ES2279585T3

ES2279585T3 - Polipeptido coestimulante de celulas t, anticuerpos monoclonales, su preparacion y su uso.

Info

Publication number: ES2279585T3
Application number: ES98956800T
Authority: ES
Inventors: Richard Kroczek
Original assignee: BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND LET; Robert Koch Institute
Current assignee: BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND LET; Robert Koch Institute
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2018-09-23
Also published as: AU752433B2; US20080118513A1; AU1332099A; EP1017723B1; WO1999015553A2; US7259247B1; CA2305350A1; CA2305350C; DE59813875D1; JP4463418B2; JP2001517425A; EP1017723A2; WO1999015553A3

Abstract

Un anticuerpo de ratón que reconoce específicamente una molécula co-estimulante humana a) con la actividad biológica de la co-estimulación de células T, b) que se presenta en linfocitos T CD4+ y CD8+ activados, pero no sobre células B en reposo o activadas, granulocitos, monocitos, células NK o células dendríticas, c) que presenta dos cadenas polipeptídicas, en donde la molécula mencionada tiene un peso molecular de aproximadamente 55 a 60 kDa, determinado en una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico, y en donde las dos cadenas polipeptídicas de la molécula mencionada tienen un peso molecular de aproximadamente 27 kDa y aproximadamente 29 kDa, medidos en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS reductora, y d) que contiene una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de al menos el 80% con la secuencia en la fig. 15 que abarca 199 aminoácidos (SEQ ID NO:2), o un fragmento biológicamente activo de la misma, que muestra asimismo un efecto co-estimulante sobre linfocitos de células T, o que contiene la secuencia de aminoácidos conforme a la fig. 15 (SEQ ID NO:2), o un fragmento biológicamente activo del mismo, que muestra asimismo un efecto co-estimulante sobre linfocitos de células T, en donde el anticuerpo reconoce linfocitos T activados con 2 señales, pero no en reposo, y en donde el anticuerpo inhibe la actividad biológica de la molécula co-estimulante o, junto con el anticuerpo OKT3 anti-CD3 monoclonal, co-estimula linfocitos T humanos.

Description

Polipéptido coestimulante de células T, anticuerpos monoclonales, su preparación y su uso.

La invención se refiere a anticuerpos de ratón contra la molécula 8F4 y células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales. Además, la invención se refiere al uso de anticuerpos monoclonales que inhiben la actividad biológica del polipéptido 8F4 de acuerdo con la invención en calidad de medicamentos. En particular, la invención se refiere al uso de estas sustancias para la prevención o terapia de enfermedades en las que participa el sistema inmunitario, en particular para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y para evitar reacciones de rechazo en trasplantes de órganos. Además, la invención se refiere al uso de la molécula 8F4 con la actividad biológica de la co-estimulación de células T, o de células que contienen la molécula 8F4, como medicamento, en particular para la prevención o terapia de enfermedades en las que participa el sistema inmunitario, en particular para el tratamiento de enfermedades cancerígenas, SIDA, enfermedades asmáticas o enfermedades virales crónicas tales como infecciones por VHC o VHB. Además, la invención se refiere al uso de anticuerpos monoclonales para el diagnóstico de enfermedades en las que participa el sistema inmunitario. En particular, la invención se refiere al diagnóstico mediante una detección ELISA, una citometría de flujo, un borrón de análisis Western, una detección por radioinmunoensayo, una nefelometría o una tinción histoquímica.

Los linfocitos T reconocen su antígeno, el cual es ofrecido por "células presentadoras de antígenos", p. ej. células dendríticas, células B y macrófagos, por su receptor de células T. El reconocimiento del antígeno por el receptor de células T solo no es, sin embargo, suficiente en todos los casos como para activar suficientemente a linfocitos T. Para ello requiere de la estimulación adicional y simultánea (en lo que sigue también denominada "co-estimulación") por parte de otras moléculas receptoras sobre la superficie de los linfocitos T. Una de estas moléculas receptoras es el denominado receptor CD28, el cual es estimulado por la molécula co-estimulante B7. Si estas moléculas "co-estimulantes", p. ej. CD28, se vuelven activas, entonces la activación de las células T alcanza un nivel suficiente después del reconocimiento del antígeno por parte del receptor de células T. Después de una activación completa de este tipo, la célula T expresa moléculas adicionales, p. ej. CD25, CD69, CD71, sobre la superficie y sintetiza numerosas citocinas, p. ej. IL-2 e IFN-\gamma, que tienen la función de sustancias mensajeras. Tanto estas moléculas de la superficie adicionales como las citocinas sirven para el intercambio de información de la célula T con otras células del sistema inmunitario. Mediante las moléculas de la superficie adicionales y las citocinas, las células T activadas dirigen toda la respuesta inmunitaria específica para el antígeno. De este modo se controla tanto la generación de células citotóxicas ("células asesinas") como la generación de anticuerpos específicos para antígenos por medio de células B. Células citotóxicas, al igual que los anticuerpos formados específicamente, eliminan agentes patógenos virales o bacterianos que penetran en el cuerpo. Sin embargo, en algunos casos se produce un exceso de la reacción inmunitaria y el sistema inmunitario se orienta contra las propias células del cuerpo. Esto conduce a la aparición de "enfermedades autoinmunes", p. ej. artritis reumatoide, enfermedad de Bechterew, síndrome de Sjögren, colitis ulcerosa, entre otras. Uno de los lugares esenciales de la cooperación entre células T activadas con antígenos y otras células del sistema inmunitario son los órganos linfáticos secundarios, entre ellos las tonsilas. Aquí, los linfocitos T son activados por el antígeno presentado por células dendríticas, aquí interactúan linfocitos T con células B. En virtud de esta interacción, células B segregan, después de varias etapas intermedias de la diferenciación, anticuerpos específicos para antígenos del tipo IgM e IgG.

La molécula co-estimuladora mejor caracterizada y, hasta ahora, más activa, es la molécula de la superficie CD28 (en lo que sigue denominada receptor CD28 o CD28), que es expresada de forma constitutiva en una gran parte de las células T. In vitro, la co-estimulación por parte de CD28, después de reconocer el antígeno por medio del receptor de células T, conduce a un muy fuerte aumento de la secreción de citocinas de, p. ej., IL-2 e IFN-\gamma, al igual que a una regulación ascendente de la expresión de moléculas de la superficie tales como CD25, CD69, CD71, que son necesarias para la interacción de las células T con otras células inmunitarias, p. ej. linfocitos B; véase Chambers y Allison, Current Opinion in Immunology 9 (1997), 396-404. Mediante la co-estimulación a través del receptor CD28 se puede aumentar claramente, además, la proliferación de los linfocitos T. También, mediante la co-estimulación a través del receptor CD28 se optimiza el control de las células T de la función de los linfocitos B de modo que se produce una secreción incrementada de anticuerpos.

