ES2280211T3 - Metodo para eliminar residuos de alanina, situados en extremos terminales de n, a partir de polipeptidos, con una aminopeptidasa procedente de aeromonas. - Google Patents

Abstract

Un método para eliminar un residuo alanilo situado en extremos terminales de N a partir de una proteína recombinante seleccionada entre el conjunto formado por derivados de Ala en extremos terminales de N de una hormona humana del crecimiento, somatotropina humana, somatotropina porcina, somatotropina bovina y un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, que comprende poner en contacto dicha proteína recombinante con una aminopeptidasa inmovilizada procedente de Aeromonas, para disociar el residuo alanilo, y recuperar la resultante proteína recombinante.

Description

Método para eliminar residuos de alanina, situados en extremos terminales de N, a partir de polipéptidos, con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas.

Este invento describe un método para eliminar residuos de alanina, situados en extremos terminales de N, a partir de proteínas recombinantes, usando una aminopeptidasa que se deriva de la bacteria marina Aeromonas proteolytica. De modo correspondiente, la aminopeptidasa procedente de Aeromonas (AAP; E.C. 3.4.11.10) se puede usar para eliminar residuos de alanilo, situados en extremos terminales de N, a partir de derivados de somatotropina humana (hST, hormona humana del crecimiento, o hGH), somatotropina porcina (pST) y somatotropina bovina (bST), por ejemplo, para proporcionar unas proteínas que tienen sus secuencias de aminoácidos naturales. Las reacciones enzimáticas se pueden llevar a cabo en una solución libre, o la AAP se puede inmovilizar sobre un soporte sólido, para reacciones llevadas a cabo in vitro. Un método eficiente para convertir una Ala-hGH en una hGH, por ejemplo, comprende una expresión de la Ala-hGH en el seno de E. coli, una recuperación de cuerpos de inclusión, una solubilización y un repliegue en un detergente, una eliminación del detergente por ultrafiltración, una precipitación selectiva, una disociación con enzimas, seguida por dos etapas de cromatografía en columna.

Las proteínas recombinantes que imitan a, o tienen la misma estructura que las proteínas naturales, son altamente deseadas para usarse en aplicaciones terapéuticas, como componentes en vacunas y estuches para ensayos de diagnóstico, y como reactivos para estudios de estructura/función. Se usan corrientemente células de mamíferos, bacterias e insectos para expresar proteínas recombinantes para tales aplicaciones. Sin embargo, se usan sistemas de expresión bacterianos con frecuencia cuando se necesitan grandes cantidades de una proteína para estudios experimentales o clínicos, y la proteína es capaz de ser replegada a su apropiada conformación. En particular, los sistemas bacterianos ofrecen importantes ventajas de costos con respecto a otros sistemas de vectores de expresión cuando no se requieren, o no se desean, en el producto proteínico final, modificaciones eucarióticas posteriores a la traducción (p.ej. una glicosilación).

Las proteínas recombinantes expresadas en bacterias, tales como E. coli, son secuestradas con frecuencia dentro de cuerpos de inclusión insolubles. Las proteínas heterólogas cosechadas a partir de los cuerpos de inclusión retienen con frecuencia un residuo de aminoácido adicional, tal como el de metionina, junto a su extremo terminal de amino. Con frecuencia, este residuo de metionina (codificado por el codón de iniciación ATG) no está presente, sin embargo, en proteínas naturales o recombinantes cosechadas a partir de células anfitrionas eucarióticas. Los extremos terminales de amino de muchas proteínas producidas en el citoplasma de E. coli, sin embargo, son tratados por medio de enzimas, tales como una aminopeptidasa de metionina (Ben Bassat y colaboradores, J. Bacteriol. 169: 751-757, 1987), de manera tal que después de una expresión la metionina es disociada ordinariamente desde el extremo terminal de N.

Se influye de muchas maneras diferentes sobre la composición de aminoácidos de los extremos terminales de proteínas (Berezovsky y colaboradores, Protein Engineering 12(1): 23-30, 1999). Un examen sistemático de las actividades de N-exopeptidasas condujo al descubrimiento del "extremo terminal de N" o de la "regla del extremo de N": El extremo terminal de N, (f)Met, es disociado si el siguiente aminoácido es Ala, Cys, Gly, Pro, Ser, Thr o Val. Si este siguiente aminoácido es Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Ile, Leu, Lys o Met, el (f)Met inicial permanece como el primer aminoácido de la proteína madura. Los radios de hidratación de las cadenas laterales de aminoácidos se propusieron como base física para estas observaciones (Bachman y colaboradores, Science, 234: 179-186, 1986; Varshavsky, Cell, 69: 725-735, 1992). La semi-vida de una proteína (desde 3 min hasta 20 horas) es influenciada espectacularmente por la estructura química del aminoácido situado en extremos terminales de N (Stewart y colaboradores, J. Biol. Chem., 270: 25-28, 1995; Griegoryev y colaboradores, J. Biol. Chem., 271: 28521-28532, 1996). Se usó subsiguientemente una mutagénesis dirigida a un sitio para confirmar la "regla del extremo de N" por vigilancia del lapso de vida de proteínas recombinantes que contienen secuencias alteradas de aminoácidos en extremos terminales de N (Varshavsky, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12142-12149, 1996). Un análisis estadístico de las secuencias de aminoácidos en los extremos terminales de N de proteínas, sugirió que los residuos Met y Ala están representados en exceso en la primera posición, mientras que en las posiciones +2 y +5 se prefiere el residuo Thr (Berezovsky y colaboradores, Protein Engineering 12(1): 23-30, 1999). Sin embargo, las influencias sobre los extremos terminales de C muestran una preferencia para aminoácidos y residuos de Cys cargados (Berezovsky y colaboradores, Protein Engineering 12(1): 23-30, 1999).

Las proteínas recombinantes que retienen a la metionina en extremos terminales de N tienen, en algunos casos, unas características biológicas que difieren de las de la especie natural en la que falta la metionina en extremos terminales de N. Una hormona humana del crecimiento, que retiene su metionina en extremos terminales de N (Met-hHG), por ejemplo, puede favorecer la inducción de anticuerpos indeseables, en comparación con una hGH purificada a partir de fuentes naturales o con una hGH recombinante que se prepara de manera tal que tenga la misma secuencia primaria que una hGH natural (que carece de una metionina en extremos terminales de N). Con frecuencia se desean para aplicaciones terapéuticas unos métodos de bajo costo para generar proteínas recombinantes que imitan a la estructura de proteínas naturales (Sandman y colaboradores, Bio/Technology, 13:504(6) (1995)).

Un método para preparar proteínas naturales en bacterias consiste en expresar la proteína deseada como una parte de una proteína de fusión de mayor tamaño, que contiene un sitio de reconocimiento para una endoproteasa que disocia específicamente secuencia arriba desde el comienzo de las secuencias de aminoácidos naturales. Los sitios de reconocimiento y de disociación pueden ser los que han sido reconocidos por peptidasas de señal naturales, que cortan específicamente al péptido de señal de los extremos terminales de N de una proteína destinada a su suministro a una membrana o a su secreción a partir de la célula. En otros casos, se pueden establecer por ingeniería genética sitios de reconocimiento y de disociación en el gen que codifica una proteína de fusión, de manera tal que una proteína recombinante es susceptible a otras endoproteasas no naturales in vitro o in vivo. El factor de coagulación de sangre Xa, colagenasa, y la enzima enterocinasa, por ejemplo, se pueden usar para liberar diferentes marcas de fusión a partir de una diversidad de proteínas. Sin embargo, ciertas consideraciones económicas excluyen generalmente la utilización de endoproteasas a una gran escala para un uso farmacéutico.

