ES2279963T3 - Estabilizacion de plasmidos in vivo. - Google Patents
Estabilizacion de plasmidos in vivo. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2279963T3 ES2279963T3 ES03752862T ES03752862T ES2279963T3 ES 2279963 T3 ES2279963 T3 ES 2279963T3 ES 03752862 T ES03752862 T ES 03752862T ES 03752862 T ES03752862 T ES 03752862T ES 2279963 T3 ES2279963 T3 ES 2279963T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- cell
- transformed
- repressor
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Célula bacteriana atenuada transformada para su uso como un medicamento, conteniendo dicha célula: a) un plásmido que comprende un gen de interés y una secuencia de operador susceptible de unirse a un represor, b) un segundo gen, que codifica para dicho represor, y que está presente en un cromosoma, y c) un tercer gen que está presente en el cromosoma y es esencial para el crecimiento y un operador unido en cis al tercer gen de tal manera que la expresión del tercer gen es susceptible a la represión al unirse un represor al operador, en la que dicho plásmido está presente en dicha célula en números suficientes para valorar dicho represor de tal manera que dicho gen esencial se expresa, permitiendo así el crecimiento celular.
Description
Estabilización de plásmidos in vivo.
Esta invención se refiere a una célula
bacteriana atenuada transformada para su uso como un
medicamento.
La expresión de proteínas recombinantes en
células huésped es importante para varias aplicaciones terapéuticas.
En particular, la expresión de proteínas antigénicas en una célula
huésped adecuada es un procedimiento eficaz de inmunización frente
a microorganismos patógenos. Un procedimiento conveniente para
lograr esto es generar una célula huésped recombinante que contiene
un plásmido que codifica para uno o más antígenos o epítopos. Sin
embargo, con el fin de mantener tales plásmidos a un número de
copias suficiente, se requiere algo de presión selectiva. Esto es
debido a que el ADN extracromosómico llevado en las células huésped
es inherentemente inestable ya que las células que contienen
plásmidos normalmente tienen una carga metabólica aumentada
comparado con células segregadoras libres de plásmido.
El procedimiento convencional de mantener el
número de copias de plásmidos deseados en células en cultivo es
incluir un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia
frente a antibióticos, en el plásmido, y cultivar las células en
presencia del antibiótico apropiado. Para las células o plásmidos
previstos para uso terapéutico, esto tiene ciertas ventajas incluso
en cultivo in vitro, por ejemplo el riesgo potencial de
propagar genes de resistencia frente a antibióticos. Por ejemplo,
para el uso in vivo, la presencia requerida de una
concentración suficiente de antibiótico para garantizar la selección
de células que contienen un alto número de copias de plásmidos
puede no ser deseable, práctico o posible.
Otros procedimientos satisfactorios para
mantener plásmidos no utilizan selección por antibióticos, sino que
en su lugar se basan en un huésped mutante que no puede sintetizar
un metabolito esencial e insertar el gen que proporciona esta
síntesis en el plásmido. Otras soluciones implican colocar un gen
que codifica para un producto tóxico en el cromosoma y luego
incluir un sistema de represor o inhibidor correspondiente en el
plásmido, con el resultado de que las células libres de plásmido
mueren eficazmente en la segregación.
Qian Feng et al (Infection and Immunity,
2002, 70:2029-2038) y Mastroeni et al
(Veterinary Journal, 2001,161(2):132-164)
describen procedimientos de expresar un gen de interés en una célula
transformada dentro de un organismo receptor. El documento
EP0851932 describe un procedimiento de mantener plásmidos dentro de
células huésped en cultivo in vitro por medio de valoración
de represor operador. Esto implica diseñar por ingeniería una célula
huésped adecuada, de tal manera que se condiciona la expresión de
un gen cromosómico esencial mediante inserción de una secuencia de
operador dentro de su región de control. Este operador se une a una
proteína represora, y en presencia de tal represor unido, la
expresión del gen se regula por disminución, y en ausencia de este
producto esencial, la célula muere o no consigue dividirse. El
cromosoma de la célula huésped se diseña por ingeniería
adicionalmente de manera que contiene un gen que expresa la proteína
represora, de manera que ahora la célula no es viable a menos que
se inhiba el gen de alguna manera o se reduzca la auxotrofía de la
célula mediante adición del producto esencial requerido como
nutriente complementario en el medio de cultivo.
Los plásmidos deseados para su mantenimiento en
esta célula huésped se diseñan mediante ingeniería para contener
uno o más sitios de operador similares al que controla la expresión
del gen de la célula huésped esencial tal como se describió
anteriormente. Cuando se transforman en la célula huésped, tales
plásmidos compiten por la unión del represor dentro de la célula.
Si se alcanza un número de copias suficiente, todo el represor está
unido a los plásmidos y el gen celular esencial se deprime,
liberando la célula de su auxotrofía y permitiéndola crecer y
dividirse en ausencia de nutrientes complementarios.
Aunque el documento EP 0851932 (y Cranenburgh
et al, 2000, Nucleic Acids Research 29:E26) describe un
sistema de este tipo para su uso in vitro, no hay
descripción de células huésped y plásmidos adecuados para un uso
terapéutico in vivo conveniente y seguro. En consecuencia,
hay una necesidad de un sistema de este tipo para la expresión
conveniente de una variedad de genes terapéuticos llevados en
plásmidos en células huésped aceptables para el uso terapéutico
in vivo.
La invención se basa en células huésped
modificadas, para su uso terapéutico in vivo, que pueden
usarse para expresar un gen llevado por plásmidos terapéuticamente
útil, usando un sistema de mantenimiento de plásmidos que no
requiere el uso de un marcador seleccionable dominante llevado por
plásmidos, sino que en su lugar utiliza un sistema de valoración de
represor.
Una aplicación particularmente útil de esto es
en el campo de la vacunación. Las formas más tempranas de
inmunización profiláctica implicaban el uso de cepas atenuadas de
microorganismos patógenos, que llevaban antígenos compartidos con
los microorganismos de tipo natural más peligrosos. La reacción
inmunitaria generada frente a las cepas atenuadas era protectora
frente a la infección con los microorganismos de tipo natural. Este
enfoque todavía se utiliza en la actualidad, por ejemplo en el uso
de la cepa BCG de Mycobacterium bovis.
Tal como se usa en el presente documento,
"inmunización" significa la estimulación de una respuesta
inmunitaria protectora o terapéutica. La "vacunación" es la
administración deliberada de antígenos que pueden estimular una
respuesta inmunitaria protectora o terapéutica para el fin de la
profilaxis. En este contexto, tales antígenos pueden denominarse
"inmunógenos".
Un microorganismo "atenuado", en este
contexto, es uno que provoca un efecto patógeno reducido (idealmente
poco o ninguno) cuando se administra a un organismo receptor,
comparado con un patógeno de tipo natural. Tales microorganismos
atenuados pueden surgir de manera natural, pueden seleccionarse
deliberadamente mediante paso repetido in vivo o in
vitro, o pueden construirse mediante tecnología de ADN
recombinante manipulando o eliminando genes que se sabe que están
asociados con la virulencia.
Sin embargo, hay limitaciones al enfoque de
utilizar cepas atenuadas de patógenos particulares como vacunas
frente a la infección provocada por sus equivalentes de tipo
natural. Puede no haber disponible una cepa atenuada segura del
patógeno relevante, o una cepa de este tipo puede generar una mala
respuesta inmunitaria protectora. El uso de técnicas de ADN
recombinante permiten, en principio, la identificación de genes
responsables de la expresión de antígenos específicos por los
patógenos, que pueden generar una respuesta inmunitaria protectora,
y transferirlos a células huésped más seguras, o más convenientes,
que pueden usarse entonces como vacunas. Tales genes pueden
codificar directamente para antígenos de proteínas, o pueden
codificar para enzimas responsables de la biosíntesis de
estructuras antigénicas de lípidos o hidratos de carbono más
complejas. Además, esto permite el uso de un número limitado de
cepas huésped para administrar antígenos recombinantes de cualquiera
de una amplia gama de especies de patógenos.
Los genes asociados a antígenos transferidos a
una célula huésped más segura y conveniente (preferiblemente
atenuada) de esta manera pueden, en principio, o bien insertarse
(integrarse) en el cromosoma del huésped, o bien llevarse en un
elemento extracromosómico tal como un plásmido autoreplicante. La
ventaja de la integración es que el gen se mantiene de manera
estable como parte del cromosoma. La desventaja es que una
integración estable de este tipo es un procedimiento complejo y que
requiere mucho tiempo, particularmente cuando deben expresarse
varios genes asociados a antígenos diferentes. La integración
aleatoria puede producir efectos inesperados debido a la
inactivación por inserción de genes de la célula huésped. La
integración específica del sitio mediante recombinación homóloga es
compleja y requiere un esfuerzo y atención considerables.
La vacunación puede llevarse a cabo con
microorganismos atenuados recombinantes que expresan genes asociados
a antígenos apropiados llevados en elementos extracromosómicos
tales como plásmidos (por ejemplo, Oyston et al, 1995,
Infect. Immun.63:563-568; Titball et al,
1995, Infect. Immun. 63: 563-568). La construcción
de vectores de expresión adecuados es sencilla en comparación, y la
transformación o transfección con tales vectores es rutina para
muchos tipos de células. La desventaja es que tales plásmidos no se
replican de manera estable a lo largo de divisiones celulares
repetidas en ausencia de algunos medios de selección.
Convencionalmente, en el caso de células transformadas en cultivo,
esto se logra por medio de un marcador seleccionable dominante,
casi siempre un gen de resistencia frente a antibióticos, llevado en
el plásmido. Las células crecen en un medio en el que se añade el
antibiótico relevante en una concentración apropiada y sólo las
células que llevan el plásmido, y por tanto expresan el gen de
resistencia, sobreviven y se dividen. Esto tiene obviamente
dificultades prácticas principales cuando se aplica al uso in
vivo de tales células para su uso terapéutico, tal como la
vacunación. Además del riesgo de propagar la resistencia frente a
antibióticos y la posibilidad de una respuesta inmunitaria
inapropiada frente al producto del gen de resistencia, puede ser
difícil o imposible mantener una concentración suficiente de
antibiótico en el compartimiento o tejido apropiado del organismo
receptor. En cualquier caso, no es deseable exponer al receptor a
la dosis requerida de antibiótico si puede evitarse.
La presente invención permite el mantenimiento
estable de un plásmido dentro de una célula huésped, en ausencia de
cualquier selección externa tal como un antibiótico. La valoración
de represor operador permite a los plásmidos ser de autoselección
en una célula huésped adecuadamente modificada. Es necesario diseñar
mediante ingeniería una célula huésped modificada de este tipo
("célula huésped ORT®") con respecto a dos genes cromosómicos,
pero una vez construida, puede usarse para cualquier número de
"plásmidos ORT®" que expresen diferentes transgenes. La
capacidad de expresar cualquier número de antígenos diferentes
usando la misma célula huésped atenuada (y validada),
transformándola sencillamente con un plásmido ORT® que codifica para
el gen asociado a antígenos correspondiente, sería una gran
ventaja. La falta de un requisito para cualquier presión de
selección externa añadida permite a las células huésped colocadas
dentro de un organismo receptor mantener de manera estable
plásmidos que codifican y expresan un gen terapéutico único (tal
como un antígeno inmunogénico o epítopo del mismo).
