ES2279929T3 - Secuencias de acidos nucleicos y sistemas de expresion para heparinasa ii derivada de flavobacterium heparinum. - Google Patents
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Abstract
Heparinasa II no glicosilada aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la heparinasa II madura que tiene un residuo metionina que precede inmediatamente al primer aminoácido de dicha heparinasa II madura, o derivados funcionales no glicosilados de la misma que degradan sulfato de heparano y heparina.
Description
Secuencias de ácidos nucléicos y sistemas de
expresión para heparinasa II derivada de Flavobacterium
heparinum.
Esta invención está dirigida a clonación,
secuenciación y expresión de heparinasa II de Flavobacterium
heparinum.
La familia de moléculas de heparina y sulfato de
heparano está constituida por glucosaminoglucanos de residuos
glucosamina y ácido hexurónico que se repiten, sea idurónicos o
glucurónicos, en los cuales la posición 2, 3 ó 6 de la glucosamina
o la posición 2 del ácido hexurónico puede estar sulfatada.
Variaciones en la extensión y localización de la sulfatación así
como la conformación del residuo de ácido hexurónico alternante
conduce a un alto grado de heterogeneidad de las moléculas dentro
de esta familia. Convencionalmente, heparina hace referencia a
moléculas que poseen un contenido elevado de sulfato, 2,6 sulfatos
por disacárido, y una cantidad mayor de ácido idurónico.
Inversamente, el sulfato de heparano contiene menores cantidades de
sulfato, 0,7 a 1,3 sulfatos por disacárido, y menos ácido
idurónico. Sin embargo, existen variantes de composición intermedia
y no han sido identificadas todavía heparinas de todas las fuentes
biológicas.
Patrones específicos de
sulfatación/glicosilación de heparina han sido asociados con la
función biológica, tales como el sitio de fijación de antitrombina
descrito por Choay et al., Thrombosis Res.
18:573-578 (1980), y el sitio de fijación del
factor de crecimiento de fibroblastos descrito por Turnbull et
al., J. Biol. Chem. 267: 10337-10341 (1992). Es
evidente por estos ejemplos que la interacción de la heparina con
ciertas moléculas es resultado de la conformación impartida por
secuencias específicas y no debida exclusivamente a interacciones
electrostáticas impartidas por su alta composición de sulfato. La
heparina interacciona con una diversidad de moléculas de mamífero,
modulando con ello varios sucesos biológicos tales como la
hemostasis, proliferación celular, migración y adhesión como ha
sido resumido por Kjellen y Lindahl, Ann Rev Biochem
60:443-475 (1991) y Burgess y Macaig, Ann.
Rev. Biochem. 58:575-606 (1989). La heparina,
extraída de pulmones de bovino e intestinos de porcino, ha sido
utilizada como anticoagulante desde que fueron descubiertas sus
propiedades antitrombóticas por McLean, Am. J. Physiol.
41:250-257 (1916). La heparina y las heparinas
modificadas químicamente están siendo continuamente objeto de
revisión para aplicaciones médicas en las áreas de curación de las
heridas y el tratamiento de la enfermedad vascular.
Enzimas que degradan la heparina, a las que se
hace referencia como heparinasas o heparina-liasas,
han sido identificadas en varios microorganismos que incluyen:
Flavobacterium heparinum, Bacteriodes sp. y Aspergillus
nidulans como ha sido resumido por Linhardt et al., Appl.
Biochem. Biotechnol. 12:135-177 (1986). Enzimas
que degradan el sulfato de heparano, a las que se hace referencia
como heparitinasas o
heparano-sulfato-liasas, han sido
detectadas en las plaquetas (Oldberg et al., Biochemistry
19:5755-5762 (1980)), tumores (Nakajima et
al., J. Biol. Chem. 259:2283-2290 (1984)) y
células endoteliales (Gaal et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
161: 604-614 (1989)). Las heparanasas de
mamífero catalizan la hidrólisis de la cadena principal de
carbohidrato del sulfato de heparano en el enlace ácido hexurónico
(1 \rightarrow 4) glucosamina (Nakajima et al., J. Cell.
Biochem. 36:157-167 (1988)) y son inhibidas por
la heparina fuertemente sulfatada. Sin embargo, las
caracterizaciones bioquímicas exactas de estas enzimas se han visto
impedidas hasta ahora por la falta de un método para obtener
preparaciones homogéneas de las moléculas.
Flavobacterium heparinum produce enzimas
que degradan la heparina y el sulfato de heparano, denominadas
heparinasa I (E.C. 4.2.2.7) como ha sido descrita por Yang et
al., J. Biol. Chem. 260(3): 1849-1857
(1985), heparinasa II, ha sido descrita por Zimmermann y Cooney,
Patente U.S. No. 5.169.772, y heparinasa III (E.C. 4.2.2.8) como ha
sido descrita por Lohse y Linhardt, J. Biol. Chem.
267:24347-24355 (1992). Estas enzimas catalizan
una escisión eliminadora del enlace (\alpha1 \rightarrow 4) de
carbohidrato entre los residuos glucosamina y ácido hexurónico en
la cadena principal de heparina/sulfato de heparano. Las tres
variantes enzimáticas difieren en su acción sobre residuos
carbohidrato específicos. Heparinasa I escinde en
\alpha-D-GlcNp2S6S(1
\rightarrow
4)\alpha-L-IdoAp2S,
heparinasa III en
\alpha-D-GlcNp2Ac(o
2S)6OH(1 \rightarrow
4)\beta-D-GlcAp y
heparinasa II en cualquier enlace como ha sido descrito por Desai
et al., Arch. Biochem. Biophys.
306(2):461-468 (1993). Sitios de
escisión secundarios para cada enzima han sido también descritos
por
Desai et al.
Desai et al.
La heparinasa I ha sido utilizada clínicamente
para neutralizar las propiedades anticoagulantes de la heparina
como ha sido resumido por Baugh y Zimmermann, Perfusion Rev.
1(2):8-13, (1993). Se ha demostrado que
heparinasa I y III modulan interacciones de factores de crecimiento
celular como ha sido demostrado por Bashkin et al., J. Cell
Physiol. 151:126-137 (1992) e interacciones
células-lipoproteína como ha sido demostrado por
Chappell et al., J. Biol. Chem.
268(19):14168-14175 (1993). La
disponibilidad de enzimas degradantes de la heparina de pureza y en
cantidad suficientes podría conducir al desarrollo de importantes
formulaciones diagnósticas y terapéuticas.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona heparinasa II aislada no glicosilada que comprende la
secuencia de aminoácidos de la heparinasa II madura que tiene un
residuo metionina que precede inmediatamente al primer aminoácido
de dicha heparinasa II madura, o derivados funcionales no
glicosilados de aquélla que degradan el sulfato de heparano y la
heparina.
\newpage
Preferiblemente, la heparinasa II de la presente
invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 que
comienza en la glutamina de la posición 26 y que incluye una
metionina que precede inmediatamente a dicha glutamina.
La invención proporciona también un anticuerpo o
fragmento del mismo que es específico para una heparinasa II de la
presente invención, así como una heparinasa II de la presente
invención para uso en terapia o diagnosis.
Con anterioridad a la presente invención,
estaban disponibles heparinasas II y III parcialmente purificadas,
pero sus secuencias de aminoácidos no se conocían. La clonación de
estas enzimas era difícil debido a la toxicidad para las células
hospedadoras. Los autores de la presente invención han logrado
clonar los genes para las heparinasas II y III, y proporcionan en
esta memoria sus secuencias de nucleótidos y aminoácidos.
Se describe un método para el aislamiento de
enzimas degradantes altamente purificadas de heparina y sulfato de
heparano procedentes de F. heparinum.
La caracterización de proteínas demostró que las
heparinasas I, II y III son glicoproteínas. Las tres proteínas
están modificadas en su residuo de aminoácido
N-terminal. Los anticuerpos generados por inyección
de heparinasas purificadas en conejos produjeron antisueros que
demostraron un alto grado de reactividad cruzada para las proteínas
de F. heparinum. Los anticuerpos policlonales se separaron
por cromatografía de afinidad en fracciones que fijan la porción de
aminoácidos de las proteínas y una fracción que fija la modificación
posterior a la traducción permitiendo el uso de estos anticuerpos
para distinguir específicamente las formas nativa y recombinante de
cada proteína heparinasa.
La información de secuencia de aminoácidos se
utilizó para sintetizar oligonucleótidos que se emplearon
posteriormente en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) para
amplificar una porción de los genes de heparinasa II y heparinasa
III. Las regiones amplificadas se utilizaron en un intento para
identificar clones de una genoteca de genes
\lambdaDASH-II que contenía DNA genómico de F.
heparinum. Se observó una selección natural contra los clones
que contenían los genes enteros de heparinasa II y III. Esto fue
soslayado por clonación de secciones del gen de heparinasa II por
separado, y por escrutinio de cepas hospedadoras para mantenimiento
estable de los clones completos de heparinasa III. La expresión de
heparinasa II y III se consiguió por el uso de un vector que
contenía un sitio modificado de fijación de ribosoma que se demostró
aumenta la expresión de heparinasa I a niveles significativos.
Esta patente describe la secuencias de gen y
aminoácidos para heparinasa II de F. heparinum, que pueden
utilizarse en conjunción con sistemas de expresión adecuados para
producir las enzimas. Se describe también una secuencia modificada
de fijación de ribosoma utilizada para expresar heparinasa I, II y
III.
La Figura 1 muestra las modificaciones a la
región de fijación de ribosoma del promotor tac, que se evaluaron
respecto al nivel de expresión de heparinasa I. La secuencia
original, como se encuentra en pBhep y las secuencias modificadas,
como se encuentran en pGhep y p\Delta4hep, se muestran con las
secuencias Shine-Dalgarno (S-D) y
el codón inicial del gen de heparinasa I, subrayados. La laguna (en
nucleótidos, nt) entre estas regiones se indica bajo cada
secuencia. La región de fijación de ribosoma para pGB no contiene
codón inicial alguno, y tiene un sitio BamHI (subrayado) en
lugar del sitio EcoRI (GAATTC) encontrado en pGhep.
La Figura 2 muestra la construcción de plásmidos
utilizados para secuenciar el gen de heparinasa II de
Flavobacterium heparinum. Los sitios de restricción son: N =
NotI, Nc = NcoI, S = SalI, B = BamHI, P
= PstI, E = EcoRI, H = HindIII, C =
ClaI y K = KpnI.
La Figura 3 muestra la construcción de pGBH2, un
plásmido capaz de dirigir la expresión de heparinasa II activa en
E. coli a partir de promotores tac en tándem (puntas de
flecha dobles). Los sitios de restricción son: B = BamHI, P
= PstI.
