ES2346442T3 - Mantenimiento de plasmido. - Google Patents
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Abstract
Célula huésped procariótica transformada, que contiene: i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento celular, operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante de ARNII o una parte del mismo, y ii) un plásmido que comprende un origen de replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNI o una parte del mismo, en la que la unión de la secuencia antisentido codificada por ARNI a ARNm transcrito a partir de ARNII inhibe la acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el crecimiento celular.
Description
Mantenimiento de plásmido.
La invención se refiere a un sistema para el
mantenimiento estable de un plásmido, a células huésped para la
utilización en dicho sistema y a métodos de utilización del sistema
para obtener un plásmido que resulta útil en aplicaciones
médicas.
Se utilizan rutinariamente plásmidos en la
preparación de proteínas recombinantes y en la preparación de ADN
con fines de terapia génica. El mantenimiento estable de un plásmido
en una célula huésped resulta importante para la preparación
eficiente de estos productos. Sin embargo, el ADN extracromosómico
alojado en células huésped es inherentemente inestable debido a la
carga metabólica incrementada para las células que contienen el
plásmido en comparación con células que se encuentran libres de
plásmido. Para mantener la estabilidad del plásmido y reducir la
carga metabólica, se han manipulado los plásmidos para que contengan
marcadores seleccionables dominantes.
El método convencional de mantenimiento de
plásmidos en células en cultivo es incluir un gen de resistencia a
antibiótico en el plásmido y cultivar las células en presencia del
antibiótico apropiado. Para las células o plásmidos destinados al
uso terapéutico, lo anterior presenta la desventaja de que la
utilización de un plásmido que contenga el gen de resistencia a
antibiótico puede construir a la extensión de resistencias a
antibióticos.
Se han intentado algunos métodos de
mantenimiento de plásmido para explotar los mecanismos naturales de
eliminación posteriores a la segregación controlados por genes del
plásmido. Por ejemplo, los sistemas hok/sok, srnB y
pnd implican una proteína asesina codificada por un ARNm
estable y regulado por un ARN antisentido inestable pequeño que se
une al ARN asesino y lo inactiva. El ARN asesino resulta retenido en
segregantes sin plásmido tras degradarse el ARN y se traduce en la
proteína letal. Se investigó el mantenimiento de plásmido utilizando
el sistema hok/sok en la cepa de vacuna de vector vivo
Salmonella typhi CDV 908 htr-A (Galen et
al., Infect. Immunol. 67:6424-6433, 1999). Sin
embargo, dichos mecanismos de eliminación posteriores a la
segregación no permiten la selección de plásmidos tras la
transformación y por lo tanto todavía dependen de la presencia de
un gen de resistencia a un antibiótico en el plásmido.
Se han desarrollado algunos métodos alternativos
de mantenimiento y selección de plásmidos sin selección con
antibióticos, en los que el plásmido codifica un gen que complementa
una auxotrofia de la célula huésped. Por ejemplo, una célula
huésped puede ser una célula mutante que es capaz de sintetizar un
metabolito aminoácido esencial y que únicamente puede sobrevivir en
medio que no incluye el aminoácido en presencia de un plásmido que
comprenda un gen codificante del elemento que falta para la síntesis
de dicho aminoácido (Wang M-D et al., J.
Bacteriol. 169:5610-5614, 1987). Sin embargo, este
enfoque limita la composición del medio de cultivo, debido a que
debe omitirse el aminoácido. Un método alternativo, que puede
utilizarse en medios complejos, utiliza una célula huésped mutante
con un gen de ARNt sintetasa termosensible que únicamente puede
sobrevivir a temperaturas no permisivas en el caso de que un
plásmido que comprenda el gen de la ARNt sintetasa de tipo salvaje
se encuentre presente (Skogman et al., Gene
31:117-122, 1984). Otro método de selección utiliza
un gen de ARNt transportado por el plásmido para complementar
mutaciones sin sentido en genes cromosómicos esenciales en una
célula huésped mutante (Zengel et al., J. Bacteriol.
145:459-465, 1981). Alternativamente, puede
introducirse en el cromosoma huésped un gen que incrementa la carga
metabólica de la célula, tal como el operón pil, de manera
que la célula huésped únicamente sobreviva en presencia de un
plásmido codificante de la proteína represora correspondiente
(Ogden et al., Biotech. Bioeng. 40:1027-1038,
1992).
La patente EP nº 0851932 describe un método de
mantenimiento dentro de células huésped en cultivo in vitro
por medio de la titulación de represor de operador. El método
implica manipular una célula huésped de manera que contenga un
primer gen cromosómico codificante de un represor y un segundo gen
cromosómico esencial para el crecimiento de la célula que presenta
una secuencia de operador para el represor en su región de control.
En ausencia de un plásmido, la expresión del segundo gen cromosómico
resulta inhibida por la unión del represor al operador y la célula
muere. Los plásmidos para el mantenimiento en esta célula huésped se
manipulan para contener la secuencia de operador, de manera que, en
presencia del plásmido, se reduce el título del represor respecto
al operador para el gen que resulta esencial para el crecimiento
celular, por lo que el gen se expresa y la célula sobrevive. Este
mecanismo también se describe en Williams et al. (Nucleic
Acids Research 26(9):2120-2124, 1999), y en
Cranenburgh et al. (Nucleic Acid Research
29(5):e26-e27, 2001).
Aunque se conocen algunos mecanismos de
mantenimiento y selección de plásmidos que no se basan en la
selección con antibióticos, sigue existiendo una necesidad de
desarrollar métodos adicionales en vista de la creciente
importancia de los plásmidos para la producción de ADN y de
proteínas recombinantes para aplicaciones terapéuticas. Además, los
sistemas de mantenimiento y selección de plásmidos desarrollados
hasta hoy requieren la utilización de plásmidos que han sido
especialmente modificados para la utilización en estos sistemas.
Sigue existiendo una necesidad de un sistema de mantenimiento y
selección de plásmidos que no implique la utilización de
resistencias a antibióticos y que utilice plásmidos que sean
comunes de la técnica y que no requieran ninguna modificación
especial.
D1 da a conocer una célula bacteriana que
presenta un gen cromosómico productor de una sustancia tóxica
(incluyendo el producto del gen hok) y un plásmido
codificante de una sustancia que neutraliza la acción del gen
cromosómico, incluyendo el antisentido codificante por el gen
sok. Asimismo, D1 da a conocer un método de mantenimiento de
un plásmido en dicha célula en cultivo, composiciones farmacéuticas
que comprenden dicha célula huésped y métodos para administrar
dichas composiciones en un paciente para la inmunización o para la
teoría.
D2 es una revisión de ARNs antisentido en
plásmidos, haciendo referencia a mecanismos de eliminación
posteriores a la segregación, incluyendo hok/sok,
par, ARNI y ARNII.
D3 da a conocer plásmidos que comprenden un
sistema de mantenimiento de plásmidos basado en un sistema de
eliminación posterior a la segregación (por ejemplo sok/hok,
ARNI/ARNII y par).
D4 da a conocer un sistema para la
estabilización de un plásmido que utiliza el sistema de titulación
del represor; D4 da a conocer la utilización de los genes
DapD y LacI en este sistema.
Según un primer aspecto de la invención, se
proporciona una célula huésped procariótica transformada que
contiene:
i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento
celular, operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante
de ARNII o una parte del mismo, e
ii) un plásmido que comprende un origen de
replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNI o
una parte del mismo,
en el que la unión de la secuencia antisentido
codificada por ARNI a ARNm transcrito a partir de ARNII inhibe la
acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el
crecimiento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un segundo aspecto de la invención, se
proporciona una célula huésped procariótica transformada que
contiene:
i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento
celular, operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante
de ARNI o una parte del mismo, e
ii) un plásmido que comprende un origen de
replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNII o
una parte del mismo,
en el que la unión de la secuencia antisentido
codificada por ARNII a ARNm transcrito a partir de ARNI inhibe la
acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el
crecimiento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "secuencia antisentido" se refiere a una secuencia
de ácidos nucleicos que es sustancialmente complementaria a su
secuencia diana y presenta la capacidad de hibridarse
específicamente a dicha secuencia diana. Preferentemente, la
secuencia antisentido codificada por el plásmido se hibrida a su
secuencia diana bajo condiciones astringentes. Las condiciones de
hibridación de alta astringencia se definen como la incubación
durante la noche a 42ºC en una solución que comprende formamida al
50%, 5XSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50
mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y 20
microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y
desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 0,1XSSC a
aproximadamente 65ºC.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "crecimiento celular" se refiere a un número
creciente de células en un medio de cultivo durante el tiempo, y a
la supervivencia celular, en la que el número de células vivas no
se reduce durante el tiempo. La expresión "inhibe el crecimiento
celular" se refiere a que el gen cromosómico es letal para la
célula, de manera que el número de células vivas en un medio de
cultivo se reduce durante el tiempo, o a que impide el crecimiento
celular, de manera que el número de células en un medio de cultivo
no se incrementa durante el tiempo.
