing" de 70ºC, tal como se indica en la
tabla A.
Los productos PCR están destanuralizados en
formamida al 50% y separados mediante electroforesis en un gel de
poliarilamida al 6% no desnaturalizante.
Después de la autorradiografía, las bandas SSCP
obtenidas en los pacientes se comparan con las de controles sanos
en búsqueda de variantes anormales. Su análisis se puede usar como
enfoque diagnóstico. Estas variantes se pueden secuenciar a
continuación si fuese necesario.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Saiki et al., Science, 239,
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\vskip1.000000\baselineskip
- escisión química
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- Allele Specific Oligonucléotidique probes
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- Molecular cloning. A laboratory manual, J.
Sambrook, EF Fritsch y T. Maniatis, 2ª edición
1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Claims (34)
1. Secuencia nucleotídica aislada seleccionada
de entre:
- a)
- las secuencias que codifican para un polipéptido que comprende la secuencia del polipéptido Notch3 humano representado en la figura 1; y
- b)
- la secuencia nucleica del ADNc representado en la figura 1 que codifica para el polipéptido Notch3 humano.
caracterizada porque las secuencias tal
como se definen en a) y b) comprenden una mutación que suprime una
cisteína o que hace aparecer una cisteína en dicho polipéptido
Notch3 en uno de sus dominios EGF.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Secuencia nucleotídica según la
reivindicación 1, caracterizada porque dicha mutación que
suprime una cisteína o que hace aparecer una cisteína en el
polipéptido Notch3 humano representado en la figura 1 se selecciona
de entre el grupo de mutaciones C49Y, W71C, R110C, R133C, R141C,
C146R, R153C, R169C, G171C, R182C, C185R, C212S, C222G, C224Y,
Y258C, C542Y, R558C, R578C, R728C, R985C, R1006C, R1031C, R1231C y
C1261R.
3. Secuencia nucleotídica según la
reivindicación 2, caracterizada porque dicha mutación que
suprime una cisteína o que hace aparecer una cisteína en el
polipéptido Notch3 humano representado en la figura 1 se selecciona
de entre el grupo de mutaciones R133C, R141C, C146R, R153C, R169C,
R182C, Y258C, R558C y R985C.
4. Vector de clonación o de expresión en una
célula hospedante apropiada de una secuencia nucleotídica,
caracterizado porque comprende una secuencia según una de
las reivindicaciones 1 a 3.
5. Vector según la reivindicación 4,
caracterizado porque comprende los elementos que permiten la
expresión de dichas secuencias en dicha célula hospedante.
6. Vector según una de las reivindicaciones 4 ó
5, caracterizado porque se trata de un vector de replicación
autónoma.
7. Vector según una de las reivindicaciones 4 ó
5, caracterizado porque se trata de un vector de integración
cromosómica.
8. Vector según una de las reivindicación 4 ó 5,
caracterizado porque se trata de un vector vírico.
9. Vector según la reivindicación 8,
caracterizado porque el vector está realizado en base a un
adenovirus, un retrovirus, un poxvirus o un virus herpético.
10. Célula transformada por un vector según una
de las reivindicaciones 4 a 9.
11. Célula según la reivindicación 10,
caracterizada porque se trata de una célula procariota.
12. Célula según la reivindicación 10,
caracterizada porque se trata de una célula eucariota.
13. Procedimiento de producción de una proteína
codificada por una secuencia según una de las reivindicaciones 1 a
3, caracterizado porque se cultiva una célula según una de
las reivindicaciones 10 a 12 y porque se recupera la proteína
producida.
14. Proteína o polipéptido codificados por una
secuencia nucleica según una de las reivindicaciones 1 a 3.
15. Proteína o polipéptido según la
reivindicación 14, que presentan una secuencia tal como se
representa en la figura 1 y que comprenden dicha mutación que
suprime una cisteína o que hace aparecer una cisteína sobre dicho
polipéptido Notch3 en uno de sus dominios EGF.
16. Polipéptido según la reivindicación 15,
caracterizado porque dicha mutación se selecciona de entre el
grupo de mutaciones R133C, R141C, C146R, R153C, R169C, R182C,
Y258C, R558C y R985C.
17. Método de diagnóstico de una predisposición
a unas afecciones de tipo CADASIL en un paciente,
caracterizado porque se determina a partir de una muestra
biológica de dicho paciente la presencia de una mutación que suprime
una cisteína o que hace aparecer una cisteína en uno de los
dominios EGF del polipéptido Notch3 cuya secuencia está
representada en la figura 1, mediante el análisis de la totalidad o
parte de la secuencia nucleica, cuya secuencia está representada en
la figura 1, siendo la presencia de dicha por lo menos una mutación
indicativa de una predisposición de dicho paciente a dichas
afecciones.
18. Método de diagnóstico según la
reivindicación 17, caracterizado porque la mutación que se
pretende determinar es una mutación seleccionada de entre el grupo
de mutaciones C49Y, W71C, R110C, R133C, R141C, C146R, R153C, R169C,
G171C, R182C, C185R, C212S, C222G, C224Y, Y258C, C542Y, R558C,
R578C, R728C, R985C, R1006C, R1031C, R1231C y C1261R.
