ES2280103T3 - Metodos de evaluacion del rechazo de trasplante. - Google Patents
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Abstract
Método de evaluación del rechazo de trasplante en un huésped, comprendiendo el método evaluar la expresión de al menos dos genes seleccionados del grupo que consiste en perforina, granzima B, y ligando de Fas en una muestra de prueba posterior al trasplante obtenida del huésped que comprende una muestra de células mononucleares de sangre periférica, líquido linfático, líquido peritoneal, o líquido pleural, en el que la regulación por incremento de los al menos dos genes indica el rechazo de trasplante en el huésped.
Description
\global\parskip0.920000\baselineskip
Métodos de evaluación del rechazo de
trasplante.
A pesar de las mejoras recientes en la
supervivencia al aloinjerto renal, continúa la pérdida de función
del injerto debido al rechazo crónico y agudo y, en la actualidad
es una causa principal de insuficiencia renal terminal. Debido a
que la aparición de episodios de rechazo agudo es el factor de
predicción más poderoso para el desarrollo posterior de rechazo
crónico en adultos y niños, muchos recomiendan estrategias para
detectar y cortar los episodios de rechazo agudo tan pronto como
sea posible.
Los procedimientos para diagnosticar el rechazo
de aloinjerto renal dependen de la detección de disfunción del
injerto y la presencia de un infiltrado leucocitario mononuclear.
Sin embargo, la presencia de un infiltrado celular moderado, a
menudo no es concluyente, y puede detectarse en injertos sin
rechazo.
Se han descrito métodos de detección de rechazo
de trasplante investigando la expresión génica en muestras
biópsicas. Por ejemplo, Strehlau y colaboradores (Strehlau et
al., 1997, Proc Natl Acad Sci U S A. 94:
695-700) identificaron marcadores, concretamente
perforina, granzima B y ligando de Fas, cuya expresión se eleva en
biopsias de trasplante de riñón y que por tanto pueden usarse como
herramienta de diagnóstico en el trasplante de riñón.
Sin embargo, hasta el momento no pudo
establecerse un método fiable para diagnosticar el rechazo de
trasplante usando muestras líquidas. Los estudios que evalúan la
sangre periférica en receptores de aloinjerto no han tenido éxito a
la hora de identificar perfiles de citocina de diagnóstico y se
estableció que las citocinas en la sangre periférica no eran
indicadores fiables de sucesos inmunológicos de intrainjerto (Nast,
C., 1995, Pediatr. Nephrol. 9: S56 - S60). Otros científicos
compararon los perfiles de expresión en sedimento de orina, sangre
y biopsias de riñón (Jeyarajah et al., 1995, Trasplant.
Proc., 27, 887 - 889). Sin embargo, no pudieron encontrar ninguna
correlación entre la expresión del marcador en las muestras de
orina, sangre y biopsias.
Sería de ayuda tener una herramienta fiable para
el diagnóstico y seguimiento del rechazo de aloinjerto renal agudo,
usando una muestra de células mononucleares de sangre periférica,
líquido linfático, líquido peritoneal o líquido pleural.
La presente invención se refiere a métodos para
monitorizar el estado de un órgano trasplantado en un huésped. Más
específicamente, la presente invención se refiere a la evaluación
del rechazo de trasplante en un huésped que comprende determinar la
magnitud de la expresión génica de los genes de perforina (P),
granzima B (GB), y ligando de Fas (FasL) marcadores de la
activación inmunitaria en una muestra biológica posterior al
trasplante obtenida del huésped y comparar la expresión relativa de
los genes marcadores con un nivel inicial de expresión del marcador
de activación inmunitaria, en la que la regulación por incremento de
la expresión génica (es decir, expresión génica incrementada o
aumentada) de dos de los tres genes marcadores de la activación
inmunitaria en la muestra indica rechazo. Los genes de activación
inmunitaria se denominan también en el presente documento moléculas
efectoras de linfocitos citotóxicos (CTL). Los métodos descritos en
el presente documento son particularmente útiles para detectar el
rechazo de trasplante agudo.
Lo más habitual es que el huésped (es decir, el
receptor de un trasplante) sea un mamífero, tal como un ser humano.
El órgano trasplantado puede incluir cualquier órgano o tejido que
pueda trasplantarse, por ejemplo riñón, hígado, corazón, pulmón o
médula ósea.
La muestra biológica posterior al trasplante (o
muestra de prueba) del huésped puede ser una muestra biológica que
comprende células que contienen ARN (es decir, transcritos) que
codifican para los genes marcadores de la activación inmunitaria de
interés. La muestra es una muestra de sangre periférica que contiene
células mononucleares, un líquido linfático, líquido peritoneal o
líquido pleural.
La magnitud de expresión de los genes marcadores
de la activación inmunitaria se determina cuantificando los
transcritos del gen marcador de la activación inmunitaria y
comparando esta cantidad con la cantidad de transcritos de un gen
expresado de manera estructural. El término "magnitud de
expresión" significa una "cantidad patrón o normalizada de
expresión génica". Por ejemplo, la expresión global de todos los
genes en las células varía (es decir, no es constante). La
observación de la expresión aumentada de un gen, tal como se
determina por un aumento de la presencia de un transcrito de ARNm,
debe ponerse en el contexto apropiado para valorar con precisión si
la detección de transcrito aumentado es significativa. Es decir,
debe haber algún modo para "normalizar" la expresión génica
para comparar con precisión los niveles de expresión entre las
muestras. Esto puede conseguirse determinando el nivel de expresión
del gen de interés (por ejemplo, determinando el ARNm o ADNc del gen
transcrito desde el ARNm del gen) y el nivel de expresión de un gen
expresado de manera estructural o universal (por ejemplo, un gen
que está presente en todos los tejidos y tiene un nivel constante de
expresión), y comparando los niveles relativos de expresión entre
el gen diana (gen de interés) y el gen expresado de manera
estructural. En una realización, el gen expresado de manera
estructural es
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH). Otros genes expresados de manera
estructural, tales como actina, se conocen por los expertos en la
técnica y pueden ser adecuados para su uso en los métodos descritos
en el presente documento. En los métodos descritos en el presente
documento, se consiguió la cuantificación de transcritos de genes
usando la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción
inversa competitiva (RT-PCR) y se determinó la
magnitud de la expresión génica calculando la razón de la cantidad
de expresión génica de cada gen marcador de la activación
inmunitaria con respecto a la cantidad de expresión génica del gen
expresado de manera estructural. Es decir, se calcula la magnitud
de la expresión del gen diana como pg de ADNc del gen diana por pg
de ADNc del gen expresado de manera estructural.
En una realización, el nivel de discriminación
para el aumento de la expresión génica (por ejemplo, la magnitud de
referencia de expresión génica) del gen marcador de la activación
inmunitaria se establece en la media \pm un intervalo de
confianza del 95% de un grupo de valores observados en trasplantes
sin rechazo (por ejemplo, valores control). El aumento de la
expresión génica se determina siendo superior a una media \pm un
intervalo de confianza del 95% de estos valores.
