ES2279849T3

ES2279849T3 - Moleculas transportadoras de antigenos modulares (moleculas mat) para la modulacion de reacciones inmunitarias, constructos, procedimientos y usos de las mismas.

Info

Publication number: ES2279849T3
Application number: ES02022774T
Authority: ES
Inventors: Reto Prof. Dr. Crameri; Sabine Dr. Fluckiger; Norbert Dr. Lamping; Isabelle Dr. Daigle
Original assignee: Imvision GmbH
Current assignee: Imvision GmbH
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2007-09-01
Anticipated expiration: 2022-10-11
Also published as: HUE025092T2; JP4718183B2; CY1106387T1; AU2003276089B2; SI1549750T1; CA2502274A1; WO2004035793A1; DK1408114T3; EP1549750B1; PT1549750E; DE50209178D1; ES2542329T3; EP1408114B1; JP2006502719A; EP1549750A1; EP1408114A1; US20050281816A1; US7563866B2; CA2502274C; US20100098635A1

Abstract

Molécula transportadora de antígenos modulares (molécula MAT), que contiene al menos un módulo de translocación, que produce el transporte de la molécula MAT desde el espacio extracelular hacia el interior de la célula, al menos un módulo de selección como diana, que produce que la molécula MAT se transporte intracelularmente hacia los orgánulos que están implicados en el procesamiento de antígenos o la carga de moléculas MHC-II con antígenos y al menos un módulo de antígeno, que determina la especificidad de una respuesta inmunitaria modulada en un individuo mediante la molécula MAT, estando acoplados los módulos a través de enlaces covalentes entre sí y a) siendo el módulo de translocación una unidad molecular peptídica y siendo tat de VIH, VP22 o Antennapedia o un fragmento de secuencia funcional del mismo como módulo de translocación y; b) siendo el módulo de selección como diana una unidad molecular con una secuencia de aminoácidos y siendo la cadena invariante de MHC (liP33, liP41, liP35, liP43) o un fragmento de secuencia funcional del mismo como módulo de selección como diana y c) siendo el módulo de antígeno un alergeno que consiste en una proteína o péptido, y produciendo la molécula MAT la proliferación in vitro de células mononucleares periféricas de la sangre de un sujeto alérgico, que reacciona frente al alergeno.

Description

Moléculas transportadoras de antígenos modulares (moléculas MAT) para la modulación de reacciones inmunitarias, constructos, procedimientos y usos de las mismas.

La invención se refiere a la estimulación y la inhibición del sistema inmunitario para la profilaxis, tratamiento o diagnosis de enfermedades, que van acompañadas de un sistema inmunitario no estimulado lo suficientemente o de uno demasiado estimulado. Entre estas enfermedades se encuentran entre otras enfermedades infecciosas, enfermedades tumorales, alergias, enfermedades autoinmunitarias, reacciones de rechazo de trasplantes, etc. La base de la invención es un procedimiento novedoso, en el que se influye el sistema inmunitario mediante la administración de una molécula MAT, que consiste en al menos los tres componentes siguientes:

1. un módulo de translocación, que hace que la molécula MAT pueda penetrar en células desde el exterior,

2. un módulo de selección como diana intracelular, que hace que la molécula MAT se procese en el interior de la célula de tal manera que se produce una respuesta inmunitaria modificada o una presentación modificada del antígeno y

3. un módulo de antígeno, que determina la especificidad de la respuesta inmunitaria modulada.

La combinación de estos tres elementos para dar una molécula MAT, tal como se define según la invención, permite la modulación específica, dirigida del sistema inmunitario del individuo tratado, o permite una presentación modificada del antígeno mediante la célula que presenta antígenos.

Estado de la técnica Preparación de antígenos mediante células que presentan antígenos

El procesamiento de antígenos mediante células que presentan antígenos (APC) tiene lugar a través de dos caminos diferentes. Los antígenos que aparecen intracelularmente se presentan en la superficie celular por moléculas MHC I (Major Histocompatibility Complex class I, MHC class I (complejo principal de histocompatibilidad clase I)), mientras que los antígenos extracelulares se presentan en la superficie celular a través de moléculas MHC II (Major Histocompatibility Complex class II, MHC class II (complejo principal de histocompatibilidad de clase II)). Ambos mecanismos inician una reacción inmunitaria del huésped sobre el antígeno. El camino, que toma el antígeno desde la absorción en la célula hasta la presentación en la superficie celular en forma de un complejo antígeno-MHCII, transcurre a través de diferentes orgánulos celulares, entre otros a través del retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, la red trans de Golgi, lisosomas, endosomas y a través de "compartimentos" de MHC de clase II (MIIC ''MHC class II "compartments"). En el caso de la presentación de antígenos mediada por MHC II los MIIC desempeñan un papel importante. En estos orgánulos de la célula, las moléculas MHC II se cargan de antígenos de bajo peso molecular o de fragmentos proteolíticos de proteínas. En este procedimiento se degrada proteolíticamente la "cadena invariante" (también denominada cadena gamma de MHC II o li) unida al principio a la molécula MHC II y bajo la regulación de diferentes proteínas, que se unen de manera directa o indirectamente a MHC II, el antígeno se une a la molécula MHC II [1]. Entre estas moléculas reguladoras se encuentran entre otras HLA-DM, HLA-DO, LAMP-1, LAMP-2, CD63, CD83, etc. La función exacta de estas proteínas hasta ahora es en parte poco clara, pero muchas de ellas presentan secuencias de señal, que promueven su transporte hacia los lisosomas, hacia los endosomas, hacia la red trans de Golgi, hacia los MIIC, etc. [2-4]. En el caso de las reacciones proteolíticas, que son necesarias, para poder presentar el antígeno en las moléculas MHC II, una serie de proteasas desempeñan un papel. A las proteasas, que están presentes en los MIIC, pertenecen entre otras diferentes miembros de la familia de catepsina, tales como por ejemplo catepsina S y catepsina L [1].

Selección como diana y secuencias de selección como diana

Las secuencias de aminoácidos, que tienen la propiedad de acumularse en el interior o exterior de una célula de manera dirigida en un sitio o en un orgánulo celular determinado, se denominan con frecuencia secuencias de selección como diana. A este respecto se destaca que pueden distinguirse diferentes tipos de selección como diana. Especialmente se distingue entre selección como diana extracelular e intracelular. Para la selección como diana extracelular se usan por ejemplo anticuerpos que se unen desde fuera a estructuras directamente accesibles en la superficie celular, por ejemplo a la parte extracelular de proteínas de membrana. Un anticuerpo, que une una proteína en la superficie celular de células tumorales, puede acoplarse por ejemplo con un citotóxico. Este anticuerpo produce entonces una selección como diana extracelular del citotóxico hacia la célula tumoral, mediante lo cual ésta puede destruirse de manera dirigida. Este tipo de selección como diana es básicamente diferente de la selección como diana intracelular, en la que a menudo deben vencerse las membranas intracelulares o en la que se une la secuencia de selección como diana de receptores intracelulares y así por ejemplo penetra en orgánulos celulares determinados, o en la que la secuencia de selección como diana puede penetrar a través de canales especiales, formados de proteínas especiales, en el orgánulo celular, para el que la secuencia de selección como diana es específica. Cuando a continuación en la presente solicitud de patente se habla de una secuencia de selección como diana o de un módulo de selección como diana, con ello siempre se refiere a selección como diana intracelular y no selección como diana extracelular. Además, en la presente solicitud de patente con selección como diana no se hace referencia a cualquier tipo de selección como diana intracelular, sino sólo a la selección como diana intracelular, que sirve para transportar moléculas hacia orgánulos o regiones intracelulares, que participan en la preparación, procesamiento y/o unión de antígenos a moléculas MHC. Tales orgánulos o regiones intracelulares son por ejemplo el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, la red trans de Golgi, endosomas, lisosomas y MIIC. Las secuencias de selección como diana intracelulares correspondientes se describen para diferentes proteínas en la bibliografía [1-5].

En el documento US 5.633.234 se describe por ejemplo un constructo de ADN, que comprende una secuencia de selección como diana lisosomal, una secuencia transmembrana y un dominio de antígeno.

Translocación y secuencias de translocación

Además de la bibliografía se conocen numerosas secuencias de aminoácidos, que se originan especialmente de virus, por ejemplo tat de VIH o la proteína VP22 que se origina del virus del herpes simple, que facilitan el transporte proteínas, péptidos y otras clases de sustancias, tales como por ejemplo ácidos nucleicos o sustancias farmacéuticamente eficaces, al interior de la célula. Para esto se unen estas denominadas secuencias de translocación a las moléculas que han de transportarse (también denominadas moléculas de carga) o bien a través de enlaces covalentes o bien no covalentes. Los compuestos que resultan de la secuencia de translocación y la molécula de carga pueden introducirse entonces extracelularmente a células. La secuencia de translocación produce entonces que la molécula de carga acceda al interior de la célula. Este principio se describe de la misma manera en numerosos trabajos, especialmente para la secuencia de tat de VIH [6-8].

Aunque ya era posible y estaba previsto usar un antígeno como molécula de carga, no era posible todavía sólo con ayuda de los agentes de translocación conocidos, conseguir una respuesta inmunitaria en un individuo tan dirigida y dosificada, como sería deseable para determinados objetivos (por ejemplo la desensibilización de alergias). Por tanto existe una necesidad de procedimientos adicionales para la modulación inmunitaria dirigida.

Rodriguez F. et al., J. Virol., 2001, 75 (21), páginas 10421-10430, describe vectores de ADN para la transfección de células. Estos vectores de ADN contienen constructos, que contienen una secuencia de selección como diana lisosomal (Limp 2). Además se usaron epítopos LCMV, que se conocen como moléculas MHC de clase II.

Van Bergen J. et al., Immunol. Rev., 1999, 172, páginas 87 a 96, resume el conocimiento en el campo de la selección como diana de antígenos hasta el año 1999. Según esto se aplican dos estrategias diferentes para la selección como diana de los antígenos frente a las moléculas MHC II, el uso de constructos de ADN y la absorción mediada por receptores de manera dirigida de antígenos mediante APC, que expresan los receptores correspondientes.

Sheldon K. et al., Proc. Natl. Acad. Science U.S.A., 1995, 92 (6), páginas 2056 a 2060, se refiere al uso de oligómeros. Las moléculas allí descritas permiten una importación de secuencias determinadas desde la zona extracelular hacia el núcleo de la célula.

Objetivo de la invención

Por tanto, es objetivo de la invención, poner a disposición agentes para conducir alergenos lo más diferentes y aleatorios posible a su lugar de procesamiento de manera dirigida, de tal manera que esto puede aprovecharse aún mejor de manera diagnóstica y terapéutica.

Solución del objetivo

La invención pone a disposición moléculas y procedimientos, que permiten conducir antígenos hacia células de una manera muy dirigida, para conseguir una reacción inmunitaria específica, eficaz. El procedimiento permite en primer lugar transportar antígenos de manera eficaz desde el espacio extracelular hacia el espacio intracelular de la célula y permite en segundo lugar que los antígenos, cuando llegan al interior de la célula, alcancen de manera eficaz los orgánulos celulares, en los que se procesan adicionalmente para la presentación del antígeno. Este procedimiento de dos etapas puede utilizarse de manera muy general para la modulación eficaz, dirigida de la reacción inmunitaria de un individuo.

Como herramienta para conseguir estas acciones se desarrollaron moléculas especiales, que se denominan a continuación en esta solicitud de patente moléculas de transporte de antígenos modulares o moléculas MAT. Estas moléculas MAT, los ácidos nucleicos respectivos, vectores, células, líneas celulares, vesículas, inmunoglobulinas así como los usos y procedimientos que pertenecen a la invención, que se refieren a estos componentes o que trabajan con ellos, se caracterizan en las reivindicaciones con más detalle.

Para la solución del objetivo se prevé una combinación no descrita hasta ahora de al menos tres módulos para dar un clase nueva de moléculas, que se denominan moléculas MAT (moléculas de transporte de antígenos modulares). Estos tres módulos comprenden al menos un módulo de translocación, al menos un módulo de selección como diana y al menos un módulo de antígeno, tal como se definen en las reivindicaciones. Los tres módulos diferentes se acoplan entre sí a través de enlaces covalentes. La molécula MAT así producida puede administrarse directamente a un individuo, sobre cuya reacción inmunitaria contra los antígenos contenidos en la molécula MAT debe influirse. Alternativamente, pueden tratarse también células in vitro con moléculas MAT y posteriormente las células así tratadas se administran al individuo. En este procedimiento, los módulos de translocación hacen que la molécula MAT pueda penetrar en la célula, los módulos de selección como diana hacen que la molécula MAC se procese intracelularmente de tal modo que se produce una respuesta inmunitaria y determina la identidad de los antígenos en el módulo de antígeno, antígeno frente al cual se dirige la reacción inmunitaria. Una ventaja esencial de este nuevo procedimiento para la modulación de la respuesta inmunitaria de un individuo es sobre todo su aplicabilidad universal, es decir puede trabajarse con los antígenos más diferentes, diferentes módulos de translocación y diferentes módulos de selección como diana. Además, el uso de un módulo de translocación tiene como consecuencia que el procedimiento no es específico para la célula o tejido, sino que es adecuado universalmente para la modulación inmnunitaria de prácticamente todos los tipos de células. Una ventaja adicional es la estructura modular de la molécula MAT. La estructura modular permite ajustar la molécula MAT rápidamente a las necesidades médicas respectivas. También puede variarse la disposición exacta de los tres componentes de la molécula MAT y el tipo de la unión entre los mismos, siempre que exista al menos en cada caso un módulo de todos los tres tipos de módulos en la molécula MAT. Además, pueden existir los módulos correspondientes en el extremo N-terminal, C-terminal o internamente en la molécula MAT. En cuanto a los antígenos no hay limitaciones debido al procedimiento. El procedimiento puede usarse por ejemplo para la activación del sistema inmunitario de un individuo frente a agentes patógenos, tales como por ejemplo frente a virus, bacterias, parásitos etc., es decir muy en general como vacuna. Además, el procedimiento puede usarse para la activación del sistema inmunitario frente a células degeneradas, tales como por ejemplo células tumorales, etc. Pero por otro lado, según la invención puede usarse también para la desensibilización del sistema inmunitario de un individuo frente a alergenos tales como por ejemplo polen, pelo de animales, ácaros de polvo doméstico, veneno de insectos, etc. o para la supresión dirigida del sistema inmunitario por ejemplo en el caso de la presencia de reacciones autoinmunitarias tales como por ejemplo artritis, reúma, diabetes, LES (lupus eritematoso sistémico), etc. y para la supresión de reacciones de rechazo de trasplantes. Enfermedades no mencionadas de manera explícita adicionales, que van acompañadas de una reacción inmunitaria muy fuerte o muy débil, también pueden tratarse con las moléculas MAT según la
invención.

En el estado de la técnica se contempló hasta ahora con frecuencia como muy desventajoso, que las secuencias de translocación no son específicas para determinados tipos de células, sino que en todos los tipos de células son igualmente eficaces [9]. Sin embargo, la funcionalidad universal de los módulos de translocación es una gran ventaja en la presente invención, que no se reconoció en el estado de la técnica anterior. En el estado de la técnica anterior se intentó repetidas veces proteger las "moléculas de carga", que se infiltran en las células con la utilización de secuencias de translocación, contra la degradación proteolítica en la célula [9]. En la presente invención se desea de manera explícita justo lo contrario y es ventajoso para el modo de acción de la invención. Una degradación proteolítica de los módulos de antígeno en la célula es ventajosa para la acción de la invención, es decir para una presentación de antígeno eficaz. Por tanto, se utilizan en la presente invención módulos de selección como diana, que facilitan de manera dirigida el transporte de los módulos de antígeno en los compartimentos celulares, en los que se degradan proteolíticamente.

Las secuencias de aminoácidos más conocidas, que pueden usarse en el sentido de la invención como módulo de translocación, son la secuencia VP22 y la Tat de VIH. Para estas secuencias se describe que producen tanto una translocación a través de la membrana celular, como también un transporte hacia el núcleo de la célula [7]. Este transporte hacia el núcleo de la célula no se desea en conexión con la presente invención, dado que en el núcleo de la célula no tiene lugar ningún procesamiento de antígenos y por consiguiente no se produce una presentación de antígenos eficaz. Este problema no resuelto hasta ahora, se soluciona con la presente invención mediante el uso de un módulo de selección como diana, que hace que la molécula MAT no se transporte intracelularmente hacia el núcleo de la célula, sino que se transporte de manera dirigida a aquellos orgánulos, en los que tiene lugar el procesamiento de antígenos o la carga de moléculas MHC con antígenos. El módulo de translocación intracelular de las moléculas MAT según la invención elimina por tanto un inconveniente esencial, que presentan las proteínas de fusión de Tat-antígeno conocidas hasta ahora en el estado de la técnica.

