ES2281087T3 - Composicion inmunoestimuladora y procedimiento. - Google Patents

Composicion inmunoestimuladora y procedimiento. Download PDF

Info

Publication number
ES2281087T3
ES2281087T3 ES96944879T ES96944879T ES2281087T3 ES 2281087 T3 ES2281087 T3 ES 2281087T3 ES 96944879 T ES96944879 T ES 96944879T ES 96944879 T ES96944879 T ES 96944879T ES 2281087 T3 ES2281087 T3 ES 2281087T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antigen
polypeptide
cell
csf
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES96944879T
Other languages
English (en)
Inventor
Reiner Laus
Curtis Landon Ruegg
Hongyu Wu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dendreon Corp
Original Assignee
Dendreon Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dendreon Corp filed Critical Dendreon Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2281087T3 publication Critical patent/ES2281087T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001136—Cytokines
    • A61K39/001139—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

SE DESCRIBEN COMPOSICIONES TERAPEUTICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA INDUCIR LAS RESPUESTAS DE CELULAS T CITOTOXICAS IN VITRO E IN VIVO. LAS COMPOSICIONES TERAPEUTICAS CONSISTEN EN CELULAS QUE PRESENTAN ANTIGENOS ACTIVADAS MEDIANTE EL CONTACTO CON UN COMPLEJO POLIPEPTIDICO CONTRUIDO JUNTANDO UNA PROTEINA DE UNION A CELULAS DENDRITICAS Y UN ANTIGENO POLIPEPTIDICO. TAMBIEN SE DESCRIBEN VECTORES DE EXPRESION Y SISTEMAS PARA PRODUCIR LOS COMPLEJOS POLIPEPTIDICOS.

