ES2343061T3 - Metodos y constructos de dna para produccion de polipeptidos con rendimiento alto. - Google Patents

Abstract

Una casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico siguiente enlazada operativamente: 5''Pr-(TIS)D-(IBFP1)E-(CL1)G-ORF-[CL2-ORF]L-(CL3)M-(IBFP2)Q-(SSC)R-(CL4)T-(Ft)W-(Tr)X-3'' en donde Pr es una secuencia promotora, TIS codifica una secuencia de iniciación de la traducción, IBFP1 codifica una primera pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15, o una variante de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador, CL1 codifica un primer enlazador peptídico escindible, ORF codifica un polipéptido preseleccionado, CL2 codifica un segundo enlazador peptídico escindible, CL3 codifica un tercer enlazador peptídico escindible, IBFP2 codifica una segunda pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID No.: 1-15, o una variante de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador, SSC es un codón de parada suprimible, CL4 codifica un cuarto enlazador peptídico escindible, Ft codifica un marcador de fusión, y Tr es una secuencia terminadora de la transcripción, en donde cada uno de D o X es independientemente 0 o un número entero de 1 a 4, en donde R es 0 o un número entero de 1 a 2, en donde cada uno de E, G, L, M, Q, T o W es independientemente 0 o un número entero de 1 a 20, en donde está presente uno cualquiera o ambos de IBFP1 o IBFP2, y en donde está presente al menos uno de CL1, CL2, CL3 o CL4, y en donde la expresión de la casete de expresión produce una proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado y que forma un cuerpo de inclusión cuando se expresa en una célula.

Description

Métodos y constructos de DNA para producción de polipéptidos con rendimiento alto.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la expresión de proteínas. Más específicamente, se refiere a métodos y constructos de DNA para la expresión de polipéptidos y proteínas.

Antecedentes de la invención

Los polipéptidos son útiles para el tratamiento de enfermedades en humanos y animales. Ejemplos de tales polipéptidos incluyen insulina para el tratamiento de la diabetes, interferón para el tratamiento de infecciones virales, interleuquinas para modulación del sistema inmunitario, eritropoyetina para estimulación de la formación de los glóbulos rojos de la sangre, y factores de crecimiento que actúan para mediar el crecimiento tanto prenatal como postnatal.

Muchos polipéptidos bioactivos pueden producirse por el uso de métodos de síntesis química. Sin embargo, tales métodos de producción son en muchos casos ineficientes e intensivos en mano de obra, lo que conduce a coste incrementado y disponibilidad reducida de polipéptidos terapéuticamente útiles. Una alternativa a la síntesis química es proporcionada por la tecnología recombinante, que permite la producción con alto rendimiento de polipéptidos bioactivos en microbios. Dicha producción permite que un número mayor de personas pueda ser tratado a un coste reducido.

Si bien se han hecho grandes progresos en la tecnología recombinante, la expresión de proteínas y péptidos en las células puede ser problemática. Esto puede ser debido a niveles de expresión bajos o por destrucción del polipéptido expresado por enzimas proteolíticas contenidas en las células. Esto es especialmente problemático cuando se trata de expresar proteínas y péptidos pequeños.

Estos problemas se han abordado en el pasado por la producción de proteínas de fusión que contienen el polipéptido deseado fusionado a un polipéptido portador. La expresión de un polipéptido deseado como una proteína de fusión en una célula protegerá a menudo el polipéptido deseado contra las enzimas destructivas y permitirá que la proteína de fusión se purifique con rendimientos elevados. La proteína de fusión se trata luego para escindir el polipéptido deseado del polipéptido portador y el polipéptido deseado se aísla. Muchos polipéptidos portadores se han utilizado de acuerdo con este protocolo. Ejemplos de tales polipéptidos portadores incluyen \beta-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, el término N de L-ribuloquinasa, la proteína gp55 del bacteriófago T4, y la proteína bacteriana quetosterioide-isomerasa. Si bien este protocolo presenta muchas ventajas, adolece de una eficiencia de producción reducida debido al gran tamaño de la proteína portadora. Así, el polipéptido deseado puede constituir un pequeño porcentaje de la masa total de la proteína de fusión purificada, lo que da como resultado rendimientos reducidos del polipéptido deseado.

Otro método para producir un polipéptido deseado por tecnología recombinante implica la producción de una proteína de fusión que contiene el polipéptido deseado fusionado a una secuencia de polipéptido adicional. En este caso, la secuencia del polipéptido adicional hace que la proteína de fusión forme una masa insoluble en una célula denominada cuerpo de inclusión. Estos cuerpos de inclusión se aíslan luego de la célula y la proteína de fusión se purifica. La proteína de fusión se trata después para escindir la secuencia del polipéptido adicional de la proteína de fusión y se aísla el polipéptido deseado. Este método ha proporcionado un alto nivel de expresión de polipéptidos deseados. Una ventaja de dicho método es que la secuencia polipeptídica adicional será en muchos casos más pequeña que el polipéptido deseado y por consiguiente constituirá un menor porcentaje de la proteína de fusión producida conduciendo a una eficiencia de producción incrementada. Una desventaja de tales sistemas es que los mismos producen cuerpos de inclusión cuya solubilización es muy difícil a fin de aislar un polipéptido de interés.

Williams et al. (Genes & Development, 5:2481, 1991) investigan el control del desarrollo de las alas y balancines de Drosophila por el producto del gen nuclear vestigial. Se generaron anticuerpos contra el producto del gen vestigial en conejos después de inmunización con una proteína recombinante de fusión que se produjo por clonación de fragmentos del cDNA del gen vestigial en un vector de expresión y purificación parcial de la proteína de fusión recombinante de los cuerpos de inclusión insolubles antes de inmunización.

Lee et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:790, 2002) describen la expresión de repeticiones multímeras en tándem de buforina II como cuerpos de inclusión. El gen codificante del péptido antimicrobiano básico, buforina II, se fusionó al gen codificante del péptido acídico, MMIS. Se construyeron genes de fusión multímeros MMIS-buforina II que contenían unidades múltiples idénticas del gen de fusión MMIS-buforina II dispuestas unas tras otras. Los constructos multímeros repetidos se expresaron en E. coli, y los péptidos recombinantes se purificaron de los cuerpos de inclusión.

De acuerdo con ello, existe necesidad de secuencias polipeptídicas adicionales que puedan utilizarse para producir polipéptidos deseados mediante formación de cuerpos de inclusión. Existe también necesidad de secuencias polipeptídicas adicionales que puedan utilizarse para producir cuerpos de inclusión que tengan características que permitan que los mismos se manipulen más fácilmente durante la producción y purificación de polipéptidos deseados.

Sumario de la invención

La invención proporciona una casete de expresión para la expresión de un polipéptido en tándem que forma un cuerpo de inclusión. La invención proporciona también una casete de expresión para la expresión de un polipéptido en tándem que forma un cuerpo de inclusión que exhibe un aislamiento mejorado. Se proporciona también por la invención un RNA producido por transcripción de una casete de expresión de la invención. La invención proporciona también una proteína producida por traducción de un RNA producido por transcripción de una casete de expresión de la invención. Se proporciona también por la invención un constructo de ácido nucleico que contiene un vector y una casete de expresión de la invención. La invención proporciona también una célula que contiene una casete de expresión o un constructo de ácido nucleico de la invención. Se proporciona también por la invención un polipéptido en tándem que contiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado. La invención proporciona también un método para seleccionar una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que confiere mejora en el aislamiento a un cuerpo de inclusión.

La casete de expresión puede codificar un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión. La casete de expresión puede codificar un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un enlazador peptídico escindible. La casete de expresión puede codificar también un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, y un marcador de fusión. La casete de expresión puede codificar también un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, un péptido enlazador escindible, y un marcador de fusión. La casete de expresión puede codificar un polipéptido en tándem que tiene un polipéptido preseleccionado, una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, un enlazador peptídico escindible, y un marcador de fusión enlazados operativamente en cualquier orden que hará que el polipéptido en tándem forme un cuerpo de inclusión.

Preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido preseleccionado que es un polipéptido bioactivo. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido preseleccionado que es útil para tratar una enfermedad en un humano o animal. Aún más preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido preseleccionado que es el péptido 1 semejante a glucagón (GLP-1), el péptido 2 semejante a glucagón (GLP-2), la hormona paratiroidea (PTH), o el factor de liberación de la hormona del crecimiento (GRF). Preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido preseleccionado que es una proteasa. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido preseleccionado que es clostripaína. La casete de expresión puede codificar más de una copia de un polipéptido preseleccionado. Preferiblemente, la casete de expresión codifica 20 copias de un polipéptido preseleccionado. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica 10 copias de un polipéptido preseleccionado. Todavía más preferiblemente, la casete de expresión codifica 5 copias de un polipéptido preseleccionado. Aún más preferiblemente, la casete de expresión codifica dos copias de un polipéptido preseleccionado. Muy preferiblemente, la casete de expresión codifica una sola copia de un polipéptido preseleccionado.

Preferiblemente, la casete de expresión codifica una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que tiene una secuencia de aminoácidos que es una variante de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-15. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-15. Preferiblemente, la casete de expresión codifica una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que confiere mejora de aislamiento al cuerpo de inclusión formado a partir del polipéptido en tándem. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que confiere resistencia a las proteasas, solubilidad controlable, estabilidad de purificación, o auto-adhesión a un cuerpo de inclusión formado a partir de un polipéptido en tándem. La casete de expresión puede codificar una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que puede estar enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado en el término amino del polipéptido preseleccionado, el término carboxilo del polipéptido preseleccionado, o el término amino y el término carboxilo del polipéptido preseleccionado. Preferiblemente, la casete de expresión codifica una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que está enlazada independientemente de modo operativo a cada uno del término amino y el término carboxilo de un polipéptido preseleccionado. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que está enlazada operativamente al término carboxilo de un polipéptido preseleccionado. Aún más preferiblemente, la casete de expresión codifica una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que está enlazada operativamente al término amino de un polipéptido preseleccionado. La casete de expresión puede codificar una o más parejas de fusión de cuerpos de inclusión que pueden estar enlazadas operativamente al término amino, el término carboxilo o el término amino y el término carboxilo de un polipéptido preseleccionado.

Preferiblemente, la casete de expresión codifica 20 parejas de fusión de cuerpos de inclusión que están enlazadas operativamente al polipéptido preseleccionado. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica 10 parejas de fusión de cuerpos de inclusión que están enlazadas al polipéptido preseleccionado. Aún más preferiblemente, la casete de expresión codifica 5 parejas de fusión de cuerpos de inclusión que están enlazadas al polipéptido preseleccionado. Todavía más preferiblemente, la casete de expresión codifica dos parejas de fusión de cuerpos de inclusión que están enlazadas al polipéptido preseleccionado. Muy preferiblemente, la casete de expresión codifica una sola pareja de fusión de cuerpos de inclusión que está enlazada al polipéptido preseleccionado.

Preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que aumenta la facilidad con la que puede aislarse un polipéptido en tándem enlazado operativamente. Más preferiblemente la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es un marcador poli-histidina. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es un marcador epitópico. Aún más preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es un marcador de fijación de sustrato. Todavía más preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es proteína de fijación de arabinosa o glutatión-S-transferasa. La casete de expresión puede codificar un marcador de fusión que es un ligando para un receptor celular. Preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es un ligando para un receptor de insulina.

La casete de expresión de la invención puede codificar uno o más enlazadores peptídicos escindibles que están enlazados operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un polipéptido preseleccionado. La casete de expresión de la invención puede codificar también uno o más enlazadores peptídicos escindibles que están enlazados operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, un polipéptido preseleccionado y un marcador de fusión. Preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido en tándem que tiene 20 enlazadores peptídicos escindibles. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido en tándem que tiene 10 enlazadores peptídicos escindibles. Aún más preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido en tándem que tiene 5 enlazadores peptídicos escindibles. Muy preferiblemente, la casete de expresión codifica un polipéptido en tándem que tiene un solo enlazador peptídico escindible posicionado independientemente, entre una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un polipéptido preseleccionado, entre una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un marcador de fusión, entre dos polipéptidos preseleccionados, o entre un polipéptido preseleccionado y un marcador de fusión.

La casete de expresión puede codificar un enlazador peptídico escindible que puede escindirse con un agente químico. Preferiblemente, la casete de expresión codifica un enlazador peptídico escindible que puede ser escindido con bromuro de cianógeno. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica un enlazador peptídico escindible que puede ser escindido con paladio. La casete de expresión puede codificar un enlazador peptídico escindible que puede ser escindido con una proteasa. Preferiblemente, la casete de expresión codifica un enlazador peptídico escindible que puede ser escindido con una proteasa específica de tejido. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica un enlazador peptídico escindible que puede ser escindido con una serina-proteasa, una proteasa aspártica, una cisteína-proteasa, o una metaloproteasa. Muy preferiblemente, la casete de expresión codifica un enlazador peptídico escindible que puede ser escindido con clostripaína.

La casete de expresión de la invención incluye un promotor. Preferiblemente, el promotor es un promotor constitutivo. Más preferiblemente, el promotor es un promotor regulable. Muy preferiblemente, el promotor es un promotor inducible.

La casete de expresión de la invención puede incluir uno o más codones de parada suprimibles. Preferiblemente, un codón de parada suprimible es un codón de parada ámbar u ocre.

La casete de expresión de la invención puede codificar un marcador de fusión. La casete de expresión puede codificar un marcador de fusión que puede ser un dominio de fijación de ligando. Preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es un dominio de fijación de metales. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es un dominio de fijación de azúcar. Aún más preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es un dominio de fijación de péptido. Muy preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es un dominio de fijación de aminoácido. La casete de expresión puede codificar un marcador de fusión que puede ser un epítope de anticuerpo. Preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es reconocido por un anticuerpo anti-proteína de fijación de maltosa. Más preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es reconocido por un anticuerpo anti-gen 10 del bacteriófago T7. La casete de expresión puede codificar un marcador de fusión que puede ser una proteína fluorescente. Preferiblemente, la casete de expresión codifica un marcador de fusión que es una proteína fluorescente verde, una proteína fluorescente amarilla, una proteína fluorescente roja o una proteína fluorescente cayena.

La invención proporciona un constructo de ácido nucleico que contiene un vector y una casete de expresión de la invención. Preferiblemente, el vector es un plásmido, fagémido, cósmido, factor F, virus, bacteriófago, cromosoma artificial de levadura, o cromosoma artificial bacteriano. Preferiblemente, el constructo de ácido nucleico es RNA. Más preferiblemente, el constructo de ácido nucleico es DNA.

La invención proporciona una célula que contiene un constructo de ácido nucleico de la invención. Preferiblemente, la célula es una célula eucariota. Más preferiblemente, la célula eucariota es una célula de mamífero. Aún más preferiblemente, la célula eucariota es una célula de levadura. Muy preferiblemente, la célula eucariota es una célula de insecto. Más preferiblemente, la célula es una célula procariota. Aún más preferente, la célula procariota es una bacteria. Todavía más preferiblemente, la célula procariota es un Escherichia coli. Muy preferiblemente, la célula procariota es Escherichia coli BL21.

La invención proporciona un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión. La invención proporciona también un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un enlazador peptídico escindible. La invención proporciona también un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, y un marcador de fusión. La invención proporciona también un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, un péptido enlazador escindible, y un marcador de fusión. La invención proporciona también un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, y enlazado operativamente de modo independiente a uno o más enlazadores peptídicos escindibles, o a uno o más marcadores de fusión en cualquier orden que pueda hacer que un polipéptido en tándem forme un cuerpo de inclusión.

La invención proporciona también un método para seleccionar una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que confiere mejora de aislamiento a un cuerpo de inclusión. Preferiblemente, la mejora de aislamiento es un punto isoeléctrico alterado. Más preferiblemente, la mejora de aislamiento es resistencia a proteasas. Aún más preferiblemente, la mejora de aislamiento es solubilidad incrementada. Todavía más preferiblemente, la mejora de aislamiento es auto-adhesión. Muy preferiblemente, la mejora de aislamiento es estabilidad de purificación.

Definiciones

Abreviaturas: IPTG: isopropiltio-\beta-D-galactosido; PCR: reacción en cadena de polimerasa; mRNA: ácido ribonucleico mensajero; DNA ácido desoxirribonucleico; RNA: ácido ribonucleico; \beta-gal: \beta-galactosidasa; GST: glutatión-S-transferasa; CAT: cloranfenicol-acetil-transferasa; SPA: proteína estafilocócica A; SPG: proteína estreptocócica G; MBP: proteína de fijación de maltosa; SBD: proteína de fijación de almidón; CBD_{CenA}: dominio de fijación de celulosa de la endoglucanasa A; CBD_{Cex}: dominio de fijación de celulosa de la exoglucanasa Cex; FLAG: péptido hidrófilo de 8 aminoácidos; TrpE: triptófano-sintasa; GLP-1: péptido 1 semejante a glucagón; GLP-2: péptido 2 semejante a glucagón; PTH: hormona paratiroidea; GRF: factor liberador de hormona del crecimiento; PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida; SDS: dodecilsulfato de sodio; Vg: vestigial.

El término "punto isoeléctrico alterado" se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que produce un cambio en el punto isoeléctrico de un polipéptido en tándem que incluye la pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado.

Un "análogo de aminoácido" incluye aminoácidos que se encuentran en la forma D en lugar de la forma L, así como otros análogos de aminoácidos bien conocidos, v.g., N-alquil-aminoácidos, ácido láctico, y análogos. Estos análogos incluyen fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, ácido hipúrico, ácido octahidroindol-2-carboxílico, estatina, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico, penicilamina, ornitina, citrulina, N-metil-alanina, parabenzoil-fenilalanina, fenilglicina, propargilglicina, sarcosina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, norleucina, norvalina, ortonitrofenilglicina, y otros aminoácidos similares.

Los términos "células", "cultivos de células", "células hospedadoras recombinantes", "células hospedadoras", y otros términos de este tipo denotan, por ejemplo, microorganismos, células de insecto, y células de mamífero, que pueden ser, o han sido, utilizadas como receptores para constructos o casetes de expresión de ácido nucleico, e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transformada. Debe entenderse que la progenie de una sola célula parental puede no ser necesariamente idéntica por completo en morfología o en complemento de DNA genómico o total al parental original, debido a mutación natural, accidental, o deliberada. Muchas células están disponibles de ATCC y fuentes comerciales. Se conocen en la técnica muchas líneas de células de mamífero e incluyen, pero sin carácter limitante, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), y células de carcinoma hepatocelular humano (v.g., Hep G2). Se conocen en la técnica muchas células procariotas e incluyen, pero sin carácter limitante, Escherichia coli y Salmonella typhimurium. Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (15 de enero, 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765. Se conocen en la técnica muchas células de insecto e incluyen, pero sin carácter limitante, células de gusano de seda y células de mosquito. (Franke et al., J. Gen. Virol., 66:2761 (1985); Marumoto et al., J. Gen. Virol., 68:2599 (1987)).

Un "enlazador peptídico escindible" (CPL) se refiere a una secuencia peptídica que tiene una secuencia de reconocimiento de escisión. Un enlazador peptídico escindible puede ser escindido por un agente de escisión enzimático o químico. Ejemplos de enlazadores peptídicos escindibles incluyen, pero sin carácter limitante, los proporcionados en la Tabla V y Tabla VI. Se conocen numerosas secuencias peptídicas que son escindidas por enzimas o productos químicos. Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Walsh, Proteins Biochemistry and Biotechnology, John Wiley & Sons, LTD., West Sussex, England (2002).

Un "agente de escisión" es un producto químico o una enzima que reconoce un sitio de escisión en un polipéptido y causa la división del polipéptido en dos polipéptidos por rotura de un enlace interno del polipéptido. Ejemplos de agentes de escisión incluyen, pero sin carácter limitante, productos químicos y proteasas.

Una "secuencia codificante" es una secuencia de ácido nucleico que se traduce en un polipéptido, tal como un polipéptido preseleccionado, usualmente por la vía de mRNA. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón inicial de traducción en el término 5' y un codón de parada de la traducción en el término 3' de un mRNA. Una secuencia codificante puede incluir, pero sin carácter limitante, cDNA, y secuencias de ácido nucleico recombinantes.

Un "aminoácido conservador" se refiere a un aminoácido que es funcionalmente similar a un segundo aminoácido. Tales aminoácidos pueden sustituirse uno por otro en un polipéptido con una alteración mínima de la estructura o función del polipéptido de acuerdo con técnicas bien conocidas. Los cinco grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras de uno por otro: alifáticos: Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I); aromáticos: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), triptófano (W); que contienen azufre: Metionina (M), Cisteína (C); básicos: Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H); ácidos: Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E), Asparagina (N) y Glutamina (Q).

"Promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es capaz de expresar un gen o marco de lectura abierto sin regulación adicional. Tales promotores constitutivos proporcionan expresión constante de genes enlazados operativamente o marcos de lectura abiertos en prácticamente todas las condiciones.