19. Método según una de las reivindicaciones 17
ó 18, en el que la secuencia de ácido nucleico analizada es un ADN
genómico, un ADNc o un ARNm.
20. Método según una de las reivindicaciones 17
a 19, caracterizado porque dicho análisis se realiza mediante
hibridación.
21. Método según una de las reivindicaciones 17
a 20, caracterizado porque la presencia de una mutación se
detecta por comparación con la secuencia correspondiente natural no
mutada.
22. Método según la reivindicación 20,
caracterizado porque dicha hibridación se realiza con la
ayuda de por lo menos una sonda oligonucleotídica específica de la
variante alélica.
23. Método según una de las reivindicaciones 17
a 21, caracterizado porque dicho análisis se realiza mediante
secuenciación.
24. Método según una de las reivindicaciones 17
a 21, caracterizado porque dicho análisis se realiza por
migración electroforética.
25. Método según la reivindicación 24,
caracterizado porque dicho análisis realizado por migración
electroforética se realiza por SSCP o DGGE.
26. Método según una de las reivindicaciones 17
a 25, caracterizado porque la totalidad o parte de la
secuencia nucleica del gen Notch3 de secuencia nucleica
correspondiente a la figura 1 está amplificada previamente a la
demostración de dicha mutación.
27. Método según la reivindicación 26,
caracterizado porque la amplificación se realiza mediante PCR
o de tipo PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Método según la reivindicación 26 ó 27,
caracterizado porque los cebadores elegidos para realizar la
amplificación se seleccionan de entre:
- -
- las secuencias de unión entre los intrones y los exones del gen Notch3 tal como se representan en la tabla A;
- -
- los fragmentos de secuencias tal como se definen en a) y b) de la reivindicación 1, presentando estos fragmentos por lo menos 10, 20 ó 30 bases y comprendiendo dicha mutación que suprime una cisteína o que hace aparecer una cisteína en uno de los dominios EGF de dicho polipéptido Notch3; y
- -
- las secuencias tal como se representan en la tabla B y su secuencia complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Método de diagnóstico in vitro de
CADASIL, caracterizado porque usa una secuencia nucleotídica
como cebador específico o sonda específica de una variante alélica
del gen Notch3 humano que tiene la secuencia nucleotídica de la
figura 1, siendo esta secuencia nucleotídica seleccionada de entre
las siguientes secuencias:
- -
- las secuencias de unión entre los intrones y los exones del gen Notch3 tal como se representan en la tabla A;
- -
- los fragmentos de secuencias tal como se definen en a) y b) de la reivindicación 1, presentando estos fragmentos por lo menos 10, 20 ó 30 bases y comprendiendo dicha mutación que suprime una cisteína o que hace aparecer una cisteína en uno de los dominios EGF de dicho polipéptido Notch3; y
- -
- las secuencias tal como se representan en la tabla B y su secuencia complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
30. Secuencia nucleotídica que se puede utilizar
como cebador específico o sonda específica de una variante alélica
del gen Notch3 humano que tiene la secuencia nucleotídica de la
figura 1 en un método de diagnóstico de CADASIL,
caracterizada porque se selecciona de entre las siguientes
secuencias:
- -
- los fragmentos de secuencias tal como se definen en a) y b) de la reivindicación 1, presentando estos fragmentos por lo menos 20 bases y comprendiendo dicha mutación que suprime una cisteína o que hace aparecer una cisteína en uno de los dominios EGF de dicho polipéptido Notch3.
\vskip1.000000\baselineskip
31. Método de diagnóstico de una predisposición
a unas afecciones de tipo CADASIL en un paciente,
caracterizado porque se determina a partir de una muestra
biológica de dicho paciente la presencia de una mutación que suprime
una cisteína o que hace aparecer una cisteína en uno de los
dominios EGF del polipéptido Notch3 cuya secuencia está
representada en la figura 1, siendo la presencia de dicha por lo
menos una mutación indicativa de una predisposición de dicho
paciente a dichas afecciones.
32. Método de diagnóstico según la
reivindicación 31, caracterizado porque la mutación que se
pretende determinar es una mutación seleccionada de entre el grupo
de mutaciones C49Y, W71C, R110C, R133C, R141C, C146R, R153C, R169C,
G171C, R182C, C185R, C212S, C222G, C224Y, Y258C, C542Y, R558C,
R578C, R728C, R985C, R1006C, R1031C, R1231C y C1261R.
33. Método según una de las reivindicaciones 31
ó 32, caracterizado porque la detección se efectúa mediante
un procedimiento ELISA o RIA.
34. Método de diagnóstico in vitro de
CADASIL, caracterizado porque usa un anticuerpo policlonal o
monoclonal que reconoce la proteína Notch3 humana normal o unas
variantes mutadas según una de las reivindicaciones 14 a 16.
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