De manera igualmente importante, la invención
permite la transformación de un plásmido libre de cualquier gen de
resistencia frente a antibióticos dentro de una célula huésped
bacteriana (o de otro tipo) adecuadamente modificada, con posterior
crecimiento preferencial y selección de transformantes resultantes,
en ausencia de antibióticos.
Por tanto, la presente invención es
particularmente útil para la expresión de una o más proteínas
antigénicas o péptidos, o de enzimas que se requieren para la
biosíntesis de antígenos no peptídicos, en células huésped, con el
fin de administrar tales células huésped recombinantes a un
organismo receptor para el fin de generar una respuesta inmunitaria
protectora frente al patógeno del que se deriva(n)
dicho(s) antígeno(s). Tales células huésped pueden
seguir o no creciendo y dividiéndose en dicho organismo receptor. El
(los) gen(es) llevado(s) por plásmido que
codifica(n) para el (los) antígeno(s) puede(n)
expresarse en la célula huésped antes de la administración al
organismo receptor o sólo tras la administración al organismo
receptor. La fase en la que se expresa el antígeno puede regularse
colocando el gen llevado por plásmido bajo el control de diferentes
promotores. Por ejemplo, cuando la célula huésped es una célula
bacteriana y el gen llevado por plásmido está bajo el control de un
promotor bacteriano, el antígeno se expresará en células huésped en
las que el plásmido se mantiene antes de la administración a un
organismo receptor. Cuando la célula huésped es una célula
bacteriana y el gen llevado por plásmido está bajo el control de un
promotor eucariota, el antígeno no se expresará en células huésped
antes de la administración sino que se expresará tras la
administración de células huésped que han mantenido el plásmido a
un organismo receptor eucariota, tal como se muestra en Galmory
et al (FEMS Microbiol Rev., 2002,
26(4):339-53).
El experto será consciente de que los antígenos
que pueden usarse para generar una respuesta inmunitaria frente a
patógenos y el plásmido administrado a la célula huésped de la
invención pueden codificar para cualquiera de estos antígenos. Por
ejemplo, se ha mostrado que el operón caf de Y. pestis
es un candidato de vacuna prometedor que induce niveles altos de
inmunidad frente a Y. pestis (Titball et al, 1997,
Infection & Immunity, 65: 1926-1930). Por
tanto, podría usarse una célula huésped ORT que comprende un
plásmido ORT que comprende el operón caf para generar una
respuesta inmunitaria frente a Y. pestis.
Alternativamente, los antígenos pueden derivarse
de un tumor, y usarse la técnica para generar una respuesta
inmunitaria antitumoral con el objetivo de destruir el tumor, o al
menos de ralentizar su crecimiento.
En una realización alternativa, la invención
puede usarse para expresar y administrar productos génicos
terapéuticos para fines distintos de generar una respuesta
inmunitaria. En principio, puede administrarse una amplia gama de
productos terapéuticos recombinantes mediante este
procedimiento.
Por ejemplo, pueden administrarse proteínas para
sustituir el producto reducido o que falta de un gen defectuoso,
tal como a-1-antitripsina en una
deficiencia de a-1-antitripsina, o
Factor VIII en hemofilia. Serían particularmente adecuadas las
aplicaciones en las que se secretan productos terapéuticos dentro
del lumen del intestino introduciendo microorganismos recombinantes
producidos según la invención. Ejemplos incluyen la producción de
enzimas pancreáticas para sustituir enzimas naturales reducidas o
ausentes como resultado de fibrosis cística, pancreatitis o
pancreatectomia, o producción de vitamina K en exceso.
Se prevé que el producto del gen codificado en
el plásmido ORT® pueda expresarse sobre la superficie de la célula
(particularmente útil para fines de vacunación) o secretarse de la
célula huésped. En el caso de una célula huésped bacteriana que
puede sobrevivir dentro de la células del organismo receptor (por
ejemplo Listeria y Salmonella) este sistema permite que se
introduzcan antígenos recombinantes directamente dentro de
compartimientos intracelulares, lo que puede tener ventajas en el
caso de células presentadoras de antígenos, influyendo en el tipo
de presentación posterior por las moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad. Tales ventajas resultarán evidentes para un
experto en la técnica apropiada. Procedimientos adecuados para la
secreción de antígenos expresados en bacterias
gram-negativas incluyen el sistema de secreción de
hemolisina de E coli (Gentschev et al, 1996, Gene
179; 133; Gentschev et al, 2001, Vaccine 79:2621).
La invención también puede usarse para
administrar productos génicos terapéuticos que son los productos de
transcripción de los genes llevados por plásmidos, tales como
oligonucleótidos antisentido. También se prevé que la invención
pueda usarse para administrar genes llevados por plásmidos que son
en sí mismos productos terapéuticos, por ejemplo para fines de
terapia génica.
La invención abarca una célula huésped
bacteriana atenuada, transformada, que contiene un plásmido que
comprende un gen de interés y un operador susceptible a la unión
por un represor expresado en trans, un segundo gen que codifica
para el represor presente en un cromosoma, y un tercer gen
cromosómico que está funcionalmente asociado con un operador y
esencial para el crecimiento celular, en el que el plásmido está
presente en la célula en números suficientes para valorar el
represor de tal manera que se expresa el gen esencial, permitiendo
así el crecimiento celular.
Preferiblemente, el tercer gen no es un gen de
resistencia frente a antibióticos.
Tal como se usa en el presente documento,
"funcionalmente asociado" u "operativamente asociado", con
respecto a cualquier secuencia de operador y un gen asociado,
significa que el operador está unido en cis al gen de tal manera
que la expresión del gen es susceptible a la represión tras la unión
de un represor al operador.
Un experto en la técnica entenderá que el
término operador se usa para definir cualquier secuencia de ácido
nucleico a la que se une un represor para evitar la transcripción de
un promotor asociado. La secuencia de operador sobre el plásmido no
necesita ser una secuencia que sea idéntica a la secuencia de
operador en el gen cromosómico, ya que el operador del plásmido
sólo necesita estar constituido por las secuencias mínimas
necesarias para la unión al represor que reprime la transcripción
del gen cromosómico. También se entenderá que las secuencias de
operador mutadas también son útiles según la invención, por ejemplo,
secuencias que tienen uno o más nucleótidos insertados, eliminados,
o sustituidos que dan como resultado un aumento o disminución de la
afinidad por el represor correspondiente.
Tal como se usa en el presente documento,
"crecimiento celular" se refiere a números crecientes de
células en un medio de cultivo o in vivo a lo largo del
tiempo, y también se refiere a la supervivencia celular en la que
el número de células no aumenta a lo largo del tiempo, sino más bien
que el número de células vivas no disminuye a lo largo del
tiempo.
Preferiblemente, el gen represor codifica para
uno de los represores lac de E. coli, en particular el
represor lac I^{q}, el represor trp de E coli, el represor
galR de E. coli, el represor araC de E. coli, el
represor ArgRNV de E. coli (Burke et al (1994) Mol.
Microbiol., 13, 609-618) y el represor Tet de E.
coli.
Tal como se describió anteriormente, cada
represor es operativo en trans con una secuencia de operador
trans-asociada que está presente tanto en el
cromosoma como en el plásmido. La invención contempla la presencia
de uno o más genes represores en el cromosoma del huésped, por
ejemplo, uno, dos o tres genes represores, con el fin de garantizar
la estabilidad del plásmido cuando se muta o elimina un gen represor
cromosómico.
Por tanto, las secuencias de operador preferidas
incluyen el operador lac, el operador A, el operador trp, el
operador gal, el operador ara, el operador Arg y el operador Tet. Si
se desea, el promotor correspondiente puede asociarse
funcionalmente con su operador.
Puede estar presente en el cromosoma de la
célula más de un gen cromosómico esencial diferente que está
funcionalmente asociado con el operador, en el que el gen esencial
está unido a un operador y por tanto es susceptible de represión
mediante el represor, para asegurar contra la pérdida de
susceptibilidad del represor en un operador cromosómico. En una
realización preferida de la invención, el gen que codifica para la
proteína represora está presente en dos o tres copias en
ubicaciones diferentes en el cromosoma para asegurar contra la
pérdida de expresión del represor en una ubicación cromosómica.
Genes esenciales preferidos que están ubicados
en el cromosoma del huésped incluyen, pero no se limitan a, genes
que se incluyen en las siguientes categorías: genes que codifican
para productos relacionados con la biosíntesis de metabolitos
celulares tales como precursores de pared celular, genes cuyos
productos están implicados en el metabolismo del carbono, genes que
codifican para resistencia frente a antibióticos y genes que
codifican para la biosíntesis o regulación de macromoléculas, por
ejemplo, genes esenciales para la síntesis de ADN y/o ARN y
funciones de replicación.
Preferiblemente, el plásmido comprende un origen
de replicación que permite la replicación de aproximadamente 20
copias del plásmido por célula huésped, o de hasta aproximadamente
200 copias del plásmido por célula huésped. Ejemplos de talas
plásmidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen el
origen de replicación pBR322 y la serie de plásmidos pUC tal como
se describe por Vieira & Messing (1982, Gene, 19(3),
259268) y Yanisch-Perron et al. (1985, Gene,
33(1), 10S-119), denominados en el presente
documento pUC. Plásmidos alternativos que pueden usarse incluyen el
plásmido pAHL, derivado del plásmido pAH34L descrito por Titball
et al (1997, Infection & Immunity, 65:
1926-1930).
Tal como se usa en el presente documento,
"origen de replicación" se refiere a aquellas secuencias en el
plásmido que son necesarias para mantener el plásmido a un número
de copias dado por célula.
El sistema de valoración de represor descrito en
el presente documento permite el mantenimiento estable de plásmidos
en un número de copias moderado o alto sin el uso de marcadores
seleccionables dominantes codificados por plásmido, tales como para
resistencia frente a antibióticos, y pueden usarse con cualquier
huésped que pueda soportar un sistema de represor/operador de
acción en trans. Una ventaja de la invención es que se basa en un
mantenimiento de plásmidos distinto de selección por antibióticos de
células que llevan plásmido. La ausencia de marcadores
seleccionables dominantes, tales como genes de resistencia frente a
antibióticos, en el plásmido, tal como se describe en el presente
documento, también es ventajosa porque evita problemas
potencialmente graves relacionados con la expresión de esos genes
en un organismo receptor, especialmente un ser humano y porque
evita un uso ampliamente extendido de genes bacterianos que
codifican para resistencia frente a antibióticos, cuyo uso favorece
la transferencia de tales genes en la población bacteriana en su
totalidad.