Un "marcador de fusión" es un segmento de aminoácido que puede estar enlazado operativamente a un polipéptido en tándem que contiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a una secuencia de aminoácidos preseleccionada. Un marcador de fusión puede exhibir numerosas propiedades. Por ejemplo, el marcador de fusión puede fijarse selectivamente a un medio de purificación que contiene una pareja de fusión para el marcador de fusión y permitir que el polipéptido en tándem enlazado operativamente se purifique fácilmente. Tales marcadores de fusión pueden incluir, pero sin carácter limitante, glutatión-S-transferasa, polihistidina, proteína de fijación de maltosa, avidina, biotina, o estreptavidina. En otro ejemplo, un marcador de fusión puede ser un ligando para un receptor celular, tal como un receptor de insulina. Esta interacción permitirá que un polipéptido en tándem que está enlazado operativamente al marcador de fusión se direccione específicamente a un tipo específico de célula basado en el receptor expresado por la célula. En otro ejemplo, el marcador de fusión puede ser un polipéptido que sirve para identificar el polipéptido en tándem marcado operativamente. Ejemplos de tales marcadores de fusión incluyen, pero sin carácter limitante, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente amarilla, y proteína fluorescente cayena.

El término "gen" se utiliza ampliamente para hacer referencia a cualquier segmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido preseleccionado. Así, un gen puede incluir una secuencia codificante para un polipéptido preseleccionado y/o las secuencias reguladoras requeridas para la expresión. Un gen puede obtenerse a partir de una diversidad de fuentes, que incluyen la clonación a partir de una fuente de interés o la síntesis a partir de información se secuencia conocida o predicha. Un gen de la invención puede optimizarse también para expresión en un organismo dado. Por ejemplo, puede utilizarse una tabla de uso de codones para optimizar un gen para expresión en Escherichia coli. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988).

Un "cuerpo de inclusión" es un depósito amorfo en el citoplasma de una célula; una proteína agregada apropiada para la célula pero deteriorada, plegada o unida a ligandos incorrectamente, o una proteína extraña procesada análogamente de modo inadecuado, tal como una proteína de la cubierta viral o producto de DNA recombinante.

Una "pareja de fusión de cuerpos de inclusión" es una secuencia de aminoácidos que tiene una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-15, o variantes de las mismas, que causan que un polipéptido en tándem que contiene un polipéptido seleccionado y una pareja de fusión de cuerpos de inclusión forme un cuerpo de inclusión cuando se expresa en una célula. Las parejas de fusión de cuerpos de inclusión de la invención pueden alterarse para conferir mejora de aislamiento en un cuerpo de inclusión que contiene la pareja de fusión de cuerpos de inclusión alterada. Ejemplos de parejas de fusión de cuerpos de inclusión incluyen, pero sin carácter limitante, las proporcionadas en la Tabla I y la Tabla II.

"Promotor inducible" se refiere a los promotores regulados que pueden ser activados por un estímulo externo (v.g., un producto químico, estrés nutricional, o calor). Por ejemplo, el promotor lac puede ser inducido por el uso de IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosido). En otro ejemplo, el promotor P_{L} del bacteriófago lambda puede estar regulado por el represor sensible a la temperatura, clts857 que reprime la transcripción de P_{L} a bajas temperaturas pero no a temperaturas altas. Así, puede utilizarse un cambio de temperatura para inducir la transcripción del promotor P_{L}. Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (15 de enero, 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765.

El término "mejora de aislamiento" se refiere a la alteración de las características de un cuerpo de inclusión que facilitan la purificación de los polipéptidos que componen el cuerpo de inclusión. Por ejemplo, la alteración de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión para aumentar la solubilidad de un cuerpo de inclusión formado a partir de polipéptidos en tándem que incluyen la pareja de fusión de cuerpos de inclusión alterada sería una mejora de aislamiento. En otro ejemplo, la alteración de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión para controlar la solubilidad de un cuerpo de inclusión a un pH seleccionado sería una mejora de aislamiento.

Un "marco de lectura abierto" (ORF) es una región de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, tal como un polipéptido preseleccionado; esta región puede representar una porción de una secuencia codificante o una secuencia codificante total.

"Enlazado operativamente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos en un solo fragmento de ácido nucleico o una sola secuencia de aminoácidos de tal modo que la función de una se ve afectada por la otra. Por ejemplo, una secuencia de DNA reguladora se dice que está "enlazada operativamente a" o "asociada con" una secuencia de DNA que codifica un RNA si las dos secuencias están situadas de tal manera que la secuencia de DNA reguladora afecta a la expresión de la secuencia de DNA codificante (es decir, que el RNA de la secuencia codificante o funcional se encuentra bajo el control de transcripción del promotor). En un ejemplo relacionado con secuencias de aminoácidos, se dice que una pareja de fusión de cuerpos de inclusión está enlazada operativamente a una secuencia de aminoácidos preseleccionada cuando la pareja de fusión de cuerpos de inclusión hace que un polipéptido en tándem forme un cuerpo de inclusión. En otro ejemplo, se dice que una secuencia señal está enlazada operativamente a un amino-ácido preseleccionado cuando la secuencia señal dirige el polipéptido en tándem a una localización específica en una célula.

Un "operador" es un sitio en un DNA en el cual una proteína represora se fija para prevenir la transcripción de la iniciación en el promotor adyacente. Se conocen muchos operadores y represores, y se ilustran por el operador lac y el represor lac. Lewin, Genes VII, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York (2000).

El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos; por tanto, dentro de la definición de polipéptido se incluyen péptidos, oligopéptidos, y proteínas. Este término incluye también modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y análogas. Se incluyen en la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido o aminoácidos marcados. Ejemplos de aminoácidos radiomarcados incluyen, pero sin carácter limitante, S^{35}-metionina, S^{35}-cisteína, H^{3}-alanina, y análogos. La invención puede utilizarse también para producir polipéptidos deuterados por crecimiento de células que expresan el polipéptido en deuterio. Tales polipéptidos deuterados son particularmente útiles durante los estudios de RMM.

"Promotor" se refiere a una secuencia nucleotídica, usualmente aguas arriba (5') a su secuencia codificante, que controla la expresión de la secuencia codificante por proporcionar el sitio de reconocimiento para RNA-polimerasa y otros factores requeridos para transcripción apropiada. "Promotor" incluye un promotor mínimo que es una secuencia corta de DNA que comprende una secuencia TATA y otras secuencias que sirven para especificar el sitio de iniciación de la transcripción, a las cuales se añaden elementos reguladores para control de la expresión. "Promotor" se refiere también a una secuencia de nucleótidos que incluye un promotor mínimo más elementos reguladores, que es capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos por elementos diferentes derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso estar constituidos por segmentos de DNA sintéticos. Un promotor puede contener también secuencias de DNA que están implicadas en la fijación de factores proteínicos que controlan la eficacia de la iniciación de la transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas o ambientales.

El término "estabilidad de purificación" se refiere a las características de aislamiento de un cuerpo de inclusión formado a partir de un polipéptido en tándem que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado. Estabilidad de purificación alta indica que el cuerpo de inclusión es susceptible de aislarse de una célula en la cual se ha producido. Estabilidad de purificación baja indica que el cuerpo de inclusión es inestable durante la purificación debido a disociación de los polipéptidos en tándem que forman el cuerpo de inclusión.

"Purificado" y "aislado" significan, cuando se hace referencia a un polipéptido o secuencia de ácido nucleico, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificado" tal como se utiliza en esta memoria, significa preferiblemente al menos 75% en peso, más preferiblemente al menos 85% en peso, más preferiblemente todavía al menos 95% en peso, y muy preferiblemente al menos 98% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo presentes (pero pueden estar presentes agua, tampones, y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tengan un peso molecular menor que 1000).

"Promotor regulado" hace referencia a un promotor que dirige la expresión génica de una manera controlada en lugar de una manera constitutiva. Promotores regulados incluyen promotores inducibles y promotores reprimibles. Tales promotores pueden incluir secuencias naturales y sintéticas, así como secuencias que pueden ser una combinación de secuencias sintéticas y naturales. Diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Promotores regulados típicos útiles en la invención incluyen, pero sin carácter limitante, promotores utilizados para regular el metabolismo (v.g., un promotor lac inducible por IPTG), promotores del choque térmico (v.g., un promotor SOS), y promotores de bacteriófago (v.g., un promotor T7).

Un "sitio de fijación de ribosoma" es una secuencia de DNA que codifica un sitio en un mRNA en el cual las subunidades pequeña y grande de un ribosoma se asocian para formar un ribosoma intacto e iniciar la traducción del mRNA. Secuencias de consenso de sitio de fijación de ribosoma incluyen AGGA o GAGG y están localizadas usualmente 8 a 13 nucleótidos aguas arriba (5') del codón Iniciador AUG en el mRNA. Se conocen en la técnica muchos sitios de fijación de ribosoma. (Shine et al., Nature, 254:34, (1975); Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", en: Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger) (1979)).

El término "auto-adhesión" se refiere a la asociación entre polipéptidos en tándem individuales, que tienen una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a una secuencia polipeptídica preseleccionada, para formar un cuerpo de inclusión. La auto-adhesión afecta a la estabilidad de purificación de un cuerpo de inclusión formado a partir de un polipéptido en tándem. Una auto-adhesión que es demasiado grande produce cuerpos de inclusión que tienen polipéptidos en tándem que están tan fuertemente asociados unos a otros que es difícil separar polipéptidos en tándem individuales de un cuerpo de inclusión aislado. Una auto-adhesión que es demasiado baja produce cuerpos de inclusión que son inestables durante el aislamiento debido a disociación de los polipéptidos en tándem que forman el cuerpo de inclusión. La auto-adhesión puede regularse por alteración de la secuencia de aminoácidos de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión.

Una "secuencia señal" es una región en una proteína o polipéptido responsable de dirigir un polipéptido enlazado operativamente a una localización o compartimiento celular, o la secreción de la célula como está diseñada por la secuencia señal. Por ejemplo, secuencias señal dirigen polipéptidos enlazados operativamente a la membrana interna, el espacio periplásmico, y la membrana externa en las bacterias. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de tales secuencias señal son bien conocidas en la técnica y han sido publicadas. Watson, Molecular Biology of the Gene, 4ª edición, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987); Masui et al., en: Experimental Manipulation of Gene Expression, (1983); Ghrayeb et al., EMBO J., 3: 2437 (1984); Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7212 (1985); Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582 (1982); Patente U.S. No. 4.336.336).

Secuencias señal, preferiblemente para uso en células de insecto, pueden derivarse de genes para proteínas secretadas de insecto o baculovirus, tales como el gen del baculovirus de la polihedrina (Carbonell et al., Gene, 73:409 (1988)). Alternativamente, dado que las señales para modificaciones post-traduccionales en células de mamífero (tales como escisión de péptidos señal, escisión proteolítica, y fosforilación) parecen ser reconocidas por células de insecto, y las señales requeridas para secreción y acumulación nuclear parecen también estar conservadas entre las células de invertebrados y células de vertebrados, pueden utilizarse también secuencias señal no procedentes de insectos, tales como las derivadas de genes codificantes de interferón \alpha humano (Maeda et al., Nature, 315:592 (1985)), el péptido humano de liberación de gastrina (Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol., 8: 3129 (1988)), IL-2 humana (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8404 (1985)), IL-3 de ratón (Miyajima et al., Gene, 58: 273 (1987)) y glucocerebrosidasa humana (Martin et al., DNA, 7:99 (1988)), para proporcionar secreción en insectos.

Secuencias señal de levadura adecuadas pueden derivarse de genes para proteínas de levadura secretadas, tales como el gen de invertasa de levadura (Publ. EPO No. 012. 873; Publ. JPO No. 62.096.086) y el gen del factor A (Pat. U.S. No. 4588684. Alternativamente, existen secuencias de origen distinto de levaduras, por ejemplo de interferón, que proporcionan también secreción en levadura (Publ. EPO No. 060 057).

El término "solubilidad" se refiere a la cantidad de una sustancia que puede disolverse en un volumen unidad de disolvente. Por ejemplo, la solubilidad, tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la capacidad de un polipéptido en tándem para resuspenderse en un volumen de disolvente, tal como un tampón biológico.

Un "codón de parada suprimible" es un codón que sirve como codón de parada para la traducción de un RNA que contiene el codón de parada suprimible cuando el RNA se traduce en una célula que no es una célula supresora. Sin embargo, cuando el RNA se traduce en una célula que es una célula supresora, la célula supresora producirá un RNA de transferencia que reconoce el codón de parada suprimible y facilita la inserción de un aminoácido en la cadena del polipéptido en crecimiento. Esta acción hace posible que la traducción del RNA continúe más allá del codón de parada suprimible. A los codones de parada suprimibles se hace referencia a veces como mutaciones sin sentido. Los codones de parada suprimibles son bien conocidos en la técnica e incluyen ejemplos tales como mutaciones ámbar (UAG) y mutaciones ocre (UAA). Existen numerosas células supresoras que insertan un aminoácido en una cadena de polipéptido en crecimiento en una posición correspondiente a un codón de parada suprimible. Ejemplos de supresores, reconocidos por codones, y el aminoácido insertado incluyen: supD, ámbar, serina; supE, ámbar, glutamina; supF, ámbar, tirosina; supB, ámbar y ocre, glutamina; y supC, ámbar y ocre, tirosina. Otros supresores se conocen en la técnica. Adicionalmente, se conocen numerosas células en la técnica que son células supresoras. Ejemplos de tales células incluyen, pero sin carácter limitante, las cepas bacterianas: 71/18 (supE); BB4 (supF58 y supE44); BNN102 (supE44); C600 (supE44); y CSH18 (supE). Los expertos en la técnica se darán cuenta de que se conocen muchas células supresoras y pueden obtenerse de ATCC u otras fuentes comerciales. Un codón de parada suprimible puede utilizarse para insertar un aminoácido específico en una cadena polipeptídica en una localización específica. Dicha inserción puede utilizarse para crear una secuencia de aminoácidos específica en un polipéptido que sirve como sitio de escisión para un agente químico o enzimático. Por selección de un codón de parada suprimible apropiado y traducción de un RNA que contiene el codón de parada suprimible en una célula apropiada, un experto en la técnica puede controlar qué agente químico o enzimático puede escindir una cadena polipeptídica en una posición dada.

Un "polipéptido en tándem", como se define en esta memoria, es una proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado que puede incluir opcionalmente aminoácidos adicionales.

Una "proteasa específica de tejido" se refiere a una enzima proteolítica que se expresa en células específicas a un nivel más alto que en otras células de un tipo diferente. El antígeno específico de próstata es un ejemplo de una proteasa específica de tejido.

Una "secuencia terminadora de la transcripción" es una señal dentro del DNA que funciona para parar la síntesis de RNA en un punto específico a lo largo del molde de DNA. Un terminador de la transcripción puede ser dependiente o independiente del factor rho. Un ejemplo de una secuencia terminadora de la transcripción es el terminador T7. Terminadores de la transcripción se conocen en la técnica y pueden ser aislados de vectores disponibles comercialmente de acuerdo con métodos recombinantes conocidos en la técnica. (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (15 de enero, 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765; Stratagene, La Jolla, CA).

"Transformación" se refiere a la inserción de una secuencia de ácido nucleico exógena en una célula hospedadora, con indiferencia del método utilizado para la inserción. Por ejemplo, pueden utilizarse captura directa, transducción, apareamiento f o electroporación para introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula hospedadora. La secuencia de ácido nucleico exógena puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente, puede integrarse en el genoma hospedador.

Una "secuencia de iniciación de la traducción" se refiere a una secuencia de DNA que codifica una secuencia en un mRNA transcrito que proporciona iniciación de la traducción a alto nivel. Se conocen en la técnica numerosas secuencias de iniciación de la traducción. A estas secuencias se hace referencia a veces como secuencias conductoras. Una secuencia de iniciación de la traducción puede incluir un sitio de fijación de ribosoma optimizado. En la presente invención, se prefieren secuencias de inicio de la traducción bacterianas. Tales secuencias de iniciación de la traducción son bien conocidas en la técnica y pueden obtenerse del bacteriófago T7, el bacteriófago \varphi10, y el gen codificante de ompT. Los expertos en la técnica pueden obtener y clonar fácilmente secuencias de iniciación de la traducción de una diversidad de plásmidos disponibles comercialmente, tales como la serie de plásmidos pET (plásmido para expresión de RNA-polimerasa T7). (Stratagene, La Jolla, CA).

Un polipéptido "variante" es un polipéptido derivado del polipéptido nativo por deleción o adición de uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal del polipéptido nativo; deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína nativa. Tales sustituciones o inserciones son preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservadoras. Métodos para tales manipulaciones se conocen generalmente en la técnica. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488, (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol., 154:367 (1987); Patente US No. 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias citadas en ellos. Asimismo, están disponibles comercialmente kits para mutación de DNA. (Quick change Kit, Stratagene, La Jolla, CA). Orientaciones en cuanto a sustituciones apropiadas de aminoácidos que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés pueden encontrarse en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).

Un "vector" incluye, pero sin carácter limitante, cualquier plásmido, cósmido, bacteriófago, cromosoma de levadura artificial, cromosoma artificial bacteriano, factor f, fagémido o virus en forma bicatenaria o monocatenaria lineal o circular que puede ser o no auto-transmisible o movilizable, y que puede transformar un hospedador procariota o eucariota sea por integración en el genoma celular o existir extracromosómicamente (v.g. plásmido de replicación autónomo con un origen de replicación).

Se incluyen específicamente vectores lanzadera por los cuales los vehículos de DNA son capaces, naturalmente o por diseño, de replicación en dos organismos hospedadores diferentes (v.g. células bacterianas, de mamífero, de levadura o de insecto.

\vskip1.000000\baselineskip

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un mapa de plásmido para el Plásmido de Expresión pBN95.

La Figura 2 es un mapa de plásmido para el plásmido pBN95 (Tac)-T7tagVgCH-GRF(1-44)A.

La Figura 3 ilustra la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos para la casete T7tagVgCH-GRF(1-44)A. La secuencia conductora, la secuencia Vg, la secuencia enlazadora, y las secuencias GRF(1-44)A se indican por líneas delimitantes. Los sitios de reconocimiento por las enzimas de restricción se indican por nombre y por subrayado. El sitio de escisión se indica por una flecha.

La Figura 4 ilustra la secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos para la casete T7tag-GRF(1-44)A. Se indican las secuencias T7tag, enlazadora, y GRF(1-44)A de ácido nucleico y aminoácidos. Los sitios de reconocimiento por las enzimas de restricción se indican por nombre y por subrayado. Un sitio de reconocimiento de enteroquinasa se indica por una flecha.

La Figura 5 ilustra la secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos para la casete T7tagVg-GRF(1-44)A. La secuencia conductora, la secuencia Vg, la secuencia enlazadora, y las secuencias GRF(1-44)A se indican por líneas delimitantes. Los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción se indican por nombre y por subrayado. El sitio de escisión de indica por una flecha. El codón de parada está marcado y se indica por asteriscos.

La Figura 6 ilustra la secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos para la casete T7 tagVg(opt)CH-GRF(1-44)A. Los codones optimizados están subrayados. El codón de parada se indica con un asterisco.

La Figura 7 ilustra una gráfica de hidrofobicidad para una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que tiene SEQ ID NO:2.

La Figura 8 ilustra la secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos para la casete T7tagVg Mut1CH-GRF(1-44)A. Las sustituciones de aminoácidos se indican como codificadas por codones en minúsculas. Los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción se indican por su nombre. El codón de parada se indica por un asterisco.

La Figura 9 ilustra la secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos para la casete T7 tagVgMut4CH-GRF(1-44)A. Las sustituciones de aminoácidos se indican por letras minúsculas. El codón de parada se indica con un asterisco.

La Figura 10 ilustra la secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos para la casete T7tagVg-PTH(1-34). Un sitio de escisión de trombina está localizado entre los aminoácidos de las posiciones 55 y 56. Los sitios de restricción se indican por subrayado y nombre.

La Figura 11 ilustra la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos para una secuencia enlazadora que contiene un sitio de escisión de paladio localizado entre los aminoácidos de la posición 16 y 17. Se indican las secuencias T7tag, enlazadora, y de escisión con Pd.

La Figura 12 proporciona secuencias de DNA y péptidos de las casetes de expresión pET23 T7tagVg(De13)-CHPTH(1-34) y pET23T7TagVg(De12+3)CHPTH(1-34) que codifican el péptido precursor PTH. Los codones optimizados se indican con subrayado, y los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción se indican por nombre y por subrayado.

La Figura 13 es un mapa de plásmido para el plásmido pBN115-T7tagVg-CAT.

La Figura 14 ilustra la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos para el fragmento T7Vg separable por NheI. Los sitios de reconocimiento de enzimas de escisión se indican por nombre.

La Figura 15 es un mapa plasmídico para el plásmido pBN115-T7tagVg-LacZ.

La Figura 16 ilustra un gel SDS-PAGE de muestras obtenidas de células que se trataron de acuerdo con las condiciones indicadas. Pista 1: marcador de peso molecular Novex Multimark; Pista 2: 37ºC, inducida 2 horas, fracción soluble de pBN115(Tac)T7tagVg-LacZ; Pista 3: 37ºC, no inducida, fracción soluble de pBN115(Tac)T7tagVg-LacZ; Pista 4: 27ºC, inducida 2 horas, fracción soluble de pBN115(Tac)-T7tagVg-LacZ; Pista 5: 27ºC, no inducida, fracción soluble de pBN115(Tac)-T7tagVg-LacZ; Pista 6: 37ºC, inducida 2 horas, fracción insoluble de pBN115(Tac)-T7tagVg-LacZ; Pista 7: 37ºC, no inducida, fracción insoluble de pBN115(Tac)-T7tagVg-LacZ; Pista 8: 27ºC, inducida 2 horas, fracción insoluble de pBN115(Tac)-T7tagVg-LacZ; Pista 9: 27ºC, no inducida, fracción insoluble de pBN115(Tac)-T7tagVg-LacZ.