El crecimiento de la célula huésped transformada
según el primer o segundo aspecto de la invención depende de la
presencia del plásmido, resultando en la selección de las células
que mantienen el plásmido. En el caso de que se pierda el plásmido
de la célula huésped, la acción del gen cromosómico ya no resultará
bloqueada por la secuencia de ARNI o ARNII codificada por el
plásmido y el crecimiento celular resulta inhibido. En algunas
realizaciones, únicamente puede resultar necesaria una única copia
del plásmido para la expresión del gen cromosómico que deben
inhibirse, permitiendo de esta manera el crecimiento celular. En
otras realizaciones, puede resultar necesario que el plásmido se
encuentre presente en múltiples copias para que resulte inhibida la
expresión del gen cromosómico.
\newpage
El gen cromosómico puede inhibir el crecimiento
celular directamente. Por ejemplo, la transcripción y traducción
del gen cromosómico pueden producir una proteína que resulta letal
para la célula, tal como una toxina. Alternativamente, el gen
cromosómico puede inhibir el crecimiento celular indirectamente. Por
ejemplo, la transcripción y traducción de un gen cromosómico pueden
producir una proteína represora que inhibe la transcripción y
traducción de una proteína que resulta esencial para el crecimiento
celular codificado por un segundo gen cromosómico. La transcripción
del gen cromosómico también puede producir una secuencia antisentido
que inhibe la transcripción y/o traducción de un segundo gen
cromosómico esencial para el crecimiento celular mediante la unión
al segundo gen cromosómico o mediante la unión a ARNm transcrito a
partir del segundo gen cromosómico.
En algunas realizaciones, el gen cromosómico
puede inhibir el crecimiento celular mediante una cascada de
reacciones más complicada. Por ejemplo, el gen cromosómico puede
codificar una proteína activadora que activa la expresión de un
segundo gen cromosómico que, a su vez, codifica una proteína
represora que inhibe la expresión de un tercer gen cromosómico
codificante de una proteína esencial para el crecimiento celular.
Alternativamente, el primer gen cromosómico puede codificar un
inhibidor antisentido de un segundo gen cromosómico que, a su vez,
codifica una proteína represora que reprime la expresión de un
tercer gen cromosómico codificante de una proteína que inhibe el
crecimiento celular. Dichas cascadas pueden incluir más de tres
genes cromosómicos. Por ejemplo, pueden incluir 4, 5, 6, 7 ó más
genes cromosómicos. En la totalidad de dichas cascadas, la ausencia
de un plásmido para inhibir el primer gen cromosómico conduce a que
el primer gen cromosómico inicie una reacción de cascada que
finalmente resulta en la inhibición del crecimiento celular. Se
proporcionan en la presente memoria ejemplos de genes cromosómicos
adecuados que inhiben el crecimiento celular.
La célula huésped transformada según la
invención preferentemente se utiliza para el mantenimiento de
plásmidos destinados al uso terapéutico. Por consiguiente, resulta
preferente que el plásmido incluya un sitio de clonación para la
inserción de un gen de interés. Preferentemente, el plásmido
comprende además un gen de interés. El gen de interés
preferentemente puede expresarse en una célula de mamífero,
preferentemente en una célula humana. El gen de interés puede
expresar un ARN de interés o una proteína de interés para el uso
terapéutico. Son conocidos de la técnica ejemplos de dichos genes
de interés que pueden incluirse en el plásmido.
La secuencia antisentido codificada por el
plásmido puede inhibir la acción del gen cromosómico mediante la
unión al gen cromosómico mismo, inhibiendo de esta manera la
transcripción del gen. Alternativamente, la secuencia antisentido
codificada por el plásmido puede inhibir la acción del gen
cromosómico mediante la unión a ARNm transcrito a partir del gen
cromosómico. Dependiendo de la naturaleza del gen cromosómico, la
unión a ARNm transcrito a partir del gen cromosómico puede inhibir
la traducción del gen cromosómico o puede impedir la unión de una
secuencia antisentido codificada por el gen cromosómico a su
diana.
En una realización preferente del primer aspecto
de la invención, una secuencia reguladora se encuentra operablemente
ligada al gen cromosómico. La expresión "operablemente ligada"
se refiere a que la secuencia reguladora se une dentro del mismo
marco del gen cromosómico de manera que se transcribe
simultáneamente al gen cromosómico. Preferentemente, la secuencia
reguladora se liga operablemente cadena arriba del gen cromosómico.
Sin embargo, la región reguladora alternativamente puede ligarse
operablemente cadena abajo del gen cromosómico. En el caso de que
la secuencia reguladora se ligue operablemente cadena arriba del gen
cromosómico, preferentemente se inserta en el sitio de unión
ribosómica. Alternativamente, la secuencia reguladora puede
insertarse cadena arriba del sitio de unión ribosómica. El gen
cromosómico o el gen cromosómico operablemente ligado a un gen
regulador puede encontrase bajo el control de un promotor
constitutivo o de un promotor inducible. Preferentemente, el gen
cromosómico, o el gen cromosómico operablemente ligado a un gen
regulador, se encuentra bajo el control de un promotor
constitutivo.
La secuencia antisentido codificada por el
plásmido puede inhibir la acción del gen cromosómico mediante la
unión a la secuencia reguladora o mediante la unión a ARNm
transcrito a partir de la secuencia reguladora. En la presente
realización de la invención, la secuencia antisentido codificada por
el plásmido se encuentra codificada por la replicación del origen
del plásmido, y en ARNI o ARNII.
Todos los orígenes de replicación de plásmido
producen ARN transcrito. En algunos casos, el ARN transcrito desde
el origen de replicación de un plásmido se utiliza directamente en
la regulación de la replicación (por ejemplo en los plásmidos R1,
RK6, pT181, pMV158 y pIP501).
Según la invención, la secuencia antisentido
codificada por el plásmido es ARNI y la secuencia reguladora cadena
arriba del gen cromosómico codifica ARNII o una parte del mismo, o
alternativamente, la secuencia antisentido codificada por el
plásmido es ARNII y la secuencia reguladora cadena arriba del gen
cromosómico codifica ARNI o una parte del mismo.
ARNI y ARNII son dos transcritos de ARN
solapantes codificados por el origen de replicación prácticamente
en la totalidad de los plásmidos utilizados en investigación y
comercialmente. ARNII ceba el inicio de la síntesis del ADN de
plásmido, permitiendo que tenga lugar la replicación autónoma del
plásmido en E. coli. ARNI es el inhibidor antisentido de
ARNII e impide el exceso de replicación del plásmido, garantizando
que el número de copias del plásmido no exceda un número que la
célula huésped sea capaz de soportar. Ahora se ha encontrado que
este mecanismo antisentido puede explotarse para estimular el
mantenimiento del plásmido en una célula huésped procariótica
transformada.
Según la presente realización, la invención
proporciona una célula huésped procariótica transformada, que
contiene:
i) una región codificante de ARNII, o una parte
de la misma operablemente ligada a un gen cromosómico, en el que el
gen cromosómico inhibe el crecimiento celular, e
ii) un plásmido que comprende una región
codificante de ARNI o una parte de la misma,
en el que ARNI transcrito a partir de dicha
región codificante de ARNI, o parte de la misma, se une a ARNII
transcrito a partir de dicha región codificante de ARNII o de parte
del mismo, inhibiendo la acción del gen cromosómico y permitiendo
de esta manera el crecimiento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La región codificante de ARNI, o una parte de la
misma, operablemente ligada al gen cromosómico se transcribe
resultando en un ARNI-ARNm de gen cromosómico. En
ausencia del plásmido codificante de ARNII, resulta inhibido el
crecimiento celular. El crecimiento celular puede ser inhibido por
la unión de ARNI-ARNm del gen cromosómico a un
segundo gen cromosómico esencial para el crecimiento celular o a
ARNm transcrito a partir de dicho segundo gen cromosómico.
Alternativamente, el ARNI-gen cromosómico puede
traducirse y el crecimiento celular puede inhibirse como resultado
de una proteína tóxica codificada por el gen cromosómico o como
resultado de que una proteína represora codificada por el gen
cromosómico inhibe un segundo gen cromosómico esencial para el
crecimiento celular. En el caso de que se encuentre presente el
plásmido, ARNII transcrito a partir del plásmido se une a ARNI en
ARNI-ARNm de gen cromosómico, impidiendo que el gen
cromosómico inhiba el crecimiento celular.