La Figura 4 muestra la secuencia de ácido
nucleico para el gen de heparinasa II de Flavobacterium
heparinum (SEQ ID NO:1).
La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos
para heparinasa II de Flavobacterium heparinum (SEQ ID NO:2).
La secuencia del péptido conductor está subrayada. La proteína
madura comienza en Q-26. Los péptidos 2A, 2B y 2C
se indican en sus posiciones correspondientes dentro de la
proteína.
La Figura 6 muestra la construcción de los
plásmidos utilizados para secuenciar el gen de heparinasa III de
Flavobacterium heparinum. Los sitios de restricción son: S =
SalI, B = @BamHI, P = PstI, E = EcoRI, H
= HindIII, C = ClaI y K = KpnI.
La Figura 7 muestra la construcción de pGBH3, un
plásmido capaz de dirigir la expresión de heparinasa III activa en
E. coli a partir de un promotor taq en tándem (puntas
de flecha dobles). Los sitios de restricción son: S = SalI,
B = BamHI, P = PstI, E = EcoRI, H =
HindIII, Bs = BspEI, C = ClaI y K =
KpnI.
\newpage
La Figura 8 muestra la secuencia de ácido
nucleico para el gen de heparinasa III de Flavobacterium
heparinum (SEQ ID NO:3).
La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos
para heparinasa III de Flavobacterium heparinum (SEQ ID
NO:4). La secuencia del péptido conductor está subrayada. La
proteína madura comienza en Q-25. Los péptidos 3A,
3B y 3C se indican en sus posiciones correspondientes dentro de la
proteína.
Para ayudar en la comprensión de la memoria
descriptiva y las reivindicaciones, con inclusión del alcance que
debe darse a tales términos, se proporcionan las definiciones
siguientes.
Gen. Por el término "gen" se
entiende una secuencia de DNA que codifica a través de su RNA molde
o mensajero una secuencia de aminoácidos característica de un
péptido específico. Adicionalmente, el término incluye regiones
intermedias, no codificantes, así como regiones reguladoras, y puede
incluir extremos 5' y 3'.
Secuencia de gen. Debe considerarse que
el término "secuencia de gen" se refiere generalmente a una
molécula de DNA que contiene uno o más genes, o fragmentos de gen,
así como una molécula de DNA que contiene una secuencia no
transcrita o no traducida. El término tiene por objeto incluir
adicionalmente cualquier combinación de uno o más genes,
fragmento(s) de gen, secuencia(s) no
transcrita(s) o secuencia(s) no traducida(s),
que están presentes en la misma molécula de DNA.
Las secuencias presentes pueden derivarse de una
diversidad de fuentes que incluyen DNA, DNA sintético, RNA, o sus
combinaciones. Tales secuencias de gen pueden comprender DNA
genómico que puede incluir o no intrones existentes naturalmente.
Además, dicho DNA genómico puede obtenerse en asociación con
regiones promotoras o secuencias poli-A. Las
secuencias de genes, DNA genómico o cDNA pueden obtenerse por
cualquiera de varios procedimientos. El DNA genómico puede
extraerse y purificarse de células adecuadas, tales como células de
cerebro, por medios bien conocidos en la técnica. Alternativamente,
el mRNA puede aislarse de una célula y utilizarse para producir
cDNA por transcripción inversa u otros medios.
DNA recombinante. Por el término "DNA
recombinante" se entiende una molécula que ha sido recombinada
por corte y empalme in vitro de cDNA o una secuencia de DNA
genómico.
Vehículo de clonación. Un DNA de plásmido
o fago u otra secuencias de DNA que es capaz de replicarse en una
célula hospedadora. El vehículo de clonación se caracteriza por uno
o más sitios de reconocimiento de endonucleasas en los cuales
pueden cortarse las secuencias de DNA de una manera determinable sin
pérdida de una función biológica esencial del DNA, que pueden
contener un marcador adecuado para uso en la identificación de
células transformadas. Marcadores incluyen por ejemplo, resistencia
a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina. El término vector
puede utilizarse para hacer relación a un vehículo de clonación.
Secuencia de control de la expresión. Una
secuencia de nucleótidos que controla o regula la expresión de genes
estructurales cuando está enlazada operativamente a dichos genes.
Dichas secuencias incluyen los sistemas lac, el operador
mayor del sistema trp y regiones promotoras del fago lambda,
la región de control de la proteína de la cubierta fd y
otras secuencias conocidas que controlan la expresión de genes en
células procariotas o eucariotas.
Vehículo de expresión. Un vehículo o
vector similar a un vehículo de clonación pero que es capaz de
expresar un gen que ha sido clonado en él, después de
transformación en un hospedador. El gen clonado se encuentra
usualmente bajo el control de (es decir, unido operativamente a)
ciertas secuencias de control tales como secuencias promotoras. Las
secuencias de control de la expresión variarán dependiendo de si el
vector está diseñado para expresar el gen enlazado operativamente
en un hospedador procariota o eucariota y pueden contener
adicionalmente elementos de transcripción tales como elementos
intensificadores, secuencias de terminación, elementos con
especificidad de tejido, y/o sitios de iniciación y terminación de
la traducción.
Promotor. El término "promotor"
tiene por objeto hacer referencia a una secuencia de DNA que puede
ser reconocida por una RNA-polimerasa. La presencia
de una secuencia de este tipo permite que la
RNA-polimerasa se fije e inicie la transcripción de
secuencias de gen enlazadas operativamente.
Región promotora. El término "región
promotora" tiene por objeto incluir en sentido general tanto la
secuencia promotora como secuencias de gen que pueden ser
necesarias para la iniciación de la transcripción. La presencia de
una región promotora es, por tanto, suficiente para causar la
expresión de una secuencia de gen enlazada operativamente.
Enlazado operativamente. Como se utiliza
en esta memoria, el término "enlazado operativamente" significa
que el promotor controla la iniciación de la expresión del gen. Un
promotor está enlazado operativamente a una secuencia de DNA
proximal si al introducirse en una célula hospedadora el promotor
determina la transcripción de la secuencia o secuencias proximales
de DNA en una o más especies de RNA. Un promotor está enlazado
operativamente a una secuencia de DNA si el promotor es capaz de
iniciar la transcripción de dicha secuencia de DNA.
\newpage
Procariota. El término "procariota"
tiene por objeto incluir todos los organismos que carecen de un
núcleo verdadero, con inclusión de bacterias.
Hospedador. El término "hospedador"
tiene por objeto incluir no solo procariotas, sino también
eucariotas tales como levaduras y hongos filamentosos, así como
células vegetales y animales. El término incluye organismos o
células que son el receptor de un vehículo de expresión
replicable.
La presente invención está basada en la
clonación y expresión de una enzima no clonada con anterioridad.
Aunque la heparinasa II había sido purificada parcialmente con
anterioridad, no se disponía de secuencia alguna de aminoácidos.
Específicamente, la invención describe la clonación, secuenciación y
expresión de heparinasa II de Flavobacterium heparinum y el
uso de una región de fijación de ribosoma modificada para expresión
de este gen. Además de las especies de nucleótidos, se proporciona
también la secuencia de aminoácidos de heparinasa II. La invención
proporciona adicionalmente la heparinasa II expresada, así como
métodos de expresión de esta enzima.
La clonación se realizó utilizando iniciadores
nucleotídicos degenerados y "guessmer" (adivinadores) derivados
de secuencias o fragmentos de aminoácidos de las heparinasas,
purificados como se describe en detalle más adelante. Las
secuencias de aminoácidos no estaban disponibles con anterioridad.
La clonación fue excepcionalmente difícil debido al problema
inesperado de la toxicidad del DNA de F. heparinum en E.
coli. Los autores de la invención descubrieron técnicas para
resolver este problema, como se describe más adelante en detalle.
Sobre la base de esta exposición, un experto en la técnica puede
clonar fácilmente heparinasas adicionales y otras proteínas de
F. heparinum o de fuentes adicionales utilizando los nuevos
métodos descritos en esta memoria.
La expresión de las heparinasas se describe
adicionalmente en esta memoria. Para expresar heparinasas I, II y
III, son necesarias señales de transcripción y traducción
reconocibles por un hospedador apropiado. Las secuencias
codificantes de las heparinasas clonadas, obtenidas por los métodos
arriba descritos, y preferiblemente en una forma bicatenaria,
pueden enlazarse operativamente a secuencias que controlan la
expresión de transcripción en un vector de expresión, e
introducidas en una célula hospedadora, sea procariota o eucariota,
para producir heparinasas recombinantes o un derivado funcional de
las mismas. Dependiendo de cuál sea la cadena de la secuencia
codificante de heparinasa que está enlazada operativamente a las
secuencias que controlan la expresión de la transcripción, es
también posible expresar RNA antisentido de heparinasa o un derivado
funcional del mismo.
Para la expresión de las heparinasas I, II y III
en E. coli, se construyeron vectores en los cuales la
expresión estaba dirigida por dos repeticiones del promotor tac. Se
hicieron modificaciones de la región de fijación de ribosoma de
este promotor por introducción de mutaciones con la reacción en
cadena de la polimerasa. En una modificación preferida del vector
de expresión, se mejoró la secuencia de consenso mínima
Shine-Dalgarno por introducción de una mutación
simple (AGGAA \rightarrow AGGAG), que presentaba la ventaja
adicional de reducir el número de nucleótidos entre la secuencia
Shine-Dalgarno y el codón de comienzo ATG. Se
produjeron modificaciones adicionales utilizando PCR en la cual la
laguna entre la secuencia Shine-Dalgarno y el codón
de comienzo estaba reducida adicionalmente. Utilizando las mismas
técnicas, pueden producirse modificaciones adicionales en esta
región, con inclusión de inserciones y deleciones, para crear
vectores de expresión de heparinasa adicionales. Como resultado, se
proporciona un vector de expresión para la expresión de heparinasas,
que comprende una región de fijación de ribosoma modificada que
contiene una secuencia Shine-Dalgarno de 5 pares de
bases, una región espaciadora de 9 pares de bases entre la secuencia
Shine-Dalgarno y el codón de comienzo ATG, y una
codificación de la secuencia de nucleótidos recombinante. Se
proporcionan también modificaciones a este vector que comprenden
cambiar la longitud y secuencia de la secuencia
Shine-Dalgarno, y también por reducción de la
separación entre la secuencia Shine-Dalgarno y el
codón de comienzo a 8, 7, 6, 5, 4 o menos nucleótidos.
