ES2281143T3

ES2281143T3 - Metodo para la medida no invasiva de un analito.

Info

Publication number: ES2281143T3
Application number: ES98957859T
Authority: ES
Inventors: Joseph Chaiken; Charles M. Peterson
Original assignee: LighTouch Medical Inc
Current assignee: LighTouch Medical Inc
Priority date: 1997-11-12
Filing date: 1998-11-12
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2018-11-12
Also published as: JP4369616B2; AU1401599A; EP1037553B1; CA2305366A1; EP1037553A1; DE69836979T2; US6377828B1; WO1999023939A1; DE69836979D1; JP2001522625A; CA2305366C; ATE352252T1; US6044285A

Abstract

Un método para medir un analito en un tejido de un sujeto que comprende: (a) poner en contacto el tejido con radiación electromagnética que tiene una primera longitud de onda de excitación, tanto en presencia como en ausencia de radiación electromagnética que tiene una segunda longitud de onda de excitación, donde la primera longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción de una sonda de temperatura dentro del tejido capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman y la segunda longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción del analito capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman, y donde la sonda de temperatura y el analito están suficientemente próximos entre sí como para que la energía depositada en uno por absorción de radiación se transfiera al otro; (b) recoger los espectros Raman emitidos por el tejido; y (c) analizar los espectros recogidos comparando los espectrosRaman emitidos por la sonda de temperatura en respuesta a la primera longitud de onda de excitación en presencia y en ausencia de la segunda longitud de onda de excitación para determinar la concentración de analito presente en el tejido.

Description

Método para la medida no invasiva de un analito.

La invención se refiere a un método y a un aparato para medir un analito en la sangre y en otros tejidos. El método emplea espectroscopía Raman donde una sonda de temperatura dentro del tejido se excita con radiación electromagnética. El método mejora la información espectral en relación con la concentración del analito.

Desde hace mucho tiempo ha habido un interés considerable en la monitorización no invasiva de la química corporal. Hay 16 millones de americanos diabéticos y todos ellos podrían beneficiarse de un método no invasivo de medición de los niveles de glucosa en sangre. Usando los métodos aceptados actualmente para medir los niveles de glucosa en sangre, muchos diabéticos tienen que pincharse para extraer sangre de cinco a siete veces al día para controlar de manera adecuada sus necesidades de insulina. Con una medición no invasiva de la glucosa sanguínea podría realizarse un control más preciso y podrían minimizarse los daños continuados, la discapacidad y los costes causados por la diabetes.

La oximetría de la sangre es un ejemplo de una aplicación de espectroscopía de absorción electrónica al control no invasivo del equilibrio entre la sangre oxigenada y desoxigenada (Patente de Estados Unidos Nº 5.615.673, expedida el 1 de abril de 1997). De manera similar, la espectroscopía vibracional es un modo fiable de análisis cuantitativo y cualitativo ex vivo para mezclas complejas, y existen informes de aplicaciones in vitro de este método a analitos interesantes desde el punto de vista metabólico (S.Y. Wang et al., 1993, Analysis of metabolites in aqueous solution by using laser Raman spectroscopy, Applied Optics 32(6): 925-929; A. J. Berger et al., 1996, Rapid, noninvasive concentration measurements of aqueous biological analytes by near-infrared Raman spectroscopy; Applied Optics 35(1): 209-212). Se han aplicado mediciones por infrarrojos, tales como espectroscopía de absorción vibracional, al tejido cutáneo, pero con un éxito limitado por la falta de disponibilidad de fuentes de luz y detectores adecuados a longitudes de onda cruciales, y por el calentamiento del tejido debido a la absorción de la radiación incidente (Patente de Estados Unidos Nº 5.551.422, véase también R. R. Anderson y J. A. Parrish, 1981, The Optics of Human Skin, J. Investigative Dermatology 77(1): 13-19). La Patente de Estados Unidos Nº 5.553.616, expedida el 10 de septiembre de 1996, resume tentativas previas de proporcionar métodos para un control no invasivo de la glucosa sanguínea. La Patente Alemana Nº 19538372 describe un dispositivo para determinar la glucosa sanguínea usando espectroscopía Raman del ojo, y un sistema de enfoque que dirige la espectroscopía al humor acuoso. La Solicitud de Patente de Europea Nº 0587008 describe un inmunoensayo de espectroscopía Raman amplificada por superficies en el que los analitos se combinan con marcadores con actividad Raman en muestras in vitro.

Un aspecto de la invención proporciona un método para medir un analito en un tejido de un sujeto, que comprende:

(a) poner en contacto el tejido con radiación electromagnética que tiene una primera longitud de onda de excitación tanto en presencia como en ausencia de radiación electromagnética que tiene una segunda longitud de onda de excitación, donde la primera longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción de una sonda de temperatura dentro del tejido capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman y la segunda longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción del analito capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman, y donde la sonda de temperatura y el analito están suficientemente próximos entre sí como para que la energía depositada en uno por absorción de radiación se transfiera al otro;

(b) recoger el espectro Raman emitido por el tejido; y

(c) analizar los espectros recogidos comparando el espectro Raman emitido por la sonda de temperatura en respuesta a la primera longitud de onda de excitación en presencia y en ausencia de la segunda longitud de onda de excitación para determinar la concentración de analito presente en el tejido.

En una realización, la concentración de analito se determina de acuerdo con la siguiente relación:

C_{A} = \Delta T / (C_{P}I_{A}\varepsilon_{A}\Delta t);

donde C_{A} es la concentración de analito;

donde \DeltaT es el cambio de temperatura entre la temperatura, en grados Kelvin, asociada con la dispersión Raman emitida por la sonda de temperatura en respuesta a la primera y segunda longitudes de onda de excitación, y la temperatura asociada con la dispersión Raman emitida por la sonda de temperatura en respuesta a la primera longitud de onda de excitación en ausencia de la segunda longitud de onda de excitación;

donde C_{P} es la capacidad calorífica del tejido;

donde I_{A} es la intensidad de la radiación electromagnética de la segunda longitud de onda de excitación;

donde \varepsilon_{A} es el coeficiente de absorción para una molécula de analito;

y donde \Deltat es la duración del contacto con la segunda longitud de onda de excitación.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para medir un analito en un tejido que contiene sangre de un sujeto, que comprende:

(a) poner en contacto el tejido con radiación electromagnética que tiene una primera longitud de onda de excitación mientras el tejido está lleno de sangre y mientras el tejido está vacío de sangre, donde la primera longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción de una sonda de temperatura dentro del tejido capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman, y donde la sonda de temperatura y el analito están suficientemente próximos entre sí como para que la energía depositada en uno por absorción de radiación se transfiera al otro;

(b) recoger el espectro Raman emitido por el tejido; y

(c) analizar los espectros recogidos midiendo los espectros Raman asociados con el analito y determinando la diferencia entre los espectros Raman recogidos en los estados lleno de sangre y vacío de sangre para determinar la concentración de analito presente en el tejido.

Los ejemplos de sondas de temperatura incluyen, pero sin limitación, hemoglobina, carboxi-hemoglobina, mioglobina, melanina y bilirrubina. Los ejemplos de analitos incluyen, pero sin limitación, glucosa, creatinina, piruvato, fármacos, gases sanguíneos y urea.