Todos los plásmidos producen ARN transcrito a
partir del origen de replicación y la mayoría de los plásmidos
disponibles comercialmente contienen un origen de replicación que
comprende una región codificante de ARNI y una región codificante
de ARNII. Al contrario que el sistema dado a conocer en la patente
EP nº 0851932, en el que el mantenimiento del plásmido depende de
la clonación de un sistema operador lac en los plásmidos
utilizados, la presente invención permite el mantenimiento en
células huésped transformadas de cualquier plásmido disponible
comercialmente que comprenda cualquier origen de replicación, además
de la selección de células huésped que mantengan estos plásmidos
sin necesidad de clonar ninguna secuencia adicional en los
plásmidos. Lo anterior presenta la ventaja de que se reduce el
tamaño del plásmido, incrementando la dosis eficaz del mismo en
aplicaciones de vacuna de ADN y de terapia génica. La eliminación
del ADN bacteriano innecesario también reduce el riesgo de
respuesta inmunológica contra los dinucleótidos CpG.
Además, puede conseguirse el mantenimiento de un
plásmido sin necesidad de selección antibiótica. Por lo tanto, los
plásmidos no requieren la presencia de un gen de resistencia a un
antibiótico. La ausencia de un gen de resistencia a un antibiótico
en el plásmido presenta varias ventajas, particularmente en
situaciones en las que el plásmido, o producto codificado por el
plásmido, se destina a la utilización terapéutica. En primer lugar,
la ausencia de un gen de resistencia a un antibiótico en el plásmido
elimina el riesgo de la transferencia de genes de resistencia a
antibióticos a organismos en el medio ambiente, incluyendo a
patógenos potenciales. También evita la contaminación de plásmidos
aislados de las células con antibióticos residuales utilizados para
la selección de plásmidos, y de esta manera eliminar el requisito de
someter a ensayo los plásmidos para la presencia de antibióticos
residuales y el riesgo de que genes de resistencia a antibiótico
provoquen efectos negativos en células del paciente. El hecho de
que la selección no depende de la resistencia a antibióticos evita
el problema de la falta de presión selectiva de plásmidos debido a
la degradación de los antibióticos durante el cultivo.
Entre los plásmidos para la utilización en la
invención se incluyen plásmidos en los que el ARN transcrito a
partir del origen de replicación se utilizan directamente en la
regulación de la replicación, tales como R1, RK6, pT181, pMV158 y
pIP501. Los plásmidos para la utilización en la invención comprenden
un origen de replicación que comprende una región codificante de
ARNI y una región codificante de ARNII. Entre los plásmidos que
comprenden un origen de replicación que comprende una región
codificante de ARNI y una región codificante de ARNII se incluyen
los plásmidos que comprende un ori tipo ColE1, tal como
ori colE1 y ori pMB1.
La región codificante de ARNII, la región
codificante de ARNI, o una parte de cualquiera de los mismos
operablemente ligado a un gen cromosómico que inhibe el crecimiento
celular puede encontrarse bajo el control de un promotor
constitutivo o de un promotor inducible. Preferentemente, la región
codificante de ARNII, la región codificante de ARNI o una parte de
cualquiera de las mismas operablemente ligado a un gen cromosómico
que inhibe el crecimiento celular se encuentra bajo el control de
un promotor constitutivo. Son conocidos de la técnica algunos
promotores constitutivos adecuados y entre ellos se incluyen, por
ejemplo, los promotores que contienen las secuencias -35 y -10 del
promotor de E. coli, tales como el promotor trc.
Según un segundo aspecto de la invención, se
proporciona una célula huésped procariótica que comprende un gen
cromosómico que inhibe el crecimiento celular operablemente ligado a
una secuencia reguladora situada cadena arriba del gen cromosómico,
en el que la secuencia reguladora comprende una región codificante
de ARNI o una parte de la misma, o una región codificante de ARNII
o una parte de la misma. La región codificante de ARNII, la región
codificante de ARNI o una parte de las mismas operablemente ligada a
un gen cromosómico que inhibe el crecimiento celular puede
encontrarse bajo el control de un promotor constitutivo o de un
promotor inducible. Preferentemente, la región codificante de
ARNII, la región codificante de ARNI o una parte de cualquiera de
las mismas operablemente ligado a un gen cromosómico que inhibe el
crecimiento celular bajo el control de un promotor constitutivo.
Son conocidos de la técnica promotores constitutivos adecuados y
entre ellos se incluyen, por ejemplo, promotores que contienen las
secuencias -35 y -10 del promotor de E. coli, tal como el
promotor trc.
La célula huésped procariótica según dicho
segundo aspecto de la invención puede transformarse con un plásmido
que comprende una región codificante de ARNI y una región
codificante de ARNII para producir una célula huésped procariótica
transformada según el primer aspecto de la invención.
La célula huésped procariótica y las células
huésped procarióticas transformadas de la invención pueden
cultivarse in vitro. Se proporcionan en la presente memoria
ejemplos de células huésped procarióticas adecuadas.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método de mantenimiento de un plásmido en una célula
huésped procariótica in vitro, que comprende la etapa de
cultivar una célula huésped procariótica transformada tal como se
ha indicado anteriormente, bajo condiciones suficientes para
permitir que dicha célula crezca. Este método permite llevar a cabo
el mantenimiento y selección de un plásmido en ausencia de
resistencias a antibiótico, convirtiéndolo en particularmente
adecuado para la producción de plásmido de ADN o proteínas
recombinantes para aplicaciones terapéuticas. Según otro aspecto de
la invención, se proporciona un método para producir un plásmido de
ADN o proteínas recombinantes para aplicaciones terapéuticas. Según
otro aspecto de la invención, se proporciona un método para
producir un plásmido de ADN que comprende llevar a cabo el método
de la invención indicado anteriormente y aislar el plásmido de ADN.
Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un
método para producir una proteína recombinante que comprende
cultivar una célula huésped procariótica transformada que comprende
un plásmido codificante de una proteína de interés según el método
indicado anteriormente y aislar la proteína de la célula.
Las células huésped procarióticas transformadas
y las células huésped procarióticas de la invención pueden
presentar ellas mismas aplicaciones terapéuticas. Según otro aspecto
de la invención, se proporciona una célula huésped procariótica
transformada según la invención para la utilización en terapia.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula
huésped procariótica transformada según la invención conjuntamente
con un excipiente, diluyente o tampón farmacéuticamente aceptable,
tal como es bien conocido para el experto en la materia relevante.
Según una realización del presente aspecto, la composición
farmacéutica es una composición de vacuna. La composición de vacuna
puede comprender uno o más adyuvantes además del excipiente,
diluyente o tampón.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona la utilización de una célula huésped procariótica
transformada según la invención en la preparación de un
medicamento. Preferentemente, la célula huésped procariótica
transformada puede utilizarse como un sistema de administración
génica. Por ejemplo, la célula huésped procariótica transformada
puede utilizarse para administrar un gen de interés en el plásmido
con fines de terapia génica. La célula procariótica transformada
también puede utilizarse para administrar un gen de interés en el
plásmido, el producto de transcripción del cual presenta un efecto
terapéutico, tal como un oligonucleótido antisentido, o para
administrar un gen de interés que codifica una proteína que presenta
un efecto terapéutico.
Alternativamente, la célula huésped procariótica
transformada puede utilizarse para administrar un inmunógeno. Según
esta realización, un gen de interés en el plásmido puede codificar
uno o más antígenos que inducen una respuesta inmunológica. El
experto en la materia conocerá genes de interés que codifican
antígenos que inducen una repuesta inmunológica y que pueden
incluirse en el plásmido en la célula procariótica transformada de
la invención.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método de tratamiento que comprende administrar en
un paciente las células huésped procarióticas transformadas
indicadas anteriormente, o una composición que comprende las
mismas. En particular, se proporciona un método de administración de
un gen de interés en un paciente, que comprende administrar en el
paciente las células huésped procarióticas transformadas indicadas
anteriormente o una composición que comprende las mismas. Tal como
se ha indicado anteriormente, un gen de interés en el plásmido en
la célula huésped procariótica transformada puede resultar útil por
sí mismo con fines de terapia génica, o el producto de
transcripción o de transcripción y traducción del gen de interés
puede presentar propiedades terapéuticas.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método para inmunizar un paciente contra una
enfermedad causada por un patógeno, que comprende administrar en el
paciente las células huésped procarióticas transformadas indicadas
anteriormente o una composición que comprende las mismas, en el que
un gen de interés presente en el plásmido en las células codifica
un antígeno que induce una respuesta inmunológica contra el
patógeno. El antígeno puede expresarse en las células antes de
administrarlas en el paciente, o las células que contienen el
plásmido pueden administrarse en el paciente expresándose el
antígeno en el paciente tras la administración, dependiendo de la
naturaleza de las células y del promotor que contra la expresión del
gen de interés. Preferentemente, el gen de interés se encuentra
funcionalmente ligado a un promotor bacteriano o a un promotor
eucariótico.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para mantener un plásmido en una célula
huésped in vivo, que comprende suministrar una célula
huésped procariótica transformada según al invención a un organismo
receptor. Preferentemente, el organismo receptor es un mamífero,
preferentemente un ser humano. Según este aspecto de la invención,
el gen cromosómico preferentemente inhibe el crecimiento celular
in vivo, de manera que únicamente las células huésped
procarióticas que mantienen el plásmido sobrevivirán in vivo
en el organismo receptor. Por ejemplo, el gen cromosómico puede
codificar una proteína represora de un segundo gen cromosómico que
codifica una proteína que resulta esencial para la integridad de la
célula.
