ES2281070T3

ES2281070T3 - Modulacion de la accion del receptor de tnf.

Info

Publication number: ES2281070T3
Application number: ES93106981T
Authority: ES
Inventors: David Wallach; Cord Brakebusch
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1992-05-03
Filing date: 1993-04-29
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2013-04-29
Also published as: US20090088558A1; EP1512697A1; DE69334129D1; US20060210560A1; JP2004340975A; EP0568925A3; EP0568925B1; IL101769A; US7056505B2; ATE358178T1; EP0568925A2; DE69334129T2; JP3683263B2; JP3712746B2; IL101769A0; DK0568925T3; US7728111B2; US7429379B2; US20020142357A1; US6395267B1

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA MODULAR LA TRANSDUCCION DE LA SEÑAL Y/O LA DIVISION EN EL RECEPTORES DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (TNF-RS). LOS PEPTIDOS U OTRAS MOLECULAS PUEDEN INTERACTUAR TANTO CON EL RECEPTOR MISMO, COMO CON LAS PROTEINAS QUE INTERACTUAN CON EL RECEPTOR, MODULANDO DE ESTA MANERA EL FUNCIONAMIENTO NORMAL DEL TNF-RS. TALES PEPTIDOS U OTRAS MOLECULAS PUEDEN EMPLEARSE PARA APLICACIONES PROFILACTICAS Y TERAPEUTICAS EN ENFERMEDADES ASOCIADAS CON EL TNF.

Description

Modulación de la acción del receptor de TNF.

La presente invención se refiere a la modulación de la transducción de señal mediante los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF-Rs). Más concretamente, la invención proporciona métodos in vitro que utilizan péptidos y otras sustancias que interaccionan con el p55-TNF-R y que por lo tanto pueden emplearse en aplicaciones profilácticas y terapéuticas en las enfermedades asociadas con la función del TNF.

El TNF, una citoquina proinflamatoria producida principalmente por los macrófagos, contribuye a la defensa del huésped contra patógenos así como contra varias manifestaciones perniciosas de la inflamación mediante varios efectos diferentes en la función celular (Old, 1990; Beutler y Cerami, 1989). Estos efectos se inician cuando el TNF se une a receptores celulares específicos de la superficie de alta afinidad (TNF-Rs), que se expresan en la mayoría de los tipos de células (Baglioni et al., 1985; Beutler et al., 1985; Kull et al., 1985; Tsujimoto et al., 1985; Aggarwal et al., 1985; Israel et al., 1986). Los receptores proporcionan las señales intracelulares para la respuesta celular al TNF (Engelmann et al., 1990a). Se han identificado dos especies moleculares de los TNF-Rs, el p55-TNF-R y el p75-TNF-R, que se expresan de forma diferenciada en los diferentes tipos de células (Engelmann et al., 1990b; Brockhaus et al.,
1990).

Una de las características más distintivas del TNF comparado con otros mediadores del sistema inmunológico es su capacidad para inducir la muerte celular. En muchas enfermedades graves, tales como los trastornos autoinmunológicos, la artritis reumatoide, el rechazo de injertos y la enfermedad injerto-contra-huésped, el TNF parece ser una causa principal de la destrucción patológica de tejidos. Por tanto, el bloqueo de la actividad del TNF en estas condiciones tiene mucha importancia a la hora de desarrollar nuevas terapias para dichas enfermedades.

Por otro lado, en algunas otras situaciones, puede resultar beneficioso potenciar la función del TNF, por ejemplo, en situaciones en los que sus actividades antitumorales o antibióticas son beneficiosas.

El mediador principal del efecto citotóxico del TNF en las células fibroblastoides y epiteliales es el p55-TNF-R, que también es el tipo del TNF-R prevalente en estas líneas de células. El bloqueo de este receptor suprime el efecto citotóxico del TNF, mientras que la inducción de la agregación de las moléculas receptores puede mimetizar el efecto citotóxico del TNF.

Se ha demostrado que la forma soluble de este receptor, así como la forma soluble del otro (p75) TNF-R, tienen efectos inhibidores sobre la función del TNF. Se presentaron indicios de que estas formas solubles se derivan proteolíticamente de formas presentes en la superficie celular (Nophar et al., 1990; Porteu y Nathan, 1990; Porteu et al., 1991).

Shalaby et al. (J. Exp. Med. 172 (1990), 1517-1520) y EP-A1 0 444 560 describen anticuerpos dirigidos contra los receptores del TNF y se ha podido demostrar que la unión del anticuerpo al TNF-R puede interferir con la transducción de señal. Sin embargo, estos documentos no indican qué regiones del TNF-R son las responsables de la transducción de señal y, por lo tanto, no describen métodos para la identificación eficaz de las sustancias que pueden modular o inhibir la transducción de señal por parte del TNF-R.

Tanto la señalización de los receptores como la escisión de los receptores parecen reflejar interacciones entre el receptor y algunas proteínas efectoras de la célula; la escisión mediante la interacción con proteasas susceptibles a la regulación, y la señalización mediante la interacción con proteínas con algo de actividad de señalización.