La Figura 17 ilustra la secuencia de ácido nucleico y aminoácidos de una casete T7tagVgCH-GLP-1(7-36)CH. Se indica un sitio de reconocimiento de enzima de restricción por su nombre.

La Figura 18 ilustra una estructura generalizada de un polipéptido de la invención.

La Figura 19 ilustra una serie de deleciones de aminoácidos que ocurren alrededor del núcleo hidrófobo de SEQ ID NO: 2.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona métodos y materiales que permiten que un polipéptido preseleccionado se exprese eficientemente en una célula. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido preseleccionado se inserta en una casete de expresión proporcionada por la invención. La casete de expresión hace que el polipéptido preseleccionado se enlace operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión para formar un polipéptido en tándem. El polipéptido en tándem formará un cuerpo de inclusión en la célula en la que se expresa el polipéptido en tándem.

Una ventaja importante de la producción de polipéptidos por técnicas de DNA recombinantes en lugar de por aislamiento y purificación de un polipéptico procedente de una fuente natural, es que pueden producirse cantidades equivalentes de la proteína utilizando menos material de partida que el que sería necesario para aislar el polipéptido de una fuente natural. Adicionalmente, la formación de cuerpos de inclusión permite que un polipéptido en tándem se purifique más fácilmente y protege el polipéptido en tándem contra la degradación indeseable en el interior de la célula. La producción del polipéptido por el uso de técnicas recombinantes permite también aislar la proteína en ausencia de algunas moléculas presentes normalmente en las células nativas. Por ejemplo, pueden producirse composiciones de polipéptidos exentas de contaminantes polipeptídicos humanos debido a que el único polipéptido humano producido por el hospedador no humano recombinante es el polipéptido recombinante en cuestión. Adicionalmente, se evitan también agentes virales potenciales de fuentes naturales y componentes virales patógenos para los humanos.

I. Casete de Expresión

La invención proporciona una casete de expresión capaz de dirigir la expresión de un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión. La invención proporciona también una casete de expresión capaz de dirigir la expresión de un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un enlazador peptídico escindible. La invención proporciona también una casete de expresión capaz de dirigir la expresión de un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un marcador de fusión. La invención proporciona también una casete de expresión capaz de dirigir la expresión de un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, un péptido enlazador escindible, y un marcador de fusión. La invención proporciona también una casete de expresión capaz de dirigir la expresión de un polipéptido en tándem que incluye un polipéptido preseleccionado que está enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión, y enlazado operativamente de modo independiente a uno o más enlazadores peptídicos escindibles, o a uno o más marcadores de fusión en cualquier orden que harán que un polipéptido en tándem forme un cuerpo de inclusión.

Promotores

La casete de expresión de la invención incluye un promotor. Puede utilizarse cualquier promotor capaz de dirigir la transcripción de la casete de expresión. De acuerdo con ello, puede incluirse muchos promotores en la casete de expresión de la invención. Algunos promotores útiles incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores regulados, promotores específicos de células, promotores virales, y promotores sintéticos. Un promotor es una secuencia de nucleótidos que controla la expresión de una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente por proporcionar un sitio de reconocimiento para RNA-polimerasa, y posiblemente otros factores, requeridos para la transcripción correcta. Un promotor incluye un promotor mínimo, constituido exclusivamente por todos los elementos basales necesarios para iniciación de la transcripción, tales como una secuencia TATA y/u otras secuencias que sirven para especificar el sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor puede obtenerse de una diversidad de fuentes diferentes. Por ejemplo, un promotor puede derivarse enteramente de un gen nativo, estar compuesto por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o estar compuesto de secuencias de ácido nucleico que son totalmente sintéticas. Un promotor puede derivarse de muchos tipos deferentes de organismos y adaptarse para uso en una célula dada.

Promotores para uso en bacterias

Para expresión de un polipéptido en tándem en una bacteria, se utilizará una casete de expresión que contenga un promotor bacteriano. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de DNA capaz de fijar RNA-polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción aguas abajo (3'') de una secuencia codificante en mRNA. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que está situada usualmente próxima al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción incluye usualmente un sitio de fijación de RNA-polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un segundo dominio llamado un operador puede estar presente y superponerse a un sitio de fijación de RNA-polimerasa adyacente en la que comienza la síntesis del RNA. El operador permite la transcripción regulada negativamente (inducible), dado que una proteína represora de gen puede fijarse al operador e inhibir con ello la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva puede ocurrir en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Adicionalmente, la regulación positiva puede conseguirse mediante una secuencia de fijación de proteínas activadores de genes, que, en caso de estar presente, está usualmente próxima (5') a la secuencia de fijación de RNA-polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de genes es la proteína activadora de catabolitos (CAP), que contribuye a iniciar la transcripción del operón lac en E. coli (Raibaud et al., Ann. Rev. Genet., 18:173 (1984)). La expresión regulada puede ser por tanto positiva o negativa, aumentando o reduciendo con ello la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas del camino metabólico proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas de metabolización de los azúcares, tales como galactosa, lactosa, (lac) (Chang et al., Nature, 198:1056 (1977), y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) (Goeddel et al., Nuc. Acids Res., 8:4057 (1980); Yelverton et al., Nuc. Acids Res., 9:731 (1981); Patente U.S. No. 4.738.921; y Publ. EPO Núms. 036 776 y 121 775). El sistema promotor de \beta-lactamasa (bla) (Weissmann, "The cloning of interferon and other mistakes", en: Interferon 3 (ed. I. Gresser), 1981), y los sistemas promotores del bacteriófago lambda P_{L} (Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981)) y T5 (Patente U.S. No. 4.689.406) proporcionan también secuencias promotoras útiles. Un promotor preferido es el promotor del virus Chlorella (Patente U.S. No. 6.316.224).

Promotores sintéticos que no existen en la naturaleza funcionan también como promotores bacterianos. Por ejemplo, secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófago pueden unirse con las secuencias operón de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético (Patente U.S. No. 4.551.433). Por ejemplo, el promotor taq es un promotor híbrido trp-lac constituido a la vez por secuencias del promotor trp y del operón lac que está regulado por el represor lac (Amann et al., Gene, 25:167 (1983); de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21 (1983)). Adicionalmente, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen no bacteriano existentes naturalmente que tienen la capacidad de fijar la RNA-polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor existente naturalmente de origen no bacteriano puede acoplarse también con una RNA-polimerasa compatible para producir niveles altos de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema T7 RNA-polimerasa/promotor del bacteriófago es un ejemplo de un sistema promotor acoplado (Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113 (1986); Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1074 (1985)). Adicionalmente, un promotor híbrido puede estar constituido también por un promotor de bacteriófago y una región operadora de E. coli (Publ. EPO No. 267.851).

Promotores para uso en células de insecto

Puede utilizarse una casete de expresión que tenga un promotor de baculovirus para expresión de un polipéptido en tándem en una célula de insecto. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de DNA capaz de fijarse a una RNA-polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción de una secuencia codificante en mRNA. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que está situada usualmente próxima al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción incluye usualmente un sitio de fijación de RNA-polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Puede estar presente un segundo dominio denominado intensificador, y usualmente se encuentra distal al gen estructural. Un promotor de baculovirus puede ser un promotor regulador o un promotor constitutivo. Las secuencias promotores útiles pueden obtenerse a partir de genes estructurales que se transcriben a veces tardíamente en un ciclo de infección viral. Ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína de la polihedrosis baculoviral ((Friesen et al., "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", en: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler), 1986; y las Publs. EPO Núms. 127 839 y 155 476) y el gen codificante de la proteína baculoviral p10 (Vlak et al., J. Gen. Virol., 69:765 (1988)).

Promotores para uso en levadura

Promotores que son funcionales en levadura son conocidos por quienes poseen una experiencia ordinaria en la técnica. Además de un sitio de fijación de RNA-polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción, un promotor de levadura puede poseer también una segunda región llamada secuencia activadora de aguas arriba. La secuencia activadora de aguas arriba permite una expresión regulada que puede ser inducida. La expresión constitutiva ocurre en ausencia de una secuencia activadora de aguas arriba. La expresión regulada puede ser constitutiva o negativa, aumentando o reduciendo por tanto la transcripción.

Promotores para uso en levadura pueden obtenerse de genes de levadura que codifican enzimas activas en caminos metabólicos. Ejemplos de tales genes incluyen alcohol-deshidrogenasa (ADH) (Publ. EPO No. 284.044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfogliceratomutasa, y piruvato-quinasa (PyK). (Publ. EPO No. 329203). El gen PHO5 de levadura, que codifica fosfatasa ácida, proporciona también secuencias promotoras útiles. (Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.80:1 (1983)).

Promotores sintéticos que no existen en la naturaleza pueden utilizarse también para expresión en levadura. Por ejemplo, secuencias activadoras de aguas arriba de un promotor de levadura penden unirse con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora ADH enlazada a la región de activación de la transcripción GAP (Patentes U.S. Núms. 4.876.197 y 4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que están constituidos por las secuencias reguladoras de los genes ADH2, GAL4, GAL10 o PHO5, combinadas con la región de la activación de la transcripción de un gen enzimático glicolítico tal como GAP o PYK (publicación EPO No. 164.556). Adicionalmente, un promotor de levadura puede incluir promotores existentes naturalmente de origen distinto de levadura que tienen la capacidad de fijar RNA-polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Ejemplos de tales promotores se conocen en la técnica. (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:1078 (1980); Henikoff et al., Nature, 283:835 (1981); Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96:119 (1981)); Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", en: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K. N. Timmis y A. Puhler), 1979; (Mercerau-Puigalon et al., Gene, 11:163 (1980); Panthier et al., Curr. Genet., 2:109 (1980)).

Promotores para uso en células de mamífero

Se conocen en la técnica muchos promotores de mamífero que pueden utilizarse en asociación con la casete de expresión de la invención. Los promotores de mamífero tienen a menudo una región de iniciación de la transcripción, que está situada usualmente próxima al extremo 5' de la secuencia codificante, y una secuencia TATA, localizada usualmente 25-30 pares de bases (pb) aguas arriba del sitio de iniciación de la transcripción. Se cree que la secuencia TATA dirige la RNA-polimerasa II a iniciar la síntesis del RNA en el sitio correcto. Un promotor de mamífero puede contener también un elemento promotor aguas arriba, localizado usualmente dentro de 100 a 200 pb aguas arriba de la secuencia TATA. Un elemento promotor de aguas arriba determina la tasa a la que se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación (Sambrook et al., "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., 1989).

Los genes virales de mamífero se expresan a menudo fuertemente y tienen una gama de hospedadores amplia; por esta razón, las secuencias que codifican genes virales de mamífero proporcionan a menudo secuencias promotores útiles. Ejemplos incluyen el promotor precoz de SV40, el promotor LTR del virus del tumor mamario del ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP), y el promotor del virus del herpes símplex. Adicionalmente, secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen metalotioneína murino, proporcionan también secuencias promotores útiles. La expresión puede ser constitutiva o regulada.

Un promotor de mamífero puede estar asociado también con un intensificador. La presencia de un intensificador aumentará usualmente la transcripción desde un promotor asociado. Un intensificador es una secuencia reguladora de DNA que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando está unida a promotores homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio de inicio normal del RNA. Los intensificadores son activos cuando están situados aguas arriba o aguas abajo del sitio de iniciación de la transcripción, en orientación normal o invertida, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos del promotor. (Maniatis et al., Science, 236:1237 (1987)); Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª ed., 1989). Los elementos intensificadores derivados de virus son útiles a veces, debido a que tienen usualmente una gama amplia de hospedadores. Ejemplos incluyen el intensificador del gen temprano de SV40 (Dijkema et al., EMBO J., 4:761 (1985)) y los intensificadores/promotores derivados de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777 (1982b)) y del citomegalovirus humano (Boshart et al., Cell, 41:521 (1985)). Adicionalmente, algunos intensificadores son regulables y se vuelven activos únicamente en presencia de un inductor, tal como una hormona o ión metálico (Sassone-Corsi y Borelli, Trends Genet., 2:215 (1986); Maniatis et al., Science, 236:1237 (1987)).

Se entiende que muchos promotores y elementos reguladores asociados pueden utilizarse dentro de la casete de expresión de la invención para transcribir un polipéptido en tándem codificado.

Secuencia de iniciación de la traducción

La casete de expresión de la invención puede contener una secuencia de ácido nucleico para aumentar la eficiencia de traducción de un mRNA que codifica un polipéptido en tándem de la invención. Dicha traducción incrementada sirve para aumentar la producción del polipéptido en tándem. La presencia de un sitio eficiente de fijación de ribosoma es útil para la expresión de genes en procariotas. En el mRNA bacteriano, se encuentra usualmente un tramo conservado de 6 nucleótidos, la secuencia Shine-Dalgarno, aguas arriba del codón de iniciación AUG. (Shine et al., Nature, 254:34 (1975)). Se cree que esta secuencia promueve la fijación de ribosoma al mRNA por apareamiento de bases entre el sitio de fijación de ribosoma y el extremo 3' del mRNA 16S de Escherichia coli. (Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", en: Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger), 1979)). Un sitio de fijación de ribosoma de esta clase, o derivados operables del mismo, se incluyen dentro de la casete de expresión de la invención.

Una secuencia de iniciación de la traducción puede derivarse de cualquier gen expresado de Escherichia coli y pude utilizarse dentro de una casete de expresión de la invención. Preferiblemente, el gen es un gen altamente expresado. Una secuencia de iniciación de la traducción puede obtenerse por métodos recombinantes estándar, técnicas de síntesis, técnicas de purificación, o combinaciones de los mismos, todos los cuales son bien conocidos. (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY. (1989); Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts., 22:1859 (1981); VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984). Alternativamente, pueden obtenerse secuencias de inicio de la traducción de numerosos vendedores comerciales. (Operon Technologies; Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). En una realización preferida, se utiliza la secuencia de iniciación de la traducción de T7. La secuencia de iniciación de la traducción de T7 se deriva del cistrón del gen 10 de T7 altamente expresado, y se proporciona en la Tabla VII. Otros ejemplos de secuencias de iniciación de la traducción incluyen, pero sin carácter limitante, la secuencia de iniciación de la proteína de fijación de maltosa (Gen Mal E) (Guan et al., Gene, 67:21 (1997)) presente en el vector de expresión pMalc2 (New England Biolabs, Beverly, MA) y la secuencia de iniciación de la traducción para los genes siguientes: gen de tiorredoxina (Novagen, Madison, WI), gen de glutatión-S-transferasa (Pharmacia, Piscataway, NJ), gen de \beta-galactosidasa, gen de cloranfenicol-acetiltransferasa y gen Trp E de de E coli (Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 16, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY).

El mRNA eucariota no contiene una secuencia Shine-Dalgarno. En lugar de ello, la selección del codón de inicio de la traducción está determinada usualmente por su proximidad a la cápsula en el extremo 5' de un mRNA. Los nucleótidos que rodean inmediatamente el codón inicial en el mRNA eucariota influyen en la eficiencia de la traducción. De acuerdo con ello, un experto en la técnica puede determinar qué secuencias de ácido nucleico aumentarán la traducción de un polipéptido en tándem codificado por la casete de expresión de la invención.

Enlazador peptídico escindible

Un enlazador peptídico escindible es una secuencia de aminoácidos que puede ser reconocida y escindida por un agente de escisión. Se conocen muchas secuencias de aminoácidos que son reconocidas y escindidas. Ejemplos de agentes de escisión y sus sitios de reconocimiento incluyen, pero sin carácter limitante, los siguientes: la quimotripsina, que escinde detrás de fenilalanina, treonina o tirosina; la trombina que escinde detrás de arginina; la Tripsina que escinde detrás de lisina o arginina, y el bromuro de cianógeno, que escinde detrás de metionina. Ejemplos de enlazadores peptídicos escindibles incluyen, pero sin carácter limitante, los proporcionados en la Tabla V y Tabla VI. Los expertos en la técnica se darán cuenta de que existen muchas secuencias de aminoácidos que pueden ser utilizadas como enlazador peptídico escindible. La casete de expresión de la invención puede codificar un polipéptido en tándem que contiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado y un enlazador peptídico escindible. Así, una casete de expresión de la invención puede diseñarse para codificar un polipéptido en tándem que contenga un enlazador peptídico escindible que puede ser escindido por un agente específico. Adicionalmente, la casete de expresión de la invención puede diseñarse para codificar un polipéptido en tándem que contenga múltiples enlazadores peptídicos escindibles. Estos enlazadores peptídicos escindibles pueden ser escindidos por el mismo agente de escisión o por agentes de escisión diferentes. Los enlazadores peptídicos escindibles pueden estar situados también en posiciones diferentes dentro del polipéptido en tándem. Un polipéptido en tándem de esta clase puede tratarse con agentes de escisión seleccionados en momentos diferentes para producir productos de escisión diferentes del polipéptido en tándem.

Adicionalmente, una casete de expresión de la invención puede diseñarse para expresar un polipéptido en tándem que contenga una proteasa específica de tejido que puede promover la escisión del polipéptido en tándem de una manera específica de tejido. Por ejemplo, el antígeno específico de próstata es una serina-proteasa expresada en células que revisten los conductos prostáticos. El antígeno específico de próstata exhibe preferencia para escindir en la secuencia de aminoácidos serina-serina-(tirosina/fenilalanina)-tirosina\downarrow-serina-(glicina/serina). Coombs et al., Chem. Biol., 5:475 (1998). De acuerdo con ello, puede diseñarse un polipéptido en tándem que es escindido específicamente en el tejido de próstata. Así, la casete de expresión de la invención puede utilizarse para expresar un polipéptido en tándem que es un profármaco que es activado en un tejido específico del cuerpo de un paciente que se encuentra en necesidad de ello. Un polipéptido en tándem de esta clase ofrece la ventaja de que el profármaco se activa únicamente en el sitio de acción y pueden evitarse efectos potencialmente tóxicos en otros tejidos. Los expertos en la técnica reconocerán que la casete de expresión de la invención puede utilizarse para expresar muchos polipéptidos en tándem diferentes que contienen un enlazador peptídico escindible que es específico de tejido.

Pareja de Fusión de Cuerpos de Inclusión

La casete de expresión de la presente invención codifica un polipéptido en tándem que incluye una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que está enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado. Sorprendentemente, se ha encontrado que el enlace de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión a un polipéptido preseleccionado hará que el polipéptido en tándem producido forme un cuerpo de inclusión. Ejemplos de parejas de fusión de cuerpos de inclusión incluyen, pero sin carácter limitante, las parejas de fusión de cuerpos de inclusión proporcionadas en la Tabla I y Tabla II. Se ha encontrado también, sorprendentemente, que la secuencia de aminoácidos de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión puede alterarse para producir cuerpos de inclusión que exhiben características útiles. Estas características útiles proporcionan mejora de aislamiento a cuerpos de inclusión que se forman a partir de polipéptidos en tándem que incluyen una pareja de fusión de cuerpos de inclusión de la invención. La mejora del aislamiento permite que un polipéptido en tándem que contiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que está fusionada a un polipéptido preseleccionado se aísle y purifique más fácilmente que el polipéptido preseleccionado en ausencia de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión. Por ejemplo, la pareja de fusión de cuerpos de inclusión puede alterarse para producir cuerpos de inclusión que son más o menos solubles en una cierta serie de condiciones. Los expertos en la técnica se darán cuenta de que la solubilidad depende de cierto número de variables que incluyen, pero sin carácter limitante, pH, temperatura, concentración de sal, y concentración de proteína. Así, una pareja de fusión de cuerpos de inclusión de la invención puede alterarse para producir un cuerpo de fusión que tenga solubilidad deseada en condiciones diferentes. En otro ejemplo, una pareja de fusión de cuerpos de inclusión de la invención puede alterarse para producir cuerpos de inclusión que contienen polipéptidos en tándem que tienen auto-asociación mayor o menor. Auto-asociación se refiere a la fuerza de la interacción entre dos o más polipéptidos en tándem que forman un cuerpo de inclusión y que contienen una pareja de fusión de cuerpos de inclusión de la invención. Una auto-asociación de esta clase puede determinarse por el uso de una diversidad de métodos conocidos utilizados para medir interacciones proteína-proteína. Dichos métodos se conocen en la técnica y han sido descritos. Freifelder, Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Molecular Bio-logy, W.H. Freeman and Co., 2ª edición, Nueva York, NY (1982). La auto-adhesión puede utilizarse para producir cuerpos de inclusión que exhiben una estabilidad variable a la purificación. Por ejemplo, puede ser deseable una mayor auto-adhesión para estabilizar los cuerpos de inclusión contra la disociación en casos en que se utilizan condiciones severas para aislar los cuerpos de inclusión de una célula. Tales condiciones pueden encontrarse si los cuerpos de inclusión están siendo aislados de células que tienen paredes celulares gruesas. Sin embargo, en los casos en que se utilizan condiciones suaves para aislar los cuerpos de inclusión, puede ser deseable menor auto-adhesión dado que ello puede permitir que los polipéptidos en tándem que componen el cuerpo de inclusión se solubilicen o procesen más fácilmente. De acuerdo con ello, una pareja de fusión de cuerpos de inclusión de la invención puede alterarse para proporcionar un nivel deseado de auto-adhesión para una serie de condiciones dada.

Una pareja de fusión de cuerpos de inclusión de esta clase puede estar enlazada al término amino, el término carboxilo o ambos términos de un polipéptido preseleccionado para formar un polipéptido en tándem. Una pareja de fusión de cuerpos de inclusión tiene un tamaño adecuado para hacer que un polipéptido preseleccionado enlazado operativamente forme un cuerpo de inclusión. Se prefiere que la pareja de fusión de cuerpos de inclusión tenga 100 o menos aminoácidos, más preferiblemente 50 o menos aminoácidos, y muy preferiblemente 30 o menos aminoácidos.