Posteriormente se proporcionan ejemplos de
plásmidos, de genes de interés transportados por lo mismos, de
células huésped procarióticas y de genes cromosómicos que inhiben el
crecimiento celular para la utilización en la invención, así como
información sobre aplicaciones médicas de las células huésped
transformadas de la invención.
El gen cromosómico incluido en las células
huésped procarióticas y en las células huésped procarióticas
transformadas de la invención puede ser cualquier gen que inhiba el
crecimiento.
- \bullet
- Genes cromosómicos que inhiben el crecimiento directamente.
Entre los genes cromosómicos preferentes que
inhiben el crecimiento celular directamente se incluyen genes
codificantes de toxinas. Entre los ejemplos de genes codificantes de
toxinas que pueden utilizarse en la invención se incluyen el gen
sacB de B. subtilis, CcdB codificado por ccdB
en el plásmido F de E. coli, la proteína Kid codificada por
el gen parD del plásmido RK2, los genes de endonucleasa de
restricción y los genes de antibiótico.
- \bullet
- Genes cromosómicos que inhiben el crecimiento indirectamente mediante la inhibición de genes esenciales para el crecimiento.
Entre los genes cromosómicos preferentes que
inhiben el crecimiento indirectamente se incluyen los genes
cromosómicos codificantes de una proteína represora que inhibe un
segundo gen cromosómico esencial para el crecimiento celular y
genes cromosómicos codificantes de una secuencia antisentido que
inhibe un segundo gen cromosómico esencial para el crecimiento
celular. En una realización de la invención, el segundo gen
cromosómico resulta condicionalmente esencial para el crecimiento
celular.
En el caso de que el gen cromosómico codifique
una proteína represora, el segundo gen cromosómico preferentemente
se liga operablemente a un operador y promotor que son
convencionalmente inhibidos por dicho represor.
Por ejemplo, en el caso de que el gen
cromosómico codifique la proteína represora LacI, el segundo gen
cromosómico esencial para el crecimiento celular preferentemente se
encuentra operablemente ligado a un operador y promotor lac.
El represor lac de E. coli se describe en "The Lactose
Operon", J. Beckwith, en: Escherichia coli and
Salmonella typhimurium, editores, J.L. Ingraham et
al., Amer. Soc. Micro., páginas 1444-1452,
1987, y Dickson et al., Science 187:27-35,
1975. El operón lac se regula de la manera siguiente. Bajo
condiciones no inductoras (tal como el crecimiento en glucosa), LacI
se une al operador del operón lac y evita la transcripción
de la b-galactosidasa (LacZ), la lactosa permeasa
(LacY) y una transacetilasa (LacA). Bajo condiciones inductoras
(tal como el crecimiento en lactosa o la adición de IPTG, un análogo
no metabolizable), el represor ya no se une al operador y se
produce la transcripción. La expresión del operón se detecta
fácilmente mediante el ensayo de la
b-galactosidasa.
Entre otros sistemas represoras útiles según la
presente invención se incluyen el sistema represor tet para la
utilización en la regulación de la actividad génica en células
eucarióticas (Gossen et al., Current Opinions in
Biotechnology 5:516-520, 1994). El sistema represor
tet se ha utilizado en levaduras, Dictiostelium, células
vegetales y plantas del tabaco. Un sistema represor adicional útil
según la presente invención es el sistema represor ArgRNV (Burke
et al., Mol. Microbiol. 13:609-618, 1994). El
represor ArgR normalmente sólo se une a su operador en presencia de
arginina. Sin embargo, el represor ArgRNV mutante se une al operador
en ausencia de arginina y permanece unido en presencia de arginina
y presenta un efecto transdominante. Un sitio de unión (operador) a
ArgR idealizado que presenta dos cajas Arg simétricas, puede
introducirse artificialmente en el plásmido de interés para
permitir reducir el número de ArgRNV respecto a un gen esencial cuya
expresión se encuentra controlada por el sitio de unión a ArgR.
El represor trp de E. coli también
resulta útil según la invención (ver "The tryptophan Operon",
Yanofsky y Crawford, en: Escherichia coli and Salmonella
typhimurium, editores, J.L. Ingraham et al., Amer. Soc.
Micro., páginas 1453-1472, 1987). El represor trp se
encuentra presente en un número de copia de aproximadamente 50
copias/célula, y requiere la presencia de triptófano en el medio de
fermentación como inductor de la unión de represor.
El represor galR de E. coli resulta útil
según la invención (ver "The Galactose Operon", S. Adhya, en:
Escherichia coli and Salmonella typhimurium, editores,
J.L. Ingraham et al., Amer. Soc. Micro., páginas
1503-1512, 1987).
El represor araC de E. coli también
resulta útil según la invención (ver "The
L-Arabinose Operon", R. Schlief, en:
Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Amer.
Soc. Micro., páginas 1473-1481, 1987; Dunn et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:5017-5020, 1984).
El represor araC presenta una afinidad de unión incrementada en
presencia de arabinosa.
Finalmente, el represor A resulta útil según la
invención (Introduction to Lambda Phages, en: Current Protocols in
Molecular Biology, editores, Ausubel et al., 1994, sección
III, unidad 1.9; Hochschild et al., Cell
47(5):807-816, 1986).
El segundo gen cromosómico esencial para el
crecimiento celular puede ser un gen codificante de productos
relacionados con la biosíntesis de metabolitos celulares, un gen
cuyos productos se encuentran implicados en el metabolismo del
carbono, o un gen codificante de la biosíntesis o la regulación de
macromoléculas, por ejemplo un gen esencial para la síntesis de ADN
y/o ARN, y funciones de replicación de la célula huésped.
Determinados genes codificantes de enzimas
implicados en el suministro de componentes celulares, en particular
en el suministro de precursores de la pared celular, resultan
esenciales para el crecimiento de la célula huésped procariótica y
resultan útiles según la invención. Por ejemplo, la pared celular
bacteriana contiene ácido meso-diaminopimélico
(DAP), y la incapacidad para sintetizar este componente resulta en
la lisis celular. Los genes en la ruta biosintética de DAP, es
decir los genes dapA, dapB, dapC, dapD y
dapE, pueden utilizarse, por lo tanto, como el segundo gen
cromosómico esencial para el crecimiento celular que resulta
inhibido por el primer gen cromosómico. Los genes dapA y
dapB han sido clonados y secuenciados, y dapB se
encuentra disponible en forma de cistrón único (Richaud et
al., J. Bacteriol. 166:297-300, 1986; Bouvier
et al., J. Biol. Chem. 259:14829-14834,
1984).
Los genes implicados en la biosíntesis de otros
componentes de la pared celular, tales como la biosíntesis de la
D-alanina, también resultan útiles según la
invención (Walsh, J. Biol. Chem.
264(5):2393-2396, 1989).
Los genes implicados en la biosíntesis de los
ácidos grasos también resultan útiles según la invención. Un
ejemplo es fabA, que codifica la
3-hidroxidecanoil-ACP deshidrasa,
responsable de la introducción de un doble enlace en la cadena de
ácidos grasos en crecimiento en el punto en que diverge la
biosíntesis de ácidos grasos insaturados y saturados (Cronan Jr.
J.E. y Rock C.O., Biosynthesis of membrane lipids, en:
"Escherichia coli and Salmonella typhimurium:
cellular and molecular biology", Neidhartdt F.C. (editor),
American Society of Microbiology, Washington D.C., 1987). El enzima
se encuentra presente a una concentración relativamente alta y los
mutantes de fabA lisan a menos que se suplementen con ácidos
grasos insaturados.
Alternativamente, el segundo gen cromosómico
esencial para el crecimiento celular puede ser un gen implicado en
la utilización de fuentes de carbono. Específicamente, el segundo
gen cromosómico puede comprender los genes del operón lactosa, de
manera que, bajo condiciones en las que la lactosa es la única
fuente de carbono, únicamente las células que mantienen el plásmido
y en las que se expresan los genes del operón lac, pueden
sobrevivir. Otras modificaciones resultarán evidentes para el
experto en la materia.