Otro método para preparar proteínas naturales en bacterias consiste en usar la enzima aminopeptidasa de metionina (MAP) para tratar y eliminar la metionina de extremos terminales de N a partir de proteínas recombinantes derivadas de E. coli. Una Met-hGH, por ejemplo, se puede tratar con MAP para generar una hGH. Las patentes de los Estados Unidos de América 4.870.017 y 5.013.662 describen la clonación, la expresión y el uso de una aminopeptidasa de metionina procedente de E. coli para eliminar la Met a partir de una diversidad de péptidos y de Met-IL-2. Se analizó la capacidad de liberar aminoácidos a partir de una diversidad de substratos de péptidos, revelando que la MAP disocia la metionina de extremos terminales de N solamente en péptidos que tienen una longitud de por lo menos tres aminoácidos. La naturaleza de los aminoácidos en las posiciones segunda y tercera también manifiesta ser importante. Se liberaba metionina, por ejemplo, a partir de Met-Ala-Met; Met-Gly-Met, Met-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu (SEQ ID NO: 1), y Met-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys (SEQ ID NO: 2), pero no a partir de Met-Phe-Gly, Met-Leu-Phe, Met-Met-Met, entre otras. No se liberaban aminoácidos a partir de Leu-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu (SEQ ID NO: 3), Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu (SEQ ID NO: 4), o Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys (SEQ ID NO: 5).

El documento de solicitud de patente internacional WO 84/02351 describe un procedimiento para preparar proteínas (naturales) maduras, tales como una hormona humana del crecimiento o una proinsulina humana, a partir de proteínas de fusión que usan una aminopeptidasa de leucina. Una proteína de fusión, que tiene la secuencia de aminoácidos (Y_{m}...Y_{2}Y_{1})- Pro)_{p}-(X_{1}X_{2}...X_{n}) en la que (Y_{m}...Y_{2}Y_{1})- Pro)_{p} es la pro-secuencia y el resto es la proteína madura, m es un número entero mayor que 2, Y es un aminoácido arbitrario, p es 0, si X_{1} o X_{2} es Pro, y es 1, si X_{1} o X_{2} es diferente de Pro, X es un aminoácido arbitrario, y n es un número entero mayor o igual que 4, es convertida por disociación escalonada con una aminopeptidasa que elimina los aminoácidos Y_{m}...Y_{2} si p es = 1 o X_{1} es = Pro, o los grupos Y_{m} hasta Y_{2}-Y_{1}, si X_{2} es = Pro, y luego los dos aminoácidos Y_{1}-Pro, si p es = 1, son disociados enzimáticamente en una o dos etapas de una manera conocida de por sí, y similarmente es disociado el Y_{1} a solas, si X_{1} es = Pro.

El documento de solicitud de patente europea EP 0.204.527 A1 describe un método para eliminar la metionina de extremos terminales de N a partir de proteínas de la fórmula H-Met-X-Pro-Y-OH, para proporcionar una proteína representada por la fórmula H-X-Pro-Y-OH, en la que X es un aminoácido distinto de prolina e Y es una cadena de péptido. La aminopeptidasa M era preferida, pero también se podría usar la aminopeptidasa de leucina, la aminopeptidasa PO o la aminopeptidasa P. La metionina de extremos terminales de N era eliminada a partir de derivados de interleucina-2 humana y de una hormona humana del crecimiento.

Una aminopeptidasa procedente de Aeromonas (AAP), que es una exo-peptidasa aislada a partir de la bacteria marina Aeromonas proteolytica, se puede usar también para facilitar la liberación de aminoácidos en extremos terminales de N a partir de péptidos y proteínas (Wilkes y colaboradores, Eur. J. Biochem. 34(3), 459-66, 1973). La secuencia más favorable es X-//-Y- mientras que Y es un residuo hidrófobo, preferiblemente un aminoácido aromático, tal como fenilalanina. Los residuos susceptibles a una hidrólisis incluyen todos los aminoácidos hidrófobos, aromáticos y básicos, más prolina. No se eliminaban residuos de aspartilo, glutamilo y de ácido cisteico a partir del extremo terminal de N de ninguno de los substratos ensayados, ni siquiera en altas concentraciones de la enzima. Sin embargo, se liberaban asparagina, glutamina y cisteína aminoetilada, a partir de substratos de oligopéptidos. La glicina era generalmente resistente a la hidrólisis, pero se liberaba lentamente a partir de algunos substratos, dependiendo de los residuos adyacentes. La actividad de AAP sobre substratos de péptidos se puede intensificar también cambiando los iones metálicos de signo contrario, tales como Cu^{2+} y Ni^{2+} por la enzima AAP libre (Prescott y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Comm. 114(2): 646-652, 1983). La AAP es una metaloenzima de 29,5 kDa que contiene dos enlaces de disulfuro.

La patente europea EP 0191827 B1 y la patente de los EE.UU. 5.763.215 describen la eliminación secuencial de aminoácidos situados en extremos terminales de N a partir de compuestos análogos a proteínas eucarióticas, formadas en un anfitrión ajeno, por medio del uso de una aminopeptidasa procedente de Aeromonas. Cuando se mezclaron 8 mg de una metionil-hormona humana del crecimiento (Met-hGH) (disueltos en 1 ml de un tampón de borato de Na 10 mM, de pH 9,5) con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas (disuelta a 0,4725 mg/ml en un tampón Tris de pH 9,5) en una relación de 900 a 19, y se incubaron a 37ºC, la disociación de la metionina estaba completa en 15 min. La disociación del nuevo aminoácido leucina situado en extremos terminales de N era ligera después de 22 h. Las metioninas situadas en extremos terminales de N de Met-pST, Met-interferón, Met-IGF-1, Met-interleucina-2 (Met-IL-2) y Met-apoliproproteína E fueron eliminadas mediante una AAP. Una alanina de extremos terminales de N, sin embargo, no era eliminada a partir de una superóxido dismutasa madura.

Se pueden usar métodos más complicados con el fin de generar proteínas recombinantes con un extremo terminal de amino natural. La patente de los Estados Unidos 5.783.413, por ejemplo, describe el uso simultáneo o secuencial (a) de una o más aminopeptidasas, (b) de una ciclotransferasa de glutamina, y (c) de una aminopeptidasa de piroglutamina para tratar proteínas prolongadas en extremos terminales de amino de la fórmula NH_{2}-A-glutamina-proteína-COOH, para producir una deseada proteína natural. La(s) primera(s) aminopeptidasa(s) (seleccionada(s) entre el conjunto que consiste en dipeptidil-aminopeptidasa I, aminopeptidasa procedente de Aeromonas, aminopeptidasa P y aminopeptidasa de prolina), cataliza(n) la eliminación de residuos situados en extremos terminales de amino con respecto a la glutamina. La ciclotransferasa de glutamina cataliza la conversión de la glutamina en piroglutamina y la aminopeptidasa de piroglutamina cataliza la eliminación de piroglutamina para producir el deseado producto proteínico.

