ES2279960T3 - Procedimiento y automata de extraccion de acidos nucleicos a partir de una mezcla compleja. - Google Patents
Procedimiento y automata de extraccion de acidos nucleicos a partir de una mezcla compleja. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de extracción de los ácidos nucleicos de microorganismos contenidos en una mezcla compleja, especialmente alimentaria, o en agua, que comprende al menos las etapas siguientes: (12) la retención des microorganismos contenidos en la mezcla sobre un dispositivo de tipo cartucho (40) de filtración; (14) la lisis de los microorganismos in situ; y (16) la recuperación de los ácidos nucleicos a partir del cartucho (40) de filtración sobre un adaptador que contiene un filtro de aclaramiento, recuperándose dichos ácidos nucleicos en forma de un lisado filtrado.
Description
Procedimiento y autómata de extracción de ácidos
nucleicos a partir de una mezcla compleja.
La presente invención pertenece al campo del
análisis de muestras biológicas y, más particularmente, del análisis
del contenido bacteriano de mezclas complejas, especialmente de
muestras alimentarias.
La invención se refiere a un procedimiento de
extracción de los ácidos nucleicos de microorganismos contenidos en
una mezcla compleja. Un procedimiento de este tipo comprende al
menos las etapas siguientes:
(12) la retención de los microorganismos
contenidos en la mezcla sobre un dispositivo de tipo cartucho (40)
de filtración;
(14) la lisis de los microorganismos in
situ; y
(16) la recuperación de los ácidos nucleicos a
partir del cartucho (40) de filtración sobre un adaptador que
contiene un filtro de aclaramiento, recuperándose dichos ácidos
nucleicos en forma de un lisado filtrado.
La presente invención tiene además por objetos
un cartucho de filtración así como un autómata de extracción de los
ácidos nucleicos de microorganismos contenidos en una mezcla
compleja o en agua, siendo dichos cartucho y autómata útiles para
la puesta en práctica del procedimiento de extracción según la
invención.
La invención se refiere finalmente a un
dispositivo para la extracción y la detección y/o la cuantificación
de los ácidos nucleicos de microorganismos contenidos en una mezcla
compleja, comprendiendo dicho dispositivo un autómata de extracción
de ácidos nucleicos según la invención, acoplado a un autómata de
amplificación en cadena en función de la temperatura de dichos
ácidos nucleicos.
El comportamiento actual del público, que
representa a los consumidores potenciales, presenta síntomas de una
preocupación sobre la salud y seguridad generales, porque se exigen
cada vez más garantías sobre la inocuidad, la calidad y el origen
de los productos disponibles en el mercado. Por lo demás, este
fenómeno ha adquirido mucha importancia estos últimos años y sigue
creciendo. También conviene aportar respuestas sólidas al público
con el fin de satisfacer su necesidad de certezas y garantías.
A este respecto, los poderes públicos y otras
autoridades y organismos competentes en materia de salud pública y
vigilancia sanitaria imponen controles regulares con el fin de velar
por un respeto estricto de las normas de seguridad y calidad,
especialmente en el campo de la alimentación, por parte de los
productores, fabricantes, distribuidores y restauradores. La
calidad del control microbiológico es un punto crucial por el que
conviene velar durante toda la cadena entre el productor y el
consumidor.
El principio de tales controles se basa en
métodos de análisis basados en técnicas corrientes de química o
bioquímica analítica, entre las que la cromatografía, la resonancia
magnética nuclear y la espectrometría de masas, así como técnicas
de biología molecular, permiten, por ejemplo, detectar ácidos
nucleicos específicos de organismos especialmente patógenos
mediante PCR o hibridación con ayuda de sondas.
Estos controles pueden realizarse a gran escala,
especialmente a nivel de una explotación agrícola o de una
industria de producción. Además, a veces se ponen en práctica de
manera urgente. Dado el caso, cuando los productos sospechosos ya
están disponibles para su venta, conviene evaluar la inocuidad de
dichos productos en el menor plazo posible con el fin de ordenar,
en caso necesario, su retirada del mercado antes de una eventual
contaminación en masa.
En particular, los controles sanitarios se
practican en el marco de la evaluación del nivel de contaminación
de alimentos de riesgo, tales como carnes, pescados, productos
lácteos y alimentos susceptibles de haber experimentado
alteraciones resultantes de diversas variaciones sensibles de
temperatura durante el paso por las diferentes etapas de la
"cadena de frío", así como en materia de conservación y
vigilancia del medioambiente, tratándose por ejemplo del control
del nivel de contaminación de las fuentes y de las redes urbanas de
agua potable.
Según aplicaciones más médicas, la pureza de los
extractos de ácidos nucleicos procedentes de muestras biológicas de
pacientes o sujetos con riesgo es un criterio esencial para la
puesta en práctica de métodos de diagnóstico y especialmente, la
realización de pruebas de detección o predisposición con respecto a
enfermedades genéticas.
En cualquier caso, las tomas de muestras
realizadas in situ deben tratarse en los menores plazos al
tiempo que se garantiza una eficacia y seguridad óptimas.
Una de las primeras etapas del tratamiento de
las muestras biológicas puede consistir especialmente en manipular
in vitro los ácidos nucleicos con fines de análisis
cualitativo y/o cuantitativo y más precisamente, en aislar dichos
ácidos nucleicos de su entorno celular.
Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, son la diana de
interacciones múltiples, relacionadas con los procesos biológicos
en los que dichos ácidos nucleicos desempeñan un papel fundamental.
A título de ejemplo, éstos últimos interaccionan directamente con
las enzimas responsables de la expresión de los genes, así como con
los factores proteicos de la regulación de dicha expresión,
constituyendo ésta última un proceso biológico fundamental que
contribuye a la supervivencia, al desarrollo y a la renovación de
las células.
Tales complejos que asocian los ácidos nucleicos
de interés con proteínas y/u otros ácidos nucleicos complican
considerablemente el aislamiento y la purificación de los ácidos
nucleicos que se buscan solos.
Con el fin de superar esta dificultad, los
métodos convencionales de extracción de los ácidos nucleicos
sacrifican generalmente el tiempo de puesta en práctica en
beneficio del grado de pureza de los extractos obtenidos. En
principio, tales métodos comprenden al menos las tres etapas
siguientes: (i) la lisis de las envolturas celulares que permite
liberar los ácidos nucleicos en el medio; (ii) la desnaturalización
de los complejos de ácidos nucleicos-proteínas; y
(iii) la separación de los ácidos nucleicos de interés de las otras
macromoléculas (Sambrook y Russel. 2001. Molecular cloning: a
laboratory manual, 3ª ed. Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y.)
Estos métodos convencionales, aunque la mayoría
conservan el tramo representado por las tres etapas mencionadas
anteriormente, se han modificado empíricamente en función de los
diferentes objetivos que deben obtenerse. De este modo, su puesta
en práctica difiere sensiblemente dependiendo de si el fin
perseguido consiste en aislar (i) los ADN y/o los ARN, (ii) a
partir de células de microorganismos procariotas o eucariotas,
sabiendo que en el caso de los microorganismos procariotas,
conviene, según el caso, (iii) diferenciar los ADN de naturaleza
plasmídica o cromosómica.
