ES2280231T3 - Polipeptidos quimericos, metodo para la produccion y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Engarce lineal peptídico para la unión de compuestos biológicamente activos, caracterizado porque dicho engarce consta de: un primer resto engarce polipéptido, que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos, elegidos entre el grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina y un segundo resto engarce polipéptido, que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos ácidos, elegidos entre el grupo formado por el glutamato y el aspartato, dichos restos primero y segundo están unidos por interacción iónica debida a sus numerosos aminoácidos cargados y por puentes disulfuro covalentes entre sus cisteínas, cada uno de dichos estos está unido por su extremo C o N a un compuesto biológicamente activo.
Description
Polipéptidos quiméricos, método para la
producción y usos de los mismos.
La presente invención se refiere a engarces
peptídicos lineales y a métodos para la producción de un polipéptido
quimérico.
Los compuestos artificiales biológicamente
activos, bifuncionales o multifuncionales, tienen un amplio abanico
de utilidades potenciales en diagnosis y en terapia. Las proteínas
bifuncionales se emplean con preferencia especial para el
inmunodiagnóstico y la inmunoterapia. Por ejemplo, se saca partido
de la unión específica de un anticuerpo o de un fragmento de
anticuerpo con su antígeno, con el fin de dirigir una proteína, que
tiene funciones biológicas diferentes, contra este antígeno
específico. Por ejemplo puede utilizarse un anticuerpo
biespecífico, cuyos antígenos están localizados por un lado en
células tumorales y, por otro lado, en macrófagos, para dirigir
células asesinas (killer cells) contra un tumor (Bohlen, H. y col.,
Blood 83, 1803-1812, 1993). Estos
anticuerpos biespecíficos pueden producirse por fusión de dos
células de hibridoma, que producen los anticuerpos monoespecíficos
respectivos, para formar células de cuadroma (Milstein, C. y Cuello,
A.C., Nature 305, 537-540, 1983). Aparte de
los dos anticuerpos originales, estas células producen también
anticuerpos biespecíficos. Sin embargo, este método de producir
proteínas biespecíficas está limitado exclusivamente a los
anticuerpos. Además, solamente el 15% de los anticuerpos expresados
poseen la biespecificidad deseada. Estos anticuerpos tienen que
aislarse de la mezcla mediante métodos laboriosos de
purificación.
Un método mucho más eficaz de producir
anticuerpos biespecíficos y otras proteínas biespecíficas se basa en
la reticulación química de dos proteínas que tengan las propiedades
deseadas (Fanger, M.W. y col., Crit. Rev. Immunol. 12,
101-24, 1992). Esta reticulación se realiza mediante
moléculas engarce bifuncionales, que reaccionan con los grupos
amino de las proteínas o de los restos cisteína. En el último caso,
por ejemplo, los restos cisteína de una proteína pueden activarse
con el ácido
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico)
(DTNB) y la adición de la segunda proteína, que contiene los restos
cisteína en forma reducida, provoca la formación de disulfuros y,
de este modo, el enlace covalente de las dos proteínas. Aplicando
este método puede mejorarse considerablemente el rendimiento de
proteínas bifuncionales heterodiméricas, si se compara con la
reticulación no específica que normalmente da lugar a una porción
elevada de homodímeros. Sin embargo, el método de la reticulación
química da lugar a un material no homogéneo. Esta heterogeneidad
puede tener un impacto negativo en la estabilidad y en la
funcionalidad del constructo biespecífico (Debinski, W. y Pastan,
I., Bioconjug. Chem. 5, 40-43, 1994).
El método aplicado con mayor frecuencia para
producir proteínas bifuncionales es la formación de proteínas de
fusión a nivel genético. A tal fin se une el extremo 5' del cDNA de
una proteína con el extremo 3' del gen de otro proteína por métodos
de ingeniería genética, pero conservando el marco de lectura, y se
expresa el constructo por métodos recombinantes en procariotas o en
eucariotas. De esta manera se fusiona por ejemplo un fragmento de
anticuerpo dirigido contra un tumor con una toxina bacteriana
(Brinkmann, U. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
8616-8620, 1991). Esta inmunotoxina es capaz de
matar específicamente a células tumorales. Aparte de la toxina
bacteriana, las fusiones de fragmentos de anticuerpos se realizan
también con éxito con la RNasa y otras enzimas y su funcionalidad
se examina en cultivos celulares (Newton, D.I. y col., J. Biol.
Chem. 267, 19572-19578, 1992); Zewe, M. y
col., Immunotechnol. 3, 127-136, 1997).
Los llamados diacuerpos (diabodies) constituyen
otra forma de proteínas de fusión (Holliger, P. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993). Los
diacuerpos consisten en dos fragmentos Fv que tienen especificidades
diferentes. A diferencia de los fragmentos scFv, en los que dos
dominios variables de un anticuerpo están unidos entre sí mediante
un engarce (linker), en el caso de los diacuerpos el dominio VL de
un anticuerpo está fusionado con el dominio VH de un segundo
anticuerpo. La estructura del engarce empleado para este propósito
es tal que el engarce impide la asociación intramolecular de los dos
dominios y en su lugar se produce una asociación intermolecular de
dos constructos de este tipo, obteniéndose un diacuerpo
bifuncional.
En los últimos años se han realizado múltiples
intentos de desarrollar sistemas que puedan aplicarse en general a
la producción de proteínas bifuncionales. A tal fin se fusionan las
proteínas a nivel genético con péptidos o proteínas como dominios
de dimerización para conferir una asociación dirigida. Como unidades
de dimerización se emplean los dominios de anticuerpo CL y CHl,
calmodulina y el correspondiente péptido de unión o estreptavidina
(Müller, K.M. y col., FEBS Lett. 422,
259-264, 1998; Neri, D. y col., BioTechnology
13, 373-377, 1995; Dübel, S. y col., J.
Immunol. Methods 178, 201-209, 1995. Además,
las secuencias cortas de péptido, por ejemplo las cremalleras de
leucina y las hélices anfífilas, pueden utilizarse como unidades
funcionales para la heterodimerización dirigida (Kostelny, S.A. y
col., J. Immunol. 148, 1547-1553, 1992). Sin
embargo, hasta el presente no se ha impuesto ninguno de los métodos
de asociación directa como técnica que pueda aplicarse en
general.
Un objeto de la presente invención consiste en
proporcionar un engarce peptídico lineal que sea estable y fácil de
producir.
La invención se refiere a un engarce peptídico
lineal para unir compuestos biológicamente activos, dicho engarce
consta de un primer resto de engarce polipéptido que contiene de 1 a
3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos elegidos entre el grupo
formado por la arginina, la lisina y la ornitina, y un segundo resto
de engarce polipéptido que contiene de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12
aminoácidos ácidos elegidos entre el grupo formado por el glutamato
y el aspartato, dichos restos primero y segundo están unidos por
interacción iónica mediante sus numerosos aminoácidos cargados y
por puentes disulfuro covalentes entre sus cisteínas, cada uno de
dichos restos está unido por su extremo C y/o N con un compuesto
biológicamente activo.
En una forma preferida de ejecución de la
invención, dichos compuestos biológicamente activos difieren entre
sí por su estructura química. Es también preferido que dicho
compuesto sea un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o una
enzima.
La invención se refiere además a un método para
la producción de un polipéptido quimérico que consta de dos
polipéptidos biológicamente activos, unidos mediante un engarce
peptídico, para ello se expresan en una células hospedante
procariota o eucariota de forma simultánea o separada los ácidos
nucleicos que codifican a un primer resto de dicho polipéptido
quimérico que consta de un primer polipéptido biológicamente activo
y de un primer resto engarce polipéptido, que contiene de 1 a 3
cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos elegidos entre el grupo
formado por la arginina, la lisina y la ornitina, y a un segundo
resto de dicho polipéptido quimérico que consta de un segundo
polipéptido biológicamente activo y de un segundo resto engarce
polipéptido, que contiene de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12
aminoácidos ácidos elegidos entre el grupo formado por el glutamato
y el aspartato; dichos restos primero y segundo de dicho polipéptido
quimérico se recuperan de la célula hospedante o del líquido
sobrenadante celular y se ponen en contacto para permitir la
formación de una interacción poliiónica entre dichos restos
engarces polipéptidos primero y segundo, tratados con un agente
oxidante para formar dichos puentes disulfuro entre dichos restos
engarces polipéptidos y se aísla dicho polipéptido quimérico.
