ES2280793T3

ES2280793T3 - Deteccion de algas toxicas.

Info

Publication number: ES2280793T3
Application number: ES03760574T
Authority: ES
Inventors: Linda Medlin Crawford; Katja Kerkmann; Martin Lange
Original assignee: Alfred Wegener Insitut fuer Polar und Meeresforschung
Current assignee: Alfred Wegener Insitut fuer Polar und Meeresforschung
Priority date: 2002-06-23
Filing date: 2003-06-22
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2023-06-22
Also published as: DK1516067T3; DE50306263D1; DE10228785A1; PT1516067E; EP1516067A2; WO2004001067A3; AU2003250271A1; DE10228785B4; WO2004001067A2; AU2003250271A8; EP1516067B1

Abstract

Procedimiento electroquímico de detección para la detección rápida in situ de algas tóxicas en una muestra líquida, mediando utilización de por lo menos una sonda captadora inmovilizada, que es específica para ciertas secuencias, destinada a la hibridación selectiva en condiciones de hibridación de una secuencia complementaria de ácido nucleico, que caracteriza inequívocamente al alga que se ha detectar, a base del ARNr de la subunidad pequeña 18S o de la subunidad grande 28S del ribosoma específico para ciertas algas, de por lo menos una sonda cooperante y de por lo menos una sonda detectora, ambas de las cuales están situadas con una distancia entre secuencias lo más pequeña que sea posible, con una diferencia máxima de 150 a 200 bases, cerca de la sonda captadora específica para ciertas secuencias, con las etapas principales de procedimiento: * Preparación de la muestra líquida a investigar con el fin de liberar el ARN total de todas las algas contenidas en la muestra, * Establecimiento de una tanda de hibridación mediante mezcladura del ARN total puesto en libertad con la sonda cooperante y con la sonda detectora, que está marcada con un antígeno, en un tampón de hibridación para la hibridación con secuencias complementarias de ácidos nucleicos del ARNr del ribosoma específico para ciertas algas, del alga que se ha de detectar en la muestra, * Humectación de la sonda captadora específica para ciertas secuencias, con la tanda de hibridación, para la hibridación en emparedado de la secuencia de ácido de nucleico que caracteriza inequívocamente al alga que se ha de detectar, realizándose que la sonda cooperante hace posible o refuerza a la hibridación en emparedado y que la sonda detectora marca a la secuencia de ácido nucleico que se ha de detectar, * Humectación de la sonda captadora específica para ciertas secuencias, después de haberse efectuado la hibridación en emparedado con un conjugado enzimático con un anticuerpo, que se fija específicamente al antígeno de la sonda detectora, y con una enzima, que cataliza la reacción de detección, * Separación por enjuagado del conjugado enzimático no fijado, * Detección amperométrica o ciclovoltamétrica de la reacción enzimática que se ha establecido al efectuarse la hibridación en emparedado del alga que se ha detectar, con una tensión de medición previamente establecida.

Description

Detección de algas tóxicas.

El invento, en conexión con la detección de algas tóxicas, se refiere a sondas captadoras específicas para ciertas secuencias destinadas a la detección de algas mediante una hibridación selectiva, que se efectúa en condiciones de hibridación de una secuencia complementaria de ácido nucleico que caracteriza inequívocamente al alga que se ha de detectar. Un objeto adicional del invento es un procedimiento electroquímico de detección, para la detección rápida in situ (en el sitio de uso) de algas tóxicas en una muestra líquida, mediando utilización de por lo menos una sonda captadora inmovilizada, que es específica para ciertas secuencias. Otros objetos del invento son una disposición para la realización del procedimiento de detección y una utilización de la disposición.

La presencia de especies contaminantes que forman toxinas en ecosistemas marinos es conocida desde hace mucho tiempo. Después de un contacto con tales organismos o de un consumo de organismos marinos enriquecidos con toxinas, pueden aparecer daños fisiológicos en el caso de los seres humanos, que en el peor de los casos pueden conducir hasta a la muerte. Precisamente en los últimos diez hasta veinte años se están observando de manera multiplicada flores de algas tóxicas que pueden tener como consecuencia problemas ecológicos y sanitarios. Los ecosistemas marinos pueden ser perturbados, pueden aparecer un crecimiento masivo de algas y un síndrome venenoso de algas. También resultan consecuencias económicas para los entornos afectados. La aparición local de algas tóxicas se efectúa sin embargo con frecuencia de una manera extremadamente repentina y solamente de una manera transitoria, de modo tal que se dificultan las investigaciones. En los últimos años se aislaron una serie de nuevas sustancias tóxicas bioactivas. Una posibilidad de análisis cualitativos y cuantitativos de los diferentes agentes causantes marinos para la producción de toxinas, es por lo tanto imperativamente necesaria. Sin embargo, los métodos convencionales de investigación son largos y difíciles, de manera tal que solamente se pueden llevar a cabo en laboratorios de ensayo por un personal especializado. En la publicación I "Unbekanntem Leben auf der Spur" - “[Vida desconocida en la huella]” de R. Amman y colaboradores, Naturwissenschaftliche Rundschau [Revista de las Ciencias Naturales] 45, fascículo 9/92, 348-351, se describen sondas de ADN para la identificación de bacterias no cultivables. Una sonda captadora en forma de una secuencia de ADN monocatenario se fija en unas condiciones de hibridación definidas con exactitud, de una manera específica para ciertas secuencias, a una secuencia complementaria de ADN o ARN. La hibridación de dos moléculas de ácidos nucleicos se basa en el principio del apareamiento específico de bases de adenina (A) y timina (T) (uracilo (U) en el caso de un ARN) y de guanina G) con citosina (C). Actualmente están ganando en importancia, por lo tanto, sondas moleculares disponibles de ácidos nucleicos, que reconocen a determinadas secuencias dianas, en particular a ARN ribosomales, anticuerpos, que se fijan a determinadas moléculas superficiales de células o respectivamente biomoléculas citoplásmaticas, y otros procedimientos moleculares y bioquímicos para la detección de especies contaminantes. Entre éstos se cuentan sobre todo también investigaciones genéticas moleculares y, basándose en ellas, el establecimiento de una taxonomía que se basa en secuencias de ADN inequívocamente caracterizadoras de una especie, que hace posible el reconocimiento de microalgas y bacterias potencialmente tóxicas. Como resultado de estas investigaciones, se pueden definir también secuencias de ADN específicas para especies, géneros y clases, que se pueden utilizar como sondas de ADN muy específicas para la identificación inequívoca de los respectivos microorganismos.