En un ejemplo, la pareja de fusión de cuerpos de inclusión tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a: GSGQGQAQYLSASCVVFTNYSGDTASQVD (SEQ ID NO: 1). Sorprendentemente, se ha encontrado que esta secuencia de aminoácidos es capaz de hacer que polipéptidos en tándem que tienen una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado formen cuerpos de inclusión. Otro descubrimiento sorprendente es que la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión puede alterarse a fin de producir polipéptidos en tándem que formen cuerpos de inclusión que exhiban mejora de aislamiento. La pareja de fusión de cuerpos de inclusión puede tener también una secuencia de aminoácidos que es una variante de SEQ ID NO: 1 y que causa la formación de cuerpos de inclusión por un polipéptido preseleccionado enlazado operativamente. Por ejemplo, una pareja de fusión de cuerpos de inclusión puede tener, pero sin carácter limitante, una secuencia de aminoácidos correspondiente a:

GSGQGQAQYLAASLVVFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 2);

GSQYLAASLVVFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 3);

GSGQGQAQYLAASLVVFTNYSGD

(SEQ ID NO: 4);

GSQYLAASLVVFTNYSGD

(SEQ ID NO: 5);

GSQYLAAVLVVFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 6);

GSGQGQAQYLTASLVKFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 7);

GSGQGQAQYLTASLVQFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 8);

GSGQGQAQYLPASLVKFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 9);

GSGQGQAQYLPASLVQFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 10);

GSGQGQAQYLAASLVKFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 11);

GSGQGQAQYLAASLVQFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 12);

GSGQGQAQYLSASLVKFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 13);

GSGQGQAQYLSASLVQFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 14); o

GSGQGQAGYLAAVLVVFTNYSGDTASQVD

(SEQ ID NO: 15).

Secuencias de ácido nucleico ilustrativas que codifican cada una de SEQ ID NOs: 1-15 se proporcionan en la Tabla II. Así, una pareja de fusión de cuerpos de inclusión puede tener también una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-15, o una variante de la misma, que causan formación de cuerpos de inclusión por un polipéptido preseleccionado enlazado operativamente. La pareja de fusión de cuerpos de inclusión puede estar enlazada también a otras secuencias de aminoácidos, tales como la secuencia T7 tag proporcionada en la Tabla VII.

Una pareja de fusión de cuerpos de inclusión de la invención puede identificarse por enlace operativo de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión a un polipéptido preseleccionado y determinación de si el polipéptido en tándem producido forma un cuerpo de inclusión en una célula. Los métodos recombinantes que pueden utilizarse para construir tales parejas de fusión variantes de cuerpos de inclusión son bien conocidos en la técnica y han sido publicados. Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (15 Enero 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765.

Una variante de pareja de fusión de cuerpos de inclusión puede identificarse también por comparación de su homología de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-15. Un fragmento de proteína que posee 75% o más de homología de secuencia de aminoácidos, especialmente 85-95%, con una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-15 se considera una variante y está abarcado por la presente invención.

Pueden utilizarse también algoritmos matemáticos, por ejemplo el algoritmo de Smith-Waterman para determinar la homología de secuencia. (Smith & Waterman, J. Mol. Biol., 147:195 (1981); Pearson, Genomics, 11:635 (1991)). Aunque puede utilizarse cualquier algoritmo de secuencia para identificar una variante, la presente invención define una variante con referencia al algoritmo de Smith-Waterman, en la cual se utiliza una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-15 como la secuencia de referencia para definir el porcentaje de homología de los homólogos peptídicos en toda su longitud. La elección de valores paramétricos para apareamientos, desapareamientos, e inserciones o deleciones es arbitraria, aunque se ha encontrado que algunos valores paramétricos proporcionan resultados más realistas biológicamente que otros. Una serie preferida de valores paramétricos para el algoritmo Smith-Waterman se expone en el método de "segmentos de semejanza máxima", que utiliza valores de 1 para un residuo apareado y -1/3 para un residuo desapareado (un residuo que es un solo nucleótido o un solo aminoácido) (Waterman, Bulletin of Mathematical Biology, 46:473 (1984)). Inserciones y deleciones x se ponderan como x_{k} = 1+k/3, donde k es el número de residuos en una inserción o deleción dada. Parejas de fusión variantes de cuerpos de inclusión preferidas son aquéllas que tienen más de 75% de homología de secuencia de aminoácidos con una cualquiera de SEQ ID NOs: 1-15 utilizando el algoritmo de Smith-Waterman. Variantes más preferidas tienen más de 90% de homología de secuencia de aminoácidos. Variantes aún más preferidas tienen más de 95% de homología de secuencia de aminoácidos, y variantes muy preferidas tienen al menos 98% de homología de secuencia de aminoácidos.

Marcos de Lectura Abiertos

Pueden insertarse numerosas secuencias de ácido nucleico en una casete de expresión o un constructo de ácido nucleico a partir de la invención y utilizarse para producir muchos polipéptidos preseleccionados diferentes. Tales polipéptidos preseleccionados incluyen aquéllos que son solubles o insolubles en la célula en la que se expresan. Ejemplos de polipéptidos preseleccionados incluyen, pero sin carácter limitante, los proporcionados en la Tabla III y Tabla IV. Un experto en la técnica puede determinar si una secuencia de ácido nucleico puede expresarse utilizando la casete de expresión de la invención por inserción de la secuencia de ácido nucleico en una casete de expresión y determinación de si un polipéptido correspondiente se produce cuando el constructo de ácido nucleico se inserta en una célula apropiada.

Puede insertarse más de una copia de un marco de lectura abierto en una casete de expresión de la invención. Preferiblemente, se inserta un enlazador peptídico escindible entre marcos de lectura abiertos si se inserta más de uno en una casete de expresión de la invención. Un constructo de este tipo permite que el polipéptido en tándem sea escindido por un agente de escisión para producir polipéptidos preseleccionados individuales a partir de la poliproteína expresada por una casete de expresión que contiene más de un marco de lectura abierto.

Se cree que una casete de expresión o constructo de ácido nucleico de la invención es particularmente ventajosa para producir polipéptidos preseleccionados que se degradan en el interior de una célula en la que se expresan. Los polipéptidos cortos son ejemplos de tales polipéptidos preseleccionados. Se cree también que las presentes casetes de expresión y constructos de ácido nucleico son ventajosos para producir polipéptidos preseleccionados que son difíciles de purificar a partir de células. Por ejemplo, el enlace operativo de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión a un polipéptido preseleccionado que en condiciones normales se asociaría fuertemente con una pared o membrana celular puede hacer posible que la proteína se purifique más fácilmente a partir de un cuerpo de inclusión.

Marcos de lectura abiertos preferidos incluyen el péptido-1 semejante a glucagón (GLP-1), el péptido-2 semejante a glucagón (GLP-2), la hormona paratiroidea (PTH), y el factor de liberación de la hormona de crecimiento (GRF). Otros marcos de lectura abiertos preferidos incluyen aquéllos que codifican péptidos semejantes a glucagón, análogos del péptido-1 semejante a glucagón, análogos del péptido-2 semejante a glucagón, GLP-2 (7-36), y análogos del factor de liberación de la hormona del crecimiento. Tales análogos pueden identificarse por su capacidad para fijarse a sus respectivos receptores. Por ejemplo, un análogo del péptido-1 semejante a glucagón se fijará detectablemente al receptor de la proteína-1 semejante a glucagón.

Un experto en la técnica se dará cuenta de que pueden utilizarse muchos marcos de lectura abiertos dentro de una casete de expresión o constructo de ácido nucleico de la invención. Ejemplos de tales marcos de lectura abiertos incluyen, pero sin carácter limitante, marcos de lectura abiertos que codifican los polipéptidos enumerados a continuación en la Tabla I.

Codón de Parada Suprimible

La casete de expresión de la invención puede incluir también un codón de parada suprimible. A un codón de parada suprimible se hace referencia a veces como mutación sin sentido. Un codón de parada suprimible sirve como señal para terminar la transducción de un RNA en la localización del codón de parada suprimible en ausencia de un supresor. Sin embargo, en presencia de un supresor, la traducción continuará a través del codón de parada suprimible hasta que otro codón señala el final de la traducción del RNA. Codones de parada suprimibles y supresores se conocen en la técnica. Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (15 de enero, 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765. Tales codones se ilustran por los codones ocre (UAA) y ámbar (UAG). Los codones de parada suprimibles pueden suprimirse en células que codifican un tRNA que reconoce el codón y facilita la inserción de un aminoácido en la cadena polipeptídica que se traduce a partir del RNA que contiene el codón. Diferentes células contienen diferentes tRNAs que facilitan la inserción de diferentes aminoácidos en la cadena polipeptídica en el codón de parada suprimible. Por ejemplo, un codón ámbar puede ser suprimido por cepas bacterianas supD, supE, supF, supB y supC que insertan serina, glutamina, tirosina, glutamina, y tirosina respectivamente en un polipéptido. Un codón ocre puede ser suprimido por las cepas bacterianas supB y supC que insertan glutamina y tirosina respectivamente en una cadena polipeptídica. Codones suprimibles y supresores adicionales pueden utilizarse con la casete de expresión de la invención.

El uso de un codón de parada suprimible en la casete de expresión de la invención permite la producción de polipéptidos que tienen un aminoácido diferente insertado en la posición codificada por el codón de parada suprimible sin alterar la casete de expresión. El uso de un codón de parada suprimible permite también que sean expresados polipéptidos en tándem de pesos moleculares diferentes por la misma casete de expresión. Por ejemplo, una casete de expresión diseñada para contener una mutación ámbar puede expresarse en una cepa no supresora para producir un polipéptido en tándem que termina en el codón ámbar. La misma casete de expresión puede expresarse en un Escherichia coli supE para producir un polipéptido en tándem que tenga una glutamina insertada en el polipéptido de fusión en la mutación ámbar. Este polipéptido en tándem puede incluir también una secuencia de aminoácidos de adición, tal como un marcador de fusión que termina con un segundo codón de parada. Una casete de expresión de la invención que contiene un codón de parada suprimible proporciona la producción de numerosas variaciones de un polipéptido en tándem que puede expresarse a partir de la misma casete de expresión. Tales variaciones de polipéptidos en tándem dependerán de la combinación del codón de parada suprimible utilizado con la casete de expresión y la célula en la que se inserta la casete de expresión.

Pueden introducirse uno o más sitios de reconocimiento de agentes de escisión en un polipéptido en tándem expresado por una casete de expresión de la invención mediante el uso de un codón de parada suprimible y célula supresora apropiados. Por ejemplo, puede diseñarse un polipéptido en tándem que contenga un sitio de escisión por quimotripsina mediante el uso de una casete de expresión que codifica el polipéptido en tándem y tiene un codón ámbar en una bacteria supF o supC de tal modo que se inserta una tirosina en el polipéptido de fusión. En otro ejemplo, puede crearse un sitio de reconocimiento por la proteasa IgA tipo 2 de Neisseria mediante el uso de una casete de expresión que contiene ámbar en una célula supD. En otro ejemplo adicional, puede crearse un sitio de reconocimiento para la proteasa Nia del potivirus pox del ciruelo, la proteasa del poliovirus 2Apro, o la proteasa Nia (virus del moteado del tabaco) mediante uso apropiado de una casete de expresión que contenga un codón ámbar u ocre en una célula supF o supC. De acuerdo con ello, una casete de expresión de la invención puede contener más de un codón suprimible para expresar un polipéptido en tándem que puede contener más de un sitio de reconocimiento de agentes de escisión modificados por ingeniería genética.

Adicionalmente, puede utilizarse una casete de expresión de la invención para expresar un polipéptido en tándem que tenga un aminoácido preseleccionado insertado en cualquier posición a lo largo de la cadena del polipéptido que corresponde a un codón de parada suprimible. Resumidamente, puede introducirse una aminoacil-tRNA-sintetasa en una célula que acila específicamente un tRNA supresor con un aminoácido predeterminado. Una casete de expresión que contenga un codón de parada suprimible que puede ser suprimido por el tRNA acilado puede expresarse en la célula. Esto hará que se produzca un polipéptido en tándem que tiene el aminoácido predeterminado insertado en el polipéptido en tándem en una posición correspondiente al codón de parada suprimible. Un sistema de este tipo permite el diseño y la producción de un polipéptido en tándem que tiene uno o más sitios de reconocimiento de agentes de escisión. Esto permite a su vez la producción de polipéptidos en tándem que pueden ser escindidos por proteasas específicas de tejidos. Métodos para facilitar la inserción de un aminoácido específico en la cadena polipeptídica se conocen en la técnica y han sido publicados. Kowal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 98:2268 (2001).

Puede utilizarse también una casete de expresión de la invención para producir polipéptidos en tándem que tienen un análogo de aminoácido insertado en cualquier posición de aminoácido. Resumidamente, un tRNA que es capaz de suprimir un codón de parada suprimible se aminoacila con un análogo de aminoácido deseado in vitro de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. El tRNA supresor aminoacilado puede importarse luego en una célula que contenga una casete de expresión de la invención. El tRNA importado facilita entonces la incorporación del análogo de aminoácido en una posición del polipéptido en tándem expresado por la casete de expresión en una posición correspondiente a la del codón de parada suprimible. Tales métodos pueden utilizarse con células de mamífero, tales como células COS1. (Kohrer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 98:14310 (2001).

Marcador de Fusión

Una casete de expresión de la invención puede expresar opcionalmente un polipéptido en tándem que contiene un marcador de fusión. Un marcador de fusión es una secuencia de aminoácidos que confiere una propiedad útil al polipéptido en tándem. En un ejemplo, un marcador de fusión puede ser un dominio de fijación de ligando que puede utilizarse para purificar el polipéptido en tándem por aplicación de un polipéptido en tándem que contiene el marcador de fusión a medios de separación que contienen el ligando. Una combinación de este tipo se ilustra por aplicación de un polipéptido en tándem que contiene un dominio de glutatión-S-transferasa a una columna cromatográfica que contiene medios de separación enlazados a glutatión. En otro ejemplo, un polipéptido en tándem que contiene un marcador de fusión de polihistidina puede aplicarse a una columna de níquel para purificación del polipéptido en tándem. En otro ejemplo adicional, un marcador de fusión puede ser un ligando. Un polipéptido en tándem de este tipo puede incluir glutatión como un marcador de fusión y aplicarse a una columna cromatográfica que contiene medios de separación enlazados a glutatión-S-transferasa. En otro ejemplo adicional, el marcador de fusión puede ser un epítope de anticuerpo. Una combinación de este tipo se ilustra por un polipéptido en tándem que contiene proteína de fijación de maltosa como marcador de fusión. Un polipéptido en tándem de este tipo puede aplicarse a medios de separación que contienen una proteína anti-fijación de maltosa. Tales sistemas son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. (New England Biolabs, Beverly, MA; Stratagene, La Jolla, CA). Los expertos en la técnica pueden darse cuenta de que se pueden incorporar numerosos marcadores de fusión en la casete de expresión de la
invención.

Secuencias de terminación Secuencias de terminación para uso en bacterias

Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por bacterias son regiones reguladoras localizadas en 3' respecto al codón de parada de la traducción, y por tanto, junto con el promotor, flanquean la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mRNA que puede traducirse en el polipéptido codificado por el DNA. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente secuencias de DNA de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras tallo-bucle que ayudan a la terminación de la transcripción. Ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos.

Secuencias de terminación para uso en células de mamífero

Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción y poliadenilación reconocidas por células de mamífero son regiones reguladoras localizadas en 3' respecto al codón de parada de la traducción y, por tanto, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificante. El término 3' del mRNA maduro se forma por escisión posterior a la transcripción específica del sitio y poliadenilación (Birnstiel et al., Cell, 41:349 (1985); Proudfoot y Whitelaw, "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA", en: Transcription and Splicing (eds. B. D. Hames y D. M. Glover), 1988; Proudfoot, Trends Biochem. Sci., 14:105 (1989)). Estas secuencias dirigen la transcripción de un mRNA que puede traducirse en el polipéptido codificado por el DNA. Ejemplos de señales de terminación de la transcripción/poliadenilación incluyen las derivadas de SV40 (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells", en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).

Secuencias de terminación para uso en células de levadura e insecto

Las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por levadura son regiones reguladoras que están localizadas usualmente en 3' respecto al codón de parada de la traducción. Ejemplos de secuencias terminadoras de la transcripción que pueden utilizarse como secuencias de terminación en sistemas de expresión de levadura e insecto son bien conocidos. López-Ferber et al., Methods Mol. Biol., 39:25 (1995); King y Possee, The baculovirus expression system. A laboratory guide. Chapman y Hall, Londres, Inglaterra (1992); Gregor y Proudfoot, EMBO J., 17:4771 (1998); O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: a laboratory manual. W.H. Freeman & Company, Nueva York, NY (1992); Richardson, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28:1 (1993); Zhao et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63:405 (1999).

\vskip1.000000\baselineskip

II. Constructos y casetes de expresión de ácido nucleico

Constructos y casetes de expresión de ácido nucleico pueden crearse por el uso de métodos recombinantes que son bien conocidos. (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (15 de enero, 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989)). Generalmente, los métodos recombinantes implican preparación de un fragmento de DNA deseado y ligación de dicho fragmento de DNA en una posición preseleccionada en otro vector de DNA, tal como un plásmido.

En un ejemplo típico, un fragmento de DNA deseado se obtiene primeramente por digestión de un DNA que contiene el fragmento de DNA deseado con una o más enzimas de restricción que cortan a ambos lados del fragmento de DNA deseado. Las enzimas de restricción pueden dejar un extremo "romo" o un extremo "cohesivo". Un extremo "romo" significa que el final de un fragmento de DNA no contiene una región de un DNA monocatenario. Un fragmento de DNA que tiene un extremo "cohesivo" significa que el extremo del fragmento de DNA tiene una región de DNA monocatenario. El extremo cohesivo puede tener un saliente 5' o 3'. Numerosas enzimas de restricción están disponibles comercialmente, y las condiciones para su uso son también bien conocidas. (USB, Cleveland, OH; New England Biolabs, Beverly, MA). Los fragmentos de DNA dirigidos pueden extraerse de acuerdo con métodos conocidos, tales como extracción con fenol/cloroformo, para producir fragmentos de DNA exentos de enzimas de restricción. Las enzimas de restricción pueden desactivarse también por calor u otros medios adecuados. Alternativamente, un fragmento de DNA deseado puede separarse por aislamiento de secuencias de ácido nucleico adicionales y enzimas de restricción mediante el uso de electroforesis, por ejemplo electroforesis en gel de agarosa o gel de poliacrilamida. Generalmente, se utiliza electroforesis de gel de agarosa para aislar fragmentos de ácido nucleico grandes, en tanto que se utiliza la electroforesis en gel de acrilamida para aislar fragmentos de ácido nucleico pequeños. Tales métodos se utilizan rutinariamente para aislar fragmentos de DNA. El fragmento de DNA sometido a electroforesis puede extraerse luego del gel a continuación de la electroforesis por el uso de muchos métodos conocidos, tales como electroelución, cromatografía en columna, o fijación a perlas de vidrio. Están disponibles comercialmente muchos kits que contienen materiales y métodos para extracción y aislamiento de fragmentos de DNA. (Qiagen, Venlo, Países Bajos; Qbiogene, Carlsbad, CA).

El segmento de DNA en el que va a ser insertado el fragmento se digiere luego con una o más enzimas de restricción. Preferiblemente, el segmento de DNA se digiere con las mismas enzimas de restricción utilizadas para producir el fragmento de DNA deseado. Esto permitirá la inserción direccional del fragmento de DNA en el segmento de DNA basado en la orientación de los extremos complementarios. Por ejemplo, si se produce un fragmento de DNA que tiene un sitio EcoRI en su extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3', el mismo puede insertarse direccionalmente en un segmento de DNA que ha sido digerido con EcoRI y BamHI basado en la complementariedad de los extremos de los DNAs respectivos. Alternativamente, puede utilizarse clonación de extremos romos si no existen sitios de restricción convenientes que permitan la clonación direccional. Por ejemplo, la enzima de restricción BsaAI escinde extremos de DNA que no tienen un saliente 5' o 3'. La clonación de extremos romos puede utilizarse para insertar un fragmento de DNA en un segmento de DNA que ha sido digerido también con una enzima que produce un extremo romo. Adicionalmente, los fragmentos y segmentos de DNA pueden digerirse con una enzima de restricción que produce un saliente y tratarse luego con una enzima apropiada para producir un extremo romo. Tales enzimas incluyen polimerasas y exonucleasas. Los expertos en la técnica conocen el modo de utilizar dichos métodos aisladamente o en combinación para producir de modo selectivo fragmentos y segmentos de DNA que pueden combinarse selectivamente.

Un fragmento de DNA y un segmento de DNA pueden combinarse por conducción de una reacción de ligación. La ligación enlaza dos piezas de DNA por formación de un enlace fosfodiéster entre las dos piezas de DNA. Generalmente, la ligación de dos o más piezas de DNA ocurre por la acción de la enzima ligasa cuando las piezas de DNA se incuban con ligasa en condiciones apropiadas. La ligasa y los métodos y condiciones para su uso son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.

La reacción de ligación o una porción de la misma se utiliza luego para transformar células a fin de amplificar el DNA recombinante formado, tal como un plásmido que tiene una inserción. Métodos para introducir DNA en células son bien conocidos y se describen en esta memoria.

