ES2353637T3

ES2353637T3 - Moléculas denominadas ldcam.

Info

Publication number: ES2353637T3
Application number: ES99942039T
Authority: ES
Inventors: Peter Robert Baum; William Christian Fanslow, Iii
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2011-03-03
Anticipated expiration: 2019-08-05
Also published as: NZ510356A; EP1102848A2; IL193886A; EP1102848B1; CA2337100C; IL193886A0; US20090011499A1; US20040204568A1; WO2000008158A3; JP2002523021A; US20090155845A1; ATE484587T1; JP4426724B2; US20100215572A1; IL140937A; AU5550399A; AU776825B2; IL140937A0; CA2337100A1; US20020168712A1

Abstract

Una composición que incluye una proteína que comprende los aminoácidos 39374 de SEQ ID NO: 2 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha proteína no consiste en la proteína de longitud completa codificada por el ADN depositado con el número de registro ATCC209529.

Description

5

10

15

20

25

30

1

ANTECEDENTES Campo de la Invención

La presente invención se refiere a nuevas moléculas. denominadas LDCAM, capaces de modular o alterar la función de las células T y a composiciones que comprenden dichas moléculas. Más particularmente, la presente invención implica una composición que incluye una proteína que comprende los aminoácidos 39-374 de SEQ ID NO:2 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha proteína no consiste en la proteína de longitud completa codificada por el ADN depositado con el número de registro ATCC209529, una composición que incluye una proteína que comprende los aminoácidos 39-374 de SEQ ID NO:2 conjugada con una toxina y una composición que incluye una proteína que comprende los aminoácidos 39-374 de SEQ ID NO:2 para usarse en la inhibición de una respuesta inmune mediada por células T o para la expansión de células asesinas naturales. La invención también incluye polipéptidos LDCAM que comprenden los aminoácidos 1-374 de SEQ ID NO:2 o los aminoácidos 1356 de SEQ ID NO:4 y el ADN que codifica dichas moléculas LDCAM.

Descripción de la Técnica Relacionada

Las moléculas de adhesión desempeñan papeles importantes en la señalización celular en el sistema inmune y en otros sistemas celulares. Además de las señales específicas de antígeno producidas por el complejo receptor de las células T, la forma y el tipo de respuesta inmune por las células T depende de señales coestimuladoras mediadas por las moléculas de adhesión en las células presentadoras de antígeno (APC). Una de dichas señalizaciones coestimuladoras implica las moléculas de adhesión B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) que envían señales importantes a través de sus receptores de la superficie de las células T, CD28 y CTLA4 (CD152). B7-1 interacciona con CD28 para producir la producción de citoquinas, proliferación celular, y la generación de células T efectoras y de memoria. Si se bloquea la señal a través de CD28, puede ocurrir la anergia de las células T o la desviación inmune, lo que resulta en respuestas inmunes muy deprimidas o alteradas.

B7-1 también interacciona con el receptor CTLA4 de las células T. Su señalización es compleja, pero un componente proporciona una señal de retroalimentación negativa que causa que las células T atenúen la señal de CD28. En ausencia de esta señal, la proliferación de las células T y la activación de las células efectoras continúa de manera desenfrenada. Cuando esta regulación de retroalimentación funciona mal, pueden resultar enfermedades autoinmunes y linfoproliferación. Por ejemplo, cuando se bloquea la interacción de CD28 y B7-1 (y B7-2) con un anticuerpo anti-CTLA4, se ha observado una inmunidad tumoral y una linfoproliferación incrementadas.

B7-2, que se expresa en diferentes células y en diferentes estadios de la

5 activación de APC respecto a B7-1, también transmite su señal coestimuladora a las células T a través de CD28 y CTLA4. La señal de B7-2 puede dar lugar a respuestas inmunes que son idénticas a, o diferentes de, las respuestas inmunes que resultan de la señalización de B7-1. La naturaleza de la señalización de B7-2 depende del contexto celular y de la coordinación de la coestimulación.

10 Aunque se unen a los mismos receptores celulares, B7-1 y B7-2 sólo están relacionadas débilmente a nivel de aminoácidos. Ambas, sin embargo, son miembros de la amplia superfamilia que contiene dominio de inmunoglobulina y gran parte de su homología de secuencia compartida se debe a los restos particulares que comparten sus dominios de Ig comunes, que son característicos de la subfamilia del dominio Ig.

15 Existe evidencia para sugerir que otras moléculas de adhesión son importantes en la respuesta de las células T a los antígenos. Por ejemplo, la proliferación de las células T y la producción de citoquinas que ocurre en respuesta a la unión de un receptor de células T con un antígeno puede ocurrir en ausencia de CD28 en determinadas enfermedades. La proliferación y la producción de citoquinas también ocurren en ausencia de CD28 en

20 las respuestas de memoria, y en los sistemas en los que CD28 se ha eliminado genéticamente. En algunos casos, la proliferación de las células T depende de una interacción en los sistemas CD48 o ICAM/LFA. Además, la molécula de adhesión conocida como ALCAM interacciona con su ligando de células T CD6 para modular la señal de CD3.

25 Claramente, la señalización a través de los receptores de la superficie de las células T desempeña un papel importante en el mantenimiento del equilibrio en el sistema inmune. Los sistemas con predominio de señales activadoras, tales como la señalización coestimuladora entre CD28 y B7-1, pueden dar lugar a autoinmunidad e inflamación. Los sistemas inmunes con un predominio de señales inhibidoras, tales como la señalización

30 coestimuladora entre CTLA4 son menos capaces de actuar sobre células infectadas o células cancerosas. El aislamiento de nuevas moléculas implicadas en la señalización de las células T es altamente deseable para estudiar la señal o señales biológicas transducidas a través de sus receptores. Además, la identificación de dichas moléculas proporciona un medio para regular y tratar estados patológicos asociados con la autoinmunidad, inflamación e infección.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención es como se expone en las reivindicaciones.

5 La presente invención proporciona polipéptidos de mamífero, denominados LDCAM, denominados así porque se encuentran en las células dendríticas obtenidas de linfoide y muestran una homología limitada con las moléculas de adhesión, incluyendo B7

1. Las moléculas LDCAM descritas en la presente memoria incluyen proteínas aisladas u homogéneas que se unen a sí mismas, tienen una homología limitada con B7L-1 (descrita

10 en la solicitud en tramitación con la presente S/N 60/095, 663 presentada el 7 de agosto, 1998) y para las que B7-L1 es una proteína de unión. La presente invención incluye además ADN aislados que codifican LDCAM. Además están en la presente invención composiciones farmacéuticas que comprenden formas solubles de moléculas LDCAM y composiciones para usarse en la inhibición de las respuestas inmunes de las células T.

15 También están incluidas las composiciones para usarse en la expansión de células asesinas naturales. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente memoria se proporcionan nuevas proteínas denominadas LDCAM. Además se proporcionan ADN que codifican LDCAM.

20 B7L-1, una molécula que tiene similitud de secuencia con B7-1, descrita en la solicitud en tramitación con la presente S/N 60/095, 663 presentada el 7 de agosto, 1998, es una proteína de unión para los polipéptidos LDCAM de la presente invención. Debido a que B7L-1 es una proteína de unión de LDCAM y a que B7L-1 y LDCAM muestran homología en su dominio intracelular que incluye los sitios de unión potenciales para la

25 banda 4.1 y los miembros de la familia PDZ, y se encuentran en muchos de los mismos tipos celulares, sus formas unidas a las células pueden transmitir señales similares cuando se unen. Así, se denominan co-receptores o contraestructuras. La secuencia de nucleótidos que codifica las formas extracelulares larga y corta de B7L-1 humana se presentan en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9, respectivamente. Las secuencias de

30 aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9 se muestran en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10, respectivamente. Para identificar líneas celulares a las que se une B7L-1 y para aislar posteriormente una proteína a la que se une B7L-1, se preparó una proteína de fusión

B7L-1/Fc como se describe en el Ejemplo 1 y se realizaron estudios de unión, descritos en el Ejemplo 2. El Ejemplo 3 describe el cribado de una biblioteca de ADNc preparada a partir de WI-26, una línea celular a la que se une B7L-1 y la identificación de un clon de LDCAM humana de longitud completa. La secuencia de nucleótidos que codifica LDCAM 5 humana, aislada como se describe en el Ejemplo 3, se presenta en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos codificada por ésta se presenta en SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de LDCAM humana codificada descrita en SEQ ID NO: 2 tiene un dominio extracelular predicho de 374 aminoácidos incluyendo una secuencia líder de 38 aminoácidos 1-38; un dominio transmembrana de 21 aminoácidos (375-395) y un

10 dominio citoplásmico de 47 aminoácidos (396-442). Los Ejemplos 5 y 6 describen la obtención y uso de LDCAM/Fc humana en estudios de unión para identificar las líneas celulares a las que se une LDCAM humana. Entre las líneas celulares identificadas positivamente estaban las células S49.1 y las células dendríticas linfoides de bazos y nódulos linfáticos de ratones tratados con FIt3-L.

15 El Ejemplo 7 describe el cribado de conjuntos de una biblioteca de expresión para identificar clones de LDCAM murinos. La secuencia de ADN de LDCAM murina aislada se presenta en SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 se presenta en SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de LDCAM murina codificada (SEQ ID NO: 4) tiene un dominio extracelular

20 predicho de 356 aminoácidos (restos 1-356); un dominio transmembrana de 21 aminoácidos (357-377); y un dominio citoplásmico que incluye los restos de aminoácidos 378-423). Las SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 describen las secuencias de LDCAM murina madura de longitud completa. Comparada con la secuencia de LDCAM humana, la secuencia señal no se describe completamente.

25 Las moléculas de LDCAM de mamífero purificadas descritas en la presente memoria son proteínas transmembrana de Tipo I que tienen una homología global limitada con B7-1 y otras moléculas de adhesión celular. LDCAM tiene una alta homología con la región citoplásmica de B7L-1. Como se describe a continuación en el Ejemplo 6, las proteínas LDCAM demuestran una expresión muy extendida. En particular, el ARNm

30 de LDCAM humana se encuentra en mama, retina, bazo e hígado fetal, corazón fetal, pulmón, músculo, placenta, tiroides y carcinoma de pulmón. Las líneas celulares que tienen el mensajero de LDCAM incluyen Wi-26. El ARNm de LDCAM de ratón se encuentra en embrión completo, testículos, células triple negativas, células murinas de bazo y de nódulo linfático CD8, S49.1 y dendríticas.

El descubrimiento de las secuencias de ADN descritas en las SEQ ID NO:1 y 3 permite la construcción de vectores de expresión que comprenden ADN que codifican proteínas LDCAM humanas y de ratón; células anfitrionas transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; LDCAM biológicamente activas como proteínas homogéneas; y anticuerpos inmunoreactivos con LDCAM.

Como B7L-1, LDCAM tiene una homología limitada con el receptor de poliovirus, proteína de unión delta de opioides y moléculas de adhesión. Además, como se describe en el Ejemplo 13, LDCAM bloquea la proliferación de las células T causada por ConA y PHA, lo que sugiere que LDCAM es útil en la modulación de la respuesta inmune mediada por las células T. LDCAM no inhibe la proliferación de las células T inducida por mAb TCR lo que sugiere que los efectos inhibidores de LDCAM en la proliferación de las células T inducida por mitógenos son debidos a la secreción de citoquinas, p. ej. IL-2, o debidos a la regulación de respuestas más abajo de la célula T después de la activación e incrementos en la expresión de la pareja de unión de LDCAM. Aunque no están limitados a estos, los usos particulares de las moléculas LDCAM se describen más abajo.