Con el método de la invención para producir
polipéptidos quiméricos es posible evitar esencialmente la formación
de homodímeros, en el supuesto de que los heterodímeros sean los
productos deseados.
La invención se basa en el hecho de que un resto
engarce polipéptido, que contiene de 4 a 12 aminoácidos básicos,
interacciona específicamente en solución acuosa de baja intensidad
iónica con un resto engarce polipéptido que contenga de 4 a 12
aminoácidos ácidos. Si ambos polipéptidos contienen además
cisteínas, en una reacción ulterior pueden formarse específicamente
puentes disulfuro entre las cisteínas de ambos restos engarces
polipéptidos en condiciones oxidantes o incluso ligeramente
reductoras. La distancia que separa dos cisteínas dentro de un
resto engarce polipéptido es con preferencia de más de un
aminoácido, con mayor preferencia de 3 a 6 aminoácidos. Esto
implica que la cantidad y la distancia de las cisteínas de ambos
polipéptidos serán con preferencia idénticas y que, si las
cisteínas de ambos polipéptidos ocupan posiciones recíprocamente
enfrentadas, entonces los aminoácidos ácidos de una hebra y los
aminoácidos básicos de la otra hebra ocuparán en cada caso
posiciones también enfrentadas. Una distancia idéntica de cisteínas
significa que en ambas hebras hay la misma cantidad de aminoácidos
diferentes de la cisteína que se hallan intercalados entre dichas
cisteínas.
Según la invención es posible unir entre sí dos
o más compuestos biológicamente activos mediante dichos restos
engarces polipéptidos primero y segundo en una forma estable y
covalente y en una posición espacialmente definida.
En otra forma preferida de ejecución de los
restos engarce de la invención, dichos restos engarces polipéptidos
primero y segundo se diseñan de modo que la posición de las
cisteínas y de los aminoácidos básicos y ácidos permitan una
interacción iónica optimizada entre los aminoácidos ácidos y básicos
y la unión mediante uno o más puentes disulfuro, en una forma
dirigida preseleccionada. De este modo es posible colocar a los
compuestos biológicamente activos en una posición espacial
preseleccionada entre sí. Por ejemplo, cuando los restos engarces
polipéptidos primero y segundo están en una posición, en la que se
tocan sus extremos terminados en N y en la que se tocan sus
extremos terminados en C, los compuestos biológicamente activos
pueden colocarse en una posición espacial muy próxima entre sí, si
ambos están unidos por su extremo C (o si ambos están unidos por su
extremo N) de los restos engarces polipéptidos. Si uno de los
compuestos biológicamente activos está unido por su extremo C y el
otro está unido por su extremo N del resto engarce polipéptido, la
distancia espacial entre ambos será mucho mayor. En tal caso, los
restos engarces polipéptidos primero y segundo dimerizados actúan
esencialmente como un engarce lineal entre dos compuestos
biológicamente activos, con preferencia entre dos polipéptidos. Un
procedimiento análogo puede adoptarse cuando cuatro compuestos
biológicamente activos se colocan en una posición espacial
determinada entre sí.
Se entiende por "polipéptido quimérico"
según la invención un polipéptido que consta de un primer y de un
segundo resto engarce polipéptido, dichos restos engarces difieren
químicamente y se componen de manera que se unan entre sí como
resultado de la interacción iónica entre los numerosos aminoácidos
que llevan cargas diferentes y que además están unidos por enlaces
covalentes entre sí gracias a los puentes disulfuro entre
cisteínas. Para producir polipéptidos quiméricos, las interacciones
poliiónicas entre los aminoácidos básicos y ácidos de los restos
engarces polipéptidos sirven para colocar a los polipéptidos en una
posición preseleccionada entre sí, dicha posición permite que los
puentes disulfuro se formen fácilmente. La finalidad de los
polipéptidos quiméricos consiste en unir entre sí a compuestos
biológicamente activos de una manera estable y predefinida,
evitando la formación de productos secundarios molestos (p. ej.
homodímeros o productos quiméricos, en los que los compuestos
biológicamente activos se hallan en una posición desfavorable entre
sí). Por lo general, el primero y el segundo restos engarces
polipéptidos no poseen de por sí actividad biológica significativa.
Son agentes meramente auxiliares que facilitan la unión de los
compuestos biológicamente activos, que en su forma dímera o
multímera son capaces de desarrollar un efecto farmacéutico
preseleccionado. Para la interacción iónica fuerte entre los restos
engarces polipéptidos es preferible que los valores pK_{a} de los
aminoácidos básicos y ácidos, que ocupan posiciones enfrentadas
entre sí en los restos engarces, debería diferir tanto como sea
posible. Por consiguiente, es preferido que el valor pK_{a} del
aminoácido básico se sitúe en 10 o más, mientras que el valor
pK_{a} del aminoácido ácido se sitúe en 4,5 o menos.
Los restos engarces polipéptidos constan de 1 a
3 cisteína y de 4 a 12 aminoácidos adicionales, que en el caso del
primer resto engarce polipéptido se eligen con preferencia entre el
grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina. También el
segundo resto engarce polipéptido consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a
12 aminoácidos ácidos, elegidos con preferencia entre el grupo
formado por el glutamato y el aspartato. En una forma preferida de
ejecución, el resto engarce polipéptido consta de 6 a 10 aminoácidos
básicos o ácidos. Es también preferido que los restos engarces
polipéptidos contengan cada uno un resto cisteína. Sin embargo
pueden utilizarse también otros aminoácidos ácidos o básicos o
derivados de los mismos según la invención, en el supuesto de que
sus valores pK_{a} difieran de modo considerable (la diferencia
preferida es de 5 o más unidades) y la interacción iónica permita la
unión de los dos restos engarces polipéptidos.
En calidad de compuesto biológicamente activo
puede utilizarse cualquier compuesto biológicamente activo que se
desee.
El término "compuesto o material
biológicamente activo" empleado aquí significa, pues, una
molécula orgánica, incluyendo a un fármaco, una macromolécula
biológica, por ejemplo un péptido, una proteína, un hidrato de
carbono (incluidos los monosacáridos, oligosacáridos y
polisacáridos), una nucleoproteína, una mucoproteína, una
lipoproteína, un péptido o una proteína sintéticos, o una molécula
pequeña unida a un proteína, glucoproteína, esteroide, ácido
nucleico (cualquier forma de DNA, incluido el cDNA, o RNA o un
fragmento del mismo), nucleótidos, nucleósidos, oligonucleótidos
(incluidos los oligonucleótidos antisentido), los genes, los
lípidos, las hormonas, las vitaminas, incluidas la vitamina C y la
vitamina E, o una combinación de los mismos, que produce un efecto
biológico cuando se administra "in vivo" a un animal,
incluidos pero sin limitarse a ellos: las aves y los mamíferos,
incluidos los humanos.
El término "fármaco" empleado aquí indica
cualquier sustancia empleada por vía interna o externa como
medicamento para el tratamiento, curación o prevención de una
enfermedad o trastorno e incluye pero no se limita a:
inmunosupresores, antioxidantes, anestésicos, agentes
quimioterapéuticos, esteroides (incluidos los retinoides), hormonas,
antibióticos, antivíricos, antifúngicos, antiproliferantes,
antihistaminas, anticoagulantes, agentes contra el envejecimiento
provocado por la luz, péptidos melanotrópicos, compuestos
antiinflamatorios no esteroideos y esteroideos y absorbentes de
radiación, incluidos los absorbentes UV.
El término "agente biológicamente activo"
incluye también los agentes del tipo insecticidas, pesticidas,
fungicidas, rodenticidas, nutrientes vegetales y promotores de
crecimiento.