La invención también proporciona un aparato para medir un analito en un tejido en un sujeto, que comprende:

(a) una primera fuente de luz que emite luz que tiene una primera longitud de onda de excitación que es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción de una sonda de temperatura dentro del tejido capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman;

(b) una segunda fuente de luz que emite luz que tiene una segunda longitud de onda de excitación que es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción del analito capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman;

(c) un detector que se dispone para recibir los espectros Raman dispersados por el tejido en respuesta a la irradiación con la primera y segunda longitudes de onda de excitación y que produce señales de salida representativas de los espectros Raman de dispersión; y

(d) un ordenador acoplado para recibir las señales de salida producidas por el detector que procesa las señales de salida para obtener un valor indicativo de la concentración de analito en el tejido a partir de una comparación de señales de salida representativas de los espectros Raman dispersados en respuesta a la primera y segunda longitudes de onda de excitación.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de bloques que representa una realización de un aparato de la invención.

La Figura 2 es un diagrama de bloques que representa una segunda realización de un aparato de la invención.

Descripción detallada

La invención descrita en el presente documento proporciona un método y un aparato para medir un analito en sangre u otro tejido de un sujeto. El método puede realizarse de forma no invasiva, y proporciona una mejor relación entre señal e interferencias que las técnicas no invasivas disponibles actualmente. La relación entre señal e interferencias se mejora por técnicas que aumentan la señal, reducen las interferencias, reducen el efecto de fondo y/o desenredan la congestión espectral. El método consigue una mejor relación entre señal e interferencias usando espectroscopía Raman y seleccionando longitudes de onda incidentes que excitan a las sondas de temperatura presentes en los tejidos del cuerpo. Una sonda de temperatura es un componente que está suficientemente próximo a un analito de interés como para que la energía depositada en la sonda de temperatura o en el analito por absorción de radiación se transfiera al otro.

En una realización, la excitación de la sonda de temperatura se usa para conseguir un aumento de resonancia del espectro Raman de la sonda de temperatura, lo cual hace que la señal Raman sea más detectable que la fluorescencia de fondo. En esta realización, la dispersión Raman producida por la sonda de temperatura en respuesta a una longitud de onda de excitación que se absorbe por la sonda de temperatura se mide con y sin excitación coincidente con una longitud de onda que se absorbe por el analito. El cambio en la dispersión Raman creada excitando el analito indica la cantidad de analito presente en el tejido.

En otra realización, la interferencia de la fluorescencia de fondo se reduce aumentando el componente anti-Stokes del espectro Raman del analito. En esta realización, la dispersión Raman producida por el analito se analiza después de la excitación con una longitud de onda que se absorbe por la sonda de temperatura. La excitación de la sonda de temperatura induce un aumento de temperatura que amplifica el componente anti-Stokes del espectro Raman del analito.

Dispersión Raman es la expresión aplicada al fenómeno por el que la luz que se dispersa desde una muestra de materia cambia en longitud de onda con respecto a la longitud de onda incidente. La cantidad de cambio de longitud de onda depende de los movimientos vibracionales que puede experimentar la materia y esto proporciona una medición sensible de la estructura molecular. Cuando se elige una luz incidente para que coincida con una longitud de onda que absorben las moléculas de interés, se produce dispersión de resonancia Raman. La interacción entre la radiación incidente y la molécula se intensifica en tal medida que el grado de dispersión Raman es de mil a un millón de veces mayor que si se elige una luz incidente que no coincida con una absorción molecular. Esto significa que cuando se dirige luz azul-verde sobre una muestra de material que contiene sangre (la hemoglobina absorbe luz azul-verde), dispersa 99,9% de los fotones incidentes no absorbidos por la muestra, sin un cambio en la longitud de onda de los fotones. El otro 0,1% de los fotones cambia en longitud de onda de una manera que depende de la estructura, la química local y el medio físico de la hemoglobina, los movimientos vibracionales de las moléculas de hemoglobina y la temperatura de la muestra.

Si se usa otra longitud de onda, tal como una longitud de onda más larga (por ejemplo, de 700 nm o más) que no corresponde a una longitud de onda fuertemente absorbida por la hemoglobina u otra sonda de temperatura, entonces el porcentaje de fotones dispersados con longitudes de onda cambiadas es aproximadamente mil veces menor. Es decir, típicamente 99,9999% se dispersan sin ningún cambio en la longitud de onda cuando no hay aumento de resonancia. Este aumento en la intensidad de dispersión Raman se produce por la absorción de la longitud de onda de la luz incidente.

Esto significa que si una mezcla de sustancias se expone a una longitud de onda incidente, entonces los componentes de la mezcla que tienen un aumento de resonancia dominarán la producción de fotones dispersados con una longitud de onda cambiada, es decir, la dispersión Raman. Esto es lo que ocurre en la sangre cuando se usa luz azul-verde como sonda debido al aumento de resonancia de dispersión Raman desde la hemoglobina. El intervalo espectral de azul a azul-verde sólo se absorbe preferentemente por la hemoglobina entre los constituyentes sanguíneos, y de esta manera presenta una oportunidad especial para los métodos basados en la temperatura de la sangre. La hemoglobina es una sonda de temperatura general que, en un ejemplo, puede usarse para detectar la elevación de la temperatura debida a la absorción infrarroja por la glucosa, tal como D-glucosa anhidra (DAG).

Es ventajosa la co-localización de glucosa y hemoglobina es ventajosa. Los gradientes de temperatura son inevitables, de forma que cuanto más próxima esté la sonda de temperatura al sitio de absorción, más fuerte será el efecto sobre la sonda de temperatura. La temperatura se obtiene midiendo y comparando la cantidad de radiación dispersada que tiene longitudes de onda más cortas que la luz incidente, denominada dispersión anti-Stokes, con la cantidad de luz dispersada que tiene longitudes de onda mayores que el haz incidente, es decir, dispersión de Stokes. La relación de las dos intensidades para un cambio de longitud de onda dado está relacionada directamente con la manera en la que se calcula la temperatura real. Este efecto permite medir la temperatura de la hemoglobina y la región circundante inmediata de una manera completamente no invasiva. Además, no es necesario determinar la temperatura real. Detectando el cambio que se produce en la dispersión Stokes o en la dispersión anti-Stokes, se puede calibrar el cambio relativo en la dispersión Raman a una concentración de glucosa conocida.

Definiciones

Todos los términos científicos y técnicos usados en esta solicitud tienen los significados usados habitualmente en la técnica a menos que se especifique otra cosa. Como se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.

Como se usa en este documento, "tejido" significa cualquier parte de un órgano o sistema del cuerpo, incluyendo pero sin limitación piel, lechos capilares, sangre, músculo, mama y cerebro.

Como se usa en este documento, "sonda de temperatura" se refiere a un componente presente en el mismo tejido que el analito. Cuando se deposita energía en la sonda de temperatura o el analito por absorción de radiación, la energía se transfiere de uno al otro.

Como se usa en este documento, "espectros Raman asociados con" un componente dado se refiere a los espectros Raman emitidos que un especialista en la técnica atribuiría a ese componente. Se pueden determinar los espectros Raman que son atribuibles a un componente dado irradiando ese componente en una forma relativamente pura y recogiendo y analizando los espectros Raman emitidos por el componente en ausencia relativa de otros
componentes.