Cuando se eleva la función del receptor CD28, se produce una merma drástica de la función de la defensa inmunitaria. Esto pudo demostrarse con ayuda de un ratón transgénico en el que el gen CD28 fue destruido por recombinación homóloga (una denominada "inactivación de CD28"). La activación de las células T específicas para el antígeno, perturbada de esta manera, conduce a una co-estimulación carente. Ésta conduce de nuevo a una perturbación de la función de las células T, es decir a una proliferación reducida de las células T y a una síntesis drásticamente reducida de diferentes citocinas. La co-estimulación carente conduce, en última instancia, a una función reducida del rechazo inmune específica para el antígeno. Así, entre otros, mediante la carencia de CD28 se reduce a un 10% del valor normal la formación de anticuerpos IgG1 e IgG2 específicos para el antígeno por parte de linfocitos B; véase Shahinian et al., Science 262 (1993), 609-612; Lucas et al., Journal of Immunology 154 (1995), 5757-5768. A través de una co-estimulación por parte de CD28 se puede impedir, in vitro, también la penetración del virus del SIDA en linfocitos T; véase Riley et al., Journal of Immunology 158 (1997), 5545-5553. Todavía no se han llevado a cabo ensayos correspondientes in vivo. De manera conocida, CD28 conecta muchos genes de citocinas que, in vivo, pueden conducir a efectos secundarios considerables. El bloqueo de los receptores de CD28 por parte de una molécula de inmunoglobulina CTLA-4 soluble ha sido empleado con éxito en un modelo con monos con el fin de impedir el rechazo de riñones trasplantados. En este caso, CTLA-4 fue empleado en combinación con un anticuerpo contra la molécula de ligando CD40; véase Kirk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 8789-8794. El bloqueo de los receptores CD28 afecta, sin embargo, a todos los linfocitos T y no sólo a los ya activados, dado que CD28 es expresado de forma constitutiva sobre linfocitos T.

El documento EP 0 984 023 A1 da a conocer una molécula de adhesión que fue observada tanto en linfoblastos T activados como en linfoblastos B activados. Redoglia V. et al. (1996), Eur. J. Immunol., 26, 2781-2789, dan a conocer una molécula que es expresada selectivamente sobre células T de ratón activadas y a la que se atribuye un papel como molécula co-estimulante específica para células T.

Por consiguiente, existe la necesidad de una molécula de la superficie co-estimulante que solamente sea expresada sobre linfocitos T activados humanos. Por lo tanto, la invención se basa en poner a disposición una molécula de la superficie sobre células T activadas humanas, que presenta un fuerte efecto co-estimulante sobre funciones centrales de los linfocitos T. Otra misión es poner a disposición anticuerpos monoclonales contra la molécula de la superficie co-estimulante.

El objeto de la invención se describe con mayor detalle en las reivindicaciones.

La invención da también a conocer un polipéptido con la actividad biológica de la co-estimulación de células T, caracterizado porque a) el polipéptido se presenta sobre linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} activados, pero no sobre células B en reposo o activadas, granulocitos, monocitos, células NK (células asesinas naturales) o células dendríticas, y b) el polipéptido es un dímero, en donde el polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 55 a 60 kDa (kilodalton), determinado en una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE - siglas en inglés) no reductora, y en donde las dos cadenas polipeptídicas del polipéptido tienen un peso molecular de aproximadamente 27 kDa y aproximadamente 29 kDa, medidos en una SDS-PAGE reductora.

El polipéptido (denominado en lo que sigue también molécula 8F4 ó 8F4) es expresado solamente después de la activación de los linfocitos T, a saber tanto en células T CD4^{+} como CD8^{+}. En una SDS-PAGE no reductora, la molécula 8F4 presenta un peso molecular entre aproximadamente 55 y 60 kDa (kilodalton). La molécula 8F4 está compuesta por dos cadenas peptídicas, en donde las dos cadenas peptídicas presentan, en una SDS-PAGE reductora, un peso molecular de aproximadamente 27 y aproximadamente 29 kDa. Desde un punto de vista histológico, el antígeno 8F4 sobre linfocitos T activados puede detectarse inequívocamente en el tejido linfático de las tonsilas y nódulos linfáticos, en especial en centros de germinación, el lugar de la interacción de linfocitos T y linfocitos B en la generación de anticuerpos. Células T tonsilares aisladas ex vivo son, en aproximadamente 50-80%, positivas para el antígeno 8F4 y presentan síntomas de una activación avanzada. La molécula 8F4 no puede ser detectada sobre células B en reposo o activadas, granulocitos, monocitos, células NK y células dendríticas.

Una importante actividad biológica de la molécula 8F4 es su actividad co-estimulante de linfocitos T. La actividad co-estimulante puede determinarse según Linsley, et al., Journal of Experimental Medicine 176 (1992), 1595-604. La actividad co-estimulante de la molécula 8F4 se asemeja a la actividad co-estimulante de la molécula CD28 que ha sido identificada como elemento de refuerzo central del reconocimiento del antígeno por el sistema inmunitario. La molécula 8F4 se diferencia, sin embargo, en muchos aspectos de CD28. Así, la expresión de la molécula 8F4 sobre la superficie de las células T debe inducirse mientras que CD28 es expresado de forma constitutiva. También en la función se pueden detectar claras diferencias: la co-estimulación a través de CD28 conduce a la sobre-expresión de numerosas linfocinas, entre otras la interleucina-2 (IL-2). También la co-estimulación a través de 8F4 conduce a una secreción reforzada de linfocinas, pero no de la IL-2. Por consiguiente, la actividad co-estimulante de la molécula 8F4 se diferencia de la actividad de la molécula CD28. Dado que la estimulación a través de 8F4 no conecta todos los genes citocina, es ventajosa una co-estimulación a través de 8F4 in vivo, p. ej. frente a una co-estimulación a través del receptor CD28. También se diferencia la inducción, la expresión, el lugar de expresión y la función de la molécula 8F4 de todas las otras moléculas de acción co-estimulante conocidas.

En el caso de la molécula 8F4 se trata de una molécula de la superficie sobre células T activadas, que presenta una fuerte acción co-estimulante sobre funciones centrales de los linfocitos T. La expresión in vivo apunta, entre otros, a una participación esencial de la molécula 8F4 en la cooperación de células T con otras células del sistema inmunitario tales como células B o células dendríticas en el marco de la defensa inmunitaria humoral y celular frente a virus y bacterias.

Después de la expresión, la molécula 8F4 tiene, in vitro, una fuerte acción co-estimulante sobre diferentes funciones de los linfocitos T:

1.: Claro refuerzo de la proliferación de linfocitos T.

2.: Claro refuerzo de la síntesis de determinadas citocinas por parte de los linfocitos T.

3.: Expresión fuertemente incrementada de moléculas de control, p. ej. de moléculas de la superficie y citocinas, sobre y en linfocitos T.

4.: Clara mejora de la formación de anticuerpos inducida por células T (IgM e IgG) por parte de células B.

La presente invención da a conocer también un polipéptido con la actividad biológica de la co-estimulación de células T y con una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de al menos el 40% con la secuencia en la fig. 15 que abarca 199 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), o un fragmento biológicamente activo o un análogo del mismo. Un fragmento biológicamente activo o análogo es un fragmento o análogo que muestra asimismo un efecto co-estimulante sobre linfocitos de células T, o al menos en el sentido de un bloqueo, despliega un efecto biológico. Se prefiere un polipéptido o un fragmento biológicamente activo o un análogo del mismo que presenta una homología de al menos el 60% con la secuencia en la fig. 15 que abarca 199 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). En una forma de realización particularmente preferida, el polipéptido abarca una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de al menos el 80% con la secuencia en la fig. 15 que abarca 199 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) o un fragmento biológicamente activo o un análogo del mismo.