El valor de una sonda de ADN consiste por lo tanto en la identificación inequívoca de un organismo o de un grupo de organismos. Cualquier organismo eucariótico posee una secuencia génica codificadora de la subunidad pequeña 18S y de la subunidad grande 28S en el ribosoma. Éstas se usan para la identificación de organismos, puesto que su secuencia es altamente específica para cualquier organismo. En este caso no es sin embargo suficiente escoger un fragmento arbitrariamente largo a partir de los ADN de 18S o 28S, sino que más bien se tiene que encontrar un segmento especial de secuencia, que corresponda inequívocamente a los criterios exigidos, tales como especificidad para una clase, un género o una especie. Para la determinación de sondas moleculares, que puedan ser consideradas como específicas, es necesario por lo tanto un trabajo largo y penoso de desarrollo. A partir del documento de patente de los EE. UU US 5.582.983 (de Anderson y Scholin) se conocen sondas captadoras específicas para ciertas secuencias, destinadas a la identificación de algunas especies de Alexandrium (dinofíceas). En el documento US 5.958.689 (de Scholin, Haydock y Cangelosi) se divulgan sondas captadoras específicas para ciertas secuencias, para algunas algas silíceas marinas tóxicas del género de las pseudo-Nitzschias. A causa de la multiplicidad de especies de algas marinas no es ni con mucho completa, sin embargo, la lista de sondas para algas marinas que se han dado a través del Banco de Genes (GenBank) del NCBI (National Center for Biotechnology Information [Centro nacional para información sobre biotecnología], http://www.ncbi.nlm.nih.gov, situación en 23./26.01.2001). Otras sondas para la detección de algas tóxicas se describen en la publicación de Simon, N. y colaboradores: "Oligonucleotide probes for the identification of three algal groups by dot blot and fluorescent whole-cell hybridization" [Sondas de oligonucleótidos para la identificación de tres grupos de algas mediante el sistema dot blot (transferencia de puntos) y la hibridación fluorescente de células enteras], JOURNAL OF EUKARYOTIC MICROBIOLOGY [REVISTA DE MICROBIOLOGÍA EUCARIÓTICA], tomo 47, Nº. 1, Enero de 2000, páginas 76-84. Con el presente invento se mencionan algunas nuevas sondas captadoras específicas para ciertas secuencias, destinadas a la detección de algas, que se distinguen por su toxicidad. Por medio de una aparición epidémica posible, estas algas tóxicas son de interés especial en conexión con la problemática para países litorales, ya abordada más arriba. En este caso, las sondas captadoras trabajan mediante una hibridación selectiva, que se efectúa en condiciones de hibridación, de una secuencia complementaria de ácido nucleico, que caracteriza inequívocamente al alga tóxica que se ha de detectar, a base del ARNr (ácido ribonucleico ribosomal) de la subunidad pequeña 18S o de la subunidad grande 28S del ribosoma específico para ciertas algas. Las caracterizaciones de las sondas captadoras individuales se pueden tomar del anejo protocolo de secuencias.

Con el fin de detectar una molécula de ácido nucleico utilizada como sonda después de la hibridación con un ADN o ARN complementario, unas sondas de ácidos nucleicos se marcan mediante una molécula reportera. Por ejemplo, como sondas se pueden emplear oligonucleótidos marcados por fluorescencia, con el fin de detectar específicamente a los ARN ribosomales (ARNr) de una especie. A partir de un biotopo arbitrario, por ejemplo procedente de muestras de agua marina, se puede detectar por consiguiente de una manera deliberada una especie, a causa de su específica secuencia de ARNr. A partir del documento US 5.344.757 se conoce la detección de ácidos nucleicos después de su hibridación con una sonda de ADN, marcada (hibridación en emparedado). En este caso, la sonda de ADN, que pasa a emplearse, es unida covalentemente con una molécula reportera, un p. ej. hapteno esteroide, tal como digoxigenina, que a su vez se puede detectar con ayuda de un anticuerpo marcado, dirigido contra una molécula de receptor. La detección de ácidos nucleicos después de una hibridación con una sonda de ADN marcada con una enzima, se describe en el documento US 5.867.928, realizándose que la enzima \beta-galactosidasa se presenta acoplada ya sea directamente, a través de un grupo SH, o después de una modificación mediante biotina o avidina, con la sonda de ADN, y el producto resultante a partir de la reacción con \beta-galactosidasa - como substrato se emplea el o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido - es detectado ópticamente mediante rayos UV (ultravioletas).

A partir del documento de solicitud de patente alemana DE-100-32.042 A1 se conoce un biosensor electroquímico de un sólo uso para la determinación cuantitativa de concentraciones de analitos en líquidos. En el caso del procedimiento de detección, que constituye su fundamento, se trata de un procedimiento electroquímico de detección mediando utilización de una sonda captadora inmovilizada, específica para ciertas secuencias, destinada a la hibridación selectiva, que se efectúa en condiciones de hibridación, de una secuencia complementaria de ácido nucleico del analito que se ha de detectar. De acuerdo con el Ejemplo 4 de la mencionada publicación, sin embargo, una detección se efectúa mediante una simple hibridación, siendo marcada directamente con digoxigenina la cadena de ADN que se ha detectar. Después de haberse efectuado una hibridación de la cadena individual complementaria con la cadena individual inmovilizada como sonda captadora, se efectúa la detección después de haber añadido un conjugado enzimático, que se compone de un anticuerpo y de una enzima, que reconoce a la marcación con digoxigenina. Mediante oxidación y reducción de un mediador circundante, se efectúa a continuación, mediando aplicación de una tensión eléctrica de medición preestablecida, una valoración amperométrica o ciclovoltamétrica. A causa de la marcación directa de la secuencia de ADN que se ha de detectar, sin embargo, el conocido procedimiento electroquímico de detección se ha de llevar a cabo no obstante de una manera relativamente costosa. Éste dispone además solamente de una sensibilidad de detección relativamente pequeña. Como misión para el procedimiento de detección conforme al invento, se ha de considerar por lo tanto un manifiesto aumento de la eficiencia en el caso de la posibilidad de detección de algas tóxicas, junto con una simultánea simplificación del procedimiento.