En el estado de la técnica anterior se conocen también proteínas de fusión, que consisten en una secuencia de selección como diana, por ejemplo de la cadena invariante de la molécula MHC II, y un antígeno. Sin embargo, estas proteínas de fusión no pueden penetrar de manera eficaz en las células que presentan antígenos. Para ello, en el caso de su uso para la inmunización de un individuo, es necesario además un adyuvante que facilita la absorción de la proteína de fusión en la célula. Estos adyuvantes, tales como por ejemplo aceite mineral, extractos de micobacterias o adyuvante de Freund, tienen sin embargo efectos secundarios no deseados, tales como por ejemplo reacciones de inflamación local. Alternativamente, se pensó en estrategias de vacunación de ADN, tal como por ejemplo se dan a conocer en el documento US 5.633.234. En este planteamiento el constructo de ADN también debe introducirse en las células con agentes auxiliares, tal como un vector o mediante transfección. Las moléculas MAT usadas ahora en la presente invención tienen en comparación con las vacunas habituales la ventaja de que se acoplan directamente con un módulo de translocación fisiológicamente muy compatible, que facilita la absorción en las células de una manera muy eficaz. Debido a esto, posiblemente puede prescindirse total o parcialmente de los adyuvantes adicionales. Esto tiene como consecuencia, que en el caso de inmunizaciones con moléculas MAT se producirán claramente menos efectos secundarios no deseados. Se conoce desde hace tiempo que los antígenos presentes en MHC I intracelular o extracelularmente conducen a una respuesta inmunitaria citotóxica, sin embargo no una respuesta inmunitaria humoral muy protectora. Sin embargo, mediante el uso de moléculas MAT pueden añadirse extracelularmente los antígenos contenidos en el módulo de antígeno, aunque actúan como antígenos intracelulares, dado que el módulo de translocación transporta el antígeno hacia el espacio intracelular y que el módulo de translocación influye intracelularmente en el transporte del antígeno de tal modo que se produce una respuesta inmunitaria humoral. Mediante este procedimiento novedoso puede conseguirse la inducción intensa que se ha intentado intensamente desde hace muchos años, de una respuesta inmunitaria humoral con antígenos añadidos extracelularmente (moléculas MAT).

Descripción detallada de la invención Secuencias de translocación / módulos de translocación

Los términos secuencia de translocación y módulo de translocación se usan en el texto de la presente solicitud equivalentemente y con igual significado paralelamente. El término módulo de translocación se ha introducido para aclarar que los módulos de translocación sólo son una parte de una molécula MAT en el sentido de la invención. Además, los módulos de translocación no sólo representan las secuencias peptídicas de translocación que se producen en la naturaleza tal como por ejemplo tat de VIH, sino también por ejemplo peptidomiméticos u otras estructuras, que pueden adoptar la misma función como las secuencias peptídicas de translocación que se producen en la naturaleza.

La invención comprende el uso de diferentes módulos de translocación, tal como se definen en la reivindicación 1, para la producción de moléculas MAT, que consisten en al menos un módulo de translocación, al menos un módulo de selección como diana y al menos un módulo de antígeno. Generalmente, son adecuadas para su uso en el sentido de la presente invención todas las secuencias de translocación actualmente conocidas y las que se conocerán en el futuro. En la bibliografía se describen numerosas secuencias de translocación adecuadas. A estas secuencias de translocación pertenecen secuencias virales, secuencias de homeoproteínas, secuencias de "cremalleras de leucina" secuencias ricas en arginina y lisina así como otras secuencias de proteínas diferentes, que se secretan a pesar de la ausencia de secuencia de señal de secreción, etc.

Secuencias peptídicas virales, que son adecuadas como módulos de translocación

Entre las secuencias peptídicas adecuadas como módulos de translocación en el sentido de esta invención se encuentran entre otras las proteínas virales o secuencias parciales de proteínas virales tales como por ejemplo la proteína "proteína activadora transcripcional de VIH" (Tat de VIH). Entre las proteínas Tat adecuadas se encuentran además de la proteína Tat del virus VIH-1 también las proteínas Tat de otros lentivirus [9]. Numerosos péptidos Tat modificados se han descrito como secuencias, que pueden producir la translocación. Entre ellos se encuentran los péptidos Tat, que representan sólo secuencias parciales de la proteína Tat [10], péptidos Tat, que contienen mutaciones puntuales [10], péptidos Tat, que se encuentran en orden de secuencia invertido (inverso) [10], o péptidos Tat que contienen aminoácidos inusuales, tales como por ejemplo isómeros D de aminoácidos [10], etc. Por tanto, todas estas variaciones de secuencias peptídicas son en general adecuadas como módulos de translocación. Además en el sentido de la presente invención son adecuados como módulos de translocación los péptidos que provienen de otros virus, VP22 (proteína del tegumento VP22 del virus 1 del herpes simple) [9]. Actualmente también pueden obtenerse en el comercio vectores de expresión, que contienen una secuencia de VP22, que es adecuada para la translocación. Estos vectores de expresión permiten por tanto la producción de proteínas de fusión VP22 (Voyager™-VP22-System, Invitrogen, Breda, Países Bajos). Sin embargo, en el uso de este sistema de expresión no se contiene ningún módulo de selección como diana en la proteína de fusión. También otros virus, por ejemplo el "virus 1 de la enfermedad de Marek", un virus que produce linfomas en las gallinas, expresan una proteína, que es afín a VP22 [11].

Homeoproteínas, que son adecuadas como módulos de translocación

Un grupos adicional de módulos de translocación adecuados en el sentido de la presente invención son péptidos, que se derivan de la "Antennapedia de proteína homeótica de Drosophila" (ANTp) [9]. Entre otros son adecuados también como módulo de translocación péptidos de ANTp, que contienen una secuencia invertida de ANTp [7], que contienen isómeros D de aminoácidos [7], o que contienen mutaciones puntuales en su secuencia [7]. Además se espera que aún sean posibles numerosas modificaciones de secuencia de ANTp adicionales, que probablemente facilitarán la translocación [7]. Las variantes de péptido de ANTp se denominan también péptidos "transportadores". Las homeoproteínas adicionales tales como por ejemplo Engrailed 1 (En1), Engrailed 2 (En2), Hoxa-5, Hoxc-8, Hoxb-4 y KNOTTED-1 [7] contienen igualmente secuencias, que pueden usarse como módulo de translocación en el sentido de la presente invención. KNOTTED-1 es incluso una proteína vegetal, que sin embargo es adecuada igualmente como módulo de translocación en células animales. Estos péptidos se mencionan sólo a modo de ejemplo y se conocen numerosas homeoproteínas adicionales [12], que contienen secuencias peptídicas, que pueden ser adecuadas como módulo de translocación en el sentido de la invención. También las homeoproteínas adicionales hasta ahora no conocidas pueden contener secuencias que son adecuadas como módulo de translocación.

Regulación de la eficacia de los módulos de translocación

Mediante la variación de la longitud de por ejemplo una cadena de poli-arginina o mediante la selección dirigida de por ejemplo sólo una secuencia parcial de la secuencia de Tat de VIH, puede regularse la eficacia de la translocación, de tal modo que según cada una de las necesidades tiene lugar una translocación muy eficaz de la molécula MAT correspondiente o una translocación menos eficaz [8, 13]. Una translocación muy eficaz puede tener la ventaja de aumentar la acción de la molécula MAT y/o de poder reducir la dosis necesaria de la molécula MAT. Una dosis reducida de molécula MAT tiene a su vez la ventaja de producir efectos secundarios más reducidos y de necesitar menos material para la inmunización, lo que a su vez ahorra costes. Por otro lado, una eficacia reducida de la translocación hace posible que las moléculas MAT se distribuyan en el individuo tratado, por ejemplo tras una inyección intravenosa, dado que no penetran inmediatamente de forma local prácticamente de manera cuantitativa en todas las células, que se encuentran en las proximidades.

Secuencias mínimas a modo de ejemplo, que actúan como módulo de translocación

Todas las secuencias de translocación mencionadas a modo de ejemplo no tienen que ser componente de la molécula MAT en forma de la proteína total, para que sean eficaces como módulo de translocación para la molécula MAT en el sentido de la invención. Más bien, se conoce una zona de secuencia mínima para muchas de las proteínas mencionadas, que puede usarse como secuencia de translocación. Esta zona de secuencia comprende por ejemplo para Tat de VIH por ejemplo la secuencia siguiente: Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg, para VP22 la secuencia siguiente: Asp-Ala-Ala-Thr-Ala-Thr-Arg-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-Val-Glu y para Antennapedia la secuencia siguiente: Arg-Gln-Iso-Lys-Iso-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys [17]. Además pueden usarse las secuencias también en forma de fragmentos, que no corresponden a los fragmentos de secuencia funcionales mínimos actualmente conocidos, siempre que la secuencia resultante aún sea funcional en el sentido de un módulo de translocación.

Por tanto, los módulos de translocación no tienen que ser componente de la molécula MAT en forma de la proteína total o de la molécula total, para que sean eficaces como módulo de translocación para la molécula MAT en el sentido de la invención. Más bien se conoce una zona de secuencia por ejemplo para algunas de las proteínas mencionadas, que puede usarse como módulo de translocación. Además, pueden usarse las secuencias de proteínas también en forma de fragmentos, que no corresponden a los fragmentos de secuencia funcionales conocidos hasta el momento, siempre que la secuencia resultante sea aún funcional como módulo de translocación. La prueba de la funcionalidad de un módulo de translocación puede determinarse por ejemplo con el uso de módulos de translocación marcados con fluorescencia o con el uso de módulos de translocación marcados con enzimas o con el uso de módulos de translocación marcados con partículas metálicas. Los módulos de translocación así marcados se administran a un animal de experimentación o a células cultivadas in vitro y se sigue el destino de los módulos de translocación con métodos tales como FACS ("fluoresence activated cell sorting" (clasificación de células activadas por fluorescencia)), microscopía, microscopía de fluorescencia confocal, microscopía electrónica etc. Estas técnicas para someter a prueba la funcionalidad de los módulos de translocación se describen en la bibliografía y en parte se ha usado ya para la determinación de la funcionalidad de secuencias para la translocación [8, 18].

Secuencias de selección como diana / módulos de selección como diana

Los términos secuencia de selección como diana y módulo de selección como diana se usan en el texto de la presente solicitud equivalentemente y con igual significado paralelamente. Por selección como diana se refiere en esta solicitud de patente básicamente siempre a la selección como diana intracelular. El término módulo de selección como diana se ha introducido para aclarar que los módulos de translocación son sólo una parte de una molécula MAT en el sentido de la invención.

La invención comprende el uso de diferentes secuencias, tal como se definen en la reivindicación 1, como módulos de selección como diana para la producción de moléculas MAT que consisten en al menos un módulo de translocación, al menos un módulo de selección como diana y al menos un módulo de antígeno. Generalmente son adecuadas todas las secuencias de aminoácidos y moléculas actualmente conocidas y las que se conocerán en un futuro, que pueden mediar la selección como diana, para su uso como módulos de selección como diana. En la bibliografía se describen numerosas secuencias adecuadas. A estas secuencias adecuadas como módulo de selección como diana pertenecen todas las secuencias que hacen que la molécula MAT se transporte intracelularmente hacia los sitios u orgánulos en el interior de una célula, en los que tienen lugar procesos, que participan en la presentación de los módulos de antígeno contenidos en la molécula MAT. A estos sitios y orgánulos en el interior de la célula pertenecen especialmente los "compartimentos de MHC de clase II" (MIIC), endosomas, lisosomas, el aparato de Golgi, la red trans de Golgi y el retículo endoplásmico. Estos orgánulos intracelulares toman parte en los procesos tales como por ejemplo el transporte o el procesamiento de antígenos, la preparación y carga de las moléculas MHC II con antígenos o antígenos procesados, y el transporte de las moléculas MHC II cargadas con antígenos a la superficie celular etc.

Moléculas MHC, que contienen secuencias, que son adecuadas como módulo de selección como diana

En el sentido de la invención son adecuadas una serie de secuencias como módulos de selección como diana. La cadena invariante de la molécula MHC II (li, cadena invariante, cadena gamma de MHC II) es la secuencia descrita con más frecuencia en la bibliografía, que puede mediar la selección como diana. En el ser humano se describen diferentes variantes de la cadena invariante, que también se denominan liP33, liP41, liP35 y liP43 [1] y que son adecuadas como módulos de selección como diana. Otras secuencias adecuadas como módulo de selección como diana son las cadenas beta de la molécula MHC II [19]. También son adecuados los fragmentos de las secuencias mencionadas como módulo de selección como diana.

Para li pudo mostrarse que tienen significado dos zonas de secuencia independientemente entre sí para la selección como diana intracelular (posición de aminoácidos 1 a 11 y posición 12 a 29) [23]. Ambas secuencias de selección como diana por sí solas son ya funcionales y la secuencia 1 a 11 contiene en la posición 7 y 8 un motivo de leucina-isoleucina esencialmente funcional [23]. En resumen, los restos de leucina tienen según esto especialmente una función importante en las secuencias de selección como diana y por tanto pueden diseñarse de manera dirigida secuencias de aminoácidos correspondientes como módulos de selección como diana. Estas pueden usarse como módulos de selección como diana en el sentido de la invención.

Todos los módulos de selección como diana mencionados a modo de ejemplo no tienen que ser componente de la molécula MAT en forma de la proteína total o de la molécula total, para que sean eficaces como módulo de selección como diana para la molécula MAT en el sentido de la invención. Más bien se conoce por ejemplo una zona de secuencia para algunas de las proteínas mencionadas, que puede usarse como módulo de selección como diana. Además, las secuencias de proteínas mencionadas a modo de ejemplo pueden usarse también en forma de fragmentos, que no corresponden a los fragmentos de secuencia funcionales conocidos hasta el momento, siempre que la secuencia resultante sea aún funcional como módulo de selección como diana. La comprobación de la funcionalidad de un módulo de selección como diana puede determinarse por ejemplo con el uso de módulos de selección como diana marcados con fluorescencia o con el uso de módulos de selección como diana marcados con enzimas o con el uso de módulos de selección como diana marcados con partículas metálicas. Los módulos de selección como diana así marcados se administran a un animal de experimentación o a células cultivadas in vitro y se sigue el destino de los módulos de selección como diana con métodos tales como FACS ("fluoresence activated cell sorting" (clasificación de células
activadas por fluorescencia)), microscopía, microscopía de fluorescencia confocal, microscopía electrónica etc.

Módulos de antígeno

Como módulos de antígeno pueden utilizarse básicamente todos los tipos de antígenos, que pueden modular una respuesta inmunitaria. Son adecuados tanto los antígenos que ya se conocen actualmente, como los antígenos que se descubrirán en un futuro. Eventualmente puede tratarse también de antígenos que en el caso de métodos de inmunización convencionales, actualmente conocidos en el estado de la técnica, no conducen a una respuesta inmunitaria, pero que conducen a una repuesta inmunitaria del individuo en el caso de la aplicación de los procedimientos novedosos descritos en la presente solicitud de patente.

Se conoce que pueden actuar como antígenos, no sólo proteínas y péptidos, sino también estructuras de azúcar, lípidos, por ejemplo lipopolisacáridos, ácidos lipoteicoicos y otros componentes de la membrana bacteriana (CD1b se une por ejemplo a estructuras de azúcar y lípidos), ácido nucleicos tales como por ejemplo ADN que contiene motivos CpG, sustancias orgánicas, tales como por ejemplo látex o sustancias farmacéuticamente eficaces. El antígeno puede proceder de seres humanos, animales, plantas, hongos, parásitos, microorganismos uni o multicelulares, virus y otras formas de vida. Los antígenos pueden haberse aislado a partir de material biológico, haberse producido de manera recombinante o haberse producido sintéticamente, por ejemplo mediante síntesis de péptidos. En el caso de antígenos producidos sintéticamente puede tratarse de sustancias que se producen en la naturaleza o que no se producen en la naturaleza, que sin embargo pueden obtenerse mediante síntesis química. Ejemplos de sustancias que no se producen en la naturaleza, pero adecuadas como antígenos eventualmente son por ejemplo sustancias producidas sintéticamente, que existen en medicamentos, o péptidos sintéticos con secuencias de aminoácidos, que no se producen en la naturaleza, o peptidomiméticos, etc. Los antígenos que se producen en la naturaleza o producidos sintéticamente o de manera recombinante pueden modificarse mediante métodos de biología molecular, enzimáticos, químicos y otros, para conferirles propiedades más ventajosas para la aplicación respectiva. Estas propiedades ventajosas pueden ser entre otras una eficacia superior o inferior como antígeno, una acción más amplia o específica como antígeno, una mejor solubilidad en disolventes hidrófilos o hidrófobos, una permeabilidad superior de los módulos de antígeno para membranas celulares, para membranas de orgánulos, para la membrana hematoencefálica, para la membrana hematocefalorraquídea, etc., un periodo de semivida superior o inferior in vivo o in vitro, una toxicidad superior o inferior, una mejor trazabilidad in vivo o in vitro del antígeno tras la aplicación del antígeno en forma de una molécula MAT, etc. Además, pueden combinarse en el sentido de la invención varios antígenos en un módulo de antígeno [25]. Para esto pueden estar contenidos antígenos idénticos en copia múltiple en el módulo de antígeno o pueden combinarse por ejemplo diferentes variantes del mismo antígeno en un módulo de antígeno. También pueden combinarse antígenos por ejemplo de antígeno 1 y otros antígenos por ejemplo de antígeno 2 en un módulo de antígeno, etc. También, pueden combinarse combinaciones adicionales, tales como por ejemplo antígeno 1 en copia múltiple y antígeno 2 en copia sencilla, en un módulo de antígeno, etc. Además, pueden existir en una molécula MAT también uno o varios módulos de antígeno diferentes y/o uno o varios idénticos. En principio pueden combinarse todas las combinaciones posibles de copias de antígenos idénticas o modificadas existentes sencillas o múltiples, derivadas de uno o varios antígenos diferentes en el sentido de la invención. El módulo de antígeno puede existir en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal o internamente en la molécula MAT, o pueden existir insertados de manera interna en un módulo de selección como diana, en un módulo de translocación o en un módulo de etiqueta. Dado el caso puede producirse el módulo de antígeno con el uso de métodos combinatorios.