Description

Composición inmunoestimuladora y procedimiento.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones y a procedimientos para estimular respuestas inmunitarias celulares específicas in vivo. Más específicamente, la invención se refiere a la eliminación de células tumorales por linfocitos T citotóxicos (CTL) activados in vivo o in vitro por exposición a células presentadoras de antígeno expuestas a un complejo polipeptídico inmunoestimulador.
Antecedentes de la invención
La respuesta inmunitaria del sistema inmunitario de los mamíferos se divide en dos tipos generales: inmunidad humoral, mediada en gran medida por los anticuerpos de la circulación, y la inmunidad celular mediada por diferentes formas de células T. Los antígenos extracelulares estimulan una respuesta humoral, mientras que los antígenos intracelulares tales como los virus, estimulan una respuesta celular.
La respuesta inmunitaria celular a las células infectadas por virus y células tumorales es mediada en gran medida por linfocitos T citotóxicos (T_{c} o CTL), cuando reconocen antígenos extraños unidos a la superficie de la célula hospedante como parte del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), y más en particular, una forma común del MHC conocido como MHC de clase I. A diferencia de esto, los antígenos derivados de patógenos no víricos (bacterias, hongos) en general se expresan como parte de un complejo MHC de clase II. Una subpoblación diferente de células T efectoras (células de inmunidad mediada por células; IMC) libera citocinas que activan la célula hospedante para destruir dichos patógenos.
En sistemas experimentales, los CTL específicos de tumor-antígeno son el mecanismo inmunológico más poderoso para eliminar los tumores. Los CTL se pueden inducir in vivo con vacunas o se pueden generar in vitro y después volver a infundir en el organismo portador del tumor. La inducción in vivo de los CTL típicamente se logra por inmunización con virus vivos o células (Tanaka, y col., J. Immunol., (1991), J47, 3646-52, Wang, y col., J. Immunol., (1995), 4685-4692, Torre-Amione, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1990), 87, 1486-90).
Excepto para algunas proteínas víricas especiales tales como el antígeno T grande de SV-40 y el antígeno de superficie de la hepatitis B, la inyección de proteínas aisladas o solubles no dan como resultado la inducción de los CTL (Schirmbeck, y col., Eur. J. Immunol., (1993), 23,1528-34). Los CTL son inducidos cuando una proteína entra en la ruta de clase I del procesamiento de antígenos. Para entrar en esta ruta, la proteína debe estar presente en el citosol de las APC. Se degrada en péptidos que después son transportados al retículo endoplasmático, donde se asocian con moléculas HLA nacientes de clase I. Estos péptidos después se presentan juntos con las moléculas de clase I sobre la superficie celular y pueden servir como un inductor y objetivo de los CTL específicos de antígenos restringidos por la clase I. Desde el punto de vista fisiológico, sólo entran en esta ruta las proteínas que las APC sintetizan de forma endógena.
Los vehículos de suministro no celular para proteínas, tales como los liposomas sensibles al pH, pueden superar el requisito de la síntesis endógena in vivo (Nair, y col., J. Exp. Med., (1992). 175, 609-12, Nair, y col., J. Virol. (1993), 67, 4062-9); sin embargo, estos tratamientos también son bastante tóxicos para las células objetivo.
No se ha descrito la inducción de CTL primarios restringidos por HLA de clase I en proteínas puras solubles in vitro. La herramienta más común para la inducción ex vivo de los CTL primarios son péptidos sintéticos pequeños (oligómero de longitud 8-11) (Stauss, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1992), 89, 7871-5, Carbone, y col., J. Exp. Med. (1988), 167, 1767-79). Estos péptidos sintéticos se asocian con moléculas de clase I en la superficie celular sin los requisitos del procesamiento endógeno. Cuando se presentan en la superficie de una APC adecuada (tal como una célula dendrítica) entonces pueden inducir una respuesta de CTL primarios. Sin embargo, con frecuencia estos CTL no protegen frente a la estimulación con patógenos que sintetizan de forma endógena la proteína de la cual derivó el péptido debido a su baja avidez por el receptor de células T (Speiser, y col., J. Immunol. (1992), 149, 972-80) y porque inducen reactividad con un solo epítopo del antígeno objetivo.
GM-CSF es una citocina que tiene función pleiotrópica tanto en la hematopoyesis como en inmunología. Se ha mostrado que GM-CSF promueve la diferenciación y supervivencia de células dendríticas. GM-CSF se puede usar como un adyuvante sistémico (Jones, y col., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. (1994), 13, S47-53).
Es bien conocido que la inmunización con proteínas solubles puede dar como resultado una respuesta de anticuerpos significativa. Sin embargo, puesto que la presentación de antígeno restringida por la clase II o la estimulación de células B directa son responsables de este efecto, la inducción de anticuerpos no tiene un valor de predicción para estimular la inducción de CTL mediada por la clase I. La mayoría de las proteínas que inducen anticuerpos in vivo no pueden inducir CTL.
Se ha mostrado que las proteínas de fusión GM-CSF inducen respuestas de anticuerpos in vivo en un modelo de linfoma en ratón (Levy, R. and Tao, M.-H. (1993) Nature 362:755-758; Chen, y col., J. Immunol. (1995), 3105-3117). En este estudio se encontró que el idiotipo tumoral fusionado con GM-CSF era superior a la mezcla de ambas moléculas y a otros adyuvantes convencionales para la inducción de respuestas de anticuerpos. A diferencia de otros tumores sólidos, se cree que las respuestas de anticuerpos son el mecanismo efector para la protección tumoral y para la terapia tumoral en el linfoma.
Además, la inducción in vitro de inmunidad en general es mucho más difícil de lograr tanto para las respuestas celulares como humorales. Por ejemplo, los fibroblastos transfectados con antígeno vírico inducen CTL restringidos por la clase I in vivo en ratones, pero no lo hacen in vitro (Kündig, y col., Science (1995), 268, 1343-1347). Por lo tanto, un estudio de inducción de anticuerpos con proteínas de fusión GM-CSF in vivo no implica ninguna de sus utilidades in vitro, y en particular tiene poco valor de predicción de la inducción de CTL in vitro o in vivo.
Otros procedimientos que se han usado para la inducción in vitro de CTL derivados de proteínas primarias son el choque osmótico de células dendríticas y el uso de liposomas sensibles al pH (Nair, y col., J. Exp. Med. (1992), 175, 609-12). Sin embargo, dichos procedimientos han demostrado ser inherentemente ineficaces y tóxicos para las APC, porque alteran las membranas celulares mediante fuerza física y química con el fin de liberar el antígeno proteínico al citoplasma.
Estas limitaciones se superan por el descubrimiento que abarca la presente invención. El descubrimiento de la presente invención es que se puede estimular una respuesta de células T, y específicamente una respuesta de células T mediada por el MHC de clase I, mediante una proteína aislada o soluble, cuando se presenta al sistema inmunitario como parte de un complejo con la proteína de unión a las células dendríticas GM-CSF. El descubrimiento adicional de la presente invención es que dicha respuesta se puede estimular in vitro. Como se ha discutido antes, no se ha demostrado previamente la estimulación in vitro de dicha respuesta usando un antígeno soluble de longitud completa. La presente invención proporciona la inducción de proteínas aisladas o solubles de inmunidad celular in vitro, presentando un antígeno específico a una célula presentadora de antígeno (APC), tal como una célula dendrítica, como parte de una proteína de fusión inmunógena.
Un aspecto importante de la presente invención es la elección de la proteína pareja para la fusión: la proteína de unión a células dendríticas, tal como la proteína estimuladora de la colonia de macrófagos y granulocitos (GM-CSF). Sin basarse en ninguna teoría mecanística en particular, se cree que el antígeno proteico es transportado por la membrana plasmática de la APC de una forma en la que no haya alteración y mediada por el receptor. Se cree además que la parte de la proteína de fusión que se une a la célula dendrítica sirve para preservar la viabilidad y funcionalidad de la APC.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a la elección del antígeno objetivo. Aunque se ha mostrado que varios antígenos relacionados con tumores sirven como objetivos para la inmunidad mediada por células T in vivo, no se ha demostrado la inducción in vitro por antígenos polipeptídicos solubles aislados. (Fisk, y col., J. Exp. Med. (1995), 181, 2109-2117). En los experimentos llevados a cabo para apoyar la presente invención, ahora se ha demostrado que un antígeno tumoral específico de tejido, caracterizado dicho antígeno tumoral específico de tejido porque (i) incluye antígenos que son comunes para un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que son específicos sólo para un tumor individual, y un producto oncogénico, seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53, pueden convertirse en dichos objetivos sensibilizando CTL con derivados de fusión de GM-CSF in vitro.
Resumen de la invención
En un aspecto, la invención se dirige a una composición terapéutica para estimular una respuesta inmunitaria celular. La composición es una célula presentadora de antígeno potente estimulada y aislada, tal como una célula dendrítica activada, que es capaz de activar células T para producir una respuesta inmunitaria celular multivalente contra un antígeno seleccionado. En general, la respuesta de células T medida es sustancialmente mayor que una respuesta de células T producida por dichas células presentadoras de antígeno potentes estimuladas solo por el antígeno seleccionado. En una realización preferida de la invención, la célula presentadora de antígeno potente se estimula por exposición de la célula in vitro a un complejo polipéptido que consta de proteína de unión a células dendríticas, GM-CSF, y un antígeno tumoral específico de tejido, caracterizado dicho antígeno tumoral específico de tejido porque (i) incluye antígenos que son comunes para un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que son específicos sólo para un tumor individual, y un producto oncogénico, seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53.
En otra realización preferida, la proteína de unión a células dendríticas que forma parte del complejo polipeptídico inmunoestimulador es GM-CSF. En otra realización preferida, el antígeno polipeptídico que forma parte del complejo es el antígeno específico de tumor la fosfatasa ácida prostática. En otras realizaciones preferidas más, el antígeno polipeptídico puede ser cualquiera de los antígenos peptídicos productos oncogénicos Her2, p21RAS y p53. El complejo polipeptídico también puede contener, entre la proteína de unión a células dendríticas y el antígeno polipeptídico, un péptido conector.
En un aspecto relacionado, la invención incluye un procedimiento para activar una célula presentadora de antígeno aislada in vitro. De acuerdo con el procedimiento, la activación incluye poner en contacto una célula presentadora de antígeno aislada con un complejo polipeptídico. El complejo polipeptídico usado en este procedimiento es como se ha descrito antes; es decir, consiste esencialmente en proteína de unión a células dendríticas GM-CSF covalentemente unida a un antígeno tumoral específico de tejido, caracterizado dicho antígeno tumoral específico de tejido porque (i) incluye antígenos que son comunes para un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que son específicos sólo para un tumor individual, y un producto oncogénico, seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53. De acuerdo con el procedimiento, la célula presentadora de antígeno activada es eficaz para activar una célula T para producir una respuesta inmunitaria celular multivalente que es sustancialmente mayor que la producida por células presentadoras de antígeno en contacto con el antígeno polipeptídico seleccionado solo. En una realización preferida, la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica, aislada, como se describe en este documento.
En otro aspecto relacionado más, la invención incluye un procedimiento para inducir una respuesta de células T citotóxicas en un sujeto vertebrado. De acuerdo con este aspecto de la invención, una célula dendrítica aislada se pone en contacto con un complejo polipeptídico inmunoestimulador de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas antes, durante un periodo de tiempo eficaz para activar la célula presentadora de antígeno. Después la célula presentadora de antígeno se inyecta en el sujeto mamífero. En una realización preferida, la célula presentadora de antígeno que se activa e inyecta es una célula dendrítica.
En otros aspectos relacionados, la invención también incluye complejos polipeptídicos formados como se ha descrito antes. Como se ha descrito antes, dichos complejos polipeptídicos se forman preferiblemente a partir de la proteína de unión a células dendríticas GM-CSF covalentemente unida a un antígeno tumoral específico de tejido, caracterizado dicho antígeno tumoral específico de tejido porque (i) incluye antígenos que son comunes para un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que son específicos sólo para un tumor individual, y un producto oncogénico, seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53.
En otros aspectos relacionados, la invención también incluye vectores de expresión y sistemas de expresión para producir las proteínas de fusión inmunoestimuladoras descritas antes, así como moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas que codifican dichas proteínas de fusión. En realizaciones preferidas, las moléculas de ácido nucleico codifican proteínas de fusión constituidas esencialmente por GM-CSF y fosfatasa ácida prostática o GM-CSF y Her2.
Breve descripción de las figuras
la fig. 1 muestra la secuencia del ácido nucleico (ID SEC Nº: 1) y de aminoácidos deducida (ID SEC Nº: 2) de la proteína de fusión PAP-GM-CSF que tiene como conector peptídico gly-ser que resulta del conector Bam HI (subrayado);
la fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión Fosfatasa ácida prostática humana/GM-CSF humano, con la secuencia señal de PAP no presente en la proteína madura mostrada con letras minúsculas, los potenciales sitios de N-glicosilación marcados "C", y los potenciales puentes disulfuros marcados "S-S";
las fig. 3A y 3B muestran representaciones esquemáticas de los vectores de expresión para PAP-GM pCEP4 PAPGM (3A) y PAPHGM-BAC (3B) usados en líneas de células de mamíferos (293 células) y de insectos (SF21), respectivamente;
la fig. 4 muestra una gráfica de la bioactividad de GM-CSF de mamífero y las proteínas de fusión PAP-GM-CSF derivadas de baculovirus;