La expresión de las heparinasas en hospedadores
diferentes puede dar como resultado distintas modificaciones
posteriores a la traducción, que pueden alterar las propiedades de
las heparinasas, o un derivado funcional de las mismas, en células
eucariotas, y especialmente en células de mamífero, insecto y
levadura. Hospedadores eucariotas especialmente preferidos son
células de mamífero, sea in vivo, en animales o en cultivo de
tejido. Las células de mamífero proporcionan modificaciones
posteriores a la traducción a las heparinasas recombinantes que
incluyen plegamiento y/o glicosilación en sitios similares o
idénticos al encontrado para las heparinasas nativas. Muy
preferiblemente, las células hospedadoras de mamífero incluyen
células de cerebro y de neuroblastoma.
Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal
como DNA, es "capaz de expresar" un polipéptido si la misma
contiene secuencias de control de la expresión que contienen
información reguladora de la transcripción, y tales secuencias
están "enlazadas operativamente" a la secuencia de nucleótidos
que codifica el polipéptido.
Un enlace operativo es un enlace en el cual una
secuencia está conectada a una secuencia o secuencias
reguladora(s)
de tal manera que pone la expresión de la secuencia bajo la influencia o el control de la secuencia reguladora. Dos secuencias de DNA (tales como una secuencia codificadora de heparinasas y una secuencia de región promotora enlazada al extremo 5' de la secuencia codificante) se dice que están enlazadas operativamente si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción del mRNA de la secuencia codificante de heparinasas y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de DNA no (1) da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión de las heparinasas, o (3) interfiere con la capacidad del molde de heparinasas para ser transcrito por la secuencia de la región promotora. Así, una región promotora estaría enlazada operativamente a una secuencia de DNA si el promotor fuese capaz de efectuar la transcripción de dicha secuencia de DNA.
de tal manera que pone la expresión de la secuencia bajo la influencia o el control de la secuencia reguladora. Dos secuencias de DNA (tales como una secuencia codificadora de heparinasas y una secuencia de región promotora enlazada al extremo 5' de la secuencia codificante) se dice que están enlazadas operativamente si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción del mRNA de la secuencia codificante de heparinasas y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de DNA no (1) da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión de las heparinasas, o (3) interfiere con la capacidad del molde de heparinasas para ser transcrito por la secuencia de la región promotora. Así, una región promotora estaría enlazada operativamente a una secuencia de DNA si el promotor fuese capaz de efectuar la transcripción de dicha secuencia de DNA.
La naturaleza precisa de las regiones
reguladoras necesarias para la expresión de los genes puede variar
entre especies o tipos de células, pero en general incluye, en caso
necesario, secuencias 5' no transcriptoras y 5' que no se traducen
(no codificantes) implicadas en la iniciación de la transcripción y
la traducción respectivamente, tales como la secuencia TATA,
secuencia de protección terminal, secuencia CAAT, y análogas.
Especialmente, tales secuencias de control 5' no transcriptoras
incluirán una región que contiene un promotor para control de la
transcripción del gen enlazado operativamente.
En caso deseado, puede construirse un producto
de fusión de las heparinasas. Por ejemplo, la secuencia codificante
de heparinasas puede enlazarse a una secuencia señal que permitirá
la secreción de la proteína por, o la compartimentación de la
proteína en, un hospedador particular. Tales secuencias señal pueden
estar diseñadas con o sin sitios de proteasa específicos de tal
modo que la secuencia del péptido señal sea susceptible de
eliminación subsiguiente. Alternativamente, puede utilizarse la
secuencia señal nativa para esta proteína.
Pueden seleccionarse señales reguladoras de la
iniciación de la transcripción que permiten represión o activación,
de tal modo que puede modularse la expresión de los genes enlazados
operativamente.
Sobre la base de esta exposición, un experto en
la técnica puede incorporar fácilmente las secuencias de la
presente invención en vectores de expresión adicionales y
trasformarlas en una diversidad de bacterias para obtener
heparinasa II recombinante.
Una vez que el vector o la secuencia de DNA que
contiene la o las construcciones se ha preparado para expresión, se
introduce(n) la o las construcciones de DNA en una célula
hospedadora apropiada por cualquiera de una diversidad de medios
adecuados, con inclusión de transfección. Después de la introducción
del vector, las células receptoras se dejan crecer en un medio
selectivo, que selecciona el crecimiento de las células que
contienen el vector. La expresión de la o las secuencias de gen
clonada(s) da como resultado la producción de heparinasa I,
II o III, o la producción de un fragmento de una de estas
proteínas. Esta expresión puede tener lugar de una manera continua
en las células transformadas, o de una manera controlada, por
ejemplo, expresión que sigue a la inducción de diferenciación de
las células transformadas (por ejemplo, por administración de
bromodesoxiuracilo a células de neuroblastoma o análogas).
La proteína expresada se aísla y purifica de
acuerdo con condiciones convencionales, tales como extracción,
precipitación, cromatografía, electroforesis, o análogas.
Procedimientos detallados para el aislamiento de las heparinasas se
exponen en detalle en los ejemplos que siguen.
La invención proporciona adicionalmente
derivados funcionales de las secuencias de heparinasa II.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término
"derivado funcional" se utiliza para definir cualquier
secuencia de DNA que se deriva de la secuencia de DNA original y
que posee todavía las actividades biológicas de la molécula
parental nativa. Un derivado funcional puede ser una inserción, una
deleción, o una sustitución de una o más bases en la secuencia de
DNA original. Las sustituciones pueden ser tales que reemplacen un
aminoácido nativo con otro aminoácido que no afecta sustancialmente
al funcionamiento de la proteína. Los expertos en la técnica
reconocerán que sustituciones adecuadas incluirán positivamente el
funcionamiento de la proteína, tales como un aminoácido pequeño con
carga neutra que reemplaza otro aminoácido pequeño con carga neutra.
Los expertos en la técnica reconocerán que derivados funcionales de
las heparinasas pueden prepararse por mutagénesis del DNA
utilizando uno de los procedimientos conocidos en la técnica, tal
como mutagénesis orientada. Adicionalmente, puede conducirse
mutagénesis aleatoria y pueden obtenerse mutantes que retienen la
función por escrutinio apropiado.
Los anticuerpos de la presente invención
incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, así como
fragmentos de estos anticuerpos. Fragmentos de anticuerpos de la
presente invención incluyen, pero sin carácter limitante, el
fragmento Fab, el Fab2, y el Fc.
La invención proporciona también hibridomas que
son capaces de producir los anticuerpos arriba descritos. Un
hibridoma es una línea de células inmortalizada que es capaz de
secretar un anticuerpo monoclonal específico.
En general, los métodos para preparación de
anticuerpos policlonales y monoclonales así como hibridomas capaces
de producir el anticuerpo deseado son bien conocidos en la técnica
(Campbell, A.M., "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier
Science Publishers, Ámsterdam, Países Bajos (1984); St. Groth et
al., J. Immunol. Methods 35: 1-21 (1980)).
Cualquier mamífero que se sepa produce
anticuerpos puede inmunizarse con el polipéptido del pseudogén.
Métodos para inmunización son bien conocidos en la técnica. Dichos
métodos incluyen inyección subcutánea o interperitoneal del
polipéptido. Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad de
heparinasa utilizada para inmunización variará basándose en el
animal que se inmuniza, la antigenicidad del péptido y el sitio de
inyección.
La proteína que se utiliza como inmunógeno puede
modificarse o administrarse en un adyuvante a fin de aumentar la
antigenicidad de la proteína. Métodos para aumentar la antigenicidad
de una proteína son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero
sin carácter limitante, acoplamiento del antígeno con una proteína
heteróloga (tal como globulina o
\beta-galactosidasa) o por la inclusión de un
adyuvante durante la inmunización.
Para los anticuerpos monoclonales, se extraen
células de bazo de los animales inmunizados, se fusionan con
células de mieloma, tales como células de mieloma
SP2/0-Ag14, y se deja que se conviertan en células
de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales.
Pueden utilizarse uno cualquiera de varios
métodos bien conocidos en la técnica para identificar la célula de
hibridoma que produce un anticuerpo con las características
deseadas. Éstos incluyen escrutinio de los hibridomas con un ensayo
ELISA, análisis por transferencia Western, o radioinmunoensayo (Lutz
et al., Exp. Cell Res. 175: 109-124
(1988)).
Los hibridomas que secretan los anticuerpos
deseados se clonan y se determina la clase y la subclase utilizando
procedimientos conocidos en la técnica (Campbell, A.M.,
Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers,
Ámsterdam, Países Bajos (1984)).
Para anticuerpos policlonales, se aísla del
animal inmunizado el antisuero que contienen los anticuerpos y se
escruta en cuanto a la presencia de anticuerpos con la especificidad
deseada utilizando uno de los procedimientos arriba descritos.
La presente invención proporciona además los
anticuerpos arriba descritos en forma marcada de modo detectable.
Los anticuerpos pueden marcarse de modo detectable por el uso de
radioisótopos, marcadores de afinidad (tales como biotina, avidina,
etc.), marcadores enzimáticas (tales como peroxidasa de rábano
picante, fosfatasa alcalina, etc.), marcadores fluorescentes (tales
como FITC o rodamina, etc.), átomos paramagnéticos, marcadores
quimioluminiscentes, etcétera. Procedimientos para la realización
de dicha marcación son bien conocidos en la técnica; por ejemplo,
véase Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem.
18:315 (1970); Byer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308
(1979); Engval E. et al., Immunol, 109:129 (1972); Goding,
J.W., J. Immunol. Meth. 13:215 (1976).
La presente invención proporciona adicionalmente
los anticuerpos arriba descritos inmovilizados sobre un soporte
sólido. Ejemplos de tales soportes sólidos incluyen plásticos, tales
como policarbonato, carbohidratos complejos tales como agarosa y
Sepharose, resinas acrílicas tales como poliacrilamida y perlas de
látex. Métodos para acoplamiento de anticuerpos a tales soportes
sólidos son bien conocidos en la técnica (Weir et al., Handbook
of Experimental Immunology, 4ª edición, Blackwell Scientific
Publications, Oxford, Inglaterra (1986)). Los anticuerpos
inmovilizados de la presente invención pueden utilizarse para
purificación de heparinasas por inmunoafinidad.
Una vez descrita en líneas generales la
invención, se comprenderá la misma por una serie de Ejemplos
específicos, que no tienen por objeto ser limitantes.
Se purificaron enzimas
heparina-liasa a partir de cultivos de
Flavobacterium heparinum. Se cultivó F. heparinum en
un fermentador de 15 l controlado por ordenador utilizando una
variación del medio nutriente definido descrito por Galliher et
al., Appl. Environ. Microbiol. 41(2):
360-365 (1981). Las fermentaciones diseñadas para
producir heparina-liasas incorporan heparina
semi-purificada (Celsus Laboratories) en el medio a
una concentración de 1,0 g/l como inductor de la síntesis de
heparinasa. Las células se cosecharon por centrifugación y las
enzimas deseadas se liberaron del espacio periplásmico por una
variación del procedimiento de choque osmótico descrito por
Zimmermann y Cooney, Patente de EE.UU. Nº 5.262.325, que se
incorpora en esta memoria por referencia.