Alérgenos como antígenos, que pueden usarse como módulo de antígeno según la invención

En la bibliografía se describen ya hasta ahora numerosos antígenos, especialmente alérgenos. Los alérgenos concretamente conocidos de a continuación pueden usarse en el sentido de la invención como módulo de antígeno. Otros alérgenos y variantes de alérgenos, que también pueden usarse en el sentido de la invención como módulo de antígeno, se conocen en el estado de la técnica [26, 27]. Los alérgenos se clasifican según los grupos tales como alérgenos de hierbas y gramíneas, de árboles, de ácaros, de hongos, de insectos, de alimentos y de otros alérgenos tales como por ejemplo alérgenos de látex. En la especificación se conocen como tal como se enumera a continuación: nombre científico del microorganismo, una abreviatura habitual del alérgeno seguida directamente del número de acceso del GeneBank del alérgeno (escrito entre paréntesis).

Los alérgenos de hierbas y gramíneas:

: Ambrosia artemisiifolia, Amb a 1 y Amb a 2; Mercurialis annua, Mer a 1 (Y13271); Parietaria judaica, Par j 1 (X77414), Par j 2 (X95865; X95866); Cynodon dactylon, Cyn d 1 (S83343); Dactylis glomerata, Dac g 3 (U25343); Holcus lanatus, Hol I 1 (Z27084, Z68893); Lolium perenne, Lol p 1 (M57474), Lol p 2 (X73363) Lol p 5 (M59163); Phalaris aquatica, Pha a 1 (S80654); Phleum pratense, Phl p 1 (X78813), Phl p 2 (X75925), Phl p 3, Phl p 5 (X74735)

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Alérgenos de árboles:

: Alnus glutinosa, Aln g 1 (S50892); Betula verrucosa, Bet v 1 (X15877), Bet v 2, Bet v 1 d; Carpinus betulus, Car b 1 (X66932, X66918); Corylus avellana, Cor a 1 (X70999, X71000, X70997, X70998, Z72439, Z72440, AF136945, AF323973, AF323974, AF323975); Ligustrum vulgare, Lig v 1 (X77787, X77788); Olea europea, Ole e 1 (S75766), Ole e 9 (AF249675); Syringa vulgaris, Syr v 1 (X76541); Cryptomeria japonica, Cry j 1, Cryj 2 (D29772, D37765); Cupressus arizonica, Cup a 1 (AJ278498); Cupressus sempervirens, Cup s 1 (AF257491); Juniperus ashei, Jun a 2 (AJ404653)

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Alérgenos de ácaros:

: Blomia tropicalis, Blo t 5 (U59102); Dermatophagoides farinae, Der f 1, Der f 2, Der f 11; Dermatophagoides pteronyssinus, Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7; Lepidoglyphus destructor, Lep d 2 (X81399); P. americana, Cra-A; T. putrescentiae, Tyr p2

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Alérgenos de animales:

: Bos domesticus, Bos d 2 (L42867); Equus caballus, Equ c 1 (U70823); Felis domesticus, Fel d 1 (M74952, M74953)

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Alérgenos de hongos:

: Alternaria alternata, Alt a 1 (U82633), Alt a 2 (U62442); Aspergillus flavus, Asp fl 1 (AF137272); Aspergillus fumigatus, Asp f 1 (M83781, S39330), Asp fl/a, Asp f 2 (U56938), Asp f 3 (U20722, U58050), Asp f 4, Asp f 6,Asp f 8; Aspergillus niger, Asp n 18; Aspergillus oryzae, Asp o 13 (X17561); C. comatus, Cop c 1; Penicillium chrysogenum, Pen ch 13 (AF193420), Pen ch 20 (S77837); Penicillium oxalicum, Pen o 18 (AAG44478); Malassezia sympodialis, Mal s 1 (X96486)

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Alérgenos de insectos:

: Apis mellifera, Api m 1 (X16709), Api m 2 (L10710), Api m 4 (X02007); Blattella germanica, Bla g 1 (AF072219, L47595, AF072221, AF072220), Bla g 2 (U28863), Bla g 4 (U40767), Bla g 5 (U92412); Periplaneta americana, Per a 1 (AF072222), Per a 3 (L40819); Dolichovespula maculata, Dol m 1 (X66869), Dol m 2 (L34548) Dol m5 (J03601); Dolichovespula arenaria, Dol a 5 (M98859), Polistes annularies, Pol a 5 (M98857); Vespula vulgaris, Ves v 1 (L43561), Ves v 2 (L43562), Ves v 5 (M98858); Myrmecia pilosula, Myr p 1 (X70256), Myr p 2 (S81785)

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Alérgenos de alimentos:

: Salmo salar, Sal s 1 (X97824); Bos domesticus, Bos d 4 (M18780), Bos d 5 (X14712); Gallus domesticus, Gald 1 (J00902), Gal d 2 (J00992); Metapenaeus ensis, Met s 1 (U08008); Hordeum vulgare, Hor v 15 (X63517); Oryza sativa, Ory s 1 (U31771); Apium graveolens, Api g 1 (Z48967); Daucus carota, Dau c 1 (U47087, D88388); Malus domestica, Mal d 1 (X83672); Pyrus communis, Pyr c 1 (AF057030); Persea americana, Pers a 1 (Z78202); Prunus armeniaca, Pru ar 1 (U93165); Prunus avium, Pru av 1 (U66076); Arachis hypogaea, Ara h 1 (L34402), Ara h 2 (L77197); Bertholletia excelsa, Ber e 1 (M17146); Juglans regia, Jug r 1 (U66866), Jug r 2 (AF066055); Ricinus communis, Ric c 1 (X54158); Sesamum indicum, Ses i 1 (AF240005)

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Alérgenos adicionales (látex):

: Hevea brasiliensis, Hev b 1 (X56535), Hev b 2, Hev b 3, Hev b 5 (U42640), Hev b 6 (M36986), Hev b 7, Hev b 8.

Estos alérgenos conocidos se mencionan solamente a modo de ejemplo y se conocen alérgenos adicionales a partir del estado de la técnica, que también pueden usarse en el sentido de la invención en módulos de antígeno.

Además de los alérgenos se conoce una serie de agentes patógenos de enfermedades, contra los que no se dispone actualmente todavía ninguna inmunización eficaz o duradera. Dado que el procedimiento según la invención se basa en una estrategia de inmunización novedosa, es posible que muestre acción para la inmunización contra estas enfermedades que hasta ahora no han podido tratarse de forma profiláctica de manera satisfactoria mediante inmunizaciones. Para estas enfermedades se enumeran especialmente infecciones con virus de VIH, virus de la hepatitis C, con agentes patógenos de tuberculosis (Mycobakterium tuberculosis), Lepra (Mycobacterium leprae), peste (Yersinia pestis) así como agentes patógenos de la malaria (especies Plasmodium, por ejemplo falciparum).

Módulos adicionales, que pueden existir en moléculas MAT

Además de los tres módulo ya descritos, módulo de translocación, módulo de selección como diana y módulo de antígeno, que al menos deben existir en la molécula MAT, pueden existir aún módulos adicionales opcionales en la molécula MAT. A estos módulos opcionales pertenecen por ejemplo módulos, que posibilitan el aislamiento o la identificación de las moléculas MAT. Tales módulos se denominan a menudo en el estado de la técnica también como "etiquetas" y por tanto se denominan a continuación en esta solicitud de patente como módulo de etiqueta. Los módulos que están contenidos en las moléculas MAT opcionales adicionales pueden ser módulos espaciadores, es decir, módulos que se disponen entre los otros módulos y cuyo objetivo es acoplar estos módulos entre sí. A continuación en esta solicitud de patente se mencionan estos módulos, módulos espaciadores. También es posible que los módulos determinados tomen simultáneamente la función de dos o más módulos. Por ejemplo muchos módulos de etiqueta pueden usarse simultáneamente para aislar y para detectar la molécula MAT, o un módulo de antígeno que está contenido en una molécula MAT pueda también usarse para detectar y/o aislar la molécula MAT, cuando por ejemplo se dispone un anticuerpo frente al módulo de antígeno etc.

Módulos de etiqueta, que pueden existir en las moléculas MAT

En el sentido de la invención uno o más módulos de etiqueta diferentes y/o uno más idénticos pueden ser componentes de una molécula MAT. Los módulos de etiqueta pueden ser péptidos cortos que consisten a menudo en no más de 20 restos de aminoácidos, pero también pueden corresponder a secuencias de proteínas completas o dominios determinados de proteínas. Los módulos de etiqueta también pueden ser grupos funcionales que no se componen de aminoácidos, tales como por ejemplo biotina o digoxigenina. Casi todos los módulos de etiqueta pueden usarse de dos maneras y tipos diferentes. Por un lado pueden usarse para aislar la molécula MAT, por otro lado pueden usarse para identificar la presencia de la molécula MAT. En general son adecuados todos los módulos de etiqueta conocidos hasta ahora y los que se conocerán aún en un futuro, para su uso en el sentido de la invención. Ejemplos de moléculas de etiqueta adecuadas que pueden usarse en el sentido de la presente invención son: secuencias de histidina de 4 a 12 o más restos de histidina preferiblemente seguidos inmediatamente uno tras otro, también las mencionadas etiqueta de His, etiqueta de His6, etiqueta HIS6, Penta-His™, Tetra-His™, RGS-His™, etc. (Qiagen, Hilden, Alemania), etiqueta Myc o c-Myc, etiqueta PinPoint™ (una secuencia de señal, que hace que la proteína correspondiente in vivo de bacterias esté dotada con un grupo de biotina), etiqueta HA, etiqueta 6xHN (Promega Biosciences Inc., San Louis Obispo, CA, EE.UU.), etiqueta Xpress™, etiqueta myc, etiqueta V5 (Invitrogen, Breda, Países Bajos), etiqueta S, etiqueta CBD, etiqueta GST, etiqueta HSV, etiqueta T7 (Novagen Inc., Madison, WI, EE.UU.), etiqueta FLAG, etiqueta HA, etiqueta c-myc, "etiqueta de péptido de unión a calmodulina" etiqueta (CBP), (calmodulin-binding peptide) (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), etiqueta de His, etiqueta de proteína A, etiqueta de glutatión S-transferasa (GST, glutathion S Transferase) (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), etiqueta II Strep (IBA GmbH, Göttingen, Alemania), etiqueta de His (Roche Applied Science, Rotkreuz, Suiza), etiqueta FLAG, etiqueta GST, etiqueta de Proteína A (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), "proteína de unión a maltosa" (MBP, Maltose Binding Protein), "etiqueta de unión a quitina", (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.), etiqueta de His (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.). Para uno de estos módulos de etiqueta se describen también aplicaciones, en las que se usan más de un módulo de etiqueta en una molécula. Por ejemplo pueden acoplarse dos módulos de etiqueta en el extremo N o C-terminal de una proteína o puede acoplarse un módulo de etiqueta en el extremo N o C-terminal (Qiagen, Hilden, Alemania y Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Los módulos de etiqueta también pueden insertarse en el interior de la secuencia de otras proteínas, por ejemplo entre dos dominios de un proteína (Strep-tagII, IBA, Göttingen, Alemania).

Otros módulos de etiqueta se usan en primer lugar para la identificación de la molécula a la que están acoplados. Sin embargo estas moléculas de etiquetas se usan en principio también para el aislamiento de proteínas, por ejemplo con el uso de cromatografía de afinidad. Para esto pueden usarse por ejemplo materiales cromatográficos, en los que están acoplados los anticuerpos frente a estos módulos de etiqueta. En el sentido de la presente invención también pueden usarse módulos de etiqueta, tales como por ejemplo la "proteína de fluorescencia verde" (green fluorescent protein, GFP), la "proteína de fluorescencia verde intensa" (enhanced green fluorescent protein, EGFP), la "proteína de fluorescnencia azul ciano intensa" (enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), la "proteína de fluorescencia amarilla intensa" (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP), la "proteína de fluorescencia roja" (red fluorescent protein, DsRed2) (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA, EE.UU.), la "proteína de fluorescencia verde de renilla" (renilla green fluorescent protein, hrGFP) (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), etc. Estos módulos de etiqueta pueden estar localizados tanto en el extremo N como en el C-terminal por ejemplo de una proteína de fusión. Además de los módulos de etiquetas fluorescentes pueden usarse también enzimas como módulo de etiqueta. Las enzimas usadas con frecuencia son por ejemplo luciferasa, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, etc. Estas enzimas pueden identificarse a través de su actividad enzimática respectiva, es decir, debido a la reacción de los sustratos de estas enzimas. Para esto son adecuados diferentes tipos de sustratos, tales como por ejemplo sustratos, que absorben luz en la región visible del espectro, sustratos fluorescentes, cuya reacción conduce a la emisión de luz, o sustratos cuya reacción enzimática puede determinarse mediante la absorción de la concentración del sustrato o el amento de producto con el uso de diferentes procedimientos de identificación, etc.

Otra posibilidad de uso de los módulos de etiqueta en el sentido de la presente invención es el uso de, por ejemplo, secuencias peptídicas, que son adecuados como sustratos de cinasa. Entonces, estas secuencias peptídicas pueden marcarse de manera radiactiva con la adición de fósforo radiactivo y la adición de cinasas. Ejemplos de módulos de etiqueta, que pueden usarse en este sentido para la presente invención son: la "etiqueta kemptide" (un péptido que puede fosforilarse por la proteína cinasa A), la "etiqueta de péptido de unión a calmodulina" (CBP), que también puede fosforilarse con proteína cinasa A (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) etc.

Otra posibilidad de uso de los módulos de etiqueta en el sentido de la presente invención es el uso de por ejemplo proteínas, dominios de proteína o secuencias peptídicas, que se unen de manera específica a otra proteína u otra estructura.

A partir de la bibliografía se conocen ejemplos de tales módulos de etiqueta: proteína A, proteína G, proteína A/G, proteína L, uniéndose todas estas proteínas a estructuras de anticuerpos (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.), glutatión-S-transferasa, que se une a glutatión, la "proteína de unión a maltosa" (MBP), que se une a amilosa, estreptavidina o avidina, que se unen las dos a biotina, el "péptido de unión a calmodulina", que se une a calmodulina, la "etiqueta de unión a quitina", que se une a quitina, etc. En general pueden usarse en el sentido de la invención, como módulo de etiqueta, todos los tipos de moléculas que se unen de manera específica a otras moléculas respectivamente, es decir receptor-ligando, anticuerpo-antígeno, lectina-estructura de azúcar, proteína-lípido, proteína-ácido nucleico, proteína-proteína, etc, así como numerosos ejemplos que se describen en la bibliografía [28].

Módulos espaciadores

Como módulos espaciadores en el sentido de la invención pueden usarse todos los tipos de moléculas, que son adecuadas, otros módulos, que son componentes de la molécula MAT, para acoplarse entre sí. El acoplamiento puede tener lugar mediante uniones covalentes. Los módulos espaciadores tienen entre otros el objetivo de separar entre sí espacialmente los diferentes módulos de la molécula MAT de tal modo que no se influyen mutuamente en su funcionalidad. El acoplamiento de los módulos de la molécula MAT en el sentido de la invención, puede tener lugar mediante los módulos espaciadores, que pueden dividirse en un momento más tarde de nuevo, mediante reacciones enzimáticas o químicas, por ejemplo mediante proteasas. Según esto, los módulos de la molécula MAT que se unen mediante los módulos espaciadores se separan entre sí de nuevo en caso necesario. Para esto, en general pueden usarse todas las proteasas conocidas actualmente o las que se conocerán en un futuro [29,30]. Las proteasas usadas con frecuencia actualmente son trombina, factor Xa, enterocinasa o el sistema TAGZyme (Qiagen, Hilden, Alemania), etc. Las diferentes reacciones químicas, que son adecuadas para la división de los módulos espaciadores, son conocidas por el experto o deducirse a partir de la especificación del productor de las moléculas espaciadoras, por ejemplo de la empresa Pierce.

En el caso de módulos espaciadores puede tratarse especialmente de secuencias peptídicas o de moléculas orgánicas. En el estado de la técnica se conocen numerosas moléculas espaciadoras, que pueden usarse en el sentido de la invención. Además, también pueden usarse en el sentido de la invención moléculas espaciadoras, que se han descubierto o se descubrirán en un futuro. Como módulos espaciadores son adecuados entre otros espaciadores peptídicos, agentes de reticulación, polímeros naturales o sintéticos tales como por ejemplo ácidos nucleicos, hidrocarburos sustituidos o no sustituidos, etc.