Como solución para este problema está previsto el procedimiento electroquímico de detección reivindicado de acuerdo con la reivindicación 1, el cual, partiendo del procedimiento electroquímico de detección, que es conocido de acuerdo con el documento DE-100-32.042 A1, comprende dos perfeccionamientos esenciales del procedimiento. Por una parte, en el caso del procedimiento de detección conforme al invento se efectúa una hibridación en emparedado (sandwich) mediando participación de una sonda detectora. De esta manera se suprime la marcación directa del ADN o ARN, que se tiene que detectar, de la especie de alga que se ha de detectar. La marcación, por ejemplo con un antígeno, se aplica de una manera preparatoria general y sencilla a la sonda detectora. El principio fundamental de la hibridación en emparedado se puede deducir por ejemplo, en conexión con un procedimiento de detección mediante amplificación con una enzima, de la publicación II de B. Wicks y colaboradores: "A Sandwich Hybridization Assay Employing Enzyme Amplification for Determination of Specific Ribosomal RNA from Unpurified Cell Lysates" [Un ensayo de hibridación en emparedado, que emplea la amplificación con una enzima para la determinación de un ARN ribosomal específico procedente de materiales lisados celulares sin purificar] (Analytical Biochemistry [Bioquímica Analítica] 259 (1998), páginas 258-264). Éste ofrece la gran ventaja, en comparación con la simple hibridación, de que se pueden analizar también muestras impurificadas.

Por lo demás, en el caso del procedimiento conforme al invento se utiliza una tercera sonda en forma de una sonda cooperante. Ésta hace posible, generalmente por primera vez, la detección en el caso de algunos tipos de especies, por ejemplo Alexandrium tamarense. En el caso de otras especies de algas, el empleo de una sonda cooperante eleva de manera significativa el límite de detección. La función de una sonda cooperante, que consiste en que, mediante una reacción por adición con el ADN o ARN que se ha detectar, se evitan plegamientos de la cadena, es conocida generalmente por ejemplo a partir de la publicación III de B. M. Fuchs: "Unlabeled Helper Oligonucleotides Increase the In Situ Accessibility to 16S rRNA of fluorescently Labeled Oligonucleotide Probes" [Unos oligonucleótidos cooperantes sin marcar aumentan la accesibilidad in situ a un ARNr 16S de sondas de oligonucleótidos marcadas fluorescentemente] (Applied and Environmental Microbiology [Microbiología Aplicada y Ambiental], Agosto de 2000, páginas 3.603-3.607). La simultánea introducción, tanto de la hibridación en emparedado mediando utilización de una sonda detectora, como también de la utilización de una sonda cooperante adicional, en el caso del procedimiento de detección conforme al invento, aporta el deseado aumento manifiesto de la eficiencia en comparación con el conocido procedimiento electroquímico de detección.

Es decisiva, para el empleo efectivo de sondas detectoras y cooperantes, la constitución molecular de éstas. También estas sondas son asimismo específicas, pero no altamente específicas y por lo tanto caracterizadoras de una especie, como lo son las sondas captadoras. Ellas, por lo tanto, no se fijan a la secuencia de ácido nucleico que caracteriza inequívocamente al alga que se ha de detectar, sino a secuencias estrechamente contiguas en relación con aquella, en el ARNr (o en el ADN monocatenario, siempre y cuando que éste se encuentre presente). Para la producción de apropiadas sondas detectoras y cooperantes, se ha de definir una distancia máxima permitida de las dos sondas adicionales a partir del sitio de acoplamiento de la sonda captadora. Se obtienen buenos resultados, cuando esta distancia entre secuencias es establecida lo más pequeña que sea posible, con una diferencia máxima de 150 a 200 bases. En el caso del conocimiento de las sondas captadoras caracterizadoras de ciertas algas, tal como se pueden utilizar en el caso del procedimiento de detección conforme al conforme al invento de acuerdo con la reivindicación 2, en la subunidad pequeña o grande del ribosoma, es posible por consiguiente, sin ninguna dificultad, a causa del conocimiento de toda la secuencia, por lo menos en esta zona, la definición de sondas detectoras y cooperantes apropiadas de manera correspondiente para la especie individual de alga. La reacción por adición de las sondas adicionales con el alga que se ha de detectar, se efectúa entonces en las mismas condiciones de hibridación que en el caso de la reacción por adición de la secuencia de ácido nucleico característica, con la sonda captadora.