Las patentes de los Estados Unidos 5.565.330 y 5.573.923 describen unos métodos para eliminar dipéptidos a partir de los extremos terminales de amino de polipéptidos precursores, que implican un tratamiento del compuesto precursor con una dipeptidil-aminopeptidasa (dDAP) procedente del moho del lodo Dictyostelium discoideum, que tiene una masa de aproximadamente 225 kDa y un valor óptimo del pH de aproximadamente 3,5. Compuestos precursores de la insulina humana, compuestos análogos a la insulina humana y una hormona humana del crecimiento, que contienen prolongaciones de dipéptidos, se trataron mediante una dDAP cuando la dDAP estaba en una solución libre y cuando ésta estaba inmovilizada sobre una apropiada superficie de soporte sólido.

Son deseables unas estrategias más eficientes para tratar y eliminar aminoácidos desde el extremo terminal de N de proteínas recombinantes, con el fin de reducir el costo de generar proteínas terapéuticas que imiten a la estructura de proteínas naturales. Unos métodos que aumenten los niveles de expresión o faciliten el tratamiento secuencia abajo de proteínas recombinantes, también acelerarán la selección y el desarrollo de pequeñas moléculas químicas y de otras moléculas basadas en proteínas, destinadas a ensayos clínicos a gran escala.

El invento se refiere a un método para eliminar un residuo alanilo situado en extremos terminales de N a partir de una proteína recombinante, seleccionada entre el conjunto de los derivados de Ala situados en extremos terminales de N de una hormona humana del crecimiento, somatotropina humana, somatotropina porcina, somatotropina bovina y un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, que comprende poner en contacto dicha proteína recombinante con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas, inmovilizada, para disociar el residuo alanilo, y recuperar la resultante proteína recombinante.

La proteína recombinante se selecciona entre el conjunto que consiste en una hormona humana del crecimiento (hGH), somatotropina bovina (bST), somatotropina porcina (pST) y un inhibidor de la ruta del factor tisular humano (TFPI). Preferiblemente, la proteína recombinante es la hGH.

Preferiblemente, el proceso de puesta en contacto se lleva a cabo a un pH de desde aproximadamente pH 7 hasta aproximadamente pH 11. De manera incluso más preferible, el proceso de puesta en contacto se lleva a cabo a un pH de desde aproximadamente pH 8 hasta aproximadamente pH 10. De un modo sumamente preferible, el proceso de puesta en contacto se lleva a cabo a un pH de desde aproximadamente pH 8,0 hasta aproximadamente pH 9,5.

Preferiblemente, el proceso de puesta en contacto se lleva a cabo en la presencia de un tampón seleccionado entre el conjunto que consiste en un borato, CHES, bicarbonato de sodio, fosfato de sodio y Tris-HCl. De manera más preferible, el tampón es borato, fosfato o Tris-HCl.

Preferiblemente, el proceso de puesta en contacto se puede llevar a cabo cuando la aminopeptidasa está inmovilizada. Preferiblemente, la aminopeptidasa es inmovilizada sobre una resina de cromatografía, una superficie de cromatografía o un gel de cromatografía.

Preferiblemente, la proteína recombinante es hecha pasar a través de una columna que contiene la aminopeptidasa inmovilizada sobre una resina de cromatografía.

Alternativamente, el proceso de puesta en contacto se puede llevar a cabo cuando la aminopeptidasa no está inmovilizada (p.ej., en una solución libre).

Se puede concebir también que una aminopeptidasa procedente de Aeromonas puede permitir el tratamiento de proteínas que contienen dos o más residuos de alanilo separados a corta distancia entre sí, en las regiones terminales de N de polipéptidos. La aminopeptidasa puede avanzar secuencialmente desde los extremos terminales de N del polipéptido o posiblemente reconocer adicionales residuos de alanina dentro de una corta distancia desde residuos expuestos de extremos terminales de N de polipéptidos. La elucidación de una secuencia de consenso para el reconocimiento específico para alanilo, y los sitios de disociación se pueden evaluar en una diversidad de substratos de proteínas y péptidos.

Una aminopeptidasa procedente de Aeromonas puede facilitar también el tratamiento de residuos que no sean alanilo en las regiones terminales de N de proteínas, en las condiciones que se describen en esta solicitud. La elucidación de una secuencia de consenso para el reconocimiento y la disociación de estos sitios, se puede evaluar en una diversidad de substratos de proteínas y péptidos.

Otro objeto del invento es el de describir un método para eliminar aminoácidos situados en extremos terminales de N a partir de un polipéptido precursor de la fórmula X-Y-Pro-Z con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas, para proporcionar un polipéptido de la fórmula Y-Pro-Z, en la que X es uno o más aminoácidos exceptuando a la prolina, Y es cualquier aminoácido exceptuando a la prolina y Z es uno o más aminoácidos.

De manera preferible, X es alanina.

Preferiblemente, Y se selecciona entre el conjunto que consiste en fenilalanina, metionina, treonina y ácido aspártico. Más preferiblemente, Y es fenilalanina.

De modo sumamente preferible, X es alanina e Y es fenilalanina.

Preferiblemente, el polipéptido precursor es Ala-hGH.

La siguiente es una lista de abreviaturas y de los correspondientes significados que se usan aquí de una manera intercambiable:

g	=	gramo(s)
HPLC	=	cromatografía de fase líquida de alto rendimiento
kb	=	kilobase(s)
mb	=	megabase(s)
mg	=	miligramo(s)
ml, mL	=	mililitro(s)
RP-HPLC	=	cromatografía de líquido de alto rendimiento y de fase inversa
ug, \mug	=	microgramo(s)
ul, uL, \mul, \muL	=	microlitro(s)

La siguiente es una lista de definiciones de diversos términos y de los correspondientes significados que se usan intercambiablemente en este contexto:

Los términos "aap" y "AAP" significan una aminopeptidasa procedente de Aeromonas.

Los términos "ap" y "AP" significan una aminopeptidasa.

El término "aminoácido(s)" significa todos los L-aminoácidos que se presentan en la naturaleza, incluyendo a norleucina, norvalina, homocisteína y ornitina.

El término "molécula de fusión" significa una molécula que codifica una proteína o un fragmento de la misma que, después de una expresión, produce una proteína de fusión.

El término "proteína de fusión" significa una proteína o un fragmento de la misma, que comprende una o más adicionales regiones del péptido, que no se derivan de esa proteína.

El término "promotor" se usa en un sentido expansivo para referirse a las secuencia(s) reguladora(s) que controla(n)
la producción de un ARNm (ácido ribonucleico mensajero).

El término "fragmento de proteína" significa un péptido o una molécula de polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende un subconjunto de la secuencia de aminoácidos de esa proteína.

El término "molécula de proteína/molécula de péptido" significa cualquier molécula que comprende cinco o más aminoácidos.

El término "recombinante" significa cualquier agente (p.ej. un ADN, un péptido, etc.), que es, o resulta, sin embargo de una manera indirecta, de una manipulación humana de una molécula de ácido nucleico.

El término "se fija específicamente" significa que la fijación de un anticuerpo o un péptido no es inhibida de una manera competitiva por la presencia de moléculas no relacionadas.

El término "sustancialmente purificado" significa que una o más moléculas, que están o pueden estar presentes en una formulación que se presenta en la naturaleza, que contiene la molécula buscada, habrán sido eliminadas o reducidas en concentración.