Los expertos en la técnica reconocen que pueden utilizarse muchas técnicas para producir ácidos nucleicos recombinantes a fin de producir una casete de expresión o constructo de ácido nucleico de la invención. Estas técnicas pueden utilizarse para aislar componentes individuales de una casete de expresión de la invención a partir de constructos de DNA existentes e insertar los componentes en otra pieza de DNA para construir una casete de expresión. Técnicas de este tipo pueden utilizarse también para aislar una casete de expresión de la invención e insertarla en un vector deseado a fin de crear un constructo de ácido nucleico de la invención. Adicionalmente, pueden obtenerse marcos de lectura abiertos a partir de genes que están disponibles o se obtienen de la naturaleza. Se conocen métodos para aislar y clonar genes de la naturaleza. Por ejemplo, puede obtenerse un marco de lectura abierto deseado por creación de una biblioteca de cDNA a partir de células que expresan un polipéptido deseado. El marco de lectura abierto puede insertarse luego en una casete de expresión de la invención para permitir la producción del polipéptido preseleccionado codificado.

Vectores

Vectores que pueden utilizarse incluyen, pero sin carácter limitante, aquéllos que son capaces de replicarse en procariotas y eucariotas. Por ejemplo, pueden utilizarse vectores que se replican en bacterias, levadura, células de insecto, y células de mamífero. Los vectores pueden ilustrarse por plásmidos, fagémidos, bacteriófagos, virus, cósmidos, y factores F. La invención incluye cualquier vector en el cual pueda insertarse la casete de expresión de la invención y replicarse in vitro o in vivo. Vectores específicos pueden utilizarse para tipos de células específicos. Adicionalmente, pueden utilizarse vectores lanzadera para clonación y replicación en más de un tipo de célula. Tales vectores lanzadera se conocen en la técnica. Los constructos de ácido nucleico pueden transportarse extracromosómicamente en el interior de una célula hospedadora o pueden integrarse en un cromosoma de célula hospedadora. Se conocen en la técnica numerosos ejemplos de vectores y están disponibles comercialmente. (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (15 de enero, 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765; New England Biolab, Beverly, MA; Stratagene, La Jolla, CA; Promega, Madision, WI; ATCC, Rockville, MD; CLONTECH, Palo Alto, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Origene, Rockville, MD; Sigma, St. Louis, MO; Pharmacia, Peapack, NJ; USB, Cleveland, OH). Estos vectores proporcionan también muchos promotores y otros elementos reguladores que los expertos en la técnica pueden incluir en los constructos de ácido nucleico de la invención mediante el uso de técnicas recombinantes conocidas.

Vectores para uso en procariotas

Un constructo de ácido nucleico para uso en un hospedador procariota, tal como una bacteria, incluirá preferiblemente un sistema de replicación que permita que el mismo se mantenga en el hospedador para expresión o para clonación y amplificación. Adicionalmente, puede estar presente un constructo de ácido nucleico en la célula en número de copias alto o bajo. Por regla general, aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y usualmente del orden de 10 a aproximadamente 150 copias de un constructo de ácido nucleico de número de copias alto estarán presentes en una célula hospedadora. Un hospedador que contenga un plásmido de número de copias alto contendrá con preferencia al menos aproximadamente 10, y de modo más preferible al menos aproximadamente 20 plásmidos. Por regla general, aproximadamente 1 a 10, y usualmente del orden de 1 a 4 copias de un constructo de ácido nucleico de número de copias bajo estarán presentes en una célula hospedadora. El número de copias de un constructo de ácido nucleico puede controlarse por selección de orígenes de replicación diferentes de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (15 de enero, 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765.

Un constructo de ácido nucleico que contenga una casete de expresión puede integrarse en el genoma de una célula hospedadora bacteriana mediante el uso de un vector de integración. Los vectores de integración contienen usualmente al menos una secuencia que es homóloga al cromosoma bacteriano que permite la integración del vector. Se cree que las integraciones son resultado de recopilaciones entre el DNA homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, vectores de integración construidos con DNA de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (publicación EPO No. 127.328). Los vectores de integración pueden contener también secuencias de bacteriófago o transposones.

Los constructos de ácido nucleico extracromosómicos y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que han sido transformadas. Los marcadores seleccionables pueden expresarse en el hospedador bacteriano y pueden incluir genes que hacen las bacterias resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina), y tetraciclina (Davies, et al., Ann. Rev. Microbiol., 32:469 (1978)). Marcadores seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, tales como los existentes en los caminos de biosíntesis de histidina, triptófano, y leucina.

Numerosos vectores, sean vectores extracromosómicos o integradores, han sido desarrollados para transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores para las bacterias siguientes: B. subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5582 (1982)); Publ. EPO Núms. 036 259 y 063 953; PCT Publ. No. WO 84/04541), E. coli (Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981); Amann et al., Gene, 40:183 (1985); Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113 (1986); Publ. EPO Núms. 036 776, 136 829 y 136 907), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., 54: 655 (1988)); Streptococcus lividans (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., 54:655 (1988)), y Streptomyces lividans (Pat. U.S. No. 4.745.056). Están disponibles también comercialmente numerosos vectores (New England Biolabs, Beverly, MA; Stratagene, La Jolla, CA).

Vectores para uso en levadura

Pueden utilizarse muchos vectores para producir un constructo de ácido nucleico que contiene una casete de expresión de la invención y que proporciona la expresión de un polipéptido en tándem en levadura. Vectores de este tipo incluyen, pero sin carácter limitante, plásmidos y cromosomas artificiales de levadura. Preferiblemente, el vector tiene dos sistemas de replicación, permitiendo así que el mismo se mantenga, por ejemplo, en lavadura para expresión y en un hospedador procariota para clonación y amplificación. Ejemplos de tales vectores lanzadera levadura-bacteria incluyen YEp24 (Botstein, et al., Gene, 8:17 (1979)), pCl/1 (Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:4642 (1984)), y YRp17 (Stinchcomb et al., J. Mol. Biol., 158:157 (1982)). Un vector puede mantenerse en una célula hospedadora en número de copias alto o bajo. Por ejemplo, un plásmido de número de copias alto tendrá generalmente un número de copias comprendido entre aproximadamente 5 aproximadamente 200, y por regla general aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un hospedador que contenga un plásmido de número de copias alto tendrá con preferencia al menos aproximadamente 10, y de modo más preferible al menos aproximadamente 20. Puede seleccionarse un vector de número de copias alto o bajo, dependiendo del efecto del vector y el polipéptido en tándem en el hospedador. (Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:4642 (1984)).

Un constructo de ácido nucleico puede integrarse también en el genoma de levadura con un vector integrador. Los vectores integradores contienen usualmente al menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura que permite que el vector se integre, y contienen preferiblemente dos secuencias homólogas que flanquean una casete de expresión de la invención. Las integraciones parecen ser resultado de recombinaciones entre DNA homólogo en el vector y el cromosoma de levadura. (Orr-Weaver et al., Methods in Enzymol., 101:228 (1983)). Un vector integrador puede estar dirigido a un locus específico en levadura por selección de la secuencia homóloga apropiada para inclusión en el vector. Pueden integrarse uno o más constructos de ácido nucleico, lo cual puede afectar al nivel de proteína recombinante producido. (Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6750 (1983)). Las secuencias cromosómicas incluidas en el vector pueden existir sea como un segmento simple en el vector, lo cual da como resultado la integración del vector entero, o dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean una casete de expresión incluida en el vector, lo cual puede dar como resultado la integración estable de la casete de expresión únicamente.

Los constructos extracromosómicos e integradores de ácido nucleico pueden contener marcadores seleccionables que permiten la selección de cepas de levadura que han sido transformadas. Marcadores seleccionables pueden incluir, pero sin carácter limitante, genes biosintéticos que pueden expresarse en el hospedador de levadura, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, y ALG7, así como el gen de resistencia a G418, que confieren resistencia en células de levadura a tunicamicina y G418, respectivamente. Adicionalmente, un marcador seleccionable puede proporcionar también levadura con la capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos, tales como metales. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite que la levadura crezca en presencia de iones cobre. (Butt et al., Microbiol. Rev., 51:351 (1987)).

Se han desarrollado muchos vectores para transformación en muchas levaduras. Por ejemplo, se han desarrollado vectores para las levaduras siguientes: Candida albicans (Kurtz et al., Mol. Cell. Biol., 6:142 (1986)), Candida maltose (Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25:141 (1985)), Hansenula polymorpha (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132:3459 (1986); Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., 202:302 (1986), Kluyveromyces fragilis (Das et al., J. Bacteriol., 158: 1165 (1984)), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154:737 (1983); van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), Pichia guillerimondii (Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25:141 (1985)), Pichia pastoris (Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3376, 1985; Pat. U.S. Núms. 4.837.148 y 4.929.555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929 (1978); Ito et al., J. Bacteriol., 153:163 (1983)), Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 300:706 (1981)), y Yarrowia lipolytica (Davidow et al., Curr. Genet., 10:39 (1985); Gaillardin et al., Curr. Genet., 10:49 (1985)).

Vectores para uso en células de insecto

Se han desarrollado vectores de baculovirus para infección en varias células de insecto y pueden utilizarse para producir constructos de ácido nucleico que contienen una casete de expresión de la invención. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (Pub. PCT No. WO 89/046699; Carbonell et al., J. Virol., 56:153 (1985); Wright, Nature, 321: 718 (1986); Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3: 2156 (1983); y véase en general, Fraser et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 25:225 (1989)). Un vector de baculovirus de este tipo puede utilizarse para introducir una casete de expresión en un insecto y facilitar la expresión de un polipéptido en tándem en el interior de la célula de insecto.

Métodos para producir un constructo de ácido nucleico que tiene una casete de expresión de la invención insertada en un vector de baculovirus son bien conocidos en la técnica. Resumidamente, se inserta una casete de expresión de la invención en un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano que contiene un fragmento del genoma del baculovirus, por el uso de métodos recombinantes comunes. El plásmido puede contener también una señal de poliadenilación de polihedrina (Miller et al., Ann. Rev. Microbiol., 42:177 (1988)) y un marcador de inserción procariota, tal como resistencia a ampicilina, y un origen de replicación para selección y propagación en Escherichia coli. Un vector de transferencia conveniente para la introducción de genes extraños en AcNPV es pAc373. Han sido diseñados muchos otros vectores, conocidos por los expertos en la técnica. Un vector de este tipo es pVL985 (Luckow y Summers, Virology, 17:31 (1989).

Un genoma de baculovirus de tipo salvaje y el vector de transferencia que tiene una inserción de casete de expresión se transfecta en una célula hospedadora de insecto en la cual el vector y el genoma viral de tipo salvaje se recombinan. Métodos para introducción de una casete de expresión en un sitio deseado en un virus de tipo baculovirus se conocen en la técnica. (Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, 1987. Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3:2156 (1983); y Luckow y Summers, Virology, 17:31 (1989)). Por ejemplo, la inserción puede tener lugar en un gen tal como el gen de polihedrina, por recombinación homóloga con entrecruzamiento doble; la inserción puede tener lugar también en un sitio de enzima de restricción modificado por ingeniería genética en el gen de baculovirus deseado (Miller et al., Bioessays, 4:91 (1989)). La casete de expresión, una vez clonada en lugar del gen de polihedrina en el constructo de ácido nucleico, estará flanqueada en ambos extremos 5' y 3' por secuencias específicas de polihedrina. Una ventaja de la inserción de una casete de expresión en el gen de polihedrina es que pueden eliminarse los cuerpos de oclusión resultantes de la expresión del gen de polihedrina de tipo salvaje. Esto puede reducir la contaminación de los polipéptidos en tándem producidos por expresión y formación de cuerpos de oclusión en células de insecto por proteínas de tipo salvaje que en caso contrario formarían cuerpos de oclusión en una célula de insecto que tenga una copia funcional del gen de polihedrina.

El virus recombinante empaquetado se expresa y las calvas recombinantes se identifican y purifican. Materiales y métodos para sistemas de expresión en baculovirus y células de insecto están disponibles comercialmente en forma de kit. (Invitrogen, San Diego, Calif., EE.UU. (kit "MaxBac")). Estos métodos son conocidos generalmente por los expertos en la técnica y se describen detalladamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, 1957.

Se han desarrollado también sistemas de expresión basados en plásmidos que pueden utilizarse para introducir una casete de expresión de la invención en una célula de insecto y producir un polipéptido en tándem. (McCarroll y King, Curr. Opin. Biotechnol., 8:590 (1997)). Estos plásmidos ofrecen una alternativa a la producción de un virus recombinante para la producción de polipéptidos en tándem.

Vectores para uso en células de mamífero

Una casete de expresión de la invención pude insertarse en muchos vectores de mamífero que son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. (CLONTECH, Palo Alto, CA; Promega, Madison, WI; Invitrogen, Carlsbad, CA). Tales vectores pueden contener elementos adicionales tales como intensificadores e intrones que tienen sitios funcionales de corte y empalme donantes y aceptores. Los constructos de ácido nucleico pueden mantenerse extracromosómicamente o pueden integrarse en el DNA cromosómico de una célula hospedadora. Vectores de mamífero incluyen los derivados de virus animales, que requieren factores con acción trans para replicarse. Por ejemplo, vectores que contienen los sistemas de replicación de papovavirus, tales como SV40 (Gluzman, Cell, 23:175 (1981) o poliomavirus, se replican con un número de copias extremadamente alto en presencia del antígeno T viral apropiado. Ejemplos adicionales de vectores de mamífero incluyen los derivados del papilomavirus bovino y el virus Epstein-Barr. Adicionalmente, el vector puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo así que el mismo se mantenga, por ejemplo, en células de mamífero para expresión y en un hospedador procariota par clonación y amplificación. Ejemplos de tales vectores lanzadera mamífero-bacteria incluyen pMT2 (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 9:946 (1989)) y pHEBO (Shimizu et al., Mol. Cell. Biol., 6:1074 (1986)).

\vskip1.000000\baselineskip

III. Células que contienen una casete de expresión o un constructo de ácido nucleico

La invención proporciona células que contienen una casete de expresión de la invención o un constructo de ácido nucleico de la invención. Dichas células pueden utilizarse para expresión de un polipéptido preseleccionado. Tales células pueden utilizarse también para la amplificación de constructos de ácido nucleico. Muchas células son adecuadas para amplificación de constructos de ácido nucleico y para expresión de polipéptidos preseleccionados. Estas células pueden ser células procariotas o eucariotas.

En una realización preferida, se utilizan bacterias como células hospedadoras. Ejemplos de bacterias incluyen, pero sin carácter limitante, organismos Gram-negativos y Gram-positivos. Escherichia coli es un organismo preferido para expresión de polipéptidos preseleccionados y amplificación de constructos de ácido nucleico. Muchas cepas de E coli disponibles al público incluyen cepas K tales como MM294 (ATCC 31, 466); X1776 (ATCC 31, 537); KS 772 (ATCC 53, 635); JM109; MC1061; HMS 174; y la cepa-B BL21. Puede utilizarse recombinación de cepas "minus" para amplificación de constructos de ácido nucleico a fin de evitar sucesos de recombinación. Tales sucesos de recombinación pueden eliminar concatémeros de marcos de lectura abiertos así como causar la desactivación de una casete de expresión. Adicionalmente, cepas bacterianas que no expresan una proteasa seleccionada pueden ser útiles también para expresión de polipéptidos preseleccionados a fin de reducir el procesamiento proteolítico de los polipéptidos expresados. Una cepa de este tipo se ilustra por Y1090hsdR que es deficiente en la proteasa
lon.

Pueden utilizarse también células eucariotas para producir un polipéptido preseleccionado y para amplificar un constructo de ácido nucleico. Las células eucariotas son útiles para producir un polipéptido preseleccionado cuando se desea procesamiento celular adicional. Por ejemplo, un polipéptido preseleccionado puede expresarse en una célula eucariota cuando se desea glicosilación del polipéptido. Ejemplos de líneas de células eucariotas que pueden utilizarse incluyen, pero sin carácter limitante: AS52, H187, células L de ratón, NIH-3T3, HeLa, Jurkat, CHO-K1, COS-7, BHK-21, A-431, HEK293, L6, CV-1, HepG2, HC11, MDCK, células de gusano de seda, células de mosquito, y
levadura.

Métodos para introducción de DNA exógeno en bacterias son bien conocidos en la técnica, e incluyen usualmente la transformación de bacterias tratadas con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El DNA puede introducirse también en células bacterianas por electroporación, uso de un bacteriófago, o transformación balística. Los procedimientos de transformación varían usualmente con la especie bacteriana a transformar (Masson et al., FEMS Microbiol. Lett., 60:273 (1989); Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5582 (1982); Publ. EPO Núms. 036 259 y 063 953; PCT Publ. No. WO 84/04541 [Bacillus], Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:856 (1988); Wang et al., J. Bacteriol., 172:949 (1990) [Campylobacter], Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1973); Dower et al., Nuc. Acids Res., 16:6127 (1988); Kushner, "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids", en: Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H. W. Boyer y S. Nicosia), 1978; Mandel et al., J. Mol. Biol., 53:159 (1970); Taketo, Biochim. Biophys. Acta, 949:318 (1988) [Escherichia], Chassy et al., FEMS Microbiol. Lett., 44:173 (1987) [Lactobacillus], Fiedler et al., Anal. Biochem, 170:38 (1988) [Pseudomonas], Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett., 66:203 (1990) [Staphylococcus], Barany et al., J. Bacteriol., 144:698 (1980); Harlander, "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", en: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III), 1987; Perry et al., Infec. Immun., 32:1295 (1981); Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., 54:655 (1988); Somkuti et al., Proc. 4th Eur. Cong. Biotechnology, 1:412 (1987) [Streptococcus]).

Métodos para introducción de DNA exógeno en hospedadores de levadura son bien conocidos en la técnica, e incluyen usualmente la transformación de esferoplastos o de células de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación varían usualmente con la especie de levadura a transformar (véase, v.g. Kurtz et al., Mol. Cell. Biol., 6:142 (1986); Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25:141 (1985) [Candida], Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132:3459 (1986); Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., 202:302 (1986) [Hansenula], Das et al., J. Bacteriol., 158:1165 (1984); De Louvencourt et al., J. Bacteriol., 754:737 (1983); Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990) [Kluyveromyces], Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5:3376 (1985); Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25:141 (1985); Pat. U.S. Núms. 4.837.148 y 4.929.555 [Piclzia], Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929 (1978); Ito et al., J. Bacteriol., 153:163 (1983) [Saccharomyces], Beach y Nurse, Nature, 300:706 (1981) [Schizosaccharomyces], y Davidow et al., Curr. Genet., 10:39 (1985); Gaillardin et al., Curr. Genet., 10:49 (1985)
[Yanrowia]).

El DNA exógeno se introduce convenientemente en células de insecto mediante el uso de virus recombinantes, tales como los baculovirus descritos en esta memoria.

Se conocen en la técnica métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero, e incluyen transfección mediada por lípidos, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del o de los polinucleótidos en liposomas, biolística, y microinyección directa del DNA en núcleos. La elección del método depende de la célula a transformar, dado que ciertos métodos de transformación son más eficientes con un tipo de célula que con otro. (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413 (1987); Felgner et al., J. Biol. Chem., 269:2550 (1994); Grahamy van der Eb, Virology, 52:456 (1973); Vaheri y Pagano, Virology, 27:434 (1965); Neuman et al., EMBO J., 1:841 (1982); Zimmerman, Biochem. Biophys. Acta., 694:227 (1982); Sanford et al., Methods Enzymol., 217:483 (1993); Kawai y Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4:1172 (1984); Chaney et al., Somat. Cell Mol. Genet., 12:237 (1986); Aubin et al., Methods Mol. Biol., 62:319 (1997)). Adicionalmente, están disponibles muchos kits y reactivos comerciales para transfección de eucariotas.

Después de la transformación o transfección de un ácido nucleico en una célula, la célula puede seleccionarse para uso directo de un marcador seleccionable. Un marcador seleccionable está codificado generalmente en el ácido nucleico que se introduce en la célula receptora. Sin embargo, la co-transfección de un marcador seleccionable puede utilizarse también durante la introducción de ácido nucleico en una célula hospedadora. Marcadores seleccionables que pueden expresarse en la célula hospedadora receptora pueden incluir, pero sin carácter limitante, genes que hacen la célula hospedadora receptora resistente a fármacos tales como actinomicina C_{1}, actinomicina D, anfotericina, ampicilina, bleomicina, carbenicilina, cloranfenicol, geneticina, gentamicina, higromicina B, kanamicina monosulfato, metotrexato, mitomicina C, neomicina B sulfato, sal de sodio de novobiocina, sal de sodio de penicilina G, puromicina dihidrocloruro, rifampicina, estreptomicina sulfato, tetraciclina hidrocloruro, y eritromicina. (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol., 32:469, 1978). Marcadores seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, tales como los caminos de biosíntesis de histidina, triptófano, y leucina. Después de transfección o transformación de una célula hospedadora, la célula se pone en contacto con un marcador de selección apropiado.

Por ejemplo, si se transforma una bacteria con un constructo de ácido nucleico que codifica resistencia a ampicilina, la bacteria transformada puede localizarse en una placa de agar que contenga ampicilina. Después de ello, las células en las cuales no se introdujo el constructo de ácido nucleico se verán imposibilitadas de crecer para producir una colonia, mientras que se formarían colonias por aquellas bacterias que se transformaran con éxito. Un sistema análogo puede utilizarse para seleccionar otros tipos de células, que incluyen células tanto procariotas como eucariotas.