Como se usa en este documento, "lleno de sangre" se refiere a un estado en el que la sangre que fluye a través de un tejido no encuentra obstáculos, por ejemplo, por vasoconstricción inducida por refrigeración o la aplicación de presión. El estado lleno de sangre puede potenciarse por condiciones que aumentan la vasodilatación, tales como calentamiento.

Como se usa en este documento, "vacío de sangre" se refiere a un estado en el que el flujo de sangre a través de un tejido está sustancialmente restringido y el volumen de sangre es mínimo. Un estado vacío de sangre puede conseguirse, por ejemplo, enfriando y/o aplicando presión al tejido. La presión puede aplicarse directamente usando una fuerza estática, tal como por medio de la aplicación de un objeto macroscópico contra el tejido (por ejemplo, una ventana óptica plana, corriente dirigida de gas), o de una manera dinámica, tal como aplicando ondas ultrasónicas u otras ondas de frecuencia acústica al tejido.

Métodos de la invención

La invención proporciona un método para medir un analito en un tejido de un sujeto. En una realización, el método comprende poner en contacto el tejido con radiación electromagnética que tiene una primera longitud de onda de excitación. La primera longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción de una sonda de temperatura dentro del tejido. La sonda de temperatura y el analito están suficientemente próximos entre sí como para que la energía depositada en uno por absorción de radiación se transfiera al otro. Los ejemplos de una sonda de temperatura incluyen, pero sin limitación, hemoglobina, carboxi-hemoglobina, mioglobina, melanina y bilirrubina. Los ejemplos de un analito incluyen, pero sin limitación, glucosa, urea, creatinina, piruvato, tirosina, triptófano, bicarbonato, electrólitos, ácido láctico, fármacos y gases sanguíneos tales como O_{2}, CO_{2} y NO. En una realización preferida, la sonda de temperatura es hemoglobina y el analito es glucosa. El método además comprende recoger los espectros Raman emitidos por el tejido y analizar los espectros recogidos para determinar la cantidad de analito presente en el tejido. En una realización, el análisis comprende medir los espectros Raman asociados con la sonda de temperatura.

Opcionalmente, el método puede comprender además poner en contacto el tejido con radiación electromagnética que tiene una segunda longitud de onda de excitación. El tejido se pone en contacto con la primera y segunda longitudes de onda de excitación de forma simultánea. La segunda longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción del analito, y el análisis comprende comparar los espectros emitidos en respuesta a la primera y segunda longitudes de onda de excitación. Después puede obtenerse información sobre el analito a partir del efecto de la segunda longitud de onda de excitación sobre los espectros emitidos en comparación con los espectros emitidos en respuesta a la primera longitud de onda de excitación en ausencia de la segunda longitud de onda de excitación. Los espectros Raman analizados pueden incluir tanto espectros Stokes como espectros anti-Stokes. En una realización, el análisis comprende determinar la concentración de analito a partir de un cambio de temperatura realizado en la sonda de temperatura por la segunda longitud de onda de excitación de acuerdo con la siguiente relación:

C_{A} = \Delta T/(C_{P}I_{A}\varepsilon_{A}\Delta t);

donde C_{A} es la concentración de analito;

donde C_{P} es la capacidad calorífica del tejido;

En otra realización, el análisis comprende medir los espectros Raman asociados con el analito. Los espectros Raman analizados pueden comprender espectros anti-Stokes, que son los espectros dispersados Raman que tienen longitudes de onda más cortas que la longitud de onda de excitación. La intensidad de la dispersión anti-Stokes es muy sensible a la temperatura de la muestra. Cuanto mayor sea la temperatura, mayor será la intensidad de la luz dispersada anti-Stokes, a expensas de la luz dispersada Stokes. Pueden usarse mediciones de cualquiera de los componentes Stokes y anti-Stokes, o de ambos componentes, para obtener una señal que sea proporcional a la cantidad de analito. Los componentes anti-Stokes de los espectros, aunque son típicamente más débiles que los componentes Stokes, son útiles porque tienen menos probabilidad que los componentes Stokes de obstruirse por el efecto de fondo que interfiere. Pueden usarse características Stokes, pero preferiblemente se evitan cuando supone un problema la fluorescencia u otra radiación de fondo.

Modulación del Tejido

En realizaciones preferidas, el método de la invención se realiza junto con la modulación del tejido. La modulación del tejido, como se usa en este documento, se refiere a la manipulación del tejido al que se aplica el método de forma que puedan realizarse mediciones tanto en el estado lleno de sangre como en el estado vacío de sangre. La diferencia entre las mediciones realizadas en los estados lleno de sangre y vacío de sangre proporciona una medida indicativa de los componentes de la sangre minimizando al mismo tiempo los efectos de las señales espectroscópicas extrañas debidas a callos, suciedad, restos de jabón y otras fuentes asociadas con el tejido circundante. Cuando se emplea modulación del tejido, la etapa de análisis incluye la determinación de la diferencia entre los espectros Raman recogidos en el estado lleno de sangre y el estado vacío de sangre.

En realizaciones preferidas, el tejido es sangre, tal como sangre que circula en el lecho capilar de la punta del dedo. Pueden usarse otros tejidos, tales como el lóbulo de la oreja, músculo, piel, mama o cerebro. Preferiblemente, el sujeto es un vertebrado, tal como un mamífero, ave, reptil o pez. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, vacas, cerdos, ovejas, ratones, caballos, perros y gatos. En una realización más preferida, el sujeto es un ser humano.

El método puede incluir además la etapa de determinar el volumen de sangre en el tejido de interés. En esta realización, el análisis comprende determinar la cantidad de analito por unidad de volumen de sangre. El volumen de sangre puede medirse poniendo en contacto la región modulada del tejido con una luz elegida para que tenga una longitud de onda a un punto isosbéstico para el equilibrio binario oxi-desoxihemoglobina, es decir, 805 nm o 580 nm. La cantidad de luz que vuelve está relacionada directamente con el volumen de sangre en la región de contacto. I_{I} es la intensidad de radiación de longitud de onda de puntos isosbésticos inyectada en el tejido en cuestión. I_{R} es la intensidad de radiación de longitud de onda de puntos isosbésticos devuelta desde el tejido en cuestión. La relación I_{R}/I_{I}, que se normaliza para la variación en el volumen de sangre en aplicaciones sucesivas de modulación de tejido, con frecuencia será constante para una serie de mediciones que tienen lugar en la misma región de tejido con los mismos láseres y detectores. Por consiguiente, este factor puede omitirse en las ecuaciones que se proporcionan a continuación y la medición de la concentración puede realizarse en unidades de volumen de sangre definido por I_{R}/I_{I}.

Estas unidades de volumen de sangre (u otro volumen de tejido) también serán evidentes en las unidades de \varepsilon, de forma que no es necesario que el volumen cuestionado aparezca explícitamente en las ecuaciones que relacionan una elevación de la temperatura con la intensidad de la excitación incidente, la concentración de la sonda de temperatura, la capacidad calorífica del medio y la duración de la exposición. El volumen estará incluido implícitamente en el valor numérico de \varepsilon, y puede medirse de manera empírica o estimarse a partir de los coeficientes de extinción conocidos de las sustancias relevantes en situaciones in vitro. Esto es posible debido al objetivo de determinar cambios relativos en la concentración de analito. El solapamiento espacial entre la región en la que se cuestiona el volumen de sangre y la región en la que se cuestiona el analito sólo necesita mantener una constancia relativa durante el transcurso de las mediciones para proporcionar una precisión suficiente en la estimación del cambio de temperatura y de esta forma la concentración de analito. Sería de esperar que las regiones solaparan considerablemente, aunque las diferentes longitudes de onda usadas para las diferentes tareas tendrían profundidades de penetración diferentes. Dado que existen otras limitaciones relacionadas con las mediciones, no es necesario conseguir un solapamiento completo.