En particular, se da a conocer un polipéptido con la actividad biológica de la co-estimulación de células T y que abarca una secuencia de aminoácidos conforme a la fig. 15 (SEQ ID NO: 2), o un fragmento biológicamente del mismo.

La invención abarca variantes alélicas y fragmentos de la molécula 8F4. Estas variantes abarcan una variante alélica que se presenta en la naturaleza, análogos de sustitución, en los que están sustituidos uno o varios aminoácidos con distintos aminoácidos, análogos de sustitución, en los que uno o varios aminoácidos están sustituidos con distintos aminoácidos, análogos de deleción, en los que están suprimidos uno o varios aminoácidos y análogos de adición, en los que se han añadido uno o varios aminoácidos. La deleción y adición de uno o varios aminoácidos pueden hacerse en una región interna del polipéptido o en el extremo amino o carboxi.

Quedan abarcados asimismo polipéptidos, fusionados a polipéptidos heterólogos.

Además, se dan a conocer secuencias de ADN que codifican un polipéptido de acuerdo con la invención o un fragmento biológicamente activo del mismo.

Estas secuencias de ADN abarcan la secuencia conforme a SEQ ID NO: 1 (fig. 16), al igual que variantes alélicas y fragmentos con actividad biológica.

Particular es una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con la actividad biológica de la co-estimulación de células T, seleccionada del grupo consistente en:

a): la secuencia de ADN conforme a SEQ ID NO: 1 (fig. 16) y su cadena complementaria

b): la secuencia de ADN que se hibrida con las secuencias en (a) y

c): secuencias de ADN que, en virtud de la degeneración del código genético, se hibridan con las secuencias en (a) y (b). Preferiblemente, las secuencias de ADN precedentes se hibridan entre sí bajo condiciones estrictas.

Además, se ponen a disposición vectores que contienen estas secuencias de ADN y células huésped que están transformadas o transfectadas con estos vectores.

En otra forma de realización, la invención da a conocer anticuerpos monoclonales contra la molécula 8F4. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse de manera habitual según el procedimiento descrito por Milstein y Köhler, Nature 256 (1975), 495-497. En especial, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar inmunizando a ratones con células T que han sido activadas in vitro con miristato-acetato de forbol (MAF) e ionomicina ("sistema de 2 señales") durante 24 h. Las células del bazo de los ratones inmunizados se fusionan con células de mieloma. Anticuerpos monoclonales, específicos para 8F4, se identifican porque reconocen linfocitos T activados con 2 señales, pero no en reposo. Tampoco los anticuerpos específicos para 8F4 tiñen con una señal (MAF o ionomicina) células T estimuladas en un procedimiento de detección llevado a cabo de manera habitual. Anticuerpos específicos para 8F4 proporcionan un modelo de tinción típico de células T tonsilares y reconocen un antígeno de aproximadamente 55 a 60 kDa en una SDS-PAGE no reductora, y de aproximadamente 27 kDa y aproximadamente 29 kDa en una SDS-PAGE reductora sobre linfocitos T activados.

En otra forma de realización la invención se refiere a células de hibridoma que producen los anticuerpos de ratón de acuerdo con la invención.

En otra forma de realización la invención se refiere al uso de anticuerpos monoclonales, que inhiben la actividad biológica del polipéptido 8F4 de acuerdo con la invención, en calidad de medicamentos. Estos anticuerpos pueden utilizarse como medicamentos para la prevención o la terapia de enfermedades en las que participa el sistema inmunitario, en particular para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o para impedir las reacciones de rechazo en los trasplantes de órganos. El bloqueo de la interacción del antígeno 8F4 con su receptor mejora, p. ej., el impedimento del rechazo del órgano, ya que un bloqueo de este tipo solamente afecta a linfocitos T ya activados. Otra forma de realización de la invención se refiere al uso del polipéptido de acuerdo con la invención como medicamento para el tratamiento de enfermedades cancerígenas, SIDA, enfermedades asmáticas o enfermedades virales crónicas tales como infecciones por VHC o VHB.

El polipéptido puede introducirse en células, asimismo de manera habitual, de modo que estas células pueden expresar el polipéptido, p. ej. de forma constitutiva. P. ej., en una célula se puede introducir la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido, o un vector que abarca la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, p. ej. el ADNc o ADN genómico, promotores, reforzadores y otros elementos requeridos para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. Preferiblemente, se emplea el ADNc de 8F4 (2641 nucleótidos), representado en la fig. 16 (SEQ ID NO: 1), o fragmentos o derivados del mismo, para la expresión del polipéptido o fragmentos del mismo.

Además, el polipéptido puede introducirse en células, p. ej, mediante liposomas los cuales configuran al polipéptido después sobre su superficie de la célula. De acuerdo con la invención, estas células se pueden utilizar como medicamento, en particular para la regeneración de la regulación correcta del sistema inmunitario humano, tal como aparece en el marco de numerosas enfermedades infecciosas crónicas, p. ej. en el marco del SIDA, enfermedades asmáticas o en hepatitis virales crónicas (p. ej. VHC, VHB), o para la estimulación del sistema inmunitario in vitro o in vivo tal como, p. ej., para la terapia de enfermedades cancerígenas.

En otra forma de realización, los anticuerpos monoclonales se utilizan para el diagnóstico de enfermedades en las que participa el sistema inmunitario. Para el diagnóstico se puede utilizar, p. ej., una detección ELISA, citometría de flujo, borrón de análisis Western, radioinmunoensayo, nefelometría o una tinción histoquímica.

Los anticuerpos monoclonales pueden influir (modular), positiva o negativamente, la vía de transducción de señales del polipéptido mencionado en la célula T.

Los anticuerpos monoclonales pueden impedir también la regulación hacia abajo del polipéptido de acuerdo con la invención a la superficie de células T.

Además, el polipéptido de acuerdo con la invención o fragmentos del mismo es expresado por un animal transgénico. También queda abarcado un animal transgénico en el que se ha inactivado ("knock-out") el gen que codifica el polipéptido de acuerdo con la invención.

Las figuras sirven para explicar la invención:

La fig. 1 muestra el resultado de una inmunoprecipitación del antígeno 8F4 procedente de células T humanas activadas. (a) Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE; gel de poliacrilamida (gel PAA) al 12%) reductora, (b) SDS-PAGE (gel PAA al 10%) no reductora. Se indican las condiciones para la elución del antígeno de la matriz de 8F4. "SDS" significa dodecilsulfato sódico; "DTT" significa ditiotreitol, "Mr" significa peso molecular y "kDa" significa kilodalton.