El término "LDCAM" se refiere a un género de polipéptidos que se unen y forman un complejo consigo mismos, polipéptidos para los que B7L-1 es una proteína de unión, y polipéptidos que alteran las señales de las células T en respuesta a antígenos y mitógenos.

El término "LDCAM murina" se refiere a productos génicos biológicamente activos del ADN de SEQ ID NO: 3 y el término "LDCAM humana" se refiere a productos génicos biológicamente activos del ADN de SEQ ID NO: 1. Englobadas en el término "LDCAM" están las proteínas solubles o truncadas que comprenden principalmente la parte de counión a B7L-1 de la proteína, retienen la actividad biológica y son capaces de secretarse y comprenden la secuencia de aminoácidos 1-374 de SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 1-356 de SEQ ID NO: 4. También están incluidas las composiciones que comprenden la proteína LDCAM que comprende los aminoácidos 39-374 de SEQ ID NO: 2.

En la realización de la invención que se refiere a una composición que incluye una proteína LDCAM que comprende los aminoácidos 39-374 de SEQ ID NO: 2 y un diluyente

o vehículo farmacéuticamente aceptable, la proteína no consiste en la proteína de longitud completa codificada por el ADN depositado con el número de registro ATCC209529. En una realización más, la invención se refiere a composiciones que incluyen cualquier proteína que comprende los aminoácidos 39-374 de SEQ ID NO: 2 conjugada con una toxina y composiciones que incluyen cualquier proteína que comprende los aminoácidos 39-374 de SEQ ID NO: 2 para inhibir una respuesta inmune mediada por las células T o

5 para la expansión de células asesinas naturales. El término "biológicamente activo" cuando se refiere a LDCAM, significa que LDCAM es capaz de alterar las señales de las células T en respuesta a mitógenos. "Aislado" significa que LDCAM no está asociada con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, como un producto de purificación de cultivo de células 10 anfitrionas recombinantes o como un extracto purificado.

Una "variante de LDCAM" como se refiere en la presente memoria, significa un polipéptido sustancialmente homólogo a LDCAM nativa, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la de LDCAM nativa (humana, murina o de otra especie de mamífero) debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones. La secuencia de

15 aminoácidos variante es preferiblemente al menos 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos de LDCAM nativa, lo más preferiblemente al menos 90% idéntica. El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, comparando la información de secuencia usando el programa informático GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible en el Genetics Computer Group de la

20 Universidad de Wisconsin (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como describen Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical

25 Research Foundation, p. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3.0 para cada hueco y una penalización adicional de 0.10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para los huecos finales. Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas de manera conservativa, lo que significa que un resto de aminoácido dado se reemplaza por un resto que tiene unas características fisicoquímicas similares. Los

30 ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala entre sí, o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras sustituciones conservativas como estas, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de

hidrofobicidad similares, son muy conocidas. Las variantes o alelos de LDCAM naturales también están englobados en la invención. Los ejemplos de dichas variantes son proteínas que resultan de eventos de corte y empalme de ARNm alternativos o de la escisión proteolítica de la proteína LDCAM, en las que se retiene la propiedad de unión de 5 LDCAM. El corte y empalme del ARNm alternativo puede dar lugar a una proteína LDCAM truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble natural de la proteína, por ejemplo. Las variaciones que pueden atribuirse a proteolisis, incluyen, por ejemplo, diferencias en el extremo N o C terminal después de la expresión en diferentes tipos de células anfitrionas, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos

10 terminales de la proteína LDCAM (generalmente de 1-5 aminoácidos terminales). El Ejemplo 9 describe la construcción de una nueva proteína de fusión LDCAM/Fc que puede utilizarse en los estudios de unión de LDCAM y en estudios dirigidos a examinar las características funcionales de la molécula. Otras regiones Fc de anticuerpo pueden sustituirse por la región Fc de IgG1 humana descrita en el Ejemplo. Otras

15 regiones Fc adecuadas son las que pueden unirse con alta afinidad a la proteína A o proteína G, o las que incluyen fragmentos de la región Fc de IgG1 humana o murina, p. ej., fragmentos que comprenden al menos la región bisagra de manera que se formarán enlaces disulfuro intercadena. La proteína de fusión LDCAM ofrece la ventaja de que puede purificarse fácilmente. Además, se forman enlaces disulfuro entre las regiones Fc

20 de dos cadenas de proteínas de fusión separadas, creando dímeros. Como se ha descrito anteriormente, un aspecto de la invención es polipéptidos LDCAM solubles. Los polipéptidos LDCAM solubles comprenden todo o parte del dominio extracelular de una LDCAM nativa pero carecen de la señal que causaría la retención del polipéptido en una membrana celular. Los polipéptidos LDCAM solubles comprenden

25 ventajosamente el péptido señal nativo (o un heterólogo) cuando se sintetizan inicialmente para estimular la secreción, pero el péptido señal se escinde después de la secreción de LDCAM de la célula. Los polipéptidos LDCAM solubles englobados en la invención retienen la capacidad de unirse a B7L-1, o la capacidad de unirse a sí mismos. Alternativamente, los polipéptidos LDCAM solubles de la presente invención retienen la

30 capacidad de alterar las respuestas de las células T. LDCAM soluble puede incluir parte de la señal o parte del dominio citoplásmico u otras secuencias, siempre que la proteína LDCAM soluble pueda secretarse.

LDCAM soluble puede identificarse (y distinguirse de sus equivalentes no solubles unidos a membrana) separando las células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, p. ej., por centrifugación, y ensayando el medio o sobrenadante para detectar la presencia de la proteína deseada. La presencia de LDCAM en el medio indica que la proteína se ha secretado de las células y es así una forma soluble de la proteína deseada.

Las formas solubles de LDCAM poseen muchas ventajas respecto a la proteína LDCAM nativa unida. La purificación de las proteínas a partir de células anfitrionas recombinantes es factible, ya que las proteínas solubles se secretan de las células. Además, las proteínas solubles son generalmente más adecuadas para la administración intravenosa.

Los ejemplos de polipéptidos LDCAM solubles incluyen los que comprenden una parte sustancial del dominio extracelular de una proteína LDCAM nativa. Por ejemplo, una proteína LDCAM soluble humana comprende los aminoácidos 38-374 ó 1-374 de SEQ ID NO:2 y una LDCAM soluble murina incluye los aminoácidos 1-356 de SEQ ID NO: 4. Además, las proteínas LDCAM solubles truncadas que comprenden menos del dominio extracelular entero están incluidas en la invención. Cuando se expresa inicialmente en una célula anfitriona, LDCAM soluble puede incluir uno de los péptidos señal heterólogos descritos a continuación que es funcional en las células anfitrionas empleadas. Alternativamente, la proteína puede comprender el péptido señal nativo. En una realización de la invención, LDCAM soluble puede expresarse como una proteína de fusión que comprende (desde el N al C terminal) el péptido señal del factor � de levaduras, un péptido FLAG® descrito a continuación y en la Patente de EEUU No.

5.011.912 y LDCAM soluble que consiste en los aminoácidos 39-374 de SEQ ID NO: 2 ó 21-356 de SEQ ID NO: 4. Esta proteína de fusión recombinante se expresa en y se secreta de células de levadura. El péptido FLAG® facilita la purificación de la proteína, y posteriormente puede escindirse de la LDCAM soluble usando enteroquinasa mucosal bovina. Las secuencias de ADN aislado que codifican proteínas LDCAM solubles están englobadas en la invención.

LDCAM truncada, incluyendo polipéptidos solubles, puede prepararse mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Una secuencia de ADN deseada puede sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas por sí mismas. También pueden producirse fragmentos de ADN por digestión con endonucleasas de restricción de una

secuencia de ADN clonada de longitud completa y aislarse mediante electroforesis en geles de agarosa. Pueden emplearse conectores que contienen sitio(s) de escisión por endonucleasas de restricción para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión, o el fragmento puede digerirse en los sitios de escisión que están presentes de 5 forma natural en él. El procedimiento muy conocido de la reacción en cadena de la polimerasa también puede emplearse para amplificar una secuencia de ADN que codifica un fragmento de proteína deseado. Como una alternativa más, pueden emplearse técnicas de mutagénesis conocidas para insertar un codón de parada en un punto deseado, p. ej., inmediatamente después del extremo 3' del codón del último aminoácido

10 del dominio de unión al receptor. Es posible obtener polipéptidos LDCAM aislados u homogéneos, tanto recombinantes como no recombinantes, así como variantes y derivados de proteínas LDCAM nativas que retengan la actividad biológica deseada. Dicha actividad incluye la capacidad de LDCAM de unirse a sí misma, o la capacidad de unirse a B7L-1, o la

15 capacidad de alterar la señalización de las células T. Las variantes y derivados de LDCAM pueden obtenerse por mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos LDCAM nativos. Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa puede conseguirse mediante cualquiera de varios métodos convencionales. Las mutaciones pueden introducirse en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que

20 contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permitan la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada. Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específica

25 de sitio dirigida por oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado en el que pueden alterarse codones predeterminados por sustitución, deleción o inserción. Los métodos ejemplares para obtener las alteraciones mostradas anteriormente se describen en Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum

30 Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad, Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); y Patentes de EEUU Nos. 4.518.584 y 4.737.462. LDCAM puede modificarse para crear derivados de LDCAM formando conjugados covalentes o de agregados con otros restos químicos, tal como grupos glicosilo, lípidos,

fosfato, grupos acetilo y semejantes. Los derivados covalentes de LDCAM pueden prepararse uniendo los restos químicos a grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos de LDCAM o en el extremo N terminal o C terminal de un polipéptido LDCAM

o el dominio extracelular de ésta. Otros derivados de LDCAM dentro del alcance de esta

5 invención incluyen conjugados covalentes o de agregados de LDCAM o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tal como por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N terminales o C terminales. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia polipeptídica señal o líder (p. ej. el líder del factor a de Saccharomyces) en el extremo N terminal de un polipéptido LDCAM. El péptido señal o líder dirige durante la

10 traducción o después de la traducción la transferencia del conjugado desde su sitio de síntesis hasta un sitio dentro o fuera de la membrana celular o pared celular.

Las fusiones de polipéptido LDCAM pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de LDCAM. Dichos péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénica descritos en la Patente de EEUU No.