La célula bacteriana atenuada transformada es
preferiblemente una célula enterobacteriana, más preferiblemente
una célula del género Salmonella, y lo más preferiblemente
una célula de la especie Salmonella typhimurium o de la
especie Salmonella typhi.
Se prefiere adicionalmente que dicha célula
bacteriana atenuada transformada se haya atenuado para reducir su
patogenicidad mediante una modificación de su gen aroA, gen
aroC, gen aroD o gen htrA. La célula
transformada puede contener una modificación de más de uno de esos
genes.
Lo más preferiblemente, la célula transformada
atenuada es de la cepa SL3261 de Salmonella typhimurium o de
la cepa CVD 908-htr de Salmonella typhi.
También se prefiere que dicho tercer gen
contenido por la célula codifique para una enzima requerida para la
síntesis de la pared de la célula bacteriana. Más preferiblemente
dicho gen es dapD.
Alternativamente, dicho tercer gen codificado
por la célula codifica para una enzima requerida para la síntesis
de ácidos grasos. Más preferiblemente, dicho tercer gen es
fabA.
El gen de interés puede ser cualquier gen que se
desea administrar al organismo receptor. El gen de interés puede
codificar para un antígeno o el producto de transcripción del gen de
interés puede ser un oligonucleótido antisentido. Preferiblemente,
el gen de interés está funcionalmente asociado con un promotor
bacteriano o un promotor eucariota.
La célula bacteriana atenuada transformada se
usa como un medicamento. El uso de la célula transformada como un
medicamento dependerá de la naturaleza del gen de interés.
Preferiblemente, la célula transformada puede usarse como un
sistema de administración de genes. Por ejemplo, la célula
transformada puede usarse para administrar un gen de interés para
fines de terapia génica. La célula transformada también puede usarse
para administrar un gen de interés, cuyo producto de transcripción
tiene un efecto terapéutico, tal como un oligonucleótido
antisentido, o administrar un gen de interés que codifica para un
antígeno que tiene un efecto terapéutico.
Alternativamente, la célula transformada puede
usarse como inmunógeno. Según esta realización, el gen de interés
puede codificar para uno o más antígenos que provocan una respuesta
inmunitaria en el organismo receptor. El experto será consciente de
genes de interés que codifican para antígenos que provocan una
respuesta inmunitaria en el organismo receptor y que pueden
incluirse en el plásmido en la célula transformada de la invención.
Un ejemplo de genes de interés que pueden incluirse en el plásmido
para inducir una respuesta inmunitaria en el organismo receptor son
los genes cafI, caflA y caflM del operón caf.
El gen de interés puede transcribirse, o
transcribirse y traducirse, en la célula transformada antes de la
administración a un organismo receptor o sólo tras la administración
a un organismo receptor dependiendo de la identidad del promotor y
la célula transformada. Por ejemplo, cuando el gen de interés
codifica para un antígeno que provoca una respuesta inmunitaria
funcionalmente unida a un promotor eucariota y la célula
transformada es una célula bacteriana, el antígeno sólo se
expresará para provocar una respuesta inmunitaria tras la
administración al organismo receptor.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona una composición para su uso como un medicamento que
comprende cualquiera de las células descritas anteriormente junto
con un tampón, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable,
tal como se conocen bien por los expertos en la técnica relevante.
Según una realización de este aspecto, la composición farmacéutica
es una composición de vacuna. La composición de vacuna puede
comprender uno o más adyuvantes además del excipiente, diluyente o
tampón.
Otras características y ventajas de la invención
resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción de las
realizaciones preferidas de la misma y a partir de las
reivindicaciones.
La figura 1 es un diagrama que ilustra el uso
del plásmido pKO3 (figura 1A) para la inserción de genes (figura 1B)
a partir de Link et al, 1997, J. Bacteriol 179:
6228-6237)
La figura 2A muestra el locus dapD cromosómico,
y B muestra los productos de PCR generados a partir del mismo para
el procedimiento de clonación.
La figura 3 muestra mapas de plásmidos usados en
la construcción de SL3261dapD (A: pTrc99; B: pGEM-T
Easy; C: placPdapD6; D: pTrc99dapD; E:
pGEM-TeasydapDL(-); F:
pGEM-TeasydapDR(-); G: pDRdapD(+); H: pdapDB(+); I:
pKO3; J: pKO3dapD).
La figura 4A muestra el locus fabA cromosómico,
y B muestra los productos de PCR generados a partir del mismo para
el procedimiento de clonación.
La figura 5 muestra mapas de los plásmidos
usados en la construcción de SL3261fabA (A: pCR2.1; B: pORT1; C:
pCR2.1STfabA(-); D: pORfabA(+); E: placfabA; F: pTrc99fabA; G:
pORIlacfabA; H: pK03fabA).
La figura 6 es una comparación de las curvas de
crecimiento de SL3261 en LB y de SL3261 dapD en LB e IPTG.
Figura 7: el plásmido pUC18I.
Figura 8: mantenimiento in vitro de
pUC18I en SL3261dapD. Se muestran los números medios de colonias de
SL3261dapD(pUC18I) sobre LB-IPTG y sobre
ampicilina.
Figura 9: mantenimiento in vitro de
pUC18I en SL3261dapD. Gel de agarosa de las minipreparaciones para
mostrar la presencia de pUC18I en SL3261dapD. M = escalera de kb; C
= referencia pUC18I. Se cargaron los puntos de tiempo desde el
"día 0" hasta el "día 5" según se describen en el ejemplo
4 en orden cronológico. 1-2-3:
clones de SL3261 dapD(pUC 18I).
Figura 10: mantenimiento in vivo de pUC
18I en SL3261 dapD en ratones. Al primer grupo de ratones se le
inyectó SL3261 como control: rombos en negro = Salmonella
viable total detectada en células del bazo sembradas en placas sobre
agar LB; rombos en blanco = Salmonella viable total detectada
en células PP sembradas en placas sobre agar LB.
Al segundo grupo de ratones se le inyectó SL3261
que contenía pUC18I: triángulos en negro = Salmonella viable
total detectada en células del bazo sembradas en placas sobre agar
LB; triángulos en blanco = Salmonella que contiene pUC18I
detectada en células del bazo sembradas en placas sobre agar LB que
contiene ampicilina; triángulos con una barra = Salmonella
viable total detectada en células PP sembradas en placas sobre agar
LB; triángulos con múltiples barras = Salmonella que
contiene pUC18I detectada en células PP sembradas en placas sobre
agar LB que contiene ampicilina.
Al tercer grupo de ratones se le inyectó SL3261
dapD que contenía pUC 18I: círculos en negro = Salmonella
viable total detectada en células del bazo sembradas en placas sobre
agar LB e IPTG; círculos en blanco = Salmonella que contiene
pUC18I detectada en células del bazo sembradas en placas sobre agar
LB que contiene ampicilina; círculos con una barra =
Salmonella viable total detectada en células PP sembradas en
placas sobre agar LB con IPTG; triángulos con múltiples barras =
Salmonella que contiene pUC18I detectada en células PP
sembradas en placas sobre agar LB que contiene ampicilina.
Recuentos bacterianos para los tres grupos
mostrados 8, 12 y 16 días tras la inyección. La línea horizontal a
través de las gráficas justo por encima de 1 en el eje vertical
representa el límite de detección.
Figura 11: el plásmido pAHL.
Figura 12: curvas de crecimiento de
SL3261(pAH34L) en LB-kanamicina y de
SL3261dapD(pAHL) en LB.
Figura 13: mantenimiento in vitro de pAHL
en SL3261dapD. Se muestran los números medios de colonias de
SL3261dapD(pAHL) sobre IPTG y sobre LB.
Figura 14: mantenimiento in vitro de pAHL
en SL3261dapD. Gel de agarosa de las minipreparaciones para mostrar
la presencia de pAHL en SL3261dapD. M = escalera de kb; K =
referencia pAHL. Se cargaron los puntos de tiempo desde el "día
0" hasta el "día 5" tal como se describe en el ejemplo 7 en
orden cronológico. 1-2-3: clones de
SL3261dapD(pAHL).
La invención se ilustra mediante los siguientes
ejemplos no limitativos en los que se emplean los siguientes
materiales y procedimientos. La totalidad de la descripción de cada
referencia bibliográfica citada a continuación en el presente
documento se incorpora como referencia en el presente documento.
La invención puede usarse con cualquier sistema
de represor/operador de acción en trans. Por ejemplo, el sistema de
valoración de represor descrito en el presente documento puede
incluir cualquier represor que tenga suficiente afinidad por su
secuencia de unión a ADN de tal manera que puede evitar la expresión
de un gen cromosómico esencial, pero también puede valorarse
mediante una secuencia de unión a ADN llevada por plásmido.
El gen cromosómico esencial que es susceptible a
la represión por el represor se vuelve susceptible a la represión
porque se coloca bajo el control de un operador/promotor que se une
al represor, o la secuencia de unión al represor (es decir,
operador) se inserta en, o se asocia con, el promotor natural del
gen esencial de tal manera que puede evitar la transcripción cuando
se une al represor, pero no altera la capacidad del promotor
natural para iniciar la transcripción del gen esencial en ausencia
de unión al represor.
Más de un gen diferente puede estar presente en
el cromosoma, por ejemplo, dos o tres genes, unido funcionalmente
cada gen a una secuencia de operador y por tanto susceptible a la
represión por el represor. La presencia de diferentes genes
esenciales susceptibles al represor en el cromosoma, preferiblemente
en posiciones diferentes en el cromosoma, reduce la posibilidad de
pérdida de estabilidad del plásmido mediante una mutación o deleción
que da como resultado la pérdida de represión de un gen cromosómico
esencial.
El represor se codifica por un gen cromosómico.
Según la invención, una o más, preferiblemente una, dos o tres
copias del gen represor cromosómico están presentes en la célula
huésped. El gen represor cromosómico puede ser un gen que se
produce de manera natural que no se ha modificado, o puede contener
una mutación genética que proporciona a la molécula represora
afinidad superior o inferior con respecto a la fuerza de unión a su
operador correspondiente. Tales mutaciones se conocen en la técnica
anterior, por ejemplo, la afinidad del represor lac por su operador
puede potenciarse mediante cambios de aminoácido único (véase Betz,
(1986) Gene, 42, 283-292 y Khoury et al.,
(1991) J. Mol. Biol., 219, 623-634).
Alternativamente, pueden introducirse más o menos copias del sitio
de unión al operador dentro del plásmido o pueden introducirse más o
menos copias del gen represor en el cromosoma o en una realización
alternativa llevarse en un plásmido.
\newpage
Alternativamente, las secuencias que inician la
expresión del gen represor tales como promotores, potenciadores,
etc., pueden mutarse o diseñarse por ingeniería genética de tal
manera que se prepara un número superior o inferior de moléculas
represoras en la célula.