La Fig. 2a muestra el resultado de una citometría de flujo tras la inducción del antígeno 8F4 sobre células T CD4^{+}. La duración de la activación de las células T está indicada entre paréntesis. "PMA" significa miristato-acetato de forbol; "PHA" significa fitohemoaglutinina; "OKT3" es un anticuerpo monoclonal contra CD3; "MLR" significa reacción de linfocitos mixta (en inglés: mixed lymphocyte reaction); "mAK 9.3" es un anticuerpo monoclonal contra CD28; "SEB" significa enterotoxina B de estafilococos.

La Fig. 2b muestra el resultado de una cinética de la inducción del antígeno 8F4 sobre células T CD4^{+} después de la activación con PMA e ionomicina en una citometría de flujo. Se registra la inmunofluorescencia (log) frente al número de células.

La Fig. 3 muestra el resultado de una citometría de flujo para la identificación de moléculas que participan en la inducción de 8F4 en la "mixed lymphocyte reaction". "bio" significa anticuerpo biotinilado.

La Fig. 4 muestra el resultado de una investigación histoquímica para la localización de células 8F4-positivas en la tonsila.

La Fig. 5 muestra el resultado de un análisis de expresión de 8F4 sobre células T y B procedentes de tonsilas humanas en una citometría de flujo. "bioPE" significa anticuerpos biotinilados y reactivo secundario de estreptavidina-ficoeritrina.

La Fig. 6 muestra la co-expresión de la molécula 8F4 con otros marcadores de activación (CD69, CD45) en una citometría de flujo.

La Fig. 7 muestra esquemáticamente la expresión reforzada de moléculas de activación sobre linfocitos T después de la co-estimulación a través de 8F4. Los círculos en blanco (\medcirc) representan anticuerpos 8F4, los triángulos (\blacklozenge) representan anticuerpos inespecíficos del mismo isotipo; los círculos rellenos (\medbullet) representan anticuerpos 9.3 anti-CD28.

La Fig. 8 muestra una comparación esquemática del efecto co-estimulante de 8F4 con el efecto co-estimulante de CD28. "mAk" significa anticuerpo monoclonal; "ATAC" significa "Activation induced T cell derived And Chemokine related - derivado de células T inducidas por activación y relacionado con quimioquina"; "cpm" significa descomposiciones radiactivas por minuto.

La Fig. 9 muestra esquemáticamente el refuerzo de la síntesis de los anticuerpos del tipo IgM e IgG por parte de las células B después de la co-estimulación de células T. "ng" significa nanogramo; "ml" significa mililitro; "mAk" significa anticuerpo monoclonal.

La Fig. 10 muestra esquemáticamente el impedimento de la apoptosis inducida por activación de células T periféricas tras la co-estimulación por parte de 8F4.

La Fig. 11 muestra la expresión del antígeno 8F4 sobre la línea de células MOLT-4V. Las células MOLT-4V se tiñieron con un anticuerpo 8F4 marcado con fluoresceína (8F4-FITC) y se investigaron en la citometría de flujo (línea en blanco, en comparación con un control del isotipo (línea rellena)).

La Fig. 12 muestra la electroforesis en gel bidimensional. Un lisado de células MOLT-4V a base de 300x10^{6} se inmunoprecipitó como se describe. El material eluido se separó en una SDS-PAGE no reductora (PAA al 10%) y se separó por corte del gel la zona en torno a 60 kDa. Para la reducción de los puentes disulfuro en la molécula 8F4, el trozo de gel se incubó durante 1 h a 50ºC en urea 5,3 M, Tris 0,5 M, pH 8,0, SDS al 1%, \beta-mercaptoetanol al 1%, y los restos cisteína libres en la molécula se alquilaron con yodoacetamida 10 mM (Sigma, Deisenhofen) (30 min, 37ºC). El trozo de gel se equilibró durante otros 30 min en tampón de muestra 1x SDS-PAGE y se montó en un gel de PAA al 12%-SDS (con gel recolector). Después de la separación electroforética, el gel se sometió a una tinción con plata. La posición de la proteína 8F4 se determinó mediante yodación en la superficie (véase la Fig. 1) y se marcó mediante rodeo con un círculo. (Todos los procesos no descritos en detalle se llevaron a cabo según métodos estándares, véase, p. ej., Westermeier, R., Electophoresis in Practice, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1997).

La Fig. 13 muestra una hibridación con oligo 1 (SEQ ID NO: 3). Clones lambda se hibridaron con oligo 1 como se describe en los Ejemplos. Se representa la expresión en una película de rayos X (sección).

La Fig. 14 muestra un análisis de un borrón de análisis Northern con el ADNc de 8F4. La hibridación de un borrón de análisis Northern con el ADNc de 8F4 proporciona una banda que en el gel discurre entra ARN 18S y 28S. En la Fig. 14A se muestra el comportamiento como antígeno de activación dependiente de 2 señales (véase antes). Ninguna expresión en células linfoides en reposo (PBL), fuerte expresión en células T CD4^{+} activadas con PMA+ionomicina y expresión claramente reducida con PMA o ionomicina solo. La Fig. 14B muestra el poder de expresión del ARNm después de diferentes momentos de estimulación (células T (purificadas a través de adherencia de lana de nilón, NTC), estimuladas con PMA+ionomicina). Junto a ello, las líneas de células MOLT-4 (ATCC CRL-1582), que muestran sólo una expresión mínima, muy a la derecha la MOLT-4V utilizada para la clonación que muestra una señal clara. Se representa, además, el ARN de otras líneas de células, en las que, en el análisis de citometría de flujo, no se podía detectar expresión alguna de 8F4: CEM (ATCC CCL-119), HUT-102 (ATCC TIB-162), HUT-78 (ATCC TIB-161), Jurkat (ATCC TIB-152), DG75 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) ACC83), Karpas 299 (Fischer, P. et al. (1988), Blood, 72:234-240), DEL (Barbey, S. et al. (1990), Int. J. Cancer, 45:546-553).

La fig. 15 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido 8F4 (SEQ ID NO: 2).

La fig. 16 muestra el ADNc de 8F4 (SEQ ID NO: 1).

Los siguientes Ejemplos explican la invención y no se han de entender como limitantes.

Ejemplo 1 Generación del anticuerpo 8F4

Ratones Balb/c se inmunizaron con células T humanas, que previamente habían sido activadas durante 24 h con 33 ng/ml del éster de forbol miristato-acetato de forbol (PMA), (Sigma, Deisenhofen), y con 200 ng/ml del ionóforo de Ca^{2+} ionomicina (Sigma, Deisenhofen) (la denominada "activación de 2 señales"). Después del refuerzo durante tres veces, las células del bazo de los ratones se fusionaron con el mieloma P3X63Ag8.653 (ATCC nº CRL-1580)y se generaron hibridomas secretores de anticuerpos según métodos estándares; véase Peters y Baumgarten, Monoclonal Antibodies, Springer, Heidelberg, 1992. La revisión de los anticuerpos obtenidos se efectuó en células T activadas frente a células T en reposo en la citometría de flujo. Células activadas ("activación de 2 señales") y en reposo se incubaron con el sobrenadante del hibridoma y, a continuación, se marcaron con un anticuerpo secundario marcado por fluorescencia; véase Shapiro, Practical Flow Cytometry. Wiley-Liss, Nueva York, 1995. Solamente los anticuerpos que reconocían moléculas, que exclusivamente fueron inducidos por PMA y el ionóforo de Ca^{2+} ionomicina sobre la superficie de células T, pero no por uno de los agentes solos ("moléculas de 2 señales"), se seleccionaron para una purificación ulterior. Los anticuerpos obtenidos se investigaron en la citometría de flujo en cuanto a similitud o diferencia con anticuerpos conocidos frente a moléculas de activación (véase la Tabla 1) en células T. En este caso, los criterios eran, junto a la "dependencia de 2 señales" ya antes mencionada, la cinética de la inducción sobre células T estimuladas y la expresión sobre diferentes líneas de células.