\vskip1.000000\baselineskip

IV. Polipéptidos en tándem

La invención proporciona numerosos polipéptidos en tándem que incluyen un polipéptido preseleccionado enlazado operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que hace que el polipéptido en tándem forme cuerpos de inclusión que tienen características de mejora de aislamiento útiles. En una realización, los polipéptidos en tándem pueden incluir una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que está enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado. La pareja de fusión de cuerpos de inclusión puede estar enlazada al término amino o al término carboxilo del polipéptido preseleccionado. En otra realización, un polipéptido en tándem puede tener una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a ambos términos amino y carboxilo de un polipéptido preseleccionado. Un polipéptido en tándem puede incluir también copias múltiples de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión. En otras realizaciones, un polipéptido en tándem puede tener secuencias de aminoácidos adicionales además de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un polipéptido preseleccionado. Por ejemplo, un polipéptido en tándem puede contener uno o más enlazadores peptídicos escindibles, marcadores de fusión, y polipéptidos preseleccionados. Los enlazadores peptídicos escindibles pueden estar enlazados operativamente entre una pareja de fusión de cuerpos de inclusión y un polipéptido preseleccionado, entre un polipéptido preseleccionado y un marcador de fusión, entre copias múltiples de un polipéptido preseleccionado, o cualquier combinación de los mismos. Asimismo, enlazadores peptídicos escindibles que son escindidos por diferentes agentes de escisión pueden estar enlazados operativamente dentro de un solo polipéptido en tándem. En realizaciones adicionales, un polipéptido en tándem puede incluir uno o más marcadores de fusión.

El polipéptido en tándem puede tener numerosos polipéptidos preseleccionados enlazados operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión. Preferiblemente, el polipéptido preseleccionado es un polipéptido bioactivo. Ejemplos de tales polipéptidos son GLP-1, GLP-2, PTH, GRF, y formas activas de los mismos.

\vskip1.000000\baselineskip

V. Métodos para producir un polipéptido en tándem

La invención proporciona métodos para producir un polipéptido en tándem. Los métodos implican la utilización de una casete de expresión de la invención para producir un polipéptido en tándem. Un polipéptido en tándem puede producirse in vitro mediante el uso de un sistema de transcripción y traducción in vitro, tal como un sistema de lisado de reticulocitos de conejo. Preferiblemente, un polipéptido en tándem se expresa en el interior de una célula en la cual se ha introducido una casete de expresión que codifica el polipéptido en tándem.

Generalmente, las células que tienen una casete de expresión integrada en su genoma o que llevan una casete de expresión extracromosómicamente se dejan crecer hasta densidad alta y se inducen a continuación. Después de la inducción, se cosechan las células y se aísla el polipéptido en tándem. Un sistema de este tipo se prefiere cuando una casete de expresión incluye un promotor reprimido. Este tipo de sistema es útil cuando un polipéptido en tándem contiene un polipéptido preseleccionado que es tóxico para la célula. Ejemplos de tales polipéptidos preseleccionados incluyen proteasas y otros polipéptidos que interfieren con el crecimiento celular. Las células pueden ser inducidas por muchos métodos reconocidos en la técnica que incluyen, pero sin carácter limitante, inversión térmica, adición de un inductor tal como IPTG, o infección por un virus o bacteriófago que causa expresión de la casete de expresión.

Alternativamente, las células pueden llevar una casete de expresión que tenga un promotor constitutivo que no necesite ser inducido, dado que el promotor está siempre activo. En tales sistemas, las células pueden crecer hasta que se produce una cantidad deseada de polipéptido en tándem, después de lo cual se cosechan las células.

Métodos y materiales para el crecimiento y mantenimiento de muchos tipos de células son bien conocidos y están disponibles comercialmente. Ejemplos de medios que pueden utilizarse incluyen, pero sin carácter limitante: YEPD, LB, TB, 2xYT, GYT, M9, NZCYM, NZYM, NZN, SOB, SOC, solución de Alsever, medio CHO, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco, y HBSS. (Sigma, St. Louis, MO; Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (15 de enero, 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765; Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, (1987)).

Tablas TABLA I

1

TABLA II

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA III

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA IV

7

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA V

11

TABLA VI

12

TABLA VII

13

Ejemplos

Se encargaron iniciadores de compañías especializadas en síntesis de oligonucleótidos de DNA (v.g., Operon Technologies, Alamedo, CA). Se siguieron procedimientos generales de clonación como se describen en Molecular Cloning (Sambrook et al, 2ª edición). Las enzimas de restricción eran de New England Biolabs (Beverly, MA).

Ejemplo 1

Construcción de un vector pBN95(Tac)

pBN95(Tac) es un vector de expresión optimizado que contiene la cadena principal, el origen de replicación, y el gen de resistencia a la tetraciclina del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA); el gen lacI (que codifica una proteína represora) de pET16b (Novagen, Madison, WI); el promotor tac de pGEX2T (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); y la secuencia de terminación rrnB de pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech). El plásmido se construyó como se describe a continuación.

La cadena principal del vector pBR322 se preparó por escisión del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) con PstI-SspI y aislamiento del fragmento grande de la cadena principal (aproximadamente 3,5 kb) a partir de un gel de agarosa. El gen lacI se escindió del vector pET16b (Novagen) por escisión con PstI, SapI y PshAI. El mayor de los tres fragmentos liberados (2,8 kb, comparado con 1,2 kb y 1,7 kb) se aisló a partir de un gel de agarosa. El fragmento que contenía lacI se mezcló con el fragmento de la cadena principal de 3,5 kb de pBR322 y se ligó utilizando DNA-ligasa T4 (Life Technologies, Division of Invitrogen, Carlsbad, CA). La mezcla de ligación se transformó en células competentes de E. coli de alta eficiencia por choque térmico a 42ºC durante 45 segundos. Las células transformadas se seleccionaron en LB + 15 \mul/ml de tetraciclina (LBT) + placas de agar. Se iniciaron cultivos de sacudidas en 5 ml de LBT a partir de colonias simples, y se prepararon plásmidos a partir de estos cultivos. Se identificó un constructo plasmídico correcto por mapeado con enzimas de restricción. El plásmido resultante se designó pBN93.

Se construyó luego el plásmido pBN95 por digestión del plásmido pBN93 con XhoI y DraI, y ligación del fragmento purificado mayor a un fragmento EcoRV-XhoI de un plásmido pCRScript-rmB, que contenía la secuencia de terminación rrnB como en pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech). Este terminador proporciona una señal de terminación altamente efectiva que se utilizó para reemplazar el terminador T7 en el plásmido pBN93. Un mapa que muestra de qué modo se ligaron los tres fragmentos de pET16b, pBR322 y rrnB para formar el plásmido pBN95 (T7) se proporciona en la Figura 1.

El promotor T7 se reemplazó subsiguientemente con un promotor tac modificado. Un promotor tac rediseñado se amplificó por PCR utilizando el plásmido pGEX2T (Amersham Pharmacia Biotech) que contenía la secuencia del promotor tac. Se utilizaron los iniciadores siguientes:

Primer 1: {}\hskip0.5cm 5' TGC ATT TCT AGA ATT GTG AAT TGT TAT CCG CTC A 3'

(SEQ ID NO: 85)

Primer 2: {}\hskip0.5cm 5' TCA AAG ATC TTA TCG ACT GCA CGG 3'

(SEQ ID NO: 86)

La amplificación por PCR dio lugar al producto siguiente:

TCAAAGATCTTATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCG {}\hskip0.4cm TCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATC {}\hskip0.4cm ACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGT {}\hskip0.4cm TTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGC {}\hskip0.4cm TG TTGACA ATTAATCATCGGCTCG TATAAT GTGT[GGAATTGTGAGC {}\hskip0.4cm GGATAACAATTC]ACAATTCTAGAAATGCA (SEQ ID NO: 87)

La secuencia de reconocimiento por la endonucleasa de restricción BglII de aguas arriba (A/GATCT) y la secuencia de reconocimiento XbaI (T/CTAGA) de aguas abajo están subrayadas con una sola línea. Las secuencias de consenso de los promotores -35 y -10 están representadas en negrilla y subrayadas con puntos. El residuo A de inicio de la transcripción aguas abajo (dentro de la secuencia del gen operador lac) está representado en negrilla y subrayado con una línea continua. La secuencia del operador/ac está encerrada entre corchetes. El fragmento BglII-XbaI del producto anterior se insertó en el plásmido pBN95 (T7) en reemplazamiento del promotor T7. El mapa de restricción y los componentes de un plásmido pBN95(Tac) que contiene la casete de expresión T7tagVg-enlazador-GRF(1-44)A se muestran en la Figura 2.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Construcción del plásmido pET23a, T7tagVg-GRF(1-44)A, el plásmido pBN95(Tac-T7tagVgCH-GRF(1-44)A, y el plásmido pBN95-T7tagVgCH-GRF-(1-44)A

La producción de polipéptidos por diferentes cepas de E coli (v.g. cepa K o cepa B) se desarrolló mediante el uso de vectores de expresión que contenían promotores diferentes (v.g., tac o T7) y selecciones de antibióticos diferentes (v.g., tetraciclina o ampicilina). El vector de expresión pET23a (Novagen) tiene el promotor T7 y el gen de resistencia a ampicilina. El vector de expresión pBN95(Tac) tiene el promotor tac y el gen de resistencia a tetraciclina. Se construyeron vectores de expresión que contenían las secuencias de genes para lo siguiente: (a) 12 aminoácidos del marcador T7 (MASMTGGQQMGR) (SEQ ID NO: 83); (b) 29 aminoácidos del péptido vestigial (Vg) (GSGQGQAQYLAASLVVFTNYSGDTASQVD) (SEQ ID NO: 2) (Williams et al., Genes & Development, 5:2481, 1991); (c) un enlazador de aminoácidos (VNGPRAMVDDDDKCH) (SEQ ID NO: 146); y (d) el péptido diana de GRF(1-44)A. La secuencia de una casete de expresión para T7tagVgCH-GRF(1-44)A se muestra en la Figura 3.

(1) Construcción del plásmido pET23a-T7tag-GRF(1-44)A

Se construyó el plásmido pET23a-T7tag-GRF(1-44)A por digestión del plásmido pET23a (Novagen) con EcoRI-HincII e inserción del enlazador y la secuencia del gen GRF(1-44)A como un fragmento de gen escindido EcoRI-EcoRV. La secuencia del gen se construyó por clonación de oligonucleótidos sintéticos solapantes reasociados por metodología estándar. El plásmido pET23a (Novagen) se digirió con EcoRI-HincII, y se escindió y purificó una banda de 3,7 kb del gel de agarosa. La secuencia del gen EcoRI-EcoRV GRF(1-44)A se resolvió en un gel PAGE al 7,5%, y se purificó el fragmento que contenía GRF. Los dos fragmentos se mezclaron y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó a células competentes de E coli de alta eficiencia por choque térmico a 42ºC durante 45 segundos. Las células transformadas se seleccionaron en LB + 50 \mug/ml de ampicilina (LBA) + placas de agar. Se prepararon plásmidos a partir de los transformantes simples. Un constructo recombinante que contenía el plásmido correcto pET23a-T7tag-GRF(1-44)A se identificó y se confirmó por mapeado con enzimas de restricción. Este constructo contiene la secuencia enlazadora, a partir de la cual se libera GRF con digestión con enteroquinasa. La secuencia de este constructo se muestra en la Figura 4.

(2) Construcción del fragmento de 29 aminoácidos del gen vestigial (Vg)

Dos iniciadores, que podrían reasociarse uno a otro, se diseñaron como iniciadores PCR para facilitar la síntesis del fragmento de 29 aminoácidos del gen vestigial (Vg).

200

Los oligo-iniciadores son auto-reasociables, por lo que no se requirió molde adicional alguno. Los sitios BamHI-HpaI en SH17V y SH18V, respectivamente, están subrayados. El producto de la reacción PCR se purificó y se clonó en el vector pCRBlunt (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) utilizando el Kit de Clonación PCR Zero Blunt de Invitrogen para producir el plásmido pCRBlunt-Vg. El fragmento Vg en pCRBlunt-Vg se digirió con BamHI-HpaI y se purificó en un gel de poliacrilamida al 7,5%. El fragmento se eluyó y se ligó con un plásmido pET23a-T7tag-GRF(1-44)A digerido con BamHI-HpaI (véase la Figura 4 para los sitios). Se aisló un clon recombinante pET23a-T7TagVg-GRF(1-44)A y se demostró por mapeado de restricción y secuenciación que contenía el constructo plasmídico correcto (Figura 5). La inserción contenía una sola sustitución de base como se indica en el iniciador 17.

(3) Construcción del plásmido pET23a-T7tagVgCH-GRF(1-44)A

El fragmento del gen CH-GRF(1-44)A se amplificó por PCR utilizando el plásmido pET23a-T7tagVg-GRF(1-44)A como molde y los dos iniciadores siguientes:

201

El sitio XhoI en el iniciador SH23CH está subrayado y se encuentra inmediatamente después del codón de parada (negrilla). El sitio SalI en el iniciador SH24 está subrayado. El iniciador SH-24 contenía también una secuencia codificante de Cys-His para proporcionar un sitio escindible por paladio (Pd) (negrilla). El producto resultante se digirió con SalI-XhoI y se ligó al plásmido pET23a-T7tagVg-GRF(1-44)A digerido con SalI-XhoI. Se identificó un constructo recombinante que contenía el plásmido correcto pET23a-T7tagVgCH-GRF(1-44)A (véase la Figura 3 para la secuencia de la casete de expresión).

(4) Construcción del plásmido pBN95(Tac)-T7tagVgCH-GRF(1-44)A

La casete de expresión del plásmido pET23A-T7tagVgCH-GRF(1-44)A se escindió con XbaI-XhoI y se aisló como un fragmento de 0,4 kb. El fragmento se ligó en el sitio XbaI-XhoI del plásmido pBN95(Tac). Se aisló un constructo recombinante, designado pBN95(Tac)-T7tagVgCH-GRF(1-44)A y se confirmó que contenía la inserción correcta (véase la Figura 3 para la secuencia de la casete de expresión).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Expresión de polipéptidos que contienen GRF(1-44)A en cultivo de sacudidas de E coli

Para expresar polipéptidos, la célula hospedadora fue E coli BL21 cuando se utilizó el promotor tac, en tanto que la célula hospedadora fue BL21 (DE3) cuando se utilizó el promotor T7 (ambas células proceden de Novagen, Madison, WI). Los plásmidos del pET23a-T7tag-GRF(1-44)A, pET23a-T7tagVg-GRF(1-44)A, pET23a-T7tagVgCH-GRF(1-44)A y pBN95(Tac)-T7tagVgCH-GRF(1-44)A se transformaron en células competentes tratadas con CaCl_{2} por choque térmico a 42ºC durante 45 segundos. Las células transformadas se seleccionaron en placas LB + 50 \mug/ml ampicilina (LBA) + agar para los constructos pET23A, o en placas LB + 15 \mug/ml tetraciclina (medio LBT) + agar para los constructos de pBN95(Tac). Los cultivos en matraces de sacudidas de 5 ml de medio LBA o LBT se iniciaron a partir de colonias simples de las células transformadas. Cultivos de células en fase logarítmica final o nocturnos se preservaron en glicerol al 10-15% a -80ºC o temperatura inferior (stocks de glicerol). Cultivos en matraces de sacudidas de 5 ml a 500 ml de medios LBA o LBT (inoculados con 100 \mul a 10 ml de cultivo nocturno) se dejaron crecer a 37ºC/220 rpm hasta una A_{600} de 0,5-1,0, y se indujo la expresión de polipéptido por adición de IPTG (concentración final 1 mM). Los cultivos se indujeron durante periodos de tiempo comprendidos entre 3 horas y una noche. Se tomaron muestras de las células pre- y post-inducidas. Las células se redujeron a un sedimento y se lisaron luego en tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 3) por sonicación. La muestra se centrifugó para separar las proteínas insolubles y solubles. El sobrenadante (proteína soluble) se mezcló en relación 1:1 con 2x de tampón de muestra SDS-PAGE. Los sedimentos se resuspendieron directamente en una muestra de 1x SDS-PAGE. Estas muestras se resolvieron en SDS-PAGE (Biorad o Novex) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se tiñeron con Azul Brillante Coomassie.

No se observó expresión alguna del constructo pET23a-T7tag-GRF(1-44)A/BL21(DE3). Se observó un alto nivel de expresión del péptido precursor insoluble del peso molecular predicho (11 Kdalton) con el plásmido pET23a-T7tagVg-GRF(1-44)A en BL21(DE3). Los resultados demostraron que la secuencia Vg promovía alto nivel de expresión de cuerpos de inclusión polipeptídicos. En cambio, el constructo sin la secuencia Vg no exhibía expresión detectable alguna de polipéptido.

Ambos constructos pET23a-T7tagVgCH-GRF(1-44)A/BL21(DE3) y pBN95(Tac)-T7tagVgCH-GRF(1-44)A/
BL21 producían niveles altos de polipéptido que tenía el tamaño predicho. Esto demostró que podrían alcanzarse expresiones de alto nivel de polipéptidos que contengan Vg utilizando el promotor tac o el promotor T7. La expresión de ambos constructos pET23a-T7tagVg-GRF(1-44)A y pET23a-T7tagVgCH-GRF(1-44)A demostró ulteriormente que la alteración de la región enlazadora no afectaba a la capacidad de la secuencia Vg para promover alto nivel de expresión de cuerpos de inclusión polipeptídicos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Optimización de codones de Vg en E coli

Los codones genéticos utilizados por Drosophila melanogaster para su gen Vg no están optimizados para E coli. Por ejemplo, codones tales como GGA que codifica glicina, CTA que codifica leucina, y TTG que codifica leucina son rara vez utilizados por E coli. Estos codones se cambiaron a GGT para el residuo 17, CTA a CTG para el residuo 22 y TTG a CTG para el residuo 26 (subrayados en la Figura 6) por PCR utilizando los iniciadores siguientes:

202

El producto PCR resultante se digirió con BamHI-XhoI y se clonó en el plásmido pET23a (Novagen, Madison, WI) en el sitio BamHI-XhoI para producir el plásmido pET23a-T7tagVg(opt)CH-GRF(1-44)A. El fragmento XbaI-XhoI de pET23a-T7tagVg(opt)CH-GRF(1-44)A se clonó en el vector pBN95(Tac) en el sitio XbaI-XhoI para producir el plásmido pBN95(Tac)-T7tagVg(opt)-CH-GRF(1-44)A. Este plásmido se transformó en células BL21 de E coli. Las células transformadas se seleccionaron en medio LBT y se identificó y confirmó un constructo correcto por mapeado con enzimas de restricción y secuenciación del DNA. La expresión de polipéptido de este constructo en un cultivo en matraz de sacudidas se evaluó como se describe en el Ejemplo 3. Se observó un alto nivel de expresión de cuerpos de inclusión del polipéptido T7tagVgCH-GRF(1-44)A por análisis SDS-PAGE.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Producción de polipéptidos por fermentación de E coli

La fermentación de un E coli BL21 que contenía el plásmido pBN95(Tac)-T7tagVg(opt)-CHGRF(1-44)A se evaluó por fermentación en escala de 5 l o mayor. Se utilizó un stock de glicerol de 100 \mul del bacterial que contenía el plásmido para inocular 100 ml de medio LBT en un matraz de sacudidas. El cultivo de sacudidas se dejó crecer en un aparato de sacudidas rotativo a 37ºC hasta que la A_{540} alcanzó 1,5 \pm 0,5. El contenido del cultivo en el matraz de sacudidas se utilizó luego para inocular un tanque de fermentación de 5 l que contenía un medio mínimo definido (v.g., medio M9, Molecular Cloning, 2ª edición, Sambrook et al.). Como fuente de carbono se utilizó glucosa y se mantuvo por debajo de 4%. Se utilizaron aproximadamente 15 \mug/ml de tetraciclina en la fermentación. El oxígeno disuelto se controló a 40% por agitación en cascada y aireación con oxígeno adicional. Se alimentó una solución de hidróxido de amonio para mantener el pH a aproximadamente 6,9 y para servir como fuente de nitrógeno adicional. Las células se indujeron con una concentración final de IPTG 0,1-1 mM después que la A_{540} alcanzó 50-75 durante 4-10 horas. Una vez completada la inducción, se enfriaron las células y se cosecharon por centrifugación. Los sedimentos de células se guardaron a una temperatura inferior a -20ºC hasta su utilización, o se lisaron inmediatamente. Las células, después de descongelación en caso de haber sido congeladas, se resuspendieron en Tris 50 mM, EDTA 2,5 mM, pH 7,5, y se lisaron por sonicación u homogeneización. El lisado se centrifugó para reducir a un sedimento los cuerpos de inclusión del polipéptido expresado. Los sedimentos de polipéptido se disolvieron en urea 8 M o ácido fórmico al 95% para análisis o tratamiento ulterior. Se obtuvieron más de 5 g del polipéptido deseado a partir de 1 l de caldo de fermentación.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Modificación del núcleo hidrófobo de Vg

Una secuencia hidrófoba de núcleo (LAASLVVF) (SEQ ID NO: 92) se identificó por representación gráfica de hidrofobicidad (v.g., Kyte & Doolitte, Hopp & Woods en el programa DNAsis) (véase la Figura 7) (Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105 (1982)). Esta región se sustituyó con otros aminoácidos para alterar la solubilidad, el rendimiento de expresión, los efectos sobre la escisión de enlazadores y otras características del polipéptido. La sustitución se realizó por PCR utilizando iniciadores degenerados. Se diseñó VgMut1 para cambiar la secuencia de aminoácidos LAASLVV a DEASDVE en la región hidrófoba del núcleo de Vg. El DNA codificante del Vg mutado se amplificó por PCR utilizando el plásmido pET23A-T7tagVgCH-GRF(1-44)A como molde y los iniciadores siguientes:

203

Las bases subrayadas en el iniciador VGXY1 representan los codones de residuos cambiados. El producto PCR se digirió con BamHI-XhoI y se clonó luego en el vector pET23a en el sitio BamHI-XhoI, produciendo el plásmido pET23a-T7tagVgMut1 CH-GRF(1-44)A (véase la Figura 8 para la secuencia del polipéptido que contiene VgMut1). Después de la confirmación por mapeado con enzimas de restricción y secuenciación del DNA, el plásmido se transformó en células BL21 (DE3) y se evaluó respecto a expresión de polipéptido como se describe en el Ejemplo 3.