Por ejemplo, el número de copias del represor
lacI puede aumentarse mediante la introducción de la mutación
lacI^{q} (véase Carlos (1978) Nature 274,
762-765). El número de moléculas represoras
presentes en la célula estará relacionado con el número de copias
del plásmido que lleva la secuencia de operador correspondiente.
Según el sistema de valoración de represor de la invención, la
concentración de represor presente en la célula huésped es tal que,
en ausencia del plásmido, el gen esencial de interés no se expresa,
pero en presencia del plásmido, el represor se valora separado del
gen esencial. Cuando más de una copia del gen represor está
presente en el cromosoma, por ejemplo, dos o tres copias, la
cantidad de proteína represora preparada en la célula aumentará con
respecto a la presencia de un gen; este aumento se tendrá en
consideración cuando se seleccione un origen de replicación de
plásmido correspondiente, y al seleccionar el número de genes
esenciales/operadores cromosómicos que están presentes en la
célula.
La fuerza de los operadores y las afinidades de
los represores puede alterarse para adaptar el sistema para su uso
con plásmidos de número de copias diferente. Por ejemplo, el grado
de represión del operón lac puede potenciarse introduciendo un
operador lac ideal auxiliar colocado de manera óptima (es decir, un
operador lac que tiene afinidad por el represor potenciada), o la
introducción del operador ideal dentro del promotor (Muller et
al., (1996) Mol. Biol., 257, 21-29 y Lewis et
al., (1996) Science 271, 1247-1254).
Alternativamente, la fuerza del operador puede
reducirse mediante la introducción de un operador no ideal, la
colocación de manera no óptima del operador o la eliminación de un
operador auxiliar (Muller et al., (1996) Mol. Biol., 257,
21-29 y Oehler et al., (1990) EMBO J.
219,973-979). Por ejemplo, puede potenciarse la
afinidad del represor lac por su operador mediante cambios de un
único aminoácido (Betz, (1986) Gene, 42,
283-292).
Los sistemas de represor útiles según la
invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes. El
represor lac de E. coli descrito en "The Lactose
Operon", J. Beckwith, en Escherichia coli y Salmonella
typhimurium, Eds., J.L. Ingraham et al., 1987 Amer. Soc.
Micro., págs. 1444-1452, y Dickson et al.,
1975, Science 187:27-35.
El operón lac se regula tal como sigue.
En condiciones no de inducción (tales como crecimiento sobre
glucosa) LacI se une al operador del operón lac y evita la
transcripción de \beta-galactosidasa (LacZ),
lactosa permeasa (LacY) y una transacetilasa (LacA). En condiciones
de inducción (tales como crecimiento sobre lactosa o adición de
IPTG, un análogo no metabolizable) el represor ya no se une al
operador y se produce la transcripción. La expresión del operón se
detecta fácilmente mediante ensayo para detectar
\beta-galactosidasa. Otros sistemas de represor
útiles según la presente invención incluyen el sistema de represor
lac descrito anteriormente y el sistema de represor tet para su uso
para regular la actividad génica en células eucariotas (Gossen et
al., (1994) Current Opinions in Biotechnology, 5,
516-520). El sistema de represor tet se ha usado en
la levadura, Dictyostelium, células vegetales y plantas del
tabaco. Un sistema de represor adicional útil según la presente
invención es el sistema de represor ArgRNV (Burke et al.,
(1994) Mol. Microbiol. 13, 609-618). Normalmente,
el represor ArgR sólo se une a su operador en presencia de arginina.
Sin embargo, el represor ArgRNV mutante se une al operador en
ausencia de arginina y permanece unido en presencia de arginina y
tiene un efecto dominante en trans. Puede diseñarse por ingeniería
un sitio de unión a ArgR idealizado (operador), que tiene dos cajas
de Arg simétricas, dentro del plásmido de interés para permitir la
valoración por ArgRNV separado de un gen esencial cuya expresión
está controlada por el sitio de unión a ArgR.
Un experto en la técnica apreciará que pueden
realizarse ciertas modificaciones a los sistemas de valoración de
represor descritos en el presente documento que sirven para adaptar
el sistema a un protocolo dado. Por ejemplo, cuando el medio de
crecimiento contiene componentes que inducen más que permiten una
represión del operador, y no se desean condiciones de inducción
durante el crecimiento, pueden usarse mutantes de operador o
represor para superar la inducción y permitir la represión. Un
ejemplo de un represor mutante es un mutante LacI del represor lac.
Un mutante LacI ya no tiene la capacidad para unirse al inductor.
Ejemplos de mutantes LacI incluyen, por ejemplo, mutantes LacI
(Beyreuthe, 1978, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY) y otros
mutantes tales como Asp276 - > Asn274 (Chang et al., 1994,
Biochem. 10 22:3607-3616). Sustituyendo el represor
de tipo natural por un represor mutante que no es sensible al
inductor, el represor puede unirse al operador durante el
crecimiento, y el plásmido se mantiene en la célula huésped incluso
en condiciones que normalmente inducirían al represor.
El represor trp de E. coli también es
útil según la invención (véase "The tryptophan Operon",
Yanofsky y Crawford, en Escherichia coli y Salmonella
typhimurium, Eds., J.L. Ingraham et al., 1987, Amer. Sec.
Micro., pp.1453-1472). El represor trp está
presente a aproximadamente 50 copias/célula, y requiere la presencia
de triptofano en el medio de fermentación como inductor de unión al
represor. 20
El represor gal R de E. coli también es
útil según la invención (véase "The Galactose Operon", S.
Adhya, en Escherichia coli y Salmonella typhimurium,
Eds., J.L. Ingraham et al., 1987, Amer. Soc. Micro., pp.
1503-1512).
El represor ara C de E. coli también es
útil según la invención (véase "The L-Arabinose
Operon", R. Schlief, en Escherichia coli y Salmonella
typhimurium, Eds., J.L. Ingraham et al., 1987, Amer. Soc.
Micro., págs. 1473-1481; Dunn et al., 1984,
Proc. Nat. Aca. Sci. 81;5017-5020). El represor ara
C tiene una afinidad de unión aumentada en presencia de arabinosa.
Finalmente, el represor A es útil según la invención (Introduction
to Lambda Phages, en Current Protocols in Molecular Biology, Eds.
Ausubel, et al., 1994, Sección III, Unidad 1.9; Hochschild
et al., 1986, Cell 47(5);
807-816).
La invención puede utilizarse ventajosamente con
un origen de replicación de plásmido que permite la replicación de
al menos 5, preferiblemente al menos 10-100, y lo
más preferiblemente al menos 100-500 copias del
plásmido por célula huésped. Los orígenes de replicación que
permiten la replicación de números de copias de plásmido de
moderados (es decir, 20-50) a altos (es decir,
100-500) son especialmente útiles porque los números
de copias de plásmido de moderados a altos pueden valorar
fácilmente moléculas represoras. Obviamente, si se desea, también
puede usarse un plásmido que tiene un número de copias de hasta
1000-2000 copias por célula.
Los plásmidos con bajos números de copias (es
decir, 5 copias o menos) se utilizan de la manera más ventajosa
según la invención tras la mutación para ocasionar un aumento del
número de copias (J. Scott, 1984, Microbial Reviews
48:1-23). De los orígenes de replicación usados
frecuentemente, pBR322 (20 copias/célula) es útil según la
invención, y se prefieren pUC (a 200 copias/célula). Aunque no se
prefieren, otros plásmidos que son útiles según la invención son
los que requieren la presencia de proteínas codificadas por plásmido
para la replicación, por ejemplo, los orígenes de replicación
pT181, Fll, y Fl.
Ejemplos de orígenes de replicación que son
útiles según la invención en E. coli y S. typhimurium
incluyen, pero no se limitan a, pMB1 (25 o más copias por célula,
20 Bolivar et al., 1977, Gene 2:95-113),
ColEI (15 o más copias por célula, Kahn et al., 1979,
Methods Enzymol. 68:268-280), p15A (aproximadamente
15 copias por célula, Chang et al.,1978, J. Bacteriol.
134:1141-1156); pSC101 (aproximadamente 6 copias por
célula, Stoker et al., 1982, Gene
18:335-341); R6K (menos de 15 copias por célula,
Kahn et al, 1979, mencionado anteriormente); R1 (origen de
replicación dependiente de la temperatura, Uhlin et al, 1983,
Gene 22:255-265); lambda dv (Jackson et al.,
1972, Proc. Nat. Aca. Sci. 69:2904-2909). Un ejemplo
de un origen de replicación que es útil en estafilococos es pT181
(aproximadamente 20 copias por célula, J. Scott, 1984, Microbial
Reviews 48:1-23). De los orígenes de replicación
descritos anteriormente, se prefieren pMBI, p15A y ColEI porque
estos orígenes no requieren proteínas codificadas por plásmido para
su replicación.
La invención puede aplicarse a todos los tipos
de células incluyendo células de animales tales como células de
mamíferos e insectos, células vegetales, hongos tales como
levaduras, y la mayoría de las cepas de bacterias, por ejemplo,
cepas bacterianas gram positivas y negativas, siempre que exista un
plásmido que pueda mantenerse en la célula huésped en un número de
copias de medio a alto.
Las bacterias gram negativas útiles según la
invención incluyen, pero no se limitan a, E. coli y
Salmonella, por ejemplo, S. typhimurium.
Las especies gram positivas útiles según la
invención incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Streptomyces,
Lactobacillus y Lactococcus, para las que ya existen
plásmidos con número de copias alto. Ejemplos de plásmidos útiles
según la invención en Lactococcus son pNZ2123 y p1L253 (Simon
et al., Biochimie 70:559,1988). El operón de lactosa de
lactococos se ha usado para controlar la expresión de proteínas
heterólogas (Wells et al., 1993, Mol. Microbiol.
8(6):1155-1162). Este operón utiliza el
represor lacR (van Rooigen et al., J. Biol. Chem.
265:18499-18503, 1990) para controlar la expresión
de T7 polimerasa, que entonces controla la expresión de la proteína
heteróloga. Ejemplos de plásmidos útiles según la invención en
Bacillus son pC 194, pUB110 y pT181. En Bacillus, por
ejemplo, B. subtilis, el represor A se ha usado para
controlar la expresión de proteínas heterólogas. El represor A se
ha colocado bajo el control del promotor sak42D, que puede
transcribirse eficazmente en B. subtilis (Breitling et
al., 1990, Gene
93(1):35-40).
93(1):35-40).
Las levaduras son útiles según la invención, ya
que se mantienen números de copias altos en las levaduras. Ejemplos
de tales plásmidos incluyen los plásmidos YRp (basados en las
secuencias de replicación autónoma (ARS)) que tienen números de
copias de hasta aproximadamente 100 copias por célula, y los
plásmidos YEp (basados en el círculo de 2 micrómetros), con un
número de copias de 50-100 por célula. (véase
Sikorski, "Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces
cerevisiae", en Plasmids, A Practical Approach, Ed. K.G.