Para la realización del procedimiento electroquímico de detección, conocido a partir del documento DE-100-32.042 A1, se describen precisamente allí unos baratos chips biosensores de un sólo uso y un aparato manual indicador con una unidad de potenciostato, en la que se pueden introducir los chips sensores para la realización de la medición. El chip sensor de un sólo uso, obtenible comercialmente, está provisto de una disposición de tres electrodos (electrodos de trabajo, de referencia y auxiliar). Aquél se introduce en el aparato manual a través de una tira de contacto para la fácil manipulación. El electrodo de trabajo de la pieza en bruto para un chip es modificado de diferentes maneras, dependiendo de cual sea la sustancia que se haya de detectar. Con el fin de determinar la concentración de un analito, éste es aplicado con pipeta sobre el electrodo de trabajo. La medición se efectúa amperométricamente o ciclovoltamétricamente con ayuda de una unidad de potenciostato integrada en el aparato manual, a través de la cual se pueden preestablecer unas tensiones de medición. La concentración de la muestra para análisis se puede leer después de un muy corto período de tiempo de medición en el visualizador del aparato manual, que se puede manipular sin problemas precisamente también por usuarios no entrenados. Los chips biosensores de un sólo uso y el aparato manual con una unidad de potenciostato son asimismo partes componentes de la disposición reivindicada, destinada a la realización del procedimiento electroquímico. Con esta disposición se pone a disposición de un usuario ignorante un juego (en inglés set) completo que, junto a los dos componentes principales mencionados y a los necesarios reactivos, contiene además solamente uno o varios recipientes destinados a la preparación de la muestra líquida que se ha de investigar, con el que este usuario puede llevar a cabo in situ sin problemas el procedimiento de detección para algas tóxicas.

En este caso, el juego puede contener uno o varios biosensores de un sólo uso con sondas captadores específicas para ciertas secuencias en forma de secuencias de bases. Es posible también una combinación de varias sondas captadoras diferentes en un chip biosensor de un sólo uso, con el fin de obtener, mediante la utilización de solamente un chip sensor, por lo menos una declaración cualitativa acerca de la presencia de un espectro de algas tóxicas en la muestra que se ha de investigar. Actualmente, la detección de algas tóxicas mediante sondas de ácidos nucleicos (compárese los documentos US 5.582.983 y US 5.958.689) es relativamente larga en su realización, y exige un conocimiento especial de técnicos especialistas. Éste solamente se puede llevar a cabo en laboratorios de ensayo por un personal entrenado. En el caso del procedimiento de detección de acuerdo con el invento, la dedicación de tiempo mediando empleo de biosensores de un sólo uso, previamente confeccionados, con sondas captadoras inmovilizadas así como con sondas detectoras y cooperantes mantenidas en reserva de un modo apropiado, es sólo de aproximadamente tres horas y se puede llevar a cabo también por un personal no entrenado.

En la publicación IV de M.I. Pividori y colaboradores: "Dot-blot amperometric genosensor for detecting an novel determinant of \beta-lactamase resistance in Staphylococcus aureus" [Genosensor amperométrico por transferencia de puntos para detectar un nuevo determinante de resistencia a \beta-lactamasa en Staphylococcus aureus] (a partir Analyst, 2001, 126, páginas 1551-1557) se describe asimismo un procedimiento electroquímico de detección, pero aquí, no obstante, con una constitución del sensor fundamentalmente diferente a la del conocido biosensor de un sólo uso para el aparato manual. Se lleva a cabo una hibridación de transferencia de puntos sobre una membrana, que entonces es sujeta y tensada en el sensor para la detección. Se efectúa por la tanto una simple hibridación indirecta. La secuencia de ácido nucleico específica para ciertas algas, del alga que se ha de detectar, es inmovilizada sobre la membrana después de una amplificación necesaria en primer término, mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR), y a continuación se detecta mediante una sonda captadora biotinilada. Por lo demás, se informa en la publicación acerca de una doble hibridación con diferentes sondas.

Una aplicación especialmente preferida de la disposición descrita con el presente invento, puede verse en la utilización como un sistema de alarma precoz con respecto a algas tóxicas. De esta manera, con el presente invento se pone a disposición un sistema de alarma precoz, que es efectivo para el análisis de un fitoplancton con el centro de importancia dirigido hacia microorganismos marinos tóxicos (microalgas y bacterias), que hasta ahora no ha existido. Él está constituido de modo favorable en cuanto a la conservación y a los costos, se puede manipular de una manera extremadamente sencilla y es fácil de transportar, de modo tal que alcanza una elevadísima flexibilidad de empleo en lo que se refiere al sitio de la medición para mediciones individuales, pero también rutinarias, en cuyo caso se suprimen totalmente elementos adicionales o etapas de preparación realizadas en laboratorios ajenos. Además, el sistema de alarma precoz mediante la tecnología empleada en lo referente a los biosensores utilizados con sondas selectivas en forma de chips de un sólo uso, apto para introducirse, es fácil de manipular y por consiguiente accesible, sin ninguna dificultad, también para un usuario no entrenado. Con las sondas especiales se pueden descubrir y trazar de una manera confiable y rápida microorganismos marinos peligrosos, directamente en el sitio de uso, con una alta sensibilidad incluso en un pequeño número de células. Las vigilancias rutinarias son posibles por consiguiente con un mínimo consumo de aparatos. En el caso de la disposición reivindicada en su aplicación como sistema de alarma precoz acerca de algas tóxicas, se trata por consiguiente de un producto comercializable, con el que se pueden conseguir de manera rápida y confiable unos resultados altamente sensibles. De esta manera se puede vigilar en tiempo real la dinámica de población de las algas tóxicas.

La disposición de acuerdo con el invento, en la aplicación reivindicada como sistema de alarma precoz acerca de algas tóxicas, se puede emplear en general en diferentes disposiciones de investigación para investigaciones científicas (investigación de la biodiversidad), pero puede también ayudar en tal caso de manera extremadamente eficaz como sistema de alarma precoz para determinar en tiempo real el comportamiento de vegetación de flores de algas tóxicas, antes de que ellas pueblen las costas y pueden provocar trastornos o incluso daños para los seres humanos. El sistema se puede usar de manera muy eficaz por ejemplo por municipios y autoridades en los sectores del turismo, de la protección del medio ambiente o de la pesquería. Precisamente, las misiones de vigilancia en costas y corrientes acuáticas, impuestas por reglamentaciones legales, se pueden simplificar y mejorar en su realización mediante un empleo de la disposición de acuerdo con el invento. Para esto, una sonda de agua marina, después de la correspondiente preparación (en ciertas circunstancias mediante aportación de ayuda por terceras personas), se aplica gota a gota de una manera sencilla sobre un chip biosensor de un sólo uso, que tiene una secuencia de sonda correspondiente a una carga tóxica con algas, que es característica para el entorno. Después de haberse efectuado una hibridación en emparedado, se comienza el desarrollo del análisis mediante introducción del chip biosensor de un sólo uso, que ha recibido la adición de las gotas. En un período de tiempo brevísimo, el aparato, sin ninguna ayuda adicional del exterior, que adicionalmente cuesta tiempo y camino, suministra una segura indicación de alarma cualitativa y cuantitativa, incluso en el caso de pequeñas presencias de cantidades trazas. Así, flores de algas tóxicas, como aparecen en los últimos años sobre todo en regiones litorales, se pueden reconocer de una manera precoz. La evitación de tales infestaciones masivas, que pueden aparecer dentro de un período de tiempo brevísimo, son de importancia existencial precisamente también para sectores que viven del turismo y/o de la economía pesquera.