Figura 1

Estructura de Ala-hGh y hGH

Una hormona humana del crecimiento (a la derecha) es un polipéptido monocatenario (de 22 kDa) con cuatro residuos de cisteína implicados en dos uniones por enlaces de disulfuro. La secuencia correcta en extremos terminales de N se puede conseguir mediante la disociación enzimática in vitro de Ala-hGH (a la izquierda) con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas.

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Figura 2

Procedimiento para la producción de una hGH a partir de una Ala-hGh

Un procedimiento general para la purificación de hGH a partir de una Ala-hGH implica una purificación de la Ala-hGH con respecto de cuerpos de inclusión bacterianos, un repliegue de la Ala-hGH en un detergente, una eliminación del detergente, una precipitación con ácidos, un tratamiento con una aminopeptidasa y una purificación de la hGH natural mediante una cromatografía en columna con intercambio de cationes y de aniones.

Figura 3

Condiciones cinéticas de una eliminación de Ala a partir de una Ala-hGH mediante una AAP

Las condiciones cinéticas de una eliminación de Ala a partir de una Ala-hGH mediante una AAP se ilustran en la Figura 3. La Ala-hGH estaba presente a razón de 3 mg/ml y la AAP estaba presente a razón de 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 y 4,0 unidades/ml en un volumen total de 6 ml. Las reacciones se realizaron a la temperatura ambiente y se recogieron muestras a lo largo de 25 horas y los productos se analizaron mediante una ES/MS. La mayor parte de las reacciones para las tres concentraciones más altas de AAP estaban completas en 6 horas.

Figura 4

Opciones de procedimientos de disociación enzimática - modalidad de columna

Se ilustra una comparación esquemática de modalidades de procedimientos de disociación con flujo constante y con flujo continuo.

Figura 5

Disociación de una Ala-hGH en una modalidad discontinua

La Figura 5 ilustra una evolución en el tiempo de una disociación intensificada de una Ala-hGH mediante una Cu-AAP, en comparación con una Zn-AAP en una modalidad discontinua.

Figura 6

Disociación de una Ala-hGH en una modalidad de recirculación

La Figura 6 ilustra una evolución en el tiempo de una disociación de una Ala-hGH mediante una Cu-AAP, en comparación con una Zn-AAP que se lleva a cabo en una modalidad de recirculación en columna.

Figura 7

Eficiencia de disociación analizada por HPLC

La Figura 7 ilustra unos perfiles de HPLC de una Ala-hGH antes de una disociación con AAP, de una disociación incompleta y después de que esté completa la reacción.

Figura 8

Comparación de productos mediante RP-HPLC

La Figura 8 ilustra el perfil de HPLC de una hGH preparada tratando una Ala-hGH con una AAP, y de dos formulaciones comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).

Figura 9

Productos de una Ala-hGH tratada con una AAP, analizados por cartografiado tríptico

Las Figuras 9-12 ilustran típicos perfiles de mapas trípticos. La Figura 9 ilustra los trazados de perfiles que ilustran la diferencia en movilidad del péptido Ala-T1 en comparación con el péptido T1.

Figura 10

Análisis cuantitativo de una Ala-hGH residual en una hGH mediante digestión tríptica

La Figura 10 muestra un trazado de perfil expandido verticalmente, que ilustra las diferencias entre las áreas de los picos bajo las posiciones de elución para Ala-T1 y para T1.

Figura 11

Comparación entre productos mediante un cartografiado tríptico

La Figura 11 ilustra los mapas trípticos de una hGH purificada después de un tratamiento de una Ala-hGH con una AAP en comparación con los mapas trípticos de una hGH procedente de fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton).

Figura 12

Niveles residuales de Ala-hGH en el producto final mediante cartografiado tríptico

La Figura 12 muestra un trazado de perfil expandido verticalmente, que ilustra la presencia o ausencia de Ala-T1 en una preparación cruda de una hGH, en la formulación a granel final de hGH, y en una hGH procedente de dos fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton).

Figura 13

Eficiencia de disociación analizada por ES/MS

La Figura 13 ilustra los perfiles de ES/MS de una Ala-hGH antes de una disociación con AAP, de una disociación incompleta y después de que esté completa la reacción. La Figura 8 ilustra el perfil de HPLC de una hGH preparada tratando una Ala-hGH con AAP, y de dos formulaciones comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).

Figura 14

Análisis de productos mediante RP-HPLC, SE-HPLC y ES/MS

La Figura 14 ilustra un perfil superpuesto de ES/MS de Ala-hGH y de hGH (panel de fondo) juntamente con trazados de HPLC del producto final resuelto en columnas de RP-HPLC y SE-HPLC.

Figura 15

Productos analizados mediante secuenciación en extremos terminales de N

La Figura 15 ilustra trazados de los productos liberados después del ciclo 1 y del ciclo 2 a partir de un secuenciador automático de proteínas. La fenilalanina (18,3 min.) es el único residuo significativo que se detecta después del ciclo 1 (panel de la izquierda). La prolina (14,2 min.) es el único residuo significativo detectado en el ciclo 2. La cantidad de alanina (*) es despreciable en ambos ciclos, indicando la falta de residuos de alanina en extremos terminales de N en el producto purificado final.

Los siguientes Ejemplos ilustrarán el invento con mayor detalle, aunque se entenderá que el invento no está limitado a estos ejemplos específicos.

Métodos generales

Métodos generales para clonar, expresar y caracterizar proteínas se encuentran en la obra de T. Maniatis y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, y en las referencias allí citadas, que se incorporan a la presente por su referencia; y en la obra de J. Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y en las referencias allí citadas, que se incorporan a la presente por su referencia. Las condiciones y los procedimientos, generales y específicas/os para la construcción, la manipulación y el aislamiento de anticuerpos se conocen bien en la especialidad (véase, por ejemplo, la obra de Harlow y Lane, In Antibodies: A Laboratory Manual [En anticuerpos: un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988)).

Reactivos

La aminopeptidasa procedente de Aeromonas y todos los productos químicos especiales, a menos que se señale otra cosa distinta, se obtuvieron de la entidad Sigma Chemical Company (St Louis, MO).

La Humatrope se obtuvo de Eli Lilly. La Zomacton se obtuvo de Gentechnisch.

Purificación de proteínas

La purificación de proteínas se puede conseguir usando uno cualquiera entre una diversidad de métodos de cromatografía tales como los de: intercambio de iones, filtración en gel, cromatografía hidrófoba o HPLC de fase inversa. Estos y otros métodos de purificación de proteínas se describen con detalle en la obra Methods in Enzymology [Métodos en enzimología], volumen 182 "Guide to Protein Purification" [Guía para la purificación de proteínas], compilada por Murray Deutscher, Academic Press, San Diego, California, 1990. Las proteínas plegadas pueden ser también purificadas por afinidad usando reactivos con afinidad, tales como anticuerpos monoclonales o subunidades de receptores, unidas a una matriz apropiada.

Las proteínas purificadas pueden ser analizadas por una RP-HPLC, una espectrometría de masas con proyección de electrones, y una SDS-PAGE. La cuantificación de las proteínas se consigue mediante la composición de aminoácidos, mediante una RP-HPLC y mediante las técnicas de determinación de proteínas de Bradford. Se puede usar también, para confirmar la identidad de las proteínas, un cartografiado tríptico de péptidos realizado en conjunción con una espectrometría de masas con proyección de electrones.