15 5.011.912 y en Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988. La invención incluye además polipéptidos LDCAM con o sin un patrón de glicosilación nativo asociado. LDCAM expresada en sistemas de expresión de levaduras o mamíferos (p. ej., células COS-7) puede ser similar a o significativamente diferente de un polipéptido LDCAM nativo en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la

20 elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos LDCAM en sistemas de expresión bacterianos, tal como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas. Las construcciones equivalentes de ADN que codifican varias adiciones o sustituciones de restos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de restos o secuencias terminales o internos que no son necesarias para la actividad biológica o

25 unión están englobadas en la invención. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular de LDCAM pueden modificarse para descartar la glicosilación, lo que permite la expresión de un análogo carbohidrato reducido en sistemas de expresión de mamíferos y levaduras. Los sitios de N-glicosilación en los polipéptidos eucariotas se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido

30 excepto Pro e Y es Ser o Thr. El polipéptido LDCAM humano de SEQ ID NO: 2 incluye seis de dichos tripletes, en los aminoácidos 67-69, 101-103, 113-115, 165-167, 304-306 y 308-310. De manera similar, el polipéptido LDCAM murino de SEQ ID NO: 4 incluye seis de dichos tripletes en 49-51, 83-85, 95-97, 147-149, 286-288 y 290-292. Las

sustituciones, adiciones o deleciones apropiadas de la secuencia de nucleótidos que codifica estos tripletes resultarán en la prevención de la unión de los restos de carbohidrato en la cadena lateral de Asn. La alteración de un único nucleótido, elegido de manera que Asn se reemplaza por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente 5 para inactivar un sitio de N-glicosilación. Los procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen los descritos en la Patente de EEUU

5.071.972 y EP 276.846. En otro ejemplo, las secuencias que codifican restos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden alterarse para causar que los restos de Cys

10 sean delecionados o reemplazados por otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos después de la renaturalización. Otros equivalentes se preparan por modificación de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes para incrementar la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad proteasa KEX2. EP 212.914 describe el uso de mutagénesis

15 específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 se inactivan delecionando, añadiendo o sustituyendo restos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg para eliminar la incidencia de estos restos básicos adyacentes. Los pares Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escisión por KEX2 y la conversión de Arg-Lys

20 o Lys-Arg a Lys-Lys representa un método conservativo y preferido para inactivar los sitios KEX2. Las secuencias de ácido nucleico que pueden mostrarse útiles incluyen secuencias de ADN y ARN aisladas que hibridan con las secuencias de nucleótidos de LDCAM descritas en la presente memoria bajo condiciones de moderada o alta

25 astringencia y que codifican LDCAM biológicamente activa. Las condiciones de astringencia moderada, como se definen por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, p. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), incluyen el uso de una disolución de prelavado de 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) y condiciones de hibridación de aproximadamente 55 C, 5 X SSC, toda la noche. Las

30 condiciones de astringencia alta incluyen temperaturas más altas de hibridación y lavado. El experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración de sal en la disolución de lavado pueden ajustarse según sea necesario según factores tales como la longitud de la molécula de ácido nucleico.

Debido a la conocida degeneración del código genético en el que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede ser distinta de las mostradas en SEQ ID NO: 1 y 3 y aún así codificar una proteína LDCAM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ D NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Dichas

5 secuencias de ADN variantes pueden resultar de mutaciones silenciosas (p. ej., que ocurren durante la amplificación por PCR), o pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.

Las secuencias de ADN equivalentes aisladas que codifican LDCAM biológicamente activa pueden seleccionarse de: (a) ADNc que comprende la secuencia de 10 nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3; (b) ADN capaz de hibridar con un ADN de (a) bajo condiciones moderadamente astringentes y que codifica LDCAM biológicamente activa; y (c) ADN que está degenerado como resultado del código genético de un ADN definido en (a), o (b) y que codifica LDCAM biológicamente activa. Las proteínas LDCAM codificadas por dichas secuencias equivalentes de ADN están

15 englobadas en la invención. Los ADN que son equivalentes a la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 hibridarán bajo condiciones moderadamente y altamente astringentes con secuencias de ADN que codifican polipéptidos que comprenden SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4. Los ejemplos de proteínas LDCAM codificadas por dicho ADN, incluyen, pero no

20 están limitados a, fragmentos de LDCAM (incluyendo fragmentos solubles) y proteínas LDCAM que comprenden sitio(s) de N-glicosilación inactivado(s), sitio(s) de procesamiento de proteasa KEX2 inactivado(s), o sustitución o sustituciones conservativas de aminoácidos, como se ha descrito anteriormente. Las proteínas LDCAM codificadas por ADN obtenido de otras especies de mamíferos, en el que el ADN hibridará

25 con el ADNc de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 también están englobadas en la presente invención. Las variantes que poseen la capacidad de unirse a B7L-1 pueden identificarse por cualquier ensayo adecuado. La actividad biológica de LDCAM puede determinarse, por ejemplo, por competición para unirse al dominio de unión de B7L-1 (es decir, ensayos de

30 unión competitiva). Un tipo de un ensayo de unión competitiva para un polipéptido LDCAM usa una LDCAM soluble marcada radiactivamente y células intactas que expresan B7L-1. En lugar de células intactas, podrían sustituirse las proteínas de fusión solubles B7L-1/Fc tal como

B7L-1/Fc unida a una fase sólida a través de la interacción de una Proteína A, Proteína G

o un anticuerpo frente a las partes B7L-1 o Fc de la molécula, con la región Fc de la proteína de fusión. Otro tipo de ensayo de unión competitiva utiliza un receptor de LDCAM soluble marcado radiactivamente y células intactas que expresan LDCAM.

5 Los ensayos de unión competitiva pueden realizarse según metodología convencional. Por ejemplo, puede usarse LDCAM marcada radiactivamente para competir con un homólogo LDCAM potencial para ensayar la actividad de unión frente a B7L-1 o un receptor de LDCAM unido a la superficie. Pueden obtenerse resultados cualitativos por ensayos de unión competitiva en placas autorradiográficas, o pueden utilizarse gráficos de

10 Scatchard para generar resultados cuantitativos. Alternativamente, las proteínas de unión a LDCAM, tales como B7L-1 y anticuerpos anti-LDCAM, pueden unirse a una fase sólida tal como una matriz de columna de cromatografía o un sustrato similar adecuado para identificar, separar o purificar las células que expresan LDCAM en su superficie. La unión de una proteína de unión a

15 LDCAM, a una superficie de contacto de una fase sólida puede conseguirse por cualquier medio, por ejemplo, construyendo una proteína de fusión B7L-1/Fc y uniendo ésta a la fase sólida a través de la interacción de Proteína A o Proteína G. Se conocen en la técnica varios medios diferentes para fijar proteínas a una fase sólida y son adecuados para usarse en la presente invención. Por ejemplo, pueden recubrirse microesferas

20 magnéticas con B7L-1 y mantenerse en el recipiente de incubación mediante un campo magnético. Las suspensiones de mezclas celulares que contienen células que expresan LDCAM se ponen en contacto con la fase sólida que tiene en ella polipéptidos B7L-1. Las células que tienen LDCAM en su superficie se unen al B7L-1 fijado y las células no unidas se eliminan por lavado. Este método de unión por afinidad es útil para purificar, cribar o

25 separar dichas células que expresan LDCAM de la disolución. Los métodos para liberar células seleccionadas positivamente de la fase sólida son conocidos en la técnica y engloban, por ejemplo, el uso de enzimas. Dichas enzimas son preferiblemente no tóxicas y no dañinas para las células y están dirigidas preferiblemente a escindir la pareja de unión en la superficie celular. En el caso de las interacciones B7L-1:LDCAM, la enzima

30 preferiblemente libera la suspensión celular resultante del material LDCAM. La población celular purificada, especialmente si se obtiene a partir de tejido fetal, puede usarse para repoblar tejidos maduros (adultos).

Alternativamente, pueden incubarse en primer lugar mezclas de células que se sospecha que contienen células LDCAM+ con B7L-1 biotinilado. Los periodos de incubación son típicamente de al menos una hora de duración para asegurar una unión suficiente a LDCAM. La mezcla resultante se pasa a través de una columna empaquetada

5 con lechos recubiertos con avidina, mediante los cuales la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de la célula a los lechos. El uso de lechos recubiertos con avidina se conoce en la técnica. Véase Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). El lavado del material no unido y la liberación de las células unidas se realiza usando métodos convencionales.

10 Como se ha descrito anteriormente, B7L-1 puede usarse para separar las células que expresan LDCAM, y,. En un método alternativo, LDCAM o un dominio extracelular o un fragmento de ésta, puede conjugarse con un resto detectable tal como 125I para detectar las células que expresan B7L-1. El marcaje radiactivo con 125I puede realizarse

125I

mediante cualquiera de varias metodologías estándar que rinden una molécula

15 LDCAM funcional marcada con una actividad específica alta. O podría usarse un anticuerpo yodado o biotinilado frente a la región B7L-1 o la región Fc de la molécula. Puede usarse otro resto detectable tal como una enzima que pueda catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células que se van a ensayar para detectar la expresión de B7L-1 pueden ponerse en contacto con LDCAM marcada.

20 Después de la incubación, LDCAM marcada no unida se elimina y la unión se mide usando el resto detectable. Las características de unión de LDCAM (incluyendo las variantes) también puede determinarse usando LDCAM/Fc soluble conjugada (por ejemplo, 125I-LDCAM/Fc) en ensayos de competición similares a los descritos anteriormente. En este caso, sin

25 embargo, las células intactas que expresan LDCAM/Fc unidas a un sustrato sólido, se usan para medir el grado en el que una muestra que contiene una variante potencial de LDCAM compite para unirse con una pareja de unión conjugada soluble de LDCAM.

Otros medios para ensayar LDCAM incluyen el uso de anticuerpos anti-LDCAM, líneas celulares que proliferan en respuesta a LDCAM, o líneas celulares recombinantes 30 que proliferan en presencia de LDCAM.

Las proteínas LDCAM descritas en la presente memoria también pueden emplearse para medir la actividad biológica de B7L-1 u otras proteínas de unión de LDCAM en términos de su afinidad de unión para LDCAM. Como ejemplo, LDCAM puede usarse para determinar si la actividad biológica se retiene después de la modificación de B7L-1 (p. ej., modificación química, truncamiento, mutación, etc.). La actividad biológica de una proteína B7L-1 puede averiguarse así antes de ser usada en un estudio de investigación, o posiblemente en clínica, por ejemplo.

5 Las proteínas LDCAM encuentran un uso como reactivos que pueden emplearse por las personas que realizan estudios de "evaluación de la calidad", p. ej., para monitorizar la vida y estabilidad a temperatura ambiente de B7L-1 u otra proteína de unión de LDCAM bajo diferentes condiciones. Como ilustración, LDCAM puede emplearse en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de una proteína B7L-1 que

10 se ha almacenado a diferentes temperaturas, o producido en diferentes tipos celulares. La afinidad de unión de la proteína B7L-1 modificada para LDCAM se compara con la de una proteína B7L-1 no modificada para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones en la actividad biológica de B7L-1. Asimismo, la actividad biológica de una proteína LDCAM puede evaluarse usando B7L-1.

15 Los polipéptidos LDCAM también encuentran uso como vehículos para administrar agentes unidos a ellos a células T u otras células que presenten B7L-1 o LDCAM. Las proteínas LDCAM pueden usarse para administrar agentes de diagnóstico o terapéuticos a esas células en procedimientos in vitro o in vivo. Como se describe en el Ejemplo 5, LDCAM se encuentra en la línea celular PAE81BM, que es una línea celular transformada

20 con EBV. Así, un ejemplo de dicho uso como vehículo es exponer esta línea celular a un conjugado agente terapéutico/LDCAM para evaluar si el agente presenta citotoxicidad frente a cualquier cáncer EBV. Además, como LDCAM se expresa en las células dendríticas y células B activadas CD40L que son importantes en la presentación del antígeno, LDCAM es un vehículo útil para la elección, identificación y purificación de estas

25 células. También, los conjugados LDCAM/agente de diagnóstico pueden emplearse para detectar la presencia de células dendríticas y células B in vitro o in vivo. El Ejemplo 6 demuestra que se encuentran transcritos de ARNm de LDCAM humana en mama, retina, hígado fetal, bazo, corazón fetal, pulmón, placenta, tiroides y carcinoma de pulmón humanos. Estudios similares para la expresión de ARNm de LDCAM de ratón, mostraron

30 que el ARNm de LDCAM de ratón se encuentra en embrión completo, testículos, células dendríticas linfoides y células triple negativas. Como LDCAM se une a sí misma, LDCAM puede usarse para estudiar su papel funcional en estos tejidos.