A continuación, el invento se ha de explicar con mayor detalle en su extensión y alcance, en sus fundamentos y en sus formas individuales de agudización, con ayuda de Ejemplos de realización y de una Figura, que muestra en representación esquemática la detección de la hibridación en emparedado en un chip biosensor de un sólo uso.

En la Figura se representa, en la parte izquierda de la Figura, un dibujo de detalle ampliado de un chip biosensor de un sólo uso (1). Sobre un soporte (2) de chip se encuentra el sensor (3) con un electrodo de trabajo (4), un electrodo de referencia (5) y un electrodo auxiliar (6). El sensor (3) trabaja amperométricamente: entre el electrodo de trabajo (4) con la sonda captadora inmovilizada, específica para ciertas secuencias (ADN monocatenario, compárese la parte derecha de la Figura) y el electrodo de referencia (5) se aplica una tensión eléctrica preestablecida de medición; se mide entonces la corriente eléctrica, que fluye entre el electrodo de trabajo (4) y el electrodo auxiliar (6) en el revestimiento del chip, siendo la corriente resultante directamente proporcional a la concentración que aparece de un producto enzimático y por consiguiente directamente proporcional a la concentración del alga tóxica especial que se busca. En el ejemplo de realización realizado seguidamente, la corriente eléctrica medida resulta de la oxidación del producto p-amino-fenol que se ha formado a partir de la reacción enzimática, para dar la p-imino-quinona.

En la parte derecha de la Figura, el electrodo de trabajo (4) se representa de modo nuevamente ampliado, con el fin de poder representar mejor la hibridación en emparedado para el proceso de detección. La sonda captadora molecular (7), específica para ciertas secuencias, está unida a través de biotina (8) con avidina (9). La avidina (9) está aplicada sobre la superficie del soporte (2) de chip en la zona del electrodo de trabajo (4), por lo que, a través de la conexión de unión, la sonda captadora (7) es inmovilizada sobre la superficie del chip. La secuencia de ácido nucleico (10) (ARN, o ADN monocatenario) característica para ciertas algas, del alga que se ha de detectar, había sido provista, en una etapa precedente de hibridación, de una sonda detectora (11) de baja especificidad y de una sonda cooperante (12) de baja especificidad. En tal caso, la sonda cooperante (12) está situada más cerca de la secuencia de ácido nucleico (10) característica para ciertas algas, con el fin de facilitar su fijación, por dificultarse la formación de estructuras secundarias en esta zona mediante la presencia de la sonda cooperante (12). La sonda detectora (11) está marcada como dig con un antígeno (13). Después de una aplicación con pipeta y de una hibridación de la secuencia de ácido nucleico (10) característica para ciertas algas, con la sonda captadora (7) específica para ciertas secuencias, se presenta una hibridación en emparedado. En este contexto, la sonda cooperante (12) actúa haciendo posible una hibridación (por ejemplo, en el caso del alga Alexandrium tamarense que forma neurotoxinas) o por lo menos reforzando esta hibridación. Para la detección amperométrica, se añade con pipeta sobre el electrodo de trabajo (4) un conjugado enzimático (conjugado de un anticuerpo anti-dig y de una POD), acoplándose los anticuerpos (15) marcados por la enzima (14), con los antígenos (13) de las sondas detectoras (11). Mediante reducción/oxidación (compárese más adelante) aparece en un mediador circundante un flujo de corriente eléctrica, que es proporcional a la concentración de las secuencias de ácidos nucleicos (10) específicas para ciertas secuencias, y características para ciertas algas, que están hi-
bridadas con las sondas captadoras (7), y que es por consiguiente la medida para el alga tóxica que se ha de detectar.

En el precedente Ejemplo de realización se describe la inmovilización de una soda captadora, es decir de un tipo de sonda captadora sobre el chip biosensor de un sólo uso. Con un gran número de sondas captadoras, inmovilizadas con una especial secuencia de bases. se puede detectar por consiguiente un alga tóxica, o respectivamente una especie, con estrecha afinidad para el tipo de especie. En este caso, la sensibilidad del procedimiento de detección aumenta con el número de las sondas captadoras inmovilizadas en un chip sensor. Por consiguiente, para la detección de diferentes algas tóxicas se han de utilizar de modo correspondiente diferentes chip sensores. Es posible también la inmovilización de diferentes sondas captadoras para diferentes algas tóxicas en un común chip sensor, con el fin de poder detectar en una pasada del procedimiento ya un espectro completo de algas tóxicas.

Al procedimiento de detección de algas tóxicas, de acuerdo con el presente invento, pertenecen principalmente las siguientes etapas de procedimiento:

\bullet Preparación de la muestra

El aislamiento del ARN total a partir de la muestra líquida, que se ha de investigar en cuanto a la presencia de algas tóxicas, por ejemplo un agua marina, se efectúa mediante un estuche (Kit) terminado de preparar previamente, en un recipiente de tratamiento (p. ej. de la entidad Qiagen (Hilden)).