En el tramo tratado anteriormente, figura una
etapa que consiste en extraer los ácidos nucleicos por medio de
disolventes orgánicos, tales como fenol, cloroformo, alcohol
isoamílico, o una mezcla de los mismos. Los ácidos nucleicos
buscados, contenidos en la fase acuosa, se recogen entonces tras la
separación de las fases orgánica y acuosa mediante
centrifugación.
La puesta en práctica de una etapa de este tipo
representa una limitación, si no la principal, de los procedimientos
de extracción de los ácidos nucleicos según la técnica anterior. De
hecho, la centrifugación necesaria para la separación de las fases
orgánica y acuosa constituye un obstáculo principal para la
automatización del método imponiendo por un lado, la intervención
necesaria del investigador y, por otro lado, costes elevados de
puesta en práctica debido a instalaciones costosas y
voluminosas.
En definitiva, la mayoría de los métodos
convencionales de lisis celular permiten extraer los ácidos
nucleicos, no en su forma nativa, sino en forma de fragmentos de
gran tamaño (50 kb). La purificación posterior de los extractos de
ácidos nucleicos con ayuda de disolventes orgánicos, tal como una
mezcla de fenol-cloroformo, puede conllevar un
cizallamiento de dichos ácidos nucleicos, generando entonces
fragmentos de tamaño heterogéneo e inferior a 50 kb.
Un "artefacto experimental" de este tipo es
susceptible de impedir o falsear la interpretación de los
resultados, en particular cuando el experto en la técnica
diferencia los productos procedentes de la extracción basándose
únicamente en su tamaño, por medio de técnicas de electroforesis
sobre geles, por ejemplo, enfrentándose entonces éste último a
fenómenos denominados de "borrosidad" ("smear") que hacen
aparecer los fragmentos de ácidos nucleicos no como bandas
perfectamente individualizadas, sino como manchas en las que se
agrupan varias bandas correspondientes a varios fragmentos de
ácidos nucleicos. Este "artefacto" puede conllevar igualmente
una reducción grave de la sensibilidad durante la detección de los
ácidos nucleicos así extraídos por métodos de hibridación,
especialmente sobre membranas.
Para remediar este inconveniente del estado de
la técnica, se ha descrito en la patente EP 0 245 945 un autómata
de extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de
células. Este autómata permite realizar la etapa de extracción por
medio de un disolvente orgánico a base de fenol y ello, liberándose
de las múltiples centrifugaciones necesarias hasta ahora. En
resumen, se genera una emulsión mediante la adición de disolvente al
lisado celular, calentándose dicha emulsión para conllevar la
separación de las fases. Se realiza una etapa de extracción final
con cloroformo.
A pesar de su posibilidad de automatización,
este método no resuelve el problema planteado por la técnica
anterior, y que está especialmente relacionado con el uso de
disolventes orgánicos. Aunque la extracción por medio de dichos
disolventes elimina eficazmente los contaminantes, es decir, los
detergentes utilizados en la etapa de lisis de las células así como
las proteínas, siguen siendo no obstante muy tóxicos. En
consecuencia, su manipulación necesita vigilancia y parsimonia, y
debe restringirse al nivel de puestos de seguridad equipados con
sistemas de ventilación
apropiados.
apropiados.
Con el fin de obviar los inconvenientes
mencionados anteriormente y presentados por los métodos de
extracción de los ácidos nucleicos del estado de la técnica, siendo
dichos métodos difícilmente conciliables con los imperativos de
seguridad, eficacia y rentabilidad de la industria o los
laboratorios de análisis modernos, se ha descrito un enfoque
alternativo en la solicitud internacional WO 93/01312.
Esta solicitud da a conocer un cartucho de
preparación ácidos nucleicos, especialmente de ADN genómico, a
partir de una muestra de sangre, de células de tejidos o de células
en cultivo, dicho de otro modo, de suspensiones de células
eucariotas relativamente homogéneas, en un fluido biológico o en un
medio de cultivo.
\newpage
La solicitud internacional WO 93/01312 describe
además un dispositivo y un procedimiento que utilizan dicho
cartucho.
Por tanto, el cartucho comprende especialmente
un recinto de diálisis delimitado por membranas de diálisis. Dado
el caso, el cartucho comprende además un filtro de retención de los
núcleos de las células.
La solicitud internacional WO 93/01312 propone
un procedimiento de preparación, es decir, de aislamiento y
purificación de los ácidos nucleicos a partir de una muestra que
contiene células eucariotas, mediante lisis de los núcleos,
degradación de las proteínas y purificación de dichos ácidos
nucleicos mediante diálisis.
Sin embargo, la tecnología relativa al cartucho
de extracción descrito en la solicitud internacional WO93/01312 no
está adaptada a una extracción de los ácidos nucleicos de
procariotas presentes, dado el caso, en mezclas complejas
heterogéneas, tales como muestras alimentarias en bruto, no
modificadas previamente mediante, por ejemplo, desecación, y cuyos
constituyentes son en parte sólidos y en parte líquidos.
Otros métodos de extracción de ácidos nucleicos
a partir de leucocitos, pero igualmente aplicables a otros tipos de
células tales como bacterias, se indican en las solicitudes de
patente WO00/21973 y WO 02/16383. Por tanto, estas dos solicitudes
dan a conocer un método de extracción que comprende las etapas
siguientes:
(a) depositar una muestra sobre un filtro que
permite retener las células contenidas en esta muestra (parte
retenida), y la eliminación de las contaminaciones,
(b) lisar la parte retenida in situ y
formar un lisado celular,
(c) filtrar el lisado celular y retener los
ácidos nucleicos sobre el filtro y eliminar el resto del lisado
celular,
(d) eventualmente, lavar los ácidos nucleicos
contenidos en el filtro, y
(e) eluir los ácidos nucleicos,
en el que la composición y dimensiones del
filtro se eligen de manera que el filtro pueda retener las células
y los ácidos nucleicos.
Además, la solicitud WO 94/21780 describe un
método para enumerar los microorganismos presentes en una muestra
mediante fijación de esos microorganismos sobre un filtro y su lisis
in situ. En un modo de realización particular, tras la lisis
de los microorganismos, se detectan los mismos mediante
amplificación por PCR directamente sobre el filtro.
Finalmente, otra solicitud de patente, el
documento WO99/14309, propone la detección de diferentes
microorganismos tras su filtración sobre un filtro de nitrocelulosa
que presenta poros de 0,45 \mum.
En este caso, la invención pretende proponer un
procedimiento de extracción de ácidos nucleicos de procariotas
automatizable y adaptado al tratamiento de un medio de partida
complejo.
Por tanto, el procedimiento según la invención,
totalmente automatizable, responde así a una cuestión de
racionalización y economía porque: (i) puede aplicarse directamente
a la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras en bruto,
incluso si éstas son complejas y heterogéneas en cuanto a la
composición y la estructura; (ii) permite una extracción rápida,
que puede realizarse en menos de 3 horas; (iii) proporciona
resultados reproducibles; (iv) permite tratar simultáneamente hasta
seis muestras diferentes, garantizando al mismo tiempo su
trazabilidad en cada etapa; (v) puede ponerse en práctica por
personal no cualificado; (vi) no requiere ni intervención ni
vigilancia por parte del investigador, salvo eventualmente de manera
puntual, dicho investigador se encuentra por tanto disponible para
realizar, en paralelo a las extracciones en curso, otras operaciones
o trabajos; y (vii) puede ponerse en práctica rutinariamente a
escala de laboratorio de análisis o de industria, sin necesidad de
grandes inversiones en cuanto al equipo.