Las macromoléculas biológicas que tienen con
preferencia un peso molecular comprendido entre dos o tres mil y
muchos millones son importantes reguladores de las funciones
fisiológicas. El tamaño y la estructura terciaria de una
macromolécula biológicamente activa contienen información química
significativa relativa a interacciones muy específicas con
receptores, enzimas, ácidos nucleicos y otros mediadores biológicos
que interaccionan con ella. Los episodios tan diversos como la
trombosis, las respuestas inflamatorias e inmunológicas se
controlan, por lo menos en parte, por la topología tridimensional
de las moléculas. La superficie de la macromolécula se compone de
grupos distribuidos geométricamente, que imparten el carácter
iónico, hidrófobo, estérico, electrostático y de enlace de hidrógeno
a la molécula y proporcionan un molde molecular para la unión con el
receptor.
Los mucopolisacáridos ácidos, también llamados
glucosaminoglucanos (GAG), constan de unidades disacárido
repetitivas, cada una de las cuales contiene un derivado de una
aminohexosa, por lo general la D-glucosamina o la
D-galactosamina. Por lo menos uno de los dos
azúcares de la unidad disacárido repetitiva de los mucopolisacáridos
ácidos contiene un grupo ácido que tiene una carga negativa a pH 7,
ya sea un grupo carboxilato, ya sea un grupo sulfato. Un
mucopolisacárido ácido importante es la heparina, que se genera en
ciertos tipos de células, que son especialmente abundantes en el
forro de los vasos sanguíneos arteriales. La heparina es un
inhibidor muy potente de la coagulación de la sangre y ayuda a
prevenir la formación de coágulos sanguíneos en la sangre circulante
(Jackson, R.L. y col., Physiol. Reviews 71,
481-522, 1991).
Se sabe que los GAG son mediadores de procesos
celulares (angiogénesis, desarrollo de células nerviosas,
proliferación de células de músculo liso), expresión genética y
homeostasis. El GAG interacciona con el DNA (Davidson, J.N., en:
"The biochemistry of the nucleic acids", Methuem, Londres,
1969).
Tanto el DNA como el GAG (por ejemplo la
heparina) son polímeros lineales que tienen cargas polianiónicas,
que son esenciales para la actividad biológica. La rigidez de la
hélice del DNA asegura que los ácidos nucleicos de secuencias
específicas se presentarán de manera que se obtenga una interacción
biológica deseada.
Las proteínas son las macromoléculas más
abundantes de las células, constituyendo más de la mitad de su peso
seco. Se sabe que las proteínas y los péptidos contienen información
química en sus estructuras terciarias. Un gran número de proteínas
de origen natural se conjugan con otros grupos químicos. Son
ejemplos de ello las lipoproteínas, las glucoproteínas, las
fosforoproteínas, las hemoproteínas, las flavoproteínas y las
metaloproteínas.
Las proteínas tienen funciones biológicas
diversas. Los ejemplos no limitantes son: proteínas de transporte
(p. ej. hemoglobina y la albúmina del suero), las proteínas
nutrientes y de almacenaje (por ejemplo la gliadina, la ovalbúmina,
la caseína y la ferritina), las proteínas contráctiles o móviles (p.
ej. la actina, la miosina, la tubulina y la dineína); las proteínas
estructurales (por ejemplo, la queratina, la fibroína, el colágeno,
la elastina y los proteoglucanos); los proteínas de defensa (p. ej.
los anticuerpos, las inmunoglobulinas, el fibrinógeno, la trombina,
la toxina botulina, la toxina de la difteria, el veneno de la
serpiente y el ricino); las enzimas y las proteínas reguladoras (p.
ej. la insulina, las hormonas de crecimiento, la corticotropina y
los represores).
Las hormonas se cla sifican en hormonas
peptídicas, por ejemplo el factor de liberación de la tirotropina,
la corticotropina, la vasopresina, la insulina y el glucagón;
hormonas amínicas, por ejemplo la adrenalina y la tiroxina; u
hormonas esteroideas, por ejemplo el cortisol, el
beta-estradiol, la testosterona y la progesterona.
Otros ejemplos de hormonas importantes incluyen, pero no se limitan
a: hormonas que liberan la adrenocorticotropina, hormonas que
liberan la somatotropina, la somatostatina, hormonas que liberan la
prolactina, hormonas que inhiben la prolactina, hormonas que
liberan el FSH y el LH, la vasopresina y la oxitocina.
Los compuestos terapéuticos biológicamente
activos pueden elegirse también entre el grupo general formado por
los agentes antineoplásicos, agentes antiinfecciosos, agentes
antidepresivos, agentes antivíricos, agentes antinociceptivos,
agentes ansiolíticos y hormonas.
Los ejemplos representativos de agentes
antineoplásicos útiles para las composiciones y métodos de la
presente invención incluyen al metotrexato, taxol, factor de
necrosis tumoral, clorambucilo, interleucinas, bleomicina,
etopósido, fluoruracilo y vinblastina.
Los ejemplos representativos de agentes
antiinfecciosos útiles para las composiciones y métodos de la
presente invención incluyen a la pentamidina, metronidazol,
penicilina, cefalexina, tetraciclina y cloranfenicol.
Los ejemplos representativos de agentes
antivíricos útiles para las composiciones y métodos de la presente
invención incluyen a la didesoxicitidina, zidovudina, aciclovir,
interferonas, didesoxiinosina y ganciclovir.
Los ejemplos representativos de ansiolíticos y
sedantes útiles para las composiciones y métodos de la presente
invención incluyen a las benzodiazepinas, por ejemplo el diazepam,
los barbituratos, por ejemplo el fenobarbital y otros compuestos,
por ejemplo la buspirona y el haloperidol.
Los ejemplos representativos de hormonas útiles
para las composiciones y métodos de la presente invención incluyen
al estradiol, prednisona, insulina, hormonas de crecimiento,
eritropoyetina y prostaglandinas.
Los ejemplos representativos de agentes
antidepresivos útiles para las composiciones y métodos de la
presente invención incluyen a la fluoxetina, trazodona, imipramina y
doxepina.
Los ejemplos representativos de antinociceptivos
útiles para las composiciones y métodos de la presente invención
incluyen a la hidromorfina, la oxicodona, el fentanilo, la morfina y
la meperidina.
La anterior lista de compuestos terapéuticos
biológicamente activos es meramente ilustrativa y no pretende
limitar el alcance de la presente invención en modo alguno. En las
composiciones y métodos de la presente invención podrían utilizarse
muchas otras clases de compuestos farmacológicos, incluidos los
anestésicos locales, las vitaminas, las vacunas, los estimuladores
de curación de heridas, los inmunosupresivos, los
anti-eméticos, los agentes
anti-malaria, los agentes antifúngicos, los
antisicóticos, los antipiréticos, los coagulantes, los diuréticos,
los bloqueadores de canales del calcio, los agentes
broncodilatadores, etc.
Los compuestos biológicamente activos pueden
unirse a restos engarces polipéptidos según métodos ya conocidos de
la técnica, por ejemplo mediante enlace químico a través de los
grupos reactivos, por ejemplo los grupos amino o carboxilo. Tales
métodos se han descrito por ejemplo en Mattson y col., Mol. Biol.
Rep. 17, 167-183, 1993.
Si el compuesto biológicamente activo es un
polipéptido, entonces es también posible construir un ácido nucleico
que contenga de uno de dichos restos engarces polipéptidos primero
o segundo y la secuencia de uno o más polipéptidos que sean
compuestos biológicamente activos, expresarlos por medios
recombinantes en células hospedantes procariotas o eucariotas,
recuperar los polipéptidos recombinantes y unirlos entre sí según la
invención.
Es especialmente preferido construir
polipéptidos quiméricos, en los que los compuestos biológicamente
activos son dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos diferentes
(fragmentos Fav, Fc, Fv) o en los que un compuesto biológicamente
activo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo y el otro es un
polipéptido que tiene actividad enzimática, por ejemplo quinasas,
fosfatasas, RNasas, toxinas o actividades específicas de fijación,
por ejemplo los factores de transcripción.