\bullet Preparación previa del chip biosensor de un sólo uso para la hibridación en emparedado

El electrodo de trabajo en un chip biosensor de un sólo uso, como pieza en bruto para chip, se reviste primeramente con avidina. Después de esto, se efectúa la fijación de la sonda captadora (oligonucleótido captador) sobre a través de biotina al electrodo revestido con avidina (compárese la Figura). En este caso, se aprovecha el hecho de que la avidina tiene una alta afinidad de fijación para la biotina. Los chips biosensores de un sólo uso, así preparados previamente, son estables a 4ºC por lo durante tres meses.

\bullet Hibridación del ARN total, procedente de la muestra preparada, con el chip biosensor de un sólo uso, preparado previamente

En la tanda de hibridación se contienen el ARN total, la sonda cooperante (oligonucleótido cooperante) y la sonda detectora (oligonucleótido detector). La hibridación de las dos sondas con el alga, que se ha de detectar, se efectúa en el tampón para hibridación. La hibridación de la secuencia de ácido nucleico, específica para ciertas algas, que ha sido preparada previamente por la sonda cooperante y por la sonda detectora, con la sonda captadora inmovilizada sobre el chip biosensor de un sólo uso, se efectúa en el chip biosensor de un sólo uso después de que la tanda de hibridación hubiera sido añadida con pipeta sobre el chip sensor. Se presenta entonces una hibridación en emparedado entre la sonda captadora y la sonda detectora, mediando ayuda de una sonda cooperante, que debe facilitar la fijación del oligonucleótido captador a la secuencia diana.

\bullet Detección de la hibridación en emparedado

La detección de la hibridación en emparedado se efectúa a través de una reacción enzimática, que también tiene lugar en el sensor. La enzima está acoplada a un anticuerpo (por ejemplo de la entidad Roche Diagnostics GmbH en Mannheim), que reconoce a un epítopo (zonas especiales de antígenos, que son reconocidas específicamente por anticuerpos), el cual está acoplado a la sonda detectora (compárese la Figura). A continuación de la reacción con el anticuerpo, se efectúa la detección de la hibridación en emparedado a través de la reacción enzimática, después de haber añadido una mezcla de substrato, que contiene el mediador y H_{2}O_{2}. El chip biosensor de un sólo uso, hibridado, es puesto en contacto entonces por introducción en el aparato manual. Por el aparato manual se mide el flujo de electrones durante una reacción de oxidación. Los substratos de la reacción son H_{2}O_{2} (peróxido de hidrógeno como agente de oxidación) y N-hidrocloruro de fenil-1,4-fenilen-diamina (mediador). La reacción del peróxido de hidrógeno con el agua es catalizada mediante la enzima "peroxidasa de rábano rusticano (horse-radish peroxidase) (POD)", que está acoplada con un anticuerpo que reconoce a la sonda detectora acoplada a una marcación con dig (digoxigenina). La peroxidasa procede como enzima inalteradamente a partir de las reacciones, puesto que ella pasa a tomar parte con los substratos solamente en estados de transición de corta vida. En el transcurso de la reacción redox, que es catalizada por la peroxidasa, se modifican el mediador y el H_{2}O_{2}, y se transfieren electrones, lo cual se puede medir como una corriente eléctrica. La corriente eléctrica que se ha medido es entonces la medida para la concentración del alga tóxica, que se ha detectar, presente en la muestra.

Una disposición en forma de un juego completo, que se puede utilizar como sistema de alarma precoz para la detección de algas tóxicas, sobre la base de una hibridación en emparedado mediando ayuda de una sonda cooperante, puede contener los siguientes componentes:

\bullet: Propuestas para la preparación de las muestras

\bullet: Chips biosensores de un solo uso, revestidos con las sondas captadoras específicas para ciertas secuencias, para las algas que se han de detectar

\bullet: Una solución para hibridación (tampón para hibridación, sondas cooperantes y sondas detectoras en vecindad de secuencias con las sondas captadoras)

\bullet: Recipiente para hibridación

\bullet: Pipetas

\bullet: Soluciones para la detección de la hibridación en emparedado

\bullet: Aparato manual con indicador y unidad de potenciostato para la detección electroquímica de las algas tóxicas que se han de detectar.

Ejemplo de realización para la hibridación en emparedado en un chip biosensor de un solo uso

	Alga tóxica que se ha de detectar:	Alexandrium ostenfeldii
	Sonda captadora (Seq. Nº 19):	CAA CCC TTC CCA ATA GTC AGG T
	Sonda detectora:	GAA TCA CCA AGG TTC CAA GCA G
	Sonda cooperante a:	TTA ATC TTT GAG ACA AGC ATA TGA AC
	Sonda cooperante b:	ACC TGA CTA TTG GGA AGG GTT G

En el ejemplo de realización, para la detección del alga tóxica "Alexandrium ostenfeldii" se utiliza la sonda captadora específica para ciertas secuencias, conforme a la Secuencia Nº 19. La sonda detectora necesaria para la hibridación en emparedado, se encuentra situada en un intervalo de distancias de como máximo 200 bases contiguamente a la secuencia de ARN complementario, específica para ciertas algas, o respectivamente la secuencia de ADN monocatenario, específica para ciertas algas, y tiene en el ejemplo de realización escogido la secuencia de bases arriba mostrada. La sonda cooperante, que ayuda a la hibridación del ARN complementario o al ADN monocatenario, específico para ciertas algas, con la sonda captadora, se encuentra situada asimismo en un intervalo de distancias de como máximo 200 bases, con respecto a ella y puede tener alternativamente la secuencia de bases a o b, arriba mostrada. Ambas sondas cooperantes cumplen la misión establecida para ellas, de ayudar a la hibridación. En este lugar, se ha mencionar el hecho de que, en particular en el caso de algas tóxicas de la especie "Alexandrium tamarense" (sonda captadora de acuerdo con la secuencia Nº 5, 6 ó 18, la utilización de una sonda cooperante hace posible la hibridación por lo general por primera vez. Esta especie de alga muy tóxica se distingue como responsable de la formación de neurotoxinas, y fue investigada intensamente ya en la ciencia de investigación.