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Ejemplo 1

Preparación de una alanil-hormona humana del crecimiento (Ala-hGH)

Se expresó una Ala-hGH (Figura 1) en el seno de E. coli usando un sistema de expresión cromosomal basado en mini-Mu (Weinberg y colaboradores, Gene 126: 25-33, 1993; patentes de los EE.UU. 5.395.763 y 5.514.483; solicitud de patente de los EE.UU. 09/044.369, presentada el 19 de Marzo de 1998, cada una incorporada específicamente aquí por su referencia). Se expresó la Ala-hGH en unos niveles de aproximadamente 1,5 a aproximadamente
2,0 g/litro.

La Ala-hGH se purificó, replegó y trató hasta llegar a una pureza de >90% basándose en un análisis de Ala-hGH (por RP-HPLC) y en la concentración total de proteínas (por absorbencia a A_{280}). Expresado brevemente, se aislaron cuerpos de inclusión y la Ala-hGH se purificó y replegó usando métodos descritos con anterioridad (documento WO 98/29433). El repliegue se consiguió de la manera más corriente con un rendimiento de >85% a un pH de 10 usando un acil-glutamato como detergente. Luego el detergente fue eliminado desde la mezcla de repliegue por ultrafiltración exhaustiva (10 TOV's) frente a un agua de pH 10. Esto fue seguido por una etapa de precipitación con ácidos para eliminar la mayor parte de las proteínas recombinantes de E. coli. La recuperación media de Ala-hGH a partir de esta etapa de precipitación fue de \sim80-85%. Esta Ala-hGh semipurificada fue diafiltrada frente al tampón de disociación (fosfato 10 mM, de pH 8,0) antes de ser tratada con la enzima, preferiblemente en una modalidad inmovilizada. Después de la etapa de disociación enzimática, la hGH fue purificada adicionalmente mediante una cromatografía de intercambio de iones en un polvo a granel. Un bosquejo general del procedimiento se ilustra en la
Figura 2.

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Ejemplo 2

Tratamiento in vitro de una Ala-hormona humana del crecimiento (Ala-hGH) con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas en solución libre (Ejemplo de referencia)

Antes de la operación de disociación, una Ala-hGH se ajustó a una concentración de 3 mg por ml en un tampón de borato 10 mM, de pH 9,5. Para esto, la aminopeptidasa procedente de Aeromonas se añadió en 3 unidades por ml y se dejó que la reacción se desarrollase durante 24-36 horas a la temperatura ambiente o durante un período de tiempo más corto a 37ºC. El progreso de la reacción de disociación se puede vigilar mediante una RP-HPLC o mediante un análisis de aminoácidos de la liberación de alanina a partir de la Ala-hGH. Al final de la reacción, la solución fue sofocada añadiendo ácido acético al 2% (dilución a 1:1,5 p/p (peso/peso)).

Las condiciones cinéticas de la eliminación de Ala a partir de la Ala-hGH mediante una AAP se ilustran en la Figura 3. La Ala-hGH estaba presente a razón de 3 mg/ml y la AAP estaba presente a razón de 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 y 4,0 unidades/ml en un volumen total de 6 ml. Las reacciones se realizaron a la temperatura ambiente y se recogieron muestras a lo largo de 25 horas, y los productos se analizaron por ES/MS. La mayor parte de las reacciones para las tres concentraciones más altas de AAP estaban completas en 6 horas.

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Ejemplo 3

Tratamiento in vitro de una Ala-hormona humana del crecimiento (Ala-hGH) usando una aminopeptidasa inmovilizada Preparación de una aminopeptidasa inmovilizada

Una aminopeptidasa procedente de Aeromonas (AAP) fue acoplada sobre resinas tales como una resina Sepharose 4B por medio de las condiciones químicas del bromuro de cianógeno (CNBr). Una resina comercial Sepharose 4B, activada con CNBr, fue lavada exhaustivamente con agua fría y luego fue suspendida en un tampón de carbonato de sodio 0,1 M, de pH 8,5, o en un tampón de fosfato 10 mM, de pH 8. Se añadió la AAP (100 unidades por gramo de resina) y la mezcla se agitó suavemente a 4ºC durante una noche. Después de haber lavado con agua, la resina fue rematada con etanolamina (0,5-1 M) a la temperatura ambiente durante 2 horas. Luego la resina fue lavada con agua y equilibrada con el tampón para disociación con una enzima, tal como un fosfato 10 mM, de pH 8. La actividad de esta enzima inmovilizada se midió mediante el análisis normalizado, sugerido por Sigma, usando L-leucina-p-nitro-anilida como substrato. La actividad media era típicamente de 10-20 unidades por ml de lecho de
resina.

Disociación in vitro de una Ala-hormona humana del crecimiento (hGH) Modalidad discontinua

Una aminopeptidasa inmovilizada se suspendió como una mezcla 1:1 en un tampón de borato o fosfato. A un tubo con una capacidad de 7 ml, que contenía 5 ml de Ala-hGH en un tampón de fosfato o borato, se le añadió un ml de resina. Esto dio un total de 6 ml con una concentración de proteína de 3 mg/ml. La mezcla se agitó por oscilación durante 10-24 horas a 20-40ºC. Al final de la reacción, la resina fue separada por filtración y la resultante solución se analizó mediante una RP-HPLC. El resto de la solución se centrifugó usando un dispositivo para microfiltración de CentriCon. El material filtrado se analizó mediante el analizador de aminoácidos en cuanto a la liberación de alanina. El material retenido fue intercambiado 4-5 veces con ácido acético al 2% antes de ser secado hasta la forma de un polvo para un análisis de espectrometría de masas.

La Tabla 1 ilustra el efecto de la temperatura sobre la disociación de una Ala-hGH en una modalidad discontinua, usando una AAP inmovilizada. La reacción es acelerada a las temperaturas del medio ambiente, y está esencialmente completa más allá de las 54 horas.

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TABLA 1 Efecto de la temperatura sobre la disociación de una Ala-hGH en una modalidad discontinua usando una AAP inmovilizada

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1

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Modalidad de circulación

Se hizo circular una Ala-hGH en un tampón de borato 10 mM, de pH 9,5, o en un tampón de fosfato 10 mM, de pH 8,0 sobre una columna de Sepharose, que previamente había sido inmovilizada con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas. El volumen del depósito está situado entre 100 ml y 700 ml, dependiendo de la concentración de la proteína. Típicamente la Ala-hGH está en una concentración de 5-10 mg por ml. El caudal está entre 2-4 ml por minuto. Esto se realizó a 20ºC durante aproximadamente 24 horas. La reacción se vigiló mediante una RP-HPLC. La eficiencia de la disociación se confirmó por espectrometría de masas y por secuenciación de extremos terminales de N. Luego el producto acabado se purificó adicionalmente mediante una cromatografía de intercambio de
iones.

La Tabla 2 ilustra el efecto del caudal sobre la disociación de una Ala-hGH usando una AAP inmovilizada a 28ºC en una modalidad de recirculación. Unos períodos de tiempo de permanencia más cortos estaban asociados generalmente con unos niveles más altos de substrato sin disociar.