El segundo gen cromosómico también puede ser un
gen esencial codificante de la síntesis de ADN y/o ARN o proteínas
de replicación de la célula huésped procariótica. Los ejemplos de
dichos genes con respecto a dichas funciones esenciales en
bacterias, tales como E. coli y Salmonella, se
proporcionan en McMacken et al. (en: Escherichia coli
and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology,
editores Neidhardt et al., Amer. Soc. Micro., Washington
D.C., 1987, páginas 564 a 612) e incluyen, aunque sin limitación,
los genes siguientes: dnaA, dnaB, dnaC, ssb, dnaG,
polC(dnaE), dnaQ (mutD), dnaN, dnaZX, gyrA, gyrB, polA, lig,
dnaT, rpoA, rpoB, rpoB y rpoD.
Aunque no preferentemente, el segundo gen
cromosómico puede ser un gen de resistencia a un antibiótico, de
manera que la transformación de la cepa con el plásmido permita el
crecimiento en presencia de dicho antibiótico.
Para las células huésped procarióticas
transformadas para la utilización en aplicaciones médicas,
dependiendo de la vía de administración, varios factores en el
ambiente local pueden ejercer una presión selectiva. En el caso de
que una capacidad de resistir dicha presión se encuentre ligada a un
gen identificado, éste puede utilizarse como marcador
seleccionable. Por ejemplo, para las células, especialmente para las
células bacterianas que deben administrarse oralmente, la
resistencia al pH bajo del contenido del estómago constituye una
ventaja selectiva significativa. Entre los genes que se ha
demostrado que se encuentran asociados a lo anterior se encuentran
el gen uvrA de Streptococcus mutans (Hanna et
al., J. Bacteriol. 183:5964, 2001), los genes gadA, B y
C de E. coli (Castanie-Cornet y
Foster, Microbiology 147:709, 2001), los genes rpoS, fur,
atp y atbR de Salmonella typhimurium (BAik et
al., Microbiology 142:3195, 1996), los genes lepA, Frasel,
czcA, uvrA, atpF' y aldo-cetorreductasa de
Helicobacter pylori (Bijlsma et al., J. Infect. Dis.
182:1566, 2000) y los genes codificantes de la ATPasa F0F1 de
Listeria monocytogenes (Cotter et al., Int. J. Food
Microbiol. 60:137, 2000).
Los genes que proporcionan la supervivencia
intracelular (por ejemplo SpvA en Listeria
monocytogenes, Borezee et al., Microbiology 147:2913,
2001) o la resistencia a localizaciones intracelulares particulares,
tales como los lisosomas, también pueden resultar útiles en células
huésped apropiadas.
Entre los genes preferentes que inhiben el
crecimiento celular indirectamente también se incluyen genes
cromosómicos codificantes de una secuencia antisentido que inhibe
un segundo gen cromosómico esencial para el crecimiento celular
mediante la unión al segundo gen cromosómico o mediante la unión a
ARNm transcrito a partir del segundo gen cromosómico.
Una secuencia antisentido es una secuencia que
es sustancialmente complementaria a su secuencia diana y que
presenta la capacidad de hibridarse específicamente a dicha
secuencia diana. Debido a que la secuencia antisentido puede actuar
mediante la unión directamente a un segundo gen cromosómico esencial
para el crecimiento celular o a ARNm transcrito a partir de dicho
segundo gen cromosómico, la secuencia diana puede ser la secuencia
de la cadena codificante o de la cadena no codificante del segundo
gen cromosómico, o de una parte del mismo. Los métodos de
preparación de secuencias antisentido que presentan la capacidad de
hibridarse específicamente a secuencias diana son conocidas del
experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, Cohen J.S.,
Trends in Pharm. Sci. 10:435, 1989; Okano, J. Neurochem. 56:560,
1991; Lee et al., Nucleic Acids Res. 6:3073, 1979; Cooney
et al., Science 241:456, 1988, y Dervan et al.,
Science 251:1360, 1991).
Preferentemente, las secuencias antisentido se
hibridan a las secuencias diana bajo condiciones astringentes. Las
condiciones de hibridación de alta astringencia se definen como la
incubación durante la noche a 42ºC en una solución que comprende
formamida al 50%, 5XSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM),
fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5X solución de Denhardt, dextrán
sulfato al 10% y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón
fragmentado y desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en
0,1X SSC a aproximadamente 65ºC.
Tal como se ha indicado anteriormente, un primer
gen cromosómico puede inhibir el crecimiento celular iniciando una
cascada de reacciones que implica varios genes que finalmente
resultan en la inhibición de un gen esencial para el crecimiento
celular o en la activación de un gen que inhibe el crecimiento
celular. Por ejemplo, el primer gen cromosómico puede codificar una
proteína represora que inhibe un segundo gen cromosómico codificante
de un activador que de otra manera activaría un tercer gen
cromosómico esencial para el crecimiento celular. Alternativamente,
el primer gen cromosómico puede codificar una proteína represora que
inhibe un segundo gen cromosómico codificante de una secuencia
antisentido que de otra manera inhibiría un tercer gen cromosómico
que inhibe el crecimiento celular. Resultará evidente para el
experto que las anteriores son meramente ejemplos de las muchas
cascadas de genes que satisfarían los requisitos de la
invención.
El gen cromosómico que inhibe el crecimiento
celular puede ser un gen que se encuentra naturalmente presente en
el genoma de la célula huésped procariótica o puede ser un gen
exógeno.
El gen cromosómico puede ser un gen natural que
se ha ligado operablemente a una secuencia exógena de ARNI o ARNII.
Por ejemplo, la secuencias que normalmente controlarían la expresión
de un gen de toxina natural pueden eliminarse y el gen de la toxina
puede ligarse operablemente en su lugar a una secuencia codificante
de ARNI exógena bajo el control de un promotor constitutivo. De
manera similar, las secuencias que normalmente controlan la
expresión de una proteína represora natural pueden eliminarse y el
gen de proteína represora ligarse operablemente en su lugar a una
secuencia codificante de ARNII exógena bajo el control de un
promotor constitutivo o de un promotor inducible. Por lo tanto, en
el ejemplo 2 de la presente memoria, un gen represor natural,
lacI, se encuentra operablemente ligado a una región
codificante de ARNII.
Alternativamente, tanto la secuencia reguladora
de ARNI o de ARNII, como el gen cromosómico pueden ser exógenos,
tal como es el caso al codificar el gen cromosómico una secuencia
antisentido que inhibe un segundo gen cromosómico esencial para el
crecimiento celular.
En el caso de que se encuentre presente un
segundo gen cromosómico esencial para el crecimiento celular, éste
también puede ser un gen natural o un gen exógeno.
Resultará evidente para el experto en la materia
el modo de manipular una célula con el fin de producir una célula
huésped procariótica adecuada para la utilización en la
invención.
La célula huésped procariótica puede ser una
célula bacteriana Gram-negativa o una célula
bacteriana Gram-positiva. En el caso de que la
célula sea una célula bacteriana Gram-negativa,
preferentemente es una célula de E. coli o una célula de
Salmonella. En el caso de que la célula sea una célula
bacteriana Gram-positiva, preferentemente es una
célula de Bacillus, Streptomyces, Lactobacillus
o Lactococcus.
Resultan particularmente útiles las células
huésped procarióticas atenuadas que han sido atenuados de manera
que se encuentren aceptablemente libres de efectos secundarios, para
el uso terapéutico en organismos receptores. Dependiendo de la
especificidad de la célula, puede resultar adecuado para el uso
terapéutico veterinario o humano.
Entre las bacterias atenuadas disponibles se
encuentran las siguientes:
- Salmonella typhimurium, incluyendo las cepas SL3261 (mutante aroA, Titball et al., Infection and Immunity 65:1926, 1997; Titball et al., Infection and Immunity 63:563, 1995), VNP20009 (purI y mutante msbB, Toso et al., J. Clin. Oncol. 20:142, 2002).
- Salmonella typhi, incluyendo las cepas CVD 908-htrA, \chi4073, \chi4632, Ty800, CVD 909 y CVD 915 (Galen et al., Infect. Immun. 67:6424-6433, 1999; Morona et al., Gene 107:139-144, 1991; Tacket et al., Infect. Immun. 65:3381-3385, 1997; Garmory et al., FEMS Microbiology Reviews 26:339-353, 2002),
- Salmonella gallinarum, incluyendo la cepa 9R (para la vacunación aviar, Feberwee et al., Avian Dis. 45:1024, 2001),
- Escherichia coli, incluyendo los mutantes aroA, cnfI y OMP (Rippere-Lampe et al., Infect. Immunol. 69:3954, 2001),
- Shigella flexnery, incluyendo la cepa S. flexneri 2a guaBA (Altbourn et al., INfect. Immunol. 69:3150, 2001),
- Vibrio cholera, incluyendo la cepa Peru2 (Ryan et al., Infect. Immun. 68:221-226, 2000)
- Listeria monocytogenes, incluyendo los mutantes PrfA y SvpA (Sheehan et al., Mol. Microbiol. 20:785, 1996; Boerezee et al., Microbiology 747:2913, 2001),
- Brucella abortus, incluyendo la cepa RB51 (Vemulapalli et al., Infect. Immunol. 68:3290, 2000),
- Mycobacterium bovis, incluyendo la cepa Calmette-Guerin (BCG), y
- Mycobacterium tuberculosis.