Se consiguió una preparación
semi-purificada de las enzimas de heparinasa por una
modificación del procedimiento descrito por Zimmermann et
al., Patente de EE.UU. Nº 5.262.325. Las proteínas del
osmolizado bruto se adsorbieron sobre una resina cambiadora de
cationes (CBX, J.T. Baker) a una conductividad de
1-7 \mumho. Las proteínas no fijadas del extracto
se desecharon y la resina se compactó en una columna cromatográfica
(5.0 cm d.e. x 100 cm). Las porciones fijadas se eluyeron a un
caudal lineal de 3,75 cm\cdotmin^{-1} con gradientes escalonados
de fosfato 0,01 M, fosfato 0,01 M/cloruro de sodio 0,1 M, fosfato
0,01 M/cloruro de sodio 0,25 M y fosfato 0,01 M/cloruro de sodio
1,0 M, todos ellos a pH 7,0 \pm 0,1. La heparinasa II se eluye en
la fracción de NaCl 0,1 M, mientras que las heparinasas I y III se
eluyen en la fracción 0,25 M.
Alternativamente, se eliminó el paso de cloruro
de sodio 0,1 M y las tres heparinasas se eluyeron juntamente con
cloruro de sodio 0,25 M. Las fracciones de heparinasa se cargaron
directamente en una columna que contenía sulfato de Cellufine (5,0
cm d.e. x 30 cm, Amicon) y se eluyeron a un caudal lineal de 2,50
cm\cdotmin^{-1} con gradientes escalonados de fosfato 0,01 M,
fosfato 0,01 M/cloruro de sodio 0,2 M, fosfato 0,01 M/cloruro de
sodio 0,4 M y fosfato 0,01 M/cloruro de sodio 1,0 M, todos ellos a
pH 7,0 \pm 0,1. Las heparinasas II y III se eluyen en la fracción
de cloruro de sodio 0,2 M, mientras que la heparinasa I se eluye en
la fracción 0,4 M.
\newpage
La fracción de cloruro de sodio 0,2 M procedente
de la columna de sulfato de Cellufine se diluyó con fosfato de
sodio 0,01 M para dar una conductancia menor que 5 \mumhos. La
solución se purificó ulteriormente por carga del material en una
columna de hidroxilapatito (2,6 cm d.i. x 20 cm) y elución de la
proteína fijada a un gradiente lineal de 1,0 cm\cdotmin^{-1}
con gradientes escalonados de fosfato 0,01 M, fosfato 0,01 M/cloruro
de sodio 0,35 M, fosfato 0,01 M/cloruro de sodio 0,45 M, fosfato
0,01 M/cloruro de sodio 0,65 M y fosfato 0,01 M/cloruro de sodio
1,0 M, todos ellos a pH 7,0 \pm 0,1. La heparinasa III se eluye en
un solo pico de proteína en la fracción de cloruro de sodio 0,45 M,
mientras que la heparinasa III se eluye en un solo pico de proteína
en la fracción de cloruro de sodio 0,65 M.
La heparinasa I se purificó ulteriormente por
carga del material procedente de la columna de sulfato de Cellufine,
diluido a una conductividad menor que 5 \mumhos, en una columna de
hidroxilapatito (2,6 cm d.i. x 20 cm) y elución de la proteína
fijada a un caudal lineal de 1,0 cm\cdotmin^{-1} con un
gradiente lineal de fosfato (0,01 a 0,25 M) y cloruro de sodio (0,0
a 0,5 M). La heparinasa I se eluye en un solo pico de proteína
aproximadamente a mitad de camino del gradiente.
Las enzimas heparinasa obtenidas por este método
se analizaron por SDS-PAGE utilizando la técnica de
Laemmli, Nature 227: 680-685 (1970), y los
genes se cuantificaron por un densitómetro de escaneo
(Bio-Rad, Modelo GS-670). Las
heparinasas I, II y III exhibían pesos moleculares de 42.500 \pm
2.000, 84.000 \pm 4.200 y 73.000 \pm 3.500 Daltons,
respectivamente. Todas las proteínas exhibían purezas mayores que
99%. Los resultados de la purificación para las enzimas heparinasa
se muestran en la Tabla 1.
Las actividades de heparinasa se determinaron
por el ensayo espectrofotométrico descrito por Yang et al.
Una modificación de este ensayo que incorporaba un tampón de
reacción constituido por Tris 0,018 M, cloruro de sodio 0,044 M y
1,5 g/l de sulfato de heparano a pH 7,5 se utilizó para medir la
actividad de degradación del sulfato de heparano.
La heparinasa I recombinante forma cuerpos de
inclusión intracelulares que requieren desnaturalización y
replegamiento de la proteína para obtener heparinasa activa. Se
examinaron dos disolventes, urea e hidrocloruro de guanidina como
agentes solubilizantes. De éstos, únicamente HCl de guanidina, a 6
M, era capaz de solubilizar los cuerpos de inclusión de heparinasa
I. Sin embargo, el grado máximo de purificación se obtuvo por lavado
secuencial de los cuerpos de inclusión en urea 3M y HCl de
guanidina 6M. El paso de lavado con urea sirvió para eliminar las
proteínas contaminantes de E. coli y residuos celulares para
antes de la solubilización de la heparinasa I agregada por HCl de
guanidina.
La heparinasa I recombinante se preparó por
crecimiento de E. coli Y1090(pGHep1), una cepa que
alberga un plásmido que contiene el gen de heparinasa I espesado
por promotores tac en tándem, en caldo Luria con IPTG 0,1 M. Las
células se concentraron por centrifugación y se resuspendieron en
una décima parte de su volumen de tampón que contenía fosfato de
sodio 0,01 M y cloruro de sodio 0,2 M a pH 7,0. Las células se
disgregaron por sonicación, 5 minutos con ciclos intermitentes de
30 segundos, ajuste de potencia #3 y los cuerpos de inclusión se
concentraron por centrifugación, 7.000 x g, 5 minutos. Los
sedimentos se lavaron dos veces con urea 3 M fría durante 2 horas a
pH 7,0 y el material insoluble se recuperó por centrifugación. La
heparinasa I se desplegó en HCl de guanidina 6M que contenía DTT 50
mM y se replegó por diálisis en sulfato de amonio 0,1 M. Las
proteínas contaminantes adicionales precipitaron en sulfato de
amonio 0,1 M y pudieron eliminarse por centrifugación. La
heparinasa I purificada por este método tenía una actividad
específica de 42,21 IU/mg y tenía una pureza de 90% por análisis
SDS-PAGE/densitometría de escaneo. La enzima puede
purificarse ulteriormente por cromatografía de intercambio de
cationes, como se ha descrito arriba, produciendo una preparación de
heparinasa I que tiene una pureza mayor que 99% por análisis
SDS-PAGE/densitometría de escaneo.
El peso molecular y las propiedades cinéticas de
las tres enzimas heparinasa han sido consignados con exactitud por
Lohse y Linhardt, J. Biol. Chem.
267:24347-24355 (1992). Sin embargo, no se había
llevado a cabo una caracterización exacta de las modificaciones de
las proteínas posteriores a la traducción. Las heparinasas I, II y
III, purificadas como se describe en esta memoria, se analizaron
respecto a la presencia de restos carbohidrato. Soluciones que
contenían 2 \mug de heparinasas I, II y III y heparinasa I
recombinante se llevaron a pH 5,7 por adición de acetato de sodio
0,2 M. Estas muestras de proteína se sometieron a biotinilación de
carbohidratos siguiendo el protocolo 2a, descrito en el kit
GlycoTrack (Oxford Glycosystems). Se sometieron 30 \mul de cada
solución de proteína biotinilada a SDS-PAGE (gel al
10%) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa por
electrotransferencia a una intensidad de corriente constante de 160
mA. La detección del carbohidrato biotinilado se realizó por una
reacción de color específica de fosfatasa alcalina después de la
fijación de un conjugado estreptavidina-fosfatasa
alcalina a los grupos biotina. Estos análisis revelaron que las
heparinasas I y II están glicosiladas y que la heparinasa III y la
heparinasa I recombinante no lo están.
Los anticuerpos policlonales generados en
conejos inyectados con heparinasa I de tipo salvaje pudieron
fraccionarse en dos poblaciones como se describe más adelante.
Parece ser que una de estas fracciones reconoce un resto posterior
a la traducción, común a las proteínas producidas en F.
heparinum, mientras que la otra fracción reconoce
específicamente secuencias de amino-ácidos contenidas en heparinasa
I. Todas las enzimas heparinasa producidas en F. heparinum
eran reconocidas por los anticuerpos "inespecíficos", pero no
la heparinasa producida en E. coli. El candidato más
probable para el determinante antigénico no proteínico de heparinasa
I es el componente carbohidrato; así, el experimento de
transferencia Western indica que todas las liasas producidas en
F. heparinum están glicosiladas.
Las heparinasas II y III purificadas se
analizaron por la técnica de Edman para determinar el residuo de
aminoácido N-terminal de la proteína madura. Sin
embargo, la química de Edman era incapaz de liberar un aminoácido,
indicando que se había producido una modificación posterior a la
traducción en el aminoácido N-terminal de ambas
heparinasas. Muestras de un nmol de las heparinasas II y III se
utilizaron para desbloqueo con
piroglutamato-aminopeptidasa. Se produjeron
muestras de control por desbloqueo falso de muestras de 1 nmol de
proteína sin adición de
piroglutamato-aminopeptidasa. Todas las muestras se
pusieron en NH_{4}CO_{3} 10 mM, pH 7,5, y DTP 10 mM (volumen
final de 100 \mul). A las muestras que no eran de control, se
añadió 1 mU de piroglutamato-aminopeptidasa y todas
las muestras se incubaron durante 8 h a 37ºC. Después de la
incubación, se añadieron 0,5 mU adicionales de
piroglutamato-aminopeptidasa a las muestras que no
eran de control y todas las muestras se incubaron durante 16 h
adicionales a 37ºC.
Se cambiaron tampones de desbloqueo por ácido
fórmico al 35% utilizando una unidad Centricon con corte a 10.000
Daltons y la muestra se secó a vacío. Las muestras se sometieron a
análisis de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con el método de
Edman.
Las propiedades de las tres proteínas heparinasa
de Flavobacterium heparinum se enumeran en la Tabla 2.