TABLA 2 Disociación de una Ala-hGH en la modalidad de circulación a 28ºC

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *  \begin{minipage}[t]{141mm} El experimento se realizó a
28 ^{o}C  en un volumen de columna de 51 ml usando un tampón de
fosfato 10 mM de pH 8 como tampón, usando de
Ala-hGH: 8 mg/ml (según HPLC).
\end{minipage} \cr}

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La Tabla 3 ilustra el efecto del caudal sobre la disociación de Ala-hGH usando una AAP inmovilizada a 20ºC en la modalidad de recirculación. Unos tiempos más cortos de permanencia, están correlacionados directamente con más altos niveles de substratos sin disociar.

TABLA 3 Disociación de Ala-hGH en la modalidad de circulación a 20ºC

3

El experimento se realizó a 20ºC con un volumen de la columna de 51 ml en un tampón de fosfato de 10 mM de pH 8, usando Ala-hGH:8 mg/ml (HPLC).

* Aproximadamente un 1% está constituido por el aducto con cisteína que se había eluído concomitantemente con el Ala-T1 péptido no disociado.

Modalidad de flujo de paso

Se introdujo una Ala-hGH (en una concentración de 8 mg/ml) en un tampón de borato 10 mM, de pH 9,5, o en un tampón de fosfato 10 mM de pH 8,0, sobre una columna de Sepharose (el volumen de la columna es de 50 ml) que se ha había inmovilizado previamente con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas. El caudal se ajustó a 15 ml por hora, por lo que el período de tiempo de permanencia fue de alrededor de 3 horas. La eficiencia de la disociación se confirmó por una RP-HPLC, por una digestión tríptica, por una espectrometría de masas o por una secuenciación de extremos terminales de N. El eluyente se recogió y se trató para una purificación por cromatografía corriente
abajo.

La Tabla 4 ilustra el efecto del caudal sobre la disociación de una Ala-hGH usando una AAP inmovilizada a 28ºC en una modalidad de flujo de paso. La mayor parte de la Ala-hGH fue tratada mediante la AAP en estas condiciones.

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TABLA 4 Disociación en la modalidad de flujo de paso a 28ºC

4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *  \begin{minipage}[t]{141mm} Todos los datos trípticos están
basados en la combinación de Ala-hGH sin disociar y
de una impureza procedente del proceso. El valor real de
Ala-hGH sin disociar es estimado como de
aproximadamente un 50% de los valores informados.
\end{minipage} \cr}

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Ejemplo 4

Comparación de los procedimientos de disociación con flujo constante y con flujo continuo

La disociación en la modalidad de columna se puede realizar en un caudal mucho más bajo en una pasada, siempre que se cumpla el período de tiempo de permanencia global. La tanda Nº 1 era una tanda típica en una modalidad de recirculación. La tanda Nº 2 se hizo trabajar con 1/10 del caudal de la tanda Nº 1. Sin embargo, la tanda Nº 2 se realizó a 175 min. por pasada, en comparación con 18 min. por pasada para la tanda Nº 1. El tiempo de permanencia global para ambas tandas es aproximadamente el mismo, \sim180 minutos. Las dos modalidades se ilustran en la Figura 4.

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TABLA 5 Efecto del caudal sobre la actividad

5

La Tabla 6 ilustra el efecto del número de pasadas sobre la disociación de una Ala-hGH usando una AAP inmovilizada a 28ºC en una modalidad de recirculación. La mayor parte de la Ala-hGH se trató mediante la AAP en estas condiciones.

TABLA 6 Recirculación a 28ºC en un tampón de fosfato

6

\text{*}

[Ala-hGH] = 9,2 mg/ml; carga de 500 ml.

La Tabla 7 ilustra el efecto de la temperatura y del tiempo de permanencia sobre la disociación de una Ala-hGH. Se manifiesta que una diferencia de temperaturas de diez grados afecta a la eficiencia de disociación. Se puede requerir un tiempo de permanencia de permanencia más largo si se necesita un % de disociación más alto.

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TABLA 7 Efecto de la temperatura y del tiempo de permanencia sobre el procedimiento de disociación de flujo constante

7

\text{*}

Los productos de disociación fueron analizados por el método de cartografiado de péptidos.

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Ejemplo 5

Intensificación con cobre de la actividad de tratamiento de alanilo con una AAP

Los efectos de reemplazar por Cu^{2+} o Ni^{2+} al cofactor catalítico Zn^{2+} natural de la AAP se examinaron en el sistema inmovilizado para un tratamiento in vitro de una Ala-hGH. Esta Cu-AAP se puede preparar ya sea directamente a partir de la operación de tratamiento de purificación con AAP, o se puede convertir en la especie con cobre reemplazando los metales de zinc de signo contrario, que están presentes como en el material comercial. La conversión se puede realizar ya sea como la enzima libre o como la forma inmovilizada.

Cu-AAP inmovilizada a partir de Zn-AAP Sepharose

La Cu-AAP se inmovilizó como arriba se ha descrito. Una suspensión de resina (muestra A, 20 ml con un volumen de lecho de resina de 10 ml) se colocó dentro de un embudo de vidrio sinterizado con una capacidad de 250 ml y se llevó casi hasta sequedad usando un vacío. Para esto, se añadieron 20 ml de una mezcla de tricina 50 mM/KCl 50 mM, de pH 7,5 y de 1,10-fenantrolina 20 mM, y se mezclaron durante 20 minutos. La solución se retiró y se colocó en un tampón de nueva aportación que contenía 1,10-fenantrolina, y se mezcló durante otras 2 horas. El tampón se retiró y la suspensión de resina se lavó con agua y con un tampón de HEPES. La resina resultante se dividió en dos tubos, cada uno con un volumen total de 12 ml. A la muestra B se le añadió CuCl_{2} 0,2 mM en HEPES 50 mM, de pH 7,5, y a la muestra C se le añadió ZnCl_{2} 0,2 mM en HEPES 50 mM, de pH 7,5. Ambos tubos se agitaron por oscilación durante 3 horas de manera suave. Las suspensiones se lavaron extensamente con agua y se almacenaron en el deseado tampón, tal como el de borato, de pH 9,5.

TABLA 8 Actividad de una AAP modificada por un metal frente a Leu-pNA

8

La velocidad de disociación de una Ala-hGH mediante Cu-AAP y Zn-AAP se comparó en ambas modalidades de columna discontinua y con recirculación. En el ensayo de disociación discontinua, se añadieron 0,5 ml de una suspensión 1:1 de cada una de las resinas (B o C) a 2,056 ml de un tampón de borato 10 mM, de pH 9,5, antes de la adición de Ala-hGH hasta una concentración final de 0,9 mg/ml. Las reacciones fueron vigiladas durante 24 horas por recogida de muestras, que fueron sofocadas mediante separación por filtración de la enzima inmovilizada a través de un filtro de 0,45 \mum. Luego el material filtrado fue analizado mediante una RP-HPLC para determinar la fracción de Ala-hGH que había sido disociada.

En el ensayo de disociación en columnas con recirculación se vertieron sobre columnas de 1 cm x 5 cm que contenían, ya sea la resina con Cu-AAP (B) o la resina con AAP testigo (B). Estas columnas fueron equilibradas con un tampón de fosfato 10 mM y se hicieron recircular 50 ml de Ala-hGH 4,75 mg/ml a través de cada una de las columnas, a razón de 2 VC por hora. Se recogieron las partes alícuotas y se sofocaron a las 3 h, 6 h, 18 h y 28 h para su análisis, como anteriormente.