En una realización, la primera longitud de onda de excitación es de aproximadamente 647 a aproximadamente 400 nm. Preferiblemente, la longitud de onda es de aproximadamente 550 a aproximadamente 400 nm. En realizaciones más preferidas, la longitud de onda es de aproximadamente 588, 514, 473, 532 o 457 nm. La radiación electromagnética a usar como longitud de onda de excitación en el método preferiblemente tiene una amplitud de banda de aproximadamente 0,03 nm a aproximadamente 0,000003 nm. En otra realización, la segunda longitud de onda de excitación es de aproximadamente 0,98, aproximadamente 1,42, aproximadamente 1,89, aproximadamente 2,15 o aproximadamente 9 a aproximadamente 11 \mum.

En una realización preferida, la invención proporciona un método para medir la concentración de glucosa en sangre en un sujeto. El método comprende poner en contacto el tejido del sujeto con una radiación electromagnética que tiene una primera longitud de onda de excitación en el intervalo de azul a azul-verde y mientras el tejido del sujeto está en un estado lleno de sangre. En una realización, la primera longitud de onda de excitación es de aproximadamente 550 a aproximadamente 400 nm. El método además comprende recoger espectros Raman emitidos por el tejido en respuesta a la primera longitud de onda de excitación, donde los espectros Raman comprenden espectros Stokes y anti-Stokes. Los espectros recogidos después se analizan para determinar los espectros asociados con la hemoglobina. El método además comprende poner en contacto el tejido del sujeto con radiación electromagnética que tiene una segunda longitud de onda de excitación de aproximadamente 0,98, aproximadamente 1,42, aproximadamente 1,89, aproximadamente 2,15 o aproximadamente 9 a aproximadamente 11 \mum, y mientras el tejido del sujeto está en un estado lleno de sangre. El tejido se pone en contacto con la primera y segunda longitudes de onda de excitación simultáneamente. Los espectros Raman, incluyendo los espectros Stokes y anti-Stokes, emitidos por el tejido en respuesta a la segunda longitud de onda de excitación se recogen y analizan para determinar los espectros asociados con la glucosa. Las etapas anteriores también se realizan mientras el tejido está en un estado vacío de sangre, antes, después o de forma alterna con la realización de las etapas mientras el tejido está en un estado lleno de sangre. El método además comprende determinar los espectros netos emitidos en respuesta a la primera y segunda longitudes de onda de excitación, donde los espectros netos comprenden la diferencia entre los espectros obtenidos en el estado lleno de sangre y el estado vacío de sangre, y determinar una primera relación entre los espectros anti-Stokes y los espectros Stokes emitidos en respuesta a la primera longitud de onda de excitación y una segunda relación entre los espectros anti-Stokes y los espectros Stokes emitidos en respuesta a la segunda longitud de onda de excitación. La segunda relación se divide por la primera relación para obtener un valor representativo de la concentración de
glucosa.

En una realización, el análisis comprende determinar la concentración de glucosa a partir de un cambio de temperatura realizado en la hemoglobina por la segunda longitud de onda de excitación de acuerdo con la siguiente relación:

C_{G} = \Delta T/(C_{P}I_{G}\varepsilon_{G}\Delta t);

donde C_{G} es la concentración de glucosa;

donde \DeltaT es el cambio de temperatura entre la temperatura, en grados Kelvin, asociada con la dispersión Raman emitida por la hemoglobina en respuesta a la primera y segunda longitudes de onda de excitación, y la temperatura asociada con la dispersión Raman emitida por la hemoglobina en respuesta a la primera longitud de onda de excitación en ausencia de la segunda longitud de onda de excitación;

donde C_{P} es la capacidad calorífica del tejido;

donde I_{G} es la intensidad de la radiación electromagnética de la segunda longitud de onda de excitación;

donde \varepsilon_{G} es el coeficiente de absorción para una molécula de glucosa;

En otra realización preferida, la invención proporciona un método para medir la glucosa sanguínea en un sujeto. El método comprende poner en contacto un tejido del sujeto con una radiación electromagnética que tiene una primera longitud de onda de excitación en el intervalo de azul a azul-verde y mientras el tejido del sujeto está en un estado lleno de sangre. En otra realización, la longitud de onda es de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 400 nm. El método además comprende recoger espectros Raman, incluyendo espectros anti-Stokes emitidos por el tejido, y analizar los espectros recogidos para determinar los espectros asociados con la glucosa. Las etapas anteriores también se realizan mientras el tejido está en un estado vacío de sangre, antes, después o de forma alterna con la realización de las etapas mientras el tejido está en un estado lleno de sangre. El método además comprende determinar los espectros netos emitidos en respuesta a la primera longitud de onda de excitación, donde los espectros netos comprenden la diferencia entre los espectros obtenidos en el estado lleno de sangre y el estado vacío de sangre, para obtener un valor representativo de la concentración de glucosa. La limitación del análisis a la parte anti-Stokes de los espectros emitidos elimina gran parte del efecto de fondo encontrado en la parte Stokes de los espectros.

Aparato

La invención proporciona un aparato para medir un analito en una muestra. La muestra puede ser un tejido en un sujeto incluyendo, por ejemplo, piel, músculo, lechos capilares, sangre, mama o cerebro. En la Figura 1 se muestra un diagrama que representa un aparato de la invención. El aparato comprende una primera fuente de luz 100, un detector 120 y un procesador de señales 130. El aparato es adecuado para usarse con los métodos de la invención descritos en este documento. Los componentes adecuados y las realizaciones específicas del aparato pueden adaptarse a partir de otros sistemas de espectroscopía Raman conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.553.616; 5.510.894; 5.615.673; y 5.551.422).

La primera fuente de luz 100 emite radiación electromagnética que tiene una primera longitud de onda de excitación, donde la primera longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción de una sonda de temperatura dentro de la muestra. Preferiblemente, la fuente de luz es un láser. Los ejemplos de láseres adecuados para uso en la producción de la primera longitud de onda de excitación incluyen, pero sin limitación, láseres de diodo de cavidad externa, láseres de CO_{2} y láseres semiconductores. En una realización preferida, el aparato comprende además una segunda fuente de luz 110 que emite radiación electromagnética que tiene una segunda longitud de onda de excitación que es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción del analito. Los ejemplos de láseres adecuados para uso en la producción de la segunda longitud de onda de excitación incluyen, pero sin limitación, ion argón, ion kriptón y láseres YAG de doble frecuencia. En una realización, la primera longitud de onda de excitación es de aproximadamente 550 a aproximadamente 400 nm y la segunda longitud de onda de excitación es de aproximadamente 0,98, 1,41, 1,89, 2,15 o aproximadamente 9 a aproximadamente
11 \mum.