Las heparinasas II y III se digirieron con
bromuro de cianógeno a fin de producir fragmentos de péptido para
aislamiento. Las soluciones de proteína (concentración de proteína
1-10 mg/ml) se llevaron a una concentración de DTT
de 0,1 M, y se incubaron a 40ºC durante 2 h. Las muestras se
congelaron y liofilizaron a vacío. El pelet se resuspendió en ácido
fórmico al 70%, y se borboteó nitrógeno gaseoso a través de la
solución para excluir el oxígeno. Se preparó una solución stock de
CNBr en ácido fórmico al 70% y la solución stock se borboteó con
nitrógeno gaseoso y se guardó en la oscuridad durante periodos de
tiempo breves. Para adición de CNBr, se utilizó un exceso molar de
500 a 1.000 veces de CNBr a residuos metionina en la proteína. El
stock de CNBr se añadió a las soluciones de proteína, se borboteó
con nitrógeno gaseoso y se cerró herméticamente el tubo. El tubo de
reacción se incubó a 24ºC durante 20 h, en la oscuridad.
Las muestras se secaron parcialmente a vacío, se
añadió agua a la muestra, y se repitió la liofilización parcial.
Este procedimiento de lavado se repitió hasta que los pelets de la
muestra eran blancos. Las mezclas de péptidos se solubilizaron en
ácido fórmico y se aplicaron a una columna HPLC de fase inversa
Vydac C_{18} (4,6 mm i.d. x 30 cm) y los fragmentos individuales
de péptidos se eluyeron a un caudal lineal de 6,0
cm\cdotmin^{-1} con un gradiente lineal de 10 a 90% de
acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 1%. Los fragmentos
recuperados de estas reacciones se sometieron a determinación de la
secuencia de aminoácidos utilizando un Secuenciador de Proteínas
Applied Biosystems 745A. Tres péptidos aislados de heparinasa II
dieron secuencias: EFPEMYNLAAGR (SEQ ID NO:5), KPADIPEVKDGR (SEQ ID
NO:6), y LAGDFVTGKILAQGFGPDNQTPDYTYL (SEQ ID NO:7) y se designaron
como péptidos 2A, 2B y 2C, respectivamente. Tres péptidos de
heparinasa III dieron las secuencias: LIKNEVRWQLHRVK (SEQ ID NO:8),
VLKASPPGEFHAQPDNGTFELFI (SEQ ID NO:9) y KALVHWFWPHKGYGYFDYKGDIN (SEQ
ID NO:10) y se designaron como péptidos 3A, 3B y 3C,
respectivamente.
Se utilizaron las heparinasas I, II y III y
heparinasa recombinante I, purificadas como se describe en esta
memoria, para generar anticuerpos policlonales en conejos. Cada una
de las heparinasas I, II y III se sometió al procedimiento de
inmunización estándar siguiente: La inyección primaria estaba
constituida por 0,5-1,0 mg de proteína purificada
disuelta en 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato,
que se homogeneizó con un 1 ml de adyuvante de Freund (Cedarlane
Laboratories Ltd.). Esta emulsión proteína-adyuvante
se utilizó para inyectar conejos hembra blancos de Nueva Zelanda; 1
ml por conejo, 0,5 ml por pata posterior, i.m., en el músculo del
muslo próximo a la cadera. Después de 2 a 3 semanas, se administró a
los conejos una inyección de refuerzo constituida por
0,5-1,0 mg de proteína purificada disuelta en
solución salina estéril tamponada con fosfato homogeneizada con 1
ml de adyuvante incompleto de Freund (Cedarlane Laboratories Ltd.).
Nuevamente, después de 2 a 3 semanas, se administró a los conejos
una tercera inyección de refuerzo idéntica.
Se recogió una muestra de sangre de cada animal
de la arteria central de la oreja aproximadamente 10 días después
de la inyección de refuerzo final. Se preparó suero dejando que la
muestra se coagulara durante 2 horas a 22ºC seguido por incubación
durante una noche a 4ºC, y aclaramiento por centrifugación a 5.000
rpm durante 10 min. Los antisueros se diluyeron en relación
1:100.000 en solución salina tamponada con Tris (pH 7,5) y se
realizó un análisis por transferencia Western para identificar los
sueros que contenían los anticuerpos
anti-heparinasa I, II o III. Los anticuerpos
generados contra heparinasa I de tipo salvaje, pero no contra la
heparinasa I recombinante, exhibían un alto grado de reactividad
cruzada contra otras proteínas de F. heparinum. Esto se
debía probablemente a la presencia de una modificación antigénica
posterior a la traducción, común a las proteínas de F.
heparinum, pero que no se encuentra en las proteínas
sintetizadas en E. coli. Para explorar más esto, se
inmovilizó la heparinasa I recombinante en perlas de Sepharose y se
compactó en una columna cromatográfica. Los anticuerpos
anti-heparinasa I purificados (tipo salvaje) se
cargaron en la columna y se recogió la fracción no fijada. Los
anticuerpos fijados se eluyeron en glicina 0,1 M, pH 2,0. Se
encontró IgG en ambas fracciones no fijada y fijada, y se utilizó
posteriormente en experimentos de transferencia Western. El
anticuerpo aislado de la fracción no fijada reconocía de modo
inespecífico las proteínas de F. heparinum, pero ya no
detectaba la heparinasa I recombinante (E. coli), mientras
que el anticuerpo aislado de la fracción fijada reconocía
únicamente la heparinasa I, sintetizada tanto en F. heparinum
como en E. coli. Este resultado indicaba que, como se
suponía, se forman dos poblaciones de anticuerpos por exposición al
antígeno de heparinasa I de tipo salvaje: una específica para la
cadena principal de la proteína, en tanto que otra reconoce un resto
modificado con posterioridad a la traducción, común a las proteínas
de F. heparinum.
Este descubrimiento proporciona a la vez un
medio para purificar anticuerpos específicos
anti-heparinasa y una herramienta para caracterizar
la proteína heparinasa I de tipo salvaje.
Se construyó una genoteca de DNA cromosómico de
Flavobacterium heparinum en el fago lambda DASHII. Se
digirieron parcialmente 0,4 \mug de DNA cromosómico de F.
heparinum con la enzima de restricción Sau3A para
producir una mayoría de fragmentos de alrededor de 20 Kb de tamaño,
como se describe en Maniatis, et al., Molecular Cloning
Manual, Cold Spring Harbor (1982). Este DNA se extrajo con
fenol/cloroformo, se precipitó con etanol, se ligó con ramas
\lambdaDASHII y se empaquetó con extractos de empaquetamiento de
un Kit de Clonación \lambdaDASHII/BamHI (Stratagene, La
Jolla, CA). La genoteca se tituló a aproximadamente 10^{-5} pfu/ml
después del empaquetamiento, se amplificó a 10^{-8} pfu/ml por el
método de lisis de placas, y se guardó a -70ºC como ha sido descrito
por Silhavy, T.J., et al. en Experiments in Molecular
Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1992.
La genoteca cromosómica de F. heparinum
se tituló a aproximadamente 300 pfu/placa, se extendió sobre un
césped de E. coli, y se dejaron transfectar las células
durante una noche a 37ºC, formando calvas. Las calvas de fago se
transfirieron a papel de nitrocelulosa, y el DNA de fago se fijó a
los filtros, como se describe en Maniatis,
et al., ibid.
et al., ibid.
El gen para la proteína heparinasa I madura se
clonó al sitio EcoRI del vector pB9, donde su expresión
estaba dirigida por dos repeticiones del promotor tac (del vector
de expresión, pKK223-3, Brosius, y Holy, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81: 6929-69233 (1984)). En
este vector, pBhep, el primer codón, ATG, para heparinasa I está
separado por 10 nucleótidos de una secuencia mínima
Shine-Dalgarno AGGA (Shine y Dalgarno, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 71: 1342-1346 (1974)),
Figura 1. Esta construcción se transformó en la cepa de E.
coli, JM109, se dejó crecer a 37ºC y se indujo con IPTG 1 mM, 2
horas antes de la cosecha. Las células se lisaron por sonicación,
la fracción de membrana celular se redujo a un pelet y se recuperó
el sobrenadante. La fracción de membrana se resuspendió en
guanidina-HCl 6 M a fin de solubilizar los cuerpos
de inclusión que contenían la enzima heparinasa I recombinante. La
heparinasa I soluble se replegó por dilución en tampón de fosfato 20
mM. La actividad de enzima se determinó en la fracción de pelet
replegada, y en la fracción sobrenadante. Se detectaron niveles de
actividad bajos en las fracciones de sobrenadante y de pelet. El
análisis de las fracciones por SDS-PAGE indicó que
ambas fracciones pueden contener bandas menores correspondientes a
la heparinasa I recombinante.
En un intento de incrementar los niveles de
expresión de pBhep, se introdujeron dos mutaciones como se indica
en la Figura 1. Las mutaciones se produjeron para mejorar el nivel
de traducción del mRNA de heparinasa I por aumento de la longitud
de la secuencia Shine-Dalgarno y por disminución de
la distancia entre la secuencia Shine-Dalgarno y el
sitio de comienzo ATG. Utilizando PCR, una mutación de una sola base
que convertía un A en un G mejoró la secuencia
Shine-Dalgarno desde una secuencia AGGA mínima a
AGGAG mientras que disminuía la distancia entre la secuencia
Shine-Dalgarno y el sitio de comienzo de la
traducción desde 10 a 9 pares de bases. Esta construcción se
designó pGhep. En la segunda construcción, p\Delta4hep, se
delecionaron 4 nucleótidos (AACA) utilizando PCR a fin de alargar
la secuencia Shine-Dalgarno hasta AGGAG además de
desplazarla hasta dentro de 5 pares de bases del sitio de comienzo
ATG.
Las diferentes construcciones se analizaron como
se ha descrito arriba. Los pelets replegados de E. coli
transformado con pGhep exhibían aproximadamente un aumento 7X en la
actividad de heparinasa I, en comparación con los pelets replegados
de E. coli que contenían pBhep. Por otra parte, E.
coli que contenía p\Delta4hep exhibía 2-3
veces menos actividad que el E. coli que contenía pBhep. Los
niveles de actividad de heparinasa I en los sobrenadantes eran
similares.
El plásmido, pBhep, se digirió con EcoRI
y se trató con nucleasa S1 para formar DNA con extremos romos. El
DNA plasmídico se digirió luego con BamHI y los extremos
monocatenarios se hicieron bicatenarios por rellenado con fragmento
Klenow. El DNA de extremos romos se ligó y se transformó en la cepa
FTB1 de E. coli. Un plásmido que contenía un sitio único
BamHI y no contenía DNA alguno del gen de heparinasa I se
purificó a partir de una colonia resistente a la kanamicina y se
designó plásmido pGB. El análisis de la secuencia de DNA reveló que
el plásmido pGB contenía el sitio de fijación de ribosoma
modificado, representado en la Figura 1.