Por tanto, la presente invención proporciona un método para la identificación de moléculas que interaccionan con un TNF-R para modular la transducción de señal por el TNF-R, que comprende las etapas que se describen en la reivindicación 1.

La presente invención también proporciona un método para identificar moléculas que interaccionan con un TNF-R para modular la transducción de señal mediante el TNF-R que comprende las etapas tales como se describen en la reivindicación 2.

En una realización preferida, dicho método se utiliza para identificar una molécula que interacciona con el TNF-R para inhibir la transducción de señal mediante el TNF-R, en el cual dicha etapa (c) comprende la identificación de dicha molécula como capaz de inhibir la transducción de señal del TNF-R.

Esta interferencia de la molécula y del TNF-R influye en el funcionamiento normal de los TNF-R o influye en una proteína efectora que interacciona con el mismo, y así modula la transducción de señal mediante la inhibición parcial o total de la misma.

Los péptidos y otras sustancias útiles en los métodos in vitro de la invención pueden producirse mediante métodos convencionales o recombinantes.

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La figura 1 muestra las secuencias del nucleótido y del aminoácido del receptor p55 TNF, en las cuales las porciones indicadas en un contorno son las secuencias de los dominios líder y transmembrana y las fechas indican las mutaciones y deleciones realizadas.

La figura 2 ilustra los diferentes mutantes de deleción examinados

La figura 3 demuestra que el mutante del p55-TNF-R del cual se eliminaron los aminoácidos 415-426 sigue siendo capaz de transmitir señales de un efecto citotóxico mientras que el mutante \Delta405-426, del cual se eliminaron 10 aminoácidos adicionales no lo es.

Se identificó una pequeña secuencia de aminoácidos en la parte intracelular del receptor del p55-TNF que demostró ser esencial para que el TNF desencadenara la muerte celular. Los mutantes del p55-TNF-R con deleciones de la terminal C en la parte intracelular no pueden actuar como señal para el efecto citotóxico si dicha secuencia de aminoácidos se suprimió. En cambio, receptores truncados que contienen esta secuencia de aminoácidos son plenamente capaces de inducir la muerte celular. Las moléculas que pueden unirse específicamente a esta secuencia así como las moléculas que mimetizan la estructura de esta secuencia pero que carecen de su capacidad para estimular la muerte celular pueden emplearse como inhibidores intracelulares del TNF. Inhibirán la interacción de los TNF-R con las moléculas que actúan aguas abajo en la cadena de transducción de señal.

Se identificaron los clones de las células A9 que expresan la cepa natural y la forma mutante del p55-TNF-R humano mediante la unión del TNF humano radiomarcado. Para las investigaciones posteriores, se emplearon los clones que potenciaron por un factor de aproximadamente diez la unión comparada con las células A9 no transfectadas o transfectadas con control, es decir, las células transfectadas sólo con el plásmido responsable de la resistencia a neomicina.

Se observaron diferentes efectos en las células transfectadas con la cepa natural o la forma mutante en cuanto a la sensibilidad de dichas células transfectadas al efecto citotóxico del TNF con anticuerpos monoclonales contra el p55-TNF-R humano que pueden mimetizar la acción del TNF. Las células transfectadas con la cepa natural humana del p55-TNF-R se hicieron muy sensibles a la acción citotóxica de estos anticuerpos, que no mostraron ningún efecto en las células A9 no transfectadas o transfectadas con control. En cambio, las células transfectadas que expresaban los receptores mutantes con deleción de los aminoácidos 405 a 426 no eran sensibles en absoluto a los anticuerpos contra el p55-TNF-R humano, a pesar de niveles similares de expresión del receptor. No obstante, estas células no pudieron responder al TNF humano que actuaba a través de los receptores murinos endógenos, lo que demostró que la falta de sensibilidad no se debía a un bloqueo después del receptor en la vía de transducción de señal.

Sin embargo, los mutantes del receptor (del:415-426), con una deleción de 10 aminoácidos menos que en el mutante anterior, indujeron en las células transfectadas una alta sensibilidad a la acción citotóxica de los anticuerpos contra el p55-TNF-R humano.

Lo señalado arriba indica que los aminoácidos 405 a 414, o parte de los mismos, son esenciales para la señalización del p55-TNF-R humano para el efecto citotóxico del TNF, mientras que los aminoácidos 415 a 426 no son esenciales.

Tal como se indica arriba, la presente invención proporciona métodos para la identificación de péptidos y substratos que pueden interaccionar con el receptor mismo o una cierta región del mismo.

Con este fin, las proteínas que interaccionan con las regiones relevantes del receptor se aíslan de los extractos celulares, por ejemplo, mediante la purificación de afinidad de ligandos con estas regiones como ligandos. Posteriormente, se hace un cribado para encontrar sustancias que pueden unirse al receptor, lo que interfiere en su interacción entre sí. Dicho cribado se lleva a cabo de acuerdo con uno de los siguientes métodos:

1) Los péptidos diana que corresponden a las regiones de aminoácidos del TNF-R caracterizadas como tal y que resultan ser cruciales para la transducción de señal se sintetizan y las bibliotecas de péptidos se criban para ligandos que se unen a las mismas. Los péptidos que se unen a estas regiones se someten a un cribado adicional para encontrar aquellos que también se unen al TNF-R. Finalmente, los péptidos capaces de unión de alta afinidad con los péptidos diana y el TNF-R se criban para la capacidad del péptido para ejercer la actividad biológica deseada, es decir, para influir en el funcionamiento normal del TNF-R.