la fig. 5 muestra una gráfica de la bioactividad de la fosfatasa ácida de las proteínas de fusión PAP-GM-CSF;
la fig. 6 muestra una gráfica de lisis de células de carcinoma prostático por CTL sensibilizados para PAP-GM-CSF y estimulados con células presentadoras de antígeno pulsadas con PAP-GM-CSF;
la fig. 7 muestra una gráfica de barras que representa el bloqueo por el anticuerpo bloqueador de HLA de clase I de la lisis de las células de carcinoma de próstata por los CTL sensibilizados para PAP-GM-CSF;
la fig. 8 muestra las secuencias de ácido nucleico (ID SEC Nº: 3) y aminoácidos (ID SEC Nº:4) de una proteína de fusión GM-CSF-Her2 de acuerdo con la presente invención;
la fig. 9 muestra la valoración de la actividad de GM-CSF en líquidos sobrenadantes de cultivos en bruto de células de insectos baculovirus (BVIC) de cultivos de Sf21 infectadas con PAP de rata o PAP de rata-GM-CSF de ratón comparado con GM-CSF de ratón recombinante y la respuesta proliferativa resultante de la línea celular dependiente de GM-CSF GM-NFS-60;
la fig. 10 muestra un esquema de inmunización de ratas COP con células dendríticas purificadas pulsadas con PAP de rata-GM-CSF de rata;
la fig. 11 muestra la secuencia del ácido nucleico y de proteína deducida del gen de fusión p53-GM-CSF, en el que el conector Xba I que codifica la serina y arginina está recuadrado; y
la fig. 12 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión p53-GM-CSF con el conector de serina-arginina sintético impreso en negrita y subrayado.
Descripción detallada de la invención I. Definiciones
Tal como se usa en este documento, la expresión "antígeno específico de tejido" se refiere a un antígeno que es característico de un tipo de tejido, incluidos tejidos tumorales específicos. Un ejemplo de un antígeno específico de tejido expresado por un tejido tumoral es el antígeno fosfatasa ácida prostática, que está presente en más del 90% de todos los tumores de próstata. A modo de contraste, los linfomas de células B producen antígenos de inmunoglobulinas que son particulares para el tumor individual. Dichos antígenos tumorales particulares no se considera que estén dentro de la definición de la expresión "antígeno específico de tejido".
La expresión "producto oncogénico" se refiere a cualesquiera productos de oncogenes que incluyen Her2, p21RAS y p53.
"Células presentadoras de antígeno" (APC) son células que son capaces de activar células T, e incluyen, pero no se limitan, algunos macrófagos, células B y células dendríticas.
Las "células presentadoras de antígeno potentes (PAP)" son células que, después de ser pulsadas con un antígeno, pueden activar los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8^{+} nativos en una respuesta inmunitaria primaria.
La expresión "célula dendrítica" se refiere a cualquier miembro de una población diversa de tipos de células morfológicamente similares encontradas en tejidos linfoides y no linfoides. Estas células se caracterizan por su diferente morfología, altos niveles de expresión de MHC de clase II de superficie (Steinman y col., Ann. Rev. Immunol., 9:271 (1991); incorporado en este documento por referencia para la descripción de dichas células). Estas células se pueden aislar de una serie de fuentes de tejidos, y de forma conveniente de sangre periférica, como se describe en este documento.
La expresión "proteína de unión a células dendríticas" se refiere a GM-CSF.
II. Complejos polipeptídicos inmunoestimuladores A. Selección de los componentes del complejo polipeptídico
Un polipéptido inmunógeno formado de acuerdo con la presente invención, en general se caracteriza como un antígeno tumoral específico de tejido, caracterizado dicho antígeno tumoral específico de tejido porque (i) incluye antígenos que son comunes para un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que son específicos sólo para un tumor individual, y un producto oncogénico, seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53, que está unido covalentemente a la proteína de unión a células dendríticas GM-CSF.
1. Antígenos polipeptídicos
Como se ha expuesto antes, los antígenos polipeptídicos aislados en general no estimulan la activación de células T in vivo o in vitro. El descubrimiento de la presente invención es que algunos tipos de antígenos polipeptídicos, cuando se acoplan a la proteína de unión a células dendríticas GM-CSF estimulan la activación de células T.
La presente invención identifica como particularmente útil para esta capacidad, (1) a los antígenos tumorales específicos de tejidos y (2) a los antígenos peptídicos productos oncogénicos seleccionados del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53. En el contexto de la presente invención, la expresión "antígenos tumorales específicos de tejido" se refiere a antígenos que son comunes de tipos específicos de tumores. A modo de contraste, los antígenos que son específicos para un tumor individual particular, tal como el antígeno idiotipo asociado a tumor de linfoma de células B, se distinguen de los antígenos tumorales específicos de tejido en que tienen un epítopo característico que varía de un individuo a otro. Dichos antígenos son menos útiles en el contexto de la presente invención, puesto que un reactivo inmunoestimulador hay que diseñarlo para el tumor individual, y por consiguiente no forman parte de la
invención.
Los tumores malignos expresan una serie de proteínas que pueden servir como antígenos objetivo para un ataque inmunitario. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan, antígenos específicos de tejido tales como MART-1, tirosinasa y GP 100 en melanoma y fosfatasa ácida prostática (PAP) y antígeno prostático específico (PSA) en el cáncer de próstata. Otras moléculas objetivo pertenecen al grupo de moléculas relacionadas con transformación tales como el oncogén HER-2/Neu/ErbB-2. Algunos de estos antígenos (CEA, HER-2, CD19, CD20, idiotipo) se han usado como objetivos para inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales con éxito limitado.
Así, los ejemplos de antígenos tumorales específicos de tejido incluyen, pero no se limitan, fosfatasa ácida prostática (PAP; asociada con tumores prostáticos), Melan-A/MART-1 (asociado con melanoma; Coulie y col., 1994, J. Exp. Med. 180:35. Hawakami y col., 1994, PNAS 91:3515, Bakker y col., 1994, J. Exp. Med. 122:1005), tirosinasa/albino (asociado con melanoma; Kawakami y col., 1994, J. Exp. Med.). CD19, CD20 y CD37 (asociado con linfoma).
\newpage
Igualmente, se pueden incorporar antígenos peptídicos productos oncogénicos seleccionados del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53, en complejos polipeptídicos de la presente invención como reactivos que en general se pueden usar para estimular respuestas de células T eficaces para reaccionar con tumores que llevan dichos antígenos.
Los antígenos polipeptídicos tales como los descritos antes, se pueden aislar, sintetizar o expresar de forma recombinante de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. En la mayoría de los casos, se han identificado secuencias de ADN codificadoras para estas moléculas. Dichos antígenos aislados pueden formar complejo químicamente con la proteína de unión a células dendríticas, GM-CSF, como se discute a continuación, o se pueden producir de forma recombinante construcciones de proteínas de fusión, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica.
Como ejemplo de lo anterior, la fosfatasa ácida prostática (PAP) es la isozima específica de la próstata de la enzima ubicua fosfatasa ácida. La PAP es una molécula secretada que se ha identificado como un marcador tumoral del suero que es específica para el cáncer de próstata. (Vihko, y col., FEBS Lett. (1988), 236, 275-281, Solin, y col., Biochem. Biophys. Acta (1990), 1048, 72-77). No hay pruebas en la bibliografía de que la PAP por sí misma pueda servir como inductora y objetivo para los CTL. Como se demuestra a continuación, la presente invención muestra que la PAP puede servir tanto como inductora de CTL como un objetivo en las células de cáncer de próstata, cuando se combina con la proteína de unión a células dendríticas GM-CSF y se usa para estimular células presentadoras de antígeno (ilustradas por células dendríticas) que después se usan para sensibilizar CTL.
2. Proteínas de unión a células dendríticas
El segundo componente del complejo polipeptídico de la presente invención es la proteína de unión a células dendríticas GM-CSF. Como se ha mencionado antes, sin basarse en ninguna teoría mecanística en particular, se cree que la presencia de dicha molécula en el complejo covalente con un antígeno proteico facilita el transporte del antígeno por la membrana plasmática de la célula presentadora de antígeno, y más en particular, la célula dendrítica, de un modo mediado por receptor y que no produce alteración. Además se cree que la parte de unión a células dendríticas de la proteína de fusión sirve para conservar la viabilidad y funcionalidad de la APC.
La proteína de unión a células dendríticas es el factor estimulador de la colonia de macrófagos y granulocitos (GM-CSF). Esta glicoproteína, que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 23-33.000 por SDS-PAGE, es una citocina que tiene función pleiotrópica tanto en la hematopoyesis como en inmunología. El GM-CSF tanto humano como murino se sintetizan con una secuencia líder hidrófoba de 17 aminoácidos que se escinde proteolíticamente durante la secreción. Las proteínas maduras tienen 127 (humana) o 124 (murina) aminoácidos, y tienen pesos moleculares del polipéptido central de 14.700 y 14.400 respectivamente, pero comparten sólo 52% de la identidad de aminoácidos. Se ha encontrado que el factor tiene una función estimuladora en la diferenciación y supervivencia de células dendríticas y es activo tanto en formas glicosiladas como desglicosiladas.
Se ha mostrado que el GM-CSF humano y murino se unen a los sitios de unión tanto de alta afinidad (K_{D} = 20-60 pM) como de baja afinidad (K_{D} = 1-6 nM) en células de monocitos-macrófagos, neutrófilos y linajes celulares de eosinófilos. Se ha mostrado la competición de la unión de otro miembro de los factores estimuladores de colonias hematopoyéticas, Multi-CSF, cuando la unión se lleva a cabo a 37º. La unión de GM-CSF a receptores de alta afinidad da como resultado la rápida internalización y degradación de GM-CSF (Metcalf, D. and Nicola, N.A. (1995) The Hemopoietic Colony-Stimulating Factors, Cambridge University Press, NY). Estas propiedades se pueden usar para servir como una guía para la selección de proteínas de unión a células dendríticas adicionales útiles en la formación de complejos polipeptídicos inmunoestimuladores de acuerdo con la presente invención.
B. Formación de complejos polipeptídicos
Los complejos polipeptídicos se pueden formar por medios químicos, tales como por técnicas de acoplamiento convencionales conocidas en la técnica. Por ejemplo, los péptidos se pueden acoplar usando un agente deshidratante tal como diciclohexilcarbodiimida (DCCI) para formar un enlace peptídico entre los dos péptidos. Alternativamente, se pueden formar uniones por grupos sulfhidrilo, grupos amino en épsilon, grupos carboxilo u otros grupos reactivos presentes en los polipéptidos, usando reactivos disponibles en el comercio. (Pierce Co., Rockford, IL).
Los complejos polipeptídicos también se pueden formar de manera recombinante como proteínas de fusión de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. El ejemplo 1 detalla los procedimientos usados para producir una proteína de fusión GM-CSF-PAP de acuerdo con la presente invención. Brevemente, la PAP humana se clonó de una línea celular de carcinoma de próstata de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Se mutó el codón de parada en el extremo 3' de la secuencia, y en su lugar se insertó un sitio Bam HI, para fusionar el ADNc de PAP al ADN de GM-CSF. El ADN de GM-CSF se clonó a partir de una biblioteca CMSP (células mononucleares de sangre periférica) de acuerdo con procedimientos estándar. Se insertó un sitio Bam HI en el extremo 5' del ADN, y se insertó un sitio de clonación XbaI en el extremo 3', junto con un codón de parada en el marco. Los ADNc generados por la PCR se hicieron digerir con las enzimas de restricción adecuadas y se clonaron en vectores de restricción para la transfección en líneas celulares específicas de mamífero o insecto. La figura 1 muestra las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos deducida del polipéptido de fusión PAP-GM-CSF que tiene un conector peptídico gly-ser. La figura 2 ilustra además la secuencia de la proteína de fusión con sitios potenciales de glicosilación indicados como "C" y los puentes disulfuro probables mostrados como "S-S". Las figuras 3A y 3B muestran representaciones esquemáticas de los vectores de expresión de PAP-GM-CSF usados para la transfección de líneas celulares de mamífero (293) y de insecto (SF21), respectivamente.
Los vectores de expresión de fusión se usaron para transfectar células COS (expresión transitoria) así como células 293-EBNA de mamífero (Invitrogen) y células SF21 de insecto (Clontech, Palo Alto, CA). Los productos de proteínas de fusión se recuperaron de los líquidos sobrenadantes del cultivo tisular, y se purificaron por afinidad por paso por una columna de inmunoafinidad de anticuerpo monoclonal anti-PAP humano. El análisis por SDS-PAGE puso de manifiesto bandas de proteínas que migraban a 75 kD y 64 kD como productos de células de mamífero e insecto, respectivamente. La banda de 75 kD corresponde a un tamaño que es aproximadamente 19,5 kD más largo que el tamaño predicho de la cadena principal del polipéptido PAP-GM-CSF que es 55,5 kD. Esto se puede explicar por la presencia de 5 sitios potenciales de N-glicosilación en la secuencia, cuya glicosilación aumentaría el M_{r} aparente de la proteína, y está de acuerdo con el hecho de que las células 293-EBNA contienen maquinaria de glicosilación humana completamente funcional. La proteína de fusión derivada de células de insecto era aproximadamente 8,5 kD más larga que la cadena principal del péptido PAP-GM-CSF. Estos datos están de acuerdo con los patrones de glicosilación conocidos en las células Sf21, de las que se ha publicado que utilizan los sitios de N-glicosilación, pero que sólo añaden hidratos de carbono truncados que típicamente terminan con la adición de un solo residuo de manosa.
Se ensayaron las bioactividades de PAP y GM-CSF de las moléculas de fusión en ensayos adecuados, detallados en el Ejemplo 2. Las proteínas de fusión derivadas de células tanto de insecto como de mamífero presentaban actividad de GM-CSF, como se puso de manifiesto por su capacidad para mantener el crecimiento de líneas celulares dependientes de GM-CSF (figura 4). Igualmente, ambos productos presentaban actividad de PAP (figura 5).
Las proteínas de fusión construidas para incorporar antígenos productos oncogénicos se ilustran por la incorporación del producto oncogénico Her2. Her2 es un receptor del factor de crecimiento que pertenece a la familia de receptores EGF-R. Es sobreexpresado por las células de cáncer de pecho, las células de cáncer de ovario y una variedad de otras células cancerígenas. El ADNc que codifica el dominio extracelular de Her2 se clona a partir de una línea celular de cáncer de pecho y se fusiona al ADNc de GM-CSF, esencialmente como se ha detallado antes para PAP-GM-CSF. La producción de la proteína soluble se puede verificar usando anticuerpos monoclonales específicos para Her2 en un ensayo ELISA, de acuerdo con procedimientos específicos conocidos en la técnica. La proteína de fusión incluye las secuencias para el dominio extracelular (aminoácidos 1-652) de Her2 (GenBank) y GM-CSF (figura 8). En esta proteína de fusión particular las dos proteínas están unidas por un conector de leucina/ácido glutámico que se genera por la inserción de un sitio XHO I.
El gen supresor de tumores celulares p53 se clona y fusiona con GM-CSF, como se describe en el Ejemplo 7. La secuencia del gen de fusión recombinante se muestra en la figura 11, y la secuencia del polipéptido p53-GM-CSF producido se muestra en la figura 12. La proteína de fusión p53-GM-CSF se usa para generar inmunidad anti-p53 como se describe para la inducción de inmunidad anti-PAP con PAP-GM-CSF en los Ejemplos 3, 4 y 6.
Otros antígenos productos oncogénicos seleccionados del grupo constituido por Her-2 y p21RAS se incorporan de forma similar en proteínas de fusión de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento, usando las secuencias publicadas.
III. Estimulación de células T
Un aspecto importante de la presente invención es la utilidad de las construcciones de complejos polipeptídicos descritos antes en un procedimiento para dirigir la pareja de la proteína antígena a las células presentadoras de antígeno (APC), tal como el tipo de célula conocido como "célula dendrítica", descrita antes. De acuerdo con la invención, la dirección se produce de una forma que da como resultado la entrada en la ruta de clase I del procesamiento de antígenos. Después las APC se usan para sensibilizar los CTL ex vivo e in vivo, de acuerdo con los procedimientos discutidos a continuación.
Las células dendríticas son APC muy potentes, y son las únicas APC que pueden sensibilizar CTL nativos. Aunque los precursores de células dendríticas presentes en la sangre humana pueden recoger antígeno, no funcionan como APC potentes. Por otra parte, la célula dendrítica madura es la APC más potente, pero no recoge antígeno de forma espontánea in vitro. En el pasado, era necesario tratar las células dendríticas maduras con fuerza física (liposomas, choque osmótico) o recubrirlas con antígenos peptídicos pequeños exógenos (8-11 aminoácidos de longitud; en general nonámero) para permitir que actuaran como APC.
La presente invención permite la introducción de una proteína añadida de forma exógena en la ruta de clase I de una célula dendrítica madura. Dicha inducción se puede realizar in vitro, aislando APC tales como células dendríticas, "pulsando" o poniéndolas en contacto con el complejo polipeptídico durante un periodo de tiempo prolongado, y después usando las APC pulsadas para estimular células T autólogas in vitro o in vivo. En este último caso, las APC pulsadas se administran (aproximadamente 10^{7} células/inyección) al sujeto. La respuesta del sujeto se mide siguiendo la inducción de una respuesta de células T citolíticas, una respuesta de células T auxiliares y respuestas de anticuerpos frente al antígeno en células mononucleares de sangre periférica por procedimientos conocidos en la técnica. Se pueden administrar dosis múltiples para producir una respuesta adecuada.
\newpage
El uso de células dendríticas estimuladas con antígeno de fusión de GM-CSF da resultados superiores a otros procedimientos, tales como las preparaciones de células dendríticas pulsadas con péptidos. Es decir, mientras que las células dendríticas pulsadas con péptidos de 8-11 unidades de longitud pueden inducir inmunidad, dicha inmunidad se dirige a un epítopo único de célula T. Las proteínas incorporadas en los liposomas o liberadas en las células dendríticas por choque osmótico inducen reactividad frente a epítopos múltiples de células T; sin embargo, este procedimiento es relativamente ineficaz debido a la toxicidad inherente de estos tratamientos para las células dendríticas.
A diferencia de esto, los antígenos de fusión de GM-CSF de la presente invención inducen inmunidad frente a epítopos múltiples y preserva y potencia al mismo tiempo la viabilidad y función de la célula dendrítica. En la práctica, se encuentra que las composiciones de la presente invención inducen una activación celular (células T) que es multivalente y sustancialmente mayor que la producida por un solo antígeno seleccionado.
En experimentos llevados a cabo para apoyar la presente invención, se usó la proteína de fusión que consistía en PAP y GM-CSF descrita en la sección previa, para la introducción in vitro en células dendríticas y posterior activación de células T citolíticas, como se detalla en el Ejemplo 4. Brevemente, se aislaron CMSP positivas para HLA-A2.1 por procedimientos estándar y se sensibilizaron con la proteína de fusión durante 2-5 días. Se redujeron las células TCD4^{+} de la mezcla celular, se separó en fracciones de alta y baja densidad, y los cultivos separados se volvieron a estimular semanalmente con APC pulsadas con PAP-GM-CSF autólogo. Se evaluó el potencial lítico de las células T presente en las fracciones usando un ensayo de liberación de cromo estándar usando una línea celular de carcinoma de próstata transgénico HLA-A2.1 como objetivo. Esta nueva línea celular se construyó de acuerdo con los procedimientos detallados en el Ejemplo 3 de este documento y es útil para seleccionar y analizar linfocitos T citotóxicos restringidos por HLA de clase I.
Los resultados de los ensayos de lisis se presentan en la figura 6. Como se muestra, de los cuatro cultivos de células T diferentes ensayados, tres presentaban sustancial citotoxicidad dependiente de la dosis frente al objetivo del carcinoma de próstata. El nivel de citotoxicidad más alto lo alcanzaron las células que se fraccionaron en la fracción de sedimento de alta densidad el día 5 (círculos blancos, día 5 P). Las células de alta (cuadrados blancos día 2 P) y baja (cuadrados negros, día 2 IF) sensibilizadas durante 2 días mostraron una potencia prácticamente igual. Los cultivos celulares obtenidos a partir de la fracción de la interfase de baja densidad el día 5 (círculos negros, día 5 IF) presentaron poca o no presentaron citotoxicidad.
La figura 7 muestra que la citolisis específica de tumor se redujo sustancialmente en presencia del anticuerpo de bloqueo específico de HLA de clase I W6/32 con una relación de efector:objetivo (E/O) de 10:1 y se es eliminada completamente por el anticuerpo con una relación E/O de 3,3/1. El anticuerpo de control CA 141 no redujo la muerte mediada por células T. Estos experimentos demuestran que la interacción con la célula objetivo es mediada por el receptor de células T clásico/ ruta específica de antígeno restringido por HLA de clase I.
Los resultados anteriores demuestran la eficacia de los complejos de polipéptido de fusión formados de acuerdo con la presente invención, para estimular las respuestas de células T in vitro. Estas respuestas se pueden comparar con las estimuladas por el antígeno solo (en ausencia de la proteína de unión a células dendríticas). Además, su carácter multivalente se puede ensayar por procedimientos estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
IV. Aplicaciones terapéuticas A. Terapia in vitro/ex vivo
La presente invención proporciona la inducción de proteínas aisladas o solubles de inmunidad celular in vitro presentando un antígeno específico a una célula presentadora de antígeno (APC), tal como una célula dendrítica, como parte de una proteína de fusión inmunógena. Como se ha discutido antes dicha inducción en general no se observa in vitro usando antígenos solubles enteros como materiales de inducción.
En la práctica, las células dendríticas se aíslan de un individuo, usando procedimientos conocidos, o preferiblemente, como se describe en el Ejemplo 5. Las células dendríticas (u otras APC) se mezclan con 10 ng/ml equivalente de antígeno de fusión de GM-CSF, como se describe en el Ejemplo 4. Después se pueden reducir las células T CD4^{+} de la preparación por inmunoadsorción en fase sólida y después fraccionar para el enriquecimiento en células que tienen actividad citolítica. Después se administran dosis de aproximadamente 10^{7} células al sujeto por inyección intravenosa o central de acuerdo con procedimientos establecidos (p. ej., infusión en 30 a 60 minutos). La sensibilidad del sujeto a este tratamiento se mide por seguimiento de la inducción de una respuesta de células T citolíticas, una respuesta de células T auxiliares y respuesta de anticuerpo frente al antígeno en células mononucleares de sangre periférica, por procedimientos conocidos en la técnica.
Además del régimen de administración in vivo directo descrito antes, las células APC se pueden usar, por ejemplo en terapia somática ex vivo, dispositivos implantables in vivo y dispositivos extracorpóreos ex vivo. También se pueden usar en la selección de antigenicidad e inmunogenicidad de epítopos peptídicos de los antígenos específicos de tumor y virus.
\newpage
En algunos casos, puede ser ventajoso usar células obtenidas de un individuo para tratar una afección en un segundo individuo. Por ejemplo, los individuos infectados por el VIH con SIDA a menudo no son capaces de armar respuestas de células T antivíricas. En dichos casos, los CTL se pueden aislar de individuos sanos con compatibilidad con HLA, tales como hermanos, estimularlos o sensibilizarlos con DC pulsado con antígeno in vitro, ampliarlos y volverlos a administrar a los individuos infectados por el VIH.
B. Terapia in vivo
Las composiciones de proteína de fusión descritas en este documento también se pueden administrar directamente a un individuo como una vacuna, con el fin de estimular las rutas de inmunidad celular del individuo in vivo. Aquí se administra una dosis de aproximadamente 5 a 200 microgramos/kg de proteína de fusión, preferiblemente los días 0, 14 y 28, con una dosis de refuerzo opcional a los 6 meses. La respuesta del sujeto se mide por seguimiento de la inducción de una respuesta de células T citolíticas, una respuesta de células T auxiliares y respuesta de anticuerpo frente al antígeno en células mononucleares de sangre periférica por procedimientos conocidos en la técnica.
C. Resultados de modelos experimentales de inmunoestimulación
El Ejemplo 6A proporciona detalles de la construcción de antígenos de fusión y protocolos de inyección usados en un modelo experimental de rata de inmunoestimulación. Se inyectó directamente una proteína de fusión compuesta de PAP de rata y GM-CSF de rata en ratas (estimulación in vivo) o para estimular células dendríticas de rata para la posterior inyección en ratas (inducción ex vivo). Es necesario usar moléculas y células de rata, puesto que las células efectoras humanas no funcionan normalmente en otras especies y además son antígenas en otras especies, tales como la rata. Además, el antígeno objetivo (PAP) es diferente entre humanos y otras especies, y no se podría esperar que el GM-CSF humano produjera el mismo tipo de efecto en otras especies. Sin embargo, se entiende que el uso de células de rata en ratas proporcionará un sistema modelo para el uso de células y proteínas humanas en seres humanos.
Como se detalla en el Ejemplo 6, se preparó fosfatasa ácida prostática de rata (PAP de rata) de forma recombinante y se fusionó con GM-CSF de rata. Las células dendríticas de tejido esplénico de rata se pulsaron con PAP de rata-GM-CSF de rata y se inyectaron en ratas normales. Además, se ensayaron sistemas de liberación alternativos, puesto que la inmunización dirigida a PAP autóloga no se había llevado a cabo previamente, según el conocimiento de los autores de la invención.
En los estudios llevados a cabo para apoyar la presente invención y detallados en el Ejemplo 6B, se inmunizaron ratas con (i) células dendríticas pulsadas con PAP de rata-GM-CSF de rata, (ii) PAP de rata-GM-CSF de rata solo, o (iii) PAP de rata en adyuvante CFA convencional. Después se examinó en los órganos de las ratas (próstata más seis sistemas de órganos principales) la inmunopatología provocada por la inmunización dirigida por PAP autóloga. De acuerdo con el sistema de modelo de rata, se esperaba que una respuesta inmunitaria satisfactoria diera como resultado el objetivo inmunitario de los órganos que expresaban PAP, y en particular, de la próstata.
Como se muestra en la Tabla 1, los estudios de histopatología muestran que las inmunizaciones con células dendríticas pulsadas con PAP de rata-GM-CSF de rata o con proteína de fusión PAP de rata-GM-CSF de rata inducen autoinmunidad específica de órgano que se limita a la próstata. En contraste, la inmunización con PAP de rata/proteína CFA no produce este resultado. Este resultado demuestra que el propio PAP-GM-CSF y las células dendríticas pulsadas con PAP-GM-CSF producen autoinmunidad específica de antígeno que es significativamente mejor, y que de hecho no puede producir, el antígeno solo asociado con un adyuvante convencional.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Histopatología^{a} de órganos de ratas inmunes y no inmunes
1
^{a} \begin{minipage}[t]{152mm} Clasificación de la patología: ND = no evaluada; N = no hay lesiones significativas; 1 = trazas/leve; 2 = leve; 3 = moderada; 4 = grave.\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{152mm} Grupos de inmunización: los animales 1C, 2C, 3C, 4C eran controles no inmunizados; los animales 5T, 6T, 7T, 8T se inmunizaron con células dendríticas pulsadas con PAP de rata-GM-CSF de rata; los animales 1CFA, 2CFA se inmunizaron con PAP de rata sumergida en CFA; los animales 1 PAP GM, 2 PAP GM se inmunizaron con PAP de rata-GM-CSF de rata recombinante.\end{minipage}
Los siguientes ejemplos ilustran, pero no se pretende que limiten la invención de ninguna forma.
Ejemplo 1 Construcción de proteínas de fusión PAP/GM-CSF
Si no se describe lo contrario, los procedimientos de clonación generales se llevaron a cabo de acuerdo con técnicas estándar como describen Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989).
Se clonó PAP humana de la línea celular de carcinoma de próstata LnCaP.FGC (American Type Culture Collection, Rockland Maryland; "ATCC"). Se sintetizaron cebadores oligonucleótidos sintéticos que contenían la secuencia CGGCTCTCCTCAACATGAGAGC de acuerdo con procedimientos estándar de Kyestone Labs (Menlo Park, CA). Estos cebadores son homólogos al extremo 5' de la secuencia de ADNc de PAP conocida que está publicada en la base de datos GenBank.
Se unieron los sitios de restricción Hind III, Mun I o Xho I, de acuerdo con los requisitos del vector de expresión particular usado. En el extremo 3' se construyó un oligonucleótido de secuencia CACAGGATCCATCTG
TACTGTCCTCAGTACC que mutaba el codón de parada 387 de la secuencia de PAP y se sustituía por un sitio Bam HI que codifica los aminoácidos glicina y serina. Este sitio Bam HI se usó para fusionar el ADNc de PAP al ADNc de GM-CSF que se clonó a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP), basándose en la secuencia que está publicada en GenBank. En el extremo 5' de GM-CSF se unió un sitio Bam HI a un oligonucleótido GACTGGATCCGCACCCGCCCGCTCGCCC que es homólogo a los nucleótidos que codifican los aminoácidos 18-23 en la secuencia GM-CSF. El extremo 3' de GM-CSF se generó con un oligonucleótido GATCTCTAGAGCTTGGC
CAGCCTCATCTGG que termina después de la parada en el marco de GM-CSF y crea un sitio de clonación Xba I. Se aisló Poli A+ARN de la línea celular LnCaP.FGC y de CMSP con el kit de rastreo Micro Fast (Invitrogen) de acuerdo con el manual suministrado por el fabricante. El Poli A+ARN se transcribió de forma inversa con el kit de ciclo de ADNc (Invitrogen) de acuerdo con los procedimientos descritos en el manual adjunto. Después la primera cadena del ADNc se sometió a 25 ciclos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los cebadores descritos antes. Las condiciones en el ciclador térmico Perkin-Elmer 9600 eran las siguientes. Se llevaron a cabo 25 ciclos de amplificación: Desnaturalización: 94ºC, 15 segundos: reasociación a 55ºC, 15 segundos; extensión a 72ºC, 60 segundos. A los 25 ciclos le siguieron un periodo de extensión final de 420 segundos a 72ºC. Los productos de la PCR se analizaron en geles de agarosa. Se hicieron digerir con las enzimas de restricción adecuadas y se clonaron en los vectores pCR3 (Invitrogen) para crear pCR3-PAP-GM (no se muestra), pCEP 4 (Invitrogen) para crear pCEP4-PAP GM (Fig. 3A) y en pBacPac 8 (Clontech) para crear PAPHGMBAC (Fig. 3B). Las secuencias de ADN de las construcciones clonadas se confirmaron usando procedimientos estándar en un secuenciador fluorescente Modelo ABI 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA). La secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos deducidas se presentan como ID SEC Nº: 1 y ID SEC Nº: 2, en la Fig. 1, respectivamente.
Se electroporó pCR3 PAP-GM en células COS-7 (ATCC) para experimentos de expresión tansitoria. Después de confirmar que una proteína del tamaño, identidad inmunológica y función predichos se podía expresar transitoriamente en células COS-7 y 293-EBNA (Invitrogen), se generaron transfectados estables en la línea celular de riñón embriónico humano 293-EBNA, usando un vector de expresión episomial pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA). Después de electroporación y selección en higromicina, se generaron clones recombinantes cultivando en placas las células en condiciones de dilución limitantes y seleccionando la bioactividad de PAP en los líquidos sobrenadantes de cultivo de tejido celular. Los clones de mayor producción se adaptaron a medio sin proteína y se hicieron crecer en biorreactores de fibra hueca CellMax (Gibco, Gaithersberg, MD). Se recogieron los medios gastados de los cultivos, se juntaron y se clarificaron por centrifugación. Después se pasaron por una columna de inmunoafinidad que se hizo por acoplamiento del anticuerpo monoclonal específico de PAP humano ATCC HB8526 (ATCC) a una resina de Sefarosa. Después de lavar, el material unido se eluyó a pH bajo, se neutralizó y se dializó frente a tampón fisiológico. La fracción eluida se analizó por electroforesis desnaturalizante en SDS-PAGE en condiciones de reducción. El gel resultante mostró una sola banda de proteína a 75 kD que corresponde al tamaño predicho de PAP-GM-CSF completamente glicosilado.
También se usó PAPHGM-BAC para generar un virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica recombinante (AcNPV, baculovirus) por recombinación homóloga de PAPHGM-BAC con el ADN vírico BacPAK6 (Clontech, Palo Alto, CA). Se usaron los reactivos del sistema de expresión del baculovirus BacPAK (Clontech) y se llevaron a cabo los procedimientos esencialmente como se describe en el manual del producto. PAPHGM-BAC y BacPAK6 se cotransfectaron en células SF21 (Clontech) por lipofección. El líquido sobrenadante del cultivo celular gastado se recogió el día 5. Se valoraron en células SF21 recientes que después se hicieron crecer en medio semisólido durante otros 4 días. Después de teñir las monocapas con rojo neutro, se identificaron las placas víricas y se cogieron con una pipeta Pateur. Los virus recombinantes purificados de la placa se eluyeron en medio reciente y después se usaron para seleccionar la producción de PAP-GM-CSF en células SF21 recientes. Se identificaron las placas positivas y se usaron para generar reservas de virus y proteína recombinante en ciclos posteriores de infección de células SF21 recientes. Se recogieron los medios de los cultivos de producción tres días después de infección. Después se procesaron como se ha descrito para PAP-GM-CSF, que se obtuvieron de células 293-EBNA. El análisis de la proteína purificada por inmunoafinidad puso de manifiesto una sola banda de proteína a 64 kD después de teñir con plata un gel de SDS-PAGE.
Ejemplo 2 Bioactividad de las proteínas de fusión PAP-GM-CSF
Se analizó en las proteínas de fusión PAP-GM-CSF de todos los sistemas de expresión descritos en el Ejemplo 1 la capacidad de mantener el crecimiento de las líneas celulares dependientes de GM-CSF. También se analizó la actividad enzimática en ensayos de fosfatasa ácida. Se usaron bioensayos estándar para determinar la bioactividad de GM-CSF.
Actividad de GM-CSF. Se usó la línea celular de eritroleucemia dependiente de GM-CSF TF-1 (ATCC, Rockville, MD) y la línea celular de leucemia monocítica aguda AML-193 (ATCC) para analizar si el GM-CSF retiene su bioactividad después de fusión con PAP. Las líneas celulares que se cultivaban habitualmente en medio que contenía GM-CSF se pusieron en medio regular durante 24 horas antes del ensayo. Se cultivaron en placa con 1500 células por pocillo por triplicado, en medio de cultivo tisular. Se añadieron a las células líquidos sobrenadantes de ensayo o GM-CSF recombinante como control positivo. Las células se cultivaron durante 72 horas y después se pulsaron durante 4 horas con timidina tritiada de 1 microcurie por pocillo para determinar la tasa de síntesis de ADN. La figura 4 muestra que el PAP-GM-CSF tanto derivado de células de mamífero como el derivado de células de insecto mantenían el crecimiento de líneas dependientes de GM-CSF. La bioactividad relativa calculada de PAP-GM-CSF es 20% de la actividad de las líneas celulares dependientes de GM-CSF recombinantes control en una base molar.
Actividad de fosfatasa ácida. Se determinó la bioactividad del segundo componente de la proteína de fusión en un ensayo enzimático de la actividad de fosfatasa ácida. La fosfatasa ácida se midió como la capacidad de la proteína para hidrolizar el para-nitrofenil-fosfato (pNPP) a pH ácido. Brevemente, el líquido de ensayo se diluyó en citrato sódico 50 mM pH 4,8. Se añadió pNPP con una concentración final de 2 mg/ml. Después de 30 minutos de incubación a 37ºC, se añadió a la reacción un volumen igual de NaOH 1 M. El pNPP hidrolizado en estas condiciones tiene un color amarillo que se puede cuantificar con un espectrofotómetro a 405 nm. La figura 5 muestra que el PAP-GM-CSF tanto de las células derivadas de mamífero como derivadas de insecto hidrolizaban pNPP en condiciones ácidas.
Por lo tanto, está claro que la actividad biológica original tanto de PAP como de GM-CSF se conserva en las proteínas de fusión PAP-GM-CSF.
Ejemplo 3 Generación de una línea celular objetivo para linfocitos T citotóxicos restringidos por HLA de clase I
Si no se describe lo contrario, todas las técnicas de cultivo tisular, manipulaciones celulares y ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con técnicas estándar.
Con el fin de generar una línea celular de cáncer de próstata que se pudiera usar como una célula objetivo en un contexto genético definido, se generó una línea celular transgénica de cáncer de próstata HLA A2.1. HLA A2.1 es el elemento de restricción mejor estudiado en respuestas inmunitarias restringidas de HLA de clase I humano y es el alelo más frecuente en los caucasianos. Se aisló un ADNc que codifica la secuencia publicada (GenBank) de HLA A2.1 y se clonó a partir de la línea celular linfoblastoide JY. El ADNc de la cadena pesada de HLA A2.1 se amplificó con el cebador homosentido 5-AgACgCCgAggATggCC-3' y el cebador antisentido 5-CCTCTCTggAACAggAAAgATg-3'. Los procedimientos y las condiciones eran como se han descrito para PAP y GM-CSF excepto que se usó la línea celular JY (obtenida de Dr. Ed Engleman, Stanford University Blood Bank, Stanford, CA) como material de partida. El fragmento génico resultante se clonó en el vector pCR3 con el kit de clonación TA (Invitrogen). La línea celular de carcinoma de próstata LnCaP.FGC (ATCC) se transfectó con este plásmido de expresión que confiere la expresión de HLA A2.1. Las líneas celulares originales no expresan el alelo A2.1. Después de selección de fármaco en G418 (Gibco) los transfectantes resultantes se seleccionaron según la expresión de HLA A2.1 por inmunoadsorción en fase sólida ("panning") con un anticuerpo monoclonal específico de HLA A2.1 (BB7.1, ATCC). La línea celular resultante expresaba HLA A2.1 de forma homogénea mientras que su pariente permanecía negativa. Esta nueva línea celular transgé-
nica es excepcionalmente útil en la selección y análisis de linfocitos T citotóxicos restringidos por HLA de clase I.
Ejemplo 4 Inducción de CTL específicos de cáncer de próstata por PAP-GM-CSF
Se usó un sistema de sensibilización y expansión in vitro de células T para establecer la utilidad de PAP-GM-CSF en la generación de CTL restringidos por HLA de clase I.
Se aislaron CMSP positivas para HLA A2.1 por procedimientos estándar de gradiente de densidad (FICOLL-HYPAQUE, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) con una densidad de 1,077 g/ml. Las células se sensibilizaron con 10 ng/ml equivalente de PAP-GM-CSF durante 2 ó 5 días. (La potencia equivalente de GM-CSF se midió en una línea celular dependiente de GM-CSF como se ha detallado en el Ejemplo 3; el peso real usado era 20 veces mayor debido a la diferencia de tamaño y actividad específica de PAP-GM-CSF). Después se redujeron las células T CD4^{+} de la preparación celular por inmunoadsorción en fase sólida y se separaron en células de baja densidad y de alta densidad en un gradiente de densidad de 1,068 g/ml. Después se cultivaron las diferentes fracciones por separado en medio AIM V (Gibco, Gaithersberg, MD) complementado con rIL-2 (20 U/ml). Se usaron CMSP autólogas que se cultivaron en PAP-GM-CSF 20 ng/ml en medio Aim V como células presentadoras de antígeno para la reestimulación a intervalos semanales. Se evaluó el potencial lítico de las células en un ensayo estándar de liberación de cromo de 4 horas con la línea celular de carcinoma de próstata transgénica con HLA A2.1 LnCaP.FGC como objetivo.
La figura 6 muestra la inducción de linfocitos T citotóxicos específicos para carcinoma de próstata LnCaP.FGC/
A2.1 por células presentadoras de antígeno pulsadas con PAP-GM-CSF. Se sensibilizaron PBL positivos para HLA-A2.1 con 10 ng/ml de GM-CSF equivalentes de PAP-GM-CSF durante 2 ó 5 días. Se redujeron las células T CD4^{+} de los cultivos y estos se separaron en fracciones de baja (IF) y de alta (P) densidad frente a un gradiente de densidad Nycodenz que tenía una densidad de 1,068 g/ml.
Para investigar si la citotoxicidad observada era un fenómeno mediado por células T citolíticas CD8+ restringidas por HLA de clase I, se realzó un ensayo de bloqueo con el anticuerpo monoclonal específico para HLA de clase I monomórfico W6/32 (ATCC). W6/32 bloquea la muerte mediada por HLA de clase I en ensayos estándar, mientras que el anticuerpo de control CA141 es específico para HLA de clase II (DR) y no interferirá con la muerte restringida por la clase I. Para este experimento se usaron los cultivos de células T que se obtuvieron de la fracción de sedimento de 5 días (descrito antes) que presentaban la citotoxicidad más alta. Las líneas de células T usadas en el experimento contenían 38% de células T positivas para CD3/CD8. Se evaluó su potencial lítico en un ensayo estándar de liberación de cromo de 4 horas con la línea celular de carcinoma de próstata transgénica HLA A2.1, LnCaP.FGC/A2.1, como objetivo. La figura 7 muestra que la citolisis específica de tumor era sustancialmente menor en presencia del anticuerpo de bloqueo de HLA de clase I W6/32 con una relación de efector:objetivo (E/O) de 10:1 y era eliminada completamente por el anticuerpo con una relación de E/O 3,3/1. El anticuerpo de control CA 141 no reducía la muerte mediada por células T. Estos experimentos demuestran que la interacción con la célula T objetivo es mediada por la ruta clásica específica de antígeno restringida por HLA de clase I/receptor de células T.
Ejemplo 5 Preparación de células dendríticas
Las capas leucocitarias preparadas a partir de una unidad de sangre de donantes voluntarios sanos positivos para HLA-A0201 se obtienen del Centro de Sangre de la Universidad de Stanford (Stanford, CA). Las células se recogen de los envases de leucocitos, se diluyen a 60 ml usando solución salina tamponada con fosfato sin Ca^{++}/Mg^{++} (D-PBS; Gibco Laboratories, Grand Island, NY) y se disponen en capas sobre dos columnas de 15 ml de medio de separación de sílice coloidal organosilanizada (OCS) (preparado como describe Dorn en la patente de EE.UU. 4.927.749, incorporada en el presente documento por referencia, con una densidad de 1,0720 g/ml, pH 7,4, 280 mOsm/kg de H_{2}O) en tubos de centrífuga de 50 ml, preferiblemente tubos con trampas celulares. El medio OCS preferiblemente se prepara haciendo reaccionar y así bloqueando los grupos silanol de la sílice coloidal (aproximadamente partículas de 10-20 mm de diámetro) con un reactivo de alquil-trimetoxi-silano.
Se describen sílices coloidales relacionadas y procedimientos para su producción en la patente de EE.UU. 4.927.749 de Dorn. En una realización preferida, el material de gradiente de densidad de OCS se diluye a una densidad específica adecuada en una solución salina fisiológica complementada con polivinilpirrolidona (PVP) tal como PVP-10 disponible en Sigma Chemical C. (St. Louis, MO).
Los tubos se centrifugan a 1000 x g durante 35 minutos a temperatura ambiente. Se para el funcionamiento de la centrifuga sin frenar y se recogen las células mononucleares de la sangre periférica (CMSP) presentes en la interfase.
Las CMSP se vuelven a suspender en D-PBS, se centrifugan a 650 x g durante 10 minutos y dos veces más a 200 x g durante 5 minutos para separar las plaquetas. Las CMSP reducidas en plaquetas se vuelven a suspender en 60 ml de D-PBS, se disponen en capas en la parte superior de dos columnas de 15 ml de OCS (densidad 1,0610 g/ml, 270 mOsm/kg de H_{2}O) en un tubo de centrífuga y se centrifugan a 650 x g durante 25 minutos a 4ºC sin frenar. La interfase resultante (principalmente monocitos) y las células sedimentadas (principalmente linfocitos) se recogen y se lavan con D-PBS por centrifugación a temperatura ambiente (una vez a 650 x g durante 10 minutos y dos veces después a 200 x g durante 5 minutos).
En los casos en los que se usan células dendríticas para generar los linfocitos T citotóxicos específicos de péptidos CTL) con el fin de elucidar su función de presentación de antígeno, la fracción de interfase (principalmente monocitos) se vuelve a suspender en suero AB humano mezclado frío (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) al que se añade gota a gota un volumen igual de suero AB al 80% dimetilsulfóxido al 20% (DMSO) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). La suspensión celular resultante se divide en partes alícuotas en crioviales y se congelan en nitrógeno líquido. Los monocitos se pueden usar para la reestimulación de CTL para la expansión.
La fracción de sedimentos se vuelve a suspender en 100 ml de medio de cultivo AB, se inocula en dos matraces de cultivo celular T-75 y se cultivan en un incubador humidificado con CO_{2} al 5% durante 40 horas. Después de la incubación, se recogen las células no adherentes mediante pipeteo moderado, se lavan y se vuelven a suspender con una concentración de 2-5 x 10^{6} células/ml de medio de cultivo AB. La suspensión celular se dispone en capas en cuatro columnas de 4,0 ml de medio de separación OCS (densidad 1,0565 g/ml, pH 7,4, 280 mOsm/kg de H_{2}O), en medio de cultivo AB y se centrifuga a 650 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente sin frenar.
La interfase y las células sedimentadas se recogen y se lavan con medio de cultivo AB (medio RPMI-1640 basal, Gibco Laboratories, Grand Island, NY) por centrifugación una vez a 650 x g durante 10 minutos y dos veces después a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente ambos. El rendimiento y la viabilidad de ambas fracciones celulares se calculan por recuento en un hemocitómetro usando exclusión con tinta azul de tripano.
La pureza de las células dendríticas en la fracción de la interfase se cuantifica por análisis en un citómetro de flujo (FACS). Las células dendríticas se caracterizan como negativas para los marcadores de fenotipo celular CD3 (linfocitos T), CD14 (monocitos), CD16 (células NK) y CD20 (células B) y positivas para la expresión de HLA de clase II usando la tinción doble con HLA-DR (en el canal FITC) y un cóctel de CD3, CD14, CD16, CD20 (en el canal PE). Se puede usar la tinción doble con IgG2a tanto en el canal FITC como PE como control de isotipo.
La morfología de las células también se puede evaluar usando fotomicroscopía. La fracción enriquecida en DC contiene células cubiertas de gran tamaño, extendiéndose los procesos citoplasmáticos desde la superficie celular, característicos de DC.
Ejemplo 6 Eficacia in vivo de células dendríticas pulsadas con PAP-GM-CSF A. Construcción, expresión y bioactividad de proteínas de fusión de PAP de rata y GM-CSF recombinantes
Se construyó PAP de rata-GM-CSF de rata recombinante, como sigue: se amplificó el ADNc de PAPr a partir de la primera cadena del ADNc hecha a partir de ARNm aislado de próstata de rata (Harlan) usando cebadores que delineaban el fragmento que contenía los nucleótidos 15-1177 (Genbank Acc. M32397) y que añadía un sitio de restricción Xho I exógeno en el extremo 5' y sitios BamHI y Bln I exógenos en el extremo 3' para facilitar la inserción en el vector pBacPAK8. En ausencia de fusión de GM, el sitio Bln I codifica un codón de parada dentro del marco. El ADNc de GM-CSF de rata maduro se amplificó por PCR a partir de la primera cadena del ADNc hecha a partir de ARNm aislado de esplenocitos de rata estimulados con ConA usando cebadores que delineaban los nucleótidos 1-384 (GenBank Acc. U00620) y añade un sitio BamHI exógeno en el exctremo 5' y un sitio Xba I exógeno en el extremo 3'.
Los plásmidos PAP de rata y PAP de rata-GM-CSF de rata se mezclaron cada uno con plásmido de genoma vírico BV linearizado y las mezclas se transfectaron en células SF21 usando lipofectina como se suministra en un kit de transfección de BV recombinante (Clonotech). Seis días después de la transfección, se recogieron los líquidos sobrenadantes de los cultivos y se valoraron las monocapas de Sf21 bajo la agarosa para formar placas víricas. Cuatro días más tarde las células se tiñeron con rojo neutro y se cogieron las placas víricas candidatas y se expandieron en células Sf21 para seleccionar el BV recombinante usando la actividad enzimática de PAP como lectura. Se eligieron clones de BV PAP^{+} y se expandieron en cultivos en suspensión a gran escala de SF21 para reservas víricas y posteriormente para la producción de proteínas usando medio Sf900 II sin proteínas (Gibco/BRL).
Todas las proteínas presentaban actividad enzimática de PAP como se mostraba por la hidrólisis del PNPP, el sustrato enzimático usado en un ensayo estándar de fosfatasa ácida, en el caso de las proteínas de fusión GM-CSF, bioactividad de GM-CSF como se mostraba por el bioensayo en células GM-NFS-60. Se determinó la bioactividad de GM-CSF de un ejemplo representativo de proteína de fusión, PAP de rata-GM-CSF de rata (figura 9) en un ensayo de proliferación de células de rata con GM-CSF llevado a cabo usando la línea celular dependiente de GM-CSF, GM-NFS-60. Se cultivaron en placa 5000 células por pocillo en 200 \mul de medio con las cantidades indicadas de citocina. La proliferación se determinó pulsando con [^{3}H]timidina 1 \muCi por pocillo durante las 4 h finales de un ensayo de 48 h. Se diluyeron con líquidos sobrenadantes de cultivo de baculovirus brutos o con GM-CSF de ratón recombinante (rmGM) 10 ng/ml disponible en el comercio, y se añadieron a las células cultivadas como se ha indicado, y se midió la proliferación.
La PAP de rata se expresó como una proteína de fusión con una cola de 6 restos histidina (PAP de rata(His_{6})) unida a su extremo C. Se purificó por cromatografía de afinidad de quelato metálico (columnas Ni-NTA), de acuerdo con los procedimientos estándar. Una purificación típica daba como resultado >90% de proteína recombinante pura. La purificación de PAP de rata-GM-CSF de rata se realizó por una combinación de cromatografía de intercambio iónico/interacción hidrófoba. Este procedimiento típicamente da >50% de pureza de PAP de rata-GM-CSF.
B. Inmunización de animales
Se usaron ratas macho engendradas por endogamia en todos los estudios que se diseñaron para abordar la inmunogenicidad de PAP de rata in vivo. El objetivo de dichos estudios era determinar si podría determinar la inmunidad frente al PAP de rata autoantígeno.
Se inmunizaron ratas macho normales de 8 semanas de edad (Wistar o COP) con PAP en CFA (aproximadamente 200 \mug) o con proteína de fusión PAP-GM-CSF (200 \mug). Tras concluir la inmunización, las ratas se mataron por eutanasia y se examinaron las próstatas desde el punto de vista histológico. Un grupo adicional de ratas se trató con células dendríticas pulsadas con PAP de rata-GM-CSF de rata. Se aislaron las células dendríticas de los bazos de las rata como se indica en la figura 10, se pulsaron toda la noche con PAP de rata-GM-CSF de rata que se había purificado del líquido sobrenadante del cultivo de baculovirus por una combinación de cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de intercambio aniónico. Se volvieron a inyectar las células (5-10 x 10^{6} células/rata) en hospedantes singénicos. Dos semanas después de la tercera inmunización, los animales se sacrificaron y un veterinario especialista en histopatología analizó la próstata, cerebro, pulmones, corazón, hígado, riñón y colon, y los comparó con tejidos de animales control que no se habían inmunizado.
El fenotipo de las células dendríticas de rata se determinó usando citometría de flujo. Para determinar su capacidad de presentación de antígeno, las células se usaron como estimuladores en una reacción mixta con linfocitos alogénicos y se comparó su capacidad aloestimuladora con esplenocitos totales y con esplenocitos adherentes. El intervalo típico de la pureza de las células dendríticas obtenidas por este procedimiento en general es entre 30% y 80%. Se analizó la capacidad presentadora de antígeno de las células dendríticas de las ratas usándolas como estimuladores en una reacción mixta con linfocitos alogénicos con esplenocitos de rata SD como respondedores. Su capacidad aloestimuladora se comparó con los esplenocitos totales y con esplenocitos adherentes de cepas tanto COP como SD.
Los esplenocitos de SD no se estimularon con esplenocitos de SD singénicos, esplenocitos adherentes o células dendríticas. Cuando se usan estimuladores de COP alogénicos, la fracción de células dendríticas estimula varios órdenes de magnitud más fuerte que las células del bazo o células del bazo adherentes de las ratas COP.
Histopatología de ratas inmunizadas. El estudio histopatológico lo llevó a cabo un veterinario especialista en histopatología de acuerdo con procedimientos estándar. Se vigiló en los animales los cambios histopatológicos de la próstata, cerebro, pulmones, corazón, hígado, riñón y colon, como se resume en la Tabla 1. Ninguno de los órganos de los animales de control (1C, 2C, 3C, 4C) mostró cambios significativos. Ninguno de los órganos salvo las próstatas en los animales tratados mostró cambios significativos. Todos los animales tratados con células dendríticas pulsadas con PAP de rata-GM-CSF de rata padecían prostatitis intersticial. La intensidad variaba: un animal (7T) tenía lesiones de grado 1 (= trazas), dos animales (6T, 8T) tenían lesiones de grado dos (= leve) y un animal (5T) tenía lesiones de grado 3 (= moderado). Los animales que se inmunizaron con PAP de rata en CFA (1CFA, 2CFA) no mostraron ninguna histopatología de la próstata. Los animales que se inmunizaron con proteína PAP de rata-GM-CSF (1 PAP GM, 2 PAP GM) tenían una prostatitis linfocítica intersticial de grado 1.
Ejemplo 7 Construcción y expresión de proteínas de fusión p53-GM CSF
Se clonó el gen supresor de tumores celulares p53 de acuerdo con las secuencias conocidas públicamente (base de datos de Genbank, salida 91, entrada HSPS3) mediante la reacción en cadena de la polimerasa con el cebador homosentido CgCggATCCTCACTgCCATggAggAgC y el cebador antisentido CTAgTCTAgACTCTgAgTCAggCCCTTCTg
TC que incluye un sitio XBA I que codifica un conector de serina-arginina. Se clonó GM-CSF como se describe en el Ejemplo 1, excepto que se usaron los cebadores CTAgTCTAgATCTgCACCCgCCCgCTCgCCC (homosentido) y CCggAATTCTCAgTgATggTgATggTgATgCgATCCTCTCATCTCCTggACTggCTCCCAgC (antisentido). El cebador antisentido codifica la secuencia MetArgGlySerHisHisHisHisHisHis que está unida al extremo C de GM-CSF y se puede usar para detección y para la purificación por cromatografía de afinidad de quelato metálico de la proteína de fusión. Las secuencias resultantes se muestran en las figuras 11 y 12. El vector de transferencia de baculovirus recombinante y el baculovirus recombinante se generaron como se ha descrito en el Ejemplo 1. Cuando se expresaba en células de insecto SF21 como se detalla en el Ejemplo 1, este baculovirus produce la proteína de fusión p53-GM-CSF que se usa para generar inmunidad anti-p53 como se describe para la inducción de la inmunidad anti-PAP por PAP-GM-CSF en los ejemplos 3, 4 y 6. La secuencia del gen de fusión recombinante se muestra en la figura 11. La secuencia del polipéptido producido p53-PAP-GM-CSF se muestra en la figura 12.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: ACTIVATED CELL THERAPY, INC.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composición y procedimiento inmunoestimuladores
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Dehlinger & Associates
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: P.O. Box 60850
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Palo Alto
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO: 94306
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECUTRA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/20241
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-DIC-1996
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/579.823
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-DIC-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Stratford, Carol A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 34.444
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7636-0010.41
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 415-324-0880
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 415-324-0960
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1588 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO PARTICULAR: gen de fusión de fosfatasa ácida prostática-GM-CSF; Fig. 1
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
BIBLIOTECA: carcinoma de próstata LnCaP.FGC; PBMC
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPICIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 515 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO PARTICULAR: proteína de fusión de fosfatasa ácida prostática-GM-CSF; Fig. 1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPICIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2385 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO PARTICULAR: gen de fusión de GM-CSF-HER-2; Fig. 8
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPICIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
5
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 782 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO PARTICULAR: proteína de fusión de GM-CSF-Her-2; Fig. 8
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPICIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:
8
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO PARTICULAR: cebador oligonucleótido sintético para PAP
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPICIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGCTCTCCT CAACATGAGA GC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO PARTICULAR: cebador oligonucleótido sintético para PAP humano
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPICIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACAGGATCC ATCTGTACTG TCCTCAGTAC C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO PARTICULAR: cebador oligonucleótido sintético para GM-CSF humano
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPICIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACTGGATCC GCACCCGCCC GCTCGCCC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO PARTICULAR: cebador oligonucleótido sintético para GM-CSF humano
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPICIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCTCTAGA GCTTGGCCAG CCTCATCTGG 
\hfill
30

Claims (22)

1. Una composición terapéutica, que comprende una célula presentadora de antígeno potente aislada, en la que dicha célula se estimula por exposición in vitro a un complejo polipeptídico soluble aislado que comprende una proteína de unión a células dendríticas que es el factor estimulador de la colonia de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) unida covalentemente a un antígeno polipeptídico,
dicho antígeno polipeptídico se selecciona del grupo constituido por
un antígeno tumoral específico de tejido y dicho antígeno tumoral específico de tejido se caracteriza porque (i) incluye antígenos que son comunes a un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que sólo son específicos para un tumor individual, y
un producto oncogénico, seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53,
en la que dicha composición es eficaz para activar las células T para producir una respuesta inmunitaria celular multivalente contra dicho antígeno polipeptídico, a un nivel de activación de células T mayor que el producido por tal célula presentadora de antígeno potente estimulada por dicho antígeno solo.
2. La composición terapéutica de la reivindicación 1, en la que el antígeno polipeptídico es el antígeno tumoral específico de tejido fosfatasa ácida prostática.
3. La composición terapéutica de la reivindicación 1 ó 2, en la que el complejo polipeptídico comprende además, entre dicha proteína de unión a células dendríticas y dicho antígeno polipeptídico, un péptido conector.
4. La composición terapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la célula presentadora de antígenos potente es una célula dendrítica activada.
5. Un procedimiento para activar una célula presentadora de antígeno aislada in vitro, que comprende poner en contacto dicha célula presentadora de antígeno aislada con un complejo polipeptídico que comprende una proteína de unión a células dendríticas que es el GM-CSF covalentemente unida a un antígeno polipeptídico seleccionado del grupo constituido por
un antígeno tumoral específico de tejido, estando dicho antígeno tumoral específico de tejido caracterizado porque (i) incluye antígenos que son comunes a un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que sólo son específicos para un tumor individual, y
un producto oncogénico, seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53, en el que dicha célula presentadora de antígeno activada es eficaz para activar una célula T para producir una respuesta inmunitaria celular multivalente que es mayor que la producida por células presentadores de antígeno en contacto con el antígeno polipeptídico seleccionado solo.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho antígeno polipeptídico es el antígeno tumoral específico de tejido fosfatasa ácida prostática.
7. El procedimiento de la reivindicación 5 ó 6, en el que el complejo polipeptídico es una proteína de fusión, obtenible por traducción de una región codificadora de nucleótidos continua.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que dicha célula presentadora de antígeno aislada es una célula dendrítica.
9. Uso de una célula presentadora de antígeno para preparar una composición farmacéutica para inducir una respuesta de células T citotóxicas en un sujeto mamífero para tratar un tumor en el mismo, en el que la célula presentadora de antígeno se ha puesto en contracto in vitro con un complejo polipetídico que comprende una proteína de unión a células dendríticas que es GM-CSF, unida covalentemente a un antígeno polipeptídico seleccionado del grupo constituido por un antígeno tumoral específico de tejido, estando dicho antígeno tumoral específico de tejido caracterizado porque (i) incluye antígenos que son comunes a un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que sólo son específicos para un tumor individual, y un producto oncogénico, seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53, durante un periodo de tiempo eficaz para activar dicha célula presentadora de antígeno.
10. El uso de la reivindicación 9, en el que dicha célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica.
11. Un polipéptido inmunoestimulador, que comprende un antígeno tumoral específico de tejido aislado unido covalentemente a una proteína de unión a células dendríticas que es GM-CSF, en el que el antígeno tumoral específico de tejido incluye antígenos que son comunes para un tipo de tumor específico y excluye antígenos que son específicos solo para un tumor individual.
12. El polipéptido de la reivindicación 11, en el que dicho antígeno tumoral específico de tejido es fosfatasa ácida prostática.
13. El polipéptido de la reivindicación 11 ó 12, en el que el polipéptido es una proteína de fusión, obtenible por traducción de una región codificadora de nucleótidos continua.
14. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que además incluye entre dicha proteína de unión a células dendríticas y dicho antígeno tumoral específico de tejido, un péptido conector.
15. Un polipéptido inmunoestimulador que comprende un producto oncogénico aislado seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53 unido covalentemente a una proteína de unión a células dendríticas que es GM-CSF.
16. El polipéptido de la reivindicación 14 ó 15, en el que el polipéptido es una proteína de fusión, obtenible por traducción de una región codificadora de nucleótidos continua.
17. El polipéptido de la reivindicación 15 ó 16, que además incluye, entre dicha proteína de unión a células dendríticas y dicho antígeno de producto oncogénico, un péptido conector.
18. Un vector de expresión para producir una proteína de fusión inmunoestimuladora, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un complejo polipeptídico que comprende una proteína de unión a células dendríticas que es GM-CSF y un antígeno polipeptídico seleccionado del grupo constituido por un producto oncogénico seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53, y un antígeno tumoral específico de tejido, dicho antígeno tumoral específico de tejido caracterizado porque (i) incluye antígenos que son comunes a un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que sólo son específicos para un tumor individual, dicha molécula de ácido nucleico está insertada en un vector de expresión, en el que dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor seleccionado capaz de iniciar la transcripción en una célula hospedante seleccionada.
19. El vector de expresión de la reivindicación 18, en el que dicho antígeno polipeptídico es el antígeno tumoral específico de tejido fosfatasa ácida prostática.
20. Una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada que codifica una proteína de fusión que comprende GM-CSF y fosfatasa ácida prostática.
21. Una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada que codifica una proteína de fusión que comprende GM-CSF y Her-2.
22. Un sistema de expresión para producir una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a células dendríticas que es GM-CSF, unida covalentemente a un antígeno polipeptídico seleccionado del grupo constituido por
un producto oncogénico, seleccionado del grupo constituido por Her-2, p21RAS y p53, y
un antígeno tumoral específico de tejido, dicho antígeno tumoral específico de tejido caracterizado porque (i) incluye antígenos que son comunes a un tipo específico de tumor, y (ii) excluye antígenos que sólo son específicos para un tumor individual, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de unión a células dendríticas que es GM-CSF,
una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno polipeptídico, cada una de dichas secuencias de ácido nucleico insertadas en un vector de expresión, en el que dichas secuencias de ácido nucleico están unidas operativamente a un promotor capaz de iniciar la transcripción en una célula hospedante seleccionada, y
dicho vector de expresión se lleva dentro de la célula hospedante.
ES96944879T 1995-12-28 1996-12-23 Composicion inmunoestimuladora y procedimiento. Expired - Lifetime ES2281087T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/579,823 US6080409A (en) 1995-12-28 1995-12-28 Immunostimulatory method
US579823 1995-12-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2281087T3 true ES2281087T3 (es) 2007-09-16