El detector 120 es un dispositivo fotosensible que está dispuesto para recibir los espectros Raman emitidos por la muestra. El detector 120 puede incluir un dispositivo 210 de selección de longitudes de onda. En una realización, el dispositivo 210 de selección de longitudes de onda es un espectrógrafo de selección de longitudes de onda que preferiblemente utiliza retícula de transmisión holográfica y detección con dispositivos de cargas interconectadas (CCD) en serie. La luz dispersada puede prefiltrarse antes de entrar en la ranura del espectrógrafo usando un filtro notch holográfico. En una realización, el filtro tiene una amplitud de bloqueo de banda de aproximadamente 250 cm^{-1} (o aproximadamente 1 nm), centrada en la longitud de onda de excitación correspondiente. En otra realización, el dispositivo 210 de selección de longitudes de onda es un detector de un solo canal. Los ejemplos de un detector de un solo canal incluyen, pero sin limitación, un fotodiodo tal como un fotodiodo de avalancha, y un tubo fotomultiplicador. La luz que entra en el detector de un solo canal puede filtrarse, por ejemplo, usando un solo filtro notch o un bloque dieléctrico. En realizaciones preferidas, el detector 120 se enfría usando, por ejemplo, nitrógeno líquido u otro método de refrigeración adecuado conocido en la técnica. El detector 120 produce señales de salida representativas de los espectros Raman dispersados por la muestra en respuesta a la irradiación con la primera y/o segunda fuentes de luz 100, 110.

El procesador 130 está acoplado para recibir señales de salida producidas por el detector 120. En una realización, el procesador 130 es un ordenador acoplado para recibir las señales de salida producidas por el detector. El ordenador procesa las señales de salida para obtener un valor indicativo de la concentración de analito en el tejido a partir de una comparación de señales de salida representativas de los espectros Raman dispersados en respuesta a la primera y segunda longitudes de onda de excitación. En una realización, el ordenador procesa las señales de salida de acuerdo con la siguiente relación:

C_{A} = \Delta T/(C_{P}I_{A}\varepsilon_{A}\Delta t);

donde C_{A}, \DeltaT, C_{P}, I_{A}, \varepsilon_{A} y \Deltat son como se han definido anteriormente.

En la Figura 2 se muestra otra realización del aparato. La luz emitida por la primera fuente de luz 100 pasa a través de un modulador de amplitud 230 a un primer y segundo reflectores 240, 250 de tal forma que la luz confluya con la trayectoria de luz emitida por la segunda fuente de luz 110. Después se irradia luz a la muestra 200. La luz dispersada por la muestra alcanza un dispositivo 210 de selección de longitudes de onda que incluye un filtro sintonizado para transmitir una característica Raman seleccionada. Esta característica incluye longitudes de onda de 1008 nm a 1029 nm para la queratina de la piel excitada con 785 nm. En una realización, el dispositivo 210 de selección de longitudes de onda tiene una ranura de 250 \mum y usa una retícula de transmisión holográfica.

La señal seleccionada después se recibe por un detector 120. En una realización, el detector 120 es una serie de dispositivos de cargas interconectadas (CCD) que puede enfriarse con nitrógeno líquido. Como alternativa, el detector 120 puede comprender un detector de un solo canal. El detector 120 opcionalmente incluye características espaciales, tales como una distribución espacial en cuadrante, que permite el uso simultáneo de codificación/modulación espacial (modulación Hadmaard/otra/modulación de tejido).

La señal después pasa a un amplificador 220 sensible a la fase que comprende un amplificador de cierre/integrador interrumpido preparado para desmodular la señal estimulada por el modulador 230. El procesador 130 después coge la señal desmodulada analógica del amplificador 220 sensible a la fase y realiza la digitalización, almacenamiento y procesamiento de los datos. Además, el procesador 130 puede proporcionar una sincronización con la modulación del tejido concurrente o codificación espacial.

Los ejemplos de sondas de temperatura incluyen, pero sin limitación, hemoglobina, carboxi-hemoglobina, mioglobina, melanina y bilirrubina. Los ejemplos de analitos incluyen, pero sin limitación, glucosa, urea, creatinina, piruvato, tirosina, triptófano, bicarbonato, electrólitos, ácido láctico, fármacos y gases sanguíneos tales como O_{2}, CO_{2} y NO. En una realización, la sonda de temperatura es hemoglobina y el analito es glucosa.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y para ayudar a un especialista habitual a realizarla y usarla. En ningún caso los ejemplos pretenden limitar de otra manera el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Uso de Aumento de Resonancia de Hemoglobina para Obtener una Medición de Glucosa in Vivo

Para una molécula dada, es posible identificar diversas longitudes de onda de luz, a partir de las partes infrarroja a ultravioleta del espectro electromagnético, que se absorberían preferentemente en comparación con la absorción total por todos los demás componentes de la sangre y los tejidos. La d-glucosa anhidra (DAG) tiene un coeficiente de extinción molecular en la región de longitudes de onda de 9-11 \mum, o cerca de esa región, que es significativamente mayor que el de la mayoría de las proteínas, sales, grasas e incluso agua, que constituyen los tejidos y la sangre humana. Varios azúcares, azúcares parcialmente fosforilados y otros intermedios en el metabolismo de los azúcares absorben a diversas longitudes de onda dentro del mismo intervalo de longitudes de onda.

Las concentraciones de la mayoría de estos azúcares y casi azúcares están muy correlacionadas entre sí por los equilibrios asociados con el metabolismo de los azúcares. Los azúcares individuales y los componentes relacionados absorben luz infrarroja a longitudes de onda claramente diferentes dentro y fuera del intervalo de longitudes de onda mencionado anteriormente. Sin embargo, no ha sido posible detectar esta excitación usando medios convencionales que se basan en mediciones dirigidas a la misma longitud de onda que la que incide en la muestra. Por ejemplo, la detección de la luz retrodispersada a la misma longitud de onda, conocida como radiación dispersada de Rayleigh, no es selectiva ya que contiene contribuciones del volumen de la sangre así como del tejido. Cualquiera de estos centros de dispersión puede ser suficientemente variable como para hacer que una medición de potencia total no selectiva carezca de significado.

Como la absorción de la luz deposita energía en la región iluminada, efectúa una elevación en la temperatura. La cantidad de elevación de la temperatura es proporcional al número de fotones absorbidos, la capacidad calorífica del absorbente y la región inmediatamente circundante y las velocidades relativas de absorción de energía y conducción de energía al interior de los tejidos y fluidos circundantes. Midiendo la elevación de la temperatura tras la exposición de una cierta muestra de sangre o de tejido in vivo a la radiación de una longitud de onda apropiada, se puede detectar la absorción de la especie de absorción. De esta manera, la medición de la absorción de luz, por ejemplo, por medio de la absorción por DAG tras la iluminación por la longitud o longitudes de onda específicas correctas, elimina el problema de medir la elevación de la temperatura asociada. Este ejemplo describe un método sencillo y versátil para obtener mediciones de la temperatura no invasivas.