2) De una manera parecida, una variedad de moléculas orgánicas, incluidos los fármacos conocidos por otras indicaciones, se criban para su capacidad de interferir en el funcionamiento normal del TNF-R. Esta capacidad se determina examinando si estas moléculas pueden unirse o interaccionar de forma diferente con los aminoácidos o regiones de aminoácidos caracterizadas anteriormente que han resultado ser cruciales para la transducción de señal.

3) Además de las moléculas orgánicas, se criban también los caldos de material biológico tal como productos de fermentación de bacterias, de hongos, y de células eucarióticas, y preparaciones no procesadas de citoquinas con los péptidos de las secuencias de aminoácidos diana descritos anteriormente. A continuación, las moléculas obtenidas de este cribado se someten a un cribado adicional para determinar su capacidad de realizar la función biológica
deseada.

De la misma manera, las proteínas efectoras obtenidas, por ejemplo, después de someter todos los extractos a una cromatografía en una resina a la cual están unidos los péptidos diana, se emplean para el cribado de las bibliotecas de péptidos descritas anteriormente, moléculas orgánicas y caldos biológicos. A continuación, las moléculas que se unen a las proteínas efectoras se examinan para ver si son capaces de inhibir la interacción entre las proteínas efectoras y el TNF-R y por ende si son capaces de interferir en el funcionamiento normal del TNF-R.

Como alternativa, se diseñan moléculas que encajan espacialmente con la estructura cuaternaria de las regiones de aminoácidos en el receptor o la proteína efectora, y por lo tanto, interfieren en la interacción entre ambos.

Las moléculas activas obtenidas con los procedimientos anteriores, en tanto que son sustancias biológicas, pueden prepararse también mediante abordajes biotecnológicos. De esta forma, se hará posible la producción masiva de estas moléculas. Los péptidos pueden producirse bien con métodos conocidos de síntesis de péptidos o con la expresión de vectores que contienen las secuencias de ADN que los codifican. Otras moléculas, si se preparan con métodos enzimáticos, pueden sintetizarse con las enzimas indicadas en las células apropiadas en cultivo.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1 Construcción de los receptores mutantes del p55-TNF

Se digirió el ADNc del p55-TNF humano (Nophar et al., 1990) con las enzimas de restricción BanII y NheI para eliminar grandes tramos de las regiones 5' y 3' no codificadoras. Se generaron los mutantes \Delta:405-426 y \Delta:415-426 (figura 3) mediante la mutación dirigida por oligonucleótidos de esta forma acortada de ADNc, con el kit de mutagénesis "Altered Status" de Promega. Se insertaron los codones de terminación después de la cisteína 404 (mutante \Delta:405-426; aminoácidos en el receptor se numeran según Loetscher et al., 1990) con el oligonucleótido 5'CTG CTG GGC TGC TAG CCT GGA GGA CAT 3', y después de la glicina 414 (mutante \Delta:416-426), con el oligonucleótido 5' AAG CCC TTT GCG GCT AGC CCC GCC GCC CT 3'. Se prepararon otros mutantes del ADNc de forma similar con los oligonucleótidos apropiados para dirigir las mutaciones deseadas para los demás mutantes investigados. Se introdujeron el ADN natural y el ADNc mutado en el vector de expresión eucariótica pMPSVEH (Artelt et al., 1988), que contiene el promotor del virus del sarcoma mieloproliferativo, un intrón SV40 y la señal SV40 de poliadenilación.

Ejemplo 2 Expresión del receptor natural y los receptores mutantes en células de cultivo

Las células del linaje A9 murino se cultivaron en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), que contenía suero fetal bovino, al 10% 100 unidades/mL de penicilina y 100 \mug/mL de estreptomicina (el medio de crecimiento). Se transfectaron las células con las construcciones de expresión que codificaban el receptor natural y los receptores mutantes, junto con el plásmido responsable de la resistencia a neomicina pSV2neo, con el método de precipitación con fosfato de calcio (Graham y van der Eb, 1973). Después de 10 a 14 días de selección en el medio de crecimiento que contenía 500 \mug/mL de G418 (Sigma), se aislaron las colonias resistentes y se examinaron para indicios de expresión del p55-TNF-R humano (hu-p55-TNF-R) mediante la medición de la unión del TNF a las células. De todas las células transfectadas, se analizaron al menos tres clones diferentes en los ensayos de funcionalidad para comprobar las variaciones en sus propiedades en función del clon.