Un gen de interés transportado en el plásmido en
las células huésped procarióticas transformadas de la invención
puede ser cualquier gen. El gen puede ser uno que presente un efecto
terapéutico al administrarlo en un organismo receptor. Por ejemplo,
puede resultar deseable administrar el gen en un organismo receptor
con fines de terapia génica.
Alternativamente, puede resultar deseable
administrar un gen en un organismo receptor debido a que el producto
de transcripción o el producto de transcripción y traducción del
gen presenta un efecto terapéutico, Por ejemplo, el producto de
transcripción de un gen de interés puede ser un oligonucleótido
antisentido o el gen de interés puede codificar un antígeno que
presenta un efecto terapéutico. En particular, un gen de interés
puede codificar uno o más antígenos que inducen una respuesta
inmunológica en un organismo receptor. Un ejemplo de genes de
interés que pueden incluirse en el plásmido para inducir una
respuesta inmunológica en el organismo receptor son los genes
cafI, cafIA y cafIM del operón caf.
En el caso de que se desee que el gen de interés
se transcriba, o que se transcriba y se traduzca, preferentemente
se asociará funcionalmente a un promotor. Preferentemente, el
promotor es un promotor eucariótico o un promotor bacteriano. La
elección del promotor funcionalmente asociado al gen de interés y la
elección de la célula huésped procariótica determinan si el gen de
interés se transcribe, o se transcribe y se traduce, en la célula
huésped procariótica antes de la administración en un organismo
receptor, o únicamente después de la administración en un organismo
receptor. En algunos casos, puede resultar deseable administrar
células huésped procarióticas que ya expresan un gen de interés, en
cuyo caso el promotor funcionalmente asociado al gen de interés se
selecciona de manera que sea operativo en la célula huésped
procariótica y estimule la transcripción y traducción del gen de
interés en la misma. En esta situación, el promotor funcionalmente
asociado con el gen de interés es un promotor bacteriano.
En otros casos, puede resultar deseable
administrar en un organismo receptor células huésped procarióticas
que comprendan el plásmido que comprende el gen de interés, aunque
retrasando la expresión del gen de interés hasta después de la
administración de las células en el organismo receptor. En esta
situación, el promotor funcionalmente asociado al gen de interés es
un promotor eucariótico que no estimula la transcripción y
traducción del gen de interés en la célula huésped procariótica,
pero que sí lo hará tras la administración en un organismo
receptor.
Se encuentra contemplado que la vacunación con
células huésped procarióticas transformadas según la invención
pueda llevarse a cabo mediante cualquiera de entre varias vías de
administración. Para Mycobacterium, por ejemplo, la vía
habitual es mediante inyección intradérmica o subcutánea. Para
bacterias entéricas, tales como Salmonella, Shigella
o E. coli, la administración oral (particularmente de
transformantes resistentes a ácidos) o la administración rectal
resultan preferentes. En algunas circunstancias, puede resultar
preferente la administración mucosal, intravenosa o
intraperitoneal.
Se encuentra contemplado que puedan utilizarse
varios métodos de administración para aplicaciones no de
vacunación.
Además de las vías enteral y parenteral de
administración utilizadas para la vacunación, la aplicación no de
vacunación podría requerir otros procedimientos. Entre ellos se
encuentran la utilización de recipientes permeables implantables en
los que se encuentran contenidas las células según la invención.
Figura 1: diagrama de pUC18 ori que muestra la
localización de los transcritos de ARNI y ARNII. ARNII ceba el
inicio de la síntesis del plásmido de ADN, y ARNI es el inhibidor
antisentido de ARNII.
Figura 2: ejemplo de genoma de célula huésped
procariótica para la utilización en oriSELECT represor. El
genoma de una célula huésped procariótica contiene una región
codificante de ARNII ligada un cistrón de gen represor, ambos bajo
el control de un promotor constitutivo de ARNII. El genoma contiene
además un gen esencial bajo el control de un promotor inducible. En
ausencia de un plásmido, la proteína represora se expresa y reprime
el gen esencial, inhibiendo el crecimiento celular. La unión de ARNI
generado por plásmido al transcrito de ARNII de la fusión de
ARNII-ARNm represor bloquea la traducción de la
proteína represora, permitiendo la expresión del gen esencial y el
crecimiento celular.
Figura 3: ejemplo de genoma de célula huésped
procariótica para la utilización en oriSELECT de gen de
toxina. El genoma contiene un gen sacB, codificante de
levansacarasa de Bacillus subtilis (Link et al., J.
Bacteriol. 179:6228-6237, 1997) situado cadena abajo
de ARNII. En presencia de sacarosa, sacB sintetiza un
producto tóxico y la célula muere en presencia de sacarosa a menos
que se encuentre presente un plásmido que expresa ARNI que bloquea
la traducción del ARNm del gen de la toxina.
Figura 4: ejemplo de genoma de célula huésped
para la utilización en oriSELECT antisentido. El genoma de
la célula huésped procariótica contiene un gen que resulta esencial
para el crecimiento celular y una región codificante de ARNII
ligada a un gen antisentido respecto al gen esencial para el
crecimiento celular. En ausencia de un plásmido, el ARN antisentido
se une al ARNm del gen esencial, impidiendo de esta manera la
traducción del gen esencial y el crecimiento celular. Al transformar
la célula con un plásmido que proporciona ARNI, éste se une a
ARNII-ARN antisentido, evitando que se una al ARNm
del gen esencial y permitiendo el crecimiento celular.
Figura 5: amplificación del extremo 5' de ARNII
de pUC18 mediante PCR. Se muestran las posiciones de los transcritos
de ARNI y ARNII, al igual que las posiciones de los cebadores
utilizados para amplificar el extremo 5' de ARNII antes de su
inserción cadena arriba del gen codificante del represor lacI
para la inserción en un genoma de célula huésped procariótica para
la utilización en oriSELECT de represor.
Figura 6: amplificación del extremo 5' de
lacI del ADN genómico de la cepa DHI ORT utilizando PCR. Se
muestran las posiciones de los cebadores 5lacI y 3lacI utilizados en
la amplificación.
Figura 7: producto formado mediante combinación
del producto de amplificación de ARNII producido utilizando los
cebadores en la figura 5 y la amplificación de lacI producida
utilizando los cebadores en la figura 6. Se muestran las posiciones
del cebador utilizado en la amplificación del producto de
combinación.
Figura 8: ejemplo adicional de genoma de célula
huésped procariótica para la utilización en oriSELECT represor. El
genoma de una célula huésped procariótica contiene una región
codificante de ARNII ligado a un cistrón de gen represor
(lacI), ambos bajo el control de un promotor constitutivo
basado en las secuencias -10 y -35 y espaciado presentes en el
promotor trc de E. coli. El genoma contiene además un
gen esencial bajo el control de un promotor inducible (no
mostrado). En ausencia de un plásmido, la proteína represora se
expresa y reprime el gen esencial, inhibiendo el crecimiento
celular. La unión de ARNI generado por plásmido al transcrito de
ARNII de la fusión de ARNII-ARNm del represor
bloquea la traducción de la proteína represora, permitiendo la
expresión del gen esencial y el crecimiento celular.
A continuación se describe la invención en mayor
detalle a título de ejemplo, haciendo referencia a sistemas de
mantenimiento de plásmidos que utilizan un origen de replicación de
plásmido como marcador seleccionable. Se apreciará que pueden
realizarse modificaciones en los sistemas descritos en los
Ejemplos.
La invención permite la selección y
mantenimiento de plásmidos utilizando únicamente el origen de
replicación (ori pMB1 o ColEI) como el marcador
seleccionable, y se denomina en la presente memoria
oriSELECT. Tal como se muestra en la figura 1, estos
oris compatibles con ColEI codifican dos transcritos de ARN
solapantes: los cebadores de ARNII ceban el inicio de la síntesis
del ADN de plásmido, y ARNI es el inhibidor antisentido del ARNII
(Scott et al., Microbiol. Rev. 48:1-23, 1984;
Chan et al., J. Biol. Chem. 260:8925-8935,
1985). Prácticamente la totalidad de los plásmidos utilizados en
investigación y comercialmente se basan en dichos oris para
la replicación autónoma en E. coli.
La invención puede implicar la construcción de
cepas genéticamente modificadas de E. coli en las que el
genoma ha sido modificado para que contenga una región codificante
de ARNII ligada a un elemento genético inhibidor en un operón. La
unión de ARNI generado por plásmido a la fusión
ARNII-ARNm impide la transcripción del ARNm del gen
inhibidor, permitiendo de esta manera la supervivencia y crecimiento
celulares. Se describen a continuación tres mecanismos propuestos
de este sistema de mantenimiento de plásmidos.