La Figura 5 ilustra una evolución en el tiempo de una disociación de una Ala-hGH intensificada mediante Cu-AAP en comparación con Zn-AAP en la modalidad discontinua. La Figura 6 ilustra una evolución en el tiempo de una disociación de una Ala-hGH mediante Cu-AAP en comparación con Zn-AAP, llevada a cabo en una modalidad de recirculación en columna.

En todas las condiciones de reacción examinadas, una AAP sustituida con Cu^{2+} era la más activa frente a una Ala-hGH (Figuras 5 y 6), incluso aunque la Cu-AAP es menos activa en la hidrólisis de los substratos cromógenos de Leu-p-nitroanilida (pNA) (Tabla 8).

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Ejemplo 6

Análisis estructural detallado del producto producido por tratamiento de una Ala-hGH con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas Purificación de una Ala-hGH Disolución/repliegue

La suspensión de cuerpos de inclusión (CI) se añadió a una solución previamente mezclada que contenía 34,5 gramos de bicarbonato de sodio, 156 gramos de un detergente basado en aminoácidos (p.ej., sarcosina y/o ácido glutámico) y 826 ml de agua. La solución de CI disueltos se mantuvo durante 20 minutos a la temperatura ambiente y se añadió una solución de cistina (100 mM, de pH 10,0). La solución se agitó durante 15 horas a la temperatura ambiente, antes de enfriar a 4ºC. La mezcla de repliegue terminada se concentró luego hasta 4 litros, antes de ser diafiltrada frente a agua de pH 10.

Precipitación con ácidos

La solución diafiltrada se diluyó con un agua de pH 10,0 hasta una concentración de Ala-hGH de \sim2,5 mg/ml. Se añadió una solución de ácido acético al 2% usando una bomba peristáltica hasta que el pH llegó a \sim5,6 a 4-6ºC. La solución acidificada se agitó durante 30 minutos adicionales. Luego, la solución se centrifugó a 6.000 RPM (revoluciones por minuto) usando una centrífuga de Sorvall RC5C a 4ºC. El material sobrenadante se decantó y luego se diafiltró frente a fosfato de sodio 10 mM, de pH 8,0. Luego la concentración de proteínas se ajustó a
8 mg/ml.

Disociación enzimática

Una aminopeptidasa procedente de Aeromonas se acopló sobre resinas tales como una resina de Sepharose 4B por medio de las condiciones químicas del bromuro de cianógeno (Hermanson, 1992). La actividad de esta enzima inmovilizada se midió mediante el ensayo patrón sugerido por Sigma, usando L-leucina-p-nitroanilida (Leu-pNA) como substrato. Una solución fría de una Ala-hGH (8 mg/ml) en un tampón de fosfato 10 mM, de pH 8,0, se hizo pasar a través de una columna con enzima inmovilizada, que estaba equipada con una camisa de agua y era mantenida a 25ºC. El caudal se ajustó a \sim8 ml/h para asegurar un tiempo de contacto suficiente entre la Ala-hGH y la enzima inmovilizada. La agrupación obtenida de la disociación se intercambió luego de tampón frente a urea 3 M, ácido acético 0,05 M de pH 5,0 (tampón A), antes de cargarla sobre la columna de cationes.

Columna de cationes

La carga de cationes se introdujo sobre una columna de Amicon de 2,2 x 20 cm empaquetada con una resina de Sepharose CM. La carga total de la columna era de 2,0 g de Ala-hGH. Después de haberla cargado, la columna se lavó con un 1 VC (volumen de columna) del tampón A, luego se eluyó con un gradiente de sal de 0-0,2 M de NaCl por un total de 54 VC's. El caudal era de 4 VC/hora. El eluyente de la columna se recogió en fracciones de 0,2 VC y el eluyente se vigiló con un detector holocromo de Gilson a 280 nm. Las fracciones se analizaron mediante una HPLC con intercambio de cationes, y las fracciones que tenían una pureza >95% se agruparon.

Columna de aniones

La agrupación de cationes se cargó sobre una columna Amicon de 1,6 x 20 cm que estaba empaquetada con una resina Q-Sepharose de Pharmacia. Después de haberla cargado, la columna se lavó con un VC del tampón A. Se realizó un gradiente lineal de 40 VC de 0-0,15 M de NaCl en un tampón Tris-Cl de 0,05 M, de pH 7,5. El eluyente de la columna se recogió igual que anteriormente. Las fracciones fueron analizadas mediante una HPLC con intercambio de aniones y las fracciones que tenían una pureza de >98% se agruparon.

Análisis estructural de los productos de disociación

El método más conveniente para el análisis de una reacción de disociación es el método de RP-HPLC. Sin embargo, el único análisis cuantitativo confiable es el método de digestión de péptidos. En este método, el límite de detección para Ala-T1 es de 0,25%.

Análisis de aminoácidos

Después de la reacción de disociación, la solución se centrifugó usando un aparato Centricon con una membrana de corte de pesos moleculares de 10 kDa. La concentración de alanina en el material filtrado se puede medir mediante un analizador de aminoácidos. Luego, el grado de disociación se puede calcular mediante la cantidad de alanina liberada a partir de la reacción. Además, cualquier otro aminoácido detectado debería ser una indicación de una disociación no específica.

Análisis por RP-HPLC

Se usó un método isocrático usando una tampón de N-propanol (NPA)/fosfato 0,25 M de pH 6,5 (26,74) como la fase móvil para analizar la Ala-hGH y la hGH en una columna Vydac 214ATP54. La separación se llevó a cabo a 40ºC. Este método se usó principalmente para vigilar la formación de hGH por medio de una disociación enzimática de Ala-hGH. Éste sirvió también como una herramienta secundaria para decidir cuales fracciones había que recoger a partir de una columna de intercambio de cationes.

Las Figuras 7 y 8 ilustran perfiles típicos de HPLC. La Figura 7 ilustra perfiles por HPLC de una Ala-hGH antes de una disociación incompleta con AAP y después de que la reacción estuviese completa. La Figura 8 ilustra el perfil de HPLC de una hGH preparada tratando una Ala-hGH con AAP, y dos formulaciones comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).

Cartografiado de péptidos usando tripsina

Una solución de una hGH se ajustó a un pH de 7,5 con NaOH 0,5 N. Esta solución se diluyó con la base de Tris (50 mM, pH 7,5) de manera tal que la concentración final fuese de 2 mg/ml. Luego se añadieron 15 ml de una solución de tripsina (1 mg/ml en la base de Tris 50 mM, pH 7,5). La muestra se mezcló e incubó a 37ºC durante 4 h, luego se sofocó con 50 ml de HCl (0,5 M). Una parte alícuota de la solución digerida se inyectó sobre una RP-HPLC y los péptidos fueron resueltos mediante un gradiente de acetonitrilo con 0,1% de TFA.

Este método proporciona información para la averiguación de las integridades estructurales primaria y secundaria de la hGH. Lo que es sumamente importante, éste es el mejor método para analizar el nivel de trazas de Ala-hGH sin disociar en la reacción de disociación y en el producto final. La única diferencia entre los materiales digeridos trípticos de la hGH y la Ala-hGH es el octa-péptido N-terminal, T1, frente a Ala-T1. Estos dos péptidos son resueltos en línea de base usando un método isocrático de RP-HPLC.