Ejemplo 3 Determinación de la unión del TNF a las células

El Dr. G. Adolf del Instituto Boehringer, Viena, Austria, fue tan amable de proporcionar el TNF-\alpha human recombinante (TNF, 5 x 10^{7} unidades/mg de proteína), producido por Genentech Co., San Francisco, Ca. El TNF se radiomarcó con cloramina T hasta una radioactividad específica de 2000 mCi/mmol (Israel et al., 1986). Para determinar la unión del TNF, se sembraron las células en placas de cultivo de tejido de 15 mm a una densidad de 2,5 x 10^{5} células/placa. Después de 24 horas de incubación a 37ºC, las placas se transfirieron a hielo, se eliminó el medio de cultivo y el TNF radiomarcado se aplicó a una concentración de 0,1 mM, bien solo o con un exceso de 1000 veces del TNF no marcado, en 200 \muL de PBS (0,154 de cloruro de sodio más 10 mM de fosfato de sodio, pH 7,4) que contenían 1 mM de CaCl_{2}, 1 mM de MgCL_{2}, BSA al 0,5% y NaN al 0,02% (tampón de unión). Después de 3 horas de incubación sobre hielo, las células se aclararon y se desprendieron mediante incubación en PBS que contenía 5 mM de EDTA. Se midió la actividad ligada a las células con un contador de radiación gama.

Ejemplo 4 Cuantificación del efecto citotóxico del TNF y de los anticuerpos al p55-TNF-R humano

Se sembraron las células en placas de 96 pocillos 24 horas antes del ensayo a una densidad de 30.000 células por pocillo. A continuación, se intercambió el medio de crecimiento por el medio de crecimiento que contenía cicloheximida (CHI, 25 \mug/mL para las células HeLa y 50 \mug/mL para todos los demás tipos de células) y el TNF-\alpha humano o anticuerpos monoclonales contra el p55 TNF-\alpha (Engelmann et al., 1990b). Después de unas 11 horas adicionales de incubación a 37ºC, se evaluó la viabilidad de las células en ensayo con una red neutral de captación tal como se ha descrito anteriormente (Wallach, 1984).

Ejemplo 5 Aislamiento de las proteínas efectoras mediante la purificación con afinidad de ligandos

Se entrelazan los péptidos sintéticos cuyas secuencias corresponden a aquellas regiones en los receptores que resultan ser cruciales para la señalización a una resina sólida, por ejemplo, un gel de sefarosa, agarosa, o agarosa de acrilamido hidrazido o parecido, mediante un enlazador covalente tal como el glutaraldehído. Se aplican los extractos de las células o las membranas celulares a una columna de este tipo y las proteínas que se unen a ella se eluyen, por ejemplo, mediante una reducción del pH. Se recogen las fracciones que contienen las proteínas y se someten a una purificación adicional. En esta purificación adicional, se pueden monitorizar las proteínas mediante la determinación de su actividad específica de señalización.

Ejemplo 6 Preparación de anticuerpos o fragmentos de los mismos que interaccionan con el TNF-R o con las proteínas efectoras

El TNF-R o las regiones del mismo que resultan cruciales para su función, o proteínas efectoras purificadas que se interaccionan con éstos, se inyectan en ratones, conejos, u otros animales apropiados habitualmente utilizados para la producción de anticuerpos, según los protocolos apropiados. Se producen los anticuerpos monoclonales contra las proteínas indicadas anteriormente con los bazos de los animales inmunizados de la forma habitual. El ADN extraído de las células esplénicas o de los hibridomas producidos de las mismas se utiliza para producir los anticuerpos mediante tecnología recombinante de ADN. De esta forma, se obtienen los anticuerpos que modulan la función del TNF al interferir con la transducción de señal.

Mediante el uso del ADN que codifica los anticuerpos, se construyen moléculas más pequeñas con la misma actividad de unión cuya estructura corresponde a las regiones hipervariables en los anticuerpos y derivados de los mismos. Se diseñan estas moléculas de tal forma que puedan penetrar en las membranas celulares donde interaccionan con el dominio citoplásmico de los receptores o con las proteínas efectoras citoplásmicas.

Ejemplo 7 Identificación de moléculas orgánicas o de otros componentes de caldos biológicos que interfieren en la interacción entre las proteínas receptoras y efectoras

Se marcan las proteínas efectoras aisladas y purificadas según lo descrito en el ejemplo 5 con, por ejemplo, ^{125}I u otro marcador radioactivo, o con un marcador fluorescente, y se mide la eficacia de su interacción con las moléculas receptoras ancladas en la fase sólida o fragmentos de las mismas en presencia de varios caldos biológicos o moléculas sintéticas orgánicas con tal de identificar una molécula o unas moléculas que son capaces de interferir en esta interacción. Mediante el mismo método, dichas moléculas pueden monitorizarse mientras se purifican de sus preparaciones sin tratar.

Ejemplo 8 Preparación de un péptido capaz de interferir en la función del TNF-R (la transducción de señal o eliminación) A. Síntesis de los péptidos diana

El péptido diana tiene la siguiente secuencia:

: Péptido D: Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly

El péptido D corresponde a los aminoácidos 405-414 de la secuencia de aminoácidos del TNF-R tal como se indica en la figura 1.