Pueden usarse varios agentes terapéuticos diferentes u otros marcadores funcionales unidos a LDCAM en conjugados en un ensayo para detectar y comparar los efectos citotóxicos de los agentes en las células o estudiar el papel de LDCAM en tejidos y células. Los agentes de diagnóstico y terapéuticos que pueden unirse a un polipéptido LDCAM incluyen, pero no están limitados a, fármacos, toxinas, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y semejantes, eligiéndose el agente particular según la aplicación pretendida. Los ejemplos de fármacos incluyen los usados para tratar varias formas de cáncer, p. ej., mostazas de nitrógeno tal como mostaza de nitrógeno de L-fenilalanina o ciclofosfamida, agentes intercalantes tales como cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo, alcaloides de vinca tales como vincristina, y antibióticos tales como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, y derivados de estos. Entre las toxinas están ricino, abrina, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactivadoras ribosomales, micotoxinas tales como tricotecenos, y derivados y fragmentos (p. ej., cadenas únicas) de éstas. Los radionúclidos adecuados para uso en diagnóstico incluyen, pero no están

123I, 131I, 99mTc, 111In, y

limitados a, 76Br. Los radionúclidos adecuados para uso en terapéutica incluyen, pero no están limitados a, 131I, 211At, 77Br, 186Re, 188Re, 212Pb, 212Bi,

109Pd, 64Cu, y 67Cu.

Dichos agentes pueden unirse a LDCAM por cualquier procedimiento convencional adecuado. LDCAM, al ser una proteína, comprende grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos que pueden reaccionar con grupos funcionales en un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. Alternativamente, la proteína o agente pueden derivatizarse para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivatización puede implicar la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponibles para unir varias moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen varias técnicas para marcar radiactivamente proteínas. Los metales radionúclidos pueden unirse a LDCAM usando un agente quelante bifuncional adecuado, por ejemplo.

Se preparan así conjugados que comprenden LDCAM y un agente de diagnóstico

o terapéutico adecuado (preferiblemente unido covalentemente). Los conjugados se administran o se emplean de otra manera en una cantidad apropiada para la aplicación particular.

Como se ha mencionado anteriormente, debido a que LDCAM bloquea la proliferación de las células T causada por ConA y PHA y no inhibe la proliferación de las células T inducida por mAb TCR, los efectos inhibidores de LDCAM en la proliferación de las células T inducida por mitógenos se debe probablemente a la inhibición de la

5 secreción de citoquinas, p. ej. IL-2. De acuerdo con esto, otro uso de LDCAM de la presente invención es como una herramienta de investigación para estudiar el papel que desempeña LDCAM en la producción de IL-2 en las células T. Los polipéptidos LDCAM de la presente invención también pueden emplearse en ensayos in vitro para la detección de B7L-1 o de interacciones de éste.

10 Las realizaciones de la presente invención son útiles para llevar a cabo un método para tratar trastornos asociados con un mal funcionamiento del sistema inmune. Más particularmente, como se sabe que LDCAM bloquea las células T estimuladas con ConA y las células T estimuladas con PHA, LDCAM puede ser útil para tratar trastornos inflamatorios y autoinmunes mediados por respuestas de células T. Una composición que

15 incluye una proteína LDCAM, preferiblemente un polipéptido soluble, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable puede administrarse a un mamífero para tratar dicho trastorno inflamatorio o autoinmune.

Los ratones SCID a los que se ha inyectado LDCAM soluble en la forma de LDCAM/Fc, experimentan un incremento en la celularidad esplénica. Parte de este 20 incremento se debe a un incremento en células DX-5+, también conocidas como células asesinas naturales (células NK). Cuando se les inyecta LDCAM/Fc e IL-5, un factor de crecimiento de las células NK, los ratones SCID demuestran un incremento en las células NK que es aditivo. Esto pone de manifiesto adicionalmente la capacidad de LDCAM, fragmentos de LDCAM y LDCAM soluble para generar células NK. A la vista de este 25 descubrimiento, otra realización de la presente invención incluye métodos para incrementar el número de células NK en un individuo mediante la administración a ese individuo de composiciones farmacéuticas de la presente invención que contienen LDCAM, LDCAM soluble o fragmentos de LDCAM. En otra realización, se puede incrementar las células NK ex vivo poniendo en contacto las células NK con LDCAM o 30 formas solubles de LDCAM y permitiendo que las células NK se expandan. De manera similar, las células NK pueden generarse in vivo o ex vivo, como se acaba de describir, mediante la administración de LDCAM o formas solubles de LDCAM junto con citoquinas

o factores de crecimiento adicionales. Así, los presentes métodos para generar células NK, in vivo o ex vivo pueden incluir además el uso de una cantidad eficaz de una citoquina en combinación secuencial o simultánea con LDCAM. Dichas citoquinas incluyen, pero no están limitadas a, interleuquinas ("IL") IL-15, IL-3 e IL-4, un factor estimulante de colonias ("CSF") seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos ("GM-CSF") o fusiones GM-CSF/IL-3 u otras citoquinas tales como TNF-�, proteínas de unión a CD40 (p. ej. CD40-L), antagonistas de 4-IBB (p. ej. anticuerpos inmunorreactivos con 4-IBB y 4-IBB-L) o ligando c-kit.

Las células NK son linfocitos grandes granulares que son distintos de los linfocitos T o B en morfología y función. Las células NK median la eliminación de determinadas células tumorales y células infectadas por virus de maneras no restringidas por MHC. Además, las células NK están implicadas en el rechazo de células donantes por receptores de transplante de médula ósea. Como LDCAM incrementa los números de las células NK, LDCAM, LDCAM soluble o los fragmentos de LDCAM son útiles para combatir células infectadas por virus y enfermedades infecciosas. De manera similar, LDCAM, LDCAM soluble y los fragmentos de LDCAM son útiles para matar células tumorales. De acuerdo con esto, se describen métodos para tratar enfermedades infecciosas y métodos para tratar individuos que padecen tumores. Dichos métodos terapéuticos implican administrar LDCAM, formas solubles de LDCAM o fragmentos de LDCAM a un individuo que necesita incrementar sus números de células NK con el fin de eliminar células tumorales o incrementar su capacidad para combatir una enfermedad infecciosa. De manera similar, los métodos terapéuticos pueden llevarse a cabo mediante la administración de LDCAM, LDCAM soluble, p. ej. proteína de fusión de LDCAM o fragmentos de LDCAM en combinación secuencial o simultánea con citoquinas. Dichas citoquinas incluyen, pero no están limitadas a, interleuquinas ("IL") IL-15, IL-3 e IL-4, un factor estimulante de colonias ("CSF") seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos ("GM-CSF") o fusiones GM-CSF/IL3 u otras citoquinas tales como TNF-�, proteínas de unión a CD40 (p. ej. CD40-L), antagonistas de 4-IBB (p. ej. anticuerpos inmunorreactivos con 4-IBB y 4-IBB-L) o ligando c-kit.

Se describen además métodos para prevenir o disminuir el efecto del rechazo de transplante de órganos y médula ósea por los receptores del transplante. Dichos métodos implican tratar a los receptores con una composición que incluye un inhibidor de LDCAM,

inhibiendo así los incrementos en las poblaciones de células NK y disminuyendo la capacidad de las células NK de rechazar los transplantes. Los polipéptidos LDCAM de la invención pueden formularse según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. LDCAM puede

5 combinarse mezclado, bien como el único material activo o con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (p. ej., Timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o vehículos. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed. 1980, Mack Publishing Co.

10 Además, dichas composiciones pueden contener LDCAM formando un complejo con polietilen glicol (PEG), iones metálicos, o estar incorporada en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o estar incorporada en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, eritrocitos fantasma o esferoblastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, solubilidad,

15 estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de aclaramiento in vivo de LDCAM. LDCAM también puede conjugarse con anticuerpos frente a receptores específicos de tejido, ligandos o antígenos, o acoplarse a ligandos de receptores específicos de tejido. Cuando una proteína de unión de LDCAM se encuentra en células tumorales, LDCAM puede conjugarse con una toxina por lo que LDCAM se usa para administrar la toxina al

20 sitio específico o puede usarse para sensibilizar dichas células tumorales frente a agentes administrados posteriormente. LDCAM puede administrarse tópicamente, parenteralmente o por inhalación. El término "parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección intracisternal o técnicas de infusión. Estas composiciones contendrán

25 típicamente una cantidad eficaz de LDCAM, sola o en combinación con una cantidad eficaz de cualquier otro material activo. Dichas dosificaciones y concentraciones de fármaco deseadas contenidas en las composiciones pueden variar dependiendo de muchos factores, incluyendo el uso pretendido, el peso corporal y edad del paciente y la vía de administración. Las dosis preliminares pueden determinarse según ensayos en

30 animales y el escalado de las dosificaciones para la administración a seres humanos puede realizarse según las prácticas aceptadas en la técnica. Los polipéptidos LDCAM pueden existir como oligómeros, tales como dímeros o trímeros unidos covalentemente o unidos no covalentemente. Los oligómeros pueden

estar unidos por enlaces disulfuro formados entre los restos de cisteína de diferentes polipéptidos LDCAM. En una realización de la invención, se crea un dímero de LDCAM fusionando LDCAM con la región Fc de un anticuerpo (p. ej., IgG1) de manera que no interfiera con la unión de LDCAM a las células T, B7L-1 o a sí misma. El polipéptido Fc se 5 fusiona preferiblemente con el extremo C terminal de una LDCAM soluble (que comprende sólo la unión al receptor). Se ha descrito la preparación general de las proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados con varias partes de polipéptidos obtenidos de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc), p. ej., por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991) y Bym et al. (Nature 344: 677, 1990). Una 10 fusión génica que codifica la proteína de fusión LDCAM:Fc se inserta en un vector de expresión apropiado. Se permite que las proteínas de fusión LDCAM:Fc se ensamblen como moléculas de anticuerpo, con lo cual se forman enlaces disulfuro intercadena entre los polipéptidos Fc, dando lugar a LDCAM divalente. Si las proteínas de fusión están formadas tanto por cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un

15 oligómero de LDCAM con hasta cuatro regiones extracelulares de LDCAM. Alternativamente, se pueden unir dos dominios solubles de LDCAM con un conector peptídico. Las células anfitrionas adecuadas para la expresión de polipéptidos LDCAM incluyen células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Los vectores de

20 clonación y expresión apropiados para usarse con anfitriones celulares bacterianos, de hongos, de levadura y mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York (1985). También podrían emplearse sistemas de traducción sin células para producir polipéptidos LDCAM usando ARN obtenidos de construcciones de ADN descritas en la presente memoria.

25 Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células anfitrionas procariotas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y otras especies más de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula anfitriona procariota, tal como E. coli, un polipéptido LDCAM puede incluir un

30 resto de metionina N terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula anfitriona procariota. La Met N terminal puede escindirse del polipéptido LDCAM recombinante expresado.