Se diseñaron cuatro oligonucleótidos
"guessmer" utilizando información de dos secuencias peptídicas
2A y 2B y el uso de los codones de consenso para
Flavobacterium, representados en la Tabla 3. Estos eran:
| 5'GAATTCCCTGAGATGTACAATCTGGCCCG-3' | (SEQ ID NO: 11), | |
| 5'CCGGCAGCCAGATTGTACATTTCAGG-3' | (SEQ ID NO:12), | |
| 5'-AAACCCGCCGACATTCCCGAAGTAAAAGA-3' | (SEQ ID NO:13), y | |
| 5'-CGAAAGTCTTTTACTTCGGGAATGTCGGC-3' | (SEQ ID NO:14), |
designados 2-1,
2-2, 2-3 y 2-4,
respectivamente. Los oligonucleótidos se sintetizaron con un
sintetizador de péptidos Bio/CAN (Mississauga, Ontario). Se
utilizaron pares de estos oligonucleótidos como iniciadores en
reacciones PCR. Se digirió DNA cromosómico de F. heparinum
con las endonucleasas de restricción SalI, XbaI o
NotI, y el DNA fragmentado se combinó para uso como el DNA
molde. Se produjeron mezclas para la reacción en cadena de la
polimerasa utilizando el Kit de Reactivos de Amplificación de DNA
(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT). Las amplificaciones PCR se
realizaron en volúmenes de reacción de 100 \mul que contenían KCl
50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 9, 0,1% de Triton X-100,
MgCl_{2} 1,5 mM, 0,2 mM de cada uno de los cuatro
desoxirribosa-nucleótido-trifosfatos
(dNTPs), 100 pmol de cada iniciador, 10 ng de DNA genómico
fragmentado de F. heparinum y 2,5 unidades de polimerasa
Taq (Bio/CAN Scientific Inc., Mississauga, Ontario). Las
muestras se pusieron en un bloque de calentamiento automático
(ciclador térmico de DNA, Barnestad/Thermolyne Corporation, Dubuque,
IA) programado para ciclos progresivos de: temperatura de
desnaturalización 92ºC (1 minutos), temperaturas de reasociación de
37ºC, 42ºC ó 45ºC (1 minuto) y temperatura de extensión 72ºC (2
minutos). Estos ciclos se repitieron 35 veces. Los productos PCR
resultantes se analizaron en un gel de agarosa al 1,0% que contenía
0,6 \mug/ml de bromuro de etidio, como ha sido descrito por
Maniatis, et al., ibid. Se produjeron fragmentos de DNA por
los oligonucleótidos 2-2 y 2-3. Los
fragmentos, de un tamaño de 250 pb y 350 pb se separaron
primeramente por electroforesis en gel de agarosa al 1%, y el DNA
se extrajo de ellos utilizando el kit GENECLEAN I (Bio/CAN
Scientific Inc., Mississauga, Ontario). Los fragmentos purificados
se ligaron a pTZ/PC (Tessier y Thomas, no publicado) digerido
previamente con NotI, Figura 2, y la mezcla de ligación se
utilizó para transformar E. coli FTB1, como ha sido descrito
en Maniatis et al., ibid. Todas las enzimas de restricción y
la DNA-ligasa T4 se adquirieron de New England
Biolabs (Mississauga,
Ontario).
La cepa FTB1 se construyó en el laboratorio de
los autores de la invención. El episoma F' de la cepa
XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, La Jolla,
CA), que lleva el gen represor lac I^{q} y produce 10 veces
más represor lac que E. coli de tipo salvaje, se
llevó, como ha sido descrito por J. Miller, Experiments in
Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972), a la
cepa TB1 de E. coli, descrita por Baker, T.A., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6779-6783 (1984).
El fondo FTB1 permite una represión más rigurosa de la transcripción
de los plásmidos que llevan promotores con un operador lac
(a saber, los promotores lac y Taq). Las colonias
resultantes de la transformación de FTB1 se seleccionaron en agar
LB que contenía ampicilina y se escrutaron utilizando el filtro
azul/blanco proporcionado por X-gal e IPTG incluido
en el medio de agar, como ha sido descrito por Maniatis, et al.,
Ibid. Los transformantes se analizaron por fragmentación de las
colonias y se realizaron mini-preparaciones de DNA
para análisis por enzimas de restricción utilizando el kit RPM
(Bio/CAN Scientific Inc., Mississauga, Ontario). Diez plásmidos
contenían insertos de tamaño correcto, que se liberaron por
digestión con EcoRI y HindIII.
La secuenciación del DNA reveló que uno de los
plásmidos, pCE14, contenía un fragmento PCR de 350 pb que tenía la
secuencia de DNA esperada como se derivaba del péptido 2C. Las
secuencias de DNA se determinaron por el método de terminación de
cadenas didesoxi de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
74:5463-5467 (1978). Se llevaron a cabo
reacciones de secuenciación con el Kit Sequenase (U.S. Biochemical
Corp., Cleveland, Ohio) y ^{35}S-dATP (Amersham
Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canadá), como ha sido especificado
por el suministrador.
El gen de heparinasa II se clonó a partir de una
genoteca de DNA cromosómico de F. heparinum, Figura 2,
construida como se ha descrito arriba. Diez filtros que contenían
calvas se hibridaron con la sonda de DNA, producida a partir del
inserto purificado en gel de pCE14, que se marcó utilizando un Kit
de Marcación Aleatoria (Boehringer Mannhein Canadá, Laval, Quebec).
La hibridación de las calvas se realizó, como se describe en
Maniatis, et al., ibid., a 65ºC durante 16 horas en un horno
de hibridación Tek Star (Bio/CAN Scientific, Mississauga, Ontario).
Se realizaron lavados subsiguientes a 65ºC: dos veces durante 15
min en 2 X SSC, una sola vez en 2 X SSC/0,1% SDS durante 30 min, y
una sola vez en 0,5 X SSC/0,1% SDS durante 15 min. Las calvas
positivas se cosecharon utilizando puntas de micropipeta de
plástico y se confirmaron por análisis de transferencia puntual,
como ha sido descrito por Maniatis, et al., ibid. Seis de los
fagos, que daban señales de hibridación fuertes, se utilizaron para
análisis por hibridación Southern, como ha sido descrito por
Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503-517
(1975). Este análisis mostró que un solo fago, HIIS, contenía un
fragmento de 5,5 kb de DNA XbaI, que se hibridaba con la
sonda. La clonación del fragmento XbaI de 5,5 kb en el sitio
XbaI de cualquiera de los vectores siguientes: pTZ/PC, pBluescript
(Stratagene, La Jolla, CA), pUC18 (descrito en
Yanisch-Perron et al., Gene
33:103-119 (1985)), y pOK12 (descrito en Vierra
y Messing, Gene 100: 189-194 (1991)),
resultó insatisfactoria, aun cuando se utilizó el fondo FTB1 para
reprimir la transcripción derivada del promotor plasmídico. El
vector pOK12, un plásmido de número de copias bajo derivado de
pACYC184 (aproximadamente 10 copias/célula, Chang, A.C.Y. y Cohen,
S.N. J. Bact. 134: 1141-1156 (1978)) se
utilizó en un intento de soslayar los efectos tóxicos de un
fragmento de DNA extraño en E. coli por minimización del
número de copias del fragmento extraño tóxico. Adicionalmente, la
inserción del inserto de DNA cromosómico entero NotI del fago
HIIS en el plásmido pOK12 fue insatisfactoria. Se llegó a la
conclusión de que esta región del cromosoma de F. heparinum
imparte un efecto selectivo-negativo sobre
cualesquiera células de E. coli que lo alberguen. Este efecto
tóxico no había sido observado previamente con otros fragmentos de
DNA cromosómico de F. heparinum.
Una segunda estrategia empleada para soslayar el
problema inesperado de la toxicidad del DNA de F. heparinum
en E. coli consistió en digerir el fragmento de DNA
cromosómico con una endonucleasa de restricción que pudiera dividir
el fragmento, y a ser posible el gen de heparinasa II en dos piezas,
Figura 2. Estos fragmentos podían clonarse individualmente. El
análisis de la secuencia de DNA del inserto de PCR en el plásmido,
pCE14, demostró que los sitios BamHI y EcoRI estaban
presentes en el inserto. Experimentos de hibridación demostraron
también que el DNA de F. heparinum digerido con BamHI
en el fago HIIS producía dos bandas de 1,8 y 5,5 kb de tamaño. El
análisis de los datos de hibridación indicó que la banda de 1,8 kb
contiene el extremo 5' y la banda de 5,5 kb contiene el extremo 3'
del gen. Adicionalmente, un fragmento de DNA cromosómico de
EcoRI de F. heparinum de 5 kb se hibridaba con la
sonda PCR. Los fragmentos de 1,8, 5, y 5,5 kb que contenían
secuencias del gen de heparinasa II se insertaron en pBluescript,
como se ha descrito arriba. Se aislaron dos clones,
pBSIB6-7 y pBSIB6-21, que contenían
el inserto BamHI de 5,5 kb en orientaciones diferentes, y se
aisló un plásmido, pBSIB213, que contenía el fragmento BamHI
de 1,8 kb. No se aisló clon alguno que contuviera el fragmento
EcoRI de 5 kb, aun cuando se realizó un escrutinio extenso
de posibles clones.
El peso molecular de la proteína heparinasa II
es aproximadamente 84 kD, por lo que el tamaño del gen
correspondiente sería aproximadamente 2,4 kb. Los fragmentos de DNA
cromosómico BamHI de 1,8 y 5,5 kb podían incluir el gen de
heparinasa II entero. Los plásmidos pBSIB6-7,
pBSIB6-21 y pBSIB2-13, Figura 2, se
utilizaron para producir deleciones anidadas con el sistema
Erase-a-Base (Omega Biotec, Madison
Wis.). Estos plásmidos se utilizaron como moldes para análisis de
secuencia de DNA utilizando iniciadores universal e inverso e
iniciadores oligonucleotídicos derivados de la secuencia conocida
de heparinasa II. Dado que partes del gen eran relativamente ricas
en G-C y contenían numerosas estructuras
secundarias fuertes, el análisis de la secuencia se realizó a veces
utilizando reacciones en las cuales dGTP estaba reemplazado por
dITP. El análisis de la secuencia de DNA, Figura 4, indicaba que
existía un marco de lectura abierto continuo simple que contenía
codones para 772 residuos de aminoácidos, Figura 5. La
investigación de una secuencia peptídica de señal posible utilizando
Geneworks (Intelligenetics, Mountain View, CA), sugirió que existen
dos sitios posibles para procesamiento de la proteína en una forma
madura: Q-26 (glutamina), y D-30
(aspartato). La secuenciación de los aminoácidos
N-terminales de la heparinasa II desbloqueada y
procesada indicó que la proteína madura comienza con
Q-26, y contiene 747 aminoácidos con el peso
molecular calculado de 84.545 Daltons, Figura 5.