Tal como se muestra en la figura 2, el genoma de
una célula huésped procariótica para la utilización en
oriSELECT represor contiene una región codificante de ARNII
ligada a un cistrón de gen represor, ambos bajo el control de un
promotor constitutivo de ARNII. La región codificante de ARNII
ligada a un cistrón represor también puede encontrarse bajo el
control de un promotor constitutivo alternativo, tal como un
promotor basado en las secuencias -10 y -35 de E. coli y el
espaciado presente en el promotor Trc, tal como se muestra
en la figura 8. El genoma de la célula huésped procariótica también
contiene un gen esencial para el crecimiento celular bajo el
control de un promotor inducible (no mostrado en la figura 8).
En ausencia de un plásmido, la proteína
represora se expresa y reprime el gen esencial mediante la unión al
operador/promotor que controla la expresión del gen esencial,
inhibiendo el crecimiento celular. La unión de ARNI generado por un
plásmido al transcrito de ARNII en la fusión
ARNII-ARNm de represor bloquea la traducción del
represor, permitiendo la expresión del gen esencial y, de esta
manera, el crecimiento celular.
Para construir esta célula huésped procariótica
para la utilización en oriSELECT represor, el gen esencial,
tal como dapD (Richaud et al., J. Biol. Chem.
259:14824-14828, 1984) o fabA (Cronan et
al., Biosynthesis of membrane lipids, en: "Escherichia
coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular
biology", Neidhardt, F.C. (editor), American Society of
Microbiology, Washington D.C., 1987), se deleciona del cromosoma de
una cepa bacteriana, bajo el control de un promotor inducible (por
ejemplo Plac) y se inserta de nuevo en el cromosoma. El gen
codificante del represor asociado al promotor inducible, en este
caso lacI, se deleciona del cromosoma. Este gen represor se
sitúa en un operón cadena abajo de la región codificante de parte
de ARNII, con el promotor constitutivo de ARNII (o cualquier otro
promotor constitutivo, por ejemplo un promotor basado en las
secuencias -10 y -35 de E. coli y con el espaciado presente
en el promotor trc) controlando la transcripción de ambos.
El extremo 3' de la región codificante de ARNII se modifica para
incorporar el sitio de unión ribosómica del represor, de manera que
se solape con ARNI y resulte bloqueado por el mismo. En algunos
casos, la expresión de la proteína represora LacI puede
incrementarse mediante el incremento de la distancia entre el
extremo 3' de la región codificante de ARNII y el sitio de unión
ribosómica de lac. Este constructo se inserta en el
cromosoma.
De esta manera, la célula producirá el represor
constitutivamente. La proteína represora se unirá al operador
cromosómico que controla el gen esencial, impidiendo de esta manera
el crecimiento celular. Al transformarse la célula con un plásmido
que contiene un ori compatible con ColEI, el ARNI se unirá a
ARNII y bloqueará la traducción del gen represor situado cadena
abajo, permitiendo el crecimiento celular.
En el caso de que el gen esencial cromosómico
presente su propio represor asociado, este represor (menos su
promotor) puede introducirse en un operón cadena abajo de ARNII e
insertarse dicho operón en el cromosoma bacteriano, sustituyendo el
represor de tipo salvaje.
El gen esencial puede ser un gen exógeno
condicionalmente esencial (por ejemplo un gen de resistencia a
antibióticos).
En el caso de que el gen esencial exógeno sea
inducible y presente su propio represor exógeno asociado, dicho gen
represor puede introducirse en un operón situado cadena abajo de
ARNII e insertarse dicho operón en el cromosoma bacteriano.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la figura 3, el genoma de
una célula huésped para la utilización en el oriSELECT del
gen de toxina contiene un gen sacB, codificante de
levansacarasa de Bacillus subtilis (Link et al., J.
Bacteriol. 179:6228-6237, 1997), situado cadena
abajo de ARNII. En presencia de sacarosa, sacB sintetiza un
producto tóxico y la célula resulta eliminada a menos que se
introduzca un plásmido que exprese ARNI. Puede fusionarse otro gen
tóxico regulado por un promotor inducible con la región codificante
de ARNII en lugar de sacB.
Se construye un constructo con un operón que
consiste de la región codificante de ARNII y un gen cadena abajo
codificante de sacB. El extremo 3' de la región codificante
de ARNII se modifica para que incorpore el sitio de unión
ribosómica de sacB. Un promotor constitutivo de ARNII
controla la expresión génica. Al insertarlo en el cromosoma
bacteriano, la célula puede crecer en ausencia de sacarosa, pero al
añadir sacarosa, se produce la toxina y la célula muere. Al
transformar la célula con un plásmido que contiene un ori compatible
con ColEI, ARNI se unirá a ARNII-ARNm del gen de
toxina y bloqueará la traducción, permitiendo el crecimiento
celular en presencia de sacarosa.
Puede utilizarse un promotor sensible a la
temperatura o químicamente inducido para controlar la expresión de
la fusión ARNII-gen de toxina. A la temperatura
permisiva o en presencia de un inductor, la célula muere a menos
que se introduzca un plásmido que exprese ARNI.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.950000\baselineskip
Tal como se muestra en la figura 4, en el
oriSELECT antisentido doble, el genoma de la célula huésped
contiene un gen que resulta esencial para el crecimiento celular y
una región codificante de ARNII ligada a un gen antisentido
respecto al gen esencial para el crecimiento celular.
Una versión antisentido de un gen esencial (por
ejemplo dapD o fabA) se sitúa en un operón cadena
abajo de la región codificante de ARNII, con el promotor
constitutivo de ARNII controlando la transcripción de ambos. El
extremo 3' de la región codificante de ARNI puede modificarse para
que incorpore parte del transcrito antisentido del gen esencial, de
manera que se encontrará parcialmente solapado por ARNII. Este
constructo se inserta en el cromosoma bacteriano.
Ahora la célula producirá el ARNII y el ARN
antisentido constitutivamente. El ARN antisentido se unirá al ARNm
del gen esencial, impidiendo de esta manera la transcripción del gen
esencial y el crecimiento celular.
Al transformarse la célula con un plásmido que
contiene un ori compatible con ColEI, el ARNI se unirá a
ARNII-ARN antisentido e impedirá que se una al ARNm
del gen esencial, permitiendo el crecimiento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas ORT DH1lackan (Williams et
al., 1998), DH1lacdapD y DH1lacP2dapD (Cranenburgh
et al., Nucleic Acids Res. 29:e26, 2001) pueden convertirse
en cepas oriSELECT mediante la integración del operón
ARNII-lacI en (produciéndose de esta manera la sustitución)
el gen represor lacI cromosómico. Se utilizó un único
plásmido construido basándose en el sistema de integración pK03
(Link et al., J: Bacteriol. 179:6228-6237,
1997) para sustituir el gen lacI de tipo salvaje con
ARNII-lacI en todas las cepas ORT de la manera
siguiente.
1. Amplificación de parte del operón lac
cromosómico circundante a lacI mediante PCR y clonación.
2. Construcción de un operón consistente de la
región codificante de ARNII insertada cadena arriba del gen
represor lacI, sustituyendo su promotor natural. El sitio de
unión ribosómica de lacI debe situarse de manera que sobre
el ARN resulte bloqueado por la unión del ARNII antisentido.
3. Clonación del locus del operón
ARNII-lacI en el plásmido de integración pKO3.
4. Integración del locus del operón
ARNII-lacI en el locus del operón lac de tipo salvaje
de DH1lackan, DH1 lacdapD y DH1lacP2dapD para
producir cepas oriSELECT.
5. Ensayo de la selección y mantenimiento de
plásmidos en dichas cepas utilizando plásmidos que presentan un ori
ColEI/pMB1 y ninguna secuencia de lacO (para evitar la
selección ORT).
Las etapas de clonación necesarias para la
construcción de esta cepa oriSELECT se describen en mayor
detalle a continuación.
1. Amplificación de parte del extremo 5' de
ARNII a partir de pUC18 mediante PCR utilizando los cebadores
siguientes (producto = 176 pb), tal como se muestra en la figura
5.
2. Amplificación de parte del extremo 5' de
lacI a partir de ADNg DH1 mediante PCR utilizando los
cebadores siguientes (producto = 597 pb), tal como se muestra en la
figura 6.
3. Combinación de los dos productos de PCR en
una única PCR y amplificación utilizando cebadores de 5ARNII y
3lacI para generar el producto de PCR de fusión ARNII-lacI de
749 pb (la región entre los cebadores de 5ARNII y 3lacI,
posteriormente), tal como se muestra en la figura 7.