Los polipéptidos LDCAM pueden expresarse en células anfitrionas de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (p. ej., S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de levaduras, tales como Pichia, K. lactis o Kluyveromyces. Los vectores de levadura contendrán habitualmente una secuencia de origen de replicación de

5 un plásmido de levadura 2µ, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para los vectores de levadura, incluyen, entre otras, promotores para metalotioneína, 3fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas

10 glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para usarse en la expresión en

15 levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman, EPA-73.657 o en Fleer et al., Gene,

107: 285-195 (1991); y van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135-139 (1990). Otra alternativa es el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). Los vectores lanzadera que pueden replicarse tanto en levaduras como en E. coli pueden construirse insertando

20 secuencias de ADN de pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Ampr y origen de replicación) en los vectores de levadura descritos anteriormente. La secuencia líder del factor � de levaduras puede emplearse para dirigir la secreción del polipéptido LDCAM. La secuencia líder del factor � se inserta habitualmente entre la secuencia promotora y la secuencia génica estructural. Véanse, p. ej., Kurjan et

25 al., Cell 30: 933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984; Patente de EEUU 4.546.082; y EP 324.274. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de anfitriones de levadura son conocidas por el experto en la técnica. Una secuencia líder puede modificarse cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con

30 el gen estructural. Los protocolos para la transformación de levaduras son conocidos por el experto en la técnica. Uno de dichos protocolos lo describe Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 75: 1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes Trp+ en un medio selectivo, en el que el medio selectivo consiste en 0,67% base nitrogenada de levadura, 0,5% casaminoácidos, 2% glucosa, 10 µg/ml adenina y 20 µg/ml uracilo.

Las células anfitrionas de levadura transformadas con vectores que contienen la

5 secuencia promotora ADH2 pueden crecerse para inducir la expresión en un medio "enriquecido". Un ejemplo de un medio enriquecido es uno que consiste en 1% extracto de levadura, 2% peptona, y 1% glucosa suplementado con 80 µg/ml adenina y 80 µg/ml uracilo. La desrepresión del promotor ADH2 ocurre cuando se agota la glucosa del medio.

También podrían emplearse sistemas de cultivo de células anfitrionas de

10 mamífero o insecto para expresar los polipéptidos LDCAM recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto los han revisado Luckow y Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). También pueden emplearse líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas celulares anfitrionas de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono

15 (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CV-1/EBNA-1 obtenida de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como describen McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991).

20 Las secuencias de control de la transcripción y traducción para los vectores de expresión en células anfitrionas de mamífero pueden escindirse de los genomas virales. Las secuencias promotoras y las secuencias amplificadoras usadas comúnmente se obtienen del virus del Polioma, Adenovirus 2, Virus de Simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN obtenidas del genoma viral de SV40, por ejemplo, el

25 origen SV40, promotor temprano y tardío, amplificador, sitios de corte y empalme y de poliadenilación, pueden usarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia génica estructural en una célula anfitriona de mamífero. Los promotores virales temprano y tardío son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen

30 de replicación viral (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40 más cortos o más largos, siempre que esté incluida la secuencia de

aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio BgI I localizado en el sitio del origen de replicación viral de SV40. Los vectores de expresión ejemplares para usarse en células anfitrionas de mamíferos pueden construirse como describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280,

5 1983). Un sistema útil para la expresión estable con un alto nivel de ADNc de mamíferos en células epiteliales mamarias murinas C127 puede construirse sustancialmente como describen Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Un vector de alta expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312: 768, 1984 se ha depositado como ATCC 39890. Vectores de expresión en mamíferos útiles adicionales se describen en EP

10 A-0367566 y en la Solicitud de Patente de EEUU Serie No. 07/701.415, presentada el 16 de mayo, 1991. Los vectores pueden obtenerse de retrovirus. En lugar de la secuencia señal nativa y además de una metionina iniciadora, puede añadirse una secuencia señal heteróloga, tal como la secuencia señal para IL-7 descrita en la Patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de IL-2 descrita por Cosman et al.,

15 Nature 312: 768 (1984); el péptido señal de IL-4 descrito en EP 367.566; el péptido señal del receptor de IL-1 tipo 1 descrito en la Patente de EEUU 4.968.607; y el péptido señal del receptor de IL-1 tipo II descrito en EP 460.846. LDCAM como una proteína aislada, purificada u homogénea según la invención puede producirse por sistemas de expresión recombinantes como se ha descrito

20 anteriormente o purificarse a partir de células naturales. LDCAM puede purificarse hasta homogeneidad sustancial, como se indica por una única banda de proteína después de análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE).

Un proceso para producir LDCAM comprende cultivar una célula anfitriona transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que 25 codifica LDCAM bajo condiciones suficientes para estimular la expresión de LDCAM. LDCAM se recupera del medio de cultivo o de los extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como conoce el experto en la técnica, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán según factores como el tipo de células anfitrionas empleado y si la proteína recombinante se secreta o no al

30 medio de cultivo. Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo puede concentrarse en primer lugar usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de

ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) laterales. Las 5 matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de

10 cromatografía líquida de alta resolución con fase reversa (RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrofóbicos (p. ej., gel de sílice que tiene metilo u otros grupos alifáticos laterales) para purificar más LDCAM. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones, son muy conocidas y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

15 Es posible utilizar una columna de afinidad que comprende el dominio de unión al ligando de una proteína de unión a LDCAM para purificar por afinidad los polipéptidos LDCAM expresados. Los polipéptidos LDCAM pueden eliminarse de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, p. ej., en un tampón de elución con mucha sal y dializarse en un tampón con poca sal para usarse o cambiando el pH u otros

20 componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada. Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender un anticuerpo que se una a LDCAM. El Ejemplo 5 describe un procedimiento para emplear LDCAM de la invención para generar anticuerpos monoclonales dirigidos frente a LDCAM. La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano puede aislarse por

25 disrupción inicial de las células anfitrionas, centrifugación, extracción de los sedimentos celulares si es un polipéptido insoluble, o del fluido sobrenadante si es un polipéptido soluble, seguido de una o más etapas de concentración, eliminación de sales, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, puede emplearse RP-HPLC para las etapas finales de purificación. Las células

30 microbianas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, disrupción mecánica o uso de agentes para el lisado de las células.

Las células anfitrionas de levadura transformadas se emplean preferiblemente para expresar LDCAM como un polipéptido secretado con el fin de simplificar la purificación. El polipéptido recombinante secretado de una fermentación de células anfitrionas de levadura puede purificarse por métodos análogos a los descritos por Urdal

5 et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Urdal et al. describen dos etapas secuenciales de HPLC en fase reversa para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparativa.

Los fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de LDCAM incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenaria 10 (bien ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias de ARNm de LDCAM diana (sentido) o de ADN de LDCAM (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o sentido, según la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificadora del ADNc de LDCAM. Dicho fragmento comprende generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos.

15 La capacidad para obtener un oligonucleótido antisentido o sentido, tomando como base una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein y Cohen (Cancer Res. 48: 2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6: 958, 1988).

La unión de oligonucleótidos antisentido o sentido a secuencias de ácido nucleico diana resulta en la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la 20 secuencia diana por uno de varios medios, incluyendo degradación incrementada de los dúplex, terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido pueden usarse así para bloquear la expresión de proteínas LDCAM. Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen núcleos modificados de azúcar-fosfodiéster (u otras uniones de azúcar, tales 25 como las descritas en WO91/06629) y en los que dichas uniones de azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Dichos oligonucleótidos con uniones de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a las secuencias de nucleótidos diana. Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluyen 30 los oligonucleótidos que están unidos covalentemente a restos orgánicos, tales como los descritos en WO 90/10448, y otros restos que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico diana, tal como poli-(L-lisina). Aún más, pueden unirse agentes intercalantes, tal como elipticina, y agentes alquilantes o complejos

metálicos a los oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o sentido por la secuencia de nucleótidos diana. Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana por cualquier método de transferencia

5 génica, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO4, electroporación, o mediante el uso de vectores de transferencia génica tal como el virus de Epstein-Barr. Los oligonucleótidos antisentido o sentido se introducen preferiblemente en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana por inserción del oligonucleótido antisentido o sentido en un vector retroviral adecuado y poniendo en

10 contacto la célula con el vector retrovirus que contiene la secuencia insertada, bien in vivo

o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a, los obtenidos del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus obtenido de M-MuLV) o los vectores de doble copia denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la Solicitud PCT EEUU 90/02656).

15 Los oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana por formación de un conjugado con una molécula de unión al ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de unión al ligando adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los

20 receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula que se une al ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula que se une al ligando de unirse a su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una

25 célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana por formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o antisentido-lípido se disocia preferiblemente en el interior de la célula por una lipasa endógena.

Además de lo anterior, los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar 30 realizaciones particulares y no limitan el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Preparación de la Proteína de Fusión B7L-1/Fc

Lo siguiente describe la generación de una proteína B7L-1/Fc humana que se usó para identificar células a las que se une B7L-1. La proteína de fusión incluye la región

5 extracelular soluble de B7L-1 humana y muteína de la región Fc humana y se preparó aislando en primer lugar el ADNc que codifica la región extracelular de B7L-1 humana usando cebadores que flanquean la región extracelular de B7L-1 (Véase la Patente de EEUU No. 5.011.912).

Para aislar los nucleótidos que codifican el dominio extracelular de B7L-1

10 (nucleótidos 108-1249 de SEQ ID NO: 1 de la solicitud en tramitación con la presente S/N 60/095.663 presentada el 7 de agosto, 1998) se usaron oligonucleótidos que flanquean la región extracelular de B7L-1 como cebadores en una reacción de PCR para obtener un producto de PCR del clon #44904 que fue el molde en la reacción. El producto de PCR resultante se digirió con las enzimas de restricción Sal 1y Bg1II en los sitios Sal1 y Bg1II

15 incorporados por los cebadores. El fragmento resultante se ligó en un vector de expresión (pDC409) que contiene la región Fc de IgG1 humana mutada para disminuir la unión al receptor de Fc.

La construcción de ADN resultante se transfectó en las líneas celulares de riñón de mono CV-1/EBNA (con co-transfección de psv3neo). Después de 7 días de cultivo en 20 medio que contiene 0,5% suero bovino bajo en inmunoglobulina, se añadió una disolución de 0,2% de azida al sobrenadante y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 µm. Aproximadamente 1L del sobrenadante del cultivo se pasó a través de un sistema de purificación de proteínas BioCad Protein A HPLC usando una columna de Proteína A de 4,6 x 100 mm (POROS 20A de PerSeptive Biosystems) a 10 mL/min. La columna de 25 Proteína A une la parte Fc de la proteína de fusión en el sobrenadante, inmovilizando la proteína de fusión y permitiendo que los demás componentes del sobrenadante pasen a través de la columna. La columna se lavó con 30 mL de disolución de PBS y la proteína de fusión unida se eluyó de la columna de HPLC con ácido cítrico ajustado a pH 3,0. La proteína de fusión purificada eluida se neutralizó en el momento en el que eluía usando

30 disolución de 1M HEPES a pH 7,4.