Para el caso específico de la DAG, el método depende de la obtención de mediciones de radiación dispersada Raman a partir de los eritrocitos en los que se localiza la d-glucosa anhidra. La técnica puede aplicarse a una diversidad de analitos y sondas de temperatura. En la sangre, puede encontrarse DAG libre en el volumen citoplásmico de los eritrocitos. La exposición del volumen de sangre a través de la piel por medio de los lechos capilares a la radiación infrarroja a la longitud de onda correcta (una longitud de onda específica en el intervalo de longitudes de onda de 9-10 \mum, por ejemplo), de forma que se absorba preferentemente por la DAG, hará que los materiales existentes dentro de los eritrocitos aumenten su temperatura. Una sustancia muy próxima al punto de absorción, y por lo tanto calentada por la energía depositada en la DAG, es la hemoglobina.

El volumen de sangre puede medirse poniendo en contacto la región modulada del tejido con luz elegida para que tenga una longitud de onda a un punto isosbéstico para el equilibrio binario de oxi-desoxihemoglobina, es decir, 805 nm o 580 nm. La cantidad de luz que vuelve está relacionada directamente con el volumen de sangre en la región en la que se ha realizado el contacto. I_{I} es la intensidad de la radiación de la longitud de onda de puntos isosbésticos inyectada en el tejido en cuestión. I_{R} es la intensidad de la radiación de longitud de onda de puntos isosbésticos devuelta desde el tejido en cuestión. La relación I_{R}/I_{I}, que se normaliza para la variación en el volumen de sangre en aplicaciones sucesivas de modulación de tejido, con frecuencia será constante para una serie de mediciones que se realizan en la misma región de tejido con los mismos láseres y detectores. Por consiguiente, este factor se omite en las ecuaciones que se proporcionan a continuación y la medición de la concentración se realizará en unidades de volumen de sangre definidas por I_{R}/I_{I}.

Un factor de normalización que relaciona la calidad del contacto óptico entre el sistema óptico del instrumento y la región de tejido de interés se obtiene poniendo en contacto la región con una longitud de onda que no se absorbe por ningún componente de la región, y detectando la cantidad de luz que vuelve. I_{N} es la intensidad de la radiación de longitud de onda no absorbida inyectada en el tejido en cuestión. I_{S} es la intensidad de la radiación de longitud de onda no absorbida devuelta desde el tejido en cuestión. Debe indicarse que la relación I_{S}/I_{N}, que normaliza la variación en el volumen de sangre en aplicaciones sucesivas de modulación de tejido, con frecuencia será constante para una serie de mediciones que se realizan en la misma región de tejido con los mismos láseres y detectores. Por consiguiente, este factor se omite en las ecuaciones que se proporcionan a continuación y la medición de la concentración se realiza en unidades de volumen de sangre definidas por I_{S}/I_{N}.

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Etapa 1

Durante esta etapa no se aplica ninguna presión externa al tejido a examinar. Se obtiene un espectro Raman, Stokes y anti-Stokes, por contacto óptico de la piel de la punta de un dedo y el tejido/lecho capilar por debajo de la piel con una luz con una amplitud de banda espectral estrecha. La luz que se dispersa debido a la interacción de esta luz "excitante" con el tejido se recoge y se analiza por la longitud de onda. La luz excitante se elige de manera que aumente la intensidad del espectro de resonancia Raman de la hemoglobina.

La parte Stokes del espectro Raman obtenida durante la etapa 1 se denomina R_{0}(\lambda)_{s1}. La parte anti-Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 1 se denomina R_{0}(\lambda)_{as1}.

La luz dispersada Raman, es decir, la luz con longitud de onda cambiada, tiene su origen en la interacción de la luz incidente, es decir, la luz excitante, con las diversas especies químicas en la mezcla. Además de cualquier fluorescencia que pueda haber inducido la absorción, parte del espectro Raman se produce a longitudes de onda más largas que la de la luz incidente. Esto se denomina dispersión Stokes. A diferencia de la fluorescencia que sigue a la absorción de un solo fotón, también puede observarse otra parte de la luz dispersada Raman a longitudes de onda más cortas. Esto se denomina dispersión anti-Stokes. La intensidad de esta dispersión a longitudes de onda más cortas es muy sensible a la temperatura de la muestra. Cuanto mayor es la temperatura, mayor es la intensidad de la luz dispersada anti-Stokes a expensas de los fotones dispersados Stokes. El proceso de dispersión Raman habitual, que implica la interacción de las vibraciones de las moléculas con la luz incidente, tiende a producir un fotón de luz con longitud de onda cambiada por cada 10^{6} fotones incidentes. Por el contrario, la fluorescencia habitual produce un fotón por cada 10^{3} fotones incidentes.

Temperatura

La siguiente ecuación relaciona la intensidad de componentes genéricos Stokes (I_{s}) y anti-Stokes (I_{AS}) de un modo vibracional que tiene una frecuencia (\upsilon), con la temperatura (T) del sistema, la frecuencia (\upsilon_{0}) de la radiación excitante y q, la relación de la respuesta del detector a las dos longitudes de onda correspondientes a \upsilon_{AS} y \upsilon_{s}. h es la constante de Planck y k es la constante de Boltzmann.

I_{AS}/I_{S} = (\upsilon_{AS}-\upsilon_{0})4/(\upsilon_{S}-\upsilon_{0})^{4}\ q\ exp(h\upsilon/kT)

La glucosa tiene una fuerte característica Raman a 200 cm^{-1}. Una elevación de la temperatura de \approx 12ºC, que se podría producir de una manera transitoria, y que está por debajo de la temperatura estática que se sabe que produce daños histológicos, produciría un cambio de 10% en la relación I_{AS}/I_{S}. La elevación transitoria de la temperatura debido a la absorción de radiación, \DeltaT, es proporcional a la cantidad total (energía) de radiación absorbida, E_{A}, y la capacidad calorífica neta del medio, C_{p}. La capacidad calorífica del tejido humano está en el mismo orden que la del agua. Basándose en un volumen irradiado del orden de microlitros, una absorción únicamente del orden de 10^{0}-10^{1} microjulios es suficiente para producir tal elevación de la temperatura. Esta cantidad de energía puede producirse por láseres de CO_{2} en un paso de banda de alrededor de los 9-10 \mum en longitud de onda, que resulta que se absorbe por la glucosa y por varios de sus descendientes metabólicos inmediatos. Hay otras longitudes de onda en la región espectral cercana a la infrarroja, tales como 980, 1410, 1890 y 2150 nm, que también se consideran absorbidas selectivamente por la glucosa y se producen de forma más conveniente usando láseres
semiconductores.

\Delta T = C_{P}E_{A}

La energía absorbida dentro del volumen irradiado es proporcional a la concentración de especies absorbentes, es decir, moléculas de glucosa, C_{G}, la intensidad de la radiación a la longitud de onda en cuestión y el coeficiente de absorción por esta molécula. E_{A} se expresa como:

E_{A} = C_{G}\ I_{G}\ \varepsilon_{G}\ \Delta t

La glucosa y la hemoglobina tienden a localizarse espacialmente en los eritrocitos de tal forma que la energía depositada en una por la absorción de radiación tienda a transferirse a la otra (y a otros componentes de la región localizada), afectando preferiblemente a los espectros de las dos. La energía absorbida es proporcional a la intensidad de la radiación incidente, la duración (\Deltat) del periodo durante el cual están expuestos los absorbentes, la concentración de absorbentes (glucosa, C_{G}), y el coeficiente de extinción de los absorbentes a la longitud de onda de la radiación incidente, por ejemplo, \varepsilon_{G} en el caso de la glucosa.