A. Revestimiento de los biosensores de un sólo uso con avidina

1.: Los biosensores de un sólo uso (en lo sucesivo denominados brevemente sensores) se humedecieron con 50 \mul de un tampón de carbonato de pH 9,6. El tampón de carbonato es aspirado mediante una bomba de vacío.

2.: Incubación de los sensores con 2 \mul de avidina en un tampón de carbonato, de pH 9,6 [200 \mug/ml] durante por lo menos 4,5 horas a 4ºC (en un armario frigorífico).

3.: La avidina en exceso es separada por lavado con una PBS [solución salina tamponada con fosfato] (de pH 7,6), para esto los sensores son sumergidos varias veces en una cápsula de Petri con una PBS (de pH 7,6). Los sensores son secados mediante aspiración del líquido con una bomba de vacío.

4.: A continuación de esto, los sensores son bloqueados durante 1 hora a la TA (temperatura ambiente) con 20 \mul de caseína al 3% en una PBS (de pH 7,6).

5.: La caseína es separada por lavado con una PBS (de pH 7,6).

6.: Los sensores revestidos con avidina se pueden almacenar en el armario frigorífico por lo menos durante 3 meses, después de una incubación con trehalosa al 2% en una PBS (de pH 7,6). Para esto, los sensores son incubados con 15 \mul de la solución de trehalosa a 37ºC en un armario de calentamiento hasta la evaporación del líquido. Antes de una utilización ulterior, la trehalosa secada es separada por lavado con una PBS (de pH 7,6).

B. Inmovilización de la sonda captadora biotinilada sobre los biosensores de un sólo uso, revestidos con avidina

1.: Los sensores son incubados durante 30 min., con 2 \mul de la sonda captadora biotinilada (sonda de ADN) [0,1 pmol/\mul] en un "tampón de perlas (Bead)".

2.: Los sensores son revestidos con 50 \mul de un 1x tampón de hibridación. El tampón de hibridación es a continuación separado directamente por aspiración

3.: Los sensores revestidos con un ADN, después una incubación con trehalosa al 2% en una PBS (de pH 7,6), se pueden almacenar asimismo en un armario frigorífico durante por lo menos 3 meses. Para esto, los sensores son incubados con 15 \mul de la solución de trehalosa a 37ºC en un armario de calentamiento hasta conseguir la evaporación del líquido. Antes de una utilización adicional, la trehalosa secada es separada por lavado con una PBS (de pH 7,6).

C. Hibridación en emparedado de una sonda captadora inmovilizada, el ARNr de la especie de alga que se ha de detectar y la sonda detectora marcada con digoxigenina

1.: La tanda típica de hibridación comprende 14 \mul y contiene un 1x tampón de hibridación, 0,25 \mug/\mul de ADN de esperma de arenque, 0,1 pmol/\mul de una sonda cooperante, 0,1 pmol/\mul de una sonda detectora marcada con dig y 6,5 \mul de un ARN (- 500 ng/\mul - 700 ng/\mul) de la especie de algas, que se ha detectar, el volumen que falta es completado con agua.

2.: La tanda de hibridación se calienta a 94ºC durante 4 min., y después de esto se enfría inmediatamente (con un bloque metálico a -20ºC). Por cada sensor se aplican 2 \mul de la tanda de hibridación.

3.: Se incuba durante 30 min., a 46ºC, en una cámara húmeda saturada con vapor. La cámara húmeda debería tener, al comienzo de la hibridación, ya una temperatura de 46ºC, y por lo tanto, precisamente al comienzo del procedimiento, debería ser colocada dentro de la estufa de hibridación.

4.: Después del transcurso del período de tiempo de incubación a 46ºC, los sensores se enfrían durante 5 min., a la temperatura ambiente.

D. Detección

1.: Después de la hibridación, los sensores se lavan con un tampón POP (de pH 6,45).

2.: Sigue una incubación de los sensores con 1,5 \mul de una POD anti-dig ([7,5 U/ml] en PBSBT) durante 30 min., a la temperatura ambiente en la cámara de incubación saturada con vapor.

3.: Después de la incubación, los sensores se lavan con un tampón POP (de pH 6,45).

4.: Después de esto los sensores se secan y, para la realización de la medición, se introducen dentro del aparato manual. La medición se efectúa después de haber añadido 20 \mul de un substrato de POD. La medición debería seguir en tal caso directamente a la etapa de lavado.

Hay que tener en cuenta que:

\sqbullet: Las etapas individuales deberían ser realizadas rápidamente unas tras de otras

\sqbullet: Los sensores son lavados por inmersión en una cápsula de Petri, llenada en cada caso con el respectivo tampón de lavado.

Tampones y soluciones 1. Tampón de carbonato, de pH 9,6

	Concentración
NaHCO_{3}	50 mM

El tampón es filtrado en condiciones estériles a través de un filtro de membrana de 0,22 \mum (filtro prolongación de jeringa).

2. 10x PBS (NaH_{2}PO_{4}*H_{2}O 0,5 M, NaCl 1,54 M, de pH 7,4)

	Concentración
NaH_{2}PO_{4}*H_{2}O	0,5 M
NaCl, de pH 7,4	1,54 M

Después de una dilución del 10x PBS a 1x PBS debería ser ensayado de nuevo el pH.

3."Tampón de perlas (Bead)"

	Concentración
NaCl	0,3 M
Tris, de pH 7,6	0,1 M

El tampón es tratado en autoclave después de la aplicación.

4. 4x tampón de hibridación

	Concentración
NaCl	0,3 M
Tris, de pH 8,0	80 mM
SDS	0,04%
SDS = dodecilsulfato de sodio.

Antes del uso, el tampón debería ser tratado en autoclave.

5. Tampón 10x POP, de pH 6,45

	Concentración
NaH_{2}PO_{4}*H_{2}O	0,5 M
NaCl, de pH 6,45	1 M

La solución es tratada en autoclave después de su formulación.