El péptido diana se sintetiza con derivados de aminoácidos protegidos con Fmoc, según los procedimientos habituales, por ejemplo, según Chang, C.D., y Meienhoffer, J., (1978): Grandas A., et al. (1989); Fournier A., et al. (1989): Stewart M.J. e Young J.D. (1984); o métodos similares.

B. Síntesis de la biblioteca combinatorial de péptidos Microesferas y enlazadores

La biblioteca combinatorial de péptidos se sintetiza sobre microesferas portadoras apropiadas, por ejemplo, microesferas hechas de poliestireno enlazado con divenilo de benceno (DVB al 1%), con un diámetro de aproximadamente 200 micras, y con aproximadamente un mili-equivalente de sitios de unión, por ejemplo, aminas primarias, o un grupo clorometilo lábil en condiciones ácidas. Enlazadores tales como la cistamina pueden acoplarse a las microesferas con un entre-enlazador apropiado, por ejemplo, glutardialdehido. Se realiza la síntesis de péptidos sobre la amina libre de la cistamina. En la terminación de la secuencia, se escinde el puente de cistamina con una reducción suave, por ejemplo, con ditiotreitol, lo que resulta en un péptido con un grupo C terminal libre de SH. Este grupo, que es único en muchos péptidos, sirve como un sitio de modificación específico para la unión de una molécula de reconocimiento, por ejemplo, mediante reacción con iminobiotina-maleimida.

Estrategia de síntesis de la biblioteca La biblioteca primaria

Se diseña la estrategia de síntesis de la biblioteca para permitir el cribado de los péptidos de tamaño de 9 residuos o más, y comprende hasta aproximadamente 100 derivados de aminoácidos diferentes. Los primeros 6 aminoácidos se sintetizan aleatoriamente mediante la incorporación de todos los diferentes derivados de aminoácidos en cada ciclo de síntesis. En los últimos 3 ciclos de síntesis, una secuencia única de aminoácidos se sintetiza para cada microesfera, de acuerdo con lo siguiente:

Después de la incorporación del aminoácido número 6, se alicuotan las microesferas. El número de alícuotas es el mismo que el número de diferentes derivados de aminoácidos. A continuación, un único derivado de aminoácido se incorpora en la posición 7 de la cadena creciente de polipéptido de todas las microesferas en una alícuota. A continuación, las microesferas se mezclan juntas y se redistribuyen como se ha indicado anteriormente. Este procedimiento se repite 3 veces para que se incorpore un total de 3 residuos únicos de aminoácidos por cada microesfera. Este formato de síntesis se llama "síntesis estructurada" para diferenciarlo del formato de síntesis aleatoria utilizado para sintetizar el péptido en las posiciones 1 a 6.

A continuación, la biblioteca primaria se somete a un cribado tal como se describe más abajo. Los resultados del cribado permiten la selección de secuencias específicas de tripéptidos capaces de unirse a las secuencias diana.

La biblioteca secundaria

La síntesis de la biblioteca secundaria se realiza después de haber identificado la(s) secuencia(s) indicada(s) de tripéptidos mediante el cribado de la biblioteca primaria. Se realiza la síntesis de la biblioteca secundaria de manera parecida en concepto a la empleada para la biblioteca primaria. Los primeros 3 residuos aminoácidos se sintetizan mediante una síntesis estructurada, y los últimos 3 aminoácidos se sintetizan según la(s) secuencia(s) derivada(s) del cribado de la biblioteca primaria.

La biblioteca terciaria

La biblioteca terciaria se sintetiza de forma parecida en concepto a la empleada para la biblioteca primaria y la secundaria. Los primeros 3 residuos aminoácidos se sintetizan mediante una síntesis estructurada, y a continuación, los últimos 6 residuos aminoácidos se incorporan según la(s) secuencia(s) derivada(s) del cribado de las bibliotecas primarias y secundarias.

C. Síntesis extendida/procedimiento de cribado

El procedimiento descrito anteriormente permite la identificación de péptidos con 9 residuos aminoácidos que son capaces de unirse específicamente a los ligandos diana. Es posible continuar el procedimiento de síntesis/cribado con tal de preparar péptidos más largos, que posiblemente darían mejor rendimiento. También podría ser ventajoso someter al péptido a modificaciones adicionales, como por ejemplo una estabilización de la conformación del péptido mediante el entre-enlazamiento de las cadenas secundarias, una protección contra escisión proteolítica mediante una modificación del enlace peptídico, un aumento en la potencial de transporte a través de la membrana mediante conjugación de residuos hidrófobos a las cadenas secundarias, etc., con tal de mejorar su actividad. Después, es posible llevar a cabo la modificación según la estrategia descrita más arriba. Este planteamiento permite un cribado rápido de muchos péptidos modificados y reduce drásticamente el tiempo necesario para identificar el péptido
deseado.

D. Cribado de la biblioteca

El cribado de la biblioteca (péptidos) se divide en 3 fases:

: Fase A: Cribado para la unión de ligandos, es decir, la unión al péptido diana y a la proteína nativa.

: Fase B: Cribado para la capacidad de los péptidos de bloquear la transducción de señal del TNF-R.