A la absorción de radiación por tejidos en el siguiente sentido relativo se le aplica la ley de Beer. La longitud de trayectoria eficaz para una longitud de onda particular puede mantenerse constante durante la interrogación espectral, y la radiación incidente puede mantenerse a una intensidad constante. Esto ocurre independientemente del hecho de que la luz en los tejidos se propaga en el límite de dispersión múltiple (R. R. Anderson y J. A. Parrish, 1981, The Optics of Human Skin, J. Investigative Dermatology 77 (1):13-19). Además, la sincronización temporal de las diversas exposiciones y mediciones puede mantenerse constante de manera que la absorción relativa sea dependiente únicamente de la concentración relativa de los absorbentes. De esta manera, el cambio de temperatura relativa de la hemoglobina depende de la concentración de glucosa.

Aumento de Resonancia

Hay un intervalo de longitudes de onda que abarcan la parte azul-verde del espectro visible, y en un grado más débil incluso más allá del intervalo de 600 nm, que corresponde a la absorción electrónica de la hemoglobina en los eritrocitos. La excitación de los espectros Raman de la hemoglobina, oxigenada o desoxihemoglobina, usando una luz incidente en estos intervalos (particularmente en la región azul-verde) produce un aumento de hasta 10^{3}-10^{6} veces de la intensidad Raman. Este aumento se debe a la interacción electrónica que intensifica el proceso de dispersión y hace que la espectroscopia Raman sea una sonda particularmente sensible de estas moléculas, particularmente en presencia de un efecto de fondo de fluorescencia.

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Etapa 2

Durante esta etapa, no se aplica ninguna presión externa al tejido a examinar. Se obtiene otro espectro Raman de resonancia aumentada, Stokes y anti-Stokes, poniendo en contacto ópticamente la piel de la punta de un dedo con una luz de amplitud de banda espectral estrecha. Simultáneamente, el tejido se pone en contacto con una fuente de luz que tiene una intensidad I_{G}, que puede absorberse preferentemente por la glucosa con respecto a otras especies presentes en el tejido/sangre.

La parte Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 2 se denomina R_{0}(\lambda)_{s2}, y la parte anti-Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 2 R_{0}(\lambda)_{as2}.

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Etapa 3

Durante esta etapa, se aplica presión externa al tejido a examinar. Se obtiene un espectro Raman, Stokes y anti-Stokes, poniendo en contacto ópticamente la piel de la punta de un dedo y el tejido/lecho capilar por debajo de la piel con una luz de amplitud de banda espectral estrecha. La luz que se dispersa debido a la interacción de esta luz "excitante" con el tejido se recoge y analiza por la longitud de onda. La luz excitante se elige de manera que la intensidad del espectro Raman aumente la resonancia para la sonda de temperatura.

La parte Stokes del espectro Raman obtenida durante la etapa 3 se denomina R_{p}(\lambda)_{s3}, y la parte anti-Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 3 R_{p}(\lambda)_{as3}.

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Etapa 4

Durante esta etapa, se aplica presión externa al tejido a examinar. Se obtiene otro espectro Raman de resonancia aumentada, Stokes y anti-Stokes, poniendo en contacto ópticamente la piel de la punta de un dedo con una luz de amplitud de banda espectral estrecha. Simultáneamente, el tejido se pone en contacto con una fuente de luz de intensidad I_{G}, que puede absorberse preferentemente por la glucosa con respecto a otras especies presentes en el tejido/
sangre.

La parte Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 4 se denomina R_{P}(\lambda)_{s4}, y la parte anti-Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 4 R_{P}(\lambda)_{2s4}. Supongamos que

(R_{o}(\lambda)_{as1}-R_{p}(\lambda)_{as3})/(R_{0}(\lambda)_{s1}-R_{p}(\lambda)_{s3}) = A

(R_{0}(\lambda)_{as1}-R_{p}(\lambda)_{as3})/(R_{0}(\lambda)_{s1}-R_{p}(\lambda)_{s3}) = (\upsilon_{AS}-\upsilon_{0})^{4} / (\upsilon_{S}-\upsilon_{0})^{4}\ q\ exp\ (h\upsilon / kT_{O}).

Donde T_{0} corresponde a la temperatura, en grados Kelvin, asociada con los dispersores Raman sin la excitación preferente de la glucosa.

De forma similar, supongamos que:

(R_{o}(\lambda)_{as2}-R_{p}(\lambda)_{as4})/(R_{0}(\lambda)_{s2}-R_{p}(\lambda)_{s4}) = B

(R_{0}(\lambda)_{as2}-R_{p}(\lambda)_{as4})/(R_{0}(\lambda)_{s2}-R_{p}(\lambda)_{s4}) = (\upsilon_{AS}-\upsilon_{0})^{4} / (\upsilon_{S}-\upsilon_{0})^{4}\ q\ exp\ (h\upsilon / kT_{O}).

Donde T corresponde a la temperatura, en grados Kelvin, asociada con los dispersores Raman con la excitación preferente de la glucosa.

De forma que:

B/A = C\ exp\ (\Delta T/TT_{0})

ln\ (B/A) = ln\ (C) + (\Delta T/TT_{0})

De esta manera, la relación medida B/A puede usarse en lo siguiente:

\Delta T = TT_{0}In(B/A)

siendo

\Delta T = C_{p}E_{A} = C_{p} C_{G} I_{G} \varepsilon_{G} \Delta t

o

\Delta T / (C_{P} I_{G} \varepsilon_{G} \Delta t) = C_{G}.

Es posible calcular la concentración de glucosa, C_{G}, directamente a partir de la serie de mediciones, repartiéndose las muchas influencias que interfieren a lo largo del camino.

Las mediciones del aumento de la temperatura relativa pueden correlacionarse empíricamente con las concentraciones de glucosa medidas de manera independiente. La descripción anterior demuestra un algoritmo y muestra que hay una base rigurosa para aplicar empíricamente dos variaciones del método para la cuantificación no invasiva de analitos.

Ejemplo 2

Uso del Espectro Raman Anti-Stokes para Obtener una Medición de Glucosa in Vivo

La intensidad del componente anti-Stokes del espectro de glucosa depende de la intensidad de la radiación excitante, que excita a la hemoglobina y calienta la glucosa. La intensidad de la dispersión anti-Stokes es muy sensible a la temperatura de la muestra. Cuanto mayor es la temperatura, mayor es la intensidad de la luz dispersada anti-Stokes a expensas de la luz dispersada Stokes. Los componentes anti-Stokes de los espectros son útiles porque tienen menos probabilidad que los componentes Stokes de obstruirse por interferencias con el efecto de fondo. En este ejemplo, se usa una longitud de onda de excitación que excita a la hemoglobina para calentar la glucosa, potenciando de esta manera los espectros anti-Stokes asociados con la glucosa.