Ejemplo 2 Inmunoprecipitación del antígeno 8F4

Moléculas de la superficie de células T humanas activadas se yodaron con ^{125}I según métodos estándares y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo 8F4 según métodos estándares; véase Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice. Academic Press, Londres, 1996. Para la inmunoprecipitación, el anticuerpo según Schneider et al., Journal of Biological Chemistry 257 (1982), 10766-10769, fue acoplado a proteína G (Pharmacia, Freiburg) (matriz 8F4). El lavado de la matriz se efectuó según Schneider et al., véase precedentemente. La molécula 8F4 inmunoprecipitada se analizó de manera habitual en la SDS-PAGE (no reducida y reducida) en cuanto a su masa molecular; Goding, véase precedentemente.

Ejemplo 3 Citometría de flujo

El análisis de las células T portadoras de 8F4 en la citometría de flujo se efectuó según métodos estándares; véase Shapiro, Practical Flow Cytometry. Wiley-Liss, Nueva York, 1995.

Ejemplo de realización 3.1

Citometría de flujo después de la inducción del antígeno 8F4 sobre células T CD4^{+}

Células T CD4^{+} de la sangre periférica se estimularon de manera habitual con diferentes agentes y se investigaron en cuanto a la expresión de la molécula 8F4 en la citometría de flujo según procedimientos habituales. La duración de la activación de las células T oscilaba con los diferentes agentes entre 24 horas y 144 horas. Modos de activación: miristato-acetato de forbol (PMA; 33 ng/ml), ionomicina (200 ng/ml), fitohemoaglutinina (PHA 1,5 mg/ml), OKT3 (anticuerpo monoclonal contra CD3), reacción mixta de linfocitos (MLR, "mixed lymphocyte reaction" entre 50.000 células T CD4^{+} y 100.000 células B), mAk 9.3 (anticuerpo monoclonal contra CD28), enterotoxina B de estafilococos (SEB, 0,1 ng/ml). La evaluación dio como resultado que son adecuados diferentes estímulos para inducir la molécula 8F4 sobre células T, pero a una densidad de expresión diferente. Los más potentes son, junto a los agentes farmacológicos fuertemente activos PMA e ionomicina estímulos que representan una situación co-estimulante tales como, p. ej., células accesorias en la MLR o el mAk 9.3 co-estimulante.

Ejemplo de realización 3.2

Cinética de la inducción del antígeno 8F4 sobre células T CD4^{+} tras la activación con PMA e ionomicina

Células T CD4^{+} de la sangre periférica se estimularon, de manera habitual, con PMA (33 ng/ml) e ionomicina (200 ng/ml) y, tras 0, 4, 8, 12, 24 y 48 horas, se investigaron de manera habitual en cuanto a la expresión de la molécula 8F4 en la citometría de flujo. La molécula se puede detectar sobre la superficie ya al cabo de cuatro horas, pertenece por lo tanto a la clase de los antígenos de activación relativamente tempranos. También al cabo de 48 horas el antígeno es expresado todavía bien.

Ejemplo de realización 3.3

Citometría de flujo para la identificación de moléculas que participan en la inducción de 8F4 en la "mixed lymphocyte reaction"

50.000 células T CD4^{+} de la sangre periférica se co-cultivaron durante 6 días con 100.000 células B alógenas tonsilares (37ºC, 5,2% de CO_{2}, 200 \mul de RPMI 1640 con FCS al 10% en placas de fondo redondo de 96 pocillos) y después se investigó en cuanto a la expresión de la molécula 8F4 en la citometría de flujo. Al comienzo del cultivo se añadieron al cultivo diferentes anticuerpos (anti-CD80, anti-CD86, anti-MHCII; todos 10 mg/ml), con el fin de verificar la dependencia de la inducción de 8F4 de estas moléculas. La expresión de 8F4 se puede bloquear sólo por medio del bloqueo de la interacción CD86/CD28, pero no por el bloqueo de CD80. En este caso, el efecto de bloqueo es aún más intenso que el bloqueo de MHCII (control positivo).

Ejemplo de realización 3.4

Expresión de 8F4 en células T y B de tonsilas humanas

Células B y células T de tejido tonsilar de diferentes fuentes se purificaron de manera habitual y se investigaron en la citometría de flujo en cuanto a la expresión de la molécula 8F4. Mientras que en células B la señal no era claramente significativa, aproximadamente el 50-80% de las células T tonsilares expresaban a la molécula 8F4 en diferente densidad. En este caso se pueden reconcoer dos poblaciones de fluorescencia de distinta intensidad (8F4-"alta" o -"baja"), cuya expresión es distinta en el caso de las distintas tonsilas. Así, p. ej. tonsilas presentan una acusada población 8F4-"baja" y otras tonsilas presentan una acusada población 8F4-"alta".

Ejemplo de realización 3.5

Co-expresión de la molécula 8F4 con otros marcadores de activación

Células T purificadas a partir de tonsilas humanas se analizaron en la citometría de flujo de 2 colores en cuanto a la co-expresión de la molécula 8F4 con otros marcadores de activación. En tonsilas 8F4 se co-expresa con CD69, al igual que con variantes de la molécula CD45. En este caso, las células 8F4-"alta" se correlacionan inequívocamente con la expresión de CD45RO, mientras que las células 8F4-negativas portan el fenotipo CD45RA. CD45RA es expresado principalmente por las denominadas células T "nativas", mientras que, por el contrario, CD45RO está asociado con una función de células de efector. Por lo tanto, en el caso de las células 8F4^{+} se trata principalmente de células T "maduras". CD45RO y CD45RA son isoformas de CD45.

Ejemplo 4 Localización de células 8F4-positivas en la tonsila

Tejido tonsilar en cortes de congelación se tiñó con el anticuerpo 8F4 en la técnica APAAP (fosfatasa-alcalina-fosfatasa-anti-alcalina) según procedimientos estándares. Células 8F4^{+} se encontraron preferiblemente en el centro de germinación de las tonsilas, pero, en parte, también en la zona de las células T de las tonsilas.

Ejemplo 5 Co-estimulación de linfocitos T

Placas de 96 pocillos se revistieron con un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón (20 \mug/ml), se lavaron y se cargaron con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 OKT3 (diferentes diluciones de un ascites) y con el anticuerpo 8F4 (2 \mug/ml) de acuerdo con la invención. Como control del isotipo se utilizaron el anticuerpo OKM1 o el anticuerpo 2A11 (ambos (2 \mug/ml).