Secuencias peptídicas como módulos espaciadores

Muchas proteínas, que consisten en varios dominios, tienen en su secuencia de aminoácidos zonas de secuencia cortas que en la bibliografía se denominan también como espaciadores. Estos espaciadores tienen el objetivo de separar espacialmente entre sí diferentes dominios de la proteína, de tal modo que no influyan mutuamente en su funcionalidad. Para esto debe garantizarse especialmente que la secuencia de espaciador sea flexible, de tal modo que los dos dominios no impidan mutuamente de manera estérica en su función.

Las secuencias peptídicas de este tipo pueden usarse en el sentido de la presente invención como módulos espaciadores. Un gran número de secuencias peptídicas de espaciador se describen en la bibliografía. Preferiblemente, estos espaciadores tienen una longitud de entre 2 y 60 aminoácidos, pero pueden presentar también secuencias más largas. Los espaciadores pueden consistir en sólo un aminoácido. Muchos vectores de expresión que pueden obtenerse comercialmente contienen ya zonas de secuencias que codifican para un espaciador peptídico, que por ejemplo unen una secuencia de etiqueta con la secuencia de proteínas insertadas en el vector de expresión. A menudo se usan espaciadores muy cortos, que consisten en sólo dos aminoácidos tales como por ejemplo leucina-glicina, glicina-alanina o serina-alanina (IBA GmbH, Göttingen, Alemania), o secuencias cortas de aminoácidos de desde 4 hasta 6 aminoácidos de longitud que consisten en glicina y/o alanina (Qbiogene Inc., Carlsbad, CA, EE.UU.). Numerosas secuencias de espaciador adicionales se describen en la bibliografía y pueden usarse en el sentido de la presente invención como módulos espaciadores. Principalmente pueden utilizarse como módulo espaciador, todas las moléculas espaciadoras conocidas actualmente y las moléculas espaciadoras que se conocerán en un futuro, en las moléculas MAT según la invención. Un método, para identificar las secuencias de aminoácidos adecuados como módulos espaciadores, es el uso de bancos de datos, que examinan las secuencias de aminoácidos según los dominios de proteínas. Las secuencias de aminoácidos cortas de preferiblemente desde 2 hasta 60 aminoácidos de longitud, que existen en una secuencia de aminoácidos entre dos dominios de proteínas así identificados, pueden usarse como módulos espaciadores en el sentido de la invención. Uno de los bancos de datos que están disponibles actualmente para la identificación de dominios de proteínas y con esto también de secuencias peptídicas, que son adecuadas como módulos espaciadores, es la "biblioteca de dominios de proteínas SBASE" ("SBASE protein domain library") [31].

Agentes de reticulación como módulos espaciadores

En el sentido de la invención pueden insertarse módulos espaciadores también en forma de reticulaciones en la molécula MAT. Para esto se producen los módulos individuales de la molécula MAT y posteriormente se acoplan entre sí de manera covalente con reticulaciones a través de reacciones químicas. Para esto pueden obtenerse comercialmente numerosas reticulaciones. Por ejemplo, la empresa Pierce (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EE.UU.) ofrece numerosas reticulaciones diferentes. Actualmente se puede elegir, por ejemplo, en el caso de Pierce, entre agentes de reticulación que se combinan con grupos amino, grupos sulfhidrilo, estructuras de azúcar, grupos carboxilo, grupos hidroxilo o de manera no selectiva con los módulos, que deben combinarse a una molécula MAT. Además se dispone actualmente de agentes de reticulación, por ejemplo en el caso de Pierce Biotechnoligy Inc., para la producción de moléculas MAT, que pueden separarse de nuevo mediante reacciones químicas determinadas, por ejemplo mediante tioles, bases, peryodato, hidroxilamina, mediante la acción de la luz o mediante reacciones no específicas. Mediante la selección de manera dirigida de los agentes de reticulación, además puede fijarse la distancia entre los módulos individuales de la molécula MAT. Actualmente por ejemplo la empresa Pierce ofrece agentes de reticulación que insertan una separación de desde 1,4 angstroms (yodoacetato de N-succinimidilo) hasta 34,7 angstroms (disulfuro de bis-(beta-(4-azidosalicilamido)etilo), según que agente de reticulación se use. Como posibilidad de variación adicional en el caso del uso de agentes de reticulación para el acoplamiento de diferentes módulos a las moléculas MAT en el sentido de la presente invención, puede usarse los agentes de reticulación sulfo-SBED de la empresa Pierce Biotechnology Inc. Sulfo-SBED acopla dos módulos en uno mediante reacción covalente y contiene además un grupo de biotina en la molécula espaciadora insertada. Entonces a ese grupo de biotina se añade un módulo adicional de la molécula MAT a través de uniones no covalentes. Para esto puede acoplarse el módulo insertado por ejemplo con avidina. Entonces, el módulo acoplado con estreptavidina así producido puede acoplarse a otro módulo a través del grupo de biotina que existe en la reticulación. En el sentido de la invención pueden usarse en principio todas las reticulaciones conocidas actualmente así como las reticulaciones que se conocerán en un futuro para obtener el enlace de los módulos a una molécula MAT.

Módulos espaciadores adicionales

Los módulos espaciadores en el sentido de la invención pueden consistir por ejemplo en isómeros L o en isómeros D de los aminoácidos, en aminoácidos inusuales, en aminoácidos con modificaciones postraduccionales, en ácidos nucleicos, en PNA ("Peptide Nucleic Acids", ácidos nucleicos peptídicos), en lípidos, en estructuras de azúcares, u otros polímeros naturales o sintéticos, tales como por ejemplo hidrocarburos sustituidos o no sustituidos, poliacetato, polietilenglicol, ciclodextrina, polimetacrilato, gelatina, oligourea etc., o en otras sustancias o en combinaciones de las sustancias mencionadas o adicionales. En el sentido de la invención pueden usarse en principio todas las sustancias actualmente conocidas, que son adecuadas para unir módulos a una molécula MAT, así como moléculas que se conocerán en un futuro y tienen propiedades correspondientes como módulo espaciador para obtener el enlace de módulos a una molécula MAT.

Otra variante para insertar el enlace de módulos espaciadores en moléculas MAT es la siguiente: en primer lugar se acoplan por lo menos dos módulos a través de un módulo espaciador de unión no covalente y posteriormente se trata el complejo con agentes de reticulación químicos, que insertan uniones covalentes entre módulos, que se encuentran en las proximidades espaciales. Esto tiene la ventaja de que en la primera etapa se acoplan entre sí de manera dirigida módulos determinados de manera y tipo definido y posteriormente se transforma el acoplamiento no covalente en un acoplamiento covalente estable. Si se tratan los módulos de manera directa con agentes de reticulación, que producen uniones covalentes, entonces es por regla general de manera y tipo casual y no específico, como los módulos se acoplan entre sí.

Estructura de las moléculas MAT

En general es posible cualquiera de las disposiciones de los módulos individuales de la molécula MAT. Cada módulo puede existir una vez o múltiples veces en la molécula MAT. Como condición mínima debe existir al menos un módulo de translocación, al menos un módulo de selección como diana y al menos un módulo de antígeno. Los módulos adicionales tales como módulos de etiqueta, módulos espaciadores etc., pueden existir opcionalmente, pero no tienen que existir. Todos los módulos pueden existir una vez o múltiples veces en la molécula MAT. Si los módulos existen múltiples veces, entonces pueden existir múltiples veces en forma de copias idénticas, o pueden existir versiones diferentes de un módulo en cada copia simple o múltiples copias. También pueden existir módulos completamente diferentes de la misma clase de módulos, por ejemplo un módulo de etiqueta de His y un módulo de etiqueta de biotina, en una molécula MAT. Ambos módulos se encargan funcionalmente del mismo objetivo (módulo de etiqueta) en la molécula MAT, sin embargo no tienen que presentar con respecto a su estructura molecular ninguna afinidad.

Para esto pueden servir por ejemplo dos o más copias idénticas de un módulo de antígeno en una molécula MAt, para producir una respuesta inmunitaria reforzada frente al antígeno respectivo. Por ejemplo, dos o más módulos de antígeno diferentes pueden combinarse en una molécula MAT, para modular simultáneamente la reacción inmunitaria frente a dos más antígenos diferentes. Se usan dos o más módulos de translocación diferentes en una molécula MAT. Por ejemplo, para esto puede servir una secuencia de Tat y una secuencia de VP22, para hacer eficaz la translocación, teniendo lugar entonces de manera eficaz la translocación de la molécula MAT en un amplio espectro de tipos de células diferentes o tipos de tejidos. También pueden usarse por ejemplo dos o más módulos de etiqueta en una molécula MAT, por ejemplo una etiqueta de His y una etiqueta FLAG, usándose la etiqueta de His para aislar la molécula MAT y sirviendo por ejemplo la etiqueta FLAG para identificar a la molécula MAT. Pueden usarse dos o más módulos de selección como diana diferentes en una molécula MAT, por ejemplo una secuencia a partir de la cadena invariante de la molécula MHC II y como módulo de selección como diana adicional, un grupo de manosa-6-fosfato, de los que por ejemplo la cadena invariante actúa como módulo de selección como diana en los MIIC y el grupo manosa-6-fosfato produce una selección como diana en el lisosoma, mediante lo cual puede aumentarse en total la eficacia de la presentación de antígeno o el número de epítopos diferentes del antígeno, que se presentan por las células que presentan antígenos.

También puede variarse arbitrariamente la posición de los módulos individuales dentro de la molécula MAT, mientras que exista al menos un módulo de translocación, al menos un módulo de selección como diana y al menos un módulo de antígeno. Todos o algunos módulos de la molécula MAT pueden encontrarse, por ejemplo en lugar de en forma de una yuxtaposición lineal de módulos, como estructura del módulo circular o como ramificada o también en forma de dendrímeros, o como una combinación de partes de la molécula lineal y/o ramificada y/o circular y/o dendrímera. Las estructuras del módulo circulares de la molécula MAT pueden generarse por ejemplo mediante reacción de dos restos de cisteína entre sí o mediante la reacción de dos restos de cisteína con un grupo tioléster dentro de una cadena de módulos estructurada originalmente de manera lineal. Hay proveedores comerciales de vectores de expresión, que ofrecen vectores especiales, que hacen posible producir a través de estos mecanismos proteínas de fusión circulares, tales como por ejemplo el sistema IMPACT™-TWIN de la empresa New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU. Los módulos ramificados pueden producirse por ejemplo mediante síntesis de péptidos, en los que, partiendo de poli L-lisina, cada uno de los restos de lisina sucesivos de los dos grupos amino libres se transforma en un nuevo resto de lisina. Según esto puede crearse casi cualquier estructura peptídica. Entonces, posteriormente, pueden sintetizarse por ejemplo módulos de translocación y/o módulos de selección como diana en la estructura principal peptídica ramificada [32]. También, mediante la ligación de proteínas, pueden acoplarse módulos adicionales a un estructura principal peptídico ramificada o circular [33, 34]. Además, pueden insertarse en el caso de la síntesis de péptidos por ejemplo grupos de biotina en la estructura principal peptídica y entonces pueden unirse los módulos de esos grupos de biotina, a través por ejemplo de estreptavidina, el sistema Strip-Tag o a través del sistema PinPoint™ (IBA GmbH, Göttingen, Alemania o Promega Biosciences Inc., San Louis Obispo, CA, EE.UU.) a la estructura principal peptídica. Los módulos así unidos se acoplan entonces a través de uniones no covalentes a la estructura principal peptídica.

La formación 1 muestra a modo de ejemplo algunos ejemplos, de cómo pueden formarse las moléculas MAT con respecto a su composición partir de módulos diferentes y con respecto a la disposición de los módulos dentro de la molécula MAT.

Estructura de los módulos de las moléculas MAT Péptidos, proteínas, aminoácidos, aminoácidos inusuales, modificaciones postraduccionales etc.

Los términos péptido y proteína se usan en la presente solicitud de patente paralelamente de igual manera. Por un péptido o una proteína en el sentido de la invención se entiende un compuesto covalente de al menos dos aminoácidos a través de un enlace peptídico. El término "aminoácido" y el término "resto de aminoácido" se utiliza en la presente solicitud de igual manera, es decir el significado de ambos términos es idéntico. Los términos aminoácidos / resto de aminoácido y péptido / proteína se usan en la presente solicitud en forma de la definición más amplia posible.

Por aminoácido en el sentido de la invención se entiende además de los 20 aminoácidos determinados mediante el código genético, también los aminoácidos, que pueden codificarse por los codones de finalización, tales como por ejemplo selenocisteína o pirrolisina. Además se incluyen todos los derivados de aminoácidos y péptidos conocidos tales como por ejemplo aminoácidos / péptidos sulfatados, fosforilados, glicosilados, así como los isómeros L e isómeros D de aminoácidos, así como los derivados de aminoácidos y péptidos que aún se conocerán en un futuro. Los derivados de aminoácidos y péptidos pueden producirse mediante modificaciones postraduccionales, mediante modificaciones químicas, mediante modificaciones enzimáticas o debido a otros mecanismos, o pueden producirse de manera dirigida. Los péptidos resultantes pueden contener modificaciones, que pueden producirse en todas las zonas de la molécula peptídica. Por ejemplo, las modificaciones pueden producirse en la cadena principal peptídica ("esqueleto peptídico"), en las cadenas laterales de los aminoácidos, en los extremos N-terminales del péptido o en los extremos C-terminales del péptido. Las modificaciones pueden existir en un único aminoácido, en varios aminoácidos o en todos los aminoácidos y pueden existir ningún, uno o más tipos de modificaciones en cualquier combinación en un péptido. Los péptidos pueden ser ramificados, pueden encontrarse péptidos cíclicos y pueden encontrarse cualquier combinación de péptidos cíclicos y ramificados. Los péptidos cíclicos y/o ramificados pueden producirse a través de procesos biológicos naturales o pueden producirse sintéticamente. Como ejemplos de aminoácidos inusuales se mencionan entre otros a modo de ejemplo: ácido alfa-aminobutírico, ácido beta-aminobutírico, ácido beta-aminoisobutírico, beta-alanina, ácido gamma-aminobutírico, ácido alfa-aminoadípico, ácido 4-aminobenzoico, aminoetilcisteína, ácido alfa-aminopenicilánico, alisina, ácido 4-carboxiglutámico, cistationina, ácido carboxiglutámico, carboxiamidometilcisteína, carboximetilcisteína, ácido cisteico, citrulina, deshidroalanina, ácido diaminobutírico, ácido deshidroamino-2-butírico, etionina, dipéptido de glicina-prolina, 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, hidroxiprolina, homoserina, homocisteína, histamina, isovalina, lisinoalanina, lantionina, norvalina, norleucina, ornitina, ácido 2-piperidincarboxílico, ácido piroglutámico, pirrolisina, dipéptido de prolina-hidroxiprolina, sarcosina, 4-selenocisteína, sindesina, tioprolina, etc. Todos los aminoácidos mencionados pueden existir en forma de su isómero L o en forma de su isómero D, siempre que esto permita su estructura. En general por el término "aminoácido" se engloban todos los aminoácidos y derivados de aminoácidos producidos o que pueden producirse enzimática o químicamente o de otra manera o tipo o que se producen naturalmente, actualmente conocidos, así como las modificaciones de los aminoácidos que se conocerán en un futuro y pueden ser en el sentido de la invención componentes de las moléculas MAT.

Como modificaciones químicas o postraduccionales, que pueden estar contenidas en el sentido de la invención en un único o varios módulos de la molécula, se mencionan como posibles entre otras las modificaciones de las secuencias de aminoácidos mediante las siguientes estructuras a modo de ejemplo: unión de una cisteína libre a una cisteína en la secuencia peptídico, formación de puentes disulfuro entre dos restos de cisteína, metilaciones, acetilaciones, acilaciones, farnesilaciones, formilaciones, geranilaciones, biotinilaciones, estearoilaciones, palmitilaciones, lipoilaciones, C-manosilaciones, miristoilaciones, fosforilaciones, sulfatilaciones, N-glucosilaciones, O-glucosilaciones, amidaciones, desamidaciones, desmetilaciones, cisteinilaciones, carboxilaciones, hidroxilaciones, yodaciones, oxidaciones, pegilaciones, prenilaciones, ADPribosilaciones, 5'-adenosilaciones, 4'-fosfopanteinilaciones, glutationilaciones, uniones covalentes: de flavina, de grupos urea (u otras porfirinas), de ácidos nucleicos o de derivados de ácidos nucleicos, de lípidos o de derivados de lípidos, de fosfatidilinositol, de anclas de glicosilfosfatidilinositol (anclas GPI), de fosfato de piridoxal, de manosa-6-fosfato, modificaciones de cisteína para dar carboxiamidometilcisteína o carboximetilcisteína o piridiletilcisteína, modificaciones de lisina para dar ácido lipoico, modificaciones de glutamina para dar ácido piroglutámico, adición de aminoácidos a péptidos mediante ARNt, marcaciones con ubiquitina de péptidos, ramificaciones de péptidos por ejemplo en forma de poli-L-lisina, ciclaciones de péptidos, por ejemplo mediante la formación de puentes disulfuro entre dos restos de cisteína, etc. En la bibliografía de describen numerosas modificaciones adicionales de proteínas, que se archivan entre otros en bancos de datos [35]. En general, por el término "péptido" se engloban todas las modificaciones de péptidos que se producen o pueden producirse enzimática o químicamente o de otra manera y tipo o que se producen naturalmente, actualmente conocidas así como las modificaciones de péptidos que se conocerán en un futuro y pueden ser en el sentido de la invención componentes de las moléculas MAT.