EJEMPLO 2 Estudios de Unión de B7L-1

La proteína de fusión B7L-1/Fc preparada como se describe en el Ejemplo 1 se usó para cribar líneas celulares para estudiar la unión de B7L-1 usando estudios de unión 5 cuantitativos según metodologías de citometría de flujo estándar. Para cada línea celular cribada, el procedimiento implicó incubar las células bloqueadas con 2% FCS (suero fetal de ternera), 5% suero de cabra normal y 5% suero de conejo en PBS durante 1 hora. Las células bloqueadas se incubaron con 5 µg/mL de proteína de fusión B7L-1/Fc en 2% FCS, 5% suero de cabra y 5% suero de conejo en PBS. Después de la incubación, la muestra 10 se lavó 2 veces con tampón FACS (2% FCS en PBS) y se trató con Fc anti-humano de ratón/biotina (adquirida en Jackson Research) y SAPE (estreptavidina-ficoeritrina adquirida en Molecular Probes). Este tratamiento causó que Fc anti-humano/biotina se uniera a cualquier B7L-1/Fc unida y que SAPE se uniera al Fc anti-humano/biotina lo que resultó en un marcaje de identificación fluorescente de B7L-1/Fc unida a las células. Las 15 células se analizaron para detectar la proteína unida usando citometría de flujo con detección fluorescente. Los resultados indicaron que B7L-1 humana se une bien a la línea epitelial de pulmón humana (WI-28), líneas linfoblastoides B humanas (Daudi y PAE8LBM1), células B de amígdalas frescas humanas, células dendríticas CD8+ murinas de nódulos del bazo/linfáticos de animales tratados con ftl3-L y linfoma de células T

20 murino S49.1. EJEMPLO 3 Cribado de Biblioteca de Expresión de WI-26 para Contrarreceptores de B7L1 Lo siguiente describe el cribado de una biblioteca de expresión con la proteína de

25 fusión B7L-1/Fc preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1. La biblioteca de expresión se preparó a partir de la línea celular humana WI-26 usando los métodos descritos en Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 1, (1987). Usando métodos de unión indirecta estándar, se ensayaron monocapas transfectadas de células CV1/EBNA por autorradiografía en portaobjetos para la expresión de un contrarreceptor de B7L-1

30 usando proteína de fusión B7L-1/Fc radioyodada. Se identificaron los portaobjetos positivos que muestran las células que expresan un contrarreceptor y se identificó un conjunto que contiene aproximadamente 2.000 clones individuales como potencialmente positivo para la unión de la proteína de fusión B7L-1/Fc.

El conjunto se tituló y se plaqueó y se raspó para proporcionar ADN plasmídico reunido para la transfección en células CV1/EBNA. Después de cribar los conjuntos más pequeños, un conjunto contenía clones que eran positivos para contrarreceptor B7L-1 según se indica por la presencia de un producto génico expresado capaz de unirse a B7L

5 1/Fc. El conjunto positivo se tituló y se plaqueó para obtener colonias individuales. Se aisló el ADN de cada clon candidato potencial, se retransfectó y se volvió a cribar. Los clones positivos resultantes contenían un inserto de ADNc de 1.535 nucleótidos. La región codificadora del ADNc del contrarreceptor B7L-1 (LDCAM) corresponde a la descrita SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1 se describe en SEQ

10 IDNO:2. EJEMPLO 4 Expresión de LDCAM Humana Lo siguiente describe la expresión de LDCAM humana de longitud completa unida a membrana en células CV1/EBNA. Se preparó una construcción de vector para expresar

15 LDCAM humana por ligación de la región codificadora de SEQ ID NO: 1 en un vector de expresión pDC409. El vector de expresión se transfectó en células CV1/EBNA y LDCAM se expresó usando técnicas descritas en McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991.

Después de que las células se trataran y se incubaran durante varios días, se recogieron las células que tienen LDCAM unida a membrana, se fijaron en 1% 20 paraformaldehído, se lavaron y se usaron en su forma intacta.

Para expresar una forma soluble de LDCAM que incluya la región extracelular de LDCAM codificada por los nucleótidos 8 a 1.130 de SEQ ID NO: 1, se prepara una construcción de vector por ligación de la región codificadora extracelular de SEQ ID NO: 1 en un vector de expresión pDC409. El vector se transfecta en células CV1/EBNA.

25 Después de un periodo de incubación de 3 días en medio fresco, se recupera LDCAM soluble recogiendo los sobrenadantes de las células CV1/EBNA que contienen la forma soluble y aislando LDCAM usando técnicas de HPLC o técnicas de cromatografía de afinidad.

EJEMPLO 5 30 Estudios de Unión de LDCAM

Con el fin de identificar las líneas celulares a las que se une LDCAM, la proteína de fusión LDCAM/Fc, descrita en el Ejemplo 9 a continuación, se preparó y se usó en ensayos de unión a células y FACS. Usando metodologías estándar de unión a células y FACS, se encontró que LDCAM se une a las líneas celulares linfoblastoides B, DAUDI y PAE8LBM1, células transfectadas con B7L-1 humana, células transfectadas con LDCAM, células S49.1 y a las DC linfoides de nódulos de bazo y linfáticos de ratones tratados con Flt3-L.

5 EJEMPLO 6 Identificación de Tejidos que Expresan LDCAM

Usando metodologías de RT-PCR estándar, análisis Northern y equivalencia de secuencia en la base de datos de EST (GENBANK), se examinaron varias líneas celulares para la expresión de ARNm de LDCAM humana y LDCAM de ratón. Los

10 resultados demostraron que LDCAM tiene una distribución amplia en los tejidos. La expresión de LDCAM humana se encontró en mama, retina, hígado fetal, bazo, corazón fetal, pulmón, músculo, placenta, tiroides y carcinoma de pulmón. El ARNm de LDCAM de ratón se encontró en embrión completo, testículos, y células triple negativas.

EJEMPLO 7 15 Aislamiento de LDCAM Murina

Como se ha demostrado que B7L-1 humana soluble se une al linfoma murino S49.1 (Ejemplo 2), se cribó una biblioteca de expresión de S49.1 para clones de ADNc de LDCAM murina. El proceso implicó metodologías de RT-PCR usando el ARN de la línea celular S49.1 y los cebadores descritos en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. Estos

20 cebadores están basados en un EST murino, descubierto en una base de datos y que tiene homología con LDCAM humana. Los ADNc se amplificaron por PCR usando los cebadores, confirmando que la LDCAM murina está presente en las células S49.1.

El producto amplificado se clonó en un vector de clonación y los clones que contienen un inserto de ADNc de LDCAM se detectaron por hibridación con un 25 oligonucleótido complementario a la región codificadora de LDCAM humana. Para detectar los ADNc con extensiones en 5' comparado con LDCAM humana, se usaron un cebador oligonucleotídico complementario al extremo 5' de la región codificadora y un cebador complementario a las secuencias del vector adyacentes al inserto de ADNc para realizar PCR anclada de manera que se amplifica la región 5' de los clones de ADNc. Los 30 productos de PCR se examinaron por electroforesis en gel y sus longitudes se compararon con un producto de amplificación obtenido de manera similar a partir del ADNc de LDCAM humana. Los insertos de ADNc para los clones que proporcionaron un producto de PCR 5' más largo se secuenciaron para proporcionar un ADNc de LDCAM

murina que codifica todos excepto los 4 primeros aminoácidos, comparado con la LDCAM humana. La secuencia de nucleótidos para LDCAM murina se proporciona en SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 se proporciona en SEQ ID NO: 4.

5 EJEMPLO 8 Expresión del Polipéptido LDCAM Murino

Para preparar una construcción de vector para expresar B7L-1 extracelular murino, se ligó la región codificadora de SEQ ID NO: 3 en un vector de expresión pDC409. El vector de expresión se transfectó en células CV1/EBNA y LDCAM se expresó

10 usando técnicas descritas en McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991. Después de que las células se trataran y se incubaran durante varios días, los sobrenadantes celulares que contienen LDCAM murina soluble se recogieron y la proteína se recuperó usando técnicas de HPLC.

EJEMPLO 9 15 Preparación de proteínas de fusión LDCAM

Lo siguiente describe la generación de una proteína LDCAM humana/Fc que se usó para identificar las células a las que se une LDCAM. La proteína de fusión incluye la región extracelular soluble de LDCAM humana y muteína de la región Fc humana y se preparó aislando en primer lugar el ADNc que codifica la región extracelular de LDCAM

20 humana usando cebadores que flanquean la región extracelular de LDCAM (Véase Patente de EEUU No. 5.011.912). Para aislar los nucleótidos que codifican el dominio extracelular de LDCAM, nucleótidos 16-1.137 de SEQ ID NO: 1, se usaron oligonucleótidos que flanquean la región extracelular de LDCAM como cebadores en una reacción de PCR para obtener un

25 producto de PCR a partir del clon WI-26. Los cebadores se muestran en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. El producto de PCR resultante se digirió con las enzimas de restricción Sal1 y Bg1II en los sitos Sal1 y Bg1II incorporados por los cebadores. El fragmento resultante se ligó en un vector de expresión (pDC409) que contiene la región Fc de IgG1 humana mutada para disminuir la unión al receptor de Fc.

30 La construcción de ADN resultante se transfectó en las líneas celulares de riñón de mono CV-1/EBNA. Después de 7 días de cultivo en medio que contiene 0,5% suero bovino bajo en inmunoglobulina, se añadió una disolución de 0,2% de azida al sobrenadante y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 µm.

Aproximadamente 1L del sobrenadante del cultivo se pasó a través de un sistema de purificación de proteínas BioCad Protein A HPLC usando una columna de Proteína A de 4,6 x 100 mm (POROS 20A de PerSeptive Biosystems) a 10 mL/min. La columna de Proteína A une la parte Fc de la proteína de fusión en el sobrenadante, inmovilizando la

5 proteína de fusión y permitiendo que los demás componentes del sobrenadante pasen a través de la columna. La columna se lavó con 30 mL de disolución de PBS y la proteína de fusión unida se eluyó de la columna de HPLC con ácido cítrico ajustado a pH 3,0. La proteína de fusión purificada eluida se neutralizó en el momento en el que eluía usando disolución de 1M HEPES a pH 7,4.

10 EJEMPLO 10 Anticuerpos Monoclonales frente a LDCAM Este ejemplo ilustra un método para preparar anticuerpos monoclonales frente a LDCAM. Puede usarse LDCAM purificada, un fragmento de ésta tal como el dominio extracelular, péptidos sintéticos o células que expresan LDCAM para generar anticuerpos

15 monoclonales frente a LDCAM usando técnicas convencionales, por ejemplo, las técnicas descritas en la Patente de EEUU 4.411.993. Brevemente, se inmunizan ratones con LDCAM como un inmunógeno emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyecta en cantidades que van de 10-100 µg subcutáneamente o intraperitonealmente. De diez a doce días después, los animales inmunizados se refuerzan con LDCAM adicional

20 emulsionada en adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se refuerzan periódicamente a partir de ese momento en un esquema de inmunización semanal o bisemanal. Se toman periódicamente muestras de suero por sangrado retro-orbital o escisión de la punta de la cola para ensayar para anticuerpos frente a LDCAM por ensayo de hibridación sobre mancha o ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima).

25 Después de la detección de una titulación de anticuerpo apropiada, se proporciona a los animales positivos una última inyección intravenosa de B7L-1 en disolución salina. De tres a cuatro días después, los animales se sacrifican, se recogen las células del bazo, y las células del bazo se fusionan con una línea celular de mieloma murino, p. ej., NS1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de

30 hibridoma, que se plaquean en múltiples placas de microtitulación en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.

Las células de hibridoma se criban por ELISA para reactividad frente a B7L-1 purificado por adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971 y en la Patente de EEUU 4.703.004. Una técnica de cribado preferida es la técnica de captura de anticuerpo descrita en Beckmann et al., (J. Immunol. 144:4212,

5 1990). Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones singénicos BALB/c para producir ascitis que contienen altas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-B7L-1-L. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecerse in vitro en matraces o botellas giratorias por varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis de ratón pueden purificarse por

10 precipitación con sulfato de amonio, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también puede usarse cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a proteína A o proteína G, como también puede usarse cromatografía de afinidad basada en la unión a B7L-1.