En otra realización, pueden obtenerse muestras
consecutivas del huésped y determinarse la cuantificación de los
marcadores génicos de la activación inmunitaria tal como se describe
en el presente documento, y puede seguirse el curso de rechazo
durante un periodo de tiempo. En este caso, por ejemplo, la magnitud
de referencia de la expresión génica de los genes marcadores de la
activación inmunitaria es la magnitud de expresión génica en una
muestra posterior al trasplante tomada muy poco después del
trasplante. Por ejemplo, puede(n) tomarse una muestra o
muestras inicial(es) dentro del periodo sin rechazo, por
ejemplo, en el plazo de una semana tras el trasplante y puede
compararse la magnitud de expresión de los genes marcadores en estas
muestras con la magnitud de expresión de los genes en las muestras
tomadas después de una semana. En una realización, las muestras se
toman en los días 0, 3, 5, 7 y 10.
En otra realización, la muestra de prueba
posterior al trasplante comprende una muestra de sangre obtenida
del huésped que contiene células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) que se evalúa para determinar los marcadores génicos de la
activación inmunitaria. De manera adicional, la muestra de PBMC se
evalúa sustancialmente de manera simultánea, o consecutivamente,
para determinar la presencia o ausencia de uno o más genes que son
característicos de (por ejemplo, un marcador para) un agente
infeccioso (por ejemplo, un virus). En esta realización, el aumento
de la expresión génica de dos de los tres genes marcadores de la
activación inmunitaria, P, GB y FasL, concomitante con la ausencia
del marcador para el agente infeccioso indica rechazo de trasplante.
Por ejemplo, para evaluar el rechazo de trasplante de un aloinjerto
renal, se valorarían los genes característicos del agente
infeccioso citomegalovirus (CMV). De manera importante, esta
realización actúa como una prueba de selección, que usa PBMC
obtenidos fácilmente, para distinguir de manera diferenciada entre
infección o rechazo de trasplante agudo. En este caso, se
realizarán pruebas adicionales, tales como con una muestra de
biopsia de transplante, solamente si la prueba de "selección"
inicial usando PBMC es positiva para el rechazo. Por tanto, los
huéspedes del trasplante no se someten a procedimientos de biopsia
invasivos a menos que esté
\hbox{justificado (es decir, que
sea necesario para establecer el rechazo).}
En una realización, la muestra biológica se
prepara para su evaluación aislando el ARN de la muestra, usando
métodos descritos en el presente documento, y proporcionando
(obteniendo) ADN complementario (ADNc) del ARN aislado mediante
técnicas de transcripción inversa. Sin embargo, pueden usarse otros
métodos para obtener ARN, y estos métodos se conocen por los
expertos en la técnica.
Kits comercialmente disponibles para su uso en
estos métodos se conocen también por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, en una realización descrita en el presente documento,
se aislan las PBMC de la sangre total y se extrae el ARN usando una
técnica de QIAGEN™ comercialmente disponible. Por ejemplo, QIAGEN
fabrica varios kits comercialmente disponibles para el aislamiento
de ARN, que incluyen RNEASY® Total RNA System (sistema de ARN total
RNEASY®) (que implica la unión del ARN total a una membrana de gel
de sílice y rotar el ARN); kits de ARNm OLIGOTEX™ (que utilizan
partículas de látex esféricas); y el kit de ARN total de QIAGEN para
transcritos in vitro y limpiar el ARN. La técnica básica de
QIAGEN implica cuatro etapas, tal como se expone en el ejemplo 2,
a continuación. La técnica de QIAGEN puede modificarse para mejorar
el aislamiento de ARN, mediante métodos muy conocidos por los
expertos en la técnica.
Se coamplificó el ADN complementario con un
competidor específico del gen y la cuantificación comprendió generar
una curva patrón de diluciones en serie del competidor específico
del gen con una cantidad constante de ADN complementario control de
transcripción inversa, permitiendo por tanto la cuantificación del
transcrito del gen de interés. Tal como se describe en el presente
documento, el competidor específico del gen se genera a partir de
tejido de nefrectomía o células blásticas simuladas por
fitohemaglutinina.
Por ejemplo, puede amplificarse el ADNc de
perforina con un par de cebadores de oligonucleótidos que comprenden
los nucleótidos de SEQ. ID. NOS.:17 y 18 de la tabla 1. Asimismo,
puede amplificarse el transcrito de
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa con cebadores de oligonucleótidos que comprenden la
secuencia de nucleótidos de SEQ. ID. NOS. 1 y 2. Aunque estos
cebadores se describen de manera específica en el presente
documento, pueden diseñarse otros cebadores adecuados usando
técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por
ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, Ausubel
et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1997) en las
páginas 15.0.1-1-15.8.8.
Los métodos descritos en el presente documento
son útiles para valorar la eficacia de la terapia antirrechazo. Los
métodos de este tipo implican comparar la magnitud de administración
previa de los transcritos de los genes marcadores con la magnitud
de administración posterior de los transcritos de los mismos genes,
en los que una magnitud de administración posterior de los
transcritos de los genes que es inferior a la magnitud de
administración previa de los transcritos de los mismos genes indica
la eficacia de la terapia antirrechazo. Puede seleccionarse
cualquier candidato para la prevención y/o tratamiento del rechazo
de trasplante, (tales como fármacos, anticuerpos u otras formas de
rechazo o prevención) por comparación de la magnitud de la expresión
del marcador antes y después de la exposición al candidato. Además,
de este modo puede recogerse información valiosa para ayudar a la
determinación del manejo clínico futuro del huésped en los que se
está realizando la valoración de su material biológico. La
valoración puede realizarse usando una muestra biológica (tal como
una biopsia o las PBMC) del huésped, usando los métodos descritos en
el presente documento para determinar la magnitud de expresión
génica de los genes marcadores. El análisis puede comprender además
la detección de un agente infeccioso.
La presente invención se refiere también al uso
de kits para evaluar el rechazo de trasplante. Por ejemplo, los
kits pueden incluir componentes de este tipo como medios para ayudar
al aislamiento de ARN, derivación de ADNc, RT-PCP,
cuantificación de la expresión génica, y detección de un agente
infeccioso. En una realización, un kit para detectar la presencia
de rechazo de trasplante en una muestra de sangre comprende medios
para determinar la magnitud de expresión de perforina, granzima B,
ligando de Fas, y GAPDH en la muestra y medios para determinar la
presencia de transcritos de agente infeccioso en la muestra. Por
ejemplo, el kit puede comprender cebadores de oligonucleótidos que
comprenden SEQ ID NOS: 1, 2, 17, 18, 19, 20, 21 y 22. El kit puede
contener también otros cebadores que pueden diseñarse usando métodos
muy conocidos por los expertos en la técnica.
Por tanto, como resultado del trabajo descrito
en el presente documento, ahora están disponibles métodos para
cuantificar con precisión la expresión génica de la activación
inmunitaria en las células mononucleares de sangre periférica y
correlacionar la magnitud de expresión de estos genes con
aloinjertos de rechazo. Específicamente, la evaluación de tres
genes de la activación inmunitaria perforina, granzima B y ligando
de Fas, y la determinación del aumento de la expresión génica de
dos de tres de estos genes diagnostica con precisión el rechazo de
aloinjerto agudo. Sorprendentemente, la evaluación de la expresión
de estos genes marcadores en las PBMC, junto con la evaluación de
la expresión de un gen de agente infeccioso, además detecta con
precisión el rechazo de aloinjerto.
La figura 1 es un diagrama que representa el
tamaño y las secuencias de los cebadores de oligonucleótidos y las
plantillas competitivas (CT) usadas para la cuantificación de 15
genes. Las deleciones e inserciones se indican mediante porciones
negras y blancas de las barras, respectivamente.
Las figuras 2A-F son gráficos
que representan el análisis cuantitativo de la expresión génica de
IL-2, IL-7, IL-15,
perforina (P), granzima B (GB), y ligando de Fas (FasL) en 38
biopsias de núcleo de trasplante tomadas para ayudar al diagnóstico
diferencial de la disfunción del injerto. Se obtuvieron también
biopsias de dos riñones de donante antes de la reperfusión. Las
líneas indican biopsias consecutivas tomadas durante el curso del
rechazo antes y después del tratamiento (ACR, rechazo celular agudo;
NR, riñones sin rechazo con necrosis tubular aguda o citotoxicidad
de la ciclosporina; CR, rechazo crónico; INF REC, complicaciones
infecciosas y reaparición de enfermedad primaria; y VASC,
complicaciones vasculares).
El trasplante renal es el tratamiento de
elección para los pacientes afectados de nefropatía terminal, una
de las diez causas principales de muerte en los Estados Unidos. Sin
embargo, aproximadamente el 20-25% del primero y el
30-35% del segundo de los aloinjertos renales
procedentes de cadáver fallan en el plazo de un año tras el
trasplante, a pesar de los avances recientes en la conservación de
órganos, pruebas de histocompatibilidad y estrategias
inmunosupresoras.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "trasplante" se refiere al proceso de tomar una célula,
tejido u órgano, denominado un "trasplante" o "injerto"
de un individuo y colocarlo o colocarlos en un individuo
(normalmente) distinto. El individuo que proporciona el trasplante
se denomina el "donante" y el individuo que recibe el
trasplante se denomina el "huésped" (o "receptor"). Un
órgano, o injerto, trasplantado entre dos individuos genéticamente
distintos de la misma especie se denomina un "aloinjerto". Un
injerto trasplantado entre individuos de especies distintas se
denomina un "xenoinjerto".
La única causa más común para el fracaso
temprano del injerto, especialmente en el plazo de un mes posterior
al trasplante, es el rechazo inmunológico del aloinjerto. El impacto
desfavorable del rechazo se aumenta por el hecho de que: (a) el uso
de tratamiento antirrechazo a dosis elevadas, superpuesto a la
inmunosupresión de mantenimiento, es principalmente responsable de
la morbimortalidad asociada al trasplante, (b) la inmunización
frente a especificidades HLA "públicas" que resulta de un
injerto rechazado hace que esta población de pacientes sea difícil
de volver a trasplantar y (c) el retorno del receptor inmunizado con
un injerto fracasado al conjunto de pacientes que esperan un
trasplante aumenta el problema perpetuo de escasez de órganos.
Tal como se usa en el presente documento,
"rechazo de trasplante" se define como el deterioro estructural
y funcional del órgano debido a una respuesta inmunitaria activa
expresada por el receptor, e independiente de causas no
inmunológicas de disfunción del órgano. El diagnóstico del rechazo
de aloinjerto renal se realiza normalmente mediante el desarrollo
de la disfunción del injerto (por ejemplo, un aumento de la
concentración de creatinina en suero) y la evidencia morfológica de
lesiones del injerto en zonas del injerto que también manifiestan
infiltración de células mononucleares. Dos advertencias aplican, sin
embargo, al uso de la función renal anormal como un indicador del
proceso de rechazo: primero, el deterioro de la función renal no
está siempre disponible como un indicio clínico para diagnosticar
el rechazo ya que muchos de los injertos renales procedentes de
cadáveres padecen insuficiencia renal (reversible) aguda en el
periodo inmediato tras el trasplante debido a lesiones por
procedimientos de conservación ex vivo y recogida. Segundo,
incluso cuando está presente la función renal inmediata, puede
desarrollarse una disfunción del injerto debido a una causa no
inmunológica, tal como el propio tratamiento inmunosupresor.
Por ejemplo, la nefrotoxicidad de ciclosporina
(CsA), una complicación que no se identifica fácilmente
exclusivamente basándose en las concentraciones en plasma/sangre de
CsA, es una complicación común. La importancia clínica de
distinguir el rechazo de la nefrotoxicidad CsA no debe enfatizarse
en exceso ya que las estrategias terapéuticas son diametralmente
opuestas: aumento a escala de inmunosupresores para el rechazo, y
reducción de la dosificación de CsA para la nefrotoxicidad.
La diferenciación del diagnóstico del rechazo de
otras etiologías para la disfunción del injerto y el establecimiento
del tratamiento eficaz se complica adicionalmente porque: (a) la
biopsia con aguja de núcleo percutánea de injerto renal, la mejor
de las herramientas actualmente disponibles para diagnosticar el
rechazo se realiza habitualmente después del "hecho", es
decir, que la disfunción del injerto y el daño del injerto
(irreversible en algunos casos) ya estén presentes, (b) el análisis
morfológico del injerto proporciona indicios moderados con respecto
al potencial para la inhibición de un episodio de rechazo dado, e
indicios mínimos con respecto a la posibilidad de reaparición
("recuperación"), y (c) las bases mecanicistas del fenómeno del
rechazo, un requisito previo para el diseño de estrategias
terapéuticas, se define mal mediante los índices de diagnóstico
\hbox{actuales, incluyendo las características morfológicas del
rechazo.}
La activación de células T desencadenada por
antígeno y la posterior infiltración de clones de células T CD8+ y
CD4+ activados, macrófagos, y células y linfocitos citolíticos
naturales (natural killer (NK) cells) en el injerto son
acontecimientos clave de rechazo de aloinjerto agudo. Aunque una
nefritis intersticial rica en células T es un distintivo de rechazo
de aloinjerto agudo, los episodios de rechazo clínico que responden
al tratamiento muestran a menudo solamente un infiltrado celular
moderado y se observan infiltrados similares en biopsias de
inspección obtenidas en aloinjertos renales que funcionan bien (Rush
et al., Transplantation 57: 208-211 (1994));
(Rush et al., Transplantation 59: 511-514
(1994)).
La presente invención se refiere al
descubrimiento de que el rechazo clínico está asociado con la
expresión de un subconjunto específico de genes de la activación
inmunitaria dependientes de células T que sirven como un indicador
diagnóstico del rechazo. Los patrones de generación de ARNm de
intrainjerto durante una respuesta de aloinjerto citopática son
sustancialmente diferentes de los observados en otras causas de
disfunción del injerto y pueden proporcionar información específica
y oportuna sobre los
\hbox{acontecimientos inmunitarios
relevantes para el rechazo del injerto.}
Más específicamente, tal como se describe en el
presente documento, el análisis combinado de tres marcadores
génicos o de la activación inmunitaria, perforina (P), granzima B
(GB), y ligando de Fas (FasL), proporciona una herramienta fiable
para la evaluación (por ejemplo, detección o diagnóstico y
seguimiento) del rechazo de aloinjerto renal celular agudo. La
determinación del aumento de transcritos de genes de dos cualquiera
de los tres genes indica rechazo de trasplante. Por ejemplo, un
incremento detectable de la expresión génica de perforina y
granzima B sin incremento detectable de la expresión génica de
ligando de Fas, indica el rechazo de trasplante.
Las perforinas y granzima B son proteínas
presentes en los gránulos de linfocitos T citotóxicos (CTL). Las
perforinas son moléculas que forman poros que pueden polimerizarse y
perforar la membrana celular. Las granzimas son una familia de
serina proteasas que se localizan conjuntamente con las perforinas
en los gránulos citoplasmáticos de CTL. La entrada de granzima B en
la célula diana por medio de canales creados por perforina da como
resultado la apoptosis de la célula diana. Las rutas independientes
de perforina de citólisis mediada por células, tales como la
interacción entre el antígeno de Fas (APO1) y ligando de Fas (FasL),
se han implicado en sistemas independientes de Ca^{2+} en los que
el monómero de perforina no puede polimerizarse pero todavía se
produce la citólisis mediada por células. Pavlakis, M. Trasplant.
Proc. 28(4):2019-2021 (1996).
El daño de CTL mediado por receptor FasL/Fas
inicia la muerte de la célula diana por medio de una ruta apoptótica
independiente de Ca^{2+}. La expresión de FasL de intrainjerto,
observada durante el rechazo de aloinjerto cardiaco murino, Larsen
et al, Transplantation 60:221-224 (1995), no
se ha investigado previamente en el trasplante clínico.
Estos marcadores génicos de la activación
inmunitaria pueden obtenerse a partir de una muestra biológica del
huésped. La muestra puede ser una muestra de sangre que contiene
células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "biopsia" se refiere a una muestra obtenida eliminando
tejido de pacientes vivos para examen de diagnóstico. El término
incluye biopsias por aspiración; biopsias por cepillo; biopsias de
vellosidad coriónica; biopsias endoscópicas; biopsias escisionales;
biopsias con aguja; (muestras obtenidas por eliminación mediante
aspiración a través de un trocar o una aguja apropiada que perfora
la piel o la superficie externa de un órgano, y dentro del tejido
subyacente que va a examinarse); biopsias abiertas; biopsias de
sacabocado (trépano); biopsias por raspado; biopsias de esponja;
biopsias en cuña; una biopsia por aspiración con aguja fina; una
biopsia con aguja de mininúcleo; y una biopsia con aguja de núcleo
percutánea convencional.
Tal como se describe en el presente documento,
el análisis combinado de tres genes de activación inmunitaria,
FasL, P, y GB, dio como resultado la detección estadísticamente
significativa del rechazo de trasplante comparado con un análisis
de cualquier transcrito génico individual. El aumento de la
expresión génica de al menos dos de los tres genes de CTL se
detecta solamente en muestras de riñones que sufren rechazo celular
agudo, mientras que la baja expresión de estos genes se limitó a
biopsias con otras causas de disfunción del injerto. Ocasionalmente
se encontraron transcritos de IL-15, FasL, y P
elevados pero no de IL-7, IL-10, o
GB, en las pocas muestras de rechazo crónico sometidas al
procedimiento. Este hallazgo propone una conexión
\hbox{entre
la causalidad de rechazo crónico y agudo.}
Es importante observar que la mera existencia de
un infiltrado leucocitario mononuclear, el distintivo para el
diagnóstico histopatológico de rechazo, puede no ser necesariamente
perjudicial para un trasplante. Las biopsias consecutivas obtenidas
a partir de aloinjertos renales que funcionan bien a los 3 y 6 meses
han mostrado frecuentemente infiltrados leucocitarios mononucleares
(Rush et al., Transplantation
57:208-211(1994)); (Rush et al.,
Transplantation 59: 511-514 (1994)) sin aumento
de expresión para citocinas, P, o GB (Lipman et al., J. Am.
Soc. Nephrol. 6: 1060 (1995)). No obstante, algunos de estos
injertos han desarrollado un rechazo crónico posterior (Rush et
al., Transplantation 59: 511-514 (1994)). En un
sistema experimental, un régimen de ciclosporina eficaz no evitó la
infiltración del injerto, pero tal tratamiento disminuyó la
frecuencia de células CD8+ que expresan P y G (Mueller et al.,
Transplantation 55: 139-145 (1993)). De acuerdo
con la idea de que mucha células T que infiltran el injerto no son
citodestructivas, en cortes histológicos de aloinjertos renales
humanos rechazados, solamente pocas células T muestran la expresión
de ARNm de P (Matsuno et al., Trasplant. Proc. 24:
1306-1307 (1992); Grimm, P. C. et al.,
Transplantation 59: 579-584 (1995). El número de
casos extremos examinados mediante los métodos descritos en el
presente documento sostienen el concepto de que un caso de rechazo
de infiltrado celular leve puede identificarse mediante el análisis
de la expresión génica de la activación inmunitaria.
Tal como se describe en el ejemplo 1
comparativo, el análisis simultáneo de la expresión génica de
intrainjerto de moléculas efectoras de CTL identificó el rechazo
agudo (RA) en aloinjertos renales con extraordinaria sensibilidad y
especificidad y puede introducirse como una herramienta de
diagnóstico fiable en el manejo clínico de los pacientes de
trasplante renal.
Los métodos descritos en el presente documento
usan la transcripción inversa competitiva (RT)-PCR
para evaluar la precisión diagnóstica de múltiples análisis de
genes de activación inmunitaria como un medio para diagnosticar el
rechazo de aloinjerto renal. Se cuantificó la magnitud de expresión
génica del intrainjerto de 15 genes de activación inmunitaria
mediante RT-PCR competitiva en 60 biopsias de núcleo
de aloinjerto renal obtenidas para la inspección o para
diagnosticar la etiología de la disfunción del injerto. Las
secuencias de los cebadores de oligonucleótidos y plantillas
competitivas que se usaron se muestran en la figura 1 y tabla 1. Se
compararon los resultados con un análisis clinicopatológico basado
en el diagnóstico histológico (criterios de Banff) y la respuesta
frente al tratamiento de antirrechazo.
Durante el rechazo de aloinjerto renal agudo, la
expresión del intrainjerto de los genes de interleucina
(IL)-7 (P < 0.001), IL-10 (P
< 0.0001), IL-15 (P < 0.0001), ligando de Fas
(P < 0.0001), perforina (P < 0.0001), y granzima B (P <
0.0015), pero no IL-2, interferón \gamma, o
IL-4, se aumentó de manera significativa. Las
RANTES amplificadas y los transcritos génicos de
IL-8 son marcadores sensibles pero no específicos
del rechazo. Una evaluación de RT-PCR simultánea de
perforina, granzima B, y ligando de Fas identificaron el rechazo
agudo, incluyendo casos con infiltración leve, con extraordinaria
sensibilidad (100%) y especificidad (100%). El tratamiento
antirrechazo eficaz dio como resultado una rápida regulación por
disminución de la expresión génica. Durante el rechazo se observó
un aumento de la expresión génica de quimiocinas
(IL-8, RANTES), factores de crecimiento de células
T no derivados de células T (IL-7,
IL-15) y moléculas efectoras selectivas de CTL.
Por tanto, el análisis cuantitativo de
RT-PCR de trascritos de IL-10 y
IL-15 de intrainjerto (macrófagos) y los genes
selectivos de CTL P, GB, y FasL proporcionaron una herramienta
altamente sensible y fiable para el diagnóstico de rechazo de
aloinjerto renal agudo. RANTES y transcritos de IL-8
demostraron ser indicadores sensibles pero no específicos del
rechazo. Los transcritos de IL-7 e
IL-17 se observaron solamente en el rechazo, pero
fueron frecuentes falsos negativos. La expresión génica de
IL-2 y IL-4 no se detectó en
muestras de rechazo, mientras que la expresión de los genes
IFN-\gamma, TGF-\beta 1, y CTLA4
no fue selectiva para el rechazo.
Además, los datos descritos en el presente
documento proponen que la expresión génica de IL-7,
IL-10, IL-15, y CTL mutados puede
servir como un indicador para el tratamiento antirrechazo eficaz
(figura 2). Este efecto puede suceder en el caso de regulación
génica o de eliminación celular. IL-2 y
IL-4 no se detectaron durante los episodios de
rechazo. Un estudio de biopsia de inspección en curso puede
determinar si (i) la expresión génica de IL-2
precede al rechazo clínicamente evidente tal como se observó en
modelos preclínicos (O'Connell et al., J. Immunol. 150:
1093-1104 (1993)) y (ii) la expresión génica de
IL-4 puede detectarse en aloinjertos estables a
largo plazo. La expresión génica de IL-4 acompaña
frecuentemente al injerto exitoso a largo plazo en ensayos
preclínicos (Strom et al., Curr. Opin. Immunol. 8:
688-693 (1996)).
También tal como se describe en el presente
documento, los métodos que usan RT-PCR con ARN
aislado de células mononucleares de sangre periférica, o PMBC, para
la expresión génica de perforina (P), granzima B(GB) y
ligando de Fas (FasL), detectó también con precisión el rechazo
agudo. Los resultados, descritos en el ejemplo 2, establecen que la
expresión de estos transcritos en las PBMC y tejido de biopsia del
núcleo están correlacionados y esta expresión está correlacionada
también con el diagnóstico histológico. Más específicamente, puede
someterse a prueba el rechazo de trasplante en las PBMC evaluando
la magnitud de expresión de los marcadores de la activación
inmunitaria P, GB y FasL, y adicionalmente detectando la presencia o
ausencia de un agente infeccioso.
Tal como se usa en el presente documento, un
"agente infeccioso" se refiere a cualquier agente que desempeña
un papel en la infección en un paciente con injerto. Los agentes
infecciosos incluyen bacterias, tales como Escherichia coli,
Klebsiella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, y Enterococcus;
hongos, tales como Candida albicans, Histoplasma capsulatum, y
Cryptococcus; virus, tales como virus de la hepatitis B y C,
virus de inmunodeficiencia humana, y virus del grupo de los herpes,
que incluyen virus herpes simple tipo 1, virus herpes simple tipo
2, virus de la varicela-zóster (VZV),
citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV),
herpesvirus humano 6, herpesvirus humano 7, virus asociado al
sarcoma de Kaposi (herpesvirus humano 8), y papovavirus; y
parásitos, que incluyen, pero no se limitan a, Plasmodium
falciparum, Toxoplasma gondii, strongyloides, stercoralis, y
Trypanosoma cruzi.
En una realización, el agente infeccioso
analizado es citomegalovirus (CMV). CMV es una infección peligrosa
y común en receptores de trasplante. Aparece generalmente en o tras
finalizar el primer mes posterior al trasplante. El 50% de todos
los receptores de trasplante renal que se presentan con fiebre de 1
a 4 meses tras el trasplante tienen evidencias de enfermedad por
CMV. Harrison's Principles of Internal Medicine, 14ª ed.
Fauci, A.S. et al., McGraw-Hill (1988). El
propio CMV explica la fiebre en más de 2/3 de los casos y por tanto
es el patógeno predominante durante este periodo. La infección por
CMV puede presentarse también como artralgias o mialgias. Esta
infección puede dar como resultado enfermedad primaria (en el caso
de un receptor seronegativo que recibe un riñón de un donante
seropositivo) o puede presentarse o bien como una superinfección o
bien como una reactivación de la enfermedad durante este intervalo.
CMV produce también glomerulopatía y está asociado con un aumento
de la incidencia de otras infecciones oportunistas (por ejemplo,
infección por hongos). Debido a la frecuencia y gravedad de la
enfermedad por CMV, se ha realizado un esfuerzo considerable para
intentar prevenir y tratarla en los receptores de trasplante renal.
La retinitis por CMV puede aparecer también como una infección
tardía (más de 6 meses tras el trasplante). Además, la infección
por CMV activa, se asocia y se confunde algunas veces con episodios
de rechazo de trasplante.
Tal como se describe en el ejemplo 2, los
resultados de las PBMC falsos positivos que indican rechazo de
trasplante agudo se obtuvieron a partir de dos pacientes con
infección por CMV. Por tanto, detectando de manera adicional la
presencia o ausencia de uno o más genes característicos de CMV puede
diferenciar de manera eficaz entre rechazo e infección por CMV. Por
ejemplo, además de cuantificar el ADNc que codifica para perforina,
granzima B y ligando de Fas, determinar la presencia o ausencia de
ADNc que codifica para un gen característico de CMV (u otro agente
infeccioso) puede determinarse simultáneamente, o posteriormente
mediante RT-PCR. Se han caracterizado en gran
detalle las propiedades genéticas del citomegalovirus, y se conocen
muy bien por los expertos en la técnica. (Véase, por ejemplo,
Virology. 2ª Ed., Fields, B.N. E., Raven Press, Ltd., N.Y.
(1990)), en las páginas 1595-2010. Se conocen las
secuencias cebadoras para CMV y están disponibles para los expertos
en la técnica. Véase Meyer König, U. et al. J. Infectious
Diseases, Vol. 171:705-709 (1995) Wright, P.A. y
D. Wynford-Thomas, J. Pathol., Vol. 162:99
(1990); Cassol, S.A. et al, J. Clin. Invest., Vol.
83:1109-1115 (1989). Por ejemplo, pueden usarse las
secuencias cebadoras TCC ACG CTG TTT TGA CCT CCA TAG (sentido de
CMV) (SEQ ID NO:31) y GAC ATC TTT CTC GGG GTT CTC GTT (antisentido
de CMV) (SEQ ID NO:32). Pueden idearse plantillas competitivas para
cuantificar con precisión transcritos de CMV y otros agentes
infecciosos usando los métodos descritos en el presente documento
para los genes marcadores de la activación inmunitaria. Véase
Clinical Laboratory Medicine, McClatchey, K.D., ed., William &
Wilkins, Baltimore, MD (1994) en 165-174.
Otros trasplantes, incluyendo de pulmón,
corazón, hígado y médula ósea, pueden someterse a prueba de un modo
similar. Por ejemplo, la realización, detección de transcritos del
virus de la hepatitis pueden diferenciar de manera eficaz entre
rechazo de trasplante de hígado e infección por hepatitis. Un
experto en la técnica puede diseñar cebadores para la detección de
los virus de la hepatitis usados en
\hbox{esta realización.
Véase Virology , supra , en las páginas
1981-2236.}
Como resultado de los datos descritos en el
presente documento, en la actualidad hay métodos disponibles para
el diagnóstico fiable y rápido del rechazo agudo, incluso en los
casos con solamente infiltrados celulares leves. Descrito por
primera vez en el presente documento, los análisis de transcritos de
genes de activación inmunitaria obtenidos a partir de las PBMC, con
análisis adicional de transcritos de CMV, detectan con precisión el
rechazo de trasplante. Usando los métodos descritos en el presente
documento, pueden identificarse marcadores de advertencia temprana
adicionales con el fin de utilizar la sensibilidad y especificidad
de RT-PCR para aclarar los patrones específicos de
activación génica en rechazos resistentes al
\hbox{tratamiento,
crónicos y vasculares perfeccionando los criterios de
diagnóstico.}
La presente invención se ilustrará ahora
mediante los siguientes ejemplos, que no están destinados de ningún
modo a ser limitativos.
Ejemplo 1
comparativo
Se investigaron sesenta biopsias de trasplante
de riñón para determinar la expresión génica de quimiocinas
(IL-8, RANTES (células T normales, reguladas por
activación expresadas y secretadas), factores de crecimiento de
células T y otras citocinas (IL-2,
IL-4, IL-7, IL- 10,
IL-15, e IL-17), proteínas
inmunorreguladoras de la superficie celular (CTLA4), moléculas
efectoras citotóxicas (P, GB, FasL), IFN-\gamma,
factor del crecimiento transformante
(TGF)-\beta1, y la proteína de mantenimiento
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH). Se obtuvieron treinta y ocho biopsias de 34
pacientes (25 adultos y 9 niños) para aclarar la causa de disfunción
del injerto, 20 para inspección posterior al trasplante temprana y
2 de riñones donantes relacionados vivos antes de la reperfusión.
Se congelaron de una vez inmediatamente pequeñas porciones de
núcleos biópsicos (1/10-1/2) en nitrógeno líquido
al lado de la camilla y se almacenaron a 70°C. La mayor parte del
tejido se usó para análisis histopatológico. Se clasificaron las
biopsias obtenidas para evaluar la causa de la disfunción del
injerto según los criterios de Banff (Solez et al., Kidney
Int. 44: 411-422 (1993)) como rechazo
(tratamiento previo n = 12, tratamiento posterior n = 3), sin
rechazo (necrosis tubular aguda, nefrotoxicidad de ciclosporina n =
12), rechazo crónico (n = 3), reaparición de enfermedad primaria (n
= 4), u otras complicaciones (n = 4). En 4 de 12 muestras de
rechazo y 4 de 12 muestras de necrosis tubular aguda se observó un
infiltrado celular leve (casos extremos) y se confirmó el
diagnóstico de rechazo mediante una respuesta clínica beneficiosa
frente a corticosteroides o tratamiento con OKT3.
Se realizaron procedimientos para el aislamiento
de ARN de tejido y transcripción inversa en ADNc tal como se
describe en detalle (Lipman et al., J. Immunol. 152:
5120-5127 (1994)). En resumen, se aisló el ARN total
mediante homogenización de tejido en isotiocianato de
guanidina/2-mercaptoetanol y ultracentrifugación en
CsCl. Se transcribió de manera inversa un microgramo de ARN mediante
la transcriptasa del virus de la leucemia murino de Moloney y se
diluyó hasta un volumen final de 40 \mul.
Se cuantificó la expresión de transcritos de
genes específicos identificados en el tejido de biopsia mediante
RT-PCR competitiva tal como se describe en Lipman,
M., et al., J. Immunol., 152:5120-5127 (1994)
La RT-PCT competitiva se describe también en Bunn
et al. (patente de los EE.UU. número 5.213.961). El ADNc
derivado de muestras biópsicas se coamplificó con una cantidad
conocida de un fragmento de ADNc de gen diana mutado (el competidor
específico de gen). Los oligonucleótidos sentido y antisentido
amplificaron de manera proporcional tanto el competidor como las
secuencias de ADNc transcritas de manera inversa con su abundancia
inicial relativa en la PCR. (Las secuencias aparecen en la figura 1
y tabla 1 como SEQ ID NOS: 1-30).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se separaron los productos de PCR mediante
electroforesis en gel de agarosa, se tiñeron con bromuro de etidio,
fotografiaron en luz UV con película positivo/negativo Polaroid tipo
55, y se escanearon mediante densitometría por láser (LKB
Ultrascan). La razón de densidades (plantilla competitiva (CT)/ADNc
transcrito de manera inversa) refleja las cantidades iniciales de
ADNc añadidas (pg de plantilla competitiva por pg de ADNc transcrito
de manera inversa). Se generaron las curvas patrón mediante
diluciones en serie de los competidores específicos del gen con una
cantidad constante de ADNc transcrito de manera inversa control,
permitiendo por tanto la cuantificación del transcrito génico de
tipo natural.
Se identificó fácilmente el ADN genómico
contaminante mediante las diferencias de tamaño, a medida que todas
las sondas de oligonucleótidos se seleccionaron como diana para
separar los exones del gen de interés. Las condiciones usadas para
todas las PCR competitivas fueron idénticas: 94°C durante 30 s, 55°C
durante 20 s, 72°C durante 20 s, 10 minutos de extensión a 72°C
tras 35 ciclos (Perkin-Elmer Cetus 480). Se
generaron los competidores a partir de blastos estimulados con
fitohemaglutinina o tejido de nefrectomía mediante cuatro técnicas
diferentes (figura 1): (i) excisión de un fragmento de 50 a 100 pb
en el centro del ADNc del gen diana usando enzimas de restricción
apropiadas (GAPDH, IFN-\gamma,
IL-10, IL-15, IL-17,
P, y GB); (ii) amplificación de las partes externas del ADNc
mediante dos PCR separadas y ligación de nuevo de estos fragmentos
(CTLA4, IL-7, FasL); (iii) inserción de un
fragmento corto de ADN en la secuencia diana (IL-2,
IL-4, TGF-1, o deleción del cebador
(IL-4)); y (iv) generación en una etapa de una
secuencia de ADN acortada mediante el uso de un cebador de doble
sentido diseñado de manera específica. Se clonaron los competidores
en un vector TA (Invitrogen, San Diego), se transfectaron en
células de DH5a (Promega), se purificaron y cuantificaron mediante
espectrometría de UV.
La amplificación del gen GAPDH expresado de
manera universal sirvió para confirmar el aislamiento de ARN y la
transcripción inversa exitosos. Se calculó la magnitud de la
expresión génica diana como pg de ADNc del gen diana por pg de ADNc
de GAPDH.
Se realizaron análisis estadísticos usando una
prueba de Newman-Keuls para determinar los datos
distribuidos normalmente o una prueba de
Kruskal-Wallis.
La pequeña cantidad de tejido disponible para
este estudio (de 1/10 a 1/2 de un núcleo de biopsia) demostró ser
suficiente para un análisis riguroso de la expresión génica. El
rendimiento de ARN osciló desde 1 a 20 \mug, dependiendo del
tamaño del fragmento de biopsia, permitiendo 40-800
PCR por muestra. Fue necesario un análisis cuantitativo de la
expresión génica, debido a que los niveles bajos de transcritos son
detectables en muchas biopsias, mientras que el aumento de la
expresión de los genes seleccionados se produjo solamente durante
el rechazo (figura 2A-F,
tabla 2).
tabla 2).
Se detectó un aumento de la expresión génica
durante el rechazo agudo para IL-7,
IL-8, RANTES, IL-10,
IL-15, IL-17, CTLA4, y todas las
moléculas efectoras de los tres CTL, por ejemplo, GB, P, y FasL
(figura 2A-F). La expresión de GB e
IL-10 (P < 0.0015 y P < 0.0005) demostró ser
marcadores significativos y específicos de rechazo agudo pero no
crónico, mientras que la transcripción de IL-15 (P
< 0.0015), FasL, y P (P < 0.0001 y P < 0.0001) se aumentó
durante el rechazo de aloinjerto agudo y en algunas de las muestras
de rechazo crónico analizadas. La magnitud de la expresión de genes
específicos de CTL individuales no estaba conectada, y no se
encontró ninguna evidencia de que las rutas mediadas por receptor
(FasL) o dependientes de gránulos (GB, P) se activaran de manera
alternativa. Se observaron los transcritos de IL-7 e
IL-17 exclusivamente, pero no de manera fiable en
muestras de rechazo, mientras que se encontró un incremento de ARNm
de RANTES e IL-8 tanto en el rechazo como en la
disfunción del injerto relacionado con otras causas. El nivel más
alto de cualquier expresión del gen diana medida fue 4,4 veces más
alto que la cantidad de expresión génica de GAPDH en esta muestra
(FasL en un episodio de rechazo agudo). La expresión génica de
IL-2 y IL-4 no acompañó a los
episodios de rechazo.
La precisión de este enfoque molecular basado en
PCR para verificar el rechazo puede mejorarse considerablemente
mediante un análisis simultáneo de la expresión génica de CTL (tabla
3). Si se establece un nivel de discriminación para el aumento de
la expresión génica en la media \pm un intervalo de confianza del
95% de los valores observados en riñones sin rechazo (máximo 0,07
pg/pg de GAPDH para B, 0,4 pg/pg de GAPDH para FasL, y 0,8 pg/pg de
GAPDH para P), el análisis combinado de todas las moléculas
efectoras de los tres CTL identifica el rechazo celular agudo,
incluyendo casos extremos con una sensibilidad del 100% y una
especificidad del 100% en nuestras series (P < 0.0001).
La magnitud de la expresión génica indicativa
para los genes asociados a rechazo, es decir, GB, P, y FasL,
aparentemente disminuye tras la iniciación del tratamiento
antirrechazo eficaz (OKT3 o pulsos de esteroides) tal como se
muestra como ejemplo en las pocas muestras de biopsia consecutivas
analizadas (figura 2).
Las biopsias de inspección posteriores al
trasplante mostraron niveles similares de transcritos de
IL-7, IL-10, IL-17,
y GB comparado con riñones sin rechazo, mientras que las muestras
posteriores al trasplantes tempranas (día 4 y 11) revelaron que los
niveles de ARNm de IL-15, CTLA4, P, y FasL eran de 2
a 5 veces más altos y mostraron una tendencia a disminuir en el
plazo de la primera semana. En una toma de muestras limitada, la
expresión génica posterior al trasplante temprana no fue predictiva
para el desarrollo posterior de los episodios de rechazo.
Ejemplo
2
En un estudio de 16 receptores de aloinjerto
renal, se aislaron las PBMC a partir de sangre total y se extrajo
ARN mediante un método de QIAGEN™ modificado. (QIAGEN Rneasy Blood
Mini Kits, Cat. No. 74303, 74304 o 74305). La técnica de QIAGEN
implica cuatro etapas: 1) se combina una muestra con un tampón
adecuado para aislar el ARN de la muestra a partir de los
componentes que permanecen, por ejemplo, 1 parte de sangre total, se
mezcla con 5 partes de tampón lisante, en el que se lisan las
células de sangre y se libera el ARN; 2) se une de manera
específica el ARN de la muestra a las partículas o una membrana; 3)
se lavan las partículas o membrana para eliminar los componentes
distintos de ARN; y 4) se eluye el ARN aislado a partir de las
partículas/membrana.
Para incrementar la eficacia del aislamiento de
ARN a partir de las PBMC, se modificó la segunda etapa del
protocolo de QIAGEN tal como se describe en el ejemplo 3.
Se analizó la expresión génica mediante PCR
semicuantitativa asistida por transcripción inversa en PMBC y en
biopsias de núcleo de trasplantes congeladas de una vez y se comparó
con los resultados histopatológicos (AR = 12 y sin rechazo NR = 4).
La expresión génica coordinada en las PBMC y los injertos AR se
observó en 11/12 (92%) para P, 10/12 (83%) para GB y 9/12 (75%)
para FasL. Pudo predecirse con precisión la patología de la biopsia
mediante la regulación por incremento de al menos 2 de los 3 genes
en las PBMC en todos los casos. En las muestras NR, se observó la
expresión génica falso positivo en las PBMC en 2/4 (50%) para P,
2/4 (50%) para GB y 1/4 (25%) para FasL si se compara con la
expresión génica de intrainjerto. Se obtuvieron resultados de PBMC
falsos positivo de 2 pacientes con infección por CMV. La
histopatología de la biopsia en las muestras NR se predijo con
precisión mediante la no expresión de 2 de los 3 genes en las PBMC
en los 2 pacientes sin infección por CMV. Estos resultados indican
que la evaluación de la expresión génica de CTL en las PBMC con
evaluación de los marcadores para CMV puede usarse para valorar la
necesidad de biopsia de aloinjerto y evaluar el rechazo de
trasplante agudo.
Ejemplo
3
- Tubos de vacío de 2 ml de EDTA (tapón morado): número cat. 369651 Vacutainer; Frasco con hielo.
- Etiquetar los tubos de EDTA con el ID del paciente, fecha y hora.
- Sacar 2 ml de sangre en el tubo de EDTA y mezclar cuidadosamente mediante inversión; transportar sobre hielo al laboratorio para someterse al proceso.*
*Para resultados óptimos, deberían tratarse las
muestras de sangre en el plazo de pocas horas.
- Jeringuillas de 3 cc
- Tubos cónicos estériles de 15 ml (Falcon) - tubos de polipropileno estériles (20-200 - 1000 \mul)
- Medio RPMI 1640: número cat. 11875-085 Gibco BRL
- Tampón EL: número cat. 79217 Qiagen
- Frasco con nitrógeno líquido: número cat. 2123 Lab-Line.
- Etanol (96-100%) -70% etanol en agua
- \beta-mercaptoetanol 14,5 M (\beta-ME)
- Centrífuga de laboratorio con rotor para tubos de 15 ml - microcentrífuga de 4C con rotor para tubos de 2 ml
- Centrífuga de laboratorio con rotor para tubos de 15 ml a 4C.
- 1.
- Transferir 1-1,5 ml de sangre a un tubo de 15 cc usando una jeringuilla de 3 cc.
- 2.
- Mezclar la muestra con tampón EL 7,5 (1 ml/5 ml de tampón EL)
- 3.
- Incubar durante 10-15 minutos sobre hielo. Mezclar agitando con vórtex brevemente 2 veces durante la incubación. Si la suspensión turbia no se vuelve traslúcida, prolongar la incubación sobre hielo hasta 20 minutos.
- 4.
- Centrifugar a 400 x g durante 10 minutos a 4C, buscar el sedimento y desechar todo el sobrenadante. Si el sedimento es rojo, incubar durante 5-10 minutos adicionales sobre hielo tras la adición del tampón EL en la etapa 5.
- 5.
- Añadir 2 ml de tampón EL al sedimento celular. Resuspender las células usando un pipeta para eliminar con cuidado los glóbulos rojos. Añadir medio de cultivo RPMI suficiente para llenar un tubo de 10 cc, colocar sobre hielo.
- 6.
- Centrifugar de nuevo tal como en la etapa 4, desechar el sobrenadante y asegurarse de que el sedimento está totalmente libre de sangre. Si no es así, repetir la etapa 5.
- 7.
- Colocar el tubo con el sedimento en el bote con nitrógeno líquido para congelar de una vez.
- \text{**}
- Almacenar a -70 grados centígrados.
- \text{**}
- Esta es una etapa crucial. El ARN permanece en la muestra congelada de una vez almacenada a -70ºC. Sin embargo, se degradará rápidamente si el sedimento se descongela o si se retrasa el congelado de una vez o el almacenamiento.
- 8.
- Añadir 600 \mul de tampón RLT (añadir 2ME) a los glóbulos blancos sedimentados. Agitar con vórtex o pipetear hasta mezclar. No debe ser visible sedimento de glóbulos blancos tras esta etapa.
- 9.
- Transferir la disolución de lisis a una columna Qiashedder y rotar 2 min a 14-18.000 rpm.
- 10.
- Desechar la columna y añadir una cantidad igual de etanol al 70% a la disolución de lisis y mezclar pipeteando.
- 11.
- Aplicar 500 \mul a la columna RNeasy y rotar 15 segundos con 10.000 rpm, desechar el flujo a través y repetir con cualquier líquido restante.
- 12.
- Desechar el flujo a través y pipetear 700 \mul de tampón de lavado RW1 a la columna agitada, centrifugar durante 15 segundos a 10.000 rpm y desechar el flujo a través.
- 13.
- Colocar la columna agitada en un tubo nuevo de recogida de 2 ml, pipetear 500 \mul de tampón de lavado RPE a la columna y centrifugar tal como anteriormente. Desechar el flujo a través.
- 14.
- Pipetear 500 ml de tampón de lavado RPE a la columna y centrifugar durante 2 minutos a toda velocidad para secar la columna; desechar el flujo a través.
- 15.
- Transferir la columna agitada a un tubo Eppendorf de 1,7 ml y eluir el ARN con 30 \mul de agua pura o tratada con DEPC. Rotar durante 1 minuto a 10.000 rpm. Repetir esta etapa con 30 \mul de agua para la elución adicional en el mismo tubo de recogida.
- 16.
- Medir el ARN mediante espectroscopía de UV y almacenar a -70°C. Si se eluye poco o nada de ARN, añadir de nuevo 30 \mul de agua DEPC a la columna agitada a temperatura ambiente durante 10 min, entonces repetir la etapa 15.
Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán
establecer, no usando más que experimentación rutinaria, muchos
equivalentes a las realizaciones específicas de la invención
descritas de manera específica en el presente documento. Tales
equivalentes están pensados para englobarse en el alcance de las
siguientes reivindicaciones.
Claims (28)
1. Método de evaluación del rechazo de
trasplante en un huésped, comprendiendo el método evaluar la
expresión de al menos dos genes seleccionados del grupo que
consiste en perforina, granzima B, y ligando de Fas en una muestra
de prueba posterior al trasplante obtenida del huésped que comprende
una muestra de células mononucleares de sangre periférica, líquido
linfático, líquido peritoneal, o líquido pleural, en el que la
regulación por incremento de los al menos dos genes indica el
rechazo de trasplante en el huésped.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el trasplante comprende un órgano o tejido.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
el órgano es un riñón, hígado, corazón o pulmón.
4. Método según la reivindicación 2, en el que
el tejido comprende médula ósea.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el trasplante es un
xenoinjerto.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el trasplante es un
aloinjerto.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que uno de los al menos dos genes es
perforina.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que uno de los al menos dos genes es
granzima B.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la evaluación de la expresión de
los al menos dos genes comprende determinar la cantidad de cada uno
de los transcritos de los al menos dos genes en la muestra de
prueba posterior al trasplante y comparar cada cantidad con la
magnitud de referencia de la expresión génica de cada uno de los
dos genes correspondientes.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la evaluación de la expresión de
los al menos dos genes comprende determinar la cantidad de cada uno
de los transcritos de los al menos dos genes y comparar cada
cantidad con la cantidad de transcritos de un gen expresado de
manera estructural.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
el gen expresado de manera estructural es
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH).
12. Método según la reivindicación 10, en el que
el gen expresado de manera estructural es actina.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que el rechazo del trasplante es un
rechazo de trasplante agudo.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
el rechazo del trasplante es un rechazo de trasplante renal
agudo.
15. Método según la reivindicación 14, que
comprende además evaluar la expresión de una
interleucina-7 (IL-7), una
interleucina-10 (IL-10) y una
interleucina-15 (IL-15), en el que
la regulación por incremento de los genes de IL-7,
IL-10 e IL-15 genes indica el
rechazo de trasplante en el huésped.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, que comprende además evaluar, en la muestra
de prueba posterior al trasplante líquida, la expresión de un gen
de un agente infeccioso, en el que la ausencia de expresión de un
gen de un agente infeccioso en presencia de una regulación por
incremento de los al menos dos genes seleccionados del grupo que
consiste en perforina, granzima B, y ligando de Fas indica rechazo
de trasplante en el huésped.
17. Método según la reivindicación 16, en el que
el agente infeccioso es un virus.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
el virus es un citomegalovirus.
19. Método según la reivindicación 17, en el que
el virus es un papovavirus.
20. Método según la reivindicación 17, en el que
el virus es un virus de la hepatitis.
21. Método según la reivindicación 16, en el que
el agente infeccioso es una bacteria.
22. Método según la reivindicación 21, en el que
la bacteria es Escherichia coli.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, en el que la evaluación de la expresión de
los al menos dos genes comprende realizar una reacción en cadena de
la polimerasa de transcripción inversa competitiva.
24. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, en el que la muestra de prueba posterior al
trasplante líquida se obtiene del huésped en el plazo de 7 días del
trasplante.
25. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, en el que el huésped es un huésped
humano.
26. Uso de un kit en un método según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 25, comprendiendo el kit cebadores
adecuados para evaluar la expresión de perforina, granzima B,
ligando de Fas y GAPDH en una muestra biológica.
27. Uso de un kit en un método según cualquiera
de las reivindicaciones 16 a 25, comprendiendo el kit cebadores
adecuados para evaluar la expresión de perforina, granzima B,
ligando de Fas y GAPDH y un reactivo para detectar la presencia de
un agente infeccioso en una muestra biológica.
28. Uso según la reivindicación 26 ó 27, en el
que los cebadores comprenden moléculas de ácido nucleico que
presentan las secuencias de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:17
y SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20; y SEQ ID NO: 21 y SEQ
ID NO:22.
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