Peptidomiméticos

Además en el sentido de la invención pueden sustituirse aminoácidos individuales o múltiples de los módulos o todo el módulo o todos los módulos de la molécula MAT por estructuras, compuestas de peptidomiméticos. El término peptidomiméticos se utiliza en la presente solicitud en forma de la más amplia definición posible. Un peptidomimético es una sustancia, que contiene elementos estructurales no peptídicos y que puede imitar o antagonizar el efecto biológico de la molécula madre natural. En el estado de la técnica se conocen numerosos trabajos, que de manera explícita se refieren a la posibilidad del aprovechamiento de peptidomiméticos como sustitución para estructuras peptídicas habituales. En general uno o varios módulos de la molécula MAT pueden estar compuestos completamente o por partes por peptidomiméticos [36-38]. Esto puede tener diferentes ventajas. De ese modo los módulos de translocación pueden penetrar eventualmente de una manera más eficaz en las células, los módulos de selección como diana pueden transportar la molécula MAT de una manera más eficaz o menos eficaz y/o más específica en el orgánulo intracelular deseado, los módulos de antígeno pueden llevar a una respuesta inmunitaria reforzada o reducida con respecto a la respuesta inmunitaria contra el antígeno habitual o los módulos de etiqueta pueden tener mejores propiedades fisicoquímicas, lo que mejora su idoneidad para el aislamiento y/o detección de la molécula MAT, etc. Además mediante el uso de peptidomiméticos puede reducirse o aumentarse eventualmente la estabilidad in vivo de la molécula MAT, reducirse o aumentarse su toxicidad, mejorarse su solubilidad en medios hidrófilos o hidrófobos y prolongarse su conservabilidad in vivo y eventualmente reducirse los costes de síntesis para el peptidomimético con respecto a los costes de síntesis del péptido habitual correspondiente. Un ejemplo de peptidomiméticos son Spiegelmere® de la empresa NOXXON Pharma AG, Berlín, Alemania. Este tipo de peptidomiméticos tiene por ejemplo la ventaja de que no provocan ninguna respuesta inmunitaria y por tanto podría utilizarse por ejemplo en módulos de translocación, módulos de selección como diana, módulos de etiqueta, módulos espaciadores, etc. de moléculas MAT de manera conveniente. Sin embargo los Spiegelmere® no serían adecuados como módulo de antígeno.

Producción y aislamiento de moléculas MAT

La obtención de moléculas MAT usando sistemas de expresión recombinantes, métodos cromatográficos y protocolos de síntesis químicos, conocidos para el experto, es posible. Las moléculas MAT así obtenidas pueden utilizarse entre otros para la producción de medicamentos y medios diagnósticos así como para la producción de anticuerpos en animales de laboratorio y en sistemas in vitro.

Producción de moléculas MAT

A los métodos conocidos para el experto para la producción de moléculas MAT pertenece la expresión recombinante de péptidos. Para la expresión de péptidos pueden utilizarse entre otros sistemas celulares como por ejemplo bacterias como Escherichia coli, células de levadura como Saccharomyces cerevisiae, células de insecto como por ejemplo células de Spodoptera frugiperda (Sf-9), o células de mamífero tales como células de "ovario de hámster chino" (CHO). Estas células pueden obtenerse de la "Colección Americana de Cultivos Tipo" (ATCC). Para la expresión recombinante de péptidos se incorporan por ejemplo secuencias de ácidos nucleicos, que codifican para moléculas MAT enteras o para módulos individuales de moléculas MAT en combinación con secuencias de ácidos nucleicos reguladoras adecuadas tales como por ejemplo marcadores de selección, promotores, etc. con métodos de biología molecular en un vector de expresión. Marcadores de selección adecuados son por ejemplo resistencias frente a antibióticos tales como ampicilina, kanamicina, neomicina, puromicina o defectos del metabolismo, por ejemplo células de levadura, que no pueden producir alanina, leucina, triptófano, etc. o células de mamífero, a las que le falta la enzima "hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa" y que por ello no pueden sobrevivir en el medio HAT (medio de hipoxantina, aminopterina y timidina), etc. Promotores adecuados son por ejemplo el "promotor inmediato temprano del citomegalovirus" (promotor CMV), el promotor SP1-mínimo o el promotor timidina-cinasa (promotor TK). En la selección de los promotores deben seleccionarse para el sistema celular respectivo promotores adecuados. Para bacterias es adecuado por ejemplo el promotor T7 o el T7/IacO, mientras que para por ejemplo las células de levadura es adecuado el promotor nmt1. En el caso de moléculas MAT tóxicas o módulos de moléculas MAT puede ser ventajoso o necesario, utilizar vectores de expresión, que permiten controlar la expresión de estas moléculas desde fuera, por ejemplo mediante el sistema de expresión Tet-On™ y el Tet-Off™ (Promega Biosciences, San Louis, CA, EE.UU.).En este sistema se regula la actividad del promotor de los vectores de expresión mediante la adición de tetraciclina al medio de crecimiento de las células. Ejemplos adicionales de métodos, que pueden utilizarse para la regulación externa de la expresión de moléculas MAT o de módulos de moléculas MAT, es la inducción de la T7 polimerasa mediante IPTG o el uso de sistemas de expresión que pueden inducirse con ecdisona como por ejemplo el sistema "Complete Control® Inducible Mammalian Expression System" (Stratagene, La Jolla, MO, EE.UU.). En el uso de vectores, que contienen una secuencia IRES ("Sitio Interno de Entrada al Ribosoma") pueden producirse también simultáneamente varias moléculas mediante el uso de sólo un vector de expresión (por ejemplo el vector pLP-IRESneo (Promega Biosciences, San Louis, CA, EE.UU.). De este modo pueden expresarse paralelamente y eventualmente también purificarse paralelamente por ejemplo dos o más módulos de una molécula MAT, que deben interactuar entre sí mediante enlaces no covalentes en proporciones cuantitativas estequiométricas ajustadas entre sí. Diferentes empresas ofrecen vectores de expresión que pueden obtenerse comercialmente para diferentes sistemas celulares, por ejemplo las empresas Invitrogen, Qiagen, Stratagen, Clontech, Novagen, New England Biolabs, Pharmingen, Promega, Pharmacia, etc. Los vectores de expresión así obtenidos pueden incorporarse entonces en células adecuadas, por ejemplo mediante electroporación, precipitación conjunta con fosfato de calcio, transfección mediada por liposomas, etc., de una forma conocida para el experto. Alternativamente también pueden utilizarse virus recombinantes producidos mediante métodos de biología molecular, que luego a su vez infectan células y provocan, que las células infectadas expresen moléculas MAT o módulos de moléculas MAT. Sistemas de expresión virales adecuados son por ejemplo el sistema de baculovirus, por ejemplo BacculoGold (BD Bioscience Pharmingen, Palo Alto, CA, EE.UU.), sistemas de expresión adenovirales como por ejemplo ViraPort™ (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), sistemas de expresión retrovirales como por ejemplo AdEasy (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) etc.

Alternativamente a la transfección de vectores de expresión y a los sistemas de expresión virales pueden utilizarse también sistemas de translación in vitro, en los que se utilizan por ejemplo lisados de reticulocitos de conejo o extractos de E. coli S30 o extractos de germen de trigo para la síntesis de moléculas MAT o para la síntesis in vitro de módulos de moléculas MAT, sin necesitar células vivas para la expresión.

Sistemas celulares para la producción de moléculas MAT

Como material de partida para la producción de moléculas MAT o la producción de módulos individuales de moléculas MAT pueden utilizarse lisados de células o sobrenadantes de cultivos celulares. Los sistemas celulares pueden obtenerse por ejemplo de bacterias tales como por ejemplo E. coli, bacillos, caulobacterias, pseudomonas o estreptomicetos o levaduras, como por ejemplo Saccharomyces, Pichia o Hansenula, o células de insecto como por ejemplo Sf-9, Sf-21 o High Five, o células de mamíferos, como por ejemplo células CHO, células COS, células 3T3, células BHK, células 293 etc. Mediante el uso de secuencias de señal, que provocan la exportación de proteínas a partir del interior de la célula al espacio extracelular, pueden enriquecerse de manera encauzada la proteína que ha de expresarse en el medio de cultivo celular o en el espacio periplasmático de por ejemplo bacterias. Una fuente adicional para material de partida para la producción de moléculas MAT o de módulos de moléculas MAT pueden ser animales transgénicos, plantas transgénicas, hongos transgénicos o microorganismos transgénicos, en los que se insertan ácidos nucleicos de manera estable o temporal, que codifican para moléculas MAT o módulos de moléculas MAT. Los ácidos nucleicos correspondientes pueden integrarse en este caso tanto directamente en el genoma del organismo respectivo, como también insertarse por ejemplo en forma de plásmidos o en forma de otras moléculas de ADN o ARN en los organismos. Las moléculas MAT correspondientes o módulos de moléculas MAT pueden obtenerse entonces por ejemplo de la leche, los huevos, del suero, de la orina, de tejido etc. de los animales transgénicos, de por ejemplo tubérculos, semillas, hojas etc. de plantas transgénicas, de por ejemplo el micelio, el cuerpo frutal, etc. de los hongos transgénicos o de células cultivadas in vitro u otros organismos o de los medios cultivo celular correspondientes. En general son adecuados todos los tipos de organismos, como sistemas de expresión para la producción de moléculas MAT o de módulos de moléculas MAT para su utilización.

Aislamiento de moléculas MAT

Las moléculas MAT o módulos de moléculas MAT así producidos pueden aislarse con técnicas, conocidas para el experto. Para ello pueden utilizarse numerosos métodos conocidos para el experto para el aislamiento de proteínas, como por ejemplo métodos de precipitación, métodos de separación de fases líquidas, métodos cromatográficos, etc. A los métodos de precipitación adecuados pertenecen entre otros la inmunoprecipitación, precipitación con sulfato de amonio, precipitación con polietilenglicol, precipitación con etanol, precipitación con ácido tricloroacético (precipitación TCA), precipitación térmica, etc. A los métodos de separación de fases líquidas pertenecen por ejemplo la extracción con disolventes orgánicos como por ejemplo alcoholes, acetona, cloroformo, acetonitrilo, etc., a los métodos cromatográficos pertenecen por ejemplo la cromatografía de intercambio catiónico, la cromatografía de intercambio aniónico, el enfoque isoeléctrico, la cromatografía en fase inversa, filtración en gel, cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC), pudiendo utilizar diferentes iones metálicos, como por ejemplo níquel, zinc, cobalto, etc., cromatografía en hidroxiapatita, numerosos métodos cromatográficos de afinidad diferentes como por ejemplo cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad utilizando ácidos nucleicos inmovilizados, o inhibidores de proteasa inmovilizados, etc. Los medios de cromatografía utilizados pueden estar compuestos a base de una matriz de agarosa, a base de partículas magnéticas, en forma de membranas, en forma de fibras huecas, a base de diferentes polímeros como por ejemplo poliestireno, etc. Los métodos cromatográficos pueden realizarse en general en las escalas más diferentes partiendo de columnas de cromatografía con pocos \mul de volumen hasta columnas de cromatografía grandes con varios cientos de litros de volumen. Además las cromatografías pueden realizarse a presión atmosférica normal, a presiones medias en el intervalo de 1 a 50 bar (por ejemplo el sistema FPLC, Pharmacia Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) y a presiones muy altas en el intervalo de hasta aproximadamente 400 bar y eventualmente aún presiones superiores (sistemas HPLC). Las cromatografías pueden realizarse en condiciones, que actúan sobre las moléculas MAT de forma nativa y desnaturalizante. En el caso de la cromatografía de afinidad pueden utilizarse diferentes interacciones entre material de matriz y una molécula MAT o módulo de moléculas MAT que ha de aislarse. Entre ellos se encuentran numerosas moléculas de etiqueta ya mencionadas en otro punto de la presente solicitud de patente, que interactúan con determinados ligandos o grupos funcionales y así permiten un aislamiento de moléculas MAT o módulos de moléculas MAT. Sin embargo en principio pueden utilizarse todos los tipos de interacción, como por ejemplo interacciones proteína-proteína, interacciones ácido nucleico-proteína, interacciones ácido nucleico-ácido nucleico, interacciones azúcar-lectina, interacciones azúcar-proteína, interacciones receptor-ligando, interacciones anticuerpo-antígeno (por ejemplo anticuerpos anti-etiqueta FLAG, anti-etiqueta HA, anti-etiqueta myc), interacciones hapteno-anticuerpo, interacciones Spiegelmer (NOXXON Pharma AG, Berlín, Alemania) etc.

Cromatografía de afinidad

Para la cromatografía de afinidad puede recurrirse especialmente a métodos, que se basan en la unión selectiva de un módulo de etiqueta a una matriz. Combinaciones adecuadas de módulos de etiqueta y matriz perteneciente para el aislamiento de una molécula MAT son entre otras: etiqueta de histidina y matriz de quelato de níquel (Qiagen, Hilden, Alemania), etiqueta GST y glutatión-sefarosa (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), etiqueta de proteína de unión a maltosa y matriz de amilosa (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.), etiqueta de biotina y matriz de estreptavidina o avidina (IBA GmbH, Göttingen, Alemania), etiqueta de proteína de unión a quitina y matriz de quitina (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.), etiqueta de péptido de unión a calmodulina y matriz de calmodulina (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), proteína A o proteína G o proteína A/G o proteína L y zonas de moléculas de anticuerpos determinadas reconocidas por cada una de las proteínas, tales como por ejemplo la parte Fc de anticuerpos (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), etiqueta FLAG, etiqueta HA, etiqueta myc, etiqueta de histidina, etc. y una matriz, a la que se acopla un anticuerpo frente a la etiqueta respectiva (muchas empresas diferentes, entre otras Promega Biosciences Inc., San Louis Obispo, CA, EE.UU., Invitrogen, Breda, Países Bajos, Qiagen, Hilden, Alemania) etc.

Secuencias de reconocimiento de proteasas

Las moléculas MAT o módulos de moléculas MAT así aisladas pueden separarse dado el caso de su módulo de etiqueta y/u otros módulos. Para ello puede incorporarse por ejemplo una secuencia de reconocimiento de proteasas en posiciones adecuadas en el vector de expresión respectivo. El experto conoce numerosas secuencias de reconocimiento de proteasas adecuadas, entre otras las secuencias de reconocimiento de proteasas como por ejemplo trombina, factor Xa, enterocinasa, o el sistema TAGZyme (Qiagen, Hilden, Alemania). Las proteasas añadidas pueden volver a separarse por ejemplo mediante inhibidores de proteasa inmovilizados como por ejemplo EK-AWAY para enterocinasa (Invitrogen, Breda, Países Bajos), Xa Removal Resin (Qiagen Hilden, Alemania), benzamidin-sefarosa para la separación de trombina, etc. Una posibilidad adicional para el aislamiento de moléculas MAT o módulos de moléculas MAT es el uso de inteínas, es decir de proteasas, que son componente de la molécula MAT y que luego se disocian por sí mismas en condiciones experimentales adecuadas del resto de la molécula MAT o de un módulo de una molécula MAT (Genease™, New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.). En general son adecuadas todas las secuencias de reconocimiento de proteasas conocidas por el momento [29, 30] y que se conocerán en el futuro, para separar en el sentido de la invención componentes de moléculas MAT. Las secuencias de reconocimiento de proteasas pueden presentarse en este caso tanto naturalmente en la naturaleza como haberse concebido de manera dirigida y pueden componerse completa o parcialmente de aminoácidos naturales, aminoácidos inusuales, peptidomiméticos, etc.

Cuerpos de inclusión

Además es posible la producción de moléculas MAT o de módulos de moléculas MAT en forma de agregados de proteínas no plegados correctamente, que también se denominan como "cuerpos de inclusión" ("inclusion bodies"). Los cuerpos de inclusión pueden producirse como moléculas, que contienen módulos de translocación, que permiten un transporte desde el espacio extracelular a través de la membrana celular al interior de la célula. Esta translocación conduce a que las moléculas originalmente no plegadas de forma correcta, se plieguen correctamente y luego actúen intracelularmente como una molécula MAT plegada correctamente desde el principio. Esta forma de proceder tiene la ventaja, de poder aislar proteínas no plegadas en condiciones desnaturalizantes, lo que con frecuencia se relaciona a un esfuerzo técnico y con ello financiero más reducido. Además los cuerpos de inclusión son estructuras relativamente estables. Esto conlleva eventualmente ventajas en el almacenamiento y la conservabilidad de moléculas MAT que se preparan para un uso médico posterior. Mediante este procedimiento pueden utilizarse también moléculas MAT o módulos de moléculas MAT en el sentido de la invención no plegadas o no plegadas correctamente. Determinados módulos de translocación provocan tanto una translocación desde el espacio extracelular a la célula, como también el transporte inverso. La transformación de una molécula MAT aún no plegada correctamente puede tener lugar directamente in vivo en el individuo que ha de tratarse con la molécula MAT, o el plegado de la molécula MAT puede tener lugar in vitro en un sistema celular. Además la translocación de la molécula MAT no plegada al interior de la célula y la translocación posterior de la molécula MAT plegada entonces correctamente en el espacio extracelular pueden producirse eventualmente mediante el mismo módulo de translocación. Para algunas secuencias, que son adecuadas como módulo de translocación en el sentido de esta invención, como por ejemplo la secuencia VP22, se conoce un mecanismo de este tipo [39].