El análisis SDS-PAGE demostró que no se observaba cantidad significativa alguna de polipéptido correspondiente a T7tagVgMut1CH-GRF(1-44)A, lo que indicaba que el cambio espectacular del núcleo hidrófobo LAASLVVF (SEQ ID NO: 92) a una región hidrófila anulaba la función de Vg para mejorar la formación de cuerpos de inclusión y la producción global del polipéptido en E coli.

Se preparó otra mutación (designada como VgMut4) en la región hidrófoba del núcleo de Vg por reasociación de dos iniciadores degenerados que eran complementarios uno a otro. Las secuencias de los iniciadores son como sigue:

204

Las bases subrayadas en estos dos iniciadores representan los residuos cambiados (véase la Figura 9 para la secuencia del polipéptido que contiene VgMut4). Los dos iniciadores se mezclaron en concentraciones molares iguales, se desnaturalizaron a 94ºC durante 1 minuto, se reasociaron a 50ºC durante 10 minutos, y se clonaron luego en pET23aT7tagVgMut1CH-GRF(1-44)A en el sitio BamHI-EcoRI para producir una biblioteca de plásmidos pET23aT7tagVgMut4CH-GRF(1-44)A. Los plásmidos resultantes se transformaron en células BL21(DE3) y se evaluaron respecto a expresión de polipéptido como en el Ejemplo 3.

Varios clones exhibían alto nivel de expresión de cuerpos de inclusión polipeptídicos por análisis SDS-PAGE. Se secuenciaron plásmidos de estos clones y se determinó la mutación en la región del núcleo hidrófobo Vg. Los cuerpos de inclusión se aislaron por lisis y centrifugación de las células a partir de cultivos de 5 ml a 500 ml en LBA que se indujeron con IPTG. Se evaluaron luego los cuerpos de inclusión respecto a solubilidad en urea 4 M y HCl 50 mM. La misma cantidad de cuerpos de inclusión de diferentes polipéptidos de T7VgMut4CH-GRF(1-44)A se suspendió en una pequeña cantidad de urea 4 M o HCl 50 mM a fin de que la solución estuviera saturada con los polipéptidos. La concentración del polipéptido solubilizado se determinó por medida de la absorbancia UV a 280 nm y análisis SDS-PAGE. Si un polipéptido podía alcanzar una concentración mayor en urea 4M o HCl 50 mM que los otros polipéptidos, se identificó el mismo como exhibidor de mayor solubilidad. Un clon que contenía una sustitución de un solo aminoácido (véase la Tabla VIII) demostró niveles altos de expresión, con propiedades de solubilidad alteradas en el disolvente urea.

TABLA VIII Solubilidad de los Polipéptidos con Vg Modificado

14

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Expresión de polipéptidos T7tagVg-PTH(1-34)

La secuencia PTH se amplificó utilizando los iniciadores siguientes:

205

Los sitios XhoI y HpaI están subrayados en los iniciadores PTH19981 y PTH19982, respectivamente. El fragmento amplificado se escindió con XhoI-HpaI y se clonó en el sitio XhoI-HpaI en el plásmido pET23a-T7tagVg-GRF(1-44)A. La secuencia polipeptídica del plásmido pET23a-T7tagVg-PTH(1-34) se muestra en Figura 10 y 12. La secuencia "Gly-Pro-Arg" antes de PTH es un sitio de escisión de trombina que proporciona la liberación del péptido PTH.

Se insertó un dipéptido Cys-His para escisión con Pd entre el enlazador trombina y PTH(1-34) por PCR utilizando pET23a-T7tagVg-PTH(1-34) como molde y utilizando el iniciador PTH19981 anterior y el iniciador PTH19983, identificado a continuación:

206

En este iniciador está subrayado un sitio EcoRI. El producto PCR se escindió con EcoRI-XhoI, y se clonó en un plásmido pET23aT7tagVg-PTH(1-34) escindido con ExoRI-XhoI. La secuencia de clon resultante se designó pET23a-T7tagVgCH-PTH(1-34).

Los dos plásmidos anteriores se transformaron en células BL21(DE3) y se evaluaron respecto a expresión de polipéptido como se describe en el Ejemplo 3. Ambos constructos expresaban niveles altos de cuerpos de inclusión inducibles por IPTG e insolubles del polipéptido deseado, que tenían enlazadores y péptidos diana diferentes de los Ejemplos 1 a 3.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Deleciones en el Vg

Se delecionaron porciones de conductor Vg para minimizar la longitud del conductor. Se llevó a cabo una reacción PCR utilizando pET23a-T7tagVgCH-PTH(1.34) como molde, el iniciador PTH19981 descrito en el Ejemplo 7, y el iniciador siguiente:

207

El iniciador GRFXY629 deleciona la secuencia de aminoácidos GQGQA (SEQ ID NO: 104) que sigue inmediatamente al sitio BamHI (subrayada), e introduce una sustitución de serina (TCC) por valina (GTG, negrilla) en la secuencia hidrófoba de Vg (LAASLVVF (SEQ ID NO: 92) por LAAVLVVF (SEQ ID NO: 105)). Esta sustitución aumentaba la hidrofobicidad del péptido Vg (gráfica de Kyte & Doolittle). La deleción disminuía también el porcentaje de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión del cuerpo de inclusión en el polipéptido en tándem y aumentaba con ello el porcentaje del polipéptido preseleccionado en el polipéptido en tándem. El producto PCR se escindió con BamHI-HpaI y se clonó en pET23a-T7tagVgCH-GRF(1-44)A escindido con HpaI-BamHI. El clon resultante, pET23a-T7tagVg(Dell)CH-GRF(1-44)A expresaba niveles altos de cuerpos de inclusión inducibles por IPTG.

El gen PTH(1-34) se reemplazó en lugar de GRF(1-44)A en el vector pET23aT7tagVg(Del1)CH-GRF(1-44)A como sigue.

El pET23aT7tagVg(Dell)CH-GRF(1-44)A se escindió con HpaI-XhoI para eliminar GRF(1-44)A, y se obtuvo el elemento PTH(1-34) de pET23aT7tagVg-PTH(1-34) por digestión con HpaI-XhoI. La ligación de estos fragmentos produjo el plásmido pET23a-T7tagVg(Dell)-PTH(1-34) (véase la Figura 10). Se produjo un alto nivel de cuerpos de inclusión inducibles por IPTG del polipéptido T7tagVg(Dell)-PTH(1-34) por este constructo en BL21(DE3).

Se hizo una segunda deleción del péptido Vg en la cual se delecionaron los aminoácidos TASQVD (SEQ ID NO: 106) inmediatamente N-terminales al sitio HpaI en el péptido Vg (Del2); véanse las Figuras 10 & 12). Los iniciadores utilizados para la PCR fueron MGDEL3 y PL28 (PL28 se reasocia a la región 5' del sitio de fijación de ribosoma), utilizando el clon pET23a-T7tagVg-PTH(1-34) como molde.

208

El producto PCR se escindió con HpaI-XbaI y se clonó en un plásmido pET23a-T7tagVg-PTH(1-34) escindido con HpaI-XbaI. El plásmido resultante, pET23a-T7tagVg-(Del2)-PTH(1-34) expresaba niveles altos de cuerpos de inclusión inducibles por IPTG e insolubles, de un tamaño correspondiente al péptido precursor T7tagVg(Del2)-PTH(1-34). El experimento demostró que esta región (TASQVD) (SEQ ID NO: 106) era dispensable para Vg a fin de formar cuerpos de inclusión.

En otro experimento, se delecionó la región enlazadora del péptido precursor T7tagVgCH-PTH(1-34). Se delecionó la secuencia de aminoácidos PEFSV (SEQ ID NO: 109) inmediatamente C-terminal al sitio HpaI (Del3; véanse las Figuras 10 & 12). Se creó la región Del3 por amplificación PCR utilizando el plásmido pET23a-T7tagVg-PTH(1-34) como molde, y empleando los iniciadores representados a continuación. El iniciador PL39 se reasocia al plásmido en la región terminadora:

209

El producto PCR contenía una secuencia codificante Cys-His en el término N de PTH(1-34) como se muestra en la Figura 11. Después de confirmar el producto PCR por secuenciación, se digirió el mismo con HpaI-XhoI y se clonó luego en el plásmido pET23a-T7tagVg-PTH(1-34) en los sitios HpaI-XhoI para producir el plásmido pET23a-T7tagVg(Del3)CH-PTH(1-34). Cuando el fragmento PCR digerido con HpaI-XhoI se clonó en el plásmido pET23a-T7tagVg(Del2)CH-PTH(1-34) en los sitios HpaI-XhoI, produjo el plásmido pET23a-T7tagVg(Del2+3)CH-PTH(1-34). Las secuencias de DNA y las secuencias predichas de aminoácidos de ambos constructos se muestran en las Figuras 10 y 12.

Los dos plásmidos anteriores y el plásmido pET23a-T7tagVg-PTH(1-34) (sin deleción) se transformaron por separado en la cepa K de E coli, HMS-174 (DE3). La expresión se indujo con IPTG. Los tres clones producían niveles altos de cuerpos de inclusión inducibles por IPTG e insolubles. Los resultados demostraron que el Vg no tenía especificidad de cepa, dado que funciona en ambas cepas BL21 y HMS-174, y que las deleciones Del1, Del2, Del3 o Del2+3 no afectan a la función de Vg. La deleción Del2+3 eliminaba 11 aminoácidos, y la longitud total del elemento conductor T7tagVg(Del2+3)CH se reducía a 44 aminoácidos. De este modo, el constructo T7tagVg(Del2+3)CHPTH(1-34) entero se redujo a una longitud de 78 aminoácidos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Expresión de T7tagVg-CAT

Para determinar si la invención descrita aumenta la producción de péptidos o proteínas solubles grandes, se preparó un constructo de DNA que codificaba cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT), con y sin fusión a Vg. La CAT activa confiere resistencia a cloranfenicol.

(1) Vector pBN115

Se derivó pBN115 de pGEX-2T por reemplazamiento del fragmento FspI-SmaI que contenía la fusión promotor tac-gen estructural GST con una casete BglII-XbaI-NheI-XhoI del plásmido pBN95(Tac). El promotor tac se reemplazó con el promotor del virus Chlorella (Patente U.S. No. 6.316.224) en el sitio BglI-XbaI. El plásmido pBN115 contiene laclq y Amp^{r}. El uso del vector pBN115 ha sido descrito en la Patente U.S. No. 6.316.224 concedida a Xia.

(2) CAT (Cloranfenicol-acetiltransferasa)

El gen de CAT (que codifica 219 aminoácidos) se amplificó por PCR a partir del plásmido pKK232-8 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Se utilizaron en la reacción PCR los dos oligonucleótidos siguientes:

210

Se utilizó CATXY1 como el iniciador directo que contiene el sitio NheI (GCTAGC) para la clonación. Como el iniciador inverso se utilizó CATXY2, que contiene el sitio XhoI (CTCGAG) para la clonación. El producto PCR resultante se insertó en pBN115 en los sitios NheI-XhoI para crear el plásmido pBN115-CAT (Figura 13). El plásmido pBN115-CAT se transformó en E coli y se expresó como se describe en el Ejemplo 3. CAT se sobreexpresaba como una proteína soluble con actividad enzimática bajo el control del promotor del virus Chlorella a 37ºC.

(3) T7tagVg-CAT

Se preparó por PCR un fragmento de DNA separable por NheI que contenía el gen de fusión T7tagVg. Se utilizaron como iniciadores de la PCR los iniciadores siguientes:

211

Como iniciador inverso se utilizó VGNHE, que contenía los sitios de restricción HpaI (GTTAAC) y NheI (GCTAGC). Como iniciador directo se utilizó XBAXY1 que contenía la secuencia de DNA aguas arriba del codón de inicio. El plásmido pBN95(Tac)-T7tagVg(opt)-CHGRF(1-44)A que contenía el Vg optimizado en codones sirvió como molde para la PCR.

El fragmento NheI generado por PCR que contenía la fusión T7tagVg (Figura 14) se insertó en pBN115-CAT en el sitio NheI para producir el plásmido pBN115-T7tagVgCAT. El plásmido se mapeó con enzimas de restricción para confirmar que se había obtenido la orientación correcta de la inserción. El plásmido se transformó en E coli y se expresó como se describe en el Ejemplo 3. Se sobreexpresaba T7tagVg-CAT como proteína insoluble a 37ºC, aunque se expresaba CAT como proteína soluble.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Expresión de T7tagVg-\beta-galactosidasa

El gen que codificaba una \beta-galactosidasa de 1021 aminoácidos se amplificó a partir del gen LacZ de E coli MG1655 utilizando los dos iniciadores siguientes:

212

El iniciador directo BGXY1 introducía un sitio NheI (subrayado) en el producto PCR, mientras que el iniciador inverso BGXY2 introducía un sitio XhoI (subrayado). El producto PCR se digirió con NheI-XhoI y se clonó luego en el plásmido pBN115 en los sitios NheI-XhoI para producir el plásmido pBN115-LacZ. El fragmento T7tagVg separable por NheI del ejemplo 9 se insertó en el plásmido pBN115-LacZ en el sitio MheI para producir el plásmido pBN115-T7tagVg-LacZ (Figura 15). El plásmido se mapeó con enzimas de restricción para confirmar que se había obtenido la orientación correcta de la inserción. El plásmido se transformó en E coli y se expresó como se describe en el Ejemplo 3.

La expresión en cultivo de sacudidas indicó que el polipéptido en tándem de T7tagVg-LacZ se expresaba en su mayoría como cuerpos de inclusión a 37ºC y era parcialmente soluble a 27ºC (Figura 16). Sin el conductor Vg, LacZ se expresaba como proteína soluble en E coli. Este resultado sorprendente demostró que el conductor Vg promovía la formación de cuerpos de inclusión o agregados polipeptídicos incluso cuando se fusionaba a proteínas solubles de gran tamaño. La formación de cuerpos de inclusión o agregados polipeptídicos aumentaba a temperaturas de expresión más altas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

Expresión de T7tagVgCH-GLP(7-36)CH

Se produjo el fragmento CH-GLP(7-36)CH por PCR utilizando los iniciadores siguientes:

213

El sitio SalI en el iniciador CHGLP y el sitio XhoI en el iniciador GLPCH están subrayados. El producto PCR se escindió con SalI-XhoI y se ligó en un vector pBN95(Tac)-T7tagVg(opt)CH-GRF(1-44)A escindido con SalI-XhoI y tratado con fosfatasa alcalina. El plásmido resultante pBN95(Tac)-T7tagVgCH-GLP(7-36)CH resultante se transformó en E coli HMS174 y BL21. Todas estas líneas de células expresaban un alto nivel de cuerpos de inclusión polipeptídicos correspondientes a T7VgCH-GLP(7-36)CH después de inducción con IPTG.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

Casetes de expresión generalizadas

Numerosos polipéptidos preseleccionados pueden ser producidos por el uso de los métodos, constructos, y parejas de fusión de cuerpos de inclusión descritos en esta memoria. Preferiblemente, un polipéptido preseleccionado se enlaza operativamente a una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que tiene SEQ ID NO: 2-4. Estos polipéptidos en tándem se ilustran por la estructura generalizada ilustrada en la Figura 18. Los métodos descritos en los Ejemplos 1 y 2 pueden utilizarse para preparar un constructo de ácido nucleico que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica virtualmente cualquier polipéptido preseleccionado. Este constructo de ácido nucleico puede cultivarse y utilizarse para producir el polipéptido preseleccionado de acuerdo con los métodos descritos en los Ejemplos 3, 5, 7 y 9-11. Así pues, los métodos y constructos pueden utilizarse en una gran diversidad de circunstancias para producir numerosos polipéptidos preseleccionados diferentes.

Referencias

Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., 1989

Amann et al., Gene, 25:167 (1983)

Aubin et al., Methods Mol. Biol., 62:319 (1997)

Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett., 66:203 (1990)

Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY. (1989)

Barany et al., J. Bacteriol., 144:698 (1980)

Beach and Nurse, Nature, 300:706 (1981)

Beaucage and Caruthers, Tetra. Letts., 22:1859 (1981)

Birnstiel et al., Cell, 41:349 (1985)

Boshart et al., Cell, 41:521 (1985)

Botstein, et al., Gene, 8:17 (1979)

Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:4642 (1984)

Butt et al., Microbiol. Rev., 51:351 (1987)

Carbonell et al., Gene, 73:409 (1988)

Carbonell et al., J. Virol., 56:153 (1985)

Chaney et al., Somat. Cell Mol. Genet., 12:237 (1986)

Chang et al., Nature, 198:1056 (1977)

Chassy et al., FEMS Microbiol. Lett., 44:173 (1987)

Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1973)

Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:1078 (1980)

Coombs et al., Chem, Biol., 5:475 (1998)

Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5:3376, 1985

Das et al., J. Bacteriol., 158:1165 (1984)

Davidow et al., Curr. Genet., 10:39 (1985)

Davies et al., Ann. Rev. Microbiol., 32:469 (1978)

Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)

de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21 (1983)

De Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154:737 (1983)

De Louvencourt et al., J. Bacteriol., 754:737 (1983)

Dijkema et al., EMBO J., 4:761 (1985)

Dower et al., Nuc. Acids Res., 16:6127 (1988)

Felgner et al., J. Biol. Chem., 269:2550 (1994)

Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7413 (1987)

Fledler et al., Anal. Biochem, 170:38 (1988)

Franke et al., J. Gen. Virol., 66:2761 (1985)

Fraser et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 25:225 (1989)

Freifelder, Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Molecular Biology, W.H. Freeman and Co., 2nd edition, New York, NY (1982)

Friesen et al., "The Regulatlon of Baculovirus Gene Expression", In: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler), 1986

Gaillardin et al., Curr. Genet., 10:49 (1985)

Ghrayeb et al., EMBO J., 3:2437 (1984)

Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132:3459 (1986)

Gluzman, Cell. 23:175 (1981)

Goeddel et al., Nuc. Acids Res., 8:4057 (1980)

Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79:6777 (1982b)

Graham and van der Eb, Virology, 52:456 (1973)

Gregor and Proudfoot, EMBO J., 17:4771 (1998)

Guan et al., Gene, 67:21 (1997)

Harlander, "Transformatlon of Streptococcus lactis by electroporation", In: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III), 1987

Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)

Henikoff et al., Nature, 283:835 (1981)

Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929 (1978)

Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes In the Yeast Saccharomyces cerevisiae", In: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K. N. "Timmis and A. Puhler"), 1979

Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96:119 (1981)

Ito et al., J. Bacteriol., 153:163 (1983)

Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 9:946 (1989)

Kawal and Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4:1172 (1984)

King and Possee, The baculovirus expression system. A laboratory guide. Chapman and Hall, London, England (1992)

Kohrer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 98:14310 (2001)

Kowal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 98:2268 (2001)

Kunkel et al., Methods In Enzymol., 154:367 (1987)

Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488, (1985)

Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25:141 (1985)

Kurtz et al., Mol. Cell. Biol., 6:142 (1986)

Kushner, "An Improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids", In: Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H. W. Boyer and S. Nicosia), 1978

Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105 (1982)

Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol., 8:3129 (1988)

Lewin, Genes VII, Oxford University Press, New York, New York (2000).