Etapa 1

Durante esta etapa, no se aplica ninguna presión externa al tejido que se va a examinar. Se obtiene un espectro Raman, Stokes y anti-Stokes, poniendo en contacto ópticamente la piel de la punta de un dedo y el tejido/lecho capilar por debajo de la piel con una luz de amplitud de banda espectral estrecha. La luz que se dispersa debido a la interacción de esta luz "excitante" con el tejido se recoge y analiza por la longitud de onda. La luz excitante se elige para que tenga una longitud de onda que se absorba por la hemoglobina. El objetivo es inducir una cantidad de fluorescencia tan pequeña como sea posible mientras se inyecta suficiente energía en la hemoglobina. Esto calentará la glucosa en las proximidades inmediatas de la hemoglobina excitada y hará que se observe la intensidad de las características anti-Stokes. Para este fin son adecuados modos de baja frecuencia, tales como de aproximadamente 200 a aproximadamente 600 cm^{-1}.

La parte Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 1 se denomina R_{0}(\lambda)_{s1}, y la parte anti-Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 1 R_{0}(\lambda)_{as1}.

Etapa 2

Durante esta etapa, se aplica presión externa al tejido a examinar. Se obtiene un espectro Raman, Stokes y anti-Stokes, poniendo en contacto ópticamente la piel de la punta de un dedo y el tejido/lecho capilar por debajo de la piel, u otra sección análoga del cuerpo humano, con una luz de amplitud de banda espectral estrecha. La luz que se dispersa debido a la interacción de esta luz "excitante" con el tejido se recoge y analiza por la longitud de onda. La luz excitante tiene una longitud de onda que se absorbe por la hemoglobina.

La parte Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 2 se denomina R_{p}(\lambda)_{s2}, y la parte anti-Stokes del espectro Raman obtenido durante la etapa 1 R_{p}(\lambda)_{as2}.

Un objetivo es realizar un cambio de temperatura apreciable en los espectros Raman, mejorando de esta manera la detectabilidad de los componentes anti-Stokes y obteniendo una forma diferente de modulación de señales de los componentes Stokes, conduciendo todo ello a un mejor análisis cualitativo y cuantitativo.

Una estrategia es usar las características Stokes para el análisis. Si la fluorescencia u otra radiación de fondo impide el uso de características Stokes, sin embargo, puede usarse el siguiente cálculo con los componentes anti-Stokes:

(R_{O}(\lambda)_{as1} - R_{P}(\lambda)_{as2}) = P(\lambda)C_{G}\sigma;

donde P(\lambda) es la potencia incidente de la luz excitante, C_{G} es la concentración de glucosa y \sigma es la función de sección transversal. Si los valores al lado izquierdo de la ecuación anterior se miden una vez para obtener un valor que puede compararse con una medición independiente de C_{G}, entonces puede determinarse P(\lambda) \sigma, y el instrumento puede calibrarse para uso en el control de los cambios posteriores en C_{G}.

La resta de los resultados de la etapa 1 de los de la etapa 2, Stokes o anti-Stokes, proporciona un número que es proporcional a la concentración de glucosa.

En la Figura 2 se muestra un aparato adecuado para uso en esta realización del método. La luz emitida por la primera fuente de luz 100 pasa a través de un modulador de amplitud 230 a un primer y segundo reflectores 240, 250 de tal forma que la luz confluya con la trayectoria de la luz emitida por la segunda fuente de luz 110. La luz después irradia la muestra 200. En esta realización particular, la primera longitud de onda de excitación es 785 nm y tiene una amplitud de banda espectral de 0,3 cm^{-1}. La emisión espontánea amplificada del efecto de fondo preferiblemente es menor de 1 parte de cada 10^{8} de la porción de 785 nm. Si la potencia a 785 nm es al menos 100 mW en la superficie de la piel, la característica espectral Raman de glucosa Stokes puede obtenerse en aproximadamente 10 minutos.

La luz dispersada por la muestra alcanza un dispositivo 210 de selección de longitudes de onda que es un espectrógrafo de selección de longitudes de onda que tiene un filtro sintonizado para transmitir una característica Raman seleccionada, tal como de 1008 nm a 1029 nm para la queratina de la piel excitada con 785 nm. El dispositivo 210 de selección de longitudes de onda tiene una ranura de 250 \mum y usa una retícula de transmisión holográfica. La luz dispersada se pre-filtra antes de entrar en la ranura del espectrógrafo usando un filtro notch holográfico que tiene una amplitud de bloqueo de banda de aproximadamente 250 cm^{-1} (aproximadamente 1 nm) centrada a 785 nm. La densidad óptica del filtro a 785 nm preferiblemente es de al menos 6 a 8. El sistema de recogida de luz no contiene ningún elemento óptico de fibras fotoconductoras y tiene un número f eficaz de 1,4. Esto puede conseguirse usando componentes ópticos conocidos tales como lentes de cámara de 35 mm convencionales. Las lentes de enfoque para la excitación Raman y la absorción de hemoglobina pueden ser de aproximadamente 2 cm a aproximadamente 18 cm, dependiendo del tamaño de la región a sondar.

La señal seleccionada después se recibe por un detector 120. El detector 120 es una serie de dispositivos de cargas interconectadas (CCD) que puede enfriarse con nitrógeno líquido. El detector 120 puede comprender un detector de un solo canal y opcionalmente incluye características espaciales tales como una distribución espacial en cuadrante, permitiendo el uso simultáneo de codificación/modulación espacial (modulación Hadmaard/otra/modulación de tejido).

La señal después pasa a un amplificador 220 sensible a la fase que comprende un amplificador de cierre/integrador interrumpido preparado para desmodular la señal estimulada por el modulador 230. El procesador 130 después coge la señal desmodulada analógica del amplificador 220 sensible a la fase y realiza la digitalización, almacenamiento y procesamiento de los datos. Además, el procesador 130 puede proporcionar una sincronización con la modulación del tejido concurrente o codificación espacial. El procesador preferiblemente es un ordenador.

Los especialistas en la técnica apreciarán otras variaciones y modificaciones que pueden usarse para el método y aparato descrito en este documento.

Claims

1. Un método para medir un analito en un tejido de un sujeto que comprende:

(a) poner en contacto el tejido con radiación electromagnética que tiene una primera longitud de onda de excitación, tanto en presencia como en ausencia de radiación electromagnética que tiene una segunda longitud de onda de excitación, donde la primera longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción de una sonda de temperatura dentro del tejido capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman y la segunda longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción del analito capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman, y donde la sonda de temperatura y el analito están suficientemente próximos entre sí como para que la energía depositada en uno por absorción de radiación se transfiera al otro;

(b) recoger los espectros Raman emitidos por el tejido; y

(c) analizar los espectros recogidos comparando los espectros Raman emitidos por la sonda de temperatura en respuesta a la primera longitud de onda de excitación en presencia y en ausencia de la segunda longitud de onda de excitación para determinar la concentración de analito presente en el tejido.

2. El método de la reivindicación 1, donde los espectros Raman analizados comprenden espectros Stokes y anti-Stokes.

3. El método de la reivindicación 1, donde la concentración de analito se determina de acuerdo con la siguiente relación:

C_{A} = \Delta T / (C_{P}I_{A}\varepsilon_{A}\Delta t);

donde C_{A} es la concentración de analito;

donde C_{P} es la capacidad calorífica del tejido;

4. Un método para medir un analito en un tejido que contiene sangre de un sujeto que comprende:

(a) poner en contacto el tejido con radiación electromagnética que tiene una primera longitud de onda de excitación mientras el tejido está lleno de sangre y mientras el tejido está vacío de sangre, donde la primera longitud de onda de excitación es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción de una sonda de temperatura dentