JPH06233684A - 腫瘍壊死因子受容体におけるシグナルトランスダクションおよび／または開裂の修飾方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）における
シグナルトランスダクションおよび／または開裂の修飾
方法。受容体自体と，または受容体と相互作用するエフ
ェクター蛋白質と，相互作用するペプチドまたは他の分
子はＴＮＦ−Ｒの正常機能を修飾する。 【効果】 このようなペプチドまたは他の分子はＴＮＦ
関連疾患に予防的または治療的適用に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は，腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）によるシ
グナルトランスダクションの修飾およびこれらのＴＮＦ
−Ｒの開裂の修飾に関する．さらに詳しくは，本発明
は，ＴＮＦ−Ｒまたはその受容体と相互作用するエフェ
クター蛋白質に干渉し，したがってＴＮＦの機能に関連
する疾患の予防的または治療的応用に使用できるペプチ
ドまたは他の分子を提供する．

【０００２】発明の背景 ＴＮＦは，主としてマクロファージによって産生される
前炎症サイトカインであって，病原体に対する宿主の防
御，ならびに細胞機能に対する様々な作用を介して炎症
の有害な各種兆候の発現に関与している（Ｏｌｄ，１９
９０；Ｂｅｕｔｌｅｒ＆Ｃｅｒａｍｉ，１９８９）．こ
れらの作用は，大部分の種類の細胞上に発現される，特
異的高親和性細胞表面受容体（ＴＮＦ−Ｒ）へのＴＮＦ
の結合によって開始される（Ｂａｇｌｉｏｎｉら，１９
８５；Ｂｅｕｔｌｅｒら，１９８５；Ｋｕｌｌら，１９
８５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら，１９８５；Ａｇｇａｒｗ
ａｌら，１９８５；Ｉｓｒａｅｌら，１９８６）．この
受容体はＴＮＦに対する細胞応答として細胞内シグナル
を提供する（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら，１９９０ａ）．種
類の異なる細胞に別個に発現するＴＮＦの２つの分子
種，ｐ５５およびｐ７５ ＴＮＦ−Ｒが同定されている
（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら，１９９０ｂ；Ｂｒｏｃｋｈａ
ｕｓら，１９９０）．

【０００３】他の免疫系メディエーターと比較して最も
明瞭なＴＮＦの特性の一つは，その細胞死を誘発する能
力出有る．自己免疫疾患，慢性関節リウマチ，移植片拒
絶および移植片対宿主病のような多くの重篤な疾患にお
いて，ＴＮＦは病的組織破壊の主要な原因であると思わ
れる．したがって，これらの状態におけるＴＮＦ活性の
遮断は，これらの疾患における新たな治療法の開発に極
めて重要である．

【０００４】一方，他のある種の状況，たとえばＴＮＦ
の抗腫瘍活性または抗細菌活性が有益な状況では，その
機能の増強が有利である．

【０００５】線維芽細胞および上皮細胞に対するＴＮＦ
の細胞傷害作用の主要なメディエーターは，これらの細
胞系において優勢なＴＮＦ−Ｒでもあるｐ５５ＴＮＦ−
Ｒである．この受容体の遮断はＴＮＦの細胞破壊作用を
消失させ，一方，この受容体分子の集合の誘導はＴＮＦ
の細胞傷害性と類似の作用を発現させることができる．

【０００６】この受容体の溶解型ならびに他の（ｐ７
５）ＴＮＦ−Ｒの溶解型は，ＴＮＦ機能の阻害作用を示
すことが明らかにされている．これらの溶解型が細胞表
面型から蛋白分解的に誘導されることの証拠も示されて
いる（Ｎｏｐｈａｒら，１９９０；Ｐｏｒｔｅｕ ＆
Ｎａｔｈａｎ，１９９０；Ｐｏｒｔｅｕら，１９９
１）．

【０００７】受容体によるシグナリングおよび受容体の
開裂の両者が，受容体とある細胞性エフェクター蛋白質
の間の相互作用を反映するものと思われる．すなわち，
調節型プロテアーゼとの相互作用による開裂，およびあ
るシグナリング活性を有する蛋白質との相互作用による
シグナリングである．

【０００８】発明の要約 本発明は，腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）における
シグナルトランスダクションおよび／または開裂の修飾
方法であり，ＴＮＦ−Ｒの配列における１個または２個
以上のアミノ酸またはＴＮＦ−Ｒと相互作用するエフェ
クター蛋白質に干渉することからなる方法を提供する．

【０００９】この干渉は， ＴＮＦ−Ｒの正常機能に影
響し，またはそれと相互作用するエフェクター蛋白質に
影響し，その結果，その部分的もしくは全体的阻害を生
じることによりシグナルトランスダクションを修飾し，
または受容体の脱落に影響し，すなわち溶解型の開裂を
停止させる．

【００１０】本発明はさらに，受容体自体と相互作用す
る，すなわち受容体配列における１個もしくは２個以上
のアミノ酸と相互作用するか，またはエフェクター蛋白
質と相互作用する，すなわちＴＮＦ−Ｒの正常機能を修
飾するペプチドまたは他の分子を提供する．上記分子に
は抗体またはそのフラグメントも包含される．ペプチド
および他の物質は慣用方法または組換え方法で製造でき
る．

【００１１】本発明はまた，上記ペプチドまたは他の物
質からなる，ＴＮＦ関連疾患処置用の医薬組成物を提供
する．

【００１２】図面の簡単な説明 図１は，ｐ５５ＴＮＦ受容体のヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列を示し，サークルで囲んだ部分はリーダーおよ
び膜通過ドメインの配列であり，矢印は行われた変異お
よび欠失を示す．図２は，調べた様々な欠失変異体を例
示する．図３は，アミノ酸４１５〜４２６が欠失したｐ
５５ＴＮＦ−Ｒの変異体が，なお細胞破壊作用のシグナ
ルを発することがでるのに対し，それからさらに１０個
のアミノ酸が欠失した変異体Δ：４０５〜４２６はシグ
ナリングを生じないことを示す．図４は，１９７ｓｅｒ
がａｌａで置換されたｐ５５ＴＮＦ−Ｒ変異体では，細
胞破壊作用のシグナルをトランスデュースする能力が低
下していることを示す．図５は，１９７ｓｅｒがａｌａ
で置換された変異体では，ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外部
分の脱落の誘導が消失していることを示す．図６は，ア
ミノ酸１７０〜１７４もしくは１７５〜１７９のいずれ
かの欠失，ならびに全アミノ酸１７０〜１７９の欠失
が，ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外部分の脱落の誘導を消失
させることを示す．

【００１３】ｐ５５ＴＮＦの細胞内部分におけるアミノ
酸の短いストレッチが同定され，これはＴＮＦによる細
胞死の誘発に必須であることが見出された．細胞内部分
にＣ末端欠失があるｐ５５ＴＮＦ−Ｒの変異体では，ア
ミノ酸のこのストレッチが欠失していると，細胞傷害作
用のシグナルを発することができない．これに対し，先
端部切断受容体でも，このアミノ酸配列を含有すれば，
細胞死を完全に誘導できる．この配列に特異的に結合で
きる分子，またこの配列構造に類似するが細胞死の刺激
能力を欠く分子も同様に，ＴＮＦに対する細胞内阻害剤
として適用できる．これらは，ＴＮＦ−Ｒの，シグナル
トランスダクション連鎖における下流を機能化する分子
との相互作用を阻害する．

【００１４】しかも，ＴＮＦの完全な細胞傷害作用の誘
発に必要であり，またこの受容体の溶解型の脱落に決定
的な役割を果す，ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒの膜通過ドメイ
ンにおける特異的アミノ酸が同定された．このアミノ酸
を「中性」アミノ酸と交換すると，シグナリングは著し
く損われるが，シグナルトランスダクション機構の完全
な不活性化は招来しない．これは受容体の溶解型の脱落
も消失させる．したがって，このアミノ酸と特異的に相
互作用するように設計された分子は，ＴＮＦの細胞傷害
作用を緩和することができ，また受容体の細胞外，溶解
型の脱落の阻害により細胞表面上の受容体部位の利用を
高め，細胞死を誘発することなくＴＮＦの治療目的での
使用を可能にする．

【００１５】膜通過領域から外部に出たばかりの受容体
領域におけるアミノ酸の他のストレッチが受容体の溶解
型の開裂に必須であることも見出された．したがって，
このストレッチへの干渉，またはそれと相互作用するエ
フェクター蛋白質への干渉も，受容体の機能化に影響す
ることが考えられる．

【００１６】ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒの野生型および変異
体を発現するＡ９細胞のクローンが，放射標識ヒトＴＮ
Ｆの結合によって同定された．非トランスフェクトＡ９
細胞または対照トランスフェクト，すなわちネオマイシ
ン耐性付与プラスミドのみでトランスフェクトされたＡ
９細胞に比較して，ＴＮＦ結合が約１０倍増大したクロ
ーンを以下の研究に使用した．

【００１７】トランスフェクトされた細胞の，ＴＮＦ細
胞傷害作用に対する感度を，ＴＮＦ作用を模倣できるヒ
トｐ５５ＴＮＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体で調べ
たところ，野生型または変異受容体によるトランスフェ
クタントの間に異なる効果が観察された．野生型ヒトｐ
５５ＴＮＦ−Ｒでトランスフェクトされた細胞は，非ト
ランスフェクトまたは対照トランスフェクトＡ９細胞に
対しては全く作用を示さなかったこれらの抗体の細胞傷
害作用に対して，著しく感受性になった．これに反し
て，細胞内アミノ酸４０５〜４２６の欠失をもつ変異受
容体を発現するトランスフェクタントは，同じレベルの
受容体を発現しているにもかかわらず，ヒトｐ５５ＴＮ
Ｆ−Ｒに対する抗体には全く応答しなかった．しかしな
がら，これらの細胞は，ＴＮＦに対する内因性マウス受
容体を介して作用するヒトＴＮＦには応答できて，非感
受性がシグナルトランスダクション経路におけるポスト
受容体の遮断によるものではなかったことが証明され
た．

【００１８】しかしながら，上述の変異体の場合よりも
１０アミノ酸短い欠失を有する受容体変異体（ｄｅｌ：
４１５〜４２６）は，トランスフェクトされた細胞に，
ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒに対する抗体の細胞破壊作用への
高い応答性を付与した．これは，アミノ酸４０５〜４１
４，またはその一部分が，ＴＮＦの細胞傷害作用のため
のヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒのシグナリングに必須であり，
一方，アミノ酸４１５〜４２６は必須ではないことを示
している．

【００１９】第三の変異体においては，膜通過ドメイン
における単一のセリン残基（アミノ酸１９７）が特定部
位の突然変異誘発により，アミノ酸配列のすべての既知
二次構造と適合できるといわれるアミノ酸，アラニンに
よって交換された．この受容体変異体でトランスフェク
トされた細胞を機能的に分析したところ，これらの細胞
には，ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒに対する模倣抗体に応答し
ての細胞死の誘発に有意な損傷が明らかにされた．しか
しながら，この機能的崩壊は完全ではなく，わずかな細
胞破壊作用は，なお観察された．

【００２０】アミノ酸１７０〜１７４もしくは１７５〜
１７９，または両者すなわちアミノ酸１７０〜１７９が
欠失したさらに他の変異体では，受容体の可溶性細胞外
型の脱落が消失した．この所見は，膜通過ドメインのす
ぐ外側にある，受容体のアミノ酸１７０〜１７９または
その一部分の領域が，可溶性ＴＮＦ受容体の形成を可能
にするためには，無傷でなければならないことを示して
いる．したがって，この領域への干渉，またはそれと相
互作用するエフェクター蛋白質は，脱落を消失させるこ
とになる．この場合，エフェクター蛋白質は蛋白分解酵
素であると考えられる．

【００２１】上述のように，本発明は，とくに，受容体
自体もしくはそのある領域または受容体と相互作用する
エフェクター蛋白質のいずれかと相互作用できるペプチ
ドおよび他の分子，ならびにこれらのペプチドおよび他
の分子の製造方法を提供する．

【００２２】この目的では，受容体の関連領域と相互作
用する蛋白質を，細胞抽出物から，たとえばこれらの領
域をリガンドとして用いるリガンドアフィニティー精製
法によって単離する．ついで，その受容体または単離さ
れたエフェクター蛋白質のいずれかに結合し，したがっ
てそれらの相互作用に干渉する物質についてスクリーニ
ングを実施した．このようなスクリーニングは以下の方
法のいずれかによって行われる．

【００２３】１）シグナルトランスダクションおよび／
または脱落に重要であることが見出されたＴＮＦ−Ｒの
アミノ酸領域に相当する標的ペプチドを合成し，ペプチ
ドライブラリーを，それに結合するリガンドについてス
クリーニングした．これらの領域に結合するペプチドは
さらに，ＴＮＦ−Ｒにも結合するものについてスクリー
ニングする．標的ペプチドはさらに、ＴＮＦ−Ｒの両者
に高いアフィニティー結合が可能なペプチドを最後に，
所望の生物学的活性を発揮する，すなわちＴＮＦ−Ｒの
正常な機能に影響する能力についてスクリーニングす
る．

【００２４】２）同様にして，他の適応症で知られてい
る薬剤を含めて様々な有機分子について，ＴＮＦ−Ｒの
正常な機能に干渉する能力をスクリーニングする．これ
は，これらの分子が，ＴＮＦ−Ｒのシグナルトランスダ
クションおよび／または脱落に重要であることが見出さ
れたアミノ酸またはアミノ酸領域と異なる様式で結合ま
たは相互作用できるか否かを調べることにより決定され
る．

【００２５】３）有機分子に加えて，細菌培養生成物，
かび培養生成物，真核細胞培養生成物および粗サイトカ
インプレパレーションのような生物学的物質のブロス
も，上述のアミノ酸標的ペプチドによりスクリーニング
する．このスクリーニングで得られた分子をついで，所
望の生物学的機能を行う能力についてスクリーニングす
る．

【００２６】同様に，たとえば標的ペプチドが連結する
樹脂を通した全抽出物のクロマトグラフィーによって得
られるエフェクター蛋白質を，上記ペプチドライブラリ
ー，有機分子および生物学的ブロスのスクリーニングに
使用する．この方法でエフェクター蛋白質に結合するこ
とが見出された分子を，ついで，エフェクター蛋白質と
ＴＮＦ−Ｒの間の相互作用を阻止する能力，すなわちＴ
ＮＦ−Ｒの正常機能に干渉する能力について調べる．

【００２７】別法として，受容体またはエフェクター蛋
白質におけるアミノ酸領域の四次元構造に空間的にフィ
ットし，したがってこの両者の相互作用に干渉する分子
を設計する．

【００２８】上述の操作によって得られた活性分子は，
それらが生物学的物質である限り，生物工学的手法によ
っても製造できる．この方法により，これらの分子の大
量生産が可能になる．ペプチドは，既知のペプチド合成
法により，またはそれらをコードするＤＮＡ配列を含有
する発現ベクターを用いて製造できる．酵素的方法出産
生される他の分子の場合には，適当な培養細胞中に包含
された酵素を製造することにより，作成できる．

【００２９】本発明のペプチドまたは他の分子を含有す
る医薬組成物は，哺乳動物におけるＴＮＦの有害作用に
拮抗するため，すなわち過剰のＴＮＦが内因的に形成さ
れるか外因的に投与された状態の処置に，またはＴＮＦ
の有益作用を増強するために，すなわち腫瘍の処置に，
使用できる．

【００３０】このような組成物は，活性成分として，本
発明のペプチドまたは他の分子を含有する．この医薬組
成物は，ＴＮＦが過剰な状態，たとえば敗血症ショッ
ク，カヘキシー，移植片対宿主反応，自己免疫疾患たと
えば慢性リウマチ等を適応とする．この医薬組成物は，
たとえば外因的に投与された過量のＴＮＦの作用を消す
ためにも使用できる．

【００３１】本発明の医薬組成物は，処置すべき状態に
応じて，許容された投与経路を介して投与される．たと
えば，敗血症ショックの場合，静脈内投与が好ましい
が，関節炎の場合には局所注射を指示できる．この医薬
組成物は，連続的に，すなわち輸液の方法でも，また経
口的にも投与できる．処方および用量は，処置すべき状
態，投与経路，および処置される患者の状態や体重に依
存する．正確な用量は担当医師によって決定されること
になる．

【００３２】本発明の医薬組成物は，常法により，たと
えば活性成分を，場合に応じて，医薬的および生理的に
許容される担体および／または安定剤および／または賦
形剤と混合して製造され，たとえば投与量バイアル中で
の凍結乾燥により剤形に調製される．

【００３３】以下の実施例により本発明を例示するが，
これらは本発明を限定するものではない．例１：変異ｐ５５ＴＮＦ受容体の構築 ヒトｐ５５ＴＮＦ−ＲのｃＤＮＡ （Ｎｏｐｈａｒら，
１９９０）をＢａｎＩＩおよびＮｈｅＩ制限酵素で消化
して，大部分の５′および３′非コード領域を除去し
た．変異体Δ：４０５〜４２６およびΔ：４１５〜４２
６（図３）は，Ｐｒｏｍｅｇａの突然変異誘発キッド”
Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ”を用いて，このｃＤＮＡ
の短縮型の特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発によ
って生成させた．停止コドンは，システイン４０４（変
異体Δ：４０５〜４２６；受容体中のアミノ酸の番号は
Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら，１９９０による）の後にオリゴ
ヌクレオチド５′ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＧＣ Ｔ
ＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＣＡＴ３′を用いて，
またグリシン４１４（変異体Δ：４１６〜４２６）の後
にオリゴヌクレオチド５′ＡＡＧ ＣＣＣ ＴＴＴ Ｇ
ＣＧ ＧＣＴ ＡＧＣＣＣＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴ
３′を用いて挿入した．ｃＤＮＡの他の変異体は同様
に，試験した残りの変異体についての所望の突然変異を
指図する適当なオリゴヌクレオチドを用いて製造した．
野生型および突然変異ＣＤＮＡを，骨髄増殖性肉腫ウイ
ルスプロモーター，ＳＶ４０イントロンおよびＳＶ４０
ポリアデニル化シグナルを含有する真核細胞発現ベクタ
−ｐＭＰＳＶＥＨ（Ａｒｔｅｌｔら，１９８８）に導入
した．

【００３４】例２：培養細胞中での野生型および変異受
容体の発現 マウスＡ９系の細胞を，１０％胎児ウシ血清，１００単
位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプト
マイシン含有ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ，
生育培地）で培養した．細胞を，野生型および変異受容
体をネオマイシン耐性付与プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏと
ともにコードする発現構築体で，リン酸カルシウム沈降
法（Ｇｒａｈａｍ＆ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３）
を用いてトランスフェクトした．５００μｇ／ｍｌのＧ
４１８（Ｓｉｇｍａ）含有生育培地中での１０〜１４日
選択後，耐性コロニーを単離し，細胞に対するＴＮＦ結
合を測定することにより，ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒ（ｈｕ
−ｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ）の発現を調べた．全トランスフ
ェクタント中，少なくとも３つの異なるクローンを機能
アッセイで分析して，それらの性質のクローン間の変動
をチェックした．

【００３５】例３：細胞に対するＴＮＦ結合の測定 Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ，ＣＡによって製造された組換えヒトＴＮＦ−α
（ＴＮＦ，６×１０^７単位／ｍｇ蛋白質）は，Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａ
ｕｓｔｒｉａのＧ．Ａｄｏｌｆ博士によって恵与され
た．ＴＮＦは，クロラミンＴにより，比放射能２０００
ｍＣｉ／ｍｍｏｌに放射標識した（Ｉｓｒａｅｌら，１
９８６）．ＴＮＦの結合の測定には，細胞を１５ｍｍの
組織培養プレートに，２×１０^５細胞／プレート密度で
接種した．３７℃で２４時間インキュベート後，プレー
トを氷に移し，生育培地を除去し，１ｍＭ ＣａＣ
ｌ_２，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．５％ＢＳＡおよび０．
０２％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ（０．１５４塩化ナト
リウム＋１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．４，結合
緩衝液）２００μｌ中，０．１ｎＭ濃度の放射標識ＴＮ
Ｆを単独または１０００倍過剰の非標識ＴＮＦとともに
適用した．氷上で３時間インキュベートしたのち，細胞
を洗浄し，ついで５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中でイン
キュベートして解離させた．細胞結合放射能はガンマー
カウンターで測定した．

【００３６】例４：ＴＮＦおよびｈｕ−ｐ５５−ＴＮＦ
−Ｒに対する抗体の細胞破壊作用の定量 アッセイの２４時間前に，細胞を，９６ウエルのプレー
トに３０，０００細胞／ウエルの密度で接種した．つい
で，生育培地を，シクロヘキシミド（ＣＨＩ，ＨｅＬａ
細胞については２５μｇ／ｍｌ，他の細胞種につては５
０μｇ／ｍｌ）ならびにヒトＴＮＦ−αもしくはヒトｐ
５５ＴＮＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体（Ｅｎｇｅ
ｌｍａｎｎら，１９９０ｂ）を含有する生育培地１００
μｌで交換した．さらに３７℃で１１時間インキュベー
ト後，前述の中性レッドの取り込みアッセイにより，細
胞の生存度を評価した（Ｗａｌｌａｃｈ，１９８４）．

【００３７】例５：リガンドアフィニティー精製による
エフェクター蛋白質の単離 配列がシグナリングまたは開裂に重要なことが見出され
た受容体の領域に相当する合成ペプチドを，固体樹脂た
とえばセファロース，アガロースまたはアクリルアミド
ヒドラジドアガロース等に，グルタルアルデヒドのよう
な共有結合リンカーによって連結させる．細胞または細
胞膜の抽出物をこのようなカラムに適用し，それらに結
合した蛋白質を，たとえばｐＨを低下させて溶出させ
る．蛋白質を含有する分画を集め，慣用方法によってさ
らに精製する．この更なる精製においては，蛋白質はそ
れらの比活性（蛋白分解またはシグナリング）の測定に
よって追跡できる．

【００３８】例６：ＴＮＦ−Ｒまたはエフェクター蛋白
質と相互作用する抗体またはそのフラグメントの調製 ＴＮＦ−Ｒもしくはその中のその機能に必須であること
が見出された領域，またはそれらと相互作用する精製エ
フェクター蛋白質を，適当なプロトコールを用いて抗体
の開発に一般に使用されるマウス，ウサギまたは他の適
当な動物に注射する．モノクローナル抗体は常法によ
り，免疫処置動物の脾臓を用いて上記蛋白質に対して発
生させる．脾臓細胞からまたはそれによって生成させた
ハイブリドーマから抽出されたＤＮＡを使用して，組換
えＤＮＡ技術により抗体を産生させる．この方法で，そ
の受容体のシグナルトランスダクションまたは開裂に干
渉することによりＴＮＦの機能を修飾する抗体が得られ
る．抗体をコードするＤＮＡを用い，その構造が抗体お
よびその誘導体の超可変領域に相当し，同じ結合活性を
有するもっと小さな分子が構築される．これらの分子
は，受容体の細胞質内ドメインまたは細胞質内エフェク
ター蛋白質と相互作用するために細胞膜の透過が可能な
ように設計される．

【００３９】例７：受容体−エフェクター蛋白質相互作
用に干渉する有機分子または生物学的ブロスの他の成分
の同定 例５のように単離され，精製されたエフェクター蛋白質
を，たとえば^１２５Ｉもしくは他の放射性トレーサー，
または蛍光マーカーで標識し，固相に結合した受容体分
子またはそのフラグメントとの相互作用の効率を，その
相互作用に干渉できる分子を同定するために，各種生物
学的ブロスまたは合成有機分子の存在下に測定する．同
じ方法により，このような分子の粗プレパレーションか
らの精製を追跡することができる．

【００４０】例８：ＴＮＦ−Ｒの機能（シグナルトラン
スダクションまたは脱落）に干渉できるペプチドの製造 Ａ．標的ペプチドの合成 標的ペプチドは以下の配列を有する． ペプチドＡ：ＩｌｅＧｌｕＡｓｎＶａｌＬｙｓ ペプチドＢ：ＧｌｙＴｈｒＧｌｎＡｓｐＳｅｒ ペプチドＣ：ＩｌｅＧｌｕＡｓｎＶａｌＬｙｓＧｌｙＴ
ｈｒＧｌｎＡｓｐＳｅｒ ペプチドＤ：ＬｅｕＧｌｕＡｓｐＩｌｅＧｌｕＧｌｕＡ
ｌａＬｅｕＣｙｓＧｌｙ ペプチドＡは図１に示すＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列のア
ミノ酸１７０〜１７４に，ペプチドＢはアミノ酸１７５
〜１７９に，ペブチドＣはアミノ酸１７０〜１８９に，
ペプチドＤはアミノ酸４０５〜４１４に相当する．標的
ペプチドは通常の操作，たとえばＣｈａｎｇ Ｃ．Ｄ．
＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｆｅｒ，Ｊ．（１９７８）；Ｇｒ
ａｎｄａｓ，Ａ．ら（１９８９）；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，
Ａ．ら（１９８９）；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｙ
ｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．（１９８４）または類似の方法によ
り，Ｆｍｏｃ保護アミノ酸誘導体を用いて合成される．

【００４１】Ｂ．組合せペプチドライブラリーの合成 ビーズおよびリンカー 組合せペプチドライブラリーは，適当なビーズ担体，た
とえばジビニルベンゼン（１％ＤＶＢ）で架橋されたポ
リエチレン製で，直径約２００ミクロン，約１ミリ当量
の結合部位たとえば一級アミンまたは酸不安定性クロロ
メチル基を含むビーズ上に合成スル．シスタミンのよう
なリンカーを，適当なクロスリンカーたとえばグルタル
アルデヒドを用いてカノプリングさせることができる．
ペプチド合成はシステアミンの遊離アミン上で行われ
る．合成の終結時には，システアミン橋を，緩和な還元
たとえばジチオスレイトールの使用により切断し，遊離
のＣ末端ＳＨ基を有するペプチドを生成させる．多くの
ペプチドに独特なこの基は，認識分子の結合のための，
たとえばイミノビオチン−マレイミドとの反応による，
特異的修飾部位として働く．

【００４２】ライブラリー合成の戦略 一次ライブラリー ライブラリー合成の戦略は９もしくはそれ以上の残基サ
イズのペプチドのスクリーニングが可能のように設計さ
れ，約１００までの異なるアミノ酸誘導体から構成され
る．最初の６個のアミノ酸はすべての異なるアミノ酸誘
導体を各合成サイクルに導入することによって，ランダ
ムに合成される．最後の３回の合成サイクルでは，ビー
ズ毎に独特の配列が，以下のように合成される．６番目
のアミノ酸の導入後，ビーズを小分けする．小分けの数
は異なるアミノ酸誘導体の数と同一とする．ついで，単
一の小分けのすべてのピーズの成長ポリペプチド連鎖の
７番目の位置には，単一のアミノ酸誘導体が導入され
る．次に，すべて一緒に混合し，前のように再分配す
る．この操作を３回反復すると，各ビーズ毎に計３個の
独特なアミノ酸残基の導入が起こる．合成のこのフォー
マットは，位置１〜６でのペプチド合成に使用されたラ
ンダム合成フォーマットと区別するために，「体系化合
成」と呼ばれる．一次ライブラリーはついで，上述のよ
うにスクリーニングする．スクリーニングの結果は標的
配列に結合可能な特異的トリペプチド配列の選択を可能
にする．

【００４３】二次ライブラリー 一次ライブラリーの合成は，一次ライブラリーのスクリ
ーニングによって適当なトイペプチド配列が同定された
のちに行われる．二次ライブラリーの合成は，考え方は
一次ライブラリーと同様に実施される．最初の３個のア
ミノ酸残基はランダムに合成され，次の３固のアミノ酸
残基は体系化合成で合成され，最後の３つのアミノ酸は
一次ライブラリーのスクリーニングから誘導された配列
に従って合成される．

【００４４】三次ライブラリー 三次ライブラリーの合成は，考え方は二次ライブラリー
と同様に合成される．最初の３個のアミノ酸残基は体系
化合成で合成され，最後の６つのアミノ酸残基は一次お
よび二次ライブラリーのスクリーニングから誘導された
配列に従って導入される．

【００４５】Ｃ．延長合成／スクリーニング過程 上述の過程により，標的リガンドに特異的に結合できる
９個のアミノ酸残基からなるペプチドが同定される．結
合が改良される可能性があるさらに長いペプチドを調製
するために，合成／スクリーニング過程を継続すること
もできる．また，ペプチドをさらに修飾すること，たと
えば，側鎖の架橋によるペプチドコンフォーメーション
の安定化，ペプチド結合の改変による蛋白分解的切断に
対する保護，側鎖への疎水基の接合による膜通過輸送能
の増大等も，その活性の改良に有利である．ついで，上
記戦略による修飾を行うこともできる．このアプローチ
は多くの修飾ペプチドの迅速なスクリーニングを可能に
し，所望のペプチドの同定に必要な時間を著しく短縮す
る．

【００４６】ライブラリーのスクリーニング ライブラリー（ペプチド）のスクリーニングは，２つの
相に分けることができる．すなわち， Ａ相：リガンド結合，すなわち標的ペプチドおよびネイ
ティブ蛋白質への結合のスクリーニング， Ｂ相：ペプチドが，ＴＮＦに応答したＴＮＦ−Ｒ脱落を
低下もしくは消失させる能力またはＴＮＦ−Ｒによるシ
グナルトランスダクションを遮断する能力のスクリーニ
ング，である．

【００４７】Ａ相：リガンド結合能のスクリーニング ライブラリーを，リガンドたとえば上述の標的ペプチド
または精製ＴＮＦ−Ｒに暴露する．結合リガンドの検出
は，リガンドの以下の直接標識たとえばテトラメチルロ
ーダミンのような蛍光染料による標識，または特異的な
ポリクローナル抗体および適当なマーカーたとえば酵素
アルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシ
ダーゼにカップリングした適当な第二の抗体の使用によ
って行うことができる．結合した酵素は適当な基質，た
とえばアルカリホスファターゼについてはニトロブルー
テトラゾリウムのようなテトラゾリウムにカップリング
したＢＣＩＰ，または西洋ワサビペルオキシダーゼにつ
いてはクロロナフトールもしくはテトラメチルベンチジ
ンを用いて検出される．

【００４８】リガンドを結合するビーズの検出は，たと
えばＦＡＣＳ装置を用いるビーズの蛍光のモニタリン
グ，または肉眼検査によるビーズの色のモニタリングに
よって行われる．標識ビーズを混合物から回収し，個々
のビーズのペピチドを自動ペプチドシーケンサーにより
配列決定する．得られた配列データ二より，以後のライ
ブラリーの設計が可能になる．標的ペプチドに結合する
ビーズの検出後，それらの標的ペプチドを有する蛋白質
への結合を確認する．これは，高度に精製したＴＮＦ−
Ｒをリガンドとして使うほかは，標的ペプチドの結合の
測定に使用したのと同じ方法を用いて行われる．

【００４９】Ｂ相；生物活性のスクリーニング 上述のライブラリースクリーニングサイクルにより，標
的ペプチドとの高アフィニティー結合およびＴＮＦ−Ｒ
への結合が可能なペプチドの同定が行われたのち，ペプ
チドの所望の生物活性を発揮する能力についてのスクリ
ーニングを行う．これにより，細胞の外部での作動が期
待されるペブチド（ＴＮＦ−Ｒ脱落の遮断を意図するペ
プチド）と，細胞質の内部で作動を意図する，たとえば
ＴＮＦ−Ｒのシグナルトランスダクションの遮断を意図
するペプチドが識別される．

【００５０】例９：ＴＮＦ−Ｒ脱落の消失を意図するペ
プチドのスクリーニング 標的ペプチドＡ，ＢまたはＣおよびＴＮＦ−ＲのＣ細胞
外ドメインに結合できる全ペプチドについて，ＴＮＦに
応答したＴＮＦ−Ｒの脱落を低下させる能力を試験す
る．細胞を，ＴＮＦ−Ｒの細胞外ドメインに結合できる
ペプチドの混合物と反応させる．インキュベーション
後，細胞を溶解し，ＴＮＦ−Ｒ分子を適当なＭｃＡｂ上
イムノアフィニティーによって精製する．各ペプチドに
よって脱落が妨害された細胞表面にのみＴＮＦ−Ｒ分子
が残ると考えることができる．したがって，精製された
ＴＮＦ−Ｒ分子はそれらの阻害ペプチドをもつことが期
待される．ペプチドを，精製ＴＮＦ−Ｒプレパレーショ
ンから精製し，その配列を決定する．別法として，所望
のペプチドを細胞自体から直接溶出し，ＴＮＦ−Ｒを精
製する必要をなくすこともできる．ＴＮＦ−Ｒは細胞膜
に極めて近接した部位で切断されて細胞から脱落するの
で，切断部位から遠い部位で結合するペプチドはすべ
て，脱落したＴＮＦ−Ｒセグメントとともに細胞表面か
ら除去されることが期待される．細胞から抽出されたペ
プチドはＳＥＣ−ＨＰＬＣで精製するか，またはペプチ
ドはイミノビオチンで標識し（上述のように），アビジ
ンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで
精製する．

【００５１】例１０：ＴＮＦ−Ｒによるシグナルトラン
スダクションの阻害を意図したペプチドのスクリーニン
グ ＴＮＦ−Ｒによるシグナルトランスダクションを阻害で
きるペプチドのスクリーニングはもっと複雑である．ペ
プチドがＴＮＦ−Ｒのシグナル変換能に干渉する能力の
ための主要な障害作用を発揮するには，細胞膜を通過
し，標的細胞内の細胞質に十分高い濃度で蓄積する必要
がある．したがって，スクリーニングは分けて行われな
ければならない．最初の試験では，上述のようにして，
ペプチド（ビーズ上）が標的ペプチドおよびＴＮＦ−Ｒ
分子の精製細胞内ドメインに結合する能力について，ペ
プチドを試験する．結合可能なペプチドについて，ＴＮ
Ｆ−Ｒのシグナルトランスダクションを遮断する能力を
スクリーニングする．細胞膜を通過して細胞質内にペプ
チドが輸送されるのを容易にするためには，ペプチドを
ビーズ上で，たとえば（１）メチオニンのスルフォキシ
ドへの酸化，（２）ペブチド結合のそのケトメチレンイ
ソエステル（ＣＯＣＨ_２）による置換（Ｚａｃｈａｒｉ
ａ，Ｓ．ら，１９９１），（３）ラウロイル誘導体の導
入（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉら，１９９１）により，化学的
に修飾する．ペプチドの修飾は，ペプチドがビーズ上に
あるときに行われる．修飾されたペプチドについて，Ｔ
ＮＦ−Ｒの細胞内ドメインに結合する能力をスクリーニ
ングする．ＴＮＦ−Ｒへの結合能力を維持しているペプ
チドをビーズ上から切断し，ＴＮＦ−Ｒを発現する肝細
胞を用いて，細胞膜を通過してＴＮＦ−Ｒのシグナルト
ランスダクションを遮断する能力を試験する．

【００５２】例１１：機能に必須であることが見出され
たＴＮＦ−Ｒの領域に空間的にフィットする，シグナリ
ングおよび開裂のインヒビターの創製 ＴＮＦ−Ｒの三次元構造を，それから生成させた結晶の
Ｘ線結晶構造解析によって決定される．突然変異分析
（図３〜６）により，受容体のシグナリングまたは開裂
に必須であることが見出された領域の構造にとくに注意
しなければならない．これらの重要な領域の構造を完全
なものにするため，既知分子の三次元構造をを上記分析
によって想定された構造と比較する．この方法で，誘導
された相補構造に類似すると考えられる分子について，
受容体のシグナリングおよび開裂との干渉能力を調べ
る．効果の何らかの兆候が見出されたならば，所望の相
補構造にさらに近づくために，これらの分子をそれらの
誘導体を創製することによって改良する．構造のこのよ
うな連続的改変および生物活性の測定によって，シグナ
リングおよび蛋白分解の効果的なインヒビターが得られ
る．

【００５３】例１２：活性ペプチドおよび他の分子をコ
ードするヌクレオチド配列からなる組換えＤＮＡ分子の
創製ならびにそれらの発現 ペプチドおよび他の分子はまた，遺伝子操作技術によっ
ても製造できる．これらの製造には，これらの技術で用
いられるすべてのツールが包含される．すなわち，この
ようなペプチドおよび他の生物学的分子をコードするヌ
クレオチドからなるＤＮＡ分子が提供される．これらの
ＤＮＡ分子は，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，合成ＤＮＡお
よびそれらの組合せのいずれであってもよい．これらの
ペプチドおよび他の分子のアミノ酸配列が決定されたな
らば，このようなペプチドおよび分子をコードするＤＮ
Ａ分子の創製は慣用手段で行われる．

【００５４】組換え蛋白質の発現は，真核細胞，細菌ま
たは酵母中で，適当な発現ベクターを用いて行うことが
できる．本技術分野で知られている任意の方法が採用で
きる．たとえば，上述の方法で得られたペプチドまたは
他の分子をコードするＤＮＡ分子は，適当に構築された
発現ベクター中に，本技術分野でよく知られた技術によ
って挿入される（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２参
照）．二本鎖ｃＤＮＡを，合成ＤＮＡリンカーまたはブ
ラント末端リゲーション法の使用を含むホモポリマーテ
ーリングまたは制限連結によって，プラスミドベクター
に連結される．ＤＮＡリガーゼはＤＮＡ分子をリゲート
するために使用され，望ましくない連結はアルカリホス
ファターゼによる処置で回避される．

【００５５】所望の生物学的物質すなわちペプチドまた
は蛋白質（以下，簡単に「蛋白質」という）を発現でき
るためには，発現ベクターはさらに，遺伝子発現および
蛋白質の生成を可能にするように，所望の蛋白質をコー
ドするＤＮＡに連結された転写および翻訳調節情報を含
む特異的ヌクレオチド配列から構成されていなければな
らない．第一に，遺伝子が転写されるために，ＲＮＡポ
リメラーゼによって認識可能なプロモーターによって先
行されていなければならない．これにポリメラーゼが結
合し，その結果，転写過程が開始される．このようなプ
ロモーターとしては様々なものが使用されていて，その
効率も多様である（強いプロモーターや弱いプロモータ
ーがある）．原核細胞用と真核細胞用でも異なってい
る．

【００５６】本発明に使用できるプロモーターは，構造
性プロモーター，たとえばバクテリオファージΔのｉｎ
ｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝
子のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのＣＡＴプ
ロモーター等，また誘導性プロモーター，たとえばバク
テリオファージ△の主要右および左プロモーター（Ｐ_Ｌ
およびＰ_Ｒ），大腸菌のｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，
ｌａｃＩ，ｏｍｐＦおよびｇａｌプロモーター，もしく
はｔｒｐ−ｌａｃハイブリドプロモーター等である（Ｇ
ｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．，１９８７）．

【００５７】大量のｍＲＮＡを発生させるための強力な
プロモーターの使用に加えて，原核細胞中での高レベル
の遺伝子発現のためには，ｍＲＮＡの効率的な翻訳を確
実にするためには，リボソーム結合部位の使用も必要で
ある．一例には，開始コドンから適当な位置に配置さ
れ，１６Ｓ ＲＮＡの３´ 末端と相補性のシャイン−
ダルガノ配列（ＳＤ配列）がある．

【００５８】真核宿主の場合には，宿主の性質に応じ
て，異なる転写および翻訳調節配列が使用される．それ
らには，ウイルス起源たとえばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，シミアンウイルス等に由来するもの
がある．この場合，調節シグナルは特定の遺伝子に関連
し，高い発現レベルを有する．たとえば，ヘルペスウイ
ルスのＴＫプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，
酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター等がある．転写開始調
節シグナルは，遺伝子の発現を調節できるようにリプレ
ッションおよびアクティベーションを可能にするものが
選択される．

【００５９】本発明のペブチドまたは他の分子をコード
するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子ならびに操作
性に連結された転写および翻訳調節シグナルは，所望の
遺伝子配列を宿主細胞の染色体中に統合できるベクター
に挿入される．導入されるＤＮＡをその染色体中に安定
に統合された細胞は，その発現ベクターを含有する宿主
細胞の選択を可能にする１種または２種以上のマーカー
も導入することによって，選択できる．マーカーは，栄
養要求宿主への栄養要求性，殺生物剤耐性たとえば抗生
物質または銅のような重金属等への耐性を付与する．選
択可能マーカー遺伝子は，発現させるＤＮＡ遺伝子配列
に直接連結させるか，または同じ細胞にコトランスフェ
クションによって導入できる．他の要素もまた，単一鎖
結合蛋白質ｍＲＮＡの至適合成には必要である．これら
の要素には，スプライスシグナル，ならびに転写プロモ
ーター，エンハンサーおよび終結シグナル等が包含され
る．このような要素が導入されたｃＤＮＡ発現ベクター
には，Ｏｋａｙａｍａ（１９８３）によって記載された
ベクターがある．

【００６０】好ましい実施態様においては，導入される
ＤＮＡ分子は，レシピエント宿主中で自律複製が可能な
プラスミドまたはウイルスベクター中に挿入される．特
定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択に重要な
因子は，そのベクターを含有するレシピエント細胞のそ
のベクターを含まないレシピエント細胞からの選択の容
易性，特定の宿主細胞中に望まれるベクターのコピー
数，宿主細胞と異なる種の間でベクターを「シャトル」
できることが望まれるか否か等である．

【００６１】好ましい原核細胞ベクターには，大腸菌中
で複製可能なプラスミド，たとえばｐＢＲ３２２，Ｃｏ
ｌＥ１，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４等（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら，１９８２参照）；バチルスプラスミドたと
えばｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等（Ｇｒｙｃ
ｚａｎ，Ｔ．，１９８２）；ストレプトミセスプラスミ
ドたとえばｐＩＪ１０１等（Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｋ．Ｊ．
ら，１９８７）；ストレプトミセスバクテリオファー
ジ，たとえばΦＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．ら，Ｓ
ｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ ｏｎ ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓＢｉｏ
ｌｏｇｙ）；およびシュードモナスプラスミド（Ｊｏｈ
ｎ．Ｊ．Ｆ．ら，１９８６，Ｉｚａｋｉ，Ｋ．ら，１９
７８）が包含される．

【００６２】好ましい真核細胞プラスミドには，ＢＰ
Ｖ，ワクシニア，ＳＶ４０，２−ミクロンサイクル等，
またはそれらの誘導体が包含される．このようなプラス
ミドは本技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓ
ｔｅｉｎ，Ｄ．ら，１９８２；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．
Ｒ．：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎ
ｃｅ，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．，１９８２；
Ｂｏｌｌｏｎ，Ｄ．Ｐ．ら，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．：ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅ
ｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３：Ｇｅ
ｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，１９８０）．

【００６３】構築体を含有するベクターまたはＤＮＡが
発現用に準備されたならば，ＤＮＡ構築体を，様々な適
当な手段，たとえばトランスフォーメーション，トラン
スフェクション，接合，プロトプラスト融合，エレクト
ロポレーション，リン酸カルシウム沈降，直接マイクロ
インジェクション等の任意の手段により，適当な宿主脂
肪に導入される．

【００６４】本発明に使用される宿主細胞は原核細胞で
も真核細胞でもよい．好ましい厳格宿主には，大腸菌，
バチルス，ストレプトミセス，シュードモナス，サルモ
ネラ，セラチア等芽包含される．最も好ましい原核宿主
は大腸菌である．とくに興味がある細菌宿主には，大腸
菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６），大腸菌Ｘ１
７７６（ＡＴＣＣ３１５３７），大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ
⁻，ラムダ⁻，原栄養性，ＡＴＣＣ２７３２５），およ
び他の腸内細菌，たとえばネズミチフス菌または霊菌お
よびシュードモナス種がある．このような条件下には，
蛋白質はグリコシル化されない．原核宿主は発現プラス
ミド中のレプリコンまたは制御配列に適合性でなければ
ならない．

【００６５】好ましい真核宿主は，蛋白分子に正しいフ
ォールディングまたは正しい位置でのグリコシル化を含
む翻訳後修飾を与えるので，哺乳動物細胞，たとえばヒ
ト，サル，マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞である．酵母細胞でも，グリコシル化を
含む翻訳後修飾を行うことができる．所望の蛋白質の酵
母中での製造に利用できる，強力なプロモーター配列と
高コピー数のプラスミドを使用する多くの組換えＤＮＡ
戦略がある．酵母は，クローン化哺乳動物遺伝子産物上
のリーダー配列を認識し，リーダー配列をもつペプチド
（すなわち，プレペプチド）を分泌する．

【００６６】ベクターの導入後，宿主細胞を，ベクター
含有細胞の増殖を選択する選択培地中で増殖っせる．ク
ローン化遺伝子配列の発現により，所望の蛋白質の産生
が起こる．組換え蛋白質の精製は，この目的で知られて
いる方法に任意の方法によって実施できる．以上，ｐ５
５−ＴＮＦ−Ｒを参照しながら説明したが，ｐ７５−Ｔ
ＮＦ−Ｒについての知識から，ｐ７５−ＴＮＦ−Ｒにつ
いても同様に機能することは明白である．したがって，
本発明は，既知の両ＴＮＦ受容体のシグナルトランスダ
クションおよび／または開裂を包含するものである．

【００６７】

【００６８】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐ５５ＴＮＦ受容体のヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列．サークルで囲んだ部分はリーダーおよび膜通
過ドメインの配列であり，矢印は行われた変異および欠
失を示す．

【図２】欠失変異体の例．

【図３】アミノ酸４１５〜４２６欠失ｐ５５ＴＮＦ−Ｒ
変異体の細胞破壊作用のシグナリング，およびさらに１
０個のアミノ酸が欠失した変異体Δ：４０５〜４２６の
シグナリングの消失．

【図４】１９７ｓｅｒがａｌａで置換されたｐ５５ＴＮ
Ｆ−Ｒ変異体の細胞破壊作用のシグナルトランスダクシ
ョンの低下．

【図５】１９７ｓｅｒがａｌａで置換された変異体の，
ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外部分の脱落の誘導の消失．

【図６】アミノ酸１７０〜１７４もしくは１７５〜１７
９のいずれかの欠失，ならびに全アミノ酸１７０〜１７
９の欠失の，ｐ５５ＴＮＦ−Ｒ細胞外部分の脱落誘導の
消失

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年７月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】 明細書

【発明の名称】 腫瘍壊死因子受容体におけるシグナル
トランスダクションおよび／または開裂の修飾方法

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は，腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）によるシ
グナルトランスダクションの修飾およびこれらのＴＮＦ
−Ｒの開裂の修飾に関する。さらに詳しくは，本発明
は，ＴＮＦ−Ｒまたはその受容体と相互作用するエフェ
クター蛋白質に干渉し，したがってＴＮＦの機能に関連
する疾患の予防的または治療的応用に使用できるペプチ
ドまたは他の分子を提供する。

【０００２】発明の背景 ＴＮＦは，主としてマクロファージによって産生される
前炎症サイトカインであって，病原体に対する宿主の防
御，ならびに細胞機能に対する様々な作用を介して炎症
の有害な各種兆候の発現に関与している（Ｏｌｄ，１９
９０；Ｂｅｕｔｌｅｒ＆Ｃｅｒａｍｉ，１９８９）。こ
れらの作用は，大部分の種類の細胞上に発現される，特
異的高親和性細胞表面受容体（ＴＮＦ−Ｒ）へのＴＮＦ
の結合によって開始される（Ｂａｇｌｉｏｎｉら，１９
８５；Ｂｅｕｔｌｅｒら，１９８５；Ｋｕｌｌ ら，１
９８５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら，１９８５；Ａｇｇａｒ
ｗａｌ ら，１９８５；Ｉｓｒａｅｌら，１９８６）。
この受容体はＴＮＦに対する細胞応答として細胞内シグ
ナルを提供する（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ら，１９９０
ａ）。種類の異なる細胞に別個に発現するＴＮＦの２つ
の分子種，ｐ５５およびｐ７５ ＴＮＦ−Ｒが同定され
ている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ら，１９９０ｂ；Ｂｒｏ
ｃｋｈａｕｓら，１９９０）。

【０００３】他の免疫系メディエーターと比較して最も
明瞭なＴＮＦの特性の一つは，その細胞死を誘発する能
力出有る。自己免疫疾患，慢性関節リウマチ，移植片拒
絶および移植片対宿主病のような多くの重篤な疾患にお
いて，ＴＮＦは病的組織破壊の主要な原因であると思わ
れる。したがって，これらの状態におけるＴＮＦ活性の
遮断は，これらの疾患における新たな治療法の開発に極
めて重要である。

【０００４】一方，他のある種の状況，たとえばＴＮＦ
の抗腫瘍活性または抗細菌活性が有益な状況では，その
機能の増強が有利である。

【０００５】線維芽細胞および上皮細胞に対するＴＮＦ
の細胞傷害作用の主要なメディエーターは，これらの細
胞系において優勢なＴＮＦ−Ｒでもあるｐ５５ＴＮＦ−
Ｒである。この受容体の遮断はＴＮＦの細胞破壊作用を
消失させ，一方，この受容体分子の集合の誘導はＴＮＦ
の細胞傷害性と類似の作用を発現させることができる。

【０００６】この受容体の溶解型ならびに他の（ｐ７
５）ＴＮＦ−Ｒの溶解型は，ＴＮＦ能の阻害作用を示す
ことが明らかにされている。これらの溶解型が細胞表面
型から蛋白分解的に誘導されることの証拠も示されてい
る（Ｎｏｐｈａｒら，１９９０；Ｐｏｒｔｅｕ ＆ Ｎ
ａｔｈａｎ，１９９０；Ｐｏｒｔｅｕら，１９９１）。

【０００７】受容体によるシグナリングおよび受容体の
開裂の両者が，受容体とある細胞性エフェクター蛋白質
の間の相互作用を反映するものと思われる。すなわち，
調節型プロテアーゼとの相互作用による開裂，およびあ
るシグナリング活性を有する蛋白質との相互作用による
シグナリングである。

【０００８】発明の要約 本発明は，腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）における
シグナルトランスダクションおよび／または開裂の修飾
方法であり，ＴＮＦ−Ｒの配列における１個または２個
以上のアミノ酸またはＴＮＦ−Ｒと相互作用するエフェ
クター蛋白質に干渉することからなる方法を提供する。

【０００９】この干渉は，ＴＮＦ−Ｒの正常機能に影響
し，またはそれと相互作用するエフェクター蛋白質に影
響し，その結果，その部分的もしくは全体的阻害を生じ
ることによりシグナルトランスダクションを修飾し，ま
たは受容体の脱落に影響し，すなわち溶解型の開裂を停
止させる。

【００１０】本発明はさらに，受容体自体と相互作用す
る，すなわち受容体配列における１個もしくは２個以上
のアミノ酸と相互作用するか，またはエフェクター蛋白
質と相互作用する，すなわちＴＮＦ−Ｒの正常機能を修
飾するペプチドまたは他の分子を提供する。上記分子に
は抗体またはそのフラグメントも包含される。ペプチド
および他の物質は慣用方法または組換え方法で製造でき
る。

【００１１】本発明はまた，上記ペプチドまたは他の物
質からなる，ＴＮＦ関連疾患処置用の医薬組成物を提供
する。

【００１２】図面の簡単な説明 図１は，ｐ５５ＴＮＦ受容体のヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列を示し，サークルで囲んだ部分はリーダーおよ
び膜通過ドメインの配列であり，矢印は行われた変異お
よび欠失を示す。図２は，調べた様々な欠失変異体を例
示する。図３は，アミノ酸４１５〜４２６が欠失したｐ
５５ＴＮＦ−Ｒの変異体が，なお細胞破壊作用のシグナ
ルを発することがでるのに対し，それからさらに１０個
のアミノ酸が欠失した変異体△：４０５〜４２６はシグ
ナリングを生じないことを示す。図４は，１９７_ｓｅｒ
がａｌａで置換されたｐ５５ＴＮＦ−Ｒ変異体では，細
胞破壊作用のシグナルをトランスデュースする能力が低
下していることを示す。図５は，１９７_ｓｅｒがａｌａ
で置換された変異体では，ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外部
分の脱落の誘導が消失していることを示す。図６は，ア
ミノ酸１７０〜１７４もしくは１７５〜１７９のいずれ
かの欠失，ならびに全アミノ酸１７０〜１７９の欠失
が，ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外部分の脱落の誘導を消失
させることを示す。

【００１３】ｐ５５ＴＮＦの細胞内部分におけるアミノ
酸の短いストレッチが同定され，これはＴＮＦによる細
胞死の誘発に必須であることが見出された。細胞内部分
にＣ末端欠失があるｐ５５ＴＮＦ−Ｒの変異体では，ア
ミノ酸のこのストレッチが欠失していると，細胞傷害作
用のシグナルを発することができない。これに対し，先
端部切断受容体でも，このアミノ酸配列を含有すれば，
細胞死を完全に誘導できる。この配列に特異的に結合で
きる分子，またこの配列構造に類似するが細胞死の刺激
能力を欠く分子も同様に，ＴＮＦに対する細胞内阻害剤
として適用できる。これらは，ＴＮＦ−Ｒの，シグナル
トランスダクション連鎖における下流を機能化する分子
との相互作用を阻害する。

【００１４】しかも，ＴＮＦの完全な細胞傷害作用の誘
発に必要であり，またこの受容体の溶解型の脱落に決定
的な役割を果す，ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒの膜通過ドメイ
ンにおける特異的アミノ酸が同定された。このアミノ酸
を「中性」アミノ酸と交換すると，シグナリングは著し
く損われるが，シグナルトランスダクション機構の完全
な不活性化は招来しない。これは受容体の溶解型の脱落
も消失させる。したがって，このアミノ酸と特異的に相
互作用するように設計された分子は，ＴＮＦの細胞傷害
作用を緩和することができ，また受容体の細胞外，溶解
型の脱落の阻害により細胞表面上の受容体部位の利用を
高め，細胞死を誘発することなくＴＮＦの治療目的での
使用を可能にする。

【００１５】膜通過領域から外部に出たばかりの受容体
領域におけるアミノ酸の他のストレッチが受容体の溶解
型の開裂に必須であることも見出された。したがって，
このストレッチへの干渉，またはそれと相互作用するエ
フェクター蛋白質への干渉も，受容体の機能化に影響す
ることが考えられる。

【００１６】ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒの野生型および変異
体を発現するＡ９細胞のクローンが，放射標識ヒトＴＮ
Ｆの結合によって同定された。非トランスフェクトＡ９
細胞または対照トランスフェクト，すなわちネオマイシ
ン耐性付与プラスミドのみでトランスフェクトされたＡ
９細胞に比較して，ＴＮＦ結合が約１０倍増大したクロ
ーンを以下の研究に使用した。

【００１７】トランスフェクトされた細胞の，ＴＮＦ細
胞傷害作用に対する感度を，ＴＮＦ作用を模倣できるヒ
トｐ５５ＴＮＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体で調べ
たところ，野生型または変異受容体によるトランスフェ
クタントの間に異なる効果が観察された。野生型ヒトｐ
５５ＴＮＦ−Ｒでトランスフェクトされた細胞は，非ト
ランスフェクトまたは対照トランスフェクトＡ９細胞に
対しては全く作用を示さなかったこれらの抗体の細胞傷
害作用に対して，著しく感受性になった。これに反し
て，細胞内アミノ酸４０５〜４２６の欠失をもつ変異受
容体を発現するトランスフェクタントは，同じレベルの
受容体を発現しているにもかかわらず，ヒトｐ５５ＴＮ
Ｆ−Ｒに対する抗体には全く応答しなかった。しかしな
がら，これらの細胞は，ＴＮＦに対する内因性マウス受
容体を介して作用するヒトＴＮＦには応答できて，非感
受性がシグナルトランスダクション経路におけるポスト
受容体の遮断によるものではなかったことが証明され
た。

【００１８】しかしながら，上述の変異体の場合よりも
１０アミノ酸短い欠失を有する受容体変異体（ｄｅｌ：
４１５〜４２６）は，トランスフェクトされた細胞に，
ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒに対する抗体の細胞破壊作用への
高い応答性を付与した。これは，アミノ酸４０５〜４１
４，またはその一部分が，ＴＮＦの細胞傷害作用のため
のヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒのシグナリングに必須であり，
一方，アミノ酸４１５〜４２６は必須ではないことを示
している。

【００１９】第三の変異体においては，膜通過ドメイン
における単一のセリン残基（アミノ酸１９７）が特定部
位の突然変異誘発により，アミノ酸配列のすべての既知
二次構造と適合できるといわれるアミノ酸，アラニンに
よって交換された。この受容体変異体でトランスフェク
トされた細胞を機能的に分析したところ，これらの細胞
には，ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒに対する模倣抗体に応答し
ての細胞死の誘発に有意な損傷が明らかにされた。しか
しながら，この機能的崩壊は完全ではなく，わずかな細
胞破壊作用は，なお観察された。

【００２０】アミノ酸１７０〜１７４もしくは１７５〜
１７９，または両者すなわちアミノ酸１７０〜１７９が
欠失したさらに他の変異体では，受容体の可溶性細胞外
型の脱落が消失した。この所見は，膜通過ドメインのす
ぐ外側にある，受容体のアミノ酸１７０〜１７９または
その一部分の領域が，可溶性ＴＮＦ受容体の形成を可能
にするためには，無傷でなければならないことを示して
いる。したがって，この領域への干渉，またはそれと相
互作用するエフェクター蛋白質は，脱落を消失させるこ
とになる。この場合，エフェクター蛋白質は蛋白分解酵
素であると考えられる。

【００２１】上述のように，本発明は，とくに，受容体
自体もしくはそのある領域または受容体と相互作用する
エフェクター蛋白質のいずれかと相互作用できるペプチ
ドおよび他の分子，ならびにこれらのペプチドおよび他
の分子の製造方法を提供する。

【００２２】この目的では，受容体の関連領域と相互作
用する蛋白質を，細胞抽出物から，たとえばこれらの領
域をリガンドとして用いるリガンドアフィニティー精製
法によって単離する。ついで，その受容体または単離さ
れたエフェクター蛋白質のいずれかに結合し，したがっ
てそれらの相互作用に干渉する物質についてスクリーニ
ングを実施した。このようなスクリーニングは以下の方
法のいずれかによって行われる。

【００２３】１）シグナルトランスダクションおよび／
または脱落に重要であることが見出されたＴＮＦ−Ｒの
アミノ酸領域に相当する標的ペプチドを合成し，ペプチ
ドライブラリーを，それに結合するリガンドについてス
クリーニングした。これらの領域に結合するペプチドは
さらに，ＴＮＦ−Ｒにも結合するものについてスクリー
ニングする。標的ペプチドおよびＴＮＦ−Ｒの両者に高
いアフィニティー結合が可能なペプチドを最後に，所望
の生物学的活性を発揮する，すなわちＴＮＦ−Ｒの正常
な機能に影響する能力についてスクリーニングする。

【００２４】２）同様にして，他の適応症で知られてい
る薬剤を含めて様々な有機分子について，ＴＮＦ−Ｒの
正常な機能に干渉する能力をスクリーニングする。これ
は，これらの分子が，ＴＮＦ−Ｒのシグナルトランスダ
クションおよび／または脱落に重要であることが見出さ
れたアミノ酸またはアミノ酸領域と異なる様式で結合ま
たは相互作用できるか否かを調べることにより決定され
る。

【００２５】３）有機分子に加えて，細菌培養生成物，
かび培養生成物，真核細胞培養生成物および粗サイトカ
インプレパレーションのような生物学的物質のブロス
も，上述のアミノ酸標的ペプチドによりスクリーニング
する。このスクリーニングで得られた分子をついで，所
望の生物学的機能を行う能力についてスクリーニングす
る。

【００２６】同様に，たとえば標的ペプチドが連結する
樹脂を通した全抽出物のクロマトグラフィーによって得
られるエフェクター蛋白質を，上記ペプチドライブラリ
ー，有機分子および生物学的ブロスのスクリーニングに
使用する。この方法でエフェクター蛋白質に結合するこ
とが見出された分子を，ついで，エフェクター蛋白質と
ＴＮＦ−Ｒの間の相互作用を阻止する能力，すなわちＴ
ＮＦ−Ｒの正常機能に干渉する能力について調べる。

【００２７】別法として，受容体またはエフェクター蛋
白質におけるアミノ酸領域の四次元構造に空間的にフィ
ットし，したがってこの両者の相互作用に干渉する分子
を設計する。

【００２８】上述の操作によって得られた活性分子は，
それらが生物学的物質である限り，生物工学的手法によ
っても製造できる。この方法により，これらの分子の大
量生産が可能になる。ペプチドは，既知のペプチド合成
法により，またはそれらをコードするＤＮＡ配列を含有
する発現ベクターを用いて製造できる。酵素的方法出産
生される他の分子の場合には，適当な培養細胞中に包含
された酵素を製造することにより，作成できる。

【００２９】本発明のペプチドまたは他の分子を含有す
る医薬組成物は，哺乳動物におけるＴＮＦの有害作用に
拮抗するため，すなわち過剰のＴＮＦが内因的に形成さ
れるか外因的に投与された状態の処置に，またはＴＮＦ
の有益作用を増強するために，すなわち腫瘍の処置に，
使用できる。

【００３０】このような組成物は，活性成分として，本
発明のペプチドまたは他の分子を含有する。この医薬組
成物は，ＴＮＦが過剰な状態，たとえば敗血症ショッ
ク，カヘキシー，移植片対宿主反応，自己免疫疾患たと
えば慢性リウマチ等を適応とする。この医薬組成物は，
たとえば外因的に投与された過量のＴＮＦの作用を消す
ためにも使用できる。

【００３１】本発明の医薬組成物は，処置すべき状態に
応じて，許容された投与経路を介して投与される。たと
えば，敗血症ショックの場合，静脈内投与が好ましい
が，関節炎の場合には局所注射を指示できる。この医薬
組成物は，連続的に，すなわち輸液の方法でも，また経
口的にも投与できる。処方およひ用量は，処置すべき状
態，投与経路，および処置される患者の状態や体重に依
存する。正確な用量は担当医師によって決定されること
になる。

【００３２】本発明の医薬組成物は，常法により，たと
えば活性成分を，場合に応じて，医薬的および生理的に
許容される担体および／または安定剤および／または賦
形剤と混合して製造され，たとえば投与量バイアル中で
の凍結乾燥により剤形に調製される。

【００３３】以下の実施例により本発明を例示するが，
これらは本発明を限定するものではない。例１：変異ｐ５５ＴＮＦ受容体の構築 ヒトｐ５５ＴＮＦ−ＲのｃＤＮＡ（Ｎｏｐｈａｒら，１
９９０）をＢａｎＩＩおよびＮｈｅＩ 制限酵素で消化
して，大部分の５′および３′非コード領域を除去し
た。変異体△：４０５〜４２６およびΔ：４１５〜４２
６（図３）は，Ｐｒｏｍｅｇａの突然変異誘発キット”
Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ”を用いて，このｃＤＮＡ
の短縮型の特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発によ
って生成させた。停止コドンは，システイン４０４（変
異体△：４０５〜４２６；受容体中のアミノ酸の番号は
Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら，１９９０による）の後にオリゴ
ヌクレオチド５′ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＧＣ Ｔ
ＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＣＡＴ３′を用いて，
またグリシン４１４（変異体△：４１６〜４２６）の後
にオリゴヌクレオチド５′ＡＡＧ ＣＣＣ ＴＴＴ Ｇ
ＣＧ ＧＣＴ ＡＧＣＣＣＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴ
３′を用いて挿入した。ｃＤＮＡの他の変異体は同様
に，試験した残りの変異体についての所望の突然変異を
指図する適当なオリゴヌクレオチドを用いて製造した。
野生型および突然変異ｃＤＮＡを，骨髄増殖性肉腫ウイ
ルスプロモーター，ＳＶ４０イントロンおよびＳＶ４０
ポリアデニル化シグナルを含有する真核細胞発現ベクタ
ーｐＭＰＳＶＥＨ（Ａｒｔｅｌｔら，１９８８）に導入
した。

【００３４】例２：培養細胞中での野生型および変異受
容体の発現 マウスＡ９系の細胞を，１０％胎児ウシ血清，１００単
位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプト
マイシン含有ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ，
生育培地）で培養した。細胞を，野生型および変異受容
体をネオマイシン耐性付与プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏと
ともにコードする発現構築体で，リン酸カルシウム沈降
法（Ｇｒａｈａｍ ＆ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，１９７
３）を用いてトランスフェクトした。５００μｇ／ｍｌ
のＧ４１８（Ｓｉｇｍａ）含有生育培地中での１０〜１
４日選択後，耐性コロニーを単離し，細胞に対するＴＮ
Ｆ結合を測定することにより，ヒトｐ５５ＴＮＦ−Ｒ
（ｈｕ−ｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ）の発現を調べた。全トラ
ンスフェクタント中，少なくとも３つの異なるクローン
を機能アッセイで分析して，それらの性質のクローン間
の変動をチェックした。

【００３５】例３：細胞に対するＴＮＦ結合の測定 Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ，ＣＡ によって製造された組換えヒトＴＮＦ−α
（ＴＮＦ，６×１０^７単位／ｍｇ蛋白質）は，Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａ
ｕｓｔｒｉａのＧ．Ａｄｏｌｆ 博士によって恵与され
た。ＴＮＦは，クロラミンＴにより，比放射能２０００
ｍＣｉ／ｍｍｏｌに放射標識した（Ｉｓｒａｅｌら，１
９８６）。ＴＮＦの結合の測定には，細胞を１５ｍｍの
組織培養プレートに，２×１０^５細胞／プレート密度で
接種した。３７℃で２４時間インキュベート後，プレー
トを氷に移し，生育培地を除去し，１ｍＭ Ｃａ Ｃｌ
_２，１ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ_２，０．５％ＢＳＡおよび０．
０２％Ｎａ Ｎ_３を含有するＰＢＳ（０．１５４塩化ナ
トリウム＋１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．４，結
合緩衝液）２００μｌ中，０．１ｎＭ濃度の放射標識Ｔ
ＮＦを単独または１０００倍過剰の非標識ＴＮＦととも
に適用した。氷上で３時間インキュベートしたのち，細
胞を洗浄し，ついで５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中でイ
ンキュベートして解離させた。細胞結合放射能はガンマ
ーカウンターで測定した。

【００３６】例４：ＴＮＦおよびｈｕ−ｐ５５−ＴＮＦ
−Ｒに対する抗体の細胞破壊作用の定量 アッセイの２４時間前に，細胞を，９６ウエルのプレー
トに３０，０００細胞／ウエルの密度で接種した。つい
で，生育培地を，シクロヘキシミド（ＣＨＩ，Ｈｅ Ｌ
ａ細胞については２５μｇ／ｍｌ，他の細胞種につては
５０μｇ／ｍｌ）ならびにヒトＴＮＦ−αもしくはヒト
ｐ５５ＴＮＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体（Ｅｎｇ
ｅｌｍａｎｎ ら，１９９０ｂ）を含有する生育培地１
００μｌで交換した。さらに３７℃で１１時間インキュ
ベート後，前述の中性レッドの取り込みアッセイによ
り，細胞の生存度を評価した（Ｗａｌｌａｃｈ，１９８
４）。

【００３７】例５：リガンドアフィニティー精製による
エフェクター蛋白質の単離 配列がシグナリングまたは開裂に重要なことが見出され
た受容体の領域に相当する合成ペプチドを，固体樹脂た
とえばセファロース，アガロースまたはアクリルアミド
ヒドラジドアガロース等に，グルタルアルデヒドのよう
な共有結合リンカーによって連結させる。細胞または細
胞膜の抽出物をこのようなカラムに適用し，それらに結
合した蛋白質を，たとえばｐＨを低下させて溶出させ
る。蛋白質を含有する分画を集め，慣用方法によってさ
らに精製する。この更なる精製においては，蛋白質はそ
れらの比活性（蛋白分解またはシグナリング）の測定に
よって追跡できる。

【００３８】例６：ＴＮＦ−Ｒまたはエフェクター蛋白
質と相互作用する抗体またはそのフラグメントの調製 ＴＮＦ−Ｒもしくはその中のその機能に必須であること
が見出された領域，またはそれらと相互作用する精製エ
フェクター蛋白質を，適当なプロトコールを用いて抗体
の開発に一般に使用されるマウス，ウサギまたは他の適
当な動物に注射する。モノクローナル抗体は常法によ
り，免疫処置動物の脾臓を用いて上記蛋白質に対して発
生させる。脾臓細胞からまたはそれによって生成させた
ハイブリドーマから抽出されたＤＮＡを使用して，組換
えＤＮＡ技術により抗体を産生させる。この方法で，そ
の受容体のシグナルトランスダクションまたは開裂に干
渉することによりＴＮＦの機能を修飾する抗体が得られ
る。抗体をコードするＤＮＡを用い，その構造が抗体お
よびその誘導体の超可変領域に相当し，同じ結合活性を
有するもっと小さな分子が構築される。これらの分子
は，受容体の細胞質内ドメインまたは細胞質内エフェク
ター蛋白質と相互作用するために細胞膜の透過が可能な
ように設計される。

【００３９】例７：受容体−エフェクター蛋白質相互作
用に干渉する有機分子または生物学的ブロスの他の成分
の同定 例５のように単離され，精製されたエフェクター蛋白質
を，たとえば^１２５Ｉもしくは他の放射性トレーサー，
または蛍光マーカーで標識し，固相に結合した受容体分
子またはそのフラグメントとの相互作用の効率を，その
相互作用に干渉できる分子を同定するために，各種生物
学的ブロスまたは合成有機分子の存在下に測定する。同
じ方法により，このような分子の粗プレパレーションか
らの精製を追跡することができる。

【００４０】例８：ＴＮＦ−Ｒの機能（シグナルトラン
スダクションまたは脱落）に干渉できるペプチドの製造 Ａ．標的ペプチドの合成 標的ペプチドは以下の配列を有する。 ペプチドＡ：ＩｌｅＧｌｕＡｓｎＶａｌＬｙｓ ペプチドＢ：ＧｌｙＴｈｒＧｌｎＡｓｐＳｅｒ ペプチドＣ：ＩｌｅＧｌｕＡｓｎＶａｌＬｙｓＧｌｙＴ
ｈｒＧｌｎＡｓｐＳｅｒ ペプチドＤ：ＬｅｕＧｌｕＡｓｐＩｌｅＧｌｕＧｌｕＡ
ｌａＬｅｕＣｙｓＧｌｙ ペプチドＡは図１に示すＴＮＦ−Ｒのアミノ酸配列のア
ミノ酸１７０〜１７４に，ペプチドＢはアミノ酸１７５
〜１７９に，ペプチドＣはアミノ酸１７０〜１８９に，
ペプチドＤはアミノ酸４０５〜４１４に相当する。標的
ペプチドは通常の操作，たとえばＣｈａｎｇ Ｃ．Ｄ．
＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｆｅｒ，Ｊ．（１９７８）；Ｇｒ
ａｎｄａｓ，Ａ．ら（１９８９）；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，
Ａ．ら（１９８９）；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｙ
ｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．（１９８４）または類似の方法によ
り，Ｆｍｏｃ保護アミノ酸誘導体を用いて合成される。

【００４１】Ｂ．組合せペプチドライブラリーの合成 ビーズおよびリンカー 組合せペプチドライブラリーは，適当なビーズ担体，た
とえばジビニルベンゼン（１％ＤＶＢ）で架橋されたポ
リエチレン製で，直径約２００ミクロン，約１ミリ当量
の結合部位たとえば一級アミンまたは酸不安定性クロロ
メチル基を含むビーズ上に合成スル。シスタミンのよう
なリンカーを，適当なクロスリンカーたとえばグルタル
アルデヒドを用いてカップリングさせることができる。
ペプチド合成はシステアミンの遊離アミン上で行われ
る。合成の終結時には，システアミン橋を，緩和な還元
たとえばジチオスレイトールの使用により切断し，遊離
のＣ末端ＳＨ基を有するペプチドを生成させる。多くの
ペプチドに独特なこの基は，認識分子の結合のための，
たとえばイミノビオチン−マレイミドとの反応による，
特異的修飾部位として働く。

【００４２】ライブラリー合成の戦略 一次ライブラリー ライブラリー合成の戦略は９もしくはそれ以上の残基サ
イズのペプチドのスクリーニングが可能のように設計さ
れ，約１００までの異なるアミノ酸誘導体から構成され
る。最初の６個のアミノ酸はすべての異なるアミノ酸誘
導体を各合成サイクルに導入することによって，ランダ
ムに合成される。最後の３回の合成サイクルでは，ビー
ズ毎に独特の配列が，以下のように合成される。６番目
のアミノ酸の導入後，ビーズを小分けする。小分けの数
は異なるアミノ酸誘導体の数と同一とする。ついで，単
一の小分けのすべてのビーズの成長ポリペプチド連鎖の
７番目の位置には，単一のアミノ酸誘導体が導入され
る。次に，すべて一緒に混合し，前のように再分配す
る。この操作を３回反復すると，各ビーズ毎に計３個の
独特なアミノ酸残基の導入が起こる。合成のこのフォー
マットは，位置１〜６でのペプチド合成に使用されたラ
ンダム合成フォーマットと区別するために，「体系化合
成」と呼ばれる。一次ライブラリーはついで，上述のよ
うにスクリーニングする。スクリーニングの結果は標的
配列に結合可能な特異的トリペプチド配列の選択を可能
にする。

【００４３】二次ライブラリー 一次ライブラリーの合成は，一次ライブラリーのスクリ
ーニングによって適当なトイペプチド配列が同定された
のちに行われる。二次ライブラリーの合成は，考え方は
一次ライブラリーと同様に実施される。最初の３個のア
ミノ酸残基はランダムに合成され，次の３固のアミノ酸
残基は体系化合成で合成され，最後の３つのアミノ酸は
一次ライブラリーのスクリーニングから誘導された配列
に従って合成される。

【００４４】三次ライブラリー 三次ライブラリーの合成は，考え方は二次ライブラリー
と同様に合成される。最初の３個のアミノ酸残基は体系
化合成で合成され，最後の６つのアミノ酸残基は一次お
よび二次ライブラリーのスクリーニングから誘導された
配列に従って導入される。

【００４５】Ｃ．延長合成／スクリーニング過程 上述の過程により，標的リガンドに特異的に結合できる
９個のアミノ酸残基からなるペプチドが同定される。結
合が改良される可能性があるさらに長いペプチドを調製
するために，合成／スクリーニング過程を継続すること
もできる。また，ペプチドをさらに修飾すること，たと
えば，側鎖の架橋によるペプチドコンフォーメーション
の安定化，ペプチド結合の改変による蛋白分解的切断に
対する保護，側鎖への疎水基の接合による膜通過輸送能
の増大等も，その活性の改良に有利である。ついで，上
記戦略による修飾を行うこともできる。このアプローチ
は多くの修飾ペプチドの迅速なスクリーニングを可能に
し，所望のペプチドの同定に必要な時間を著しく短縮す
る。

【００４６】ライブラリーのスクリーニング ライブラリー（ペプチド）のスクリーニングは，２つの
相に分けることができる。すなわち， Ａ相：リガンド結合，すなわち標的ペプチドおよびネイ
ティブ蛋白質への結合のスクリーニング， Ｂ相：ペプチドが，ＴＮＦに応答したＴＮＦ−Ｒ脱落を
低下もしくは消失させる能力またはＴＮＦ−Ｒによるシ
グナルトランスダクションを遮断する能力のスクリーニ
ング，である。

【００４７】Ａ相：リガンド結合能のスクリーニング ライブラリーを，リガンドたとえば上述の標的ペプチド
または精製ＴＮＦ−Ｒに暴露する。結合リガンドの検出
は，リガンドの以下の直接標識たとえばテトラメチルロ
ーダミンのような蛍光染料による標識，または特異的な
ポリクローナル抗体および適当なマーカーたとえば酵素
アルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシ
ダーゼにカップリングした適当な第二の抗体の使用によ
って行うことができる。結合した酵素は適当な基質，た
とえばアルカリホスファターゼについてはニトロブルー
テトラゾリウムのようなテトラゾリウムにカップリング
したＢＣＩＰ，または西洋ワサビペルオキシダーゼにつ
いてはクロロナフトールもしくはテトラメチルベンチジ
ンを用いて検出される。

【００４８】リガンドを結合するビーズの検出は，たと
えばＦＡＣＳ装置を用いるビーズの蛍光のモニタリン
グ，または肉眼検査によるビーズの色のモニタリングに
よって行われる。標識ビーズを混合物から回収し，個々
のビーズのペプチドを自動ペプチドシーケンサーにより
配列決定する。得られた配列データ二より，以後のライ
ブラリーの設計が可能になる。標的ペプチドに結合する
ビーズの検出後，それらの標的ペプチドを有する蛋白質
への結合を確認する。これは，高度に精製したＴＮＦ−
Ｒをリガンドとして使うほかは，標的ペプチドの結合の
測定に使用したのと同じ方法を用いて行われる。

【００４９】Ｂ相：生物活性のスクリーニング 上述のライブラリースクリーニングサイクルにより，標
的ペプチドとの高アフィニティー結合およひＴＮＦ−Ｒ
への結合が可能なペプチドの同定が行われたのち，ペプ
チドの所望の生物活性を発揮する能力についてのスクリ
ーニングを行う。これにより，細胞の外部での作動が期
待されるペプチド（ＴＮＦ−Ｒ脱落の遮断を意図するペ
プチド）と，細胞質の内部で作動を意図する，たとえば
ＴＮＦ−Ｒのシグナルトランスダクションの遮断を意図
するペプチドが識別される。

【００５０】例９：ＴＮＦ−Ｒ脱落の消失を意図するペ
プチドのスクリーニング 標的ペプチドＡ，ＢまたはＣおよびＴＮＦ−Ｒの細胞外
ドメインに結合できる全ペプチドについて，ＴＮＦに応
答したＴＮＦ−Ｒの脱落を低下させる能力を試験する。
細胞を，ＴＮＦ−Ｒの細胞外ドメインに結合できるペプ
チドの混合物と反応させる。インキュベーション後，細
胞を溶解し，ＴＮＦ−Ｒ分子を適当なＭｃ Ａｂ上イム
ノアフィニティーによって精製する。各ペプチドによっ
て脱落が妨害された細胞表面にのみＴＮＦ−Ｒ分子が残
ると考えることができる。したがって，精製されたＴＮ
Ｆ−Ｒ分子はそれらの阻害ペプチドをもつことが期待さ
れる。ペプチドを，精製ＴＮＦ−Ｒプレパレーションか
ら精製し，その配列を決定する。別法として，所望のペ
プチドを細胞自体から直接溶出し，ＴＮＦ−Ｒを精製す
る必要をなくすこともできる。ＴＮＦ−Ｒは細胞膜に極
めて近接した部位で切断されて細胞から脱落するので，
切断部位から遠い部位で結合するペプチドはすべて，脱
落したＴＮＦ−Ｒセグメントとともに細胞表面から除去
されることが期待される。細胞から抽出されたペプチド
はＳＥＣ−ＨＰＬＣで精製するか，またはペプチドはイ
ミノビオチンで標識し（上述のように），アビジンカラ
ムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製す
る。

【００５１】例１０：ＴＮＦ−Ｒによるシグナルトラン
スダクションの阻害を意図したペプチドのスクリーニン
グ ＴＮＦ−Ｒによるシグナルトランスダクションを阻害で
きるペプチドのスクリーニングはもっと複雑である。ペ
プチドがＴＮＦ−Ｒのシグナル変換能に干渉する能力の
ための主要な障害作用を発揮するには，細胞膜を通過
し，標的細胞内の細胞質に十分高い濃度で蓄積する必要
がある。したがって，スクリーニングは分けて行われな
ければならない。最初の試験では，上述のようにして，
ペプチド（ビーズ上）が標的ペプチドおよびＴＮＦ−Ｒ
分子の精製細胞内ドメインに結合する能力について，ペ
プチドを試験する。結合可能なペプチドについて，ＴＮ
Ｆ−Ｒのシグナルトランスダクションを遮断する能力を
スクリーニングする。細胞膜を通過して細胞質内にペプ
チドが輸送されるのを容易にするためには，ペプチドを
ビーズ上で，たとえば（１）メチオニンのスルフォキシ
ドへの酸化，（２）ペプチド結合のそのケトメチレンイ
ソエステル（ＣＯＣＨ２）による置換（Ｚａｃｈａｒｉ
ａ，Ｓ．ら，１９９１），（３）ラウロイル誘導体の導
入（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉら，１９９１）により，化学的
に修飾する。ペプチドの修飾は，ペプチドがビーズ上に
あるときに行われる。修飾されたペプチドについて，Ｔ
ＮＦ−Ｒの細胞内ドメインに結合する能力をスクリーニ
ングする。ＴＮＦ−Ｒへの結合能力を維持しているペプ
チドをビーズ上から切断し，ＴＮＦ−Ｒを発現する肝細
胞を用いて，細胞膜を通過してＴＮＦ−Ｒのシグナルト
ランスダクションを遮断する能力を試験する。

【００５２】例１１：機能に必須であることが見出され
たＴＮＦ−Ｒの領域に空間的にフィットする，シグナリ
ングおよび開裂のインヒビターの創製 ＴＮＦ−Ｒの三次元構造を，それから生成させた結晶の
Ｘ線結晶構造解析によって決定される。突然変異分析
（図３〜６）により，受容体のシグナリングまたは開裂
に必須であることが見出された領域の構造にとくに注意
しなければならない。これらの重要な領域の構造を完全
なものにするため，既知分子の三次元構造をを上記分析
によって想定された構造と比較する。この方法で，誘導
された相補構造に類似すると考えられる分子について，
受容体のシグナリングおよび開裂との干渉能力を調べ
る。効果の何らかの兆候が見出されたならば，所望の相
補構造にさらに近づくために，これらの分子をそれらの
誘導体を創製することによって改良する。構造のこのよ
うな連続的改変および生物活性の測定によって，シグナ
リングおよび蛋白分解の効果的なインヒビターが得られ
る。

【００５３】例１２：活性ペプチドおよび他の分子をコ
ードするヌクレオチド配列からなる組換えＤＮＡ分子の
創製ならびにそれらの発現 ペプチドおよび他の分子はまた，遺伝子操作技術によっ
ても製造できる。これらの製造には，これらの技術で用
いられるすべてのツールが包含される。すなわち，この
ようなペプチドおよび他の生物学的分子をコードするヌ
クレオチドからなるＤＮＡ分子が提供される。これらの
ＤＮＡ分子は，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，合成ＤＮＡお
よびそれらの組合せのいずれであってもよい。これらの
ペプチドおよび他の分子のアミノ酸配列が決定されたな
らば，このようなペプチドおよび分子をコードするＤＮ
Ａ分子の創製は慣用手段で行われる。

【００５４】組換え蛋白質の発現は，真核細胞，細菌ま
たは酵母中で，適当な発現ベクターを用いて行うことが
できる。本技術分野で知られている任意の方法が採用で
きる。たとえば，上述の方法で得られたペプチドまたは
他の分子をコードするＤＮＡ分子は，適当に構築された
発現ベクター中に，本技術分野でよく知られた技術によ
って挿入される（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２参
照）。二本鎖ｃＤＮＡを，合成ＤＮＡリンカーまたはブ
ラント末端リゲーション法の使用を含むホモポリマーテ
ーリングまたは制限連結によって，プラスミドベクター
に連結される。ＤＮＡリガーゼはＤＮＡ分子をリゲート
するために使用され，望ましくない連結はアルカリホス
ファターゼによる処置で回避される。

【００５５】所望の生物学的物質すなわちペプチドまた
は蛋白質（以下，簡単に「蛋白質」という）を発現でき
るためには，発現ベクターはさらに，遺伝子発現および
蛋白質の生成を可能にするように，所望の蛋白質をコー
ドするＤＮＡに連結された転写および翻訳調節情報を含
む特異的ヌクレオチド配列から構成されていなければな
らない。第一に，遺伝子が転写されるために，ＲＮＡポ
リメラーゼによって認識可能なプロモーターによって先
行されていなければならない。これにポリメラーゼが結
合し，その結果，転写過程が開始される。このようなプ
ロモーターとしては様々なものが使用されていて，その
効率も多様である（強いプロモーターや弱いプロモータ
ーがある）。原核細胞用と真核細胞用でも異なってい
る。

【００５６】本発明に使用できるプロモーターは，構造
性プロモーター，たとえばバクテリオファージΔのｉｎ
ｔプロモーター，ｐＢＲ３２２のβーラクタマーゼ遺伝
子のｂｌａプロモーター，およびｐＰＲ３２５のクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのＣＡＴプ
ロモーター等，また誘導性プロモーター，たとえばバク
テリオファージΔの主要右および左プロモーター（Ｐ_Ｌ
およびＰ_Ｒ），大腸菌のｔｒｐ，ｒｅｃＡ，ｌａｃＺ，
ＬａｃＩ，ｏｍｐＦおよびｇａｌプロモーター，もしく
はｔｒｐ−ｌａｃハイブリドプロモーター等である（Ｇ
ｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．，１９８７）．

【００５７】大量のｍＲＮＡを発生させるための強力な
プロモーターの使用に加えて，原核細胞中での高レベル
の遺伝子発現のためには，ｍＲＮＡの効率的な翻訳を確
実にするためには，リボソーム結合部位の使用も必要で
ある。一例には，開始コドンから適当な位置に配置さ
れ，１６Ｓ ＲＮＡの３′末端と相補性のシャイン−ダ
ルガノ配列（ＳＤ配列）がある。

【００５８】真核宿主の場合には，宿主の性質に応じ
て，異なる転写および翻訳調節配列が使用される。それ
らには，ウイルス起源たとえばアデノウイルス，ウシパ
ピローマウイルス，シミアンウイルス等に由来するもの
がある。この場合，調節シグナルは特定の遺伝子に関連
し，高い発現レベルを有する。たとえば，ヘルペスウイ
ルスのＴＫプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，
酵母ｇａ１４遺伝子プロモーター等がある。転写開始調
節シグナルは，遺伝子の発現を調節できるようにリプレ
ッションおよびアクティベーションを可能にするものが
選択される。

【００５９】本発明のペプチドまたは他の分子をコード
するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子ならびに操作
性に連結された転写および翻訳調節シグナルは，所望の
遺伝子配列を宿主細胞の染色体中に統合できるベクター
に挿入される。導入されるＤＮＡをその染色体中に安定
に統合された細胞は，その発現ベクターを含有する宿主
細胞の選択を可能にする１種または２種以上のマーカー
も導入することによって，選択できる。マーカーは，栄
養要求宿主への栄養要求性，殺生物剤耐性たとえば抗生
物質または銅のような重金属等への耐性を付与する。選
択可能マーカー遺伝子は，発現させるＤＮＡ遺伝子配列
に直接連結させるか，または同じ細胞にコトランスフェ
クションによって導入できる。他の要素もまた，単一鎖
結合蛋白質ｍＲＮＡの至適合成には必要である。これら
の要素には，スプライスシグナル，ならびに転写プロモ
ーター，エンハンサーおよび終結シグナル等が包含され
る。このような要素が導入されたｃＤＮＡ発現ベクター
には，Ｏｋａｙａｍａ （１９８３）によって記載され
たベクターがある。

【００６０】好ましい実施態様においては，導入される
ＤＮＡ分子は，レシピエント宿主中で自律複製が可能な
プラスミドまたはウイルスベクター中に挿入される。特
定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択に重要な
因子は，そのベクターを含有するレシピエント細胞のそ
のベクターを含まないレシピエント細胞からの選択の容
易性，特定の宿主細胞中に望まれるベクターのコピー
数，宿主細胞と異なる種の間でベクターを「シャトル」
できることが望まれるか否か等である。

【００６１】好ましい原核細胞ベクターには，大腸菌中
で複製可能なプラスミド，たとえばｐＢＲ３２２，Ｃｏ
ｌＥｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＡＣＹＣ１８４等（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら，１９８２参照）；バチルスプラスミドたと
えばｐＣ１９４，ｐＣ２２１，ｐＴ１２７等（Ｇｒｙｃ
ｚａｎ，Ｔ．，１９８２）；ストレプトミセスプラスミ
ドたとえばｐＩＪ１０１等（Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｋ．Ｊ．
ら，１９８７）；ストレプトミセスバクテリオファー
ジ，たとえばΦＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．ら，Ｓ
ｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ）；およびシュードモナスプラスミド（Ｊｏ
ｈｎ，Ｊ．Ｆ．ら，１９８６，Ｉｚａｋｉ，Ｋ．ら，１
９７８）が包含される。

【００６２】好ましい真核細胞プラスミドには，ＢＰ
Ｖ，ワクシニア，ＳＶ４０，２−ミクロンサイクル等，
またはそれらの誘導体が包含される。このようなプラス
ミドは本技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓ
ｔｅｉｎ，Ｄ．ら，１９８２；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．
Ｒ．：ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：
Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃ
ｅ，１９８１；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．，１９８２；Ｂ
ｏｌｌｏｎ，Ｄ．ｐ．ら，１９８０；Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．：ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｒｅｈ
ｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３：Ｇｅｎ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，１９８０）。

【００６３】構築体を含有するベクターまたはＤＮＡが
発現用に準備されたならば，ＤＮＡ構築体を，様々な適
当な手段，たとえばトランスフォーメーション，トラン
スフェクション，接合，プロトプラスト融合，エレクト
ロポレーション，リン酸カルシウム沈降，直接マイクロ
インジェクション等の任意の手段により，適当な宿主脂
肪に導入される。

【００６４】本発明に使用される宿主細胞は原核細胞で
も真核細胞でもよい。好ましい厳格宿主には，大腸菌，
バチルス，ストレプトミセス，シュードモナス，サルモ
ネラ，セラチア等芽包含される。最も好ましい原核宿主
は大腸菌である。とくに興味がある細菌宿主には，大腸
菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６），大腸菌Ｘ１
７７６（ＡＴＣＣ３１５３７），大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ
−，ラムダー，原栄養性，ＡＴＣＣ２７３２５），およ
び他の腸内細菌，たとえばネズミチフス菌または霊菌お
よびシュードモナス種がある。このような条件下には，
蛋白質はグリコシル化されない。原核宿主は発現プラス
ミド中のレプリコンまたは制御配列に適合性でなければ
ならない。

【００６５】好ましい真核宿主は，蛋白分子に正しいフ
ォールディングまたは正しい位置でのグリコシル化を含
む翻訳後修飾を与えるので，哺乳動物細胞，たとえばヒ
ト，サル，マウスおよびチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞である。酵母細胞でも，グリコシル化を
含む翻訳後修飾を行うことができる。所望の蛋白質の酵
母中での製造に利用できる，強力なプロモーター配列と
高コピー数のプラスミドを使用する多くの組換えＤＮＡ
戦略がある。酵母は，クローン化哺乳動物遺伝子産物上
のリーダー配列を認識し，リーダー配列をもつペプチド
（すなわち，プレペプチド）を分泌する。

【００６６】ベクターの導入後，宿主細胞を，ベクター
含有細胞の増殖を選択する選択培地中で増殖っせる。ク
ローン化遺伝子配列の発現により，所望の蛋白質の産生
が起こる。組換え蛋白質の精製は，この目的で知られて
いる方法に任意の方法によって実施できる。以上，ｐ５
５−ＴＮＦ−Ｒを参照しながら説明したが，ｐ７５−Ｔ
ＮＦ−Ｒについての知識から，ｐ７５−ＴＮＦ−Ｒにつ
いても同様に機能することは明白である。したがって，
本発明は，既知の両ＴＮＦ受容体のシグナルトランスダ
クションおよび／または開裂を包含するものである。

【００６７】

【図面の簡単な説明】

【００６８】

【図１】ｐ５５ＴＮＦ受容体のヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列。サークルで囲んだ部分はリーダーおよび膜通
過ドメインの配列であり，矢印は行われた変異および欠
失を示す。

【図２】欠失変異体の例。

【図３】アミノ酸４１５〜４２６欠失ｐ５５ＴＮＦ−Ｒ
変異体の細胞破壊作用のシグナリング，およびさらに１
０個のアミノ酸が欠失した変異体Δ：４０５〜４２６の
シグナリングの消失。

【図４】１９７_ｓｅｒがａｌａで置換されたｐ５５ＴＮ
Ｆ−Ｒ変異体の細胞破壊作用のシグナルトランスダクシ
ョンの低下。

【図５】１９７_ｓｅｒがａｌａで置換された変異体の，
ｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞外部分の脱落の誘導の消失。

【図６】アミノ酸１７０〜１７４もしくは１７５〜１７
９のいずれかの欠失，ならびに全アミノ酸１７０〜１７
９の欠失の，ｐ５５ＴＮＦ−Ｒ細胞外部分の脱落誘導の
消失。

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）にお
   けるシグナルトランスダクションおよび／または開裂の
   修飾方法において，ＴＮＦ−Ｒの配列における１個また
   は２個以上のアミノ酸またはＴＮＦ−Ｒと相互作用する
   エフェクター蛋白質に干渉することからなる方法
2. 【請求項２】 ＴＮＦ−Ｒはヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒで
   ある「請求項１」記載の方法
3. 【請求項３】 ＴＮＦ−Ｒはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒで
   ある「請求項１」記載の方法
4. 【請求項４】 ＴＮＦ−Ｒにおけるシグナルトランスダ
   クションの修飾方法において，ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒ
   のアミノ酸４０５〜４１５またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−
   Ｒの相当するアミノ酸に干渉する方法
5. 【請求項５】 シグナルトランスダクションの修飾方法
   において，ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１９７ｓｅｒまた
   はヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当するアミノ酸に干渉す
   る方法
6. 【請求項６】 ＴＮＦ−Ｒの可溶性型の開裂を阻害する
   方法において，ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１９７ｓｅｒ
   またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当するアミノ酸に干
   渉する方法
7. 【請求項７】 ＴＮＦ−Ｒの可溶性型の開裂を阻害する
   方法において，ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７０〜１７
   ４のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当する
   アミノ酸に干渉する方法
8. 【請求項８】 ＴＮＦ−Ｒの可溶性型の開裂を阻害する
   方法において，ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７５〜１７
   ９のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当する
   アミノ酸に干渉する方法
9. 【請求項９】 ＴＮＦ−Ｒの可溶性型の開裂を阻害する
   方法において，ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７０〜１７
   ９のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当する
   アミノ酸に干渉する方法
10. 【請求項１０】 ＴＮＦ−Ｒまたはエフェクター蛋白質
    に干渉してＴＮＦ−Ｒの正常機能を修飾できるペプチド
    または他の分子
11. 【請求項１１】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸４
    ０５〜４１５またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当する
    アミノ酸に干渉できる「請求項１０」記載のペプチドま
    たは他の分子
12. 【請求項１２】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１９７ｓｅ
    ｒまたはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当するアミノ酸に
    干渉できる「請求項１０」記載のペプチドまたは他の分
    子
13. 【請求項１３】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７０〜１
    ７４のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当す
    るアミノ酸に干渉できる「請求項１０」記載のペプチド
    または他の分子
14. 【請求項１４】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７５〜１
    ７９のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当す
    るアミノ酸に干渉できる「請求項１０」記載のペプチド
    または他の分子
15. 【請求項１５】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７０〜１
    ７９のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当す
    るアミノ酸に干渉できる「請求項１０」記載のペプチド
    または他の分子
16. 【請求項１６】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸４
    ０５〜４１５またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当する
    アミノ酸に干渉できるエフェクター蛋白質
17. 【請求項１７】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１９７ｓｅ
    ｒまたはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当するアミノ酸に
    干渉できるエフェクター蛋白質
18. 【請求項１８】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７０〜１
    ７４のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当す
    るアミノ酸に干渉できるエフェクター蛋白質
19. 【請求項１９】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７５〜１
    ７９のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当す
    るアミノ酸に干渉できるエフェクター蛋白質
20. 【請求項２０】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７０〜１
    ７９のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当す
    るアミノ酸に干渉できるエフェクター蛋白質
21. 【請求項２１】 蛋白分解酵素からなる「請求項１８〜
    ２０」のいずれかに記載のエフェクター蛋白質
22. 【請求項２２】 ＴＮＦ−Ｒまたはエフェクター蛋白質
    に干渉してＴＮＦ−Ｒの正常機能を修飾できる抗体
23. 【請求項２３】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒのアミノ酸４
    ０５〜４１５またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当する
    アミノ酸に干渉できる「請求項２２」記載の抗体
24. 【請求項２４】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１９７ｓｅ
    ｒまたはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当するアミノ酸に
    干渉できる「請求項２２」記載の抗体
25. 【請求項２５】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７０〜１
    ７４のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当す
    るアミノ酸に干渉できる「請求項２２」記載の抗体
26. 【請求項２６】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７５〜１
    ７９のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当す
    るアミノ酸に干渉できる「請求項２２」記載の抗体
27. 【請求項２７】 ヒトｐ５５−ＴＮＦ−Ｒの１７０〜１
    ７９のアミノ酸またはヒトｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの相当す
    るアミノ酸に干渉できる「請求項２２」記載の抗体
28. 【請求項２８】 実質的に明細書に記載された「請求項
    １」に記載の方法
29. 【請求項２９】 実質的に明細書に記載された「請求項
    １０」に記載のペプチド
30. 【請求項３０】 実質的に明細書に記載された「請求項
    １６〜２１」に記載のエフェクター蛋白質
31. 【請求項３１】 実質的に明細書に記載された「請求項
    ２２」に記載の抗体
32. 【請求項３２】 モノクローナル抗体である「請求項３
    １」記載の抗体
33. 【請求項３３】 「請求項１０」に記載のペプチドまた
    は他の分子をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮ
    Ａ分子
34. 【請求項３４】 「請求項３３」記載のＤＮＡ分子から
    なり，トランスフォーマント宿主細胞内で「請求項１
    ０」記載のペプチドまたは他の分子を発現できる複製可
    能な発現ベクター
35. 【請求項３５】 「請求項３４」記載の複製可能な発現
    ベクターでトランスフォームされた宿主細胞
36. 【請求項３６】 「請求項１０」記載のペプチドまたは
    他の分子を活性成分としてなる医薬組成物