Es también preferido utilizar como primer
compuesto biológicamente activo una sustancia que se fija
específicamente sobre las superficies de las células, mientras que
el otro compuesto biológicamente activo es un compuesto
farmacéuticamente activo, que desarrolla su efecto terapéutico en
este sitio. En este contexto, por ejemplo, el primer compuesto
biológicamente activo puede ser un ligando para una molécula de
superficie celular, p. ej. el CD40 o el CD40L (CD154) y el segundo
compuesto biológicamente activo puede ser un compuesto
farmacéuticamente activo, por ejemplo un ácido nucleico antisentido
o un compuesto citostático.
Otros ejemplos de uso terapéutico serían un
anticuerpo específico de un tumor como primer compuesto
biológicamente activo y un segundo compuesto biológicamente activo
sería una exototoxina de pseudomonas, la toxina de la difteria, los
factores de transcripción que activan la producción del p53 u otros
factores que inducen la apóptosis.
Otra combinación de compuestos biológicamente
activos podría ser la asociación del dominio de fijación
gp120-HIV del CD4 y cualquier fármaco antivírico o
citotóxico capaz de bloquear la maduración vírica o de matar la
célula infectada.
Con la invención pueden crearse no sólo
oligómeros bifuncionales sino también multifuncionales, utilizando
como uno de los compuestos (no necesariamente biológicamente activo)
un sistema multivalente que permita la asociación covalente a
través de las interacciones poliiónicas y un puente disulfuro entre
los diferentes compuestos biológicamente activos. Por ejemplo, una
cápsula vírica que contenga diversas secuencias peptídicas
poliiónicas podría proporcionar una matriz multivalente de este
tipo.
Según la invención se expresan los ácidos
nucleicos que codifican a los dos restos engarces polipéptidos
mencionados, que están unidos entre sí para formar un polipéptido
biológicamente activo, en una célula hospedante procariota o
eucariota de modo simultáneo o separado, se recuperan los
polipéptidos de la célula hospedante o del líquido sobrenadante, se
tratan con un agente oxidante para formar dichos puentes disulfuro y
se aísla dicho polipéptido quimérico. Estos métodos de
"naturalización" se describen por ejemplo en la patente
US-4,933,434, páginas 453, 363 y en la patente
US-5,593,865.
Según la invención, en el primer paso, se unen
los restos engarces polipéptidos primero y segundo mediante la
interacción iónica en un pH neutro o ligeramente básico (con
preferencia un pH de 7 a 8,5) y de intensidad iónica baja (con
preferencia de 0 a 200 mmoles/l de NaCl). En el segundo paso se unen
directamente los restos engarces polipéptidos con enlace covalente
mediante el puente disulfuro, para ello se forma un puente disulfuro
y los dos restos engarces polipéptidos quedan unidos mediante dicho
puente disulfuro en condiciones oxidantes o ligeramente reductoras.
En una forma preferida de ejecución de la invención se emplea el GSH
en combinación con el GSSG, situándose la proporción entre GSH y
GSSG entre 5:1 y 1:5, a un valor de pH entre neutro y débilmente
básico.
Figura 1. Formación del heterodímero
ACE8-ACK8 unido por puente disulfuro en función de
la concentración de NaCl del tampón. Se representan las cantidades
relativas de ACK8 (\Delta), el disulfuro mixto entre ACK8 y GSSG
(ACK8-SG, \Box) y el heterodímero
ACE8-ACK8 unido con puente disulfuro
(\bullet).
Figura 2. Formación del heterodímero
ACE8-ACK8 unido con puente disulfuro en función del
potencial redox del tampón. Se representan la cantidad del
heterodímero ACE8-ACK8 (\bullet) y del péptido
ACK8 no convertido (\Box).
Figura 3. Se analiza la formación del
heterodímero ACE8-ACK8 unido mediante puente
disulfuro en función de un exceso molar décuple de un péptido de
laminina que contiene cisteína y de
\alpha-glucosidasa, respectivamente.
Figura 4. SDS-PAGE (18%) teñido
con Coomassie en condiciones reductoras para poner de manifiesto la
asociación directa de las VLP con el dsFv; pistas: (1) dsFv
disociado en VH y VL; (2) reacción de asociación entre el tipo
salvaje de las VLP y el dsFv en presencia de 200 mM de NaCl; (3)
reacción de asociación entre las VLP construido con
VPl-Glu y dsFv en presencia de 750 mM de sulfato
amónico; (4) reacción de asociación entre las VLP construidas con
VPl-Glu y dsFv en presencia de 200 mM de NaCl; (5)
marcador de peso molecular.
Figura 5. Perfil de elución de la reacción de
asociación de FabD10SCP y
\alpha-glucosidasa-R10CGP de baja
intensidad iónica (TosoHaas TSK 2000 SWXL; 50 mM
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} de pH 7,0; 300 mM NaCl; caudal:
0,75 ml/min; volumen de columna: 14,335 ml). Se representan los
resultados del ensayo de bifuncionalidad (ELISA modificado) que
detecta solamente las moléculas que contienen tanto el
th-Fab como la \alpha-glucosidasa.
Se incuban partes alícuotas de 100 \mul de las fracciones eluidas
con 1 ml de una solución de creatina-quinasa
biotinilada (5% de reactivos de bloqueo) en tubos recubiertos con
estreptavidina a temperatura ambiente durante 1 h; después de lavar
dos veces con tampón salino alto (2M NaCl; 10 mM
Tris-HCl, pH 7,5) y una vez con tampón salino bajo
(10 mM Tris-HCl, pH 7,5) se incuban los tubos con
800 \mul de paranitroglucopiranósido 2 mM en 100 mM
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} de pH 6,8, a 30ºC durante 3 h;
se mide la absorbancia en una longitud de onda de 405 nm frente a un
patrón. La fracción de peso molecular elevado que contiene la
proteína quimérica presenta la actividad bifuncional más elevada. La
presencia de la \alpha-glucosidasa no asociada se
manifiesta en una señal de fondo baja.
La asociación específica y el enlace covalente
de péptidos mediante interacciones poliiónicas y un puente
disulfuro se analiza utilizando péptidos poliiónicos (SEQ ID NO: 1)
AlaCysGluGluGluGluGluGluGluGlu (ACE_{8}) y SEQ ID NO: 2)
AlaCysLysLysLysLysLysLysLysLys (ACK_{8}). Todos los péptidos se
sintetizan en un aparato del tipo ABI Applied Biosystem Peptide
Syntetizer 431A con arreglo al método Fmoc. Se disuelve un 1 mM de
péptido en una solución 20 mM de borato sódico, de pH 8,5, 2 mM de
EDTA (concentración comprobada con arreglo a Ellman, G.L., Arch.
Biochem. Biophys. 82, 70-77, 1959).
Se analiza la formación de heterodímeros unidos
mediante puente disulfuro por cromatografía de intercambio
catiónico. Se introducen las muestras en una columna POROS 20 HS
(volumen de columna: 1,7 ml, equilibrada con 50 mM fosfato sódico,
de pH 7,0). Se realiza la elución con un gradiente lineal de NaCl
entre 0 y 2 M y un caudal de 4 ml/min. Se eluye el péptido ACK8 en
1070 mM NaCl, el disulfuro mixto de ACK8 y glutationa
(ACK8-SG) a 800 nM NaCl y el heterodímero
ACK8-ACE8 unido mediante puente disulfuro a 350 mM
NaCl. El ACE8 no se fija sobre la columna. Se cuantifican las
cantidades de los péptidos integrando las áreas de los picos de la
absorción a 205 nm (programa informático de Pharmacia Unikorn).
Se mide la especificidad de la asociación de los
péptidos ACK8 y ACE8 en función de diferentes parámetros.
- b)
- influencia de la intensidad iónica
- c)
- importancia del potencial redox para la formación del puente disulfuro entre los péptidos
- d)
- competición de asociación entre péptidos no cargados que contienen cisteína y proteínas.