Se utilizó el vector pGB para expresión de
heparinasa II en E. coli, Figura 3. pGB contiene la región de
fijación de ribosoma modificada de pGhep, Figura 1, y un sitio
BamHI único, por lo cual la expresión de un fragmento de DNA
insertado en este sitio está dirigida por un promotor tac doble. El
vector incluye también un gen de resistencia a la kanamicina, y el
gen lac I^{q} para permitir la inducción de la
transcripción con IPTG. Inicialmente, un fragmento BamHI de
5,5 kb purificado en gel procedente de pBSIB6-21 se
ligó con pGB digerido con BamHI y se transformó en FTB1, que
se seleccionó en agar LB con kanamicina. Seis de las colonias
resultantes contenían plásmidos con insertos en la orientación
correcta para expresión del marco de lectura abierto. La digestión
con PstI y la religación de uno de los plásmidos, formando
pGBIID, delecionaba 3,5 kb del fragmento BamHI de 5,5 kb y
retiraba un sitio BamHI dejando solamente un sitio
BamHI inmediatamente después de la secuencia
Shine-Dalgarno. Finalmente, se diseñaron dos
oligonucleótidos sintéticos:
5'-TGAGGATTCATGCAAACCAAGGCCGATGTGGTTTGGAA-3'
(SEQ ID NO:15), y
5'-GGAGGATAACCACATTCGAGCATT-3' (SEQ
ID NO:16) para uso en una PCR a fin de producir un fragmento que
contuviera un sitio BamHI y un codón de iniciación ATG aguas
arriba de la secuencia codificante de la proteína madura y un sitio
BamHI aguas abajo, Figura 3. Se utilizó como DNA molde el
clon lambda HII-I, aislado al mismo tiempo que el
clon lambda HIIS.
La clonación del producto de la PCR de extremos
romos en pTZ/PC resultó insatisfactoria, utilizando FTB1 como el
hospedador. La clonación del producto PCR digerido con BamHI
en el sitio BamHI de pBluescript utilizando nuevamente FTP1
como hospedador, dio como resultado el aislamiento de dos plásmidos
que contenían el fragmento PCR, después de escrutinio de 150 clones
posibles. Uno de éstos, pBSQTK-9, que se secuenció
con iniciadores inverso y universal, contenía una reproducción
exacta de la secuencia de DNA del gen de heparinasa II. El
fragmento PCR digerido con BamHI de pBSQTK-9
se insertó en el sitio BamHI de pGBIID en tal orientación que
el sitio ATG se encontraba aguas abajo de la secuencia
Shine-Dalgarno. Esta construcción, pGBH2, ponía el
gen de heparinasa II maduro bajo control de los promotores tac en
pGB, Figura 3. La cepa de E. coli FTB1 (pGBH2) se dejó
crecer en medio LB que contenía 50 \mug/ml de kanamicina a 37ºC
durante 3 h. La introducción del promotor tac se realizó por
adición de 1 mmol de IPTG y el cultivo se dispuso a temperatura
ambiente o a 30ºC. Se midió la actividad degradante de heparina y
sulfato de heparano en los cultivos después de crecimiento durante 4
horas utilizando el método descrito por Yang et al., ibid.
Se observaron las actividades degradantes de heparina de 0,36 y
0,24 UI/mg de proteína y las actividades degradantes del sulfato de
heparano de 0,49 y 0,44 UI/mg de proteína a la temperatura ambiente
y 30ºC, respectivamente.
Ejemplo comparativo
1
La información de secuencia de aminoácidos
obtenida de los péptidos derivados de heparinasa III, Figura 9,
purificada como se describe en esta memoria, se tradujo inversamente
a oligonucleótidos fuertemente degenerados. Para ello, una
estrategia de clonación basada en la amplificación por la reacción
en cadena de la polimerasa de una sección del gen de heparinasa
III, utilizando oligonucleótidos sintetizados sobre la base de
información de secuencias de aminoácidos, requería la eliminación
de algunas de las posibilidades de secuencias de DNA. Se calculó
una utilización de codones supuesta basada en secuencias de DNA
conocidas para los genes de otras especies de
Flavobacterium. Las secuencias para 17 genes se analizaron y
se recopiló una tabla de uso de codones, Tabla 3.
Se diseñaron cuatro oligonucleótidos
seleccionando cada codón de acuerdo con la tabla de uso de codones.
Éstos fueron:
5'-GAATTCCATCAGTTTCAGCCGCATAAA-3'(SEQ
ID NO: 17), 5'-GAATTCTTTATGCGGCTGAAACT
GATG-3'(SEQ ID NO:18), 5'-GAATTCCCGCCGGGCGAATTTCATGC-3'(SEQ ID NO:19) Y 5'-GAATTCGCAT
GAAATTCGCCCGGCGG-3'(SEQ ID NO:20) y se designaron oligonucleótidos 3-1, 3-2, 3-3 y 3-4, respectivamente. Estos oligonucleótidos se utilizaron en todas las combinaciones posibles, en un intento de amplificar una porción del gen de heparinasa III utilizando la reacción en cadena de la polimerasa. Las amplificaciones PCR se llevaron a cabo como se ha descrito arriba. Los ciclos de: temperatura de desnaturalización 92ºC (1 minuto), temperaturas de reasociación comprendidas entre 37º y 55ºC (1 minuto) y temperatura de extensión 72ºC (2 minutos), se repitieron 35 veces. El análisis de las reacciones PCR como se ha descrito arriba demostró que no se producía fragmento alguno de DNA por estos experimentos.
GATG-3'(SEQ ID NO:18), 5'-GAATTCCCGCCGGGCGAATTTCATGC-3'(SEQ ID NO:19) Y 5'-GAATTCGCAT
GAAATTCGCCCGGCGG-3'(SEQ ID NO:20) y se designaron oligonucleótidos 3-1, 3-2, 3-3 y 3-4, respectivamente. Estos oligonucleótidos se utilizaron en todas las combinaciones posibles, en un intento de amplificar una porción del gen de heparinasa III utilizando la reacción en cadena de la polimerasa. Las amplificaciones PCR se llevaron a cabo como se ha descrito arriba. Los ciclos de: temperatura de desnaturalización 92ºC (1 minuto), temperaturas de reasociación comprendidas entre 37º y 55ºC (1 minuto) y temperatura de extensión 72ºC (2 minutos), se repitieron 35 veces. El análisis de las reacciones PCR como se ha descrito arriba demostró que no se producía fragmento alguno de DNA por estos experimentos.
Se sintetizó una segunda serie de
oligonucleótidos que estaba comprendida por secuencias de 32 bases,
en las cuales se utilizó la tabla de uso de codones para adivinar
la tercera posición de solo la mitad de los codones. Los
nucleótidos encerrados entre paréntesis indican degeneraciones de 2
ó 4 bases en un solo sitio.
Éstos fueron:
| 5'-GG(ACGT)GAATTTCCATGCCCAGCC(ACGT)GA(CT)AATGG(ACGT)AC-3' | (SEQ ID NO:21) | |
| 5'-GT(ACGT)CCATT(AG)TC(ACGT)GGCTGGGCATGAAATTC(ACGT)CC-3' | (SEQ ID NO:22) | |
| 5'-GT(ACGT)CATCAGTT(CT)CAGCC(ACGT)CATAAAGG(ACGT)TATGG-3' | (SEQ ID NO:23) y | |
| 5'-CCCATA(ACGT)CCTTTATG(ACGT)GGCTG(AG)AACTGATG(ACGT)AC-3' | (SEQ ID NO:24), |
y se designaron oligonucleótidos
3-5, 3-6, 3-7 y
3-8, respectivamente. Estos oligonucleótidos se
utilizaron en un intento de amplificar una porción del gen de
heparinasa III utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, y
la combinación de 3-6 y 3-7 dio
lugar a un producto PCR específico de 983 pb. Se realizó un intento
de clonar este fragmento por ligación de extremos romos en el vector
de E. coli, pBluescript, así como dos vectores diseñados
específicamente para la clonación de productos PCR, pTZ/PC y pCRII a
partir del kit TA Cloning™ (Invitrogen Corporation, San Diego,
CA). Todas estas construcciones se transformaron en la cepa FTB1 de
E. coli. Los transformantes se analizaron primeramente por
fragmentación de colonias, y posteriormente se realizaron
mini-preparaciones de DNA para análisis de
restricción enzimática. No se aisló clon alguno que contuviera este
fragmento
PCR.
Se sintetizó una tercera serie de
oligonucleótidos incorporando secuencias de endonucleasa
BamHI en los extremos de las secuencias de oligonucleótidos
3-6 y 3-7. Se obtuvo una secuencia
de DNA de 999 pares de bases utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa con DNA cromosómico de F. heparinum como diana. Se
realizaron intentos de clonar el DNA amplificado en el sitio
BamHI del plásmido de número de copias alto pBluescript y los
plásmidos de número de copias bajo pBR322 y pACYC184. Todas estas
construcciones se transformaron de nuevo en la cepa FTB1 de E.
coli. Se escrutaron más de 500 candidatos, pero no se obtuvo
transformante alguno que contuviera un plásmido que albergara el
DNA de F. heparinum. Una vez más, se llegó a la conclusión de
que esta región del cromosoma de F. heparinum imparte un
efecto de selectividad negativo en las células de E. coli que
la albergan.
Como en el caso del aislamiento del gen de
heparinasa II, el fragmento PCR se dividió a fin de evitar el
problema de la toxicidad del DNA extraño. La digestión del
fragmento PCR de heparinasa III de 981 pb digerido con
BamHI con la endonucleasa de restricción ClaI produjo
dos fragmentos de 394 y 587 pb. La región de F. heparinum
amplificada se trató con ClaI y los dos fragmentos se
separaron por electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de
587 y 394 pares de bases se ligaron por separado al plásmido
pBluescript que se había tratado con las endonucleasas de
restricción BamHI y ClaI. Adicionalmente, el fragmento
PCR entero de 981 pb se purificó y se ligó a pBluescript cortado
con BamHI. Los plásmidos ligados se insertaron en el E.
coli XL-1 Blue. Los transformantes que
contenían los plásmidos con insertos se seleccionaron sobre la base
de su capacidad para formar colonias blancas de placas en agar LB
que contenían X-Gal, IPTG y 50 \mug/ml de
ampicilina, como ha sido descrito por Maniatis. El plásmido pFB1
que contenía el fragmento de DNA de 587 pb de F. heparinum y
el plásmido pFB2 que contenía el fragmento entero de 981 pares de
bases se aislaron por este método. La cepa XL-1
Blue, que, al igual que la cepa FTB1, contiene el gen represor
lac I^{q} en un episoma F', permitía el mantenimiento
estable del fragmento PCR BamHI completo, al contrario que
FTB1. La razón para esta discrepancia no es evidente a partir de
los genotipos de las dos cepas (es decir, ambas son rec A,
etc.).
El análisis de la secuencia de DNA del DNA de
F. heparinum en el plásmido pFB1 demostró que el mismo
contenía una secuencia que codificaba el péptido
Hep3-B, mientras que el inserto de F.
heparinum en el plásmido pFB2 contenía una secuencia de DNA que
codificaba los péptidos Hep3-D y
Hep3-B, Figura 9. Este análisis confirmó que estos
insertos eran parte del gen codificante de heparinasa III.
El inserto del fragmento PCR en el plásmido pFB1
se marcó con ^{32}P-ATP utilizando un kit de
Marcación de DNA Cebado Aleatorio (Boehringer Mannheim, Laval,
Quebec), y se utilizó para escrutar la genoteca \lambdaDASHII de
F. heparinum, Figura 6, construida como se describe en esta
memoria. La genoteca lambda se extendió en placas para obtener
aproximadamente 1500 calvas, que se transfirieron a filtros de
nitrocelulosa (Schleicher & Schuel, Keene, NH). La sonda PCR se
purificó por precipitación con etanol. La hibridación de las calvas
se realizó utilizando las condiciones arriba descritas. Se
identificaron 8 calvas lambda positivas. El DNA lambda se aisló de
cultivos bacterianos lisados como se describe en Maniatis y se
analizó ulteriormente por análisis de restricción y por
transferencia Southern utilizando una membrana de nailon
Hybond-N (Amersham Corporation, Arlington Heights,
IL) siguiendo el protocolo descrito en Maniatis. Un fragmento
HindIII de 2,7 kilobases de la calva lambda #3, que se
hibridaba fuertemente a la sonda PCR, se aisló y se clonó en
pBluescript, en el fondo de E. coli XL-1
Blue, para producir el plásmido pHind-IIIBD, Figura 6. Este
clon se analizó ulteriormente por secuenciación del DNA. Los datos
de la secuencia se obtuvieron utilizando deleciones anidadas
sucesivas de pHindIIIBD generadas con el sistema
Erase-a-Base (Omega Corporation,
Madison, WI) o secuenciadas utilizando iniciadores
oligonucleotídicos sintéticos.
El análisis de la secuencia reveló un solo marco
de lectura abierto continuo, sin un codón de terminación de la
traducción, de 1929 pares de bases, correspondiente a 643
aminoácidos. El escrutinio ulterior de la genoteca lambda condujo a
la identificación de un fragmento KpnI de 673 pb que se clonó
análogamente al sitio KpnI de pBluescript, creando el
plásmido pFB4. El codón de terminación se encontró dentro del
fragmento KpnI añadiendo una cantidad adicional de 51 pares
de bases al gen de heparinasa III y 16 aminoácidos adicionales a la
proteína heparinasa III. Posteriormente se encontró que el gen
completo de heparinasa III estaba incluido dentro de fragmento
PstI de 3,2 kilobases de la calva lambda #118. El gen de
heparinasa III completo de Flavobacterium tiene por tanto
una longitud de 1980 pares de bases, Figura 8, y codifica una
proteína de 659 aminoácidos, Figura 9. La secuenciación de
aminoácidos N-terminales de la heparinasa III
desbloqueada y procesada indicó que la proteína madura comienza con
Q-25, y contiene 635 aminoácidos con un peso
molecular calculado de 73.135 Daltons, Figura 9.
Ejemplo comparativo
2
Se utilizó PCR para generar un gen de heparinasa
III maduro truncado, que tenía 16 aminoácidos delecionados del
término carboxi de la proteína. Se diseñó un oligonucleótido
constituido por 5'-CGCGGATCCATGCAAAAGCTCT
TCCATT-3' (SEQ ID NO:25) para insertar un sitio de comienzo ATG que precede inmediatamente al codón para el primer aminoácido (Q-25) de la heparinasa III madura, en tanto que se diseñaba un oligonucleótido constituido por 5'-CGCGGATCCTCAAAGCTTGCCTTTCTC-3' (SEQ ID NO:26), para insertar un codón de terminación después del último aminoácido del gen de heparinasa III en el fragmento HindIII de 2,7 kb. Ambos oligonucleótidos contenían también un sitio BamHI. Se utilizó el plásmido pHindIIIBD como el molde en una reacción PCR con una temperatura de reasociación de 50ºC. Se obtuvo un fragmento específico del tamaño esperado, 1857 pares de bases, Este fragmento codifica una proteína de 620 aminoácidos con un PM calculado de 71.535 Da. Se aisló el mismo y se insertó en el sitio BamHI del vector de expresión pGB. Esta construcción se designó pGB-H3\Delta3', Figura 7.
TCCATT-3' (SEQ ID NO:25) para insertar un sitio de comienzo ATG que precede inmediatamente al codón para el primer aminoácido (Q-25) de la heparinasa III madura, en tanto que se diseñaba un oligonucleótido constituido por 5'-CGCGGATCCTCAAAGCTTGCCTTTCTC-3' (SEQ ID NO:26), para insertar un codón de terminación después del último aminoácido del gen de heparinasa III en el fragmento HindIII de 2,7 kb. Ambos oligonucleótidos contenían también un sitio BamHI. Se utilizó el plásmido pHindIIIBD como el molde en una reacción PCR con una temperatura de reasociación de 50ºC. Se obtuvo un fragmento específico del tamaño esperado, 1857 pares de bases, Este fragmento codifica una proteína de 620 aminoácidos con un PM calculado de 71.535 Da. Se aisló el mismo y se insertó en el sitio BamHI del vector de expresión pGB. Esta construcción se designó pGB-H3\Delta3', Figura 7.
Para añadir la región 3' ausente de la
heparinasa III, se retiró el fragmento de restricción
BspEI/SalI de pGB-H3\Delta3' y se
reemplazó con el fragmento BspEI/SalI de pFB5. La
construcción que contenía el gen de heparinasa III completo se
designó pGBH3, Figura 7. La heparinasa III recombinante es una
proteína de 636 aminoácidos con un peso molecular calculado de
73.266 Daltons. La cepa de E. coli XL-1 blue
(pGBH3) se dejó crecer a 37ºC en medio LB que contenía 75 \mug/ml
de kanamicina hasta una DO_{600} de 0,5, en cuyo punto el
promotor tac de pGB se indujo por la adición de IPTG 1 mM. Los
cultivos se dejaron crecer durante 2-5 horas
adicionales a 23ºC, 30ºC o 37ºC. Las células se enfriaron en hielo,
se concentraron por centrifugación y se suspendieron de nuevo en
PBS fría a una décima del volumen original del cultivo. Las células
se lisaron por sonicación y los residuos celulares se eliminaron
por centrifugación a 10.000 x g durante 5 minutos. El sedimento y
las fracciones sobrenadantes se analizaron respecto a actividad de
degradación del sulfato de heparano (heparinasa III). Se observaron
actividades de degradación de sulfato de heparano de 1,29, 5,27 y
3,29 UI/ml a partir de cultivos que se habían dejado crecer a 23ºC,
30ºC y 37ºC, respectivamente.
La presente invención descripción describe una
metodología para obtener proteínas degradantes de heparina y
sulfato de heparano altamente purificadas por la expresión de los
genes para estas proteínas en un sistema de expresión adecuado y
aplicación de los pasos de disgregación celular, cromatografía de
intercambio de cationes, cromatografía de afinidad y cromatografía
con hidroxilapatito. Variaciones de estos métodos serán evidentes
para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada
que antecede de la invención. Tales modificaciones deben
considerarse comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE(S): IBEX TECHNOLOGIES y
\hskip4,3cmZIMMERMANN, Joseph
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias de ácido nucleico y sistemas de expresión para Heparinasa II y Heparinasa III derivadas de Flavobacterium heparinum
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 26
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Hale and Dorr
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1455 Pennsylvania Avenue, N.W.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Washington, D.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20004
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SISTEMA LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/07391
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-JUNIO-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/258.639
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 JUNIO 1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BAKER, Hollie L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.321
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 104385.116PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (202)942-8400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (202)942-8484
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2339 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 772 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1980 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 659 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Phe Pro Glu Met Tyr Asn Leu Ala Ala Gly
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Pro Ala Asp Ile Pro Glu Val Lys Asp Gly
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ala Gly Asp Phe Val Thr Gly Lys Ile Leu
Ala Gln Gly Phe Gly}
\sac{Pro Asp Asn Gln Thr Pro Asp Tyr Thr Tyr
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ile Lys Asn Glu Val Arg Trp Gln Leu His
Arg Val Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Lys Ala Ser Pro Pro Gly Glu Phe His
Ala Gln Pro Asp Asn}
\sac{Gly Thr Phe Glu Leu Phe Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ala Leu Val His Trp Phe Trp Pro His Lys
Gly Tyr Gly Tyr Phe}
\sac{Asp Tyr Gly Lys Asp Ile Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCCCTG AGATGTACAA TCTGGCCGC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGCAGCCA GATTGTACAT TTCAGG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAACCCGCCG ACATTCCCGA AGTAAAAGA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAAAGTCTT TTACTTCGGG AATGTCGGC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGGATTCA TGCAAACCAA GGCCGATGTG GTTTGGAA
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGGATAAC CACATTCGAG CATT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCCATC AGTTTCAGCC GCATAAA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCTTTA TGCGGCTGAA ACTGATG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCCCGC CGGGCGAATT TCATGC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCGCAT GAAATTCGCC CGGCGG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAATTTCC ATGCCCAGCC GAAATGGAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCCATTTCG GCTGGGCATG AAATTCCC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCATCAGTT CAGCCCATAA AGGTATGG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCATACCTT ATGGGCTGAA CTGATGAC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCA TGCAAAGCTC TTCCATT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCT CAAAGCTTGC CTTTCTC
\hfill27
Claims (4)
1. Heparinasa II no glicosilada aislada
que comprende la secuencia de aminoácidos de la heparinasa II
madura que tiene un residuo metionina que precede inmediatamente al
primer aminoácido de dicha heparinasa II madura, o derivados
funcionales no glicosilados de la misma que degradan sulfato de
heparano y heparina.
2. Una heparinasa II de la
reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO:2 que comienza con glutamina en la posición 26 y que incluye
una metionina que precede inmediatamente a dicha glutamina.
3. Un anticuerpo o fragmento del mismo
que es específico para heparinasa II como se define en la
reivindicación 1 o la reivindicación 2.
4. Una heparinasa II como se define en
la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para uso en terapia o
diagnosis.
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