EJEMPLO 11 15 Detección de la Expresión de LDCAM Por Análisis de Transferencia Northern

Lo siguiente describe experimentos de Transferencia Northern realizados para identificar los tejidos y tipos celulares que expresan polipéptidos LDCAM de la presente invención.

Se generaron transferencias Northern fraccionando 5 µg a 10 µg de ARN total en

20 un gel de agarosa formaldehído 1,2% y transfiriendo el ARN a membranas de Nilon Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL). Se usaron procedimientos estándar para generar transferencia northern como se describe en Maniatis, (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Se adquirieron de Clonetech múltiples transferencias de tejidos poli A+ que contienen 1 µg de ARNm de varias fuentes

25 diferentes. Se generó una ribosonda, que contiene la región codificadora de LDCAM, usando el Kit de Riboprobe Combination de Promega y ARN Polimerasa T7 según las instrucciones del fabricante. Los resultados de sondear las transferencias Northern y de visualizar la película de rayos x resultante para sondas que se unen positivamente

30 muestra que se detectó un ARNm de 5,0 kB que hibrida para LDCAM murina en pulmón, hígado, cerebro, testículos y células dendríticas de bazo. Los ARNm adicionales que hibridan que tienen diferentes tamaños incluyeron un ARNm de aproximadamente 1,9 kB en pulmón y testículos; un ARNm de aproximadamente 3,0 kB en macrófagos de médula ósea estimulados con LPS, pulmón y testículos; un ARNm de aproximadamente 7,0 kB que hibrida en células T de bazo estimuladas con anticuerpo anti-receptor de células T, macrófagos de médula ósea estimulados con LPS y testículos; y un ARNm de

5 aproximadamente 9,0 kB que hibrida se detectó en timo y células T de bazo estimuladas con anticuerpo anti-receptor de células T.

EJEMPLO 12 Estudios de Unión a Células del Sistema Inmune

Lo siguiente describe experimentos de unión celular por FACS que demuestran

10 que LDCAM se une a determinadas células del sistema inmune activadas. Para propósitos de estudio y comparación, también se incluyeron las características de unión de B7L-1. Las células estudiadas incluyeron células T murinas, células T humanas, células B murinas, células NK murinas, células endoteliales humanas y líneas celulares de tumor humano.

15 Para estudiar la unión a células T murinas, células del nódulo linfático (LN) murinas de BALB/c se cultivaron en medio de cultivo solo y en presencia de diferentes estímulos durante 18-20 horas. Las células cultivadas se recogieron y se prepararon para los estudios de unión usando la proteína de fusión B7L-1/Fc, la proteína de fusión LDCAM/Fc y una proteína control Fc. Después de un cultivo toda la noche, las células LN

20 murinas de BALB/c son típicamente >90% CD3+. La proteína unida se detectó usando análisis de citometría de flujo. Los resultados mostrados en la Tabla I indican la unión observada expresada como media de unidades de intensidad de fluorescencia (MFI) en células T no estimuladas (medio) y en células T estimuladas (por estímulo). Tabla I Fc medio ConA mAb TCR PHA Fc control 12,7 10,4 14,5 14,2 B7L1Fc 11,7 14,3 24,0 12,6 LDCAMFc 18,7 51,7 230,0 91,4

25 Cuando se analizan por subconjuntos de células T, 75-80% de las células T murinas LN CD4+ presentaron una unión de LDCAM detectable después de la estimulación anti-TCR in vitro. Aproximadamente 50% de las células T murinas LN CD8+ presentan una unión detectable. Además, las células T CD4+ presentan unos niveles mayores de unión de LDCAM que los de las células T murinas CD8+. Los resultados demuestran que LDCAM/Fc se une a bajos niveles a células T sin estimular. Sin embargo, después de una activación toda la noche con estímulos policlonales la unión se incrementó 5-20 veces dependiendo del estímulo. De los estímulos estudiados, PMA induce la unión más baja de LDCAM a células T murinas y anti-TCR induce la unión más

5 alta.

Para estudiar la unión de las células T humanas a LDCAM y su contraestructura B7L1, se cultivaron células T de sangre periférica (PB) humana en medio de cultivo solo o en presencia de diferentes estímulos durante 18-20 horas. Las células cultivadas se recogieron y se prepararon para los estudios de unión usando la proteína de fusión B7L

10 1/Fc, la proteína de fusión LDCAM/Fc y una proteína control Fc. La proteína unida en las células T de PB humana se determinó por análisis de citometría de flujo. La Tabla II detalla los resultados observados, expresados como MFI, en células T no estimuladas (medio) y en células T estimuladas (por estímulo). Tabla II Fc medio ConA PMA PHA Fc control 4,7 4,8 3,5 4,3 B7L1Fc 6,3 7,5 4,5 5,7 LDCAMFc 22,3 42,8 61,9 38,8

15 Los resultados muestran que PMA induce una unión mayor de LDCAM en células T humanas de lo que lo hace en células T murinas. La presencia de unión específica de LDCAM a células T tanto murinas como humanas en ausencia de unión de B7L1 sugiere que LDCAM se une a B7L1, o a una molécula diferente y no a sí misma. Debido a que los estudios indican que las células T expresan poco o nada de B7L1, LDCAM puede tener

20 otra pareja de unión. Se realizaron estudios similares a los descritos anteriormente para evaluar la unión de LDCAM y B7L1 a células B de bazo murinas. No se detectó unión ni de B7L1 ni de LDCAM en las células B murinas no estimuladas. El cultivo de células B de bazo murinas con muCD40L o LPS indujo niveles bajos de unión de LDCAM pero no se detectó

25 un nivel apreciable de unión de B7L1. Con el fin de estudiar la unión a células NK murinas, se extirparon bazos de ratones CB-17/SCID tratados con IL-15 y se usaron como fuente para células NK murinas altamente enriquecidas y activadas. Las células del bazo aisladas de ratones SCID tratados con IL-15 son 60-80% positivas para DX-5. DX-5 es un marcador de NK global

que se expresa en células NK de muchas cepas diferentes de ratones. Se realizó análisis por citometría de flujo como se ha descrito anteriormente para detectar la unión de B7L1 y LDCAM a células NK murinas DX-5+ activadas in vivo con IL-15. La Tabla II proporciona los resultados de un estudio de unión a células NK murinas.

5 Tabla III Molécula Fc DX-5+células NK %+ / MFI Fc control 8% / 88 B7L1Fc 19% / 265 LDCAMFc 38% 432

Al contrario que lo observado en células T murinas y humanas, la unión de LDCAM y B7L1 puede detectarse en células NK murinas activadas in vivo. Los resultados de los experimentos dirigidos a estudiar la unión de B7L1 y LDCAM a células endoteliales humanas demostraron que no había unión en células endoteliales

10 de la vena umbilical humana (HUVEC) de diferentes donantes. Sin embargo, en una HUVEC de un donante, B7L1 indujo bajos niveles de CD62E y CD106 comparado con el Fc control.

La Tabla IV detalla los resultados de los experimentos dirigidos a evaluar la unión de B7L1 y LDCAM a líneas celulares tumorales humanas. Los resultados se expresan 15 como porcentaje de células que unen LDCAM o B7L1.

Tabla IV

Línea celular: Tipo de célula LDCAMFc (%+)** B7L1Fc (%+)**

U937: leucemia monocítica 10 7

K562: leucemia 7 5

eritroblástica

Jurkat: leucemia de células 10 7

T aguda

MP-1: LCL de células B 46 10

DAUDI-hi: Burkitt de células B 8 6

RPMI 8866: linfoma de células B 0 0

#88EBV: LCL de células B 4 3

#33EBV: LCL de células B 0 0

Tonsil G EBV: LCL de células B 25 13

MDA231 adenocarcinoma de 8 9

mama OVCAR-3 carcinoma de ovario 48 30 H2126M1 adenocarcinoma de 0 0

pulmón ** la unión de Fc control se ha restado de manera que es %+ de unión a células neta respecto al fondo. Los resultados muestran una unión significativa de LDCAM en la línea celular de carcinoma de ovario y 2 de las líneas tumorales de células B humanas (MP-1 y Tonsil G).

5 B7L1 también se une a estas tres líneas celulares tumorales pero a niveles mucho menores. Estos resultados demuestran que LDCAM es un marcador para determinados tipos de linfomas de células B o diferentes tipos de carcinomas. Además, la señalización biológica mediada por LDCAM o B7L1 podría mediar efectos anti tumorales funcionales en estos tipos de tumores.

10 EJEMPLO 13 Efectos de LDCAM en la Proliferación de las Células T

La discusión siguiente describe experimentos realizados para evaluar los efectos de LDCAM en la proliferación de las células T murinas y humanas inducida por estímulos policlonales.

15 La proteína de fusión LDCAM/Fc y la proteína de fusión B7L1/Fc se evaluaron en un modelo estándar de proliferación de células T murinas in vitro. Se obtuvieron células del nódulo linfático (LN) a partir de ratones BALB/c normales y se pusieron en cultivo en medio. Se pusieron en el medio cantidades diferentes de Fc control, B7L1/Fc y LDCAM/Fc solo o en presencia de diferentes estímulos policlonales para las células T incluyendo

20 ConA, PHA o mAb TCR inmovilizado.

Los resultados de estos experimentos demostraron que LDCAM inhibe fuertemente la proliferación de las células T murinas inducida por ConA (50% de inhibición a �0,625 µg/ml), inhibe moderadamente la proliferación inducida por PHA (50% de inhibición a �5 µg/ml) y no tiene efecto en la proliferación inducida por mAB TCR 25 inmovilizado. En los ensayos de proliferación de células T de sangre periférica humana, LDCAM inhibe la proliferación inducida por ConA pero no inhibe eficazmente la

proliferación inducida por PHA o OKT3. B7L1/Fc no tiene efecto en las respuestas proliferativas de las células T murinas o humanas. Los resultados sugieren que los efectos inhibidores de LDCAM/Fc en la proliferación de las células T murinas y humanas inducida por mitógenos se deben a una

5 inhibición de la secreción de citoquinas (especialmente IL-2) o se deben a la regulación de las respuestas más abajo de la célula T después de la activación e incrementos en la expresión de la pareja de unión de LDCAM. LDCAM también puede modular las interacciones célula a célula entre las células T, células T y APC o células T y células NK. La incapacidad de LDCAM de inhibir la proliferación inducida por mAb TCR sugiere que

10 está ocurriendo una desrregulación de citoquinas ya que la proliferación inducida por ConA y PHA es muy dependiente de citoquinas mientras que la inducida por mAb anti TCR lo es mucho menos.

EJEMPLO 14 Efectos de LDCAM en la producción de citoquinas por las células T murinas

15 Lo siguiente describe los experimentos realizados con el fin de evaluar LDCAM por sus efectos en la secreción de citoquinas por las células LN murinas o células T purificadas después de la activación in vivo de las células T con PHA, ConA y mAB TCR. Los resultados se muestran en la Tabla V. Los niveles de citoquinas detectados se expresan en pg/ml.