Modificación de moléculas MAT

Las moléculas MAT o módulos de moléculas MAT pueden modificarse mediante numerosos procedimientos conocidos para el experto de manera enzimática, química o mediante otros procedimientos. Por ejemplo los péptidos pueden dotarse de grupos de fósforo usando cinasas, usando fosfatasas pueden eliminarse grupos de fósforo, las estructuras de azúcar pueden eliminarse usando glicosidasas, etc. Las correspondientes cinasas, fosfatasas y glicosidasas, etc. y los protocolos correspondientes pueden obtenerse de diferentes fabricantes, como por ejemplo New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU. La fosforilación de moléculas MAT o de módulos de moléculas MAT puede utilizarse además para marcar moléculas MAT o módulos de moléculas MAT con fósforo radiactivo, mediante lo cual éstos pueden identificarse entonces in vitro y/o in vivo de una forma sencilla. Las moléculas MAT o módulos de moléculas MAT pueden modificarse también mediante reacciones químicas. Por ejemplo los puentes disulfuro pueden romperse mediante reducción, los grupos de tioéster pueden reaccionar de forma covalente con restos de cisteína, o dos restos de cisteína pueden reaccionar para dar un puente disulfuro, mediante lo cual pueden producirse moléculas MAT o módulos de moléculas MAT circulares o ramificados (por ejemplo "IMPACT™-TWIN Protein Fusion and Purification System", New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.). Mediante la selección del sistema de expresión también puede influirse de manera dirigida en las modificaciones de la molécula MAT o módulos de moléculas MAT. Por ejemplo en las bacterias no tiene lugar ninguna glucosilación y las células de insecto sólo sintetizan determinados tipos de glucosilaciones, mientras que las células de mamíferos producen glucosilaciones completas. Para la expresión pueden utilizarse también líneas celulares, que se modificaron de tal manera o se seleccionaron de tal manera, que producen determinadas modificaciones postraduccionales de manera dirigida, o no pueden producir de manera dirigida. Estas propiedades ventajosas pueden ser entre otras una mejor solubilidad en disolventes hidrófilos o hidrófobos, una conservabilidad más duradera de la molécula MAT a por ejemplo temperatura ambiente, a 37ºC, a 4ºC, a -20ºC, a -70ºC o a otras temperaturas, una estabilidad molecular más duradera de las moléculas MAT, cuando se presentan individualmente o en mezclas con otras sustancias sólidas, líquidas o gaseosas, por ejemplo en forma de preparaciones como medicamento o medio diagnóstico, una permeabilidad superior de las moléculas MAT para membranas celulares, para membranas de orgánulos, para la barrera hematoencefálica, para la barrera hematocefalorraquídea y para otras barreras y membranas biológicas, etc., una vida media superior o inferior in vivo o in vitro, una toxicidad inferior o superior, una mejor posibilidad de comprobación in vivo o in vitro de la molécula, MAT etc.

Ligación de proteínas

Una posibilidad adicional de producir moléculas MAT o módulos de moléculas MAT es la ligación de proteínas. Con esto se entiende por ejemplo una reacción química, en la que dos extremos de péptidos se unen entre sí mediante una o varias reacciones químicas de manera covalente. Un ejemplo sería la reacción de un tioéster con una cadena lateral de cisteína (por ejemplo "IMPACT™-TWIN Protein Fusion and Purification System", New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.). De este modo pueden producirse por ejemplo péptidos cíclicos. Las moléculas MAT ramificadas pueden producirse por ejemplo mediante la síntesis química de péptidos de polilisina, en los que a cada lisina se añaden en cada caso dos restos de lisina adicionales (en cada caso una lisina en cada grupo amino de la lisina) y así se produce un péptido de polilisina ramificado. A continuación puede sintetizarse entonces en cada lisina en cada extremo una cadena de péptidos, o mediante ligación de péptidos puede añadirse un péptido de manera covalente. También pueden utilizarse otros polímeros ramificados como estructura portadora para moléculas MAT o módulos de moléculas MAT en el sentido de la invención. Un ejemplo de ello son por ejemplos las moléculas "PEG star" que pueden producirse mediante polimerización de óxido de etileno con divinilbencenos reticulados.

Peptidomiméticos

Una posibilidad adicional para la producción de moléculas MAT o módulos de moléculas MAT es la síntesis química de péptidos o peptidomiméticos [40] o de combinaciones de péptidos y peptidomiméticos. La producción de moléculas MAT o módulos de moléculas MAT mediante síntesis química puede realizarse por ejemplo según el protocolo de síntesis en fase sólida de Merrifield usando máquinas automáticas de síntesis o productos químicos de síntesis, que pueden obtenerse de diferentes fabricantes. Un ejemplo de una empresa, que ofrece síntesis de peptidomiméticos es "The Peptide Laboratory®", Benicia, CA, EE.UU. En Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, EE.UU. pueden adquirirse por ejemplo numerosas unidades de síntesis para péptidos habituales y para peptidomiméticos.

Composición de medicamentos, y medios diagnósticos

Los porcentajes de péptidos, porcentajes de aminoácidos, porcentajes de derivados de aminoácidos, porcentajes de peptidomiméticos etc. de las moléculas MAT contenidos en los medicamentos y medios diagnósticos pueden presentarse también en forma de sus sales, siempre que en el caso de estas sales se trate de sales farmacológicamente aceptables. Medicamentos o medios diagnósticos, previstos para su inyección, pueden ser por ejemplo disoluciones acuosas u oleosas estériles, mezclados de manera correspondiente al estado de la técnica con aditivos adecuados como por ejemplo agentes de dispersión, agentes de humectación y medios, que estabilizan suspensiones. Las disoluciones de inyección estériles pueden producirse con disolventes o diluyentes farmacológicamente aceptables, como por ejemplo 1,3-butanodiol. Entre los disolventes y sustancias tampón aceptables que pueden utilizarse son entre otros el agua, disolución Ringer, disoluciones de cloruro de sodio isotónicas, etc. Adicionalmente pueden utilizarse aceites estériles, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Adicionalmente puede recurrirse a ácidos grasos tales como por ejemplo ácido oleico para la preparación de las disoluciones de inyección. Además pueden emplearse dimetilacetamida, detergentes, incluyendo detergentes iónicos y no iónicos, polietilenglicoles, etc. También son posibles las mezclas de las sustancias anteriormente mencionadas. Además pueden producirse medicamentos también en forma de mezclas con polímeros biológicamente degradables, que liberan los medicamentos de manera continua. Un ejemplo de un sistema de este tipo es por ejemplo el sistema Atrigel (Atrix Labs, Fort Collins, CO, EE.UU.).

Para aplicaciones por vía rectal puede recurrirse a preparaciones, que se componen de mezclas compuestas de moléculas MAT y dado el caso sustancias adicionales con una sustancia de relleno o pomada adecuada, no irritante como por ejemplo manteca de cacao, polietilenglicol, ácidos grasos o mono, di o triglicéridos sintéticos. Además pueden contener colorantes, conservantes y sustancias aromatizantes. Estas y otras sustancias adecuadas son sólidas a temperatura ambiente y se derriten a temperatura corporal, de modo que liberan las sustancias contenidas.

Para la aplicación por vía oral pueden utilizarse entre otras cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, gránulos, etc. En tales presentaciones farmacéuticas los principios activos de los medicamentos y medios diagnósticos se combinan con frecuencia con adyuvantes, adecuados para la presentación farmacéutica correspondiente. Las sustancias pueden tratarse con lactosa, sacarosa, polvo de almidón, ésteres de celulosa, ácidos alcanoicos, ésteres alquílicos de celulosa, ácido esteárico, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio o calcio del ácido fosforoso o sulfuroso, gelatina, goma arábiga, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), etc. para dar por ejemplo comprimidos, cápsulas, etc. Tales cápsulas, comprimidos, etc. pueden contener adicionalmente sustancias, que permiten o promueven una liberación controlada de los principios activos, como por ejemplo hidroxipropilmetilcelulosa. Además pueden contener sustancias tampón tales como citrato de sodio, carbonato o bicarbonato de magnesio o calcio, etc. Otros componentes pueden ser colorantes, aromatizantes, sustancias de sabor, conservantes y edulcorantes. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, etc. pueden contener aún adicionalmente recubrimientos, que por un lado los convierte en resistentes frente al ácido gástrico, que por otro lado provocan, que se disuelvan en el medio alcalino del intestino.

Para la aplicación por vía oral pueden utilizarse también disoluciones, jarabes, preparaciones en forma de gel y emulsiones farmacéuticamente aceptables y líquidas. Estas preparaciones pueden contener disolventes, que se utilizan en la medicina, tales como por ejemplo agua, etanol, etc. Estas preparaciones pueden contener también adyuvantes, agentes humectantes, emulsionantes y agentes de suspensión, etc. así como edulcorantes, sustancias de sabor, colorantes, conservantes y sustancias aromatizantes.

Las preparaciones líquidas, previstas para su inyección, pueden producirse a partir de polvos estériles o a partir de gránulos mediante disolución en disolventes acuosos o no acuosos. Los polvos y gránulos en los que se basan estas disoluciones pueden contener una o varias de las sustancias mencionadas para los medicamentos que pueden aplicarse por vía oral. Disolventes adecuados son entre otros agua, polietilenglicol, polipropilenglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de semillas del algodón, aceite de coco, alcohol bencílico, disoluciones de cloruro de sodio u otros tampones diferentes. Como componentes adicionales son posibles colorantes, conservantes, etc.

La cantidad de moléculas MAT y otros constituyentes de los medicamentos depende de la presentación farmacéutica, la frecuencia de administración, la vía de aplicación seleccionada, la edad, el sexo, el peso y el estado de salud del paciente, etc. Además ha de tenerse en cuenta, si el tratamiento se realiza para el diagnóstico, la terapia o para la profilaxis y si mediante el tratamiento debe conseguirse una intensificación de la reacción inmunitaria o una disminución de la reacción inmunitaria. Para la formulación y dosificación de medicamentos el experto conoce numerosos trabajos [41, 42].

Vías de aplicación para medicamentos y medios diagnósticos según la invención

Los medicamentos y medios diagnósticos según la invención pueden administrarse al paciente o a un animal de laboratorio que ha de inmunizarse a través de diferentes vías. Entre estos métodos se encuentran entre otras la administración por vía oral y por vía sublingual, por ejemplo en forma de comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, gránulos, disoluciones líquidas, polvos para disolver en líquidos, etc. pudiendo estar compuestos los comprimidos recubiertos de azúcar, comprimidos, gránulos y cápsulas dado el caso de tal manera, que los medicamentos lleguen al intestino sin influencia del medio ácido del estómago y liberen los componentes de los medicamentos sólo en éste. Además los medicamentos pueden administrarse mediante aplicación tópica sobre la piel o sobre las mucosas por ejemplo en forma de pomadas, pulverizadores, polvos, tinturas, etc. o inhalarse como aerosol a través de las mucosas por ejemplo a través de las vías respiratorias. También es posible la aplicación por vía rectal en forma de supositorios, enemas, etc. En el caso de la aplicación por vía transdérmica de los medicamentos pueden utilizarse también aditivos tales como emplastos o aparato de iontoporesis (aplicación por vía transdérmica con ayuda de corrientes eléctricas). Otras formas adecuadas de administración de los medicamentos y medios diagnósticos según la invención son inyecciones, infusiones o la administración mediante sistemas de bombeo médicos. Las inyecciones, infusiones y la administración mediante sistemas de bombeo pueden realizarse entre otros de forma intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea, intraarticular, intraesternal, intratecal, intraperitoneal, etc. También es posible la inyección directa de las moléculas MAT en nódulos linfáticos como por ejemplo en nódulos linfáticos inguinales. Una forma posible de la aplicación de moléculas MAT es el tratamiento in vitro de células de pacientes, especialmente de células, especializadas en la presentación de antígenos, como por ejemplo las células dendríticas, linfocitos B, macrófagos, otras células similares a los macrófagos, etc. Como ejemplo adicional pueden tratarse células de animales de laboratorio, o líneas celulares con moléculas MAT. Las células tratadas pueden administrarse entonces posteriormente al paciente o al animal de laboratorio. Las células pueden administrarse al paciente o al animal de laboratorio como células vivas, como células inactivadas sin capacidad de división, o como células muertas. Las células inactivadas o muertas pueden obtenerse por ejemplo mediante tratamiento con sustancias adecuadas o mediante irradiación, por ejemplo con radiación radiactiva o ultravioleta. Otra posibilidad de la aplicación de los medicamentos, especialmente de las moléculas MAT según la invención es la transfección estable o temporal, de células animales, humanas o vegetales con un vector, que conduce a la expresión de una molécula MAT. Las células modificadas de este modo pueden incluirse en una matriz, que por un lado las fija localmente y por otro las protege frente al sistema inmunitario del paciente o del animal de laboratorio, pero que sin embargo, por otro lado, deja escapar las moléculas MAT liberadas por las células al organismo del paciente o del animal de laboratorio. Eventualmente las células transfectadas pueden administrarse también directamente al paciente o al animal de laboratorio, tratando las células dado el caso de tal manera, que ya no pueden dividirse, por ejemplo mediante irradiación o mediante tratamiento con productos químicos adecuados. Además los medicamentos pueden administrarse envasados en liposomas, u otras vesículas, como por ejemplo exosomas, o dexosomas, o los medicamentos pueden administrarse en forma de mezclas con polímeros biológicamente degradables, que liberan los medicamentos de manera continua. Un ejemplo de un sistema de este tipo es por ejemplo el sistema Atrigel (Atrix Labs, Fort Collins, CO, EE.UU.). Además a través de la misma o a través de una o varias otras vías de aplicación pueden administrarse otras sustancias simultáneamente o desplazadas en el tiempo con la administración del medicamento o medio diagnóstico según la invención. Estas otras sustancias pueden mejorar entre otros a través de sus propiedades inmunoestimuladoras, el efecto de los medicamentos o medios diagnósticos según la invención. Tales sustancias proporcionadas simultáneamente o desplazadas en el tiempo pueden ser entre otras adyuvantes, aceite mineral, adyuvante de Freund, mediadores o proteínas inmunoestimuladoras tales como por ejemplo citocinas, otras vacunas, etc. Además la administración simultánea o desplazada en el tiempo de sustancias inmunosupresoras es útil dado el caso, para por ejemplo reducir o suprimir reacciones inmunitarias locales no deseadas, mientras que se conservan las reacciones inmunitarias sistémicas. Sin embargo, la administración simultánea o desplazada en el tiempo de sustancias inmunosupresoras puede utilizarse también de manera inversa, para evitar reacciones inmunitarias sistémicas, mientras al mismo tiempo se conservan las reacciones inmunitarias locales.

Posibilidades para comprobar la eficacia de moléculas MAT

Para comprobar la eficacia de moléculas MAT con respecto a una modulación de la respuesta inmunitaria de un individuo, pueden llevarse a cabo diferentes experimentos in vitro e in vivo.