Se convierte el ACK8 200 \muM en la forma
disulfuro mixto ACK8-SG utilizando GSSG 10 mM en un
tampón borato sódico 500 mM, de pH 8,5. Se purifica este disulfuro
mixto por cromatografía de intercambio iónico. Se efectúa la
asociación específica y la reacción redox de ACE8 20 \muM y del
ACK8-SG disulfuro mixto en borato sódico 20 mM, de
pH 8,5, EDTA 2 mM, a 25ºC, en presencia de NaCl en una concentración
entre 0 y 1 M. Después de incubar durante 30 min se bloquea la
reacción redox ulterior añadiendo 20 mM yodoacetamida. Los análisis
de formación de heterodímeros se realizan por cromatografía de
intercambio catiónico ya descritos anteriormente.
El heterodímero ACK8-ACE8 unido
por puente disulfuro se forma cuantitativamente en una concentración
de NaCl inferior a 20 mM. En concentraciones salinas más elevadas
resulta suprimida la interacción poliiónica entre los péptidos,
conduciendo a rendimientos más bajos de formación de
heterodímeros.
Se incuban 50 \muM ACK8 y 75 \muM ACE8 en
100 mM fosfato sódico, de pH 8,5, 2 mM EDTA, a 25ºC en presencia de
2,5 mM sustancias redox (GSH y GSSG). Se varía el potencial redox
cambiando la relación entre el GSH y el GSSG. Después de una
incubación de 5 h se interrumpe la reacción añadiendo 100 mM
yodoacetamida y se analiza del modo descrito antes.
La asociación específica y el enlace covalente
de los péptidos ACE8 y ACK8 tienen lugar incluso en condiciones
reductoras. La formación del heterodímero ACE8-ACK8
es cuantitativa en condiciones redox de GSH^{2}/GSSG = 1:1
(mM).
La especificidad de la formación del puente
disulfuro entre ACE8 y ACK8 se analiza utilizando en ensayo de
competencia. Se incuban 25 \muM ACK8 y 37,5 \muM ACE7 en 100 mM
borato sódico de pH 8,5, 2 mM EDTA, 0,5 mM GSH, 2 mM GSSG en
presencia de 250 \muM de nonapéptido laminina (secuencia:
CysAspProGlyTyrIleGlySerArg, SEQ ID NO: 3). En otro ensayo se crea
el potencial redox del tampón con 1,65 mM GSH y 0,85 mM GSSG. Como
control se realizan los mismos ensayos en ausencia del péptido
laminina. Después de una incubación de 2 h se bloquea la reacción
por acidificación (pH 2) y se analizan los productos por
HPLC-RP. La cantidad de ACE8-ACK8
heterodímero de los controles se iguala al 100% y se analiza el
rendimiento de la formación de heterodímeros en los ensayos de
competencia.
\newpage
Como segundo competidor se emplea la
\alpha-glucosidasa (68,1 kDa). Esta proteína
contiene 5 cisteínas, accesibles para reactivos tiol de bajo peso
molecular. Se incuban 25 \muM ACK8 y 36,5 \muM ACE8 en borato
sódico, pH 8,5, 2 mM EDTA, en presencia de 60 \muM
\alpha-glucosidasa. Las dos condiciones redox
diferentes son idénticas a las descritas antes. Los análisis se
realizan por HPLC-RP.
La formación del ACE8-ACK8
heterodímero y unido con enlace covalente no resulta influenciado
por la adición de un exceso de péptido laminina ni
\alpha-glucosidasa, respectivamente. En base a las
interacciones poliiónicas entre el ACE8 y el ACK8, la dimerización
de estos péptidos para formar el ACE8-ACK8 es muy
específica.
Se combina la actividad de fijación sobre
antígeno del fragmento Fab del MAb 33 (anticuerpo monoclonal 33)
con la actividad enzimática de la
\alpha-glucosidasa utilizando péptidos poliiónicos
de fusión, lo cual conduce a la formación de un derivado anticuerpo
bifuncional (polipéptido quimérico).
Se modifica genéticamente el fragmento Fab del
mAb 33 de modo que contenga un péptido de fusión cargado
negativamente, con un resto cisteína adicional en su extremo C:
AspAspAsp-AspAspAspAspAspAspAspSerCysPro (abreviado
como D_{10}SCP, SEQ ID NO: 4). La cadena del segundo péptido es
un derivado de la \alpha-glucosidasa PI del
Saccharomyces cerevisiae que lleva un péptido de fusión con
extremo C cargado positivamente
(ArgArgArgArg
ArgArgArgArgArgArgCysGlyPro (abreviado como R_{10}CGP, SEQ ID NO: 5).
ArgArgArgArgArgArgCysGlyPro (abreviado como R_{10}CGP, SEQ ID NO: 5).
La formación de la proteína quimérica incluye
los pasos siguientes:
I. Producción de un fragmento Fab con un péptido
poliiónico de fusión de extremo terminado en C,
- a)
- Construcción de vectores de expresión,
- b)
- Expresión en E. coli, aislamiento de los cuerpos de inclusión, solubilización y renaturalización,
- c)
- Purificación por cromatografía de intercambio aniónico.
\vskip1.000000\baselineskip
II. Producción de la
\alpha-glucosidasa con un péptido poliiónico de
fusión de extremo terminado en C,
- a)
- Construcción del vector de expresión,
- b)
- Expresión en E. coli en forma soluble,
- c)
- Purificación por cromatografía de intercambio iónico.
\vskip1.000000\baselineskip
III. Formación de una proteína quimérica unida
con puente disulfuro mediada por péptidos poliiónicos de fusión
\vskip1.000000\baselineskip
Se utiliza el fragmento Fab del mAb (anticuerpo
monoclonal) 33 como una parte de la proteína quimérica. El mAb 33
es un anticuerpo murino del subgrupo kIgGl dirigido contra la
creatina-quinasa humana dímera, específica del
músculo (CK-MM E. C. 2.7.3.2.) (Buckel y col., Gene
51, 13, 1987). El fragmento Fab del mAb 33 contiene un enlace
disulfuro entre la cadena ligera k (25 kD) y la cadena pesada fd (25
kD).
Se codifica la cadena ligera del mAb 33 en el
plásmido pBT1111, que es un derivado del plásmido
pBR223-3. La secuencia y la estrategia de clonación
se describen en el documento EP-0 364 926 B1. Para
la expresión se transforma el plásmido en células hospedantes de
E. coli que contienen el plásmido pUBS520 (Brinkmann y col.,
Gene 85, 109-114, 1989).
Se inicia la construcción del vector con un
plásmido p12016 que codifica a la cadena pesada del mAb 33 (Buckel
y col., Gene 51, 13, 1987). Las secuencias de nucleótido que
codifican a los dominios Ch2 y Ch3 de la cadena pesada se someten a
deleción y se añade una secuencia de nucleótido que codifica a un
péptido poliiónico con una cisteína en su extremo C en el dominio
ch1, aplicando una mutagénesis con cebador. La secuencia de
nucleótidos contiene codones auxiliares en su extremo 5' que
codifican a los cinco restos aminoácido del extremo N de la
\beta-galactosidasa (ITNSR) con el fin de
facilitar la expresión de la proteína en la E. coli. Se
amplifica el cDNA que codifica al fragmento fd con los cebadores 1
y 2 mediante PCR. Se inserta en el extremo 5' un sitio de
restricción NdeI. En el extremo 3' se insertan un sitio de
restricción Hind III y la secuencia de nucleótidos del péptido
poliiónico con la cisteína adicional.
Se lleva a cabo la PCR con los cebadores
siguientes:
- Cebador delantero: NdI Fd de extremo N (SEQ ID NO: 6):
- 5'-GCG TTA GCC ATA TGA CCA TGA TTA CGA ATT CCC GG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
- Cebador inverso de la variante fdD_{10}SCP (SEQ ID NO: 7):
- 5'-CAT AGT CCC AAG CTT TTA CGG GCA AGA ATC ATC GTC ATC ATC ATC GTC GTC ATC ATC ACC ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3'
El fragmento cDNA modificado se clona en el
vector pET-11a (Novagen), que pertenece a los
sistemas de expresión T7 (Studier, F.W. y Moffatt, B.A., J. Mol.