Hardy, IRL Press, 1993; y Yeast Cloning Vectors and Genes, Sección
II, Unidad 13.4, Current Protocols in Molecular Biology, Eds.,
Ausubel et al., 1994.) Las levaduras pueden expresar el gen
lacZ de E. coli, por tanto se contempla según la invención
utilizar el sistema de valoración de represor lac para controlar la
expresión de genes de levadura esenciales tales como ura3 o Ieu2,
genes que se han usado para el mantenimiento de plásmidos en
levaduras (Gunge, 1983, Ann. Rev. Micro.
37:253-276).
37:253-276).
Son particularmente útiles las células huésped
atenuadas que se han atenuado de manera que estén aceptablemente
libres de efectos secundarios, libres para su uso terapéutico en
organismos receptores. Dependiendo de la especificidad de la
célula, puede ser adecuada para uso terapéutico veterinario o en
seres humanos.
\newpage
Entre las bacterias atenuadas disponibles están
las siguientes:
Salmonella typhimurium incluyendo las
cepas SL3261 (mutante aroA, Titball et al, 1997, Infection
and Immunity 65: 1926, Titball et al, 1995, Infection and
Immunity 63: 563), VNP20009 (mutante purl y msbB, Toso et al,
2002, J Clin Oncol 20: 142);
Salmonella typhi incluyendo las cepas CVD
908-htrA, \chi4073, \chi4632, Ty800, CVD 909 y
CVD 915 (Galen et al, 1999, Infect. Immun. 67:
6424-6433; Morona et al, 1991, Gene 107:
139-144; Tacket et al, 1997, Infect. Immun.
65:3381-3385; Garmory et al, 2002, FEMS
Microbiology Reviews 26: 339-353);
Salmonella gallinarum incluyendo la cepa
9R (para la vacunación aviar, Feberwee et al, 2001, Avian Dis
45: 1024);
Escherichia coli incluyendo los mutantes
aroA, cnfl y OMP (Rippere-Lampe et al, 2001,
Infect Immunol 69: 3954);
Shigella flexneri incluyendo la cepa S.
flexneri 2a guaBA (Altboum et al, 2001, Infect Immunol
69:3150);
Vibrio cholerae incluyendo la cepa Peru2
(Ryan et al, 2000, Infect. Immun. 68:
221-226);
Listeria monocytogenes incluyendo los
mutantes PrfA y SvpA (Sheehan et al, 1996, Mol Microbiol 20:
785; Borezee et al, 2001, Microbiology 747:2913);
Brucella abortus incluyendo la cepa RB51
(Vemulapalli et al, 2000, Infect Immunol 68:3290);
Mycobacterium bovis incluyendo la cepa
Calmette-Guerin (BCG); y
Mycobacterium tuberculosis. Se conocen
auxótrofos de M tuberculosis que pueden usarse directamente para el
enfoque de ORT®, tales como el mutante trpD (auxótrofo triptofano,
Smith et al, 2001, Infect Immun 69: 1142).
La invención puede usarse junto con varios genes
de huésped cromosómicos esenciales diferentes para el mantenimiento
estable del plásmido. Estos genes esenciales incluyen, pero no se
limitan a, las siguientes categorías, por ejemplo, genes que
codifican para productos relacionados con la biosíntesis de
metabolitos celulares, genes cuyos productos están implicados en el
metabolismo del carbono, genes que codifican para resistencia frente
a antibióticos, y genes que codifican para la biosíntesis o
regulación de macromoléculas, por ejemplo, genes esenciales para
funciones de replicación y síntesis de ADN y/o ARN.
Ciertos genes que codifican para enzimas
implicadas en el suministro de componentes celulares, en particular
el suministro de precursores de la pared celular, también son
esenciales para el crecimiento de la célula huésped y son útiles
según la invención. Por ejemplo, la pared de la célula bacteriana
contiene ácido meso-diamiopimélico (DAP), y una
incapacidad de sintetizar este componente da como resultado la lisis
celular.
Se ha demostrado que pueden usarse mutantes en
los que se ha eliminado el gen asd (aspartato
p-semialdehído deshidrogenasa) o el gen dapD
(tetrahidrodipicolinato N-succinil transferasa) para
el mantenimiento de plásmidos que llevan una copia completa de ese
gen en el plásmido. (Nakayama et al., Bio/technology
6:693-697, 1988; DeGryse, patente de los EE. UU.
número 5.198.343).
También pueden usarse varios otros genes en la
ruta biosintética del DAP, concretamente los genes dapA, dapB, dapC
y dapE. Se han clonado y secuenciado dapA y dapB, y dapB está
disponible como cistrón único (Richaud et al., J. Bacteriol.
166:297-300, 1986; Bouvier et al., J. Biol.
Chem. 259:14829-14834, 1984).
Los genes implicados en la biosíntesis de otros
componentes de la pared celular, tales como biosíntesis de
D-alanina, también son útiles según la invención
(Walsh, 1989, J. Biol. Chem.
264(5):2393-2396). Se ha usado una secuencia
de ADN que codifica para un componente de D-alanina
para la estabilización de plásmidos sin usar antibióticos (véase el
documento EP 85/309020).
Los genes implicados en la biosíntesis de ácidos
grasos también son útiles según la invención. Un ejemplo es fabA,
que codifica para
3-hidroxidecanoil-ACP deshidrasa,
responsable de la introducción de un doble enlace en la cadena de
ácido graso en crecimiento en el punto en el que diverge la
biosíntesis de ácido graso insaturado y saturado (Cronan Jr. J. E.
y Rock. C. O. (1987)). Biosynthesis of membrane lipids. En
"Escherichia coli and Salmonella typhimurium:
cellular and molecular biology". Neidhardt .F.C. (ed.) American
Society of Microbiology, Washington D. C.). La enzima está presente
en una concentración relativamente alta, y se produce la lisis de
los mutantes de fabA a menos que se complementen con un ácido graso
insaturado.
La invención contempla el uso de valoración de
represor junto con tales genes. Se elimina el gen de interés de
tipo natural de la cepa huésped y se sustituye por una copia en la
que la expresión está dirigida por un promotor/operador que se une
a la proteína represora elegida, usando una cepa huésped que
sintetiza la proteína represora. Por tanto, la transformación de la
cepa con un plásmido que contiene la secuencia de unión a represor
da como resultado la valoración del represor separado del gen
biosintético, permitiendo la expresión del gen esencial.
El procedimiento de valoración de represor de la
invención puede usarse con genes implicados en la utilización de
fuentes de carbono. Específicamente, el procedimiento puede usarse
con el operón de la lactosa y la utilización de lactosa como única
fuente de carbono, tal como se describe en el presente documento.
Otras modificaciones resultarán evidentes a un experto en la
técnica. Existen mutantes de represor lac que ya no pueden unirse
al inductor (alolactosa) y permanecen unidos al operador lac en
condiciones de inducción normales. Se representan por los mutantes
lac Is; sin embargo, existen otras mutaciones que no tienen
capacidad para unirse al inductor pero son normales en todas las
demás funciones (Chang et al., Biochem.
33:3607-3616 (1994)).
Las cepas que lleven estas mutaciones no podrán
expresar los genes del operón lac y por tanto no podrán
crecer con lactosa como única fuente de carbono. La transformación
de tales cepas con un alto número de copias de plásmidos que
contienen las secuencias de operador lac de tipo natural valorará el
represor separado del operón lac y permitirán el crecimiento
sobre lactosa.
La glutamina sintetasa es un gen esencial para
las células eucariotas tales como la línea de células de mieloma
NSO (Bebbington et al., (1992) Bio/Technology 10,
169-175) y se usa preferiblemente cuando la célula
huésped es una célula eucariota.
La invención también puede usarse junto con
genes esenciales que codifican para proteínas de replicación o
síntesis de ADN y/o ARN de la célula huésped. Ejemplos de tales
genes con respecto a estas funciones esenciales en bacterias tales
como E. coli y Salmonella se proporcionan en McMacken
et al. (en Escherichia coli y Salmonella
typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Ed. Neidhardt et
al., Amer. Soc. Micro., Wash. D.C., 1987,
págs.564-612), e incluyen, pero no se limitan a,
los siguientes genes: dnaA, dnaB, dnaC, ssb, dnaG, polC (dnaE), dnaQ
(mutD) dnaN, dnaZX, gyrA, gyrB, polA, lig, dnaT, rpoA, rpoB, rpoC,
y rpoD.
Para células huésped administradas a un
organismo receptor, dependiendo de la vía de administración, varios
factores en el entorno local pueden ejercer presión selectiva.
Cuando una capacidad de resistir tal presión está relacionada con
un gen identificado, entonces puede usarse un marcador
seleccionable. Por ejemplo, para células, especialmente células
bacterianas que deben administrarse por vía oral, la resistencia
frente al pH bajo del contenido del estómago constituye una ventaja
selectiva significativa. Entre los genes que se ha mostrado que
están asociados con esto, están el gen uvrA de mutantes de
Streptococcus (Hanna et al, 2001 J. Bacteriol 183:
5964), los genes gadA, B y C de E. coli
(Castanie-Comet y Foster, 2001, Microbiology 147:
709), los genes rpoS, fur, atp y atbR de Salmonella
typhimurium (Baik et al, 1996 Microbiology 142: 3195),
los genes lepA, Frasel, czcA, uvrA, atpF' y
aldo-ceto reductasa de Helicobacter pylori
(Bijlsma et al, 2000, J Infect Dis 182: 1566) y los genes
que codifican para la F_{0}F_{1} ATPasa de Listeria
monocytogenes (Cotter et al 2000 Int J Food Microbiol
60: 137).
Los genes que confieren supervivencia
intracelular (por ejemplo, SvpA en Listeria monocytogenes
Borezee et al, 2001, Microbiology 147:2913) o resistencia
frente a ubicaciones intracelulares particulares tales como
lisosomas también pueden ser útiles en células huésped
apropiadas.
Aunque no se prefiere, la invención también
puede usarse junto con resistencia frente a antibióticos. El gen de
resistencia se construye de tal manera que su expresión está bajo el
control del promotor/operador que se une a la proteína represora
deseada. Entonces se inserta este constructo dentro del cromosoma de
la cepa huésped. La transformación de la cepa con plásmido que
contiene la secuencia de unión a represor valorará el represor del
gen de resistencia frente a antibióticos y permitirá la expresión y
por tanto el crecimiento en presencia de ese antibiótico. Un gen de
resistencia frente a antibióticos es un marcador seleccionable tan
útil que una persona que pone en práctica la invención puede
seleccionar resistencia frente a antibióticos como el gen esencial
del huésped aunque deberá prestarse atención a los efectos
sistémicos sobre el receptor. En este caso, la ventaja de utilizar
el enfoque de valoración de represor operador se basa en la
capacidad del plásmido. El hecho de que el propio gen de
resistencia frente a antibióticos se codifique en el cromosoma de
la célula huésped aumenta el tamaño de inserto que puede clonarse
dentro del plásmido de expresión ORT®.