Como modelo in vitro son por ejemplo adecuadas las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), obtenidas por ejemplo de la sangre del paciente, que sufre de afecciones alérgicas. Tales células tienen la ventaja, de que con frecuencia se conoce el antígeno exacto, contra el que el paciente respectivo reacciona de manera alérgica. Este conocimiento permite por ejemplo simular in vitro una desensibilización del paciente, antes de llevar a cabo estudios clínicos en el paciente o en animales de experimentación. Para ello pueden tratarse por ejemplo las PBMC de personas alérgicas con el antígeno respectivo, contra el que reacciona la persona alérgica, o con una molécula MAT, que contiene el alergeno respectivo en el módulo de antígeno. Así puede examinarse la reacción inmunológica de las células primarias del paciente con respecto a diferentes formas de administración (molécula MAT completa, moléculas con/sin módulo de translocación, moléculas con/sin módulo de selección como diana, etc.) del alergeno. Como parámetro de medida se proponen entre otros determinaciones de citocina en el sobrenadante del cultivo celular. En la respuesta inmunitaria contra un antígeno participan diferentes tipos de células T, tales como por ejemplo linfocitos T auxiliares del tipo 1 (células Th1) o del tipo 2 (células Th2) o del tipo 0 (células Th0). El tipo de las células T implicadas en cada caso tiene una gran influencia en el hecho de desencadenar una respuesta inmunitaria contra el antígeno, que de forma primaria se compone de inmunoglobulinas de clase E (IgE) o de inmunoglobulinas de clase G (IgG). De la bibliografía se conoce que las respuestas inmunitarias de IgE son responsables especialmente de reacciones alérgicas y asma, mientras que por norma general las respuestas inmunitarias de IgG están relacionadas con una tolerancia contra el antígeno. El tipo de célula T respectivo, que se activa mediante el tratamiento de las PBMC con un antígeno puede determinarse también mediante la determinación de la expresión de antígenos de superficie sobre la superficie celular o mediante la determinación de mensajeros tales como por ejemplo citocinas, que se liberan por las PBMC. Como marcador para una respuesta inmunitaria Th1 pueden determinarse por ejemplo interferón-gamma (IFNg) o interleucina-1 (IL-1) en el medio de cultivo celular, mientras que IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y IL-13 muestran una respuesta inmunitaria Th2. Estas citocinas pueden comprobarse mediante métodos normalizados conocidos por el experto como por ejemplo determinación mediante ELISA a partir de por ejemplo sobrenadantes de cultivos celulares o análisis de FACS (Citometría de flujo activada por fluorescencia) de los mensajeros presentes en la superficie o intracelularmente en las PBMC, o mediante inmunotransferencias de tipo Western de sobrenadantes de cultivos celulares o lisados celulares, etc. Por la bibliografía se conocen numerosos métodos diferentes, adecuados para comprobar estos u otros mensajeros [43, 44]. Además de los mensajeros liberados por las PBMC, puede recurrirse también a mensajeros intracelulares o de membrana u otras proteínas para la caracterización inmunológica de las células T en PBMC. Entre otras, las empresas Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU., Beckmann Coulter Inc., Fullerton, CA, EE.UU., Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU., etc. ofrecen numerosos anticuerpos, adecuados para tales ensayos. Sin embargo los ensayos correspondientes no sólo pueden realizarse en células primarias del paciente, sino también con células que se obtienen de animales de experimentación tratados correspondientemente, por ejemplo ratones, ratas, cobayas, etc. En este caso los experimentos con animales de experimentación tienen la ventaja de que no sólo puede trabajarse con las células de estos animales in vitro, sino que el sistema inmunitario puede examinarse in vivo en el contexto de un organismo intacto. Con ello puede examinarse también el efecto de la dosificación, composición y la forma de aplicación de las moléculas MAT así como controles correspondientes como por ejemplo moléculas que sólo se componen de un antígeno o sólo de un módulo de translocación y un módulo de antígeno o sólo de un módulo de selección como diana y un módulo de antígeno. Puede examinarse entre otros, si existen diferencias en el tipo de la respuesta inmunitaria, cuando se inyectan moléculas MAT o controles correspondientes de la forma convencional por vía subcutánea o cuando la inyección se realiza por ejemplo directamente en el nódulo linfático. También pueden examinarse las administraciones no invasivas, como por ejemplo aplicación por vía oral o sublingual de las moléculas MAT y controles correspondientes con respecto a su efecto. Un ensayo adicional que puede llevarse a cabo en el animal de experimentación es la aplicación de las moléculas MAT o controles correspondientes con y sin toma simultánea de adyuvantes tales como por ejemplo aceite mineral, extractos de microbacterias o adyuvante de Freund. También pueden establecerse el esquema en el tiempo más eficaz o más tolerable para las inmunizaciones que han de realizarse, así como la dosis y número de inmunizaciones. Además pueden someterse a prueba diferentes módulos de antígeno con respecto a su eficacia. De este modo puede establecerse la mejor estrategia de inmunización para estudios posteriores en el paciente humano.

Además de los mensajeros, proteínas intracelulares y proteínas de superficie son especialmente adecuadas también las inmunoglobulinas para la caracterización de la reacción inmunitaria de células cultivadas in vitro o para la caracterización de la reacción inmunitaria de animales de experimentación o de pacientes humanos en estudios clínicos. Por ejemplo puede examinarse y cuantificarse usando ELISA, si los anticuerpos liberados debido a la administración del alergeno o antígeno son del tipo IgE o IgG. Estas informaciones aclararían el tipo de reacción inmunitaria de la que se trata.

Debido a que los mensajeros liberados de las células T tienen entre otros también influencia sobre la proliferación de células del sistema inmunitario, que entre otros existen en preparaciones de PBMC, la respuesta inmunitaria puede caracterizarse también a través de la determinación de la proliferación de células como por ejemplo PBMC. Para ello pueden realizarse por ejemplo ensayos in vitro, como por ejemplo estudios de incorporación al ADN de timidina marcada con tritio, como prueba de crecimiento celular. En estos ensayos pueden aplicarse también numerosos métodos diferentes conocidos por el experto para la determinación de proliferación celular. La proliferación de determinadas células del sistema inmunitario puede determinarse también in vivo, realizando por ejemplo ensayos FACS con muestras de sangre de animales de experimentación o pacientes humanos que participan en estudios. Mediante la selección de anticuerpos adecuados pueden cuantificarse por ejemplo las diferentes subpoblaciones de tipos de células existentes en la sangre. De este modo puede examinarse el efecto de un tratamiento con moléculas MAT o controles correspondientes.

Ejemplos de realización

Los ejemplos de realización siguientes pretenden ilustrar la invención a modo de ejemplo, sin embargo de ningún modo deben limitar el campo de protección de la invención.

Ejemplo 1 Clonación de vectores de expresión para moléculas MAT

Todos los procedimientos de biología molecular descritos a continuación se realizaron correspondientemente a métodos normalizados conocidos por el experto [43]. Para la clonación de un vector para la expresión de las moléculas MAT (moléculas de transporte de antígenos modulares) se utilizó el vector pQE-30 (Qiagen, Hilden, Alemania).

En una primera etapa de trabajo se incorpora una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica para un módulo de translocación, en un vector de expresión bacteriano. La secuencia de ADN, que codifica para los aminoácidos GYGRKKRRQRRR de tat de VIH, se incorporó mediante oligonucléotidos sintéticos en el vector pQE-30. Los oligonucléotidos contenían adicionalmente a la secuencia de tat de VIH en el extremo 5' una secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción Bgl II y en el extremo 3' secuencias de reconocimiento para BamH I, Spe I, Pst I y Hind III. Posteriormente se cortó la secuencia de tat de VIH producida de forma sintética con Bgl II y Hind III y se cortó el vector pQE30 con las endonucleasas de restricción Bam HI y Hind III. Posteriormente se aisló la secuencia de tat y el vector pQE-30 con NucleoSpin Extract 2 en 1 (Macherey-Nagel, Oensingen, Suiza), se juntaron usando ligasa, se transformaron en bacterias competentes mediante electroporación y se colocaron sobre placas de agar que contenían ampicilina. De las colonias de bacterias resultantes se seleccionaron algunas y de éstas se aisló el vector de ADN. Se secuenciaron los vectores así obtenidos para la confirmación de la secuencia de ácidos nucleicos usando métodos normalizados. Los clones de bacterias, que contenían vectores con la secuencia correcta, se utilizaron para trabajos adicionales.

En una segunda etapa de trabajo se incorporó un módulo de selección como diana en el vector. Para ello se aisló ARNm de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas usando métodos normalizados conocidos por el experto y se transcribieron mediante PCR transcriptasa inversa en ADN complementario (ADNc). Mediante el uso del ADNc así obtenido y usando diferentes cebadores de PCR, que en el extremo 5' del producto de PCR incorporaron una secuencia de reconocimiento para Bgl II y en el extremo 3' de los productos de PCR, secuencias de reconocimiento para Spe I, Bam H I, Pst I y Hind III, se obtuvo la secuencia de ácidos nucleicos de la cadena invariante humana de la molécula MHC II, que codifica para los aminoácidos 1 a 110 de la cadena invariante de MHC II. Esta región de secuencia de la cadena invariante del MHC II se incorporó, correspondientemente a la primera etapa de trabajo, detrás del extremo 3' de la secuencia de tat ya incorporada en el vector pQE-30. Se confirmó la secuencia del vector resultante mediante secuenciación. Mediante el uso de métodos normalizados conocidos por el experto, se reemplazó mediante mutagénesis dirigida al sitio en la posición 292 citosina por timidina y en la posición 318 guanina por adenina. Ambas mutaciones puntuales no conducen a modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente, sino que sólo eliminan secuencias de reconocimiento no deseadas para endonucleasas de restricción. En una tercera etapa de trabajo se incorporó posteriormente un módulo de antígeno en el vector. Mediante el uso del vector pQE-30, en el que anteriormente se incorporó la secuencia de codificación del antígeno respectivo y mediante el uso de cebadores de PCR, que en el extremo 5' del producto de PCR incorporan una secuencia de reconocimiento para Spe I y/o BamH I y en el extremo 3' del producto de PCR incorporan un codón de parada y una secuencia de reconocimiento para Pst I o Hind III, se obtuvieron secuencia de ácidos nucleicos de diferentes antígenos. Entre otros se obtuvo como módulo de antígeno la secuencia de ácidos nucleicos, que codifica para los aminoácidos 1 a 222 del antígeno Der p 1 (con respecto a la secuencia de aminoácidos de la proteína Der p 1 madura). Esta región de secuencia del antígeno Der p 1, correspondiente a las dos primeras etapas de trabajo, se incorporó detrás del extremo 3' de la secuencia de la cadena invariante del MHC II ya incorporada en el vector pQE-30. Se confirmaron las secuencias correctas de los vectores resultantes mediante secuenciación. Para trabajos posteriores se obtuvieron los vectores de expresión mediante el uso de QIAfilter Plasmid Midi-Kits (Qiagen, Hilden, Alemania) correspondientemente al protocolo del fabricante.

Ejemplo 2 Obtención de la secuencias de codificación de los antígenos Bet v 1, Asp f 1, Asp f 6 y Der p 1

Se aislaron las secuencias de codificación de los diferentes antígenos en los módulos de antígeno mediante diferentes métodos conocidos por el experto [43]. La secuencia Bet v 1 se obtuvo a través de oligonucléotidos sintéticos, las secuencias Asp f 1 y Asp f 6 se obtuvieron en estudios anteriores y se obtuvieron a partir de los vectores utilizados en estos estudios [45, 46] y posteriormente se incorporaron en el vector pQE-30 y se aisló la secuencia Der p 1 a través de PCR transcriptasa inversa usando ARNm, que se obtuvo de ácaros de polvo doméstico (Dermatophagoides pteronyssinus).

Ejemplo 3 Expresión y aislamiento de moléculas MAT en bacterias

La expresión y aislamiento de las moléculas MAT se realizó correspondientemente a las indicaciones del fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania). En detalle, se preparó un cultivo previo de 15 bacterias de E. coli M, transfectadas con el vector de expresión respectivo (molécula MAT pQE-30), en 20 ml de medio (2x medio YT, 100 \mug/ml de ampicilina, 25 \mug/ml de kanamicina) durante la noche a 37ºC en el agitador de bacterias. A continuación se cultivó el cultivo previo en 2000 ml de medio (2x medio YT, 100 \mug/ml de ampicilina, 25 \mug/ml de kanamicina) a 37ºC en el agitador de bacterias hasta que había alcanzado una densidad óptica de 0,6 con una longitud de onda de 600 nm. Tras añadir IPTG en una concentración final de 1 mM y una nueva fase de crecimiento de 5 a 15 h, se separaron las bacterias mediante centrifugación a 2000 g durante 20 minutos del medio de cultivo y se almacenó el sedimento de bacterias a -20ºC. Para la producción de lisados de células se descongeló el sedimento de bacterias, se volvió a suspender en disolución de urea 8 M (5 ml de disolución de urea por gramo de peso húmedo de los sedimentos de bacterias), se agitó con cuidado de 1 a 2 h y posteriormente se centrifugó durante 30 min a 48000 g. El sobrenadante transparente se utilizó para la cromatografía preparativa con quelato de níquel de las moléculas MAT. Para el aislamiento de las moléculas MAT se utilizaron columnas de 49 o 18 ml (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE.UU.), rellenas con de 5 a 10 ml de NI-NTA Superflow Matrix (Qiagen) y un sistema de cromatografía de la empresa Bio-Rad (Econo Pump y monitor UV). En primer lugar se lavó la columna de cromatografía con 5 volúmenes de columna de tampón A (NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris/HCl 10 mM, guanidina-HCl 6M, pH ajustado a 8,0 con HCl) y posteriormente se aplicó a la columna el lisado de bacterias a una velocidad de flujo de 1,4 ml/min. Posteriormente se bombean en cada caso de 5 a 10 volúmenes de columna de tampón A y tampón B (tampón B: NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris/HCl 10 mM, urea 8M, pH 8,0) a una tasa de flujo de 1,4 ml/min y se observó la absorción del flujo a una longitud de onda de 280 nm (A280). Una vez que el flujo ha alcanzado una A280 estable inferior a aproximadamente 0,01 se aclara la columna con de 5 a 10 volúmenes de columna de tampón C (NaH_{2}PO_{4} 100 mM, tris/HCl 10 mM, urea 8M, pH ajustado a 6,3 con HCl), hasta alcanzar finalmente una A280 estable inferior a 0,01. A continuación se eluye la molécula MAT con tampón E (NaH_{2}PO_{4} 100 mM, Tris/HCl 10 mM, urea 8M, pH ajustado a 4,5 con HCl) y se recoge.

Ejemplo 4 Comprobación de moléculas MAT con geles de SDS-poliacrilamida, tinción de Coomassie e inmunotransferencia de tipo Western anti-His Electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida

Para la electroforesis se utilizaron tampones, geles NuPAGE® y una cámara de electroforesis Xcell SureLock™ de Invitrogen (Invitrogen Life Technologies, Breda, Países Bajos) correspondientemente a las indicaciones del fabricante. Se separaron 5 ó 10 \mug de las moléculas MAT aisladas por traza en geles bis-tris NuPAGE® Novex al 12% (Invitrogen) a una tensión constante de 200 V usando el tampón de muestra SDS NuPAGE® concentrado 1x en condiciones reductoras en un periodo de 35 a 50 min mediante electroforesis. Como tampones de desplazamiento se utilizó tampón MES o MOPS (tampón MES: MES 50 mM (ácido morfolinoetanosulfónico), Tris/HCl 50 mM, SDS 3,5 mM, EDTA 1 mM, pH 7,3, tampón MOPS: MOPS 50 mM (ácido (3-(N-morfolino)propanosulfónico), Tris/HCl 50 mM, SDS 3,5 mM, EDTA 1 mM, pH 7,7).

Tinción con azul de Coomassie

Para la tinción de los geles, se incuban éstos durante 1 h en disolución de tinción (200 ml de metanol, 50 mg de ácido acético, 250 ml de agua. 0,5 g de azul de Coomassie R-250) y posteriormente se decolora cambiando varias veces la disolución de decoloración (200 ml de etanol, 50 ml de ácido acético, 250 ml de agua), hasta que el fondo de los geles es transparente. Para la electrotransferencia de las proteínas desde el gel NuPAGE® a una membrana de inmunotransferencia, se utiliza el módulo de inmunotransferencia Xcell II™ (Invitrogen) correspondientemente a las indicaciones del fabricante. El aparato de inmunotransferencia se construye correspondientemente a las indicaciones del fabricante usando el tampón de transferencia NuPAGE® 1x con el 10 o el 20% de metanol. Como membrana de inmunotransferencia se utilizaron membranas de PVDF y se produjo la electrotransferencia durante 1 h a una tensión constante de 30 V.

Comprobación inmunológica de las moléculas MAT

Se realizó la comprobación inmunológica de las moléculas MAT usando anticuerpo anti-His correspondientemente a las indicaciones del fabricante (anti-RGS(His)4, Qiagen, Hilden, Alemania). Todas las etapas de ensayo se realizan a temperatura ambiente. En primer lugar se seca la membrana de PVDF y luego se incuba directamente, sin un bloqueo previo de puntos de unión de proteínas libres, con el anticuerpo anti-His (Qiagen) a una dilución de 1:1000 a 1:2000 en TBS (Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) con el 3% de BSA (albúmina de suero bovino) durante 1 h. A continuación se lava la membrana 3x en cada caso durante 10 min con TBS, Tween 20 al 0,05%, Triton X-100 al 0,2% y posteriormente se lava una vez con TBS sin aditivos adicionales. Como anticuerpo secundario se utiliza el conjugado HRP-anti-Ig de ratón (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) a una dilución de 1:10000 a 1:20000 en TBS con leche en polvo al 10% y se incuba durante 1 h. Finalmente se lava la inmunotransferencia 4x en cada caso durante 10 min con TBS, Tween 20 al 0,05%, Triton X-100 al 0,2%. La comprobación del conjugado se realiza con el sistema ECL™ (Amersham) correspondientemente a las indicaciones del fabricante. La señal de quimioluminiscencia se comprueba usando películas de autorradiografía, que se revelan correspondientemente a protocolos
normalizados.