Por tanto, la invención se refiere a un
procedimiento de extracción de ácidos nucleicos de microorganismos
contenidos en una mezcla compleja, especialmente alimentaria,
comprendiendo dicho procedimiento al menos las etapas
siguientes:
(12) la retención de los microorganismos
contenidos en la mezcla sobre un dispositivo de tipo cartucho 40 de
filtración (véase la figura 3)
(14) la lisis de los microorganismos in
situ
(16) la recuperación de los ácidos nucleicos a
partir del cartucho 40 de filtración (figura 1).
Según la naturaleza de la muestra a analizar
(triturado alimentario sólido/líquido o agua, por ejemplo, agua de
consumo), se requiere una primera etapa:
(10) el aclaramiento de dicha mezcla mediante
filtración sobre un dispositivo de tipo cartucho de prefiltración
(figura 1, vía A), realizándose entonces la etapa (12) sobre el
filtrado.
En el caso en el que los ácidos nucleicos se
extraigan en vista de una cuantificación, se requiere una etapa
suplementaria:
(18) la concentración y la purificación de los
ácidos nucleicos mediante cromatografía de adsorción
líquido-sólido (figura 1, vía B).
Se hace referencia, a nivel de las etapas 12, 14
y 16, a un "dispositivo 40 de tipo cartucho de filtración"
(figura 3). Se entiende por tal denominación, así como por los
términos y expresiones equivalentes "cartucho", "cartucho de
extracción" y "cartucho de filtración", un sistema que
comprende un filtro 42 de retención fijado entre dos rejillas o
pegado a una única rejilla, manteniéndose la(s)
rejilla(s) por cualquier medio, por ejemplo por dos anillas
pegadas, enroscadas o sujetas con clips, o empotrándose en una
anilla.
Este cartucho puede someterse a tratamientos de
lisis (figura 4). En ese caso, la pieza de plástico sobre la que se
coloca el cartucho de filtración se desenrosca del puesto de
filtración y el cartucho se cierra de manera estanca sobre su cara
inferior (es decir, la cara que no está en contacto con las
bacterias) mediante una cubierta. La cara superior del cartucho de
filtración se cierra de manera estanca mediante un dispositivo que
comprende un embudo, un adaptador, un filtro de aclaramiento del
lisado y un tubo de 15 ml con fondo cónico. El adaptador se enrosca
sobre el embudo. Contiene el filtro de aclaramiento del lisado,
previamente encajado en el adaptador. En la extremidad libre del
adaptador, se enrosca un tubo colector de 15 ml de fondo cónico,
tal como se representa en la figura 4.
Dicho sistema presenta especificidades
originales debido a las características de los filtros que lo
componen. De hecho, tal como se muestra en la descripción detallada
de la invención a continuación, la selección de los filtros es un
elemento esencial de obtención del resultado con el que se cuenta.
Una descripción del cartucho 40 de filtración objeto de la presente
invención se proporciona a continuación.
En el sentido de la presente invención, la
"extracción" de los ácidos nucleicos comprende a la vez el
aislamiento de dichos ácidos nucleicos de su entorno biológico
natural, su purificación y su concentración. El grado de pureza y
la concentración de los ácidos nucleicos extraídos con ayuda del
procedimiento según la invención son tales que dichos ácidos
nucleicos pueden ser objeto de una detección por métodos tan
sensibles como la PCR y ello directamente y sin necesidad de
someterse a ningún tratamiento suplementario de eliminación de
contaminantes residuales susceptibles de inhibir o alterar la
especificidad y la sensibilidad de dichos métodos, y especialmente
de las reacciones de PCR.
Los "ácidos nucleicos" comprenden, según la
acepción habitual, los ADN y los ARN. Resulta evidente que dicho
procedimiento puede utilizarse tanto en el marco de la extracción
sólo de los ADN, por medio de la adición de ARNasas en una etapa
que el experto en la técnica habrá seleccionado sin dificultad, como
sólo de los ARN, gracias a la adición de ADNasas y
anti-ARNasas, así como de ADN y ARN.
Por "ácidos nucleicos de interés",
"buscados", "deseados", o cualquier otro calificativo
equivalente, el experto en la técnica identificará fácilmente los
ácidos nucleicos diana del procedimiento de extracción según la
invención, constituyendo dichos ácidos nucleicos en sí mismos el
material de partida del procedimiento de análisis cualitativo y/o
cuantitativo posterior.
En el presente documento, se entiende por
"microorganismo", cualquier microorganismo procariota,
abarcando esta definición tanto las bacterias gram positivas y
negativas como las desprovistas de pared, así como las formas
esporuladas de las bacterias.
Por "mezcla compleja", se hace referencia
en el sentido de la presente invención a cualquier composición que
contiene células de microorganismos procariotas, pudiendo ser dicha
composición de naturaleza heterogénea, siendo una ilustración una
muestra alimentaria en bruto caracterizada porque comprende un
número más o menos grande de elementos diferentes, en la que
algunos están en estado líquido y otros en sólido, o de naturaleza
más homogénea, que corresponde entonces, por ejemplo, a un cultivo
bacteriano más o menos puro.
El procedimiento de extracción según la
invención emplea técnicas de separación con membranas o de
filtración, que utilizan membranas porosas denominadas
permselectivas haciendo referencia a sus propiedades selectivas y
cuyo funcionamiento es asimilable al de una barrera con efecto
tamiz: se retienen las moléculas o partículas cuyo tamaño
aproximado es superior a un umbral dado, que corresponde al tamaño
medio de los poros de la membrana, mientras que las de tamaño
inferior a dicho umbral pasan a través de la "barrera", bajo la
acción de un flujo de disolvente generado por la aplicación de un
gradiente de presión.
A este respecto, el paso a través del tamiz
constituido por la membrana porosa permite separar dos líquidos, el
permeado o filtrado que pasa a través de los poros de dicha
membrana, y el retenido que se enriquece con respecto al líquido
inicial en especies de diámetro medio superior al de los poros.
Entre las técnicas de filtración, debe
distinguirse especialmente la ultrafiltración y la
microfiltración.
La ultrafiltración utiliza membranas
microporosas cuyo diámetro de poros está generalmente comprendido
entre 1 y 100 nm. Tales membranas dejan pasar las pequeñas
moléculas (agua, sales) y retienen las moléculas de masa molar
elevada (polímeros, proteínas, coloides). A pesar del intervalo con
respecto al diámetro de los poros indicado anteriormente, es
habitual utilizar, para caracterizar la membrana en el campo de la
ultrafiltración, la noción de umbral de corte más bien que la de
tamaño de los poros. De hecho, el umbral de corte se define como la
masa, expresada en daltones, de la molécula retenida al 90 incluso
el 95% por la membrana en cuestión.
En cuanto a la microfiltración, consiste en un
procedimiento de separación sólido-líquido que pone
en práctica membranas cuyo diámetro medio de poros está comprendido
entre 0,1 y 10 \mum aproximadamente. Este procedimiento permite
por tanto retener las partículas en suspensión.
Los procedimientos de filtración pueden ponerse
en práctica según diferentes modos y configuraciones, teniendo el
tipo de corriente y la geometría del dispositivo que alberga la
membrana un efecto determinante sobre el rendimiento de la
separación. A continuación en el presente documento se facilitan a
título indicativo ejemplos de modos y configuraciones posibles.
En filtración frontal, el líquido que contiene
las especies que van a separarse se lleva perpendicularmente a la
membrana mientras que en modo tangencial, la membrana porosa se
barre tangencialmente por dicho líquido.
La configuración plana facilita las operaciones
de montaje/desmontaje y puede utilizarse con fluidos viscosos. No
obstante, debe considerarse el riesgo de aparición de fenómenos
limitantes tales como los definidos a continuación, en particular
la colmatación, durante la puesta en práctica del procedimiento de
filtración en configuración plana.
La configuración en espiral consiste en una
membrana plana enrollada sobre sí misma. Entonces se recoge el
filtrado a nivel de la luz central. Esta configuración es ventajosa
desde el punto de vista de su compacidad, pero complica la limpieza
de la membrana y hace imposible el desmontaje del sistema de
filtración. Además, genera fenómenos de colmatación no
despreciables.
Según la configuración tubular, la membrana
tapiza el interior de una matriz cilíndrica de acero poroso o de
fibra de vidrio. La alimentación de disolución que va a filtrarse se
realiza por el interior de la matriz, atravesando a continuación
dicha disolución la membrana bajo el efecto de la presión y entonces
se recupera el filtrado en el exterior de la matriz. Este sistema
presenta la ventaja de una limpieza fácil mediante simple inversión
del flujo de filtración pero exige volúmenes de instalaciones
importantes.
La elección de las condiciones de funcionamiento
del procedimiento de filtración viene impuesta generalmente por la
preocupación de reducir los fenómenos limitantes, entre ellos la
obstrucción de la membrana, o colmatación, y la polarización de la
concentración.
La colmatación consiste en fenómenos físicos,
químicos y biológicos que se producen en la interfase
membrana-disolución. Se caracteriza por una
modificación de las propiedades filtrantes de la membrana durante su
utilización debida especialmente a fenómenos de deposición y/o de
adsorción que provocan una acumulación de materia en los poros,
luego en la superficie de dicha membrana. La colmatación tiene como
consecuencia inmediata la obstrucción de los poros, lo que conlleva
variaciones a la vez de permeabilidad y de selectividad cuyo impacto
sobre la eficacia de la separación resulta atenuante y a veces
drástico.
Al tener las membranas utilizadas la propiedad
de realizar separaciones a escala molecular o de partículas, la
acumulación de especies (moléculas o partículas), progresivamente
ralentizadas y después detenidas en la superficie de dichas
membranas es un fenómeno ineludible, inherente a los procedimientos
de filtración. Dicho fenómeno, denominado polarización de la
concentración, genera un flujo de difusión de la membrana hacia el
centro de la disolución que va a tratarse, es decir, en dirección
opuesta a la del flujo filtración que el investigador desea imponer
a dicha disolución. En consecuencia, la polarización de la
concentración induce una disminución del flujo de filtración, una
variación de la selectividad, desempeñando eventualmente la
deposición relacionada con la acumulación el papel de "segunda
membrana", y una colmatación de los poros de la membrana debido
a precipitaciones o gelificaciones superficiales, formando las
especies acumuladas redes de aspecto casi sólido.
En el transcurso de la etapa 10 del
procedimiento de extracción según la invención, (que no es
indispensable cuando el material que debe analizarse es agua), el
material de partida, es decir, la mezcla compleja, se filtra con el
fin de retener las partículas cuyo diámetro medio de los poros es
superior a aproximadamente 5 \mum, y preferiblemente superior a
aproximadamente 8 \mum.
Se entiende por "membrana" o "filtro",
en el sentido de la presente invención, cualquier dispositivo según
la definición de "membrana permselectiva" tal como se enunció
anteriormente.
El procedimiento de filtración puesto en
práctica en la etapa 10 es de tipo microfiltración frontal,
realizándose dicha microfiltración en modo plano, a vacío.
Los parámetros de puesta en práctica de esta
etapa de microfiltración se han dictado por el doble objetivo que
debe lograrse, es decir, por una parte distinguir por el tamaño los
restos contenidos en la mezcla compleja y que comprenden
eventualmente células eucariotas, que conviene eliminar, y células
procariotas, para las que el nivel de pérdida tolerado debe ser
mínimo, y por otra parte evitar cualquier fenómeno limitante tal
como la colmatación y la polarización de la concentración.
Con este fin, la etapa 10 se realiza con ayuda
de un filtro constituido por un material adaptado al tratamiento de
los líquidos viscosos con grandes cargas de partículas, tales como
policarbonato y nitrato de celulosa, siendo dicho filtro de un
único uso con el fin de evitar cualquier riesgo de contaminación
entre las diferentes muestras susceptibles de tratarse
simultáneamente. El diámetro medio de los poros de dicho filtro está
comprendido entre 1,2 y 12 \mum, y es de manera preferida
sensiblemente igual a 5 \mum.
La etapa 12 del procedimiento de extracción
objeto de la presente invención consiste en una microfiltración
realizada en modo plano, tangencial, a vacío.
El filtro 42 de retención utilizado en esta
etapa, incorporado en el cartucho 40 de filtración, se ha
seleccionado con el fin de separar selectivamente las especies
contenidas en el filtrado procedente de la etapa 10 y de enriquecer
en microorganismos, al tiempo que se dejan pasar tantos restos y
especies indeseables como sea posible.
Los criterios que dirigen la elección del
filtro, es decir, un porcentaje de pérdida de microorganismos en el
filtrado mínimo y una ausencia de fenómenos susceptibles de limitar
la eficacia de la filtración, han conducido a los inventores a
seleccionar un filtro de policarbonato o de nitrato de celulosa para
la uniformidad de estructura de sus poros así como su alto poder de
adsorción no específica. El filtro 42 así elegido presenta un
diámetro medio de poros situado entre 0,22 y 0,55 \mum, con un
valor preferido del orden de 0,45 \mum.
La etapa 14 del procedimiento de extracción
según la invención es con respecto a la lisis química y/o mecánica
de los microorganismos contenidos en el retenido procedente de la
etapa 12 de dicho procedimiento. Tal como se indicó anteriormente,
esta etapa se realiza in situ, es decir, a nivel incluso del
cartucho 40 de filtración.
El objetivo buscado por los inventores es poner
a punto un procedimiento de lisis a la vez: (i) eficaz; (ii)
adaptado a la biodiversidad de las mezclas complejas de partida, que
comprenden eventualmente bacterias gram positivas y esporas cuya
lisis es, si nos limitamos a los modos clásicos, larga y difícil; y
finalmente (iii) adaptable a la automatización del procedimiento
global.
Por lisis química, se entiende la acción sobre
las células procariotas de un detergente, estando contenido dicho
detergente por ejemplo en un tampón de lisis que comprende
especialmente:
- Tris-HCl (pH entre 7 y 9,
preferiblemente igual a aproximadamente 8; y concentración de entre
aproximadamente 25 y 400 mM, preferiblemente igual a
aproximadamente 100 mM);
- dado el caso, el conjunto de los tres
componentes siguientes:
- -
- EDTA (pH entre aproximadamente 7 y 9 preferiblemente igual a aproximadamente 8; y concentración de entre aproximadamente 10 y 100 mM, preferiblemente igual a aproximadamente 40 mM);
- -
- NaCl (de 50 a 800 mM, de manera preferida aproximadamente 200 mM);
- -
- SDS (entre el 0,5 y el 8% aproximadamente, de manera preferida aproximadamente el 2%),
Formando la mezcla de los cuatro componentes
anteriores un tampón denominado TENS (Kuske et al. 1998.
Appl. Environ. Microbiol. 64: 2463-2472); y
- Chelex-100 (entre el 3 y el
60% aproximadamente, de manera preferida aproximadamente el
15%).
El tratamiento mecánico consiste en la
ultrasonicación de las células procariotas fijadas sobre el filtro
de retención, realizándose dicha ultrasonicación en las mismas
condiciones de tampón que la lisis química, en un cilindro de
lavado de ultrasonidos y a temperaturas comprendidas entre 60 y
100ºC, y preferiblemente próximas a 70ºC. Alternativamente, este
tratamiento mecánico puede realizarse a temperatura ambiente y en
seco, es decir, mediante fijación directa del recipiente que
contiene la disolución que va a someterse a lisis sobre el
generador de ultrasonidos sin intermediario de un baño, colocándose
cada cartucho de lisis directamente sobre un sonotrodo
independiente.
El tratamiento químico, realizado alternativa o
posteriormente a la lisis mecánica, se administra en caliente.
Cubriendo la expresión "en caliente", en el sentido de la
presente invención, temperaturas comprendidas entre 80 y 120ºC, y
preferiblemente próximas a 100ºC.
Según un modo de realización preferido de la
presente invención, la etapa 14 del procedimiento de extracción
comprende un tratamiento mecánico a temperatura ambiente y en seco,
seguido de un tratamiento químico, siendo dichos tratamientos tal
como se describieron anteriormente.
\newpage
Eventualmente pueden añadirse agentes
caotrópicos sumamente desnaturalizantes al tampón de lisis, con el
fin de inhibir las actividades ADNasas y ARNasas susceptibles de
reducir el rendimiento de extracción de los ácidos nucleicos. Los
agentes caotrópicos propios a un uso en el marco del procedimiento
según la invención comprenden, sin limitarse a, tiocianato de
guanidio, cloruro de guanidio, urea, ácido perclórico, ácido
tricloroacético, tiocianato de sodio, yoduro de sodio,
isotiocianato de guanidio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio
(CTAB).
Según un modo de puesta en práctica del
procedimiento de extracción objeto de la presente invención (figura
1, vía A), en el transcurso de la etapa 16, se recupera la
disolución que contiene los ácidos nucleicos de interés mediante
aspiración a partir del cartucho 40. Ventajosamente, se realiza al
menos un lavado de dicho cartucho 40 con tampón TE 1X, ello con el
fin de minimizar las pérdidas de ácidos nucleicos.
A continuación, la etapa 18 tiene por objetivo
concentrar y purificar los ácidos nucleicos sobre una columna de
sílice. Aquí se recurre a la cromatografía de adsorción
líquido-sólido, modo de separación basado en la
repartición de los solutos entre el adsorbente fijado y la fase
líquida móvil. En este caso, la sílice es un adsorbente dipolar. La
fijación mediante adsorción se debe al establecimiento de uniones
secundarias de superficie, o uniones dipolo-ión,
entre el adsorbente y la molécula adsorbida.
La etapa 18 se descompone entonces en al menos
cuatro subetapas:
181) la dilución del extracto de ácidos
nucleicos, especialmente en presencia de etanol absoluto, ello con
el fin de optimizar la unión de dichos ácidos nucleicos a la
sílice;
182) la deposición de la mezcla sobre una
columna de sílice;
183) uno o varios lavados de dicha columna,
seguido de su secado; y
184) la elución de los ácidos nucleicos
retenidos sobre la columna de sílice.
Durante la subetapa 182, los ácidos nucleicos se
adsorben sobre la sílice en presencia de fuertes concentraciones de
sales caotrópicas, que eliminan agua de las moléculas hidratadas del
soluto.
Los polisacáridos, así como las proteínas, no se
adsorben y se eliminan en el transcurso de la subetapa 183.
En el marco de la subetapa 184, la elución de
los ácidos nucleicos purificados se realiza en condiciones de poca
salinidad.
De manera preferida, las subetapas 181 a 184 se
realizan a vacío con el fin de evitar cualquier recurso a
eventuales centrifugaciones, especialmente para eluir el tampón de
lavado así como la disolución de ácidos nucleicos.
Según un modo de realización preferido, el
procedimiento de extracción objeto de la presente invención
comprende etapas preliminares adicionales, que tienen por objetivo
facilitar las manipulaciones posteriores de la mezcla compleja
representada, por ejemplo, por una muestra alimentaria tal como un
producto cárnico de tipo carne picada, o un producto lácteo de tipo
queso.
Dichas etapas preliminares consisten en:
26) triturar la muestra compleja, especialmente
alimentaria; y
28) tratar previamente de manera enzimática y
química el triturado así obtenido.
La invención se refiere igualmente a un cartucho
40 de filtración útil para la puesta en práctica de las etapas 12 y
14 (figura 1, vía A) del procedimiento de extracción de los ácidos
nucleicos de microorganismos.
Cuando la etapa de concentración y purificación
se realiza mediante cromatografía (etapa 18), el cartucho 40
comprende un filtro 42 de retención de policarbonato, cuyo diámetro
medio de los poros es preferiblemente de 0,45 \mum, insertado
entre dos soportes de filtración (rejillas), manteniéndose el
conjunto por dos anillas de polímero, tal como se representa sobre
la figura 3. Este cartucho puede cerrarse de manera estanca con el
fin de someterse a los tratamientos de lisis (figura 4) o,
alternativamente, se empotra el filtro de retención en una anilla
de polímero inyectado. En este caso, la pieza sobre la que se coloca
el cartucho de filtración se desenrosca del puesto de filtración, y
se cierra el cartucho de manera estanca sobre la cara inferior (es
decir, la cara que no está en contacto con las bacterias) por una
cubierta. La cara superior del cartucho de filtración se cierra de
manera estanca por un dispositivo que comprende un embudo, un
adaptador, un filtro de aclaramiento del lisado y un tubo de 15 ml
de fondo cónico. El adaptador se enrosca sobre el embudo. Contiene
el filtro de aclaramiento del lisado, previamente incrustado en el
adaptador. En la extremidad
libre del adaptador, se enrosca un tubo colector de 15 ml de fondo cónico, tal como se representa en la figura 4.
libre del adaptador, se enrosca un tubo colector de 15 ml de fondo cónico, tal como se representa en la figura 4.
La invención tiene además por objeto un autómata
de extracción de los ácidos nucleicos de microorganismos contenidos
en una mezcla compleja, especialmente alimentaria, o en agua, siendo
dicho autómata útil para la puesta en práctica del procedimiento de
extracción según la invención.
Por "autómata", se designa un dispositivo o
aparato que puede poner en práctica un procedimiento, encadenar las
etapas esenciales de manera autónoma, sin requerir asistencia,
intervención o vigilancia por parte de un operario, salvo
eventualmente a nivel de etapas puntuales y no esenciales, por
ejemplo, cuando se trata de garantizar la conexión entre dos etapas
esenciales.
La invención prevé igualmente un dispositivo
para la extracción y detección y, dado el caso, la cuantificación
de los ácidos nucleicos de microorganismos contenidos en una mezcla
compleja, especialmente alimentaria, comprendiendo dicho
dispositivo un autómata de extracción de ácidos nucleicos según la
presente invención, acoplado a un autómata de amplificación en
cadena dependiente de la temperatura de dichos ácidos nucleicos.
En un modo de realización preferido, el autómata
de amplificación en cadena dependiente de la temperatura
incorporado en el dispositivo según la invención es de tipo
rotativo.
Un autómata de amplificación en cadena
dependiente de la temperatura de secuencias de ácidos nucleicos
utilizable en el marco del dispositivo según la presente invención
se ha descrito en la patente US 6.821.771 presentada el 23 de
noviembre de 2004 que se beneficia de la prioridad de la patente
francesa FR 2812306 presentada el 14 de enero de 2005. Un ejemplo
de un dispositivo de este tipo comprende especialmente: (i) un
cartucho que comprende una pluralidad de cámaras de reacción, que
contienen pares de cebadores para la amplificación de las
secuencias nucleotídicas específicas, a las que se encuentra unido
un depósito de alimentación de extracto de ácidos nucleicos
purificados que sirven como matrices durante dicha amplificación;
(ii) un platillo de calentamiento en el que al menos dos zonas
distintas pueden llevarse a al menos dos temperaturas diferentes y
mantenerse constantes, correspondiendo cada temperatura así a una
etapa de un ciclo de amplificación, es decir, la etapa de
desnaturalización, de hibridación o de elongación; (iii) medios de
desplazamiento relativo entre el cartucho y el platillo,
garantizando dicho desplazamiento una exposición cíclica de las
cámaras de reacción a la temperatura de cada una de las zonas del
platillo, lo que permite encadenar automáticamente los ciclos de la
reacción de amplificación que se desarrolla en el interior de dichas
cámaras.
La presente invención se ilustra, sin por ello
limitarse, por las figuras siguientes:
Figura 1: esquema del procedimiento de
extracción de los ácidos nucleicos.
Figura 2: esquema del autómata de extracción de
ácidos nucleicos. En ella se representan los tres puestos, es
decir, el puesto 80 que realiza las etapas 10 (opcional), 12, 16 y
18 del procedimiento de extracción, los puestos 82 y 84 que
realizan la etapa 14.
Figura 3: esquema de un cartucho de
filtración.
Figura 4: esquema del montaje para realizar la
etapa 14 del procedimiento de extracción.
Figura 5: esquema del montaje para realizar la
etapa 16 del procedimiento de extracción.
El procedimiento de extracción de ácidos
nucleicos objeto de la invención se ha sometido a prueba sobre dos
mezclas alimentarias complejas, es decir, un producto cárnico de
tipo carne picada y un queso de pasta blanda comercializado con la
marca Babybel®, así como sobre una muestra de agua de consumo. Las
dos mezclas alimentarias complejas ilustran la vía A de la figura 1
de la presente invención mientras que la muestra de agua de consumo
ilustra la vía B de la figura 1 de la presente invención.
Se inocularon las dos mezclas complejas con
cantidades conocidas de dos microorganismos diferentes (Listeria
monocytogenes y Salmonella ser. Enteritidis),
seleccionándose dichos microorganismos con el fin de verificar la
eficacia de extracción por el procedimiento según la invención de
los ácidos nucleicos de bacterias gram positivas y gram negativas.
Se inoculó la muestra de agua de consumo con cantidades conocidas de
una cepa de Legionnella pneumophila de serogrupo 1.
Según las normas editadas y difundidas por la
Association Française de Normalisation (AFNOR) (Asociación Francesa
de Normalización) y la Fédération Internationale de laiterie (FIL)
(Federación Internacional de Lechería) actualmente en vigor, se
trituró la muestra alimentaria con ayuda de un homogeneizador
Stomacher con el fin de preparar una suspensión madre.
Se suspendió la muestra alimentaria para ensayo,
de 25 g, a 1/10 en un diluyente, según las normas NF V
08-010 (marzo de 1996, Ediciones AFNOR, París,
Francia), NF V 04-501 (abril de 1998, Ediciones
AFNOR) y FIL 122C: 1996 (diciembre de 1996, Ediciones FIL,
Bruselas, Bélgica). Según dichas normas, la composición del
diluyente es función del tipo de alimento considerado. En la
muestra actual, se suspendieron la carne picada y el queso
respectivamente en agua de peptona tamponada y citrato de sodio a 20
g/l.
Se trituraron las suspensiones así obtenidas
durante 3 minutos.
Se tomaron alícuotas de 10 ml de triturado,
correspondientes a 1 g de alimento de partida, con el fin de la
extracción de los ácidos nucleicos.
Las matrices alimentarias pueden tratarse
igualmente tras un enriquecimiento en microorganismos diana en
medios de cultivo definidos, en función del microorganismo buscado,
por las normas AFNOR en vigor. En ese caso, el tratamiento
enzimático previo se aplica directamente sobre 10 ml de medio
enriquecido.
Esta etapa permite hidrolizar los glóbulos de
materia grasa y las micelas proteicas, con el fin de liberarse de
fenómenos tales como la colmatación susceptibles de disminuir el
rendimiento de las etapas posteriores de filtración.
Se determinaron las composiciones de las
disoluciones de tratamiento previo de manera empírica, mediante un
estudio bibliográfico (Driehuis y Teernstra 1992. Neth. Milk Dairy
J. 46: 209-215; Starbuck et al. 1992. Lett.
Appl. Microbiol. 15: 248-252; Yang y Lundahl 1994.
Anal. Biochem. 218: 210-221; Rijpens et al.
1996. Appl. Environ. Microbiol. 62: 1683-1688).
Los adyuvantes añadidos a cada alícuota de 10 ml
estaban compuestos por 0,2 g de tripsina para el triturado de carne
picada, y 0,2 g de pancreatina, 10 mM de EDTA, un 5% de Triton y un
4% de ácido cólico para el triturado de queso.
Se incubaron las muestras a 25ºC durante 1 hora
para el triturado de carne picada y a 30ºC durante 1 hora y 30
min., para el triturado de queso. Esta etapa de incubación no
permite ni un crecimiento bacteriano significativo, ni una lisis
"prematura" de las células procariotas, dos fenómenos
susceptibles de perjudicar el rendimiento del procedimiento.
En atención a los imperativos referentes a
evitar la colmatación, se seleccionaron filtros de nitrato de
celulosa cuyo diámetro medio de los poros es de 8 \mum.
La microfiltración se realizó en modo plano, a
vacío.
Se filtraron cada 10 ml de triturado alimentario
tratado previamente. Según si se trataba de carne picada o de
queso, se lavó el dispositivo de microfiltración con 40 ml de tampón
TE 1X (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 y EDTA 1 mM pH 8,0) o
10 ml de Triton al 0,5% (diluido en agua destilada estéril)
precalentado a 50ºC, respectivamente. Esta etapa de lavado pretende
limitar la pérdida de material, en particular de bacterias de
interés, y diluir las muestras de manera que se eviten las
colmataciones, especialmente durante la etapa siguiente de retención
sobre filtro.
A la salida de la etapa de microfiltración, se
recuperaron 20 y 50 ml de filtrado que contenía las bacterias diana
para cada 10 ml de triturado inicial de queso y de carne picada,
respectivamente.
Esta etapa se realiza a nivel del puesto de
filtración unido a la bomba, con ayuda de un montaje que comprende,
de arriba hacia abajo, un embudo de un único uso, un cartucho de
filtración previa de un único uso, un cilindro de plástico y un
cartucho de retención de un único uso. Este montaje está conectado
al puesto 80 de filtración por medio de una pieza de plástico
(figura 2).
Se realiza la microfiltración en modo plano.
Se distribuyen manualmente los líquidos
(triturados alimentarios con adición de tampón de lavado).
Tras numerosas pruebas de filtros de retención
en atención a los imperativos referentes a evitar la colmatación,
se observaron los mejores resultados con filtros de policarbonato
cuyo diámetro medio de los poros es de 0,45 \mum.
Se filtró el filtrado de 40 ml sobre el filtro
42 de retención así seleccionado.
Se separó el filtrado y se colocó el filtro 42
de retención en un tubo de polipropileno.
\newpage
En lo que se refiere a las muestras de agua de
consumo, las etapas de trituración de la muestra y de tratamiento
enzimático y químico previo de la muestra no son necesarias (figura
1, vía B). Según las normas editadas y difundidas por la
Association Française de Normalisation (AFNOR) actualmente en vigor,
la muestra de agua de ensayo está comprendida entre 250 ml y 2 L, y
es preferiblemente de 1 L. Esta muestra de ensayo se filtra
directamente sobre filtros de policarbonato cuyo diámetro medio de
los poros es de 0,45 \mum con el fin de retener las bacterias del
género Legionnella.
Al realizarse la filtración previa y la
retención serie, se lleva el filtrado de 40 ml directamente a la
salida de la filtración previa, por medio de un cilindro, al
cartucho 40 de retención situado a la entrada del módulo 80 del
extractor (figura 2).
Se prevé un recipiente de desechos, que permite
evacuar el filtrado.
A la salida de la etapa anterior, se depositó el
filtro 42 de retención en un tubo de polipropileno, siendo este
material próximo al polímero requerido para fabricar el cartucho 40
de filtración.
Se suspendió el retenido fijado en el filtro 42
de retención en 1 ml de tampón de lisis Tris-HCl 100
mM pH 8,0 - Chelex-100 al 25%.
Se colocó el tubo de polipropileno que contenía
el filtro 42 de retención y el tampón de lisis en un baño de
sonicación de 120 W. Se realizó la sonicación a 70ºC durante 40 min.
y al 80% de la potencia máxima del sonicador, es decir, una
potencia comprendida entre 80 y 120 W, y preferiblemente de 100
W.
A continuación se incubó el tubo al baño maría
durante 10 min. a 100ºC.
Se desenrosca la pieza de plástico colocada a
nivel del puesto de filtración de la bomba a la que está unido el
cartucho de filtración. Se cierra el cartucho de filtración sobre su
cara inferior por una cubierta. Se depositan 2 ml de tampón de
lisis Tris-HCl 100 mM pH 8,0 -
Chelex-100 al 25% sobre el cartucho de filtración.
Se cierra éste último sobre su cara superior mediante un embudo
sobre el que está enroscado un adaptador que comprende una columna
de aclaramiento del lisado y un tubo de 15 ml (figura 4).
Entonces el investigador coloca el montaje para
realizar la lisis sobre un sonotrodo a nivel del módulo 82, durante
40 min., a una frecuencia de 35 KHz. A continuación el investigador
incuba el cartucho en un baño maría en seco a nivel del module 84,
durante 10 min. a 100ºC.
Se extrae el lisado bacteriano contenido en el
tubo de polipropileno con ayuda de una pipeta de 1 ml y se deposita
en un nuevo tubo equipado con una columna "Filter". A
continuación se aclara el tubo de lisis con 1 ml de TE 1X, que se
extrae igualmente y se deposita sobre la columna "filter".
Entonces se filtra el lisado sobre la columna "filter"
únicamente mediante gravedad. Se extrae el lisado filtrado y se
analiza directamente mediante PCR o se concentra y se purifica según
la etapa 18 de la vía B (figura 1).
El investigador coloca el montaje requerido para
realizar la lisis, que contiene el cartucho 40 de filtración, en el
puesto de filtración a nivel del módulo 80. Tras haber sustituido la
cubierta por un depósito pequeño (figura 5), se conecta la bomba
con el fin de filtrar el lisado a través de la columna
"filter". El investigador deposita a continuación 1 ml de TE
1X sobre el cartucho 40 de filtración, el TE permite aclarar el
filtro 42 de retención. Se extrae el tubo de polipropileno que
contiene el lisado filtrado y se analiza directamente el ADN
mediante PCR o se concentra y se purifica según la etapa 18 de la
vía B (figura 1).
Se purificaron y concentraron los ácidos
nucleicos con ayuda de una columna de sílice, tal como está
disponible en el sistema "Nucleospin Plant L"
(Macherey-Nagel, Düren, Alemania).
Se colocó una columna de sílice sobre una cámara
a vacío que permite tratar varias muestras simultáneamente. Dicha
cámara estaba constituida por una cuba de vidrio equipada con un
manómetro y una cubierta de polipropileno, pudiendo recibir dicha
cubierta, sobre su cara externa, las columnas y, sobre su cara
interna, garantizando las agujas de un único uso la transferencia
de líquido.
Dado el caso, podía regularse el vacío de cada
columna con ayuda de un grifo amovible.
En la cuba de vidrio, se encontraba un soporte
que permitía colocar tubos debajo de cada aguja con el fin de
recuperar los diversos líquidos (tampón de unión y etanol,
disoluciones de lavado, eluato).
Se mezclaron los ácidos nucleicos (1 volumen)
con 1 volumen de tampón de unión (tampón "C4" del sistema
comercializado mencionado anteriormente) y 1 volumen de etanol
absoluto. Se agitó esta mezcla vigorosamente durante 30 segundos, a
continuación se depositó sobre una columna tal como se describió
anteriormente.
Se lavó en primer lugar la columna de sílice con
1 ml de tampón de lavado "CQW", después con 2 ml de tampón
"C5", proporcionándose dichos tampones en el sistema
"Nucleospin Plant L".
Se vació el tubo colocado en la cuba de vidrio y
que contenía los desechos procedentes de las etapas de lavado.
A continuación se aplicó el vacío durante 12
minutos con fines de secado de la columna.
Se incubaron 200 \mul de tampón "CE"
precalentado a 70ºC sobre la columna durante 5 minutos.
Tras la elución a vacío en un tubo nuevo, se
repitió la etapa anterior una vez. Entonces, se eluyeron los ácidos
nucleicos a vacío durante 5 minutos.
El volumen de ácidos nucleicos así purificados
se encontraba entre 15 y 250 \mul, y preferiblemente de 200
\mul.
A nivel del puesto de filtración, se desenroscan
el adaptador que contiene un tubo de polipropileno, destinado a
recoger el lisado filtrado, y la columna "filter". Se elimina
la columna "filter" y se sustituye por una columna de sílice,
necesaria para la concentración y la purificación del ADN. A este
nivel, la columna no está condicionada en un tubo de manera que
permite la eliminación del lisado (que ya no contendrá ADN, que se
habrá retenido por la sílice) y de los líquidos de lavado, que se
recogen directamente en un recipiente de desechos.
Se mezcla el lisado filtrado contenido en el
tubo de polipropileno (1 volumen), con 1 volumen de tampón de unión
(tampón "C4" del sistema comercializado por
Macherey-Nagel) y 1 volumen de etanol absoluto. Se
agita vigorosamente esta mezcla durante 30 segundos y a
continuación se deposita a nivel del puesto de filtración, sobre la
columna de sílice recién instalada. Tras la conexión de la bomba con
el fin de garantizar la filtración del lisado sobre la columna de
sílice, se lava el ADN retenido sobre la columna de sílice con 1 ml
de tampón de lavado "CQW" y después con 2 ml de tampón
"C5", proporcionándose dichos tampones en el sistema
"Nucléospin Plant L" y distribuyéndose manualmente por el
investigador.
A continuación se aplica el vacío durante 15
minutos con fines de secado de la columna.
Se enrosca un tubo nuevo destinado a la
recuperación del ADN concentrado y purificado en la extremidad libre
del adaptador.
Se incuban 200 \mul de tampón TE 1X
precalentados a 70ºC sobre la columna durante 5 minutos. Tras la
elución a vacío durante 1 minuto en el tubo nuevo, se repite una
vez la etapa anterior.
El volumen de ácidos nucleicos así purificados
se sitúa entre 100 y 300 \mul, y preferiblemente de 200
\mul.
Claims (19)
1. Procedimiento de extracción de los ácidos
nucleicos de microorganismos contenidos en una mezcla compleja,
especialmente alimentaria, o en agua, que comprende al menos las
etapas siguientes:
(12) la retención des microorganismos contenidos
en la mezcla sobre un dispositivo de tipo cartucho (40) de
filtración;
(14) la lisis de los microorganismos in
situ; y
(16) la recuperación de los ácidos nucleicos a
partir del cartucho (40) de filtración sobre un adaptador que
contiene un filtro de aclaramiento, recuperándose dichos ácidos
nucleicos en forma de un lisado filtrado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa (12) está precedida por una etapa (10) de
aclaramiento de la mezcla compleja mediante filtración, realizándose
entonces dicha etapa (12) sobre el filtrado procedente de la etapa
(10).
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la etapa (10) de aclaramiento de la mezcla compleja se
realiza con ayuda de un filtro de un único uso de policarbonato o
nitrato de celulosa, y cuyo diámetro medio de los poros está
comprendido entre 1,2 y 12 \mum, y es preferiblemente igual a 5
\mum.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa (16) está seguida por
una etapa (18) de concentración y purificación de los ácidos
nucleicos mediante cromatografía de adsorción
líquido-sólido.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el cartucho (40) utilizado en las
etapas (12) y (14) comprende un filtro (42) de retención.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que la etapa (18) se realiza sobre una columna de sílice.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que la etapa(18) comprende al menos las subetapas
siguientes:
(181) la dilución del extracto de ácidos
nucleicos;
(182) la deposición de la mezcla sobre una
columna de sílice;
(183) al menos un lavado seguido por el secado
de la columna; y
(184) la elución de los ácidos nucleicos
retenidos en la columna de sílice.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que las subetapas (181) a (184) se realizan a vacío.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa (12) consiste en una microfiltración tangencial,
realizada con ayuda del filtro (42) de retención contenido en el
cartucho (40), siendo dicho filtro (42) de nitrato de celulosa o de
policarbonato y presentando un diámetro medio de los poros de 0,22 a
0,55 \mum, y preferiblemente de 0,45 \mum.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa (14) comprende un tratamiento de lisis química que
consiste en la acción en caliente, en particular a 70ºC, del
detergente contenido en un tampón de lisis que comprende:
- Tris-HCl (pH entre
aproximadamente 7 y 9, preferiblemente igual a aproximadamente 8; y
concentración entre aproximadamente 25 y 400 mM, preferiblemente
igual a aproximadamente 100 mM);
- Chelex-100 (entre el 3 y el
60% aproximadamente, de manera preferida aproximadamente el
15%);
- y, dado el caso, el conjunto de los tres
componentes siguientes:
- -
- EDTA (pH entre aproximadamente 7 y 9, preferiblemente igual a aproximadamente 8; y concentración entre aproximadamente 10 y 100 mM, preferiblemente igual a aproximadamente 40 mM);
- -
- NaCl (de 50 a 800 mM aproximadamente, de manera preferida aproximadamente 200 mM);
- -
- SDS (entre el 0,5 y el 8% aproximadamente, de manera preferida aproximadamente el 2%).
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa (14) comprende un
tratamiento de lisis mecánica que consiste en la ultrasonicación de
los microorganismos en tampón que comprende TENS y
Chelex-100, preferiblemente TENS 2X y
Chelex-100 al 15%.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que la ultrasonicación se realiza en caliente, a aproximadamente
70ºC.
13. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa (14) comprende un
tratamiento de lisis mecánica que consiste en la sonicación en seco
de los des microorganismos.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa (14) comprende un tratamiento de lisis mecánica
según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, y un
tratamiento de lisis química según la reivindicación 10.
15. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además las etapas preliminares siguientes:
(26) la trituración de la muestra compleja,
especialmente alimentaria; y
(28) el tratamiento enzimático y químico previo
del triturado obtenido.
16. Autómata de extracción de los ácidos
nucleicos de microorganismos contenidos en una mezcla compleja,
especialmente alimentaria, o en agua, para la puesta en práctica del
procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15,
caracterizado porque comprende al menos tres módulos (80, 82,
84), realizando el primero de dichos módulos las etapas (12), (16)
y (18), realizando los módulos (82) y (84) segundo y tercero la
etapa (14) de dicho procedimiento de extracción.
17. Autómata según la reivindicación 16,
caracterizado porque el primer módulo (80) también puede
realizar la etapa (10) del procedimiento de extracción según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
18. Dispositivo para la extracción, la detección
y, dado el caso, la cuantificación de los ácidos nucleicos de
microorganismos contenidos en una mezcla compleja, especialmente
alimentaria, o en agua, que comprende un autómata de extracción de
ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a
17, acoplado a un autómata de amplificación en cadena dependiente de
la temperatura de dichos ácidos nucleicos.
19. Dispositivo según la reivindicación 18, en
el que el autómata de amplificación en cadena dependiente de la
temperatura es de tipo rotativo.
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