\newpage
El gen de interés llevado en el plásmido en las
células atenuadas transformadas de la invención puede ser cualquier
gen. El gen puede ser uno que se desea administrar al organismo
receptor debido a su efecto terapéutico. Por ejemplo, puede ser
deseable administrar el gen al organismo receptor para fines de
terapia génica.
Alternativamente, puede ser deseable administrar
el gen al organismo receptor porque el producto de transcripción o
el producto de transcripción y traducción del gen tenga un efecto
terapéutico. Por ejemplo, el producto de transcripción del gen de
interés puede ser un oligonucleótido antisentido o el gen de interés
puede codificar para un antígeno que tiene un efecto terapéutico.
En particular, el gen de interés puede codificar para uno o más
antígenos que provocan una respuesta inmunitaria en el organismo
receptor. Un ejemplo de genes de interés que pueden incluirse en el
plásmido para inducir una respuesta inmunitaria en el organismo
receptor son los genes cafI, caflA y caflM del operón caf.
Cuando se desea que el gen de interés se
transcriba o se transcriba y traduzca, preferiblemente se asocia de
manera funcional con un promotor. Preferiblemente, el promotor es un
promotor eucariota o un promotor bacteriano. La elección del
promotor funcionalmente asociado con el gen de interés y la elección
de la célula huésped determina si el gen de interés se transcribe,
o se transcribe y se traduce, en la célula huésped antes de la
administración al organismo receptor o sólo tras la administración
al organismo receptor.
En algunos casos, puede ser deseable administrar
células huésped que ya expresan a gen de interés, en cuyo caso, el
promotor funcionalmente asociado con el gen de interés se elegirá de
tal manera que sea operacional en la célula huésped y favorezca la
transcripción y traducción del gen de interés en la célula huésped.
Por ejemplo, cuando la célula huésped es una célula bacteriana, el
promotor funcionalmente asociado con el gen de interés en esta
situación puede ser un promotor bacteriano.
En otros casos, puede ser deseable administrar
células huésped que comprenden el plásmido que comprende el gene de
interés al organismo receptor pero retrasar la expresión del gen de
interés hasta después de la administración de las células al
organismo receptor. Por ejemplo, cuando la célula huésped es una
célula bacteriana, el promotor funcionalmente asociado con el gene
de interés en esta situación puede ser un promotor eucariota, que no
favorecerá la transcripción y traducción del gen de interés en la
célula huésped, sino que lo hará tras la administración a un
organismo receptor.
Se prevé que la vacunación con células atenuadas
vivas recombinantes según la invención pueda ser cualquiera de
varias vías de administración. Para Mycobacterium, por
ejemplo, la vía habitual es mediante inyección intradérmica o
subcutánea. Para bacterias entéricas tales como Salmonella,
Shigella o E coli, se prefiere la administración por vía
oral (particularmente de transformantes resistentes al ácido) o
administración por vía rectal. En algunas circunstancias, puede
preferirse la administración por vía mucosa, intravenosa o
intraperitoneal.
Se prevé que pueden usarse varios procedimientos
de administración para aplicaciones distintas de la vacunación.
Además de las vías de administración enteral y
parenteral usadas para la vacunación, la aplicación distinta de
vacunas puede requerir otros procedimientos. Entre ellos está el uso
de depósitos permeables implantables en los que se contienen las
células según la invención.
Se convierte el mutante SL3261 de Salmonella
typhimurium aroA (Oyston et al, 1995, Infect. Immun.
63:563-568; Titball et al, 1997, Infect.
Immun. 63: 563-568) en una cepa que facilita el
mantenimiento de plásmido mediante valoración de
operador-represor (ORT®). Esto implica sustituir un
gen cromosómico esencial con el mismo gen bajo el control del
operador/promotor lac (lacO/P; Williams et al, 1998, Nucleic
Acids Res. 26: 2120-2124). La sustitución del gen
se lleva a cabo usando una estrategia que no deja un gen de
resistencia frente a antibióticos en el cromosoma de SL3261.
El gen dapD codifica para tetrahidrodipicolinato
N-succinil transferasa, que cataliza la conversión
de tetrahidrodipicolinato y succinil-CoA en
N-succinil-\alpha-amino-\varepsilon-cetopimilato
y CoA en la ruta de lisina/diaminopimelato (Richaud et al,
1984, J. Biol. Chem, 259:14824-14828; Gilvarg, 1961,
J. Biol. Chem, 236: 1429-1431). El locus dapD
cromosómico se muestra en la figura 2A. DAP se reticula con el
peptidoglicano en la pared de la célula bacteriana y es un
precursor para la biosíntesis de lisina (Work, 1950, Nature 765:
74-75). Por tanto, los mutantes con dapD alterado
son auxótrofos para DAP y lisina. Ya que la lisina está presente en
el medio rico usado a menudo para hacer crecer E. coli y
S. typhimurium (tal como caldo LB) y DAP no lo está, los
mutantes dapD experimentarán lisis celular a menos que se añada DAP
al medio (Davis, 1952, Nature 169: 534-536). Ya se
ha usado dapD satisfactoriamente como gen ORT® en cepas DH1lacdapD
y DH1lacP2dapD de E. coli (Cranenburgh et al, 2001,
Nucleic Acids Research 29: E26). Por tanto, se usan los constructos
de de lac-dapD de E. coli para complementar
dapD en S. typhimurium.
El constructo con el dapD de E. coli bajo
el control del promotor lac mutado, no rezumante
(lacP2) está presente en el plásmido placPdapD6. El extremo
3' del gen represor de lactosa lacI ya está presente en estos
constructos, de modo que puede clonarse el gen de longitud
completa. Esto es necesario ya que lacI o bien está ausente o bien
no es funcional en S. typhimurium SL3261 (Oyston et
al, 1995, Infect. Immun. 63:563-568 y confirmado
por los inventores). La fuente de este gen es el plásmido pTrc99
(Amersham-Pharmacia), que tiene la mutación de
sobreexpresión lacI^{q}.
Se amplificaron mediante PCR las regiones que
flanquean dapD de S. typhimurium, y se clonaron estos
productos (mostrados en la figura 2B) en plásmidos
pGEM-T Easy (Promega) separados. Entonces se
cortaron estos flancos izquierdo y derecho y se ligaron a un
pTrc99dapD adecuadamente preparado (que tiene
lacO/P-dapD junto a lacI^{q}), a ambos lados
del casete de expresión (es decir, flanqueando a lacI^{q} y
lacO/P-dapD) y en orientación correcta con respecto
al dapD cromosómico. Este procedimiento creó el plásmido
pdapDB(+).
El plásmido de integración se basa en pKO3
(Link, 1997, J. Bacteriol 179: 6228-6237), que
utiliza el gen de levansucrosa sacB de Bacillus subtilis
como contraselección. sacB convierte la sacarosa en un compuesto
tóxico que destruirá las células que contienen pKO3. Se subclona el
casete de sustitución de gen a partir de pdapDB+ en el poliligador
de pKO3, entonces el gen de resistencia a cloramfenicol cat es la
selección para la integración cromosómica inicial mediante un único
acontecimiento de recombinación. La siguiente etapa es la selección
de la resolución del cointegrante en presencia de sacarosa para dar
la eliminación de las secuencias de pKO3 del cromosoma, dejando
sólo la fusión lac-gen. El principio de este
procedimiento se muestra en la figura 1.
1. Clonar las fusiones lac-gen
dentro de pTrc99 adyacentes a lacI^{q}.
2. Amplificar las regiones que flanquean
dapD de ADN cromosómico de S. typhimurium mediante
PCR.
3. Reunir los loci de genes eliminados.
4. Clonar los productos de PCR de loci de genes
eliminados en pGEM-T Easy.
5. Cortar los flancos del gen dapD y
ligarlos a ambos lados de lacI^{q} y
lacO/P-dapD.
6. Cortar el casete de deleción y ligarlo en el
sitio de clonación múltiple de pKO3.
7. Usar este plásmido basado en pKO3 para
insertar el casete lacI^{q} + lac-dapD en el
locus de dapD cromosómico, eliminar el gen de tipo natural en
el procedimiento.
8. Verificar el genotipo de la cepa ORT®
mediante análisis de tipo Southern y PCR, y someter a prueba el
mantenimiento y selección de plásmido mediante ORT®.
1. Cortar pTrc99 (figura 3A) con PfIMI y
extremos romos (con T4 DMA polimerasa).
2. Eliminar el casete de expresión
lacZ-dapD de E. coli de placPdapD6 (figura 3C)
como un fragmento de AfIII-EarI y extremos romos.
3. Ligar para crear pTrc99dapD (figura 3D). Las
orientaciones de dapD y lacI^{q} deben ser
opuestas.
4. Amplificar los flancos en 5' y 3' de
dapD ADN cromosómico de Salmonella typhimurium SL3261
mediante PCR usando cebadores 5STdapD con LST2dapD (producto de PCR
= 2406 pb) y RSTdapD con 3STdapD (producto de PCR = 1361 pb). Los
cebadores flanqueantes (5STdapD y 3STdapD) contienen sitios
SphI y NotI.
5. Clonar ambos flancos dentro de pGEM®-Teasy
(Promega) mostrado en la figura 3B para crear
pGEM-
TeasydapDL(-) (figura 3E) y pGEM-TeasydapDR(-) (figura 3F).
TeasydapDL(-) (figura 3E) y pGEM-TeasydapDR(-) (figura 3F).
6. Cortar el flanco derecho de
pGEM-TeasydapDR(-) (figura 3F) como un fragmento de
NsiI, crear extremos romos y ligarlo dentro de pTrc99dapD
(figura 3D) cortado con Ec/1136II para crear pDRdapD(+)
(figura 3G). Entonces cortar el flanco izquierdo de
pGEM-TeasydapDL(-) (figura 3F) como un fragmento de
NsiI y ligarlo dentro de pDRdapD(+) (figura 3G) cortado con
NsiI para crear pdapDB(+) (figura 3H).
7. Cortar el inserto de pdapDB(+) (figura 3H)
como un fragmento de NotI y ligarlo dentro de pKO3 cortado
con NotI (figura 3I) para crear pKO3dapD (figura 3J) (la
orientación del inserto no es importante).
8. Usar pKO3dapD (figura 3J) para sustituir
dapD de tipo natural con lacZ-dapD en S.
typhimurium SL3261. La cepa resultante es SL3261 dapD.
Sitios de SphI y NotI en negrita,
sitios de NsiI subrayados.
| 5STdapD (39 nt) | |
| CGAATGGCATGCGGCCGCAGCTATTTTTATCAGGATTTG | |
| LST2dapD (35 nt) | |
| GCGAATGCATAGCGGGGGCGACAGCCCCCCTTTGC | |
| 3STdapD (39 nt) | |
| TGTGGGGCATGCGGCCGCAGTGGTCGCACATCGTCGGAC | |
| RSTdapD (46nt) | |
| GCTTTTCACTCGATGCATCTACCCTTTATCGTTTGGATTGAGGGCC |
\vskip1.000000\baselineskip
Un gen alternativo adecuado para su uso en una
cepa ORT® es fabA, que codifica para
3-hidroxidecanoil-ACP deshidrasa,
que cataliza la introducción de un doble enlace en la cadena de
ácido graso en crecimiento en el punto en el que diverge la
biosíntesis de ácido graso insaturado y saturado (Cronan y Rock,
1987, Biosynthesis of membrane lipids. En "Escherichia
coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular
biology". Neidhardt, F.C. (ed.). American Society of
Microbiology, Washington DC). El locus fabA cromosómico se muestra
en la figura 4A. La enzima está presente a una concentración
relativamente alta, y los mutantes fabA experimentan lisis a menos
que se complementen con un ácido graso insaturado, incluso en medio
LB. Esto hace de fabA una elección adecuada para una cepa
ORT®.
Se usa un procedimiento similar al explicado en
el ejemplo 1 para generar una cepa fabA ORT®, pero en vez de
amplificar las dos regiones flanqueantes del gen como productos de
PCR separados, se amplificó mediante PCR una única región que
contenía todo el locus fabA y se clonó. Entonces se cortó fabA y se
sustituyó con el casete lacI^{q} y
lacO/P-fabA. El producto de PCR generado a partir del
locus fabA para el procedimiento de clonación se muestra en la
figura 4B.
1. Cortar pTrc99 (figura 3A) con PflMI y
extremos romos (con T4 ADN polimerasa).
2. Eliminar el casete de expresión
lacZ-fabA de E. coli de placfabA (figura 5E)
como un fragmento de EarI-DraIII y extremos romos.
3. Ligarlo para crear pTrc99fabA (figura 5F)
(las orientaciones de fabA y lacI^{q} deben ser
opuestas).
4. Amplificar el locus fabA de ADN cromosómico
de Salmonella typhimurium SL3261 mediante PCR (Taq
polimerasa) usando los cebadores 5STfabA y 3STfabA (contienen sitios
de SphI y NotI, el producto de PCR tiene 4713 pb).
5. Clonar el producto de PCR dentro de
pCR®2.1-TOPO (Invitrogen), para crear pCR2.1StfabA
(figura 5C).
\newpage
6. Cortar el locus fabA de pCR2.1 (figura 5A)
como un fragmento de NotI y clonarlo dentro de pORT1 (figura
5B) cortado con NotI, para crear pORfabA (figura 5D).
7. Cortar lacZ-fabA y
lacI^{q} de pTrc99fabA (figura 5F) como un fragmento de
SmaI-BsaBI.
8. Cortar pORfabA (figura 5D) con
PmII-BsaBI para eliminar la región codificante
N-terminal de fabA y ligarla al fragmento de
SmaI-BsaBI de pTrc99fabA (figura 5F) para crear
pORlacfabA (figura 5G).
9. Cortar el inserto de pORIacfabA (figura 5G)
como un fragmento de NotI y ligarlo dentro de pKO3 cortado
con NotI para crear pKO3fabA (figura 5H) (la orientación del
inserto no es importante).
10. Usar pKOSfabA (figura 5H) para sustituir el
fabA de tipo natural con lacZ-fabA en S.
typhimurium SL3261. La cepa resultante se denomina SL3261
fabA.
Sitios de SphI y NotI en
negrita.
| 5STfabA(41 nt) | |
| CACCGCGCATGCGGCCGCCCGATGCCAAAGGTATTCGTGTG | |
| 3STfabA(41 nt) | |
| TTTGCAGCATGCGGCCGCGTGTGCAGCGTGACGGGTTAGGC |
\vskip1.000000\baselineskip
Se comparó la tasa de crecimiento de SL3261 en
LB con la de SL3261dapD en LB-IPTG.
Se inocularon tres clones de SL3261 y SL3261dapD
en cultivos de 5 ml y se dejaron crecer durante la noche a 37ºC en
un agitador orbital a 200 rpm. Se usaron los precultivos para
inocular cultivos de 50 ml hasta una densidad óptica de inicio de
0,01 DO_{600} y se realizaron lecturas cada hora (figura 6).
Las curvas de crecimiento no mostraron
diferencia significativa, lo que indica que el crecimiento de la
cepa ORT no se ve afectado de manera adversa por las modificaciones
a dapD.
El plásmido pUC18I (figura 7) tiene el origen de
replicación pMB1 y bla (resistencia frente a la ampicilina)
de pUC18 así como un operador lac palindrómico ideal. El operador
lac activa ORT, permitiendo el crecimiento celular sobre un medio
libre de DAP/IPTG.
Se investigó la estabilidad del plásmido de
pUC18I en SL3261 dapD tal como sigue. Se inocularon tres clones en
50 ml de LB ampicilina (25 \mug/ml) y se incubaron durante la
noche a 37ºC en un agitador orbital a 200 rpm. Se determinó la
densidad óptica y dio los valores para el "día 0", luego se
inocularon 50 ml de LB nuevo en ausencia de ampicilina hasta 0,001
de DO_{600}, se incubaron tal como anteriormente, dando "día
1". El procedimiento se repitió hasta el "día 5".
Las células crecieron aproximadamente 11,6
generaciones al día durante cinco días, de modo que dieron
aproximadamente 59 generaciones a lo largo del experimento. Número
de generaciones cada día = In(DOfinal/DOinicial)/In2.
Para comparar el mantenimiento de plásmido, cada
día se sembraron en placa 10^{-7} DOml en medio permisivo y no
permisivo y se contaron los clones (figura 8).
Se realizó una minipreparación (miniprep) a
muestras diarias de 20 Dml y se examinaron los plásmidos mediante
electroforesis en gel de agarosa. Tal como se muestra en la figura
9, pUC18I es claramente visible en muestras de todos los puntos de
tiempo en un estado sumamente multimerizado (esto se espera ya que
la cepa es competente para la recombinación y el plásmido carece de
sitios correctos para permitir la inversión hasta el estado de
monómero).
Se cultivaron las cepas SL3261, SL3261 (pUC 181)
y SL3261 dapD(pUC 18I) de S. enterica serovar
Typhimurium en caldo LB suplementado con histidina al 1%
(v/v), "aromix" (tirosina 4 mg/ml, fenilalanina 4 mg/ml, ácido
p-aminobenzoico 1 mg/ml, ácido dihidroxibenzoico 1
mg/ml) al 1% (v/v) (para suplementar el genotipo aro his de
SL3261). Se añadió IPTG 0,1 mM a cultivos de
SL3261dapD(pUC18I). Ya que SL3261(pUC18I) y
SL3261dapD(pUC18I) contenían ambas un gen que confiere
resistencia frente a ampicilina, se cultivaron estas cepas en medio
suplementado también con ampicilina 25 \mug/ml. Para producir
inóculos, se cultivó estáticamente S. enterica serovar
Typhimurium durante la noche a 37ºC, luego se centrifugó
(6000 g, 20 min, 4ºC), se lavó una vez en PBS y volvió a
centrifugarse, y volvió a suspenderse en PBS hasta una densidad
celular final de aproximadamente 5 x 10^{9} ufc/ml. Se enumeraron
las bacterias viables sobre placas de agar LB que contenían
IPTG/ampicilina cuando era apropiado.
Se inocularon grupos de 30 ratones Balb/c hembra
por vía intragástrica con dosis de aproximadamente 5x10^{8}
ufc/100 \mul de Salmonella usando una aguja de sonda. En
los días 8, 12 y 16 tras la inoculación, se sacrificaron 10 ratones
mediante dislocación cervical y para cada ratón se extirparon el
bazo y 6 placas de Peyer (PP). El programa usado fue:
Se homogeneizaron el bazo o las o 6 PP en 1 ml
de PBS estéril usando tamices celulares de 50 \mum (Becton
Dickinson Labware) y se sembraron en placas diluciones adecuadas
sobre agar adecuado para su enumeración. Específicamente, SL3261 se
sembró en placas sobre agar LB solo, SL3261(pUC18I) se sembró
en placas sobre agar LB y agar LB que contenía ampicilina, y
SL3261dapD(pUC18I) se sembró en placas sobre agar LB que
contenía IPTG o agar LB que contenía ampicilina.
Se detectaron bacterias viables en los bazos y
pulmones de todos los grupos de ratones inoculados en el experimento
(véase la figura 10). Se realizaron las siguientes
observaciones:
1. SL3261 colonizó los bazos y PP según se
esperaba.
2. SL3261(pUC18I) fue inestable in
vivo. Se detectaron números significativamente inferiores de
SL3261 (pUC 18I) en las placas de LB agar que contenía ampicilina
comparado con placas de agar LB, indicando que se perdió el plásmido
pUC18I de la bacteria.
3. SL3261 dapD(pUC18I) fue estable in
vivo. Se detectaron números similares de
SL3261dapD(pUC18I) sobre palcas de agar LB que contenía IPTG
y placas de agar LB que contenía ampicilina, indicando que el
plásmido pUC 18I estaba estabilizado.
4. Se detectaron SL3261(pUC18I) y
SL3261dapD(pUC18I) (en algunos casos) con números
significativamente inferiores tanto en bazos como PP comparado con
SL3261. Esto puede reflejar la carga sobre la Salmonella de
albergar el plásmido de alto número de copias pUC18I.
1. pUC18I fue inestable en SL3261 in
vivo, pero se estabilizó en SL3261dapD.
2. pUC18I redujo la capacidad de SL3261 y
(algunas veces) de SL3261dapD para colonizar bazos y PP.
3. Es posible que un plásmido con un bajo número
de copias, tal como pAH34L que contiene el operador lac se
estabilice en SL3261dapD, sin efectos perjudiciales sobre la
colonización.
El plásmido pAHL (figura 11) tiene el origen de
replicación pSC101, un operador lac palindrómico ideal así como el
operón termorregulado caf de Yersinia pestis. El
operador lac activa ORT, permitiendo el crecimiento celular en un
medio libre de DAP/IPTG. La expresión a 37ºC y no a 28ºC de los
genes caf1, caf1A y caf1M está controlada por
caf1R. El plásmido pAH34L es el precursor para pAHL y
confiere resistencia frente a kanamicina, pero carece del operador
lac necesario para ORT.