Ejemplo de realización 5.1

Expresión reforzada de moléculas de activación en linfocitos T después de la co-estimulación por parte de 8F4

Células T CD4^{+} purificadas de la sangre periférica se activaron con diferentes concentraciones del anticuerpo monoclonal OKT3 y, al mismo tiempo, se co-estimularon con el anticuerpo 8F4 o un anticuerpo inespecífico del mismo isotipo. Como comparación se llevó a cabo la co-estimulación con el anticuerpo 9.3 anti-CD28, uno de los anticuerpos co-estimulantes más potentes conocidos. Incluso en el caso de una estimulación óptima a través de CD3, se puede observar aún un efecto co-estimulante tanto con el mAk 8F4 como con el mAk 9.3. En el intervalo subóptimo de OKT3, es decir en el intervalo en el que, sin una co-estimulación, ya no se puede alcanzar una activación completa de células T, los dos anticuerpos pueden aumentar la expresión de otros antígenos de activación en un factor de 4 a 100, siendo visible el efecto del anticuerpo anti-CD28 también todavía a diluciones de OKT3 muy altas. Esto ha de atribuirse a que en el caso de una estimulación de OKT3 muy débil el antígeno 8F4 no puede disponerse ya sobre la superficie de la célula y, por consiguiente, tampoco puede reticularse por el mAk 8F4.

Ejemplo de realización 5.2

Comparación del efecto co-estimulante de 8F4 con el efecto co-estimulante de CD28

Células T CD8^{+} purificadas se estimularon durante 51 h con una concentración subóptima del anticuerpo monoclonal OKT3. Como co-estimulador se emplearon anticuerpos 8F4, anticuerpos 9.3 (anti-CD28) y controles de isotipo (en cada caso (2 \mug/ml)). Después de transcurrida la duración de la estimulación se determinó la tasa de proliferación de células T mediante la incorporación de ^{3}H-timidina. En cultivos paralelos se retiró el material sobrenadante y se determinó la concentración de las citocinas ATAC/linfotactina e IL-2. En relación con la síntesis de IL-2, 8F4 y CD28 se diferencian mucho entre sí. La co-estimulación con CD28 conduce, como ya se ha descrito en el estado conocido de la técnica (Chambers y Allison, Current Opinion in Immunology 9 (1997), 396-404), a una muy fuerte secreción de IL-2. Por el contrario, con 8F4 la producción de IL-2 se encuentra por debajo del límite de detección. Sin embargo, la proliferación es equiparable en ambas tandas, por lo tanto el desarrollo autocrino de las células T debe atribuirse la co-estimulación con 8F4 a otros factores. También en relación con la secreción de la linfocina ATAC los dos anticuerpos apenas se diferencian en el efecto co-estimulante.

Ejemplo 6 Determinación de las inmunoglobulinas sintetizadas por células B después de la interacción con células T estimuladas con 8F4

Placas de 96 pocillos se revistieron con un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón (20 \mug/ml), se lavaron y se cargaron con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 OKT3 (1:500 a 1:80.000 de un ascites) y con el anticuerpo 8F4 (2 \mug/ml) de acuerdo con la invención. Como control del isotipo se utilizó el anticuerpo OKM1 o el anticuerpo 2A11. En algunos experimentos se llevó a cabo, con fines comparativos, una co-estimulación con un anticuerpo específico para CD28 ("9.3"); véase Hara et al., Journal of Experimental Medicine 161 (1985), 1513-1524. En las placas de cultivo, así previamente tratadas se pipetearon por cada pocillo 50.000 células T CD4^{+} purificadas (Magnetobeads, Dynal, Hamburgo) (pureza > 95%) de la sangre periférica y 25.000 células B tonsilares alógenas (selección negativa mediante formación de rosetas de células T con eritrocitos de oveja, pureza del 96%) y se co-cultivaron durante 8 días. Después de este tiempo se retiró el material sobrenadante y se analizó en cuanto a la concentración de inmunoglobulinas segregadas del tipo IgM e IgG en el ELISA de manera habitual; véase Nishioka y Lipsky, Journal of Immunology 153 (1994), 1027-1036.

Ejemplo de realización 6.1

Refuerzo de la síntesis de los anticuerpos del tipo IgM e IgG mediante las células B después de co-estimulación de células T

Células T CD4^{+} purificadas procedentes de la sangre periférica se co-cultivaron de manera habitual durante 8 días con células B alógenas procedentes de tonsilas. En el caso de una estimulación subóptima de las células T con el anticuerpo OKT3, la co-estimulación de las células T mediante 8F4 refuerza la secreción de las inmunoglobulinas IgM e IgG en un factor de 40.

Ejemplo 7 Impedimento de la apoptosis inducida por activación de células T periféricas tras la co-estimulación mediante 8F4

Células T periféricas (purificadas de manera habitual a través de adherencia de lana de nilón) se estimularon durante 20 h con PHA (1,5 mg/ml) y se cultivaron a lo largo de 6 días con IL-2. A continuación, las células se re-estimularon mediante OKT3 con y sin co-estimulación mediante el mAk 8F4 (2 \mug/ml). La apoptosis se determinó mediante tinción del ADN con yoduro de propidio en la citometría de flujo (FACS). En el caso de la estimulación subóptima, a través del complejo del receptor de células T la co-estimulación a través de 8F4 puede reducir la proporción de células apoptóticas en un factor de 4.

Ejemplo 8 Clonación del ADNc que codifica la proteína 8F4

Mediante tinción con un anticuerpo 8F4 acoplado a colorante de fluorescencia se identificó en la citometría de flujo una línea de células (MOLT-4V) que expresa constitutivamente el antígeno 8F4 (Fig. 11). En el caso de la línea MOLT-4V se trata de una variante de la línea de células T humana MOLT-4 (American Type Culture Collection (ATCC) CRL-1582).

Esta línea de células se utilizó para la purificación preparativa del antígeno 8F4 con ayuda del anticuerpo monoclonal:

Las células se cultivaron a gran escala (150 l) en frascos de cultivo con bola movible, se separaron por centrifugación y las proteínas celulares se extrajeron con un tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM (Sigma, Deisenhofen), NP-40 al 1% (Boehringer, Mannheim)). Los núcleos de las células y otros componentes insolubles se separaron mediante ultracentrifugación. El lisado de células, así obtenido, se pre-incubó durante 2 h con Sepharose CL4-B (Pharmacia, Freiburg) con el fin de separar proteínas que se unen de manera no específica a sefarosa. A continuación, se efectúa la incubación con la matriz de inmunoafinidad de 8F4 ya descrita en el Ejemplo 2 (4h a 4ºC). La matriz se cargó en una columna y entonces se lavó varias veces bajo condiciones que condicionan una separación exclusiva de proteínas que se unen de manera no específica (1. Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, NP-40 al 0,5%; 2. Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, NP-40 al 0,5%, SDS al 0,1%; 3. glicina 0,2 M pH 4,0, CHAPS al 0,5% (Merck, Darmstadt)). La elución del antígeno 8F4 de la matriz se efectuó con glicina 0,2 M, pH 2,5, CHAPS al 0,5%. El material eluido se concentró mediante ultrafiltración (Amicon Centricon 10, Millipore, Eschborn).

Con el fin de alcanzar una purificación ulterior de la molécula 8F4 se aprovechó la estructura dímera de la molécula (véase la Fig. 1) en una electroforesis en gel bidimensional (no reductora/reductora): dado que la mayoría de las proteínas se presentan como monómeros, discurren en la electroforesis en gel en una diagonal, por el contrario, la molécula 8F4 discurre en la 1ª dimensión (no reductora)a 55-60 kDa y en la 2ª dimensión (reductora) a 27 y 29 kDa (Fig. 12).

Para la separación preparativa, los inmunoprecipitados se separaron en la electroforesis en gel bidimensional de en cada caso 20x10^{9} células tal como se describe precedentemente en la descripción de la Fig. 12, el gel se tiñó con Azul de Coomasie G250 (Biorad, Munich) y se recortaron por separado del gel las zonas designadas en la Fig. 12 (8F4-27 kDa u 8F4-29 kDa).

Para la microsecuenciación del péptido, las proteínas de en cada caso 4 trozos de gel se digerieron con tripsina y se eluyeron del gel. Los fragmentos típicos se separaron a través de HPLC y las distintas fracciones se sometieron a una degradación de Edman (procedimiento ampliamente descrito en Groettrup, M. et al. (1996), Eur. J. Immunol., 26:863-869).

A partir de la secuenciación de la muestra de 8F4-29 kDa se encontró, junto a fragmentos de proteínas conocidas, una secuencia peptídica XRLTDVT para la cual no se encontró correlación alguna en el sector humano en todos los bancos de datos de proteínas.

No es posible una inequívoca retro-traducción de una secuencia de proteínas en una secuencia de ADN. Así, la retro-traducción de la secuencia peptídica anterior en un oligonucleótido con 17 nucleótidos proporciona un número de 2048 permutaciones. Sin embargo, un procedimiento especial (Wozney, J.M. (1990), Methods Enzymol. 182:738-751) proporciona el rastreo de una genoteca de ADNc con oligonucleótidos degenerados. En base a la secuencia peptídica encontrada se sintetizaron 2 oligonuleótidos (Oligo 1 (SEQ ID NO: 3): MGN CTS ACN GAY GTN AC, 512 permutaciones; (Oligo 2 (SEQ ID NO: 4): MGN YTD ACN GAY GTN AC, 1024 permutaciones).

Para el rastreo se construyó una genoteca de ADNc a partir de la línea de células MOLT-4V utilizada para la purificación de proteínas:

El ARN total se aisló según el método de guanidinio/CsCl (Chirgwin, J.M. et al. (1979), Biochemistry 18:5294-5299)y el ARNm se enriqueció a través de columnas de oligo-dT-celulosa (Gibco BRL, Eggenstein). La síntesis de ADNc de primera y segunda cadenas se llevó a cabo utilizando un sistema de síntesis comercial de ADNc (Gibco BRL, Eggenstein) utilizando cebadores oligo-dT según los datos del fabricante. El ADNc se ligó a través de adaptadores EcoRI en el vector Lambda ZAPII (Stratagene, Heidelberg).

La genoteca de ADNc se extendió en placas conforme a métodos estándares (Vogeli, G. y Kaytes, P.S. (1987). Methods Enzymol., 152:407-515) y el Lambda-ADN se inmovilizó sobre filtros de nitrocelulosa (Optitran BA-S 85, Schleicher & Schuell, Dassel).

Los oligonucleótidos arriba mencionados se marcaron radiactivamente con el uso de T4 polinucleótido-cinasa (NEBL, Schwalbach) y \gamma-^{32}P ATP (NEN Du Pont, Bruselas) (Wallace, R.B. y Miyada, C.G. (1987), Methods Enzymol. 152:432-442).

La hibridación de los filtros se efectuó en un tampón descrito para oligonuclóetidos degenerados (Wozney, J.M. (1990), Methods Enzymol. 182:738-751) con cloruro de tetrametilamonio 3 M (Roth, Karlsruhe) a 48ºC. Como se describe en la referencia arriba mencionada los filtros se lavaron, ascendiendo la temperatura de lavado a 50ºC. Después de la exposición de los filtros a una película de rayos X se manifestaron aprox. 50 clones positivos por cada 100.000 fagos extendidos en placas (Fig. 13).

Se caracterizaron adicionalmente 6 clones, transfiriéndoles en un vector de plásmido mediante escisión in vivo según el método descrito por el fabricante del vector (Stratagene, Heidelberg) y se secuenciaron con cebadores T3 y T7 (BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). Uno de los clones contenía una secuencia, cuya traducción proporcionó exactamente la secuencia peptídica buscada. Este clon se utilizó para la hibridación de un borrón de análisis Northern (Fig. 14) (Kroczek, R.A. (1993), J. Chromatogr., 618, 133-145). El modelo de expresión del ARNm correspondía exactamente a la expresión de la molécula 8F4, tal como se conocía por las investigaciones de citometría de flujo con el anticuerpo monoclonal. Dado que el clon encontrado solamente contenía el extremo 3' del ADNc buscado, se utilizó un fragmento, situado en posición 5', para el aislamiento del ADNc completo de 8F4. Se secuenciaron varios clones en las dos cadenas.

El ADNc de 8F4 (2641 nucleótidos) está representado en la Fig. 16 y en el protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO: 1 y codifica una proteína con 199 aminoácidos (nucleótidos 68-664), representada en la Fig. 15 y en el protocolo de secuencias bajo SEQ ID NO: 2. La secuenciación de varios clones independientes procedentes de la genoteca de ADNc proporcionó algunas desviaciones de la secuencia aquí mostrada que, sin embargo, se encuentran todos en la región 3'-no traducida:

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Pos. 909-910: deleción

Pos. 1631: T>C

Pos. 2074: G>T

Pos. 2240: G>C

Pos. 2633 : lugar alternativo de poliadenilación

\newpage

TABLA 1

La Tabla 1 reproduce una panorámica sobre los anticuerpos (clon) utilizados, su fuente de origen (fuente), la especificidad contra su antígeno respectivo (especificidad) y, eventualmente, su marcaje (marcador).

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}  \+ La línea de células de hibridoma se generó de forma
habitual, el anticuerpo se purificó y, eventualmente,\cr  \+ se
marcó.\cr   ^{2}  \+ dirigido contra un péptido
sintético\cr}

Los antisueros y reactivos secundarios utilizados en los Ejemplos se adquirieron de: Ig de cabra anti-ratón, conjugada con FITC, de Jackson Immuno Research Lab., EE.UU.; estreptavidina, conjugada con PE, de Jackson Immuno Research Lab., EE.UU.; fracción de Ig de conejo anti-ratón, de Sigma, Deisenhofen.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: República Federal de Alemania, representada por el Director del Instituto Robert-Koch

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(B): CALLE: Nordufer 20

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(C): LUGAR: Berlín

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(D): LAND FEDERAL: Berlín

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: 13353

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Polipéptido co-estimulante de células T, anticuerpos monoclonales, así como la preparación y su uso

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SOPORTE DE DATOS: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (OEP)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2641 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótidos

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(C): FORMA DE LA CADENA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 199 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