6. PBS-BT, de pH 7,4

	Concentración
PBS	1x
BSA	0,1% [p/v]
TWEEN 20, de pH 7,4	0,05% [v/v]
BSA = albúmina de suero bovino.

7. Substrato de POD

1,1 mg de hidrocloruro de N-fenil-1,4-fenilen-diamina (mediador ADPA, amino-difenil-amina) se disuelven en 110 \mul de EtOH. Esta solución se mezcla con 250 \mul de H_{2}O_{2} 100 mM (12 \mul de H_{2}O_{2} concentrado + 988 \mul de H_{2}O) y se completa hasta 25 ml con un tampón 1x POP (de pH 6,45). Esto corresponde a 1 mM de H_{2}O_{2} y 0,2 mM de ADPA.

Lista de signos de referencia

1.: Chip biosensor de un sólo uso

2.: Soporte de chip

3.: Sensor

4.: Electrodo de trabajo

5.: Electrodo de referencia

6.: Electrodo auxiliar

7.: Sonda captadora, específica para ciertas secuencias

8.: Biotina

9.: Avidina

10.: Secuencia de ácido nucleico, específica para ciertas secuencias, del alga que se ha de detectar (ARN, o ADN monocatenario)

11.: Sonda detectora

12.: Sonda cooperante

13.: Antígeno

14.: Enzima

15.: Anticuerpo.

<110> Stiftung Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung, Columbusstrasse, 27568 Bremerhaven, Alemania

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<120> Detección de algas tóxicas

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<130> AWI 01/0602DE

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<160> 20

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<210> 1

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Heterokonta, tóxica

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

acgacttcac cttcctct

\hfill

18

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<210> 2

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Prymnesium gl01A, tóxica

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgctcgccaa cgaggtgt

\hfill

18

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<210> 3

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Prymnesium gl02B, tóxica

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagaagtgct cgccaacg

\hfill

18

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<210> 4

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Pseudo-nitzschia

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagtacagcg caatcact

\hfill

18

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<210> 5

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Alexandrium tamarense/fundyense/catenella especie compleja, tóxica

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttcaaggcca aacacctg

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Alexandrium tamarense (América del Norte)

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

aacactccca ccaagcaa

\hfill

18

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<210> 7

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Gymnodinium mikimotoi especie compleja

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttccgggcaa ggtcgaaa

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Prorocentrum lima

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccttctgcta agtcgggt

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Prorocentrum lima

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctctagcatt tccacggg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Prorocentrum lima especie

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

acaccccaat tgcctcgt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

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<213> Prorocentrum lima especie cluster (racimo)

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcaatcagaa cccatcct

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Alexandrium ostenfeldii (G+15)

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

caccaaggtt ccaagcag

\hfill

18

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<210> 13

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Alexandrium ostenfeldii (D)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

tccatgtagc aatcgacc

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Pseudo-nitzschia australis

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

aacgtcgttc cgccaat

\hfill

17

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<210> 15

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Pseudo-nitzschia multiseries

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgccgccaaa aggcatgc

\hfill

18

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<210> 16

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Pseudo-nitzschia pungens

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<400> 16

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcaccctc agtacgac

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Alexandrium minutum

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<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

tccaggcaag gttgcaaa

\hfill

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Alexandrium tamarense

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<400> 18

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\hskip1,1cm

tgcacctctg ttggtrrtac att (R=A/G)

\hskip10,4cm

23

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<210> 19

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Alexandrium ostenfeldii (captadora)

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<400> 19

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\hskip-.1em\dddseqskip

caacccttcc caatagtcag gt

\hfill

22

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Claims

1. Procedimiento electroquímico de detección para la detección rápida in situ de algas tóxicas en una muestra líquida, mediando utilización de por lo menos una sonda captadora inmovilizada, que es específica para ciertas secuencias, destinada a la hibridación selectiva en condiciones de hibridación de una secuencia complementaria de ácido nucleico, que caracteriza inequívocamente al alga que se ha detectar, a base del ARNr de la subunidad pequeña 18S o de la subunidad grande 28S del ribosoma específico para ciertas algas, de por lo menos una sonda cooperante y de por lo menos una sonda detectora, ambas de las cuales están situadas con una distancia entre secuencias lo más pequeña que sea posible, con una diferencia máxima de 150 a 200 bases, cerca de la sonda captadora específica para ciertas secuencias, con las etapas principales de procedimiento:

\bullet: Preparación de la muestra líquida a investigar con el fin de liberar el ARN total de todas las algas contenidas en la muestra,

\bullet: Establecimiento de una tanda de hibridación mediante mezcladura del ARN total puesto en libertad con la sonda cooperante y con la sonda detectora, que está marcada con un antígeno, en un tampón de hibridación para la hibridación con secuencias complementarias de ácidos nucleicos del ARNr del ribosoma específico para ciertas algas, del alga que se ha de detectar en la muestra,

\bullet: Humectación de la sonda captadora específica para ciertas secuencias, con la tanda de hibridación, para la hibridación en emparedado de la secuencia de ácido de nucleico que caracteriza inequívocamente al alga que se ha de detectar, realizándose que la sonda cooperante hace posible o refuerza a la hibridación en emparedado y que la sonda detectora marca a la secuencia de ácido nucleico que se ha de detectar,

\bullet: Humectación de la sonda captadora específica para ciertas secuencias, después de haberse efectuado la hibridación en emparedado con un conjugado enzimático con un anticuerpo, que se fija específicamente al antígeno de la sonda detectora, y con una enzima, que cataliza la reacción de detección,

\bullet: Separación por enjuagado del conjugado enzimático no fijado,

\bullet: Detección amperométrica o ciclovoltamétrica de la reacción enzimática que se ha establecido al efectuarse la hibridación en emparedado del alga que se ha detectar, con una tensión de medición previamente establecida.

2. Procedimiento electroquímico de detección de acuerdo con la reivindicación 1, con una utilización de por lo menos una sonda captadora específica para ciertas secuencias, de acuerdo con la siguiente tabla

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(Tabla pasa a página siguiente)

1