Lopez-Ferber et al., Methods Mol. Biol., 39:25 (1995)

Luckow and Summers, Virology, 17:31 (1989)

Maeda et al., Nature, 315:592 (1985)

Mandel et al., J. Mol. Biol., 53:159 (1970)

Maniatis et al., Science, 236:1237 (1987)

Martn et al., DNA, 7: 99 (1988)

Marumoto et al., J. Gen. Virol., 68:2599 (1987)

Masson et al., FEMS Microbiol. Lett., 60:273 (1989)

Masul et al., In: Experimental Manipulation of Gene Expression, (1983)

McCarroll and King, Curr. Opin. Biotechnol., 8:590 (1997)

Mercerau-Pulgalon et al., Gene, 11:163 (1980)

Miller et al., Ann. Rev. Microbiol., 42:177 (1988)

Miller et al., Bioessays, 4:91 (1989)

Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:856 (1988)

Miyajima et al., Gene, 58:273 (1987)

Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:1 (1983)

Neuman et al., EMBO J., 1:841 (1982)

Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7212 (1985)

O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: a laboratory manual. W.H. Freeman & Compariy, New York, NY (1992)

Orr-Weaver et al., Methods In Enzymol., 101:228 (1983)

Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5582 (1982)

Panthler et al., Curr. Genet., 2:109 (1980)

Pearson, Genomics, 11:635 (1991)

Perry et al., Infec. Immun., 32:1295 (1981)

Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., 54:655 (1988)

\newpage

Proudfoot and Whitelaw, "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA", In: Transcrtption and Splicing (eds. B. D. Hames and D. M. Glover). 1988

Proudfoot, Trends Biochem. Sci., 14:105 (1989)

Ralbaud et al., Ann. Rev. Genet., 18:173 (1984)

Richardson, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28:1 (1993)

Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6750 (1983)

Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., 202:302 (1986)

Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (January 15, 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765

Sanford et al., Methods Enzymol., 217:483 (1993)

Sassone-Corsi and Borelli, Trends Genet., 2:215 (1986)

Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981)

Shimizu et al., Mol. Cell. Biol., 6:1074 (1986)

Shine et al., Nature, 254:34, (1975)

Smith & Waterman, J. Mol. Biol., 147:195 (1981)

Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3: 2156 (1983)

Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404 (1985)

Somkuti et al., Proc. 4th Eur. Cong. Biotechnology, 1:412 (1987)

Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", in: Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger) (1979)

Stinchcomb et al., J. Mol. Biol., 158:157 (1982)

Studier et al., J. Mol. Biol., 159:113 (1986)

Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, 1987

Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1074 (1985)

Taketo, Biochim. Blophys. Acta, 949:318 (1988)

Vaherl and Pagano, Virolog, 27:434 (1965)

Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)

Van Devanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984)

Vlak et al., J. Gen. Virol., 69:765 (1988)

Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques In Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)

Walsh, Proteins Biochemistry and Blotechnology, John Wlley & Sons, LTD., West Sussex, England (2002)

Wang et al., J. Bacteriol., 172:949 (1990)

Waterman, Bulletin of Mathematical Biology, 46:473 (1984)

Watson, Molecular Biology of the Gene, 4th edition, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park. CA (1987)

Welssmann, "The cloning of Interferon and other mlstakes", In: Interferon 3 (ed. I. Gresser), 1981

Williams et al., Genes & Development, 5:2481, 1991

Wright, Nature, 321:718 (1986)

Yelverton et al., Nuc. Acids Res., 9:731 (1981)

Zhao et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63:405 (1999)

Zimmerman, Biochem. Biophys. Acta., 694:227 (1982)

<110> Wagner, F.

\hskip1cm

Peng, L.

\hskip1cm

Xia, U.

\hskip1cm

Holmquist, B.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Métodos y Constructos de DNA para Producción de Polipéptidos con Rendimiento Alto

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 1627.010WO1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/383.370

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-05-24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcccaat atctggctgc ctccctggtt gtgttcacca actactcggg cgac

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una pareja de inclusión de cuerpo de fusión.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GLP-1(7-36).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GLP-1 (7-37).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un péptido modificado preseleccionado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un péptido modificado preseleccionado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GLP-2(1-34).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GLP-2(1-33).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un péptido modificado preseleccionado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un péptido modificado preseleccionado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GRF(1-44).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PTH(1-34).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PTH(1-37).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PTH(1-84).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Componente P del amiloide (27-38).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> (Tyr0)-Fibrinopéptido A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Urechistachiquinina II.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína B del amiloide (12-28).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína B del amiloide (22-35).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Camello

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GLP-1(7-36).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GLP-1(7-37).

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un péptido modificado preseleccionado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un péptido modificado preseleccionado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GLP-2(1-34).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GLP-2(1-33).

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un péptido modificado preseleccionado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un péptido modificado preseleccionado.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> GRF(1-44).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PTH(1-34).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PTH(1-37).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PTH(1-84).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\hskip1cm

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Componente P del amiloide (27-38).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaaaaccgc tgcagaactt caccctgtgc ttccgt

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> (Tyr0)-Fibrinopéptido A.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacgctgatt ccggtgaagg tgatttcctg gctgaaggtg gtggtgtccg t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Urechistachiquinina II.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgctggta tgggtttctt cggtgcgcgt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína B del amiloide (12-28).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccatcatc agaaactggt cttcttcgct gaagatgtcg gttccaacaa a

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína B del amiloide (22-35).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagatgtcg gttccaacaa aggtgctatt attggtctga tg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Camello

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\hskip1cm

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\hskip1cm

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\hskip1cm

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip1cm

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip1cm

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip1cm

1000

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\hskip1cm

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\hskip1cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctttcctgg ggccgggtga tcgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgacgatc gt

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatctgacc gt

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcactgacc gt

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de un enlazador peptídico escindible.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgggtgacc gt

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FLAG.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\hskip1cm

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de inicio de la traducción de T7.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatata

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T7tag.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\hskip1cm

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T7tag.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcatttcta gaattgtgaa ttgttatccg ctca

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcatttcta gaattgtgaa ttgttatccg ctca

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Producto de la PCR.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\hskip1cm

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgctcgagt tatgccagac gagcacgagc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctatggtcg acgacgacga caaatgccac tacgctgacg ctatcttcac caac

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatccg gccagggtca ggctcaatat ctggcggcct ccctggttgt gttc

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctcgagt tatgccagac gagcacgagc accacg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de núcleo hidrófobo.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\hskip1cm

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\hskip1cm

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagtcacga tgaattccc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica mixta

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a o t o g o c.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatccggcca gggtcaggct caatatctgn cggcctccct ggttm

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica mixta

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a o t o g o c.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattkaacca gggaggcagn cagatattga gcctgaccct ggccg

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de núcleo hidrófobo modificada.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\hskip1cm

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de núcleo hidrófobo modificada.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\hskip1cm

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de núcleo hidrófobo modificada.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\hskip1cm

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgctcgag gatatcttag aagttgtgaa cgtcctgcag

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcgttaac ccggaattct ctgttggtgg tggtggtggt ccgcgttct

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaattct ctgttggtgg tggtggtggt ccgcgttgcc actctgtttc tgaaatc

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcggatccc aatatctggc tgccgtgctg gttgtgttca ccaactactc g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Porción delecionada de la secuencia conductora de VG.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\hskip1cm

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia hidrófoba de Vg modificada.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\hskip1cm

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Porción delecionada de la secuencia VG.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\hskip1cm

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgttaacg tcgcccgagt agttggtgaa cac

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagcggataa caattcaca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia delecionada.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\hskip1cm

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgttaacg gtggtggtgg tggttgccac tctgtttctg aaatc

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctagttat tgctcagcgg tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgctagca tggagaaaaa aatcact

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcctcgagc tgccaagggt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcgctagcg ttaacgtcca cctggctggc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgggtcga caactttaag aaggagata

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggctagca tagatcccgt cgttttacaa cgtcgtgac

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggctcgagt tattattttt gacaccagac caactggta

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctatggtcg acgacgacga caaatgccac catgctgaag gtaccttcac ctcc

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcatctcg agttagtggc aacgaccttt aaccagccaa gcgatgaa

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVgCH-GRF(1-44)A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\hskip1cm

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVgCH-GRF(1-44)A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\hskip1cm

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tag-GRF(1-44)A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\hskip1cm

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tag-GRF(1-44)A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\hskip1cm

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVg-GRF(1-44)A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVg-GRF(1-44)A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVg(opt)-GRF(1-44)A.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVg(opt)CH-GRF(1-44)A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVgMut1CH-GRF(1-44)A.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\hskip1cm

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVgMut1CH-GRF(1-44)A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\hskip1cm

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVgMut4CH-GRF(1-44)A.

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Thr o Pro o Ala o Ser.

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Lys o Gln.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVgMut4CH-GRF(1-44)A.

\vskip0.400000\baselineskip

<221> estructura mixta

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a o t o g o c.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVg-PTH(1-34)A.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\hskip1cm

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para la casete T7tagVg-PTH(1-34)A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\hskip1cm

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para una secuencia enlazadora que contiene un sitio de escisión por paladio.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\hskip1cm

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para una secuencia enlazadora que contiene un sitio de escisión por paladio.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttaacccgg aattctctgt tggtggtggt ggtggtccgc gttgccactc tgtttct

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia conductora Del 3.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\hskip1cm

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia conductora Del 3.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\hskip1cm

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia conductora Del 2 y 3.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\hskip1cm

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia conductora Del 2 y 3.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia PTH.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia PTH.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para un fragmento T7Vg separable por NheI.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\hskip1cm

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia para un fragmento T7Vg separable por NheI.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\hskip1cm

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una casete T7tagVgCH-GLP-1(7-36)CH.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\hskip1cm

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de una casete T7tagVgCH-GLP-1(7-36)CH.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\hskip1cm

121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlazador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\hskip1cm

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcggatcc ggccagggac aggctcaata tctatgggcc tccttggttg tgttcacca

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgttaacg tccaacctgg ctggccgtgt cgcccgagta gttggtgaac acaaccaagg

\hfill

60

Claims (48)

1. Una casete de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico siguiente enlazada operativamente:

5'Pr-(TIS)_{D}-(IBFP1)_{E}-(CL1)_{G}-ORF-[CL2-ORF]_{L}-(CL3)_{M}-(IBFP2)_{Q}-(SSC)_{R}-(CL4)_{T}-(Ft)_{W}-(Tr)_{X}-3'

en donde

Pr es una secuencia promotora,

TIS codifica una secuencia de iniciación de la traducción,

IBFP1 codifica una primera pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15, o una variante de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador,

CL1 codifica un primer enlazador peptídico escindible,

ORF codifica un polipéptido preseleccionado,

CL2 codifica un segundo enlazador peptídico escindible,

CL3 codifica un tercer enlazador peptídico escindible,

IBFP2 codifica una segunda pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID No.: 1-15, o una variante de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador,

SSC es un codón de parada suprimible,

CL4 codifica un cuarto enlazador peptídico escindible,

Ft codifica un marcador de fusión, y

Tr es una secuencia terminadora de la transcripción,

en donde cada uno de D o X es independientemente 0 o un número entero de 1 a 4,

en donde R es 0 o un número entero de 1 a 2,

en donde cada uno de E, G, L, M, Q, T o W es independientemente 0 o un número entero de 1 a 20,

en donde está presente uno cualquiera o ambos de IBFP1 o IBFP2, y

en donde está presente al menos uno de CL1, CL2, CL3 o CL4, y

en donde la expresión de la casete de expresión produce una proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado y que forma un cuerpo de inclusión cuando se expresa en una célula.

\vskip1.000000\baselineskip

2. La casete de expresión de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal que está acoplada operativamente a o próxima al término amino o al término carboxilo de la proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado.

3. La casete de expresión de la reivindicación 2, en donde la secuencia señal dirige la proteína asociada operativamente que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado a un espacio periplásmico, a una membrana interna, o a una membrana externa de la célula.

4. La casete de expresión de la reivindicación 2, en donde la secuencia señal se obtiene a partir de una proteína seleccionada del grupo constituido por la proteína mayor de la cubierta del fago fd, la proteína menor de la cubierta del fago fd, fosfatasa alcalina, proteína de fijación de maltosa, proteína de fijación específica de leucina, \beta-lactamasa, lipoproteína, LamB y OmpA.

5. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera o ambas de IBFP1 o IBFP2 codifica una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que modula la mejora de aislamiento de un cuerpo de inclusión formado a partir de la proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado.

6. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la mejora de aislamiento del cuerpo de inclusión es auto-adhesión, solubilidad, estabilidad de purificación, resistencia a la proteólisis, o punto isoeléctrico alterado.

7. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el promotor incluye un operador seleccionado del grupo constituido por un operador lac, un operador del fago lambda, un operador de \beta-galactosidasa, un operador arabinosa, un operador lexA, y un operador trp.

8. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el promotor es un promotor T7lac, un promotor tac, un promotor lac, un promotor del fago lambda, un promotor del choque térmico, o un promotor del virus Chlorella.

9. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la secuencia de iniciación de la traducción se obtiene a partir de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo constituido por el gen 10 del fago T7, A del fago Q\beta, la cubierta del fago Q\beta, la replicasa del fago Q\beta, Cro del fago lambda, la cubierta del fago fl, A del fago \varphiX174, B del fago \varphiX174, E del fago \varphi174, lipoproteína, RecA, GalE, GalT, lacI, lacZ, el ribosoma L10, el ribosoma L7/L12, y la subunidad \beta de RNA-polimerasa.

10. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde cada uno del primer enlazador peptídico escindible, el segundo enlazador peptídico escindible, el tercer enlazador peptídico escindible, o el cuarto enlazador peptídico escindible puede ser escindido independientemente por un agente de escisión seleccionado del grupo constituido por paladio, bromuro de cianógeno, Clostripaína, Trombina, Tripsina, roteasa afín a Tripsina, Carboxipeptidasa, Enteroquinasa, proteasa Kex 2, proteasa Omp T, proteasa del Factor Xa, Subtilisina, proteasa de HIV, proteasa de Rhinovirus, proteasa de Furilisina, proteasa IgA, proteasa Pace Humana, Colagenasa, proteasa Nia del potivirus pos del Ciruelo, proteasa 2APro del Poliovirus, proteasa 3C del Poliovirus, proteasa Nia, Genenasa, Furina, Quimotripsina, Elastasa, Subtilisina, Proteinasa K, Pepsina, Rennina, proteasas aspárticas microbianas, Papaína, Ficina, Bromelaína, Colagenasa, Termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, Calicreína y Plasmina.

11. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el ORF codifica GLP-1, GLP-2, PTH, GRF, clostripaína, o una variante de las mismas.

12. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el ORF contiene un codón de parada suprimible.

13. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el codón de parada suprimible es un codón ámbar o un codón ocre.

14. La casete de expresión de la reivindicación 13, en donde el codón de parada suprimible crea un enlazador peptídico escindible, que es escindible por ejemplo por una proteasa específica de tejido tal como el antígeno específico de próstata.

15. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde el marcador de fusión es \beta-gal, GST, CAT, TrpE, SPA, SPG, MBP, SBD, CBD_{CenA}, CBD_{Cex}, dominio de fijación de biotina, recA, Flag, poli(Arg), poli(Asp), glutamina, poli(His), poli(Phe), poli(Cys), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente cayena, biotina, avidina, estreptavidina, o un epítope de anticuerpo.

16. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la secuencia de terminación es un terminador T7.

17. Un RNA producido por transcripción de la casete de expresión de la reivindicación 1.

18. Una proteína que tiene una pareja de fusión de cuerpos de inclusión enlazada operativamente a un polipéptido preseleccionado y que se produce por traducción del RNA de la reivindicación 17.

19. Un constructo de ácido nucleico que comprende un vector y la casete de expresión de la reivindicación 1.

20. El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 19, en el cual el vector es un virus, un plásmido, un fagémido, un cromosoma artificial bacteriano, un cromosoma artificial de levadura, un bacteriófago, un factor f o un cósmido.

21. Una célula procariota como por ejemplo una bacteria tal como Escherichia coli o una célula eucariota como por ejemplo una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de mamífero que comprende el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 19.

22. La proteína de la reivindicación 18, en donde el polipéptido preseleccionado codificado por ORF no está asociado naturalmente con la pareja de fusión de cuerpos de inclusión codificada por IBFP1 o IBFP2.

23. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la primera región está en o próxima al término N de la segunda región; o en donde la primera región está en o próxima al término C de la segunda región.

24. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la secuencia de aminoácidos preseleccionada corresponde a la de GLP-1, GLP-2, PTH, GRF, clostripaína, o una variante de las mismas.

25. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende adicionalmente un enlazador peptídico escindible entre la primera región y la segunda región.

26. La proteína de la reivindicación 25, en donde el enlazador peptídico escindible puede ser escindido por un agente de escisión seleccionado del grupo constituido por paladio, bromuro de cianógeno, Clostripaína, Trombina, Tripsina, proteasa afín a Tripsina, Carboxipeptidasa, Enteroquinasa, proteasa Kex 2, proteasa Omp T, proteasa del Factor Xa, Subtilisina, proteasa de HIV, proteasa de Rhinovirus, proteasa de Furilisina, proteasa IgA, proteasa Pace Humana, Colagenasa, proteasa Nia del potivirus pos del Ciruelo, proteasa 2APro del Poliovirus, proteasa 3C del Poliovirus, proteasa Nia, Genenasa, Furina, Quimotripsina, Elastasa, Subtilisina, Proteinasa K, Pepsina, Rennina, proteasas aspárticas microbianas, Papaína, Ficina, Bromelaína, Colagenasa, Termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, Calicreína y Plasmina.

27. La proteína de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el enlazador peptídico escindible es escindido por una proteasa específica de tejido, tal como el antígeno específico de próstata.

28. La proteína de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende adicionalmente un marcador de fusión enlazado operativamente.

29. La proteína de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el marcador de fusión es un ligando para un receptor celular, tal como insulina; o en donde el marcador de fusión es \beta-gal, GST, CAT, TrpE, SPA, SPG, MBP, SBD, CBD_{CenA}, CBD_{Cex}, dominio de fijación de biotina, recA, Flag, poli(Arg), poli(Asp), glutamina, poli(His), poli(Phe), poli(cys), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente cayena, biotina, avidina, estreptavidina, o un epítope de anticuerpo.

30. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la secuencia de aminoácidos preseleccionada tiene una longitud de 2 a 1000, particularmente 2 a 100, y más particularmente 2 a 10 aminoácidos.

31. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 22, en donde al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos preseleccionada está reemplazado por un análogo de aminoácido.

32. La proteína de la reivindicación 22, en donde la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15 está alterada por reemplazamiento de al menos un aminoácido con un aminoácido seleccionado del grupo constituido por un aminoácido acídico, un aminoácido básico y un aminoácido alifático.

33. La proteína de la reivindicación 22, en donde la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15 está alterada por reemplazamiento de al menos un aminoácido que tiene un valor pK entre 4 y 12; particularmente un valor pK entre 4 y 7, más particularmente entre 6 y 7; o particularmente un valor pK entre 7 y 12.

34. La proteína de la reivindicación 28, que comprende adicionalmente un enlazador peptídico escindible entre la secuencia de aminoácidos preseleccionada y el marcador de fusión.

35. La proteína de la reivindicación 34, en donde el enlazador peptídico escindible puede ser escindido por un agente de escisión seleccionado del grupo constituido por paladio, bromuro de cianógeno, Clostripaína, Trombina, Tripsina, proteasa afín a Tripsina, Carboxipeptidasa, Enteroquinasa, proteasa Kex 2, proteasa QmpT, proteasa del factor Xa, Subtilisina, proteasa de HIV, proteasa de Rinovirus, proteasa de Furilisina, proteasa de IgA, proteasa Pace Humana, Colagenasa, proteasa Nia del potivirus pos del Ciruelo, proteasa 2APro del Poliovirus, proteasa 3C del Poliovirus, proteasa Nia, Genenasa, Furina, Quimotripsina, Elastasa, Subtilisina, Proteinasa K, Pepsina, Rennina, proteasas aspárticas microbianas, Papaína, Ficina, Bromelaína, Colagenasa, Termolisina, Endoproteasa Arg-C, Endoproteasa Glu-C, Endoproteasa Lys-C, Calicreína y Plasmina.

36. Una proteína de la reivindicación 22, donde la primera región hace que la proteína forme un cuerpo de inclusión cuando se expresa en una célula, por ejemplo una bacteria tal como Escherichia coli, una célula de insecto, una célula de levadura, o una célula de mamífero.

37. Una secuencia de DNA que codifica la proteína de la reivindicación 22.

38. Uso de la proteína de la reivindicación 22, en donde la pareja de fusión de cuerpos de inclusión comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15, para selección de una secuencia de aminoácidos de una pareja de fusión de cuerpos de inclusión que confiere mejora de aislamiento a un cuerpo de inclusión que comprende:

a) alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que forma el cuerpo de inclusión, y

b) determinar si el cuerpo de inclusión exhibe autoadhesión mejorada, solubilidad controlable, estabilidad de purificación, o resistencia a la proteólisis.

\vskip1.000000\baselineskip

39. El uso de la reivindicación 38, en donde la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15 está alterada por reemplazamiento de al menos un aminoácido con un aminoácido seleccionado del grupo constituido por un aminoácido conservador, un aminoácido hidrófobo, un aminoácido hidrófilo, y un aminoácido sin carga.

40. El uso de la reivindicación 38, en donde la secuencia de aminoácidos de la pareja de fusión de cuerpos de inclusión que comprende una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15 se altera por reemplazamiento de al menos un aminoácido que tiene un valor pK entre 4 y 12; particularmente un valor pK entre 4 y 7, más particularmente 6 y 7; o particularmente un valor pK entre 7 y 12.

41. Una pareja de fusión de cuerpos de inclusión producida por escisión de la proteína de la reivindicación 18 y que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15.

42. Un método para producir la proteína de la reivindicación 18 que comprende:

a) expresar la proteína de la reivindicación 18 en una célula, y

b) aislar la proteína.

\vskip1.000000\baselineskip

43.Una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende

a) SEQ ID NO: 83;

b) un enlazador peptídico escindible, y

c) una cualquiera de SEQ ID NO: 1-15.

\vskip1.000000\baselineskip

44. Una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 43.

45. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la al menos una IBFP1 ó 2 que está presente codifica una cualquiera de SEQ ID NO: 2-15, y variantes de la misma, en donde al menos un aminoácido en la pareja de fusión de cuerpos de inclusión está reemplazado con otro aminoácido que es un aminoácido conservador.

46. La casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la al menos una IBFP1 ó 2 que está presente codifica una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70%, particularmente al menos 80%, más particularmente al menos 90% y muy particularmente al menos 98% de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO: 2-15.

47. Una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la casete de expresión de la reivindicación 45.

48. Una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la casete de expresión de la reivindicación 46.