Family

ID=24318489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES96944879T Expired - Lifetime ES2281087T3 (es) 1995-12-28 1996-12-23 Composicion inmunoestimuladora y procedimiento.

Country Status (12)

Country Link
US (3) US6080409A (es)
EP (1) EP0870022B1 (es)
JP (1) JP3908277B2 (es)
AT (1) ATE353363T1 (es)
AU (1) AU716783B2 (es)
CA (1) CA2241373C (es)
DE (1) DE69636891T2 (es)
DK (1) DK0870022T3 (es)
ES (1) ES2281087T3 (es)
NZ (2) NZ326092A (es)
PT (1) PT870022E (es)
WO (1) WO1997024438A1 (es)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020187131A1 (en) * 1995-01-31 2002-12-12 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
US20040258688A1 (en) * 1995-01-31 2004-12-23 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
US20080286228A1 (en) * 1995-10-20 2008-11-20 Tarantolo Stefano R Compositions and methods for enhancing immune responses mediated by antigen-presenting cells
DE69637571D1 (de) * 1995-10-20 2008-08-07 Univ Nebraska Zusammensetzung und verfahren zur verstärkung der immunantwort antigen-präsentierender zellen
US6096313A (en) * 1996-02-09 2000-08-01 Ludwig Institute For Cancer Research Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant
US6942862B2 (en) * 1996-04-01 2005-09-13 University Of Washington Methods and compositions to generate immunity in humans against self tumor antigens by immunization with homologous foreign proteins
EP0961824A4 (en) * 1996-07-10 2003-01-29 Immunex Corp METHOD FOR ACTIVATING DENTRITIC CELLS
DE69840326D1 (de) * 1997-03-27 2009-01-22 Csl Ltd Steigerung der immunantwort unter verwendung von zielgerichteten molekülen
US6642013B1 (en) * 1997-08-21 2003-11-04 The University Of Arkansas For Medical Sciences Extracellular serine protease
US7157084B2 (en) * 1997-08-21 2007-01-02 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas System Extracellular serine protease
US6872518B2 (en) 1997-09-22 2005-03-29 University Of Rochester Methods for selecting polynucleotides encoding T cell epitopes
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US6849452B1 (en) * 1998-03-03 2005-02-01 Institut Gustave Roussy Methods for activating natural killer (NK) cells and means for carrying out said methods
US7402307B2 (en) * 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
EP1068296B1 (en) 1998-03-31 2011-08-10 Geron Corporation Compositions for eliciting an immune response to a telomerase antigen
ES2267263T3 (es) * 1998-04-15 2007-03-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Coadministracion de un inhibidor de la angiogenesis para reforzar la respuesta inmunologica por medio de la mediacion de una proteina de fusion de una citoquina con un anticuerpo.
EP1104456A1 (en) * 1998-08-10 2001-06-06 Chiron Corporation Engineered antigen-presenting cells expressing an array of antigens and uses thereof
US7351546B2 (en) 1998-09-22 2008-04-01 Becton, Dickinson And Company Flow cytometric, whole blood dendritic cell immune function assay
US6495333B1 (en) 1998-09-22 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Flow cytometric, whole blood dendritic cell immune function assay
ATE407206T1 (de) * 1998-11-10 2008-09-15 Univ Rochester Methoden zu herstellung von genbanken
US7198920B1 (en) 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
CA2367692A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
MXPA02001417A (es) * 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
HUP0204475A2 (en) 2000-02-11 2003-04-28 Merck Patent Gmbh Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US7541184B2 (en) * 2000-02-24 2009-06-02 Invitrogen Corporation Activation and expansion of cells
JP2003523398A (ja) 2000-02-24 2003-08-05 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 樹状細胞のインビボ活性化によるアジュバント治療
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
EP1268763A2 (en) 2000-03-28 2003-01-02 University Of Rochester Methods of producing a library and methods of selecting polynucleotides
ATE507295T1 (de) 2000-03-30 2011-05-15 Dendreon Corp Zusammensetzungen und verfahren für eine auf dendritischen zellen basierende immuntherapie
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7560534B2 (en) 2000-05-08 2009-07-14 Celldex Research Corporation Molecular conjugates comprising human monoclonal antibodies to dendritic cells
KR100881471B1 (ko) * 2000-05-08 2009-02-05 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체
KR20030064275A (ko) * 2000-06-29 2003-07-31 메르크 파텐트 게엠베하 면역싸이토카인 흡수 증강제와의 조합 치료에 의한항체-싸이토카인 융합 단백질 매개 면역 반응 증강
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
US6911204B2 (en) 2000-08-11 2005-06-28 Favrille, Inc. Method and composition for altering a B cell mediated pathology
HK1052314A1 (zh) * 2000-08-11 2003-09-11 Favrille, Inc. 改变t细胞介导的病理的方法和组合物
US6892140B1 (en) * 2000-11-27 2005-05-10 Enteron, Inc. Immunogenic cancer peptides and uses thereof
RU2003129528A (ru) * 2001-03-07 2005-04-10 Мерк Патент ГмбХ (DE) Способ экспрессии белков, содержащих в качестве компонента гибридный изотип антитела
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
US20020193295A1 (en) * 2001-05-04 2002-12-19 Emanuel Calenoff Immunogenic peptides and uses thereof
US20030082806A1 (en) * 2001-04-27 2003-05-01 Xcyte Therapies, Inc. Maturation of antigen-presenting cells using activated T cells
EP1383785B1 (en) 2001-05-03 2011-03-16 Merck Patent GmbH Recombinant tumor specific antibody and use thereof
AU2002341717A1 (en) * 2001-09-17 2003-04-01 Medcell Biologics, Llc. Cell therapy system
DK1454138T3 (da) * 2001-12-04 2012-02-13 Merck Patent Gmbh Immunocytokiner med moduleret selektivitet
US7413869B2 (en) * 2002-04-05 2008-08-19 Dendreon Corporation Method for determining potency of antigenic presenting cell based vaccines
WO2003087338A2 (en) * 2002-04-11 2003-10-23 Amgen, Inc. Her-2 receptor tyrosine kinase molecules and uses thereof
US20060292618A1 (en) * 2002-04-12 2006-12-28 Mellor Andrew L Antigen-presenting cell populations and their use as reagents for enhancing or reducing immune tolerance
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
ATE509025T1 (de) * 2002-06-12 2011-05-15 Gavish Galilee Bio Appl Ltd ßMIT MHC-KLASSE-I-PEPTIDEPITOPEN KOVALENT VERKN PFTES MEMBRANVERANKERTES BETA2-MIKROGLOBULINß
US20080286312A1 (en) * 2002-06-12 2008-11-20 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd. Membrane-anchored beta2 microglobulincovalently linked to MHC class I peptide epitopes
US20040048258A1 (en) * 2002-09-10 2004-03-11 Windber Research Institute Multiple-gene diagnostic probes and assay kits and method for the assessment of multiple markers for breast cancer prognosis
AU2003267088A1 (en) * 2002-09-11 2004-04-30 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Chemokine receptor antagonists as therapeutic agents
EP1540627A4 (en) * 2002-09-20 2006-08-16 Dendreon Corp IMMUNOTHERAPEUTIC COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING MULTIPLE TO DIFFERENTIATED CANCER
US7179797B2 (en) * 2002-09-27 2007-02-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and compositions for treating prostate cancer using DNA vaccines
WO2004055056A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
US20040142328A1 (en) * 2003-01-06 2004-07-22 Windber Research Institute Method and cloning vector for preparing multiple-gene diagnostic probes for the assessment of multiple markers for breast cancer prognosis
ATE552860T1 (de) * 2003-01-31 2012-04-15 Celldex Res Corp Antikörper-vakzine-konjugate und ihre verwendungen
US9259459B2 (en) * 2003-01-31 2016-02-16 Celldex Therapeutics Inc. Antibody vaccine conjugates and uses therefor
US20060134067A1 (en) * 2003-02-18 2006-06-22 Maxcyte, Inc. Loading of cells with antigens by electroporation
EP1601684B1 (en) 2003-03-05 2014-10-15 Dendreon Corporation Alternative reading frame polypeptides for treatment
US7763452B2 (en) 2003-06-25 2010-07-27 Bn Immunotherapeutics, Inc. Purification of HER-2 variants
EP2090586A1 (en) * 2003-06-25 2009-08-19 BN ImmunoTherapeutics, Inc. Purification of her-2 variants
US20050201992A1 (en) * 2004-03-15 2005-09-15 Moviglia Gustavo A. Tumor/B-cell hybrid cells and uses thereof
FR2868781B1 (fr) * 2004-04-13 2008-02-22 Immutep Composition de vaccin comprenant un ligand cmh de classe ii couple a un antigene, procede de preparation et utilisations
CA2504451A1 (en) * 2004-08-10 2006-02-10 Geron Corporation Dendritic cell vaccines for treating cancer made from embryonic stem cells
WO2006079169A1 (en) * 2005-01-25 2006-08-03 Apollo Life Sciences Limited Parameter selected gm-csf, il-3, il-4, il-5 and chimeras thereof for therapeutic and diagnostic purposes
EP1888105A2 (en) * 2005-05-12 2008-02-20 Introgen Therapeutics, Inc. P53 vaccines for the treatment of cancers
KR100647847B1 (ko) * 2005-05-27 2006-11-23 크레아젠 주식회사 인간 전립선암 동물모델 및 이를 이용한 수지상세포-유래전립선암 면역치료제의 예방 및 치료 효능을 분석하는 방법
US7838503B2 (en) * 2005-06-15 2010-11-23 Children's Medical Center Corporation Methods for extending the replicative lifespan of cells
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
EP1951281B1 (en) * 2005-10-17 2015-04-15 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Wt1 hla class ii-binding peptides and compositions and methods comprising same
ATE461216T1 (de) * 2006-01-25 2010-04-15 Viro Pharmaceuticals Gmbh & Co Humaner verstärker der viralen infektion (sevi) und seine anwendung
US8361479B2 (en) * 2006-08-11 2013-01-29 Dendreon Corporation Promiscuous PAP CD4 T cell epitopes
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
JP5543207B2 (ja) * 2006-10-04 2014-07-09 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 不活性化された人工抗原提示細胞の調製および細胞治療におけるそれらの使用
CA2682661C (en) * 2007-03-22 2017-03-14 Dendreon Corporation Methods for inducing a natural killer (nk) cell-mediated immune response and for increasing nk cell activity
CN101888856B (zh) 2007-11-07 2014-08-27 塞尔德克斯医疗公司 结合人树突和上皮细胞205(dec-205)的抗体
US8666674B2 (en) * 2009-07-28 2014-03-04 Promising Future, Llc Pairing processes for preparing reactive cytotoxic T cells
WO2013122178A1 (ja) * 2012-02-16 2013-08-22 国立大学法人岡山大学 融合タンパク質を含む癌治療用医薬組成物
WO2014087217A1 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Subhadra Dravida Allogenic mesendritic vector for ovarian cancer
US20160220649A1 (en) 2013-09-13 2016-08-04 Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud Combinations of aggregating proteins and molecular chaperone proteins for the treatment of proteinopathies or conformational diseases
WO2016145578A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Syz Cell Therapy Co. Methods of cancer treatment using activated t cells
IL256522B2 (en) * 2015-06-30 2024-10-01 Northwest Biotherapeutics Inc Optimally activated dendritic cells that result in an enhanced or enhanced antitumor immune response
US20170107580A1 (en) 2015-10-15 2017-04-20 Dendreon Pharmaceuticals, Inc. Gene expression markers for predicting overall survival in subjects treated with sipuleucel-t
EP3173098A1 (en) 2015-11-27 2017-05-31 Assistance Publique-Hopitaux De Paris Immunostimulatory compositions
US10130658B2 (en) 2015-12-18 2018-11-20 Provectus Pharmatech, Inc. Method of ex vivo enhancement of immune cell activity for cancer immunotherapy with a small molecule ablative compound
CN105647970A (zh) * 2016-02-22 2016-06-08 河北利同康生物科技有限公司 前列腺癌特异性pap-gm-csf-il-6基因重组融合蛋白及其制备方法
CN110079539B (zh) * 2018-01-25 2022-07-01 上海惠盾因泰生物科技有限公司 前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激因子制备方法
WO2019183924A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Syz Cell Therapy Co. Improved multiple antigen specific cell therapy methods
US20220088183A1 (en) * 2018-08-31 2022-03-24 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Chimeric oncolytic herpesvirus that stimulates an antitumor immune response
KR20210053923A (ko) * 2018-08-31 2021-05-12 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 항종양 면역 반응을 자극하는 키메라 종양 용해성 허피스바이러스
CN110358735B (zh) * 2019-06-24 2021-09-21 广州安捷生物医学技术有限公司 一种ctl细胞的制备方法及应用
EP3868401A1 (en) 2020-02-21 2021-08-25 Assistance Publique Hôpitaux de Paris Optimization of peptide-melanin binding
EP4200427A1 (en) 2020-10-15 2023-06-28 Aavocyte, Inc. Recombinant adeno-associated virus vectors with cd14 promoter and use thereof
WO2022174052A1 (en) * 2021-02-12 2022-08-18 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Consensus prostate antigens, nucleic acid molecules encoding the same, and vaccines and uses comprising the same
EP4382121A1 (en) 2022-12-07 2024-06-12 Altevax Vaccines against ptprz1-positive tumors
EP4420677A1 (en) 2023-02-22 2024-08-28 Altevax Vaccines against tert-positive tumors

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5078996A (en) * 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5194254A (en) * 1986-05-06 1993-03-16 Connaught Laboratories Limited Enhancement of antigen immunogenicity
US5019384A (en) * 1986-06-30 1991-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Immunonodulating compositions and their use
US4861589A (en) * 1987-03-23 1989-08-29 Trustees Of Boston University Method for therapeutically treating abnormal cells expressing a major histocompatibility complex class II antigen using cytolytic inducer T4 cells
GB8722741D0 (en) * 1987-09-28 1987-11-04 Hoffmann La Roche Induction of cytotoxic t cell response
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
EP0406857B1 (en) * 1989-07-07 1995-05-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteins and production thereof
KR920703114A (ko) * 1989-07-14 1992-12-17 원본미기재 접합체 백신을 위한 시토킨 및 호르몬 운반체
US20030072751A1 (en) * 1990-03-14 2003-04-17 Heribert Bohlen Idiotypic vaccination against b cell lymphoma
AU687733B2 (en) * 1992-04-01 1998-03-05 Rockefeller University, The Method for in vitro proliferation of dendritic cell precursors and their use to produce immunogens
DE69333433T2 (de) * 1992-04-01 2004-12-02 The Rockefeller University Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung
US5633234A (en) * 1993-01-22 1997-05-27 The Johns Hopkins University Lysosomal targeting of immunogens
EP0692973A1 (en) * 1993-03-15 1996-01-24 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Peptide coated dendritic cells as immunogens
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
US5820866A (en) * 1994-03-04 1998-10-13 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for T cell regulation
PT765386E (pt) * 1994-06-14 2015-02-06 Univ Leland Stanford Junior Processos para a activação in vivo de células t, através de células dendríticas pulsadas com antigénio
WO1996001903A1 (en) * 1994-07-07 1996-01-25 Immunex Corporation Fusion proteins comprising gm-csf and antigens and their expression in yeast
GB9501079D0 (en) * 1995-01-19 1995-03-08 Bioinvent Int Ab Activation of T-cells
WO1996037107A1 (en) * 1995-05-23 1996-11-28 The Scripps Research Institute Antigen-specific activation of unprimed cd8+ t cells

Also Published As

Publication number Publication date
CA2241373C (en) 2013-04-09
AU1338097A (en) 1997-07-28
US6080409A (en) 2000-06-27
DK0870022T3 (da) 2007-05-21
DE69636891D1 (de) 2007-03-22
US6210662B1 (en) 2001-04-03
EP0870022A1 (en) 1998-10-14
WO1997024438A1 (en) 1997-07-10
PT870022E (pt) 2007-04-30
JP3908277B2 (ja) 2007-04-25
NZ500665A (en) 2005-06-24
US5976546A (en) 1999-11-02
NZ326092A (en) 1999-11-29
JP2000502567A (ja) 2000-03-07
ATE353363T1 (de) 2007-02-15
AU716783B2 (en) 2000-03-09
DE69636891T2 (de) 2007-12-06
CA2241373A1 (en) 1997-07-10
EP0870022B1 (en) 2007-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2281087T3 (es) Composicion inmunoestimuladora y procedimiento.
US5633234A (en) Lysosomal targeting of immunogens
AU767149B2 (en) FLT3-L mutants and methods of use
US7414108B2 (en) Composition and method for producing an immune response against tumor-related antigens
ES2693213T3 (es) Epítopos agonistas de HLA-A24 de oncoproteína MUC1-C y composiciones y métodos de uso
EP2626081B1 (en) Immunogenic control of tumours and tumour cells
JPH08507921A (ja) 癌ワクチンの調製方法
Tang et al. Multistep process through which adenoviral vector vaccine overcomes anergy to tumor-associated antigens
CA2529058A1 (en) Increased t-cell tumor infiltration by mutant light
ES2343419T3 (es) Vacuna quimiocina antigenica recombinante.
US20060093553A1 (en) Cd26-based therapies for cancers and immune disease
ES2315011T3 (es) Polipeptidos de semaforina.
AU4439202A (en) Composition and method for inducing and immune response against tumor-related antigens