20 Tabla V condiciones del molécula Fc IL-2 (pg/ml) IFN-gamma (pg/ml) cultivo medio nada <2 <10 Fc control <2 <10 LDCAM/Fc <2 <10 ConA nada 366 100 Fc control 614 244 LDCAM/Fc <2 <10 PHA nada 36 358 Fc control 39 354 LDCAM/Fc 10 <10 mAb TCR inmov. nada 1.703 1.114 Fc control 1.722 1.215

LDCAM/Fc 1.642 1.027

Los resultados muestran que LDCAM/Fc inhibe significativamente la producción de IL-2 e IFN-gamma por las células T LN murinas que es inducida tanto por ConA como PHA. Cuando se usa mAb TCR inmovilizado para inducir la producción de citoquinas por células T murinas, se observaron efectos menos pronunciados de LDCAM en la

5 producción de citoquinas. LDCAM disminuyó la producción de IFN-gamma después de la activación con TCR. Por otra parte, la producción de IL-2 no disminuyó después de la activación con TCR. Se generó muy poca IL-4 por las células T en estos experimentos por lo que no se evaluó si LDCAM tiene o no efecto en la producción por las células T de IL-4 u otras citoquinas/quimioquinas adicionales.

10 EJEMPLO 15 Efectos de LDCAM en Ensayos de Activación de Células Murinas Mixtas Se desarrolló un ensayo de células mixtas in vitro para examinar la capacidad de las células T de activar las células B a través de su interacción CD40L/CD40. El ensayo implica cultivar células del bazo y células LN con mAb anti-TCR in vitro durante 36 horas

15 seguido del análisis por citometría de flujo de la activación de las células T y células B/células APC que ocurre después de que las células T sean activadas e interaccionen con células B/APC. Las células del bazo se cultivaron con mAb anti TCR, ConA, PHA, o en medio solo con Fc control o LDCAM/Fc durante 36 horas. La activación de las células B CD19+ y

20 células T CD3+ se siguió examinando la expresión en la superficie celular de CD25, CD69, CD54, CD45Rb, CD44, CD28, CD23, CD86 y CD152 usando una tinción con dos colores y análisis por citometría de flujo.

Los resultados demuestran que después de la activación con PHA o ConA, la expresión de CD69, CD54 y CD25 se incrementa varias veces en las células T y las 25 células B en el cultivo. Comparado con un Fc control que tiene poco efecto en estos incrementos, LDCAM redujo significativamente la expresión (casi a los mismos niveles que las células T no activadas) de CD69, CD54 y CD25 que se inducen en ambos tipos celulares en este sistema de cultivo a través de la activación con ConA. ConA activa las células T que expresan moléculas de activación (p. ej. CD40L) en su superficie. Las 30 moléculas de activación se unen a receptores en la superficie de las células B y activan las células B para expresar varias proteínas relacionadas con la activación en su

superficie celular. La inhibición de células T y B activadas con PHA ocurrió en un grado más moderado respecto al observado después de la activación con ConA.

Además, LDCAM disminuyó los niveles de CD45RB expresada tanto en células del bazo CD3+ como CD3-cultivadas con ConA. Este efecto en la disminución de los niveles de CD45RB fue más pronunciado cuando LDCAM se cultivó con células del bazo estimuladas con mAb TCR y no se observó cuando se usó PHA como estímulo o cuando las células se cultivaron en medio solo.

Usando mAb TCR para estimular las células del bazo cultivadas en presencia de un Fc control o LDCAM/Fc se mostró que los niveles de CD69, CD25 y CD25 inducidos en las células T y células B por este estímulo no se vieron afectados por LDCAM. Sin embargo, LDCAM incrementó la expresión de CD28 tanto en células T CD3+ como en células distintas de las T. En un experimento, el incremento fue de 5-10 veces y en los demás experimentos el incremento fue 50%. Esto también se observó en un experimento cuando se usó ConA como estímulo además de mAb TCR. LDCAM causó disminuciones moderadas en la intensidad de la expresión de CD45RB en las células B (50% de disminución) y en las células T (20-30% de disminución) después de la activación con mAb TCR.

De manera interesante, LDCAM no tiene efecto en la expresión de CD45RB en las células del bazo cuando se cultivan en ausencia de estímulos de células T policlonales. Se ha publicado que la expresión de CD45RB en roedores disminuye al progresar las células T desde células sin estimular a células de memoria. También, diferentes subpoblaciones de células T CD4+ expresan altos o bajos niveles de CD45RB y median distintas funciones inmunes in vivo.

Los resultados discutidos anteriormente sugieren que bajo determinadas condiciones de estimulación inmunes, particularmente estimulaciones con ConA y PHA, LDCAM inhibe la activación de las células T a nivel celular en ensayos de células mixtas e inhibe la proliferación de las células T inducida por estos mitógenos al menos parcialmente mediante la disminución de la producción de IL-2 e IFN-gamma.

Mientras que LDCAM regula a la baja de manera modesta la producción de IFN gamma inducida por la activación inducida por mAb TCR, tiene poco efecto en la producción de IL-2 en este sistema y no tiene efecto en la proliferación de las células T murinas inducida por mAb TCR inmovilizado. LDCAM causa un incremento en la expresión de CD28 y una disminución en la expresión de CD45RB en las células T y células B activadas por mAb TCR. Tomando como base estos datos, LDCAM o su pareja de unión en las células T puede regular (incrementar, disminuir o redirigir) las respuestas inmunes dependientes de efector de las células T in vivo incluyendo pero sin limitarse a respuestas inmunes anti-tumorales, respuestas DTH y respuestas inmunes anti

5 enfermedad infecciosa dependientes de las células T.

Los resultados anteriores sugieren que LDCAM es útil en la modulación de las rutas de activación de las células T y que puede usarse para tratar enfermedades autoinmunes e inflamación.

EJEMPLO 16 10 LDCAM.Fc se Une a Células NK Murinas y Causa La Expansión de las Células NK

Lo siguiente describe experimentos que demuestran que LDCAM se une a la superficie de células NK del bazo constitutivamente y que la activación de estas células con IL-15 incrementó los niveles de la unión de LDCAM. Los experimentos también

15 describen la administración de LDCAM:Fc a ratones CB-17 SCID y los efectos de la administración en la expansión de las células NK y la activación en el bazo. Se dividieron doce ratones CB-17/SCID hembras de edad equivalente en 4 grupos con 3 animales por grupo. En el día 0, día 1 y día 2, se administraron al grupo I, grupo II, grupo III y grupo IV las siguientes proteínas IP: los ratones del grupo I recibieron 10 µg de

20 IgG humana; los ratones del grupo II recibieron 10 µg de IL-15 humana; los ratones del grupo III recibieron 10 µg de LDCAM:Fc humana (lote# 7488-16 de Immunex); y el grupo IV recibió 10 µg de LDCAM:Fc y 10 µg de IL-15 humana. En el día 3 (el 4º día del experimento), los ratones se eutanizaron y se extirparon sus bazos. Cada bazo se enumeró separadamente y se juntaron para los análisis por

25 citometría de flujo. El número de células NK en el bazo de cada grupo tratado se determinó por citometría de flujo usando el anticuerpo DX-5 como un marcador global de células NK murinas. Además, se evaluaron otras medidas de la activación de las células NK incluyendo la expresión de CD69 y CD54. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla I. La administración de

30 LDCAM:Fc solo (Grupo III) incrementó el número total de células del bazo recuperado aproximadamente 5 veces sobre el grupo control IgG humana (Grupo I). La administración de IL-15 humana sola (Grupo II) incrementó el número total de células del bazo recuperado aproximadamente 9 veces sobre el grupo control (Grupo I). El tratamiento de combinación con IL-15 y LDCAM incrementó el número de células del bazo de manera aditiva.

El número de células NK recuperado de los bazos estaba correlacionado con la

5 recuperación de células total en el bazo. Más particularmente, LDCAM indujo un incremento de aproximadamente 5 veces en las células NK recuperadas; IL-15 causó un incremento de aproximadamente 9 veces en las células NK recuperadas; y, la combinación de LDCAM e IL-15 indujo un incremento de aproximadamente 13 veces en el número de células NK recuperadas de los bazos de los ratones tratados. LDCAM también

10 incrementó el número de células NK en el bazo que expresaban CD69 y CD54. Este incremento se debió a la expansión global de las células NK en lugar de incrementos específicos en la expresión de CD69 o CD54 en las células NK in vivo después de la administración de LDCAM:Fc. TABLA I Grupo de recuentos de Número de % de células # de células NK Ratones SCID células del Ratones (NK) DX-5+ recuperadas X bazo X 10^6 10^6 Grupo I (IgG 2,3 3 67,8 1,6 humana control) Grupo II (IL15 17,8 3 81,7 14,5 control positivo) Grupo III 10,25 3 51,2 5,3 (LDCAM:Fc) LDCAM:Fc e 24,8 3 72,6 18,0 IL15

15 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Baum, Peter Robert Fanslow III, William C.

<120> Moléculas Denominadas LDCAM 5 <130> 2873-WO

<140> --pendiente de asignación-

<141> 1999-08-05

<150> 60/095.672

<151> 1998-08-07 10 <160> 10

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1

<211> 1.598

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> 16..1.341

<400> 1

imagen1

imagen2

<210> 2

<211> 442

<212> PRT

<213> LDCAM Humana

<400> 2

imagen2

<210> 3

<211> 1.935

<212> ADN

<213> LDCAM Murina

<220>

<221> CDS

<222> 2..1.273

<400> 3

imagen3

imagen2

<210> 4

<211> 424

<212> PRT

<213> LDCAM Murina

<400> 4

imagen2

<210> 5

<211> 29

<212> Oligonucleótido

<213> Humano

<400> 5

imagen2

<210> 6

<211> 30 10 <212> Oligonucleótido

<213> Humano

<400> 6

imagen2

<210> 7 15 <211> 1.820

<212> ADN

<213> B7L-1 Humana forma larga

<220>

<221> CDS 20 <222> 157..1.452

<400> 7

imagen2

<210> 8

<211> 432

<212> PRT

<213> B7L-1 Humana forma larga

<400> 8

imagen2

<210> 9

<211> 1.718 5 <212> ADN

<213> B7L-1 Humana forma corta

<220>

<221> CDS

<222> 157..1.350 10 <400> 9

imagen2

<210> 10

<211> 398

<212> PRT

<213> B7L-1 Humana forma corta

<400> 10

imagen2

Claims

1. Una composición que incluye una proteína que comprende los aminoácidos 39374 de SEQ ID NO: 2 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha proteína no consiste en la proteína de longitud completa codificada por el ADN

5 depositado con el número de registro ATCC209529.

2. Una composición que incluye una proteína que comprende los aminoácidos 39374 de SEQ ID NO: 2 conjugada con una toxina.

3. Una composición que incluye una proteína que comprende los aminoácidos 39

374 de SEQ ID NO: 2 para inhibir una respuesta inmune mediada por células T o para la 10 expansión de células asesinas naturales.

4. La composición de la reivindicación 3, que es para usarse en el tratamiento de una infección viral en un individuo, en la que dicha composición incrementa o genera células asesinas naturales frente a células infectadas por virus.

5.: La composición de la reivindicación 3 que es para usarse para matar células 15 tumorales en un individuo.

6. Un polipéptido purificado que comprende la secuencia como se muestra en los aminoácidos 1-374 de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos 1-356 de SEQ ID NO: 4.

7. El polipéptido de la reivindicación 6 que comprende además una etiqueta.

8.: El polipéptido de la reivindicación 7, en el que la etiqueta es un radionúclido, un 20 cromóforo o una enzima.

9. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido según la reivindicación 6.