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Fase A

Cribado para la capacidad de unión de ligandos

Las bibliotecas se exponen al ligando, por ejemplo, cualquiera de los péptidos diana indicados más arriba o el TNF-R purificado. La detección del ligando unido es posible mediante la monitorización de un marcaje directo del ligando, por ejemplo, con un colorante fluorescente, tal como rodamina tetrametilo, o con anticuerpos específicos policlonales y un segundo anticuerpo apropiado acoplado a un marcado indicado, por ejemplo, la enzima alcalino fosfatasa o peroxidasa de rábano picante. La enzima unida se detecta con un sustrato apropiado, por ejemplo, para alcalino fosfatasa, ECIP acoplado a una sal tetrazolio tal como nitroazul tetrazolio, o para peroxidasa de rábano picante, cloronaftol o benzidino tetrametilo.

La detección de las microesferas que unen el ligando se realiza siguiendo la fluorescencia de las microesferas, por ejemplo mediante un equipo de FACS, o siguiendo el color de las microesferas mediante una inspección visual. Las microesferas marcadas se recuperan de la mezcla y los péptidos de las microesferas individuales se secuencian con un secuenciador automático de péptidos. Los datos de la secuencia obtenidos permiten el diseño de bibliotecas adicionales.

Después de detección de las microesferas que se unen al péptido diana, se confirma su unión a la proteína que lleva el péptido diana. Esto se lleva a cabo de acuerdo con un procedimiento parecido al que se utiliza para la determinación de la unión del péptido diana, pero con el empleo de un TNF-R altamente purificado como ligando.

Fase B

Cribado para bioactividad

Después de la identificación de los péptidos capaces de unirse con alta afinidad a los péptidos diana y al TNF-R mediante ciclos de cribado de la biblioteca según lo descrito anteriormente, se lleva a cabo un cribado para detectar la capacidad del péptido para efectuar la actividad biológica deseada. Los péptidos que están pensados para llevar a cabo su acción dentro del citoplasma son aquellos pensados para bloquear la transducción de señal del TNF-R.

Ejemplo 9 Cribado de péptidos pensados para la inhibición de la transducción de señal por el TNF-R

El cribado para péptidos capaces de inhibir la transducción de señal por el TNR-R es más complicado. El principal obstáculo para la capacidad de los péptidos de interferir en la capacidad del TNF-R de transducir una señal es su necesidad de atravesar la membrana celular y acumularse a una concentración lo suficientemente alta en el citoplasma de la célula diana.

Por lo tanto, el cribado tiene que dividirse en diferentes procesos. En el cribado inicial, que se lleva a cabo tal como se ha descrito anteriormente, los péptidos se ensayan para detectar su capacidad (cuando estén en las microesferas) de unirse a los péptidos diana y al dominio purificado intracelular de la molécula del TNF-R. Aquellos péptidos capaces de unirse se sometan a un cribado para detectar su capacidad para bloquear la transducción de señal mediante el TNF-R. Con tal de facilitar el transporte del péptido a través de la membrana y en el citoplasma, los péptidos se modifican químicamente en las microesferas por ejemplo (1) mediante la oxidación de metionina a sulfoxido, (2) mediante la sustitución del enlace del péptido con su isoéster quetometileno (COCH_{2}) (Zacharia S., et al. (1991)), (3) mediante la introducción de derivados de lauroil (Muranishi et al. (1991)).

Se lleva a cabo la modificación de los péptidos cuando los péptidos están en las microesferas. Los péptidos modificados se sometan a un cribado para detectar su capacidad de unirse al dominio intracelular del TNF-R. Aquellos péptidos que retienen la capacidad de unirse al TNF-R se escinden de las esferas y se sometan a ensayos adicionales en células vivas que expresan el TNF-R para detectar su capacidad de atravesar la membrana y bloquear la transducción de la señal del TNF-R.

Ejemplo 10 Creación de inhibidores de la señal que quepan espacialmente en las regiones de los TNF-Rs que resultan ser críticos para la función

Se determina la estructura en 3 dimensiones del TNF-R mediante cristalografía de rayos X de los cristales producidos del mismo. Se debe prestar especial atención a la estructura de las regiones que resultan ser críticas para la señalización o la escisión del receptor mediante el análisis de mutaciones (fig. 3). Las estructuras en 3 dimensiones de las moléculas conocidas se comparan con las estructuras concebidas mediante el análisis descrito anteriormente con tal de complementar la estructura de esas regiones críticas. Las moléculas que se determinan de esta forma que se asemejan a la estructura derivada complementaria se examinan para su capacidad para interferir en la señalización o la escisión de los receptores. Si se encuentra un indicio de un efecto, estas moléculas se modifican creando derivados de las mismas con tal de acercarse más a las estructuras complementarias deseadas. Con una modificación secuencial de este tipo de la estructura y la determinación de la bioactividad, se obtienen inhibidores efectivos de la señalización y de la proteolisis.

Ejemplo 11 Creación de moléculas recombinantes de ADN que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos activos y otras moléculas y su expresión

Los péptidos y otras moléculas pueden también prepararse mediante técnicas de ingeniería genética y su preparación implica todas las herramientas utilizadas en estas técnicas. De esta forma, se proporcionan moléculas de ADN que comprenden la secuencia nucleótido que codifica dichos péptidos y otras moléculas biológicas. Estas moléculas de ADN pueden ser ADN genómico, ADNc, ADN sintético y una combinación de los mismos.

La creación de moléculas de ADN que codifican dichos péptidos y otras moléculas se realiza de acuerdo con métodos convencionales, una vez que se haya determinado la secuencia de aminoácidos de estos péptidos y otras moléculas.

La expresión de las proteínas recombinantes puede efectuarse en células eucarióticas, bacterias o levaduras con los vectores de expresión apropiados. Puede emplearse cualquier método conocido en el estado de la técnica.

Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican los péptidos u otras moléculas obtenidos mediante los métodos descritos anteriormente se insertan en los vectores de expresión con una estructura apropiada mediante métodos bien conocidos en la técnica (véase Maniatis et al., (1982)). El ADNc bicatenario se enlaza con los vectores del plásmido mediante prolongación con homopolímeros o enlaces de restricción con el uso de enlazadores sintéticos de ADN o técnicas de ligación despuntada. Se utilizan las ligasas de ADN para ligar las moléculas de ADN y se evita la unión no deseada mediante un tratamiento con alcalino fosfatasa.

Con tal de ser capaz de expresar una sustancia biológica deseada, por ejemplo, un péptido o una proteína (de ahora en adelante "proteína" con tal de simplificar el texto), un vector de expresión debería también comprender secuencias específicas de nucleótidos que contienen información que regula la trascripción y traducción, enlazadas con el ADN que codifica la proteína deseada de tal forma que permita la expresión génica y la producción de la proteína. Primero, para poder transcribir el gen, tiene que precederse con un promotor reconocible para la polimerasa de ARN a la que se une la polimerasa y de esta forma se inicia el proceso de trascripción. Existen una variedad de dichos promotores que se emplean y que funcionan con eficacias diferentes (promotores fuertes y débiles). Son diferentes para células procarióticas y eucarióticas.

Los promotores que pueden emplearse en la presente invención pueden ser constitutivos, por ejemplo, el promotor int del bacteriofago \Delta, el promotor bla del gen \beta-lactamasa de pBR322, y el promotor CAT del gen de cloramfenicol acetilo transferasa de pPR325, etc., o inducibles, tal como los promotores procarióticos que incluyen los promotores principales derecho e izquierdo del bacteriofago \Delta (P_{L} y P_{R}), los promotores trp, recA, lacZ, lacI, ompF y gal de E. coli, o el promotor híbrido tryp-lac, etc. (Glick, B.R. (1987)).

Aparte del uso de promotores fuertes para generar grandes cantidades de ARNm, con tal de conseguir altos niveles de expresión génica en las células procarióticas, también es necesario emplear los sitios de unión ribosómicos para asegurar que el ARNm se traduzca de forma eficaz. Un ejemplo es la secuencia Shine-Dalgarno (secuencia SD) posicionada a una distancia apropiada del codón de iniciación y complementaria a la secuencia 3'-terminal de 16S ARN.

Para los huéspedes eucarióticos, pueden emplearse secuencias diferentes que regulan la trascripción y traducción de acuerdo con la naturaleza del huésped. Pueden derivarse de las fuentes víricas, tales como los adenovirus, virus del papiloma bovino, virus simio, o parecidas, donde las señales de regulación se asocian con un gen en concreto que tiene un alto nivel de expresión. Ejemplos son el promotor TK del virus Herpes, el promotor temprano SV40, el promotor de levadura del gen ga14, etc. Las señales de regulación que inicien la trascripción pueden seleccionarse teniendo en cuenta la represión y activación, con tal de que la expresión de los genes pueda modularse.

Se inserta la molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica los péptidos u otras moléculas de la invención y las señales de regulación de trascripción y traducción enlazadas de forma operacional en un vector que es capaz de integrar las secuencias génicas deseadas en el cromosoma de las células huésped. Las células que se han integrado el ADN insertado de forma estable en sus cromosomas pueden seleccionarse también mediante la introducción de uno o más marcadores que permiten la selección de células huésped que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar prototrofia a un huésped auxotrófico, resistencia a las sustancias biocidas tales como los antibióticos, o metales pesados tales como el cobre o parecido. El gen marcador seleccionado puede enlazarse directamente con la secuencia génica de ADN para expresarse o introducirse en la misma célula mediante cotransfección. Pueden precisarse también elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm monocatenario que se une a las proteínas. Estos elementos pueden incluir señales de corte y empalme, así como promotores de trascripción, potenciadores, y señales de terminación. Los vectores de expresión de ADNc que incorporan dichos elementos incluyen aquellos descritos por Okayama H., (1983).

En una realización preferida, la molécula de ADN insertada se incorpora en un plásmido o un vector vírico capaz de replicarse de forma autónoma en el huésped receptor. Los factores de importancia al seleccionar un plásmido o vector vírico en concreto incluyen la facilidad con que las células receptoras que contienen el vector pueden reconocerse y seleccionarse de entre aquellas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped específico; y si es deseable poder cambiar el vector entre células huésped de diferentes especias.

Los vectores procarióticos preferidos incluyen plásmidos tales como aquellos capaces de replicarse en E. coli, por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, etc. (véase Maniatis et al., (1982)); plásmidos de bacilos tales como pC194, pC221, pT127, etc. (Gryczan T., (1982)); plásmidos de estreptomices tales como pIJ101 (Kendall, K.J. et al., (1987)); bacteriófagos de estreptomices tales como 0C31 (Chater, K.F. et al., en Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, (1986)), y plásmidos de pseudomonas (John, J.F., et al. (1986), y Izaki, K. (1978)).

Los vectores eucarióticos preferidos incluyen BPV, vaccínea, SV40, círculo de 2 micra, etc., o derivados de los mismos. Dichos plásmidos están bien conocidos en el estado de la técnica (Botstein D., et al. (1982); Broach, J.R., en: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance (1981); Broach, J.R., (1982); Bolton, D.P., et al. (1980); Maniatis, T., en: Cell Biology: A Comprehensive Treatise. Vol. 3: Gene Expression, (1980)).

Una vez que el vector o la secuencia de ADN que contiene el/los constructo/s se ha preparado para expresión, el/los constructo/s de ADN pueden introducirse en una célula huésped indicada mediante cualquiera de los métodos apropiados, tales como transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa, etc.

Las células huésped a emplear en esta invención pueden ser o procarióticas o eucarióticas. Huéspedes procarióticos preferidos incluyen bacterias tales como E. coli, bacilos, estreptomices, pseudomonas, salmonela, serratia, etc. El huésped procariótico más preferido es E. coli. Varios huéspedes bacterianos de especial interés incluyen E. coli K12 cepa 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F^{-}, lamba^{-}, prototrópico (ATCC 27325)), y otras enterobacterias tales como Salmonella tryphimurium o Serratia marcescens y varias especies de pseudomonas. En estas condiciones, la proteína no estará glicosilada. El huésped procariótico tiene que ser compatible con el replicón y la secuencia de control en el plásmido de expresión.

Los huéspedes preferidos son células mamíferas, por ejemplo, células humanas, de mono, murinas, y del ovario del hámster chino (CHO), porque proporcionan modificaciones pos-traducción a las moléculas tales como un plegamiento correcto o una glicosilación en los sitios correctos. También, las células de levadura pueden efectuar modificaciones pos-traducción a los péptidos tales como la glicosilación. Existe un número de estrategias con ADN recombinante que utilizan secuencias de promotor fuerte y un alto número de copias de plásmidos que pueden emplearse para la producción de las proteínas deseadas en la levadura. La levadura reconoce las secuencias de encabezamiento en los productos génicos clonados de mamíferos y secreta los péptidos que llevan las secuencias de encabezamiento (es decir, pre-péptidos).

Después de la introducción del vector, las células huésped se cultivan en un medio selectivo, que selecciona las células que contienen el vector. La expresión de la/s secuencia/s del gen clonado resulta en la producción de las proteínas deseadas.

Se realiza la purificación de las proteínas recombinantes de acuerdo con cualquiera de los métodos conocidos para este fin.

Lista de referencias

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Yeda Research and Development Co., Ltd.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: P.O.Box 95

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Rehoboth

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: Israel

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL (ZIP): 76100

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Modulación de la Acción de los Receptores TNF.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR EL ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: compatible con PC IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release nº1.0, Versión nº 1.25 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.800000\baselineskip

\hskip1.4cm

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 93 10 6981.9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCTGGGCT GCTAGCCTGG AGGACAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCCCTTTG CGGCTAGCCC CGCCGCCCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Glu Asn Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Thr Gln Asp Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Gln Asp Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2715 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 455 amino ácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

3

4

Claims

1. Un método para identificar las moléculas que interaccionan con el TNF-R para modular la transducción de señal mediante el TNF-R, que comprende:

(a) preparar un péptido diana con los aminoácidos 405 a 414 del p-55-TNF-R humano indicado en la figura 1;

(b) cribar las bibliotecas de péptidos, una variedad de moléculas orgánicas y/o un caldo biológico con dicho péptido diana; e

(c) identificar cualquier molécula que se une a aminoácidos 405 a 414 del p-55-TNF-R humano indicado en la figura 1.

2. Un método para identificar moléculas que se unen a aminoácidos 405 a 414 del p-55-TNF-R humano indicado en la figura 1 y que interaccionan con el TNF-R para modular la transducción de señal mediante el TNF-R, que comprende:

(b) cribar las bibliotecas de péptidos, una variedad de moléculas orgánicas y/o un caldo biológico con dicho péptido diana e identificar cualquier molécula que se una a dicho péptido diana; y

(c) cribar cualquier molécula identificada en la etapa (b) por su capacidad de modular la transducción de señal mediante el TNF-R.

3. Un método según la reivindicación 2 para identificar una molécula que interacciona con el TNF-R para inhibir la transducción de señal mediante el TNF-R, en donde dicha etapa (c) comprende la identificación de cualquier molécula como capaz de inhibir la transducción de señal mediante el TNF-R.