MGNCTSACNG AYGTNAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

MGNYTDACNG AYGTNAC

\hfill

17

Claims

1. Un anticuerpo de ratón que reconoce específicamente una molécula co-estimulante humana

a): con la actividad biológica de la co-estimulación de células T,

b): que se presenta en linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} activados, pero no sobre células B en reposo o activadas, granulocitos, monocitos, células NK o células dendríticas,

c): que presenta dos cadenas polipeptídicas, en donde la molécula mencionada tiene un peso molecular de aproximadamente 55 a 60 kDa, determinado en una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico, y en donde las dos cadenas polipeptídicas de la molécula mencionada tienen un peso molecular de aproximadamente 27 kDa y aproximadamente 29 kDa, medidos en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS reductora, y

d): que contiene una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de al menos el 80% con la secuencia en la fig. 15 que abarca 199 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), o un fragmento biológicamente activo de la misma, que muestra asimismo un efecto co-estimulante sobre linfocitos de células T, o que contiene la secuencia de aminoácidos conforme a la fig. 15 (SEQ ID NO: 2), o un fragmento biológicamente activo del mismo, que muestra asimismo un efecto co-estimulante sobre linfocitos de células T,

en donde el anticuerpo reconoce linfocitos T activados con 2 señales, pero no en reposo, y en donde el anticuerpo inhibe la actividad biológica de la molécula co-estimulante o, junto con el anticuerpo OKT3 anti-CD3 monoclonal, co-estimula linfocitos T humanos.

2. Un anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal.

3. Un anticuerpo según la reivindicación 2, en donde los linfocitos T son células T CD4^{+}.

4. Un anticuerpo según la reivindicación 2, en donde los linfocitos T son células T CD8^{+}.

5. Un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo reconoce un antígeno de aproximadamente 55-60 kDa en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS no reductora sobre linfocitos T activados.

6. Un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo reconoce un antígeno de aproximadamente 27 y aproximadamente 29 kDa en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS reductora sobre linfocitos T activados.

7. Una célula de hibridoma que genera el anticuerpo monoclonal según una de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Uso de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente una molécula co-estimulante

a): con la actividad biológica de la co-estimulación de células T,

c): que presenta dos cadenas polipeptídicas, en donde la molécula mencionada tiene un peso molecular de aproximadamente 55 a 60 kDa, determinado en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS no reductora, y en donde las dos cadenas polipeptídicas de la molécula mencionada tienen un peso molecular de aproximadamente 27 kDa y aproximadamente 29 kDa, medidos en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS reductora, y

en donde el anticuerpo reconoce linfocitos T activados con 2 señales, pero no en reposo, y en donde el anticuerpo inhibe la actividad biológica de la molécula co-estimulante o, junto con el anticuerpo OKT3 anti-CD3 monoclonal, co-estimula linfocitos T humanos, para la producción de medicamentos.

9. Uso según la reivindicación 8, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, para evitar reacciones de rechazo en trasplantes de órganos y/o para el tratamiento de una disregulación del sistema inmunitario.

10. Uso según la reivindicación 9, en donde la enfermedad autoinmune se elige de artritis reumatoide, enfermedad de Bechterew, síndrome de Sjögren y/o colitis ulcerosa.

11. Uso de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente una molécula co-estimulante

a): con la actividad biológica de la co-estimulación de células T,

d): que contiene una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de al menos el 80% con la secuencia en la fig. 15 que abarca 199 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), o un fragmento biológicamente activo de la misma, que muestra asimismo un efecto co-estimulante sobre linfocitos de células T, o que contiene la secuencia de aminoácidos conforme a la fig. 15 (SEQ ID NO: 2), o un fragmento biológicamente activo de la misma, que muestra asimismo un efecto co-estimulante sobre linfocitos de células T,

en donde el anticuerpo reconoce linfocitos T activados con 2 señales, pero no en reposo, para la preparación de un agente para el diagnóstico de enfermedades en las que participa el sistema inmunitario.

12. Uso según una de las reivindicaciones 8-11, en donde los linfocitos T son células T CD4^{+}.

13. Uso según una de las reivindicaciones 8-11, en donde los linfocitos T son células T CD8^{+}.

14. Uso según una de las reivindicaciones 8-13, en donde el anticuerpo reconoce un antígeno de aproximadamente 55-60 kDa en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS no reductora sobre linfocitos T activados.

15. Uso según una de las reivindicaciones 8-13, en donde el anticuerpo reconoce un antígeno de aproximadamente 27 y aproximadamente 29 kDa en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS reductora sobre linfocitos T activados.

16. Uso de una molécula co-estimulante

a): con la actividad biológica de la co-estimulación de células T,

para la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades cancerígenas, SIDA, enfermedades asmáticas y/o enfermedades virales crónicas tales como infecciones por VHC o VHB.

17. Uso de células que contienen una molécula co-estimulante

a): con la actividad biológica de la co-estimulación de células T,

para la preparación de medicamentos.

18. Uso de células según la reivindicación 17, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cancerígenas, SIDA, enfermedades asmáticas y/o enfermedades virales crónicas tales como infecciones por VHC o VHB.

19. Uso según la reivindicación 11, en donde para el diagnóstico se utiliza una detección ELISA, una citometría de flujo, un borrón de transferencia Western, un radioinmunoensayo, una nefelometría o una tinción histoquímica.

20. Uso de una molécula co-estimulante

a): con la actividad biológica de la co-estimulación de células T,

para la preparación in-vitro de anticuerpos.

21. Procedimiento para la producción de anticuerpos monoclonales, en el que células B de ratones, que son inmunizados con linfocitos T humanos activados con PMA y el ionóforo de Ca^{2+} ionomicina, se fusionan con una línea de células de mieloma en un hibridoma secretor de anticuerpos, y los anticuerpos monoclonales se purifican frente a células T en reposo activadas en la citometría de flujo frente a moléculas de 2 señales y se identifican como anticuerpos que reconocen específicamente una molécula co-estimulante

a): con la actividad biológica de la co-estimulación de células T,

d): que contiene una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de al menos el 80% con la secuencia en la fig. 15 que abarca 199 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), o un fragmento biológicamente activo de la misma, que muestra asimismo un efecto co-estimulante sobre linfocitos de células T, o que contiene la secuencia de aminoácidos conforme a la fig. 15 (SEQ ID NO: 2), o un fragmento biológicamente activo de la misma, que muestra asimismo un efecto co-estimulante sobre linfocitos de células T.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el anticuerpo co-estimula linfocitos T.

23. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el anticuerpo inhibe la actividad biológica de la molécula co-estimulante o, junto con el anticuerpo OKT3 anti-CD3 monoclonal, co-estimula linfocitos T humanos.

24. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que los linfocitos T son células T CD4^{+}.

25. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que los linfocitos T son células T CD8^{+}.

26. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el anticuerpo reconoce un antígeno de aproximadamente 55 a 60 kDa en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS no reductora sobre linfocitos activados.

27. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el anticuerpo reconoce un antígeno de aproximadamente 27 y aproximadamente 29 kDa en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS reductora sobre linfocitos T activados.

28. Un medicamento que contiene un anticuerpo que reconoce específicamente una molécula co-estimulante humana

a): con la actividad biológica de la co-estimulación de células T,