Ejemplo 5 Translocación de moléculas MAT en líneas celulares y células humanas primarias

Se obtuvieron PBMC (células mononucleares de sangre periférica) correspondientemente a métodos normalizados conocidos por el experto mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) a partir de sangre humana fresca, tratada con heparina de personas voluntarias sometidas a examen. La línea celular Jurkat se obtuvo de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640, que contenía los siguientes aditivos: 10% de suero bovino fetal, 200 unidades/ml de penicilina, 200 \mug/ml de estreptomicina, vitaminas MEM, aminoácidos MEM no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM y 2-mercaptoetanol al 0,001%. Para la determinación de la translocación se volvieron a suspender las células en una concentración de 1 x 10Exp6/ml de medio RPMI con todos los aditivos. Las células se incubaron correspondientemente a las indicaciones respectivas en las explicaciones con respecto a las figuras con concentraciones de 0,01 a 5 mM de las moléculas recombinantes, o moléculas MAT durante un periodo de tiempo de 5 min a 4, 22 o 37ºC. A continuación se centrifugaron las células y se incubó el sedimento celular en 40 \mul de tampón de lisis (urea 8 M, fosfato de sodio 100 mM, Tris/HCl 10 mM, cloruro de amonio 100 mM) durante 5 min a temperatura ambiente. Se separaron componentes celulares insolubles mediante centrifugación (15000 g, 15 min) y se siguió examinando el lisado transparente correspondientemente al ejemplo 4 en una inmunotransferencia de tipo Western. Para la comprobación de las proteínas se utilizó un anticuerpo anti-His.

Ejemplo 6 Estimulación de células mononucleares periféricas de la sangre (PBMC) de pacientes con alergias

Los métodos descritos a continuación para la estimulación de PBMC y la determinación de la proliferación de las PBMC estimuladas se describen en la bibliografía [44]. Las PBMC se aislaron mediante centrifugaciones en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) a partir de sangre humana fresca, tratada con heparina de personas voluntarias sometidas a examen. En el caso de las personas voluntarias sometidas a examen se trataba de pacientes con una alergia a un alergeno conocido para el paciente individual. Los pacientes fueron informados de forma correspondiente a las normas suizas acerca de los experimentos realizados con sus muestras sanguíneas y con ello declararon estar de acuerdo con la participación en este estudio. Tras la obtención de las PBMC éstas se absorbieron en medio RPMI con los aditivos correspondientemente al ejemplo 5 y en cada caso se añadieron de 0,01 a 100 nM del antígeno recombinante producido, frente al que el paciente respectivo reacciona de manera alérgica. En cada caso se examinó el antígeno no modificado y el antígeno (molécula MAT) acoplado a un módulo de translocación y un módulo de selección como diana. En algunos experimentos también se realizaron mezclas de prueba, en las que no había acoplado ningún módulo de selección como diana, sino sólo un módulo de translocación al módulo de antígeno (figura 7A). Como controles también se utilizaron en algunos experimentos sólo el módulo de translocación o un constructo compuesto de módulo de translocación y módulo de selección como diana, aunque sin módulo de antígeno. Tras un tiempo de incubación de 5 días se añadió al medio 10 \muCi/ml de timidina marcada con tritio. La incorporación de timidina a las PBMC se determinó como medida para la eficacia de la presentación de antígenos y la proliferación relacionada con ella de las células tratadas. Para ello se separó después de 8 a 10 h el medio de cultivo celular radioactivo, se lavaron las células y se determinó la cantidad de timidina radioactiva incorporada mediante medición de la radioactividad. Para ello se utilizó un contador de centelleo 1205 Betaplate Liquid de la empresa Wallac ADL AG, Hünenberg, Suiza. Como control se incubaron células no estimuladas con antígeno igualmente con timidina marcada con tritio y posteriormente se analizaron de la misma manera. Como resultado se obtiene un valor de medida para la incorporación de timidina radioactiva como medida para la proliferación y con ello como medida para la eficacia de la presentación de antígenos. Cuanto mayor es la incorporación de timidina medida, tanto más eficaz era la presentación de antígenos. Puesto que en cada experimento se examinaron concentraciones de antígenos de 0,01 nM a 100 nM, puede determinarse además, a qué concentración de antígenos se produce una presentación de antígenos máxima. Cuanto menor es esta concentración, tanto más eficaz es el antígeno como modulador de una respuesta inmunitaria. Como control adicional se trataron células con en cada caso 0,5 \mug/ml de un anticuerpo anti-CD3 y de un anticuerpo anti-CD28, lo que representa un estímulo de proliferación muy intenso. De este modo pudo determinarse para cada experimento la incorporación máxima posible de timidina mediante la proliferación de PBMC.

Explicaciones de las figuras

Figura 1

Estructura teórica de moléculas MAT

La figura 1 muestra a modo de ejemplo, cómo los módulos individuales de una molécula MAT según la invención pueden estar estructurados esquemáticamente. A este respecto "Trans" representa un módulo de translocación, "Target" ("diana") representa un módulo de selección, "AG" representa un módulo de antígeno, "Tag" ("etiqueta") representa un módulo de etiqueta y una línea (-) representa un módulo de enlace. El módulo de enlace puede unir los demás módulos entre sí mediante enlaces covalentes y/o no covalentes. La figura 1A muestra una serie de disposiciones lineales a modo de ejemplo de los diferentes módulos. La figura 1B muestra diferentes disposiciones a modo de ejemplo de moléculas MAT ramificadas, estando incluidas también estructuras dendrímeras y la figura 1C muestra algunas disposiciones a modo de ejemplo de moléculas MAT circulares, pudiendo estar combinadas disposiciones circulares con disposiciones ramificadas y/o lineales. En general todas las disposiciones mostradas son sólo ejemplos, que han de aclarar, que son posibles las disposiciones más variadas. Los ejemplos de moléculas MAT mostrados esquemáticamente no deben considerarse en ningún caso como limitantes del campo de protección de la presente invención.

Figura 2 Expresión, purificación e identificación de proteínas de fusión

Se expresaron en E. coli diferentes moléculas MAT que consistían en módulo de etiqueta (etiqueta de His6), módulo de translocación (secuencia de Tat), módulo de selección como diana (cadena invariante de MHC II humana) y módulo de antígeno (Asp f1 = antígeno 1 de Aspergilus fumigatus) y se aislaron en condiciones de desnaturalización con el uso de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizadas. Se realizaron las etapas de trabajo de manera correspondiente a las indicaciones del fabricante del sistema de expresión (Qiagen, Hilden, Alemania) [47, 48]. Se separaron mediante electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida 10 \mug o 5 \mug de cada una de las proteínas aisladas y posteriormente o bien se tiñeron con azul Coomassie (figura 2A), o bien se analizaron en un ensayo de inmunotransferencia de tipo Western con el uso de anticuerpos, que reconocían el módulo de etiqueta (figura 2B). Las posiciones de las proteínas expresadas están marcadas mediante flechas.

Figura 3 Translocación dependiente de la temperatura de proteínas y moléculas MAT

Se incubaron células mononucleares periféricas humanas primarias (PBMC) durante 5 minutos a 4, 22 ó 37ºC con las proteínas o las moléculas MAT respectivamente en una concentración de 1 \muM, se lavaron, se recogieron en tampón de muestra que contenía urea y se lisaron. Posteriormente se separó el lisado mediante electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida, se electrotransfirió a una membrana de PVDF y se detectaron las proteínas o las moléculas MAT con un anticuerpo específico (anticuerpo anti-RGS(His)4). Las flechas muestras la posición de las proteínas o las moléculas MAT. Pudieron identificarse las proteínas de fusión en los lisados de las células, a todas las temperaturas, lo que muestra una translocación exitosa hacia el interior de la célula.

Figura 4 Translocación de moléculas MAT en líneas celulares y células primarias

Los resultados representados en la figura 4 se realizaron con la metodología casi igual que el ensayo de la figura 3, pero con dos variaciones: la figura 4 muestra que tanto en las células humanas primarias (PBMC) como en las líneas de células tumorales humanas (células Jurkat) tuvo lugar con éxito la translocación de las moléculas MAT. Las flechas muestran la posición en la inmunotransferencia de tipo Western, en la que se detecta la proteína o la molécula MAT. La figura 4A y 4B muestran además que los diferentes módulos de antígeno (Asp f1 = alérgeno de Aspergillus fumigatus, Der p1 = alérgeno de ácaros doméstico, Bet v1 = alérgeno del polen de abedul) pueden lograrse a través de la translocación en células PBMC humanas primarias.

Figura 5 Cinética de la tasa de aplicación de la translocación de moléculas MAT

Los resultados representados en la figura 5 se obtuvieron con la metodología casi igual que el ensayo de la figura 3, sin embargo usándose tres o cuatro concentraciones diferentes de proteínas o moléculas MAT (0,01 mM, 0,1 mM, 1 mM y 5 mM). Pudo mostrarse una clara dependencia de la tasa de aplicación para la reacción de translocación. Con el aumento de la concentración de moléculas MAT añadidas se detectaron cantidades mayores de cada molécula en el interior de la célula. Las posiciones de cada una de las moléculas están marcadas por flechas.

Figura 6 Diferentes estructuras funcionales de moléculas MAT

Los resultados representados en la figura 6 se obtuvieron con la metodología casi igual que el ensayo de la figura 3, sin embargo sometiendo a ensayo tres órdenes diferentes de módulo de translocación (secuencia de Tat) y módulo de antígeno (Asp f1 = alérgeno de Apergillus fumigatus). La flecha en la figura 6 indica la posición a la que se detectó la proteína de fusión en la inmunotransferencia de tipo Western. La figura 6B representa la estructura de las tres proteínas de fusión diferentes. Se sometieron a ensayo las proteínas de fusión con módulo de translocación en los extremos N-terminales, en los extremos C-terminales y C-terminales invertidos. Las tres proteínas de fusión se transportaron mediante la translocación con éxito hacia el interior de la célula.

Figura 7 Función de moléculas MAT en células primarias de sujetos alérgicos

En la figura 7 se representan los ensayos de PBMC (periphere Blut mononukleäre Zellen, células mononucleares de sangre periférica) de sujetos alérgicos, que se dieron in vitro junto con una molécula MAT. La molécula MAT contenía como módulo de antígeno el alérgeno respectivo frente al que reacciona alérgicamente el paciente con alergia. Una presentación de antígeno eficaz debido a la adición de la molécula MAT de las células que presentan antígenos del sujeto alérgico conduce a una estimulación del crecimiento de las PBMC. La proliferación celular que resulta de esto se cuantificó a través de la incorporación de las bases estructurales de ADN marcadas de manera radiactiva (timidina) (eje y). El eje x indica la concentración en nM de molécula de antígeno o molécula MAT usada en la prueba de estimulación celular respectivamente. En todos los pacientes sometidos a ensayo con todos los módulos de antígeno sometidos a ensayo (como parte de la molécula MAT) surge en el caso del uso de moléculas MAT en concentraciones reducidas una proliferación celular (= inmunoestimulación = aumento de la incorporación de timidina = aumento de la radiactividad). Como control, se trató cada una de las PBMC iguales sólo con agua, que no contenía moléculas MAT o antígeno (= control en las leyendas). Además, se midió para cada ensayo como control positivo de la estructura de timidina de las células, que se trataron con un fuerte estimulo de crecimiento (anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, 0,5 \mug/ml de cada uno) durante 5 días. El crecimiento obtenido mediante este estimulo representa un control de la calidad de las PBMC preparadas con respecto a su capacidad de proliferación. Para el ensayo de la figura 7A se obtuvo un valor de 77864 \pm 5347 cpm, para el ensayo de la figura 7B se obtuvo un valor de 100374 \pm 11678 cpm y para los ensayos de las figuras 7C y D se obtuvo un valor de 112205 \pm 5958 cpm.

Todos los ejemplos y especificaciones en la presente solicitud de patente están pensados básicamente para la aclaración de la situación, pero no para la limitación de las reivindicaciones. Especialmente los ejemplos de módulos de translocación, módulos de selección como diana, módulos de antígeno, módulos espaciadores y módulos de etiqueta se entienden sólo como ejemplos pero no como la lista exhaustiva de todos los componentes posibles de la molécula MAT. La idea fundamental de la invención no está en una combinación determinada de módulos de translocación determinados, de módulos de selección como diana determinados y de módulos de antígeno determinados. La idea fundamental de la presente invención es más bien usar una combinación de al menos estos tres módulos para dar una molécula Mat para la inmunización. Por tanto, el ejemplo usado especialmente no desempeña ningún papel en cada uno de los módulos individuales para el entendimiento de la invención y por lo tanto pueden usarse también otros ejemplos, también no conocidos aún actualmente, de cada uno de los módulos en el sentido de la invención.

En caso de que en esta memoria de patente no esté bien definido un término, o que el experto en cada materia no deba saber, o puede no definirse claramente un término en relación al texto, entonces es válida cada una de las definiciones de cada uno de los términos mencionadas en los trabajos habituales de a continuación. En caso de que un término se introduzca con diferentes definiciones en más de los trabajos citados a continuación, entonces es válida cada una de las definiciones, que se mencionan en primer lugar en los trabajos introducidos en la lista de a continuación. Las siguientes publicaciones se citan para este fin:

\bullet: The Merck Manual [49]

\bullet: Molecular Cloning – A Laboratory Manual [43]

\bullet: Current Protocols in Immunology [44]

\bullet: Current Protocols in Protein Science [50]

\bullet: Current Protocols in Pharmacology [51]

\bullet: Current Protocols in Cell Biology [52].

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<110> BioVisioN AG

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<120> Molécula transportadora de antígeno modular (Molécula MAT) para la modulación de reacciones inmunitarias

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<130> MAT

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<140> 02022774.0

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<141> 11-10-2002

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<160> 20

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 870

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<212> ADN

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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana + Homo sapiens + Aspergillus fumigatus

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<211> 903

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<212> ADN

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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana + Homo sapiens + Betula verrucosa

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<212> ADN

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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana + Homo sapiens + Dermatophagoides pteronyssinus

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<400> 7

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<212> ADN

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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

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<211> 429

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<213> Aspergillus fumigatus

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<213> Aspergillus fumigatus

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<213> Betula verrucosa

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<213> Betula verrucosa

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<210> 19

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<211> 1099

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<212> ADN

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<213> Dermatophagoides pteronyssinus

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<400> 19

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25

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<210> 20

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<211> 320

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<212> PRT

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<213> Dermatophagoides pteronyssinus

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<400> 20

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Claims

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1. Molécula transportadora de antígenos modulares (molécula MAT), que contiene al menos un módulo de translocación, que produce el transporte de la molécula MAT desde el espacio extracelular hacia el interior de la célula, al menos un módulo de selección como diana, que produce que la molécula MAT se transporte intracelularmente hacia los orgánulos que están implicados en el procesamiento de antígenos o la carga de moléculas MHC-II con antígenos y al menos un módulo de antígeno, que determina la especificidad de una respuesta inmunitaria modulada en un individuo mediante la molécula MAT, estando acoplados los módulos a través de enlaces covalentes entre sí y

a)

siendo el módulo de translocación una unidad molecular peptídica y siendo tat de VIH, VP22 o Antennapedia o un fragmento de secuencia funcional del mismo como módulo de translocación y;

b)

siendo el módulo de selección como diana una unidad molecular con una secuencia de aminoácidos y siendo la cadena invariante de MHC (liP33, liP41, liP35, liP43) o un fragmento de secuencia funcional del mismo como módulo de selección como diana y

c)

siendo el módulo de antígeno un alergeno que consiste en una proteína o péptido,

y produciendo la molécula MAT la proliferación in vitro de células mononucleares periféricas de la sangre de un sujeto alérgico, que reacciona frente al alergeno.
2. Molécula MAT según la reivindicación 1, en la que los módulos están unidos entre sí a través de módulos espaciadores.
3. Molécula MAT según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque el módulo de antígeno contiene al menos un alergeno, que procede del alergeno Fel d1.
4. Ácido nucleico, que codifica para una molécula MAT según una de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Vector, que contiene al menos una secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 4.
6. Célula primaria o línea celular, que contiene al menos un vector según la reivindicación 5 o un ácido nucleico según la reivindicación 4.
7. Exosoma, dexosoma o liposoma, que contiene al menos una molécula MAT según una de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico según la reivindicación 4 o un vector según la reivindicación 5.
8. Medicamento que contiene moléculas MAT según las reivindicaciones 1 a 3 y/o ácidos nucleicos según la reivindicación 4 y/o vectores según la reivindicación 5 y/o células según la reivindicación 6 y/o exosomas, dexosomas o liposomas según la reivindicación 7.
9. Medicamento según la reivindicación 8, que además contiene al menos uno de los componentes siguientes y/u otros aditivos y excipientes farmacéuticamente aceptables:

a)

una disolución de cloruro de sodio fisiológica

b)

un adyuvante farmacéuticamente aceptable

c)

una sustancia tampón farmacéuticamente aceptable

d)

una proteína portadora farmacéuticamente aceptable

e)

un conservante farmacéuticamente aceptable

f)

un colorante farmacéuticamente aceptable.
10. Medicamento según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque, se diseña el preparado para una administración sublingual, una inyección en un nódulo linfático o para la aplicación a través de las mucosas, especialmente a través de las mucosas del aparato gastrointestinal o del sistema respiratorio.
11. Medicamento según una de las reivindicaciones 8 a 10, en el que se trata de una vacuna.
12. Uso de una molécula de transporte de antígenos modulares (molécula MAT), según las reivindicaciones 1 a 3, o ácidos nucleicos según la reivindicación 4, vectores según la reivindicación 5, líneas celulares o células primarias según la reivindicación 6 o exosomas, dexosomas o liposomas según la reivindicación 7 para la producción de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de alergias.
13. Uso según la reivindicación 12, siendo el medicamento una vacuna.