\global\parskip1.000000\baselineskip
4. Corte del producto de PCR procesado con
NsiI y ApaI para generar el fragmento para la
clonación en el operón lactosa en lugar del promotor lacI y
el extremo 5'.
1. Amplificación del operón lac a partir
de ADNg DH1 con los cebadores siguientes:
El cebador de 5L0 incorpora un sitio SalI
natural (subrayado), mientras que 3L0 introduce uno con un único
cambio de nucleótido (negrita). Tamaño total del producto de PCR =
5.803 pb.
2. Corte del producto de PCR con SalI y
clonación en pUC18 cortado con el mismo.
3. Corte del plásmido con NsiI y
ApaI y clonación en el fragmento de la etapa 4, sustituyendo
el promotor y el extremo 5' de lacI con l afusión génica
ARNII-lacI.
4. Corte de la inserción con SalI y
ligación en pK03recA cortado con el mismo.
5. Integración en el cromosoma de DH1lacdapD,
DH1lacP2dapD y DH1lackan para producir cepas
oriSELECT.
6. Ensayo de la selección y mantenimiento de
plásmidos utilizando plásmidos con orígenes de replicación de
pMB1.
En el caso de que se utilice el promotor
constitutivo de ARNII para controlar la expresión de la fusión
ARNII-gen, puede sustituirse cualquier otro
promotor constitutivo en caso necesario. Se utiliza el promotor de
ARNII en los presentes ejemplos tal como se encuentra ya presente.
Un promotor constitutivo preferente alternativo es un promotor
basado en las secuencias -10 y -35 óptimas de E. coli y el
espaciado presente en el promotor trc. Este promotor de
E. coli es más fuerte que el promotor de ARNII y por lo tanto
puede utilizarse en caso de que se desee para producir cantidades
incrementadas de la proteína represora de LacI, garantizando de
esta manera que se bloquea el crecimiento en ausencia de un
plásmido. La expresión de la proteína represora de LacI también
puede incrementarse mediante el incremento de la distancia entre el
extremo 3' de la región codificante de ARNII y el sitio de unión
ribosómica de LacI.
También se apreciará que pueden utilizarse
métodos alternativos de inserción del casete génico en lugar del
método pKO3 indicado anteriormente. Por ejemplo, puede utilizarse un
sistema de recombinación lambda Red para integrar el casete en
forma de un producto lineal de PCR (Murphy, J. Bacteriol.
180:2063-2071, 1998).
Los ejemplos se basan en un casete de expresión
de fusión ARNII-gen en el que el ARNI funciona como
el inhibidor antisentido. Esto se debe a que, en una célula que
contiene un plásmido, ARNI se encuentra presente en un exceso de 5
veces respecto a ARNII (Liang et al., J. Mol. Biol.
292:19-37, 1999), y de esta manera ARNI puede
servir como un inhibidor más eficaz, ya que existirá un exceso molar
de ARNI disponible. Sin embargo, pueden existir situaciones en las
que resultaría ventajoso construir fusiones génicas utilizando ARNI
y no ARNII. En este caso, será el transcrito de ARNII del plásmido
que actuará como el inhibidor antisentido.
La integración cromosómica del gen que expresa
la proteína Rom del ori ColE1/pMB1 puede resultar necesaria en
cepas oriSELECT, debido a que esto incrementará la afinidad
de unión de ARNI por ARNII (Chan et al., J. Biol. Chem.
260:8925-8935, 1984).
Claims (31)
1. Célula huésped procariótica transformada, que
contiene:
i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento
celular, operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante
de ARNII o una parte del mismo, y
ii) un plásmido que comprende un origen de
replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNI o
una parte del mismo,
en la que la unión de la secuencia antisentido
codificada por ARNI a ARNm transcrito a partir de ARNII inhibe la
acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el
crecimiento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Célula huésped procariótica transformada, que
contiene:
i) un gen cromosómico que inhibe el crecimiento
celular operablemente ligado a una secuencia reguladora codificante
de ARNI o una parte del mismo, y
ii) un plásmido que comprende un origen de
replicación codificante de una secuencia antisentido que es ARNII o
una parte del mismo,
en la que la unión de la secuencia antisentido
codificada por ARNII a ARNm transcrito a partir de ARNI inhibe la
acción del gen cromosómico, permitiendo de esta manera el
crecimiento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Célula huésped procariótica transformada
según la reivindicación 1 ó 2, en la que el plásmido comprende un
sitio de clonación para la inserción de un gen de interés.
4. Célula huésped procariótica transformada
según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que el plásmido comprende
además un gen de interés.
5. Célula huésped procariótica que comprende un
gen cromosómico que inhibe el crecimiento celular operablemente
ligado a una secuencia reguladora situada cadena arriba del gen
cromosómico, en la que la secuencia reguladora es un gen de ARNI o
una parte del mismo, o un gen de ARNII o una parte del mismo.
6. Célula huésped procariótica transformada
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una célula huésped
procariótica según la reivindicación 5, en la que la célula se
encuentra en cultivo in vitro.
7. Célula huésped procariótica transformada o
una célula huésped procariótica según la reivindicación 6 que es
una célula bacteriana.
8. Célula huésped procariótica transformada o
una célula huésped procariótica según la reivindicación 7, en la
que la célula es una célula bacteriana
Gram-negativa.
9. Célula huésped procariótica transformada o
una célula huésped procariótica según la reivindicación 8, en la
que la célula es una célula de E. coli o una célula de
Salmonella.
10. Célula huésped procariótica transformada o
una célula huésped procariótica según la reivindicación 7, en la
que la célula es una célula bacteriana
Gram-positiva.
11. Célula huésped procariótica transformada o
una célula huésped procariótica según la reivindicación 10, en la
que la célula es una célula de Bacillus.
12. Célula huésped procariótica transformada o
una célula huésped procariótica según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11, que es una célula atenuada.
13. Célula huésped procariótica transformada o
una célula huésped procariótica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en la que el gen cromosómico es un gen de
una toxina.
14. Célula huésped procariótica transformada o
una célula huésped procariótica según la reivindicación 13, en la
que el gen de toxina es sacB.
15. Célula huésped procariótica transformada o
una célula huésped procariótica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en la que el gen cromosómico codifica una
proteína represora que inhibe la expresión de un segundo gen
cromosómico que resulta esencial para el crecimiento celular.
16. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según la reivindicación 15, en la que
el segundo gen cromosómico es condicionalmente esencial para el
crecimiento celular.
17. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según la reivindicación 15 ó 16, en la
que el gen cromosómico codifica el represor de lacI y el
segundo gen cromosómico se encuentra operablemente ligado a un
operador y promotor lac.
18. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según la reivindicación 15 ó 16, en la
que el gen cromosómico es dapD o fabA.
19. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 12, en la que el gen cromosómico codifica una secuencia
antisentido que inhibe la expresión de un segundo gen cromosómico
esencial para el crecimiento celular.
20. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según la reivindicación 19, en la que
la secuencia antisentido codificada por el gen cromosómico inhibe la
expresión del segundo gen cromosómico mediante la unión al gen
cromosómico.
21. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según la reivindicación 19, en la que
la secuencia antisentido codificada por el gen cromosómico inhibe la
expresión del segundo gen cromosómico mediante la unión a ARNm
transcrito a partir del segundo gen cromosómico.
22. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones
19 a 21, en la que el segundo gen cromosómico es condicionalmente
esencial para el crecimiento celular.
23. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones
19 a 21, en la que el segundo gen cromosómico es dapD o fabA.
24. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 23, en la que el gen cromosómico o la fusión de secuencia
reguladora-gen cromosómico se encuentra bajo el
control de un promotor constitutivo.
25. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 23, en la que el gen cromosómico o la fusión de secuencia
reguladora-gen cromosómico se encuentra bajo el
control de un promotor inducible.
26. Método de mantenimiento de un plásmido en
una célula huésped in vitro, que comprende la etapa de
cultivar una célula huésped procariótica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 ó 6 a 25 bajo condiciones suficientes para
permitir que dicha célula crezca.
27. Método para producir ADN de plásmido, que
comprende cultivar una célula huésped procariótica transformada
según el método según la reivindicación 26 y asilar el ADN de
plásmido.
28. Método para producir una proteína
recombinante, que comprende cultivar una célula huésped procariótica
transformada, que comprende un plásmido codificante de una proteína
de interés según el método según la reivindicación 26, y asilar la
proteína a partir de la célula.
29. Composición farmacéutica que comprende una
célula huésped procariótica transformada o una célula huésped
procariótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25
conjuntamente con un excipiente, diluyente o tampón
farmacéuticamente aceptable.
30. Célula huésped procariótica transformada o
célula huésped procariótica según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5 para la utilización en terapia.
31. Utilización de una célula huésped
procariótica transformada o una célula huésped procariótica según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 en la preparación de un
medicamento para la administración de genes o proteínas.
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