Biol. 189, 113, 1986). Para la expresión se transforma el
vector en células hospedantes que contengan el plásmido pUBS520. El
plásmido pUBS520 (Brinkmann y col., Gene 85,
109-114, 1989) codifica al tRNA que es necesario
para la traducción de los codones AGA y AGG que raramente aparecen
en la E. coli.
Se realizan los cultivos en medio salino mineral
con glucosa como única fuente de carbono, a 37ºC, en una escala de
5 litros, en un fermentador. Cuatro horas después de la inducción
con 0,4 mM IPTG se recogen las células por centrifugación (5000
rpm; 20 min; 4ºC). Se almacena la biomasa a -70ºC. La proteína
recombinante sobreexpresada se acumula en cuerpos de inclusión en
el citosol bacteriano. Se aíslan los cuerpos de inclusión con
arreglo a Rudolph y col., Folding Proteines, en: T.E. Creighton
(coord.): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996); y se
almacenan a -20ºC. Se solubilizan los agregados proteicos en
clorhidrato de guanidina 6 M (100 mM TRIS-HCl, pH
8,5; 1 mM EDTA; 100 mM DTT) a 4ºC durante una noche. Se reduce el pH
a 4,0 utilizando HCl 0,5 M y se separa el material no solubilizado
por centrifugación (20.000 rpm; 30 min; 4ºC). Se dializa con
profusión la solución frente a clorhidrato de guanidina 4 M, pH 4,0,
con el fin de eliminar el ditiotreitol. Se determina la
concentración de proteína por espectrofotometría utilizando como
patrón un fragmento Fab auténtico, desnaturalizado y reducido.
Se diluye la proteína desnaturalizada 100 veces
en tampón de renaturalización (1 M Tris/HCl, pH 8,0; 2 mM EDTA; 2,4
mM GSSG/0,6 mM GSH) hasta una concentración proteica final de 10
\mug/ml. Se realiza la renaturalización a una escala de 10 litros
a 15ºC durante 150 h. Se comprueba la funcionalidad de los
fragmentos Fab renaturalizados con un ELISA con arreglo a Buchner,
J. y Rudolph, R., Bio/Technology 9, 157, 1991. Se centrifuga
la solución de proteína renaturalizada (13.000 rpm; 30 min; 4ºC)
con el fin de separar los agregados de peso molecular más elevado y
se concentra el líquido sobrenadante por filtración de flujo cruzado
(ultrafiltración con flujo tangencial; sistema ProVario 3; filtro
cassette: Minisette OMEGA FSQ; corte en: 8 kD). Se dializa el
material retenido del fragmento Fab con el péptido de fusión
poliaspartato (abreviado como FabD_{10}SCP) frente a 20 mM
Tris/HCl de pH 8,0.
Se purifica el fragmento FabD_{10}SCP por
cromatografía de intercambio aniónico empleando una columna Resource
Q (Pharmacia, volumen de columna: 6 ml). Se realiza la elución en
un gradiente lineal de cloruro sódico, de 0 a 1 M en 20 mM
Tris-HCl, pH 8,0, a lo largo de 20 volúmenes de
columna, con un caudal de 6 ml/min. Se eluye el FabD_{10}SCP en
una concentración de NaCl de 300 mM. Se separa eficazmente el dímero
de las cadenas fdD_{10}SCP unidas con puente disulfuro, de peso
molecular más elevado, que eluye en una concentración de cloruro
sódico de 400 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
El tipo salvaje de la
\alpha-glucosidasa del Saccharomyces
cerevisiae es una proteína monómera que tiene un peso molecular
de 68 kDa. Contiene cinco cisteínas, que no intervienen en la
formación de puentes disulfuro. Para las investigaciones presentes
se construye genéticamente una proteína de fusión que consta de
\alpha-glucosidasa PI y un péptido de fusión
deca-arginina en extremo C con una cisteína, glicina
y prolina adicionales.
El vector pKK177-3/GlucPI
descrito por Kopetzki y col., Mol. Gen. Genet. 216, 149,
1989, codifica a la \alpha-glucosidasa PI del
Saccharomyces cerevisiae. El vector de expresión es un
derivado del pKK223-3 (Brosius, J. y Holy, A.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6929, 1984), que contiene un
promotor tac y un gen de \beta-lactamasa. Se
modifica el vector de manera que contenga un solo sitio de
restricción EcoRI en la posición 1600 del gen de la
\alpha-glucosidasa. El péptido de fusión que
codifica a diez restos arginina, uno de cisteína, uno de glicina y
uno de prolina se inserta en el extremo C por mutagénesis con
cebador aplicando técnicas estándar de DNA recombinante. La PCR se
realiza utilizando las siguientes secuencias de cebador:
- Cebador delantero EcoRI1600 (SEQ ID NO: 8):
- 5'-CAT AAG AGT ACG GAG ACA AGA CGC TGT TTG C-3'
\vskip1.000000\baselineskip
- Cebador inverso R10CGP (SEQ ID NO: 9):
- 5'-AAA CAG AAG CTT ATT ATG GTC CAC ATC GAC GTC GAC GAC GCC GGC GAC GTC GGC GTT TGA CCA GGT AGA TTC TAC C-3'
Después de la digestión del vector y de los
productos de la PCR con el EcoRI y el Hind III, se someten a
ligación.
Para la expresión se transforma el vector en
E. coli C600 (Appleyard, R.K., Genetics 39, 440, 1954),
pFDX500 - LacI^{q} en pACYC177 (Chang, A.C.Y. y Cohen, S.N., J.
Bacteriol. 134, 1141, 1978). El cultivo y la inducción se realizan
con arreglo a Kopetzki y col., Mol. Gen. Genet. 216, 149,
1989. Se incuban las células en un medio del tipo Luria Broth (LB)
suplementado con un 2% de glucosa a 37ºC. Para la inducción se
reduce el pH de 7,0 a 5,0 con ácido fosfórico (3 M) y se reduce la
temperatura a 24ºC. En combinación con la inducción limitada en
presencia de un 0,5% de lactosa, la
\alpha-glucosidasa se acumula predominantemente en
forma soluble en el citosol. Seis horas después de la inducción se
recogen las células por centrifugación (5000 rpm; 4ºC; 10 min) y se
lavan con 10 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH 6,8; 10 mM
EDTA. Se almacena la biomasa a -20ºC.
Se suspenden de nuevo 10 g de biomasa en 50 ml
de tampón (10 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH 6,8; 10
mM EDTA). Se desintegran las células por homogeneización de alta
presión (Gaulin MicronLab 40; 1200 bar; 2 pasadas). Después se
incuba el extracto en bruto en presencia de 15 mM MgCl_{2} y 1
U/ml de benzonasa (Merck, Darmstadt) a 4ºC durante dos horas. Se
separan por centrifugación (20.000 rpm; 4ºC; 2 h) los cascotes de
las células insolubles.
Se purifica el líquido sobrenadante del extracto
en bruto por cromatografía de intercambio catiónico en una columna
Resource 5 (Pharmacia; 6 ml). Se eluye la fracción proteica que
contiene actividad de \alpha-galactosidasa en una
concentración de NaCl de 350 mM en un gradiente lineal de 0 a 500 mM
de NaCl (tampón: 10 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH
6,8; 10 mM EDTA) a lo largo de 20 volúmenes de columna, con un
caudal de 6 ml/min. Se determina la actividad enzimática por
espectrofotometría con arreglo a Kopetzki y col., Yeast 5,
11, 1989, a 405 nm y 30ºC empleando como sustrato artificial 2 mM
de para-nitrofenilglucopiranósido (PNGP) (Sigma) en
100 mM K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH 6,8; 10 mM EDTA (ver
Kopetzki y col., Yeast 5, 11, 1989).