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 T1: FPTIPLSR \+ (SEQ ID NO: 6)\cr  Ala-T1:
AFPTIPLSR \+ (SEQ ID NO:
7)\cr}

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Las Figuras 9-12 ilustran típicos perfiles de mapas trípticos. La Figura 9 ilustra los trazados de perfiles que ilustran la diferencia en movilidad del péptido Ala-T1 en comparación con el péptido T1. La Figura 10 muestra un trazado de perfil expandido verticalmente, que ilustra las diferencias en las áreas de pico por debajo de las posiciones de elución para Ala-T1 y para T1. La Figura 11 ilustra los mapas trípticos de una hGH purificada después de un tratamiento de una Ala-hGH con una AAP, en comparación con los mapas trípticos de una hGH procedente de fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton). La Figura 12 muestra un trazado de perfil expandido verticalmente que ilustra la presencia o ausencia de Ala-T1 en una formulación cruda de una hGH, en la formulación a granel final de una hGH y en una hGH procedente de dos fuentes comerciales (Humatrope y Zomacton).

Espectrometría de masas con proyección de electrones (ES/MS)

La medición está basada en la intensidad de pico para hGH (22,125) y para Ala-hGH (22,195). La presencia de otros picos es indicativa de una disociación enzimática no específica.

La Figura 13 ilustra perfiles de ES/MS de una Ala-hGH antes de una disociación con AAP, de una disociación incompleta y después de que la reacción esté completa. La Figura 8 ilustra el perfil de HPLC de una hGH preparada tratando una Ala-hGH con una AAP, y de dos formulaciones comerciales de hGH (Humatrope y Zomacton).

La Figura 14 ilustra un perfil de ES/MS superpuestas de Ala-hGH y de hGH (panel inferior) juntamente con los trazados por HPLC del producto final resuelto en columnas de RP-HPLC y SE-HPLC.

Secuenciación de extremos terminales de N

La secuenciación de proteínas en extremos terminales de N se realizó por métodos clásicos. Las cantidades relativas de Ala (presente en la Ala-hGH) y de Phe (en la hGH) como el aminoácido situado en extremos terminales de N, son indicativas del grado de disociación. Una disociación interna se puede detectar también mediante un análisis de secuencias de extremos terminales de N.

La Figura 15 ilustra los trazados de los productos liberados después del ciclo 1 y del ciclo 2 de un secuenciador automático de proteínas. La fenilalanina (18,3 min.) es el único residuo importante detectado después del ciclo 1 (panel de la izquierda). La prolina (14,2 min.) es el único residuo importante detectado en el ciclo 2. La cantidad de alanina (*) es despreciable en ambos ciclos, indicando una falta de residuos de alanina en extremos terminales de N en el producto purificado final.

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Ejemplo 7

Tratamiento in vitro del inhibidor de la ruta del alanil-factor tisular (Ala-TFPI) usando una aminopeptidasa

Un Ala-TFPI, aislado a partir de E. coli (documento US 5.212.091) puede ser transformado en un TFPI usando una AAP en solución. Un Ala-TFPI apropiadamente replegado es ajustada a una concentración de 0,5-3 mg por ml en un tampón de fosfato 10 mM, de pH 8,0 o de borato 10 mM, de pH 9,5. Para esto, una aminopeptidasa procedente de Aeromonas se añade en una concentración de 3 unidades por ml y se deja que la reacción se desarrolle durante 24-36 horas a la temperatura ambiente o durante un período de tiempo más corto a 37ºC. El progreso de la reacción de disociación se puede vigilar por un método de HPLC o por un análisis de aminoácidos de la liberación de alanina a partir de Ala-TFPI. Al final de la reacción, la solución se sofoca añadiendo ácido acético al 2% (dilución 1:1,5 p/p). El grado de disociación se determina mediante un análisis por HPLC de los fragmentos trípticos de péptidos y por una ES/MS del producto aislado.

Un Ala-TFPI puede ser transformado también en TFPI usando una AAP inmovilizada como arriba se ha descrito. El grado de disociación es determinado por medio de un análisis por HPLC de los fragmentos trípticos de péptidos y por una ES/MS del producto aislado.

<110> Tou, Jacob

\hskip1cm

Taylor, Douglas

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<120> Método para eliminar residuos de alanina situados en extremos terminales de N a partir de polipéptidos con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> S03108-00-US

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<150> 60/132,O62

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<151> 1999-04-30

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<160> 7

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<170> FastSEQ para Windows versión 4,0

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<210> 1

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<211> 13

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<212> PRT (proteína)

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Péptido sintético para ensayar la especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina procedente de E. coli

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<400> 1

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\sa{Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu}

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<210> 2

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido sintético para ensayar la especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina procedente de E. coli

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<400> 2

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\sa{Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Gln Cys}

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<210> 3

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido sintético para ensayar la especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina procedente de E. coli

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<400> 3

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\sa{Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu}

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<210> 4

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido sintético para ensayar la especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina procedente de E. coli

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<400> 4

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\sa{Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu}

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<210> 5

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido sintético para ensayar la especificidad para substratos de una aminopeptidasa de metionina procedente de E. coli

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<400> 5

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\sa{Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Gln Cys}

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<210> 6

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> T1 es el péptido tríptico situado en extremos terminales de N de una hGH humana natural

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<400> 6

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\sa{Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg}

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<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Ala-T1 es el péptido tríptico situado en extremos terminales de N de Ala-hGH

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<400> 7

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\sa{Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg}

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Claims (11)

1. Un método para eliminar un residuo alanilo situado en extremos terminales de N a partir de una proteína recombinante seleccionada entre el conjunto formado por derivados de Ala en extremos terminales de N de una hormona humana del crecimiento, somatotropina humana, somatotropina porcina, somatotropina bovina y un inhibidor de la ruta del factor tisular humano, que comprende poner en contacto dicha proteína recombinante con una aminopeptidasa inmovilizada procedente de Aeromonas, para disociar el residuo alanilo, y recuperar la resultante proteína recombinante.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el residuo alanilo es no natural para la proteína.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la puesta en contacto se lleva a cabo a un pH comprendido desde pH 7 hasta pH 11.

4. El método de una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la aminopeptidasa es inmovilizada sobre un soporte sólido seleccionado entre el conjunto que consiste en una resina de cromatografía, una superficie de cromatografía, o un gel de cromatografía.

5. El método de una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína que se pone en contacto con la aminopeptidasa es recirculada de manera tal que la proteína se pone en contacto con la aminopeptidasa al menos en un momento adicional.

6. El método de una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la puesta en contacto se realiza a una temperatura de desde 20ºC hasta aproximadamente 40ºC.

7. El método de una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que un cofactor catalítico natural Zn^{2+} de la aminopeptidasa es reemplazado por un catión seleccionado entre el conjunto que consiste en Cu^{2+} y Ni^{2+}.

8. Un método para eliminar residuos alanilo situados en extremos terminales de N a partir de una proteína precursora de la fórmula X-Y-Pro-Z con una aminopeptidasa procedente de Aeromonas para proporcionar una proteína de la fórmula Y-Pro-Z, en la que X es alanilo, Y es cualquier aminoácido distinto de prolina y Z es uno o más aminoácidos.

9. El método de la reivindicación 8, en el que Y se selecciona entre el conjunto que consiste en fenilalanina, metionina, treonina y ácido aspártico.

10. El método de la reivindicación 8, en el que Y es fenilalanina.

11. El método de la reivindicación 9 ó 10, en el que la proteína precursora es un derivado de Ala situado en extremos terminales de N de una hormona humana del crecimiento.