Se comparó el perfil de crecimiento de
SL3261(pAH34L) en LB-kanamicina con el perfil
de crecimiento de SL3261dapD(pAHL) en LB. Se inocularon tres
clones de SL3261(pAH34L) y SL3261dapD(pAHL) en
cultivos de 5ml y se dejaron crecer durante la noche a 37ºC en un
agitador orbital a 200 rpm. Se usaron los precultivos para inocular
cultivos de 50 ml hasta una densidad óptica de partida de 0,01
DO_{600} y se realizaron lecturas cada hora (figura 12). Las
curvas de crecimiento no mostraron diferencia significativa entre
estas dos cepas.
Se investigó la estabilidad del plásmido de pAHL
en SL3261dapD tal como sigue. Se inocularon tres clones en 50 ml de
LB y se incubaron durante la noche a 37ºC en un agitador orbital a
200 rpm. Se determinó la densidad óptica y se obtuvieron valores
para el "día 0", luego se inocularon 50 ml de LB nuevo hasta
0,001 de DO_{600}, se incubaron tal como anteriormente, dando el
"día 1". Se repitió el procedimiento hasta el "día 5".
Las células crecieron aproximadamente 11,6
generaciones al día durante cinco días (aproximadamente 59
generaciones a lo largo del experimento). Número de generaciones
cada día = In(DOfinal/DOinicial)/In2.
Para demostrar el mantenimiento de plásmido,
cada día se sembraron en placas 10^{-7} DOml sobre medio permisivo
y no permisivo y se contaron las colonias. Véase la figura 13.
Se realizó una minipreparación a muestras
diarias de 20 Dml, se examinaron los plásmidos mediante
electroforesis en gel de agarosa. El plásmido es claramente visible
en muestras de todos los puntos de tiempo (figura 14). Todas estas
muestras preparadas a partir de Salmonella muestran una banda
distorsionada pequeña, que está por debajo de la banda
superenrollada, que presumiblemente es ADN desnaturalizado de manera
irreversible.
La cepa SL3261dapD permite la selección de
plásmido libre de antibióticos y el mantenimiento en medio complejo
(LB) de plásmidos de número de copias alto y muy bajo mediante ORT.
La cepa también permite el mantenimiento estable in vivo de
pUC18I en ratones, mientras que se pierde este plásmido de la cepa
SL3261 original.
La cepa SL3261dapD(pAHL) permite la
selección y mantenimiento estable de un plásmido que lleva el operón
caf de Y. pestis. Se ha demostrado que esto es un
candidato de vacuna prometedor, que induce altos niveles de
inmunidad frente a Y. pestis. (Titball et al., 1997,
Infection and Immunity 65: 1926-1930).
Por tanto, la tecnología ORT permitirá la
construcción de cepas recombinantes de Salmonella adecuadas
para su uso para administración de antígenos mediante vacunas
vivas. Estas cepas no necesitarán genes de resistencia frente a
antibióticos para el mantenimiento del plásmido. También tendrán la
ventaja de un nivel superior de expresión de antígeno que sería
posible mediante integración cromosómica del gen del antígeno.
Además, la cepa se convertirá fácilmente para la administración de
diferentes antígenos mediante transformación con plásmidos
apropiados.
Otras realizaciones resultarán evidentes a los
expertos en la técnica. Debe entenderse que la descripción
detallada anterior se proporciona sólo para claridad y meramente a
modo de ejemplo. El alcance de la presente invención no se limita a
los ejemplos anteriores, sino que se define por las siguientes
reivindicaciones.
<110> COBRA THERAPEUTICS LIMITED
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ESTABILIZACIÓN DE PLÁSMIDO IN
VIVO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Documento P033103WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> pct/gb03/02166
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
19-05-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento GB0211459.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
18-05-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> SeqWin99, versión 1.02
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 5STdapD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaatggcat gcggccgcag ctatttttat caggatttg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador LST2dapD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaatgcat agcgggggcg acagcccccc tttgc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador 3STdapD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtggggcat gcggccgcag tggtcgcaca tcgtcggac
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador RSTdapD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttttcact cgatgcatct accctttatc gtttggattg agggcc
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 5STfabA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccgcgcat gcggccgccc gatgccaaag gtattcgtgt g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 3STfabA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgcagcat gcggccgcgt gtgcagcgtg acgggttagg c
\hfill41
Claims (20)
1. Célula bacteriana atenuada transformada para
su uso como un medicamento, conteniendo dicha célula:
a) un plásmido que comprende un gen de interés y
una secuencia de operador susceptible de unirse a un represor,
b) un segundo gen, que codifica para dicho
represor, y que está presente en un cromosoma, y
c) un tercer gen que está presente en el
cromosoma y es esencial para el crecimiento y un operador unido en
cis al tercer gen de tal manera que la expresión del tercer gen es
susceptible a la represión al unirse un represor al operador,
en la que dicho plásmido está presente en dicha
célula en números suficientes para valorar dicho represor de tal
manera que dicho gen esencial se expresa, permitiendo así el
crecimiento celular.
2. Célula transformada según la reivindicación
1, en la que dicho gen no es un gen de resistencia frente a
antibióticos.
3. Célula transformada según la reivindicación 1
o la reivindicación 2, en la que dicha célula transformada es una
enterobacteria.
4. Célula transformada según la reivindicación
3, en la que dicha célula transformada es del género
Salmonella.
5. Célula transformada según la reivindicación
4, en la que dicha célula transformada es de la especie
Salmonella typhimurium.
6. Célula transformada según la reivindicación
4, en la que dicha célula huésped transformada es de la especie
Salmonella typhi.
7. Célula transformada según una cualquiera de
las reivindicaciones 4 a 6, en la que dicha célula transformada se
ha atenuado mediante modificación de su gen aroA, gen
aroC, gen aroD o gen htrA.
8. Célula transformada según la reivindicación
7, en la que dicha célula huésped transformada es de la cepa
Salmonella typhimurium SL3261.
9. Célula transformada según la reivindicación
7, en la que dicha célula huésped transformada es de la cepa
Salmonella typhi CVD908-htr.
10. Célula transformada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho tercer gen contenido en la
célula codifica para una enzima requerida para la síntesis de la
pared de la célula bacteriana.
11. Célula transformada según la reivindicación
10 en la que dicho tercer gen es dapD.
12. Célula transformada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho tercer gen contenido en
dicha célula codifica para una enzima requerida para la síntesis de
ácidos grasos.
13. Célula transformada según la reivindicación
12, en la que dicho tercer gen es fabA.
14. Célula transformada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en la que dicho tercer gen de interés está
funcionalmente asociado con un promotor bacteriano.
15. Célula transformada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en la que dicho tercer gen de interés está
funcionalmente asociado con un promotor eucariota.
16. Célula transformada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho tercer gen de interés
codifica para un antígeno.
17. Célula transformada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en la que el producto de transcripción de
dicho gen de interés es un oligonucleótido antisentido.
18. Uso de una célula transformada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un
medicamento que comprende dicha célula transformada para la
administración de genes.
19. Uso de una célula transformada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un
medicamento que comprende dicha célula transformada para la
inmunización.
20. Composición para su uso como un medicamento
que comprende una célula según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17 y un excipiente, diluyente o tampón
farmacéuticamente aceptables.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0211459.3A GB0211459D0 (en) | 2002-05-18 | 2002-05-18 | Plasmid stabilisation in vivo |
| GB0211459 | 2002-05-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2279963T3 true ES2279963T3 (es) | 2007-09-01 |
Family
ID=9936960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03752862T Expired - Lifetime ES2279963T3 (es) | 2002-05-18 | 2003-05-19 | Estabilizacion de plasmidos in vivo. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1507863B1 (es) |
| AT (1) | ATE349539T1 (es) |
| AU (1) | AU2003232336A1 (es) |
| DE (1) | DE60310708T2 (es) |
| DK (1) | DK1507863T3 (es) |
| ES (1) | ES2279963T3 (es) |
| GB (1) | GB0211459D0 (es) |
| PT (1) | PT1507863E (es) |
| SI (1) | SI1507863T1 (es) |
| WO (1) | WO2003097838A1 (es) |
| ZA (1) | ZA200410202B (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006017857A2 (en) * | 2004-08-13 | 2006-02-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Antibiotic resistance free dna vaccines |
| PT2942391T (pt) | 2004-08-13 | 2018-10-09 | Univ Pennsylvania | Métodos de produção de vacinas não resistentes aos antibióticos |
| NZ596453A (en) * | 2009-05-22 | 2013-09-27 | Merial Ltd | Antibiotic-free plasmid |
| EP2906682B1 (en) | 2012-10-15 | 2025-06-11 | University of Maryland, Baltimore | Bacterial live vector vaccines expressing chromosomally-integrated foreign antigens |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9518395D0 (en) * | 1995-09-08 | 1995-11-08 | Therexsys Ltd | Plasmid stabilization |
| US6780405B1 (en) * | 2000-04-28 | 2004-08-24 | Avant Immunotherapeutics, Inc. | Regulated antigen delivery system (RADS) |
-
2002
- 2002-05-18 GB GBGB0211459.3A patent/GB0211459D0/en not_active Ceased
-
2003
- 2003-05-19 ES ES03752862T patent/ES2279963T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-19 AU AU2003232336A patent/AU2003232336A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-19 PT PT03752862T patent/PT1507863E/pt unknown
- 2003-05-19 DE DE60310708T patent/DE60310708T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-19 SI SI200330720T patent/SI1507863T1/sl unknown
- 2003-05-19 DK DK03752862T patent/DK1507863T3/da active
- 2003-05-19 EP EP03752862A patent/EP1507863B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-19 AT AT03752862T patent/ATE349539T1/de active
- 2003-05-19 WO PCT/GB2003/002166 patent/WO2003097838A1/en not_active Ceased
-
2004
- 2004-12-17 ZA ZA200410202A patent/ZA200410202B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60310708D1 (de) | 2007-02-08 |
| EP1507863B1 (en) | 2006-12-27 |
| ATE349539T1 (de) | 2007-01-15 |
| GB0211459D0 (en) | 2002-06-26 |
| WO2003097838A1 (en) | 2003-11-27 |
| PT1507863E (pt) | 2007-03-30 |
| ZA200410202B (en) | 2006-08-30 |
| DK1507863T3 (da) | 2007-05-07 |
| AU2003232336A1 (en) | 2003-12-02 |
| SI1507863T1 (sl) | 2007-06-30 |
| EP1507863A1 (en) | 2005-02-23 |
| DE60310708T2 (de) | 2007-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6977176B2 (en) | Plasmid maintenance system for antigen delivery | |
| ES2346442T3 (es) | Mantenimiento de plasmido. | |
| AU710494B2 (en) | Plasmid stabilization | |
| ES2279963T3 (es) | Estabilizacion de plasmidos in vivo. | |
| US8076130B2 (en) | Plasmid maintenance system for antigen delivery | |
| US20060135457A1 (en) | Methods for constructing antibiotic resistance free vaccines | |
| HK1101704B (en) | Plasmid maintenance | |
| HK1217108B (en) | Methods for constructing antibiotic resistance free vaccines |