\vskip1.000000\baselineskip
La asociación se realiza en 20 mM
Tris-HCl, pH 7,5; 2 mM EDTA, en presencia de un
sistema redox. Se utilizan la glutationa oxidada y reducida en una
proporción molar de 10:1 y con una concentración total de 2 mM (1,8
mM GSSG/0,2 mM GSH). Se incuban los polipéptidos en cantidades
equimolares (3 \mumoles/l) a 20ºC durante 48 h. Para el análisis
se interrumpe la reacción con yodoacetamida (concentración final: 20
mM en Tris-HCl, de pH 8,0) y se separan las
muestras en un SDS-PAGE del 12% en condiciones
oxidantes y reductoras. Se detectan las pistas que contienen Fab por
revelado inmune (immunobloting) en nitrocelulosa.
Como alternativa se separan los productos de
reacción en una columna de filtración a través de gel (TSKgel 2000
SW_{XL}; TosoHaas) en un tampón 50 mM
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4}, que contiene 300 mM NaCl, con
un caudal de 0,75 ml/min, utilizando un aparato filtrador del tipo
Vision Workstation (BioCad Vision station: Perspective
Biosystems).
Biosystems).
Se inyectan en la columna 200 \mul de la
mezcla de la reacción de asociación. Se analizan las fracciones para
determinar la funcionalidad de fijación de antígeno, la actividad
enzimática y la bifuncionalidad. La bifuncionalidad se detecta con
un sistema ELISA modificado: incubación en presencia de la
creatina-quinasa biotinilada a temperatura ambiente
durante una hora en tubos recubiertos con estreptavidina (Roche
Diagnostics GmbH) y posterior lavado, dos veces, con tampón de alto
contenido en sal (2 M NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 7,5)
y una vez con tampón de bajo contenido en sal (10 mM
Tris-HCl, pH 7,5) y detección a 405 nm después de
una incubación de 3 horas con 2 mM pNPG en 100 mM
K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4}, de pH 6,8, a 30ºC. Las reacciones
de asociación se efectúan en ausencia y en presencia de 500 mM
NaCl. La asociación de la especie individual se investiga también
en una intensidad iónica baja y elevada. Como control se incuba el
FabD_{10}SCP con el tipo salvaje de la
\alpha-glucosidasa.
La especie individual incubada sola no reacciona
con el producto de peso molecular más alto en una intensidad iónica
baja, tampoco en la alta. Además, el FabD_{10}SCP no reacciona con
el tipo salvaje de la \alpha-glucosidasa. La
reacción del FabD_{10}SCP con
\alpha-glucosidasa-R_{10}CGP en
ausencia de NaCl puede la única que permitió obtener un producto
dotado de actividad bifuncional.
La asociación covalente de las VLP de la
proteína de cubierta de polioma VP1 y los fragmentos Fv unidos
mediante puente disulfuro (ds-Fv) del mAb B33,
basada en secuencias de péptidos poliiónicos de ingeniería genética,
es otro ejemplo de la presente invención. La invención incluye la
producción de las VLP, la producción de los fragmentos
ds-Fv y la posterior asociación.
I) Producción de las VLP
- a)
- Inserción de un péptido poliiónico en el VP1 a nivel de cDNA y expresión en E. coli
- b)
- Purificación de la proteína (mutante) soluble VP1-Glu
- c)
- Asociación "in vitro" de VP1-Glu con las VLP
\vskip1.000000\baselineskip
II) Producción del ds-Fv
- a)
- Expresión del ds-Fv con una secuencia de péptido poliiónico en E. coli
- b)
- Aislamiento de los cuerpos de inclusión (los ib) y solubilización
- c)
- Renaturalización y purificación del ds-Fv-mAb B3
\vskip1.000000\baselineskip
III) Asociación de las VLP con los
ds-Fv, mediada por interacciones poliiónicas y
formación de un puente disulfuro intermolecular
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de cubierta de polioma VP1 es capaz
de asociarse "in vitro" con las VLP icosaédricas
(Salunke, D.M. y col., Cell 46, 895-904,
1986; Salunke, D.M. y col., Biophysical J. 56,
887-904, 1989). El plásmido pALVPITAC (Leavitt,
A.D. y col., J. Biol. Chem. 260, 12803-12809,
1985) codifica al tipo salvaje de la proteína y permite la
producción recombinante de una proteína pentámera soluble en E.
coli. Basándose en este plásmido se inserta una secuencia
poliiónica en un bucle HI expuesto a disolvente en la superficie del
VP1 (Stehle, T. y col., Structure 4,
165-182, 1996). Esta secuencia consta de 8
glutamatos y una cisteína. Para clonar el VP1 mutante se inserta la
secuencia GluGluGluGluGluGluGluGluCys (E_{8}C, SEQ ID NO: 10)
entre los aminoácidos Asn^{294} y Tyr^{295} a nivel de cDNA
mediante un kit de mutagénesis dirigida a una posición, llamado
QuickChange™ (Stratagene).
Para la expresión se transforma el plásmido
resultante que codifica al VP1-Glu en Eco B. Se
cultiva la cepa de expresión en medio de sal mineral a 30ºC a
escala de 5 litros en un aparato Biostat-Fermenter
(Braun), utilizando una técnica llamada
"fed-batch". Se induce la expresión
recombinante del VP1-Glu con 0,4 mM IPTG en una
densidad celular de OD_{600} = 20. Seis horas después de la
inducción se recogen las células por centrifugación (8000 rpm, 15
min) y se almacenan a -70ºC.
Para la obtención de la VP1-Glu
mutante se suspenden de nuevo 50 g de células en 500 ml de tampón A
(50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 5% de glicerina; 2 mM
EDTA; 200 mM NaCl; 4 mM DTT). Se realiza la lisis celular por
dispersión de alta presión (Gaulin, 1200 bar) en presencia de 1
unidad/ml de benzonasa, 20 \mug/ml de RNasa y 4 tabletas de
cóctel completo de inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics GmbH,
Alemania). Se centrifuga el lisado a 47.000 rpm durante 30 min.
El primer paso de purificación y concentración
consiste en una precipitación fraccionada en sulfato amónico entre
una saturación de sal del 17,5 al 27,5%. Se introduce la proteína
resuspendida en una columna de intercambio aniónico (Poros 20 HQ).
En un gradiente lineal comprendido entre 200 mM y 1 M de NaCl en el
tampón A se eluyen unos 30 volúmenes de columna de
VP1-Glu en 500 mM NaCl en forma de proteína casi
homogénea. A continuación se incuba el líquido eluido a 20ºC
durante 20 min con 2,5 unidades/ml de benzonasa y 20 \mug/ml de
RNasa en presencia de 10 mM cloruro magnésico. Después se realiza
una cromatografía de exclusión de tamaños (Pharmacia Superdex 200,
calidad preparativa, en tampón A) para separar el VP1 pentámero de
material oligómero superior y agregado.
Para la asociación con las VLP se dializa el
VP1-Glu pentámero purificado frente al tampón B (20
mM Tris, pH 7,4; 0,75 M sulfato amónico; 5% de glicerina; 1 mM
CaCl2) a 15ºC durante 2 días. En estas condiciones se induce la
formación de las VLP. Con el fin de separar el sulfato amónico se
dializa la solución de las VLP frente al tampón C (20 mM Tris, pH
7,4; 200 mM NaCl; 5% glicerina; 1 mM CaCl2) a 15ºC durante 1 día y
después se almacena a 4ºC o a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en el vector pUli39-1,
que codifica al cDNA del dominio Vl asociado a exotoxina de
pseudomonas, y en el vector pYR 38-2, que codifica
al dominio VH (Reiter, Y. y col., Protein Engng. 12,
1323-1331, 1995) se construye un fragmento Fv
estabilizado con disulfuro con un péptido poliiónico de fusión. A
tal fin se introduce un codón de paro entre la secuencia
codificadora del VL y la parte de toxina, creándose de este modo un
vector de expresión para el dominio Vl del mAb B3.
El dominio V_{H}, codificado en el plásmido
pYR 38-2, se amplía con una secuencia poliiónica
ArgArgArgArg
ArgArgArgArgCysPro (R_{8}CP, SEQ ID NO: 11) en el extremo C. Esta extensión se realiza mediante un procedimiento de dos pasos empleando el kit de mutagénesis dirigido a una posición QuickChange™ (Stratagene). En primer lugar se inserta un oligonucleótido que codifica al ArgArgArgArgCysPro en el extremo 3' del gen V (Reiter, Y. y col., Protein Engng. 12, 1323-1331, 1985).
ArgArgArgArgCysPro (R_{8}CP, SEQ ID NO: 11) en el extremo C. Esta extensión se realiza mediante un procedimiento de dos pasos empleando el kit de mutagénesis dirigido a una posición QuickChange™ (Stratagene). En primer lugar se inserta un oligonucleótido que codifica al ArgArgArgArgCysPro en el extremo 3' del gen V (Reiter, Y. y col., Protein Engng. 12, 1323-1331, 1985).
Para completar el marcador que contiene al
péptido R8CP se insertan otras cuatro argininas en una segunda
mutagénesis.
Se expresan por separado los dominios V_{H} y
V_{L} en E. coli como cuerpos de inclusión. La preparación
de los ib se realiza con arreglo al método de Rudolph y col.
(Rudolph y col., Folding Proteins, en: T.E. Creighton (coord.):
Protein function: A Practical Approach, 57, 1996). Se almacenan los
ib a -70ºC. La solubilización de los ib se realiza de modo similar
al descrito en el método de Rudolph y col. (Rudolph y col., Folding
Proteins, en: T.E. Creighton (coord.): Protein function: A Practical
Approach, 57, 1996).
Se renaturaliza el ds-Fv del mAb
B3 por dilución simultánea de los ib solubilizados de V_{H} y de
V_{L} en el tampón de pliegue (100 mM, pH 8,5; 1 mM EDTA; 0,5 M
arginina; 1 mM GSH; 1 mM GSSG). La renaturalización se realiza en
una concentración total de proteínas de 30 \mug/ml con una
proporción molar V_{H} : V_{L} = 5:1. Se incuba la mezcla de
renaturalización a 10ºC durante 7 días. Después se separa por
centrifugación a 47.000 rpm durante 30 min el material agregado. En
el caso de una proteína plegada correctamente se forma un puente
disulfuro intermolecular entre V_{H} y V_{L}. Se concentra el
material renaturalizado soluble por flujo tangencial
(Vario-3-System Filtron; Minisette
FSQ; corte: 8 kD) y se cambia el tampón al tampón D (50 mM Tris, pH
7,5; 200 mM NaCl).
La secuencia policatiónica del extremo C del
dominio V_{H} permite la purificación del ds-Fv
plegado por cromatografía de intercambio catiónico. Se introduce la
proteína renaturalizada en una columna Poros 20 HS y se eluye con
un gradiente lineal de 0,2 a 1 M de NaCl en tampón D. El
ds-Fv eluye en forma de proteína homogénea a 400 mM
NaCl. La homogeneidad del ds-Fv se pone de
manifiesto por filtración a través de gel (Pharmacia Superdex 75),
eluyendo con tampón D y SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza la asociación dirigida de los
ds-Fv con las VLP en tampón E (20 mM Tris, pH 7,4;
5% de glicerina; 1 mM CaCl_{2}; 37,5 mM GSSG). La concentración
empleada del VP1-Glu es de 5 \muM y la
concentración de los ds-Fv es de 2,5 \muM. Se
efectúa la reacción en presencia de 0,2 M NaCl y 0,75 M sulfato
amónico, respectivamente. Como control se mezcla el tipo salvaje de
VP1 sin secuencia poliiónica con el ds-Fv en
presencia de 0,2 M NaCl. Se incuban las mezclas de reacción a 20ºC
durante 8 h y después se introducen en una columna de filtración a
través de gel (TosoHAAS TSK-Gel PW 6000 XL),
equilibrada con tampón E y 0,2 M NaCl. Se precipitan las fracciones
que contienen las VLP con desoxicolato sódico y se analizan con 18%
SDS PAGE (figura 4) y Western Blot.
\newpage
Solamente se forma un puente disulfuro entre el
ds-Fv y las VLP mutantes en la mezcla en la que está
presente 0,2 M NaCl y las dos proteínas poliiónicas,
VP1-Glu y ds-Fv, respectivamente,
dicha formación está promovida por las interacciones poliiónicas
entre los péptidos poliiónicos de fusión. En presencia de 0,75 M
sulfato amónico se suprimen las interacciones poliiónicas y no se
forma el puente disulfuro. De igual manera, en la mezcla de control
tampoco se detectan puentes disulfuro intermoleculares entre el
ds-Fv y el tipo salvaje de las VLP. Estos datos
indican que los péptidos poliiónicos de fusión inducen la
heterodimerización de las proteínas. En el ejemplo indicado, uno de
los reactivos, el VP1-Glu, está presente en forma
multímera, permitiendo no solo la unión con la otra proteína
funcional sino también el amarre de diversas proteínas poliiónicas
marcadas diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido ACE8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Cys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido ACK8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
laminina nona-péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido D10SCP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser
Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido D10CGP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys
Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador NdI Fd
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgttagcca tatgaccatg attacgaatt cccgg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador fdD10SCP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador EcoRI1600
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcataagagta cggagacaag acgctgtttg c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador R10CGP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido E8C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido R8CP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys
Pro}
Claims (4)
1. Engarce lineal peptídico para la unión de
compuestos biológicamente activos, caracterizado porque dicho
engarce consta de:
un primer resto engarce polipéptido, que consta
de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos, elegidos entre
el grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina y
un segundo resto engarce polipéptido, que consta
de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos ácidos, elegidos entre el
grupo formado por el glutamato y el aspartato,
dichos restos primero y segundo están unidos por
interacción iónica debida a sus numerosos aminoácidos cargados y por
puentes disulfuro covalentes entre sus cisteínas,
cada uno de dichos estos está unido por su
extremo C o N a un compuesto biológicamente activo.
2. Un engarce peptídico reivindicado en la
reivindicación 1, en el que dichos compuestos biológicamente activos
unidos a dicho engarce peptídico primero y segundo difieren entre sí
por su estructura química.
3. Un engarce peptídico reivindicado en la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicho compuesto biológicamente
activo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
4. Un método para la producción de un
polipéptido quimérico que consta de dos polipéptidos biológicamente
activos unidos mediante un engarce peptídico, caracterizado
porque
a) se expresan en una célula hospedante
procariota o eucariota de modo simultáneo o por separado los ácidos
nucleicos que codifican a
- aa)
- un primer resto de dicho polipéptido quimérico que consta de un primer polipéptido biológicamente activo y un primer resto engarce polipéptido que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos básicos, elegidos entre el grupo formado por la arginina, la lisina y la ornitina y
- ab)
- un segundo resto de dicho polipéptido quimérico que consta de un segundo polipéptido biológicamente activo y un segundo resto engarce polipéptido que consta de 1 a 3 cisteínas y de 4 a 12 aminoácidos ácidos, elegidos entre el grupo formado por el glutamato y el aspartato,
b) dichos restos primero y segundo de dicho
polipéptido quimérico se recuperan de la célula hospedante o del
líquido sobrenadante celular y se ponen en contacto para permitir la
formación de una interacción poliiónica entre dichos restos engarces
polipéptidos primero y segundo,
c) el producto de b) se trata con un agente
oxidante para formar puentes disulfuro entre dichos restos engarces
polipéptidos y
d) se aísla dicho polipéptido quimérico.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| EP99115022 | 1999-08-02 | ||
| EP99115022A EP1074563A1 (en) | 1999-08-02 | 1999-08-02 | Chimeric polypeptides enhancing dimer formation through electrostatic interactions and disulfide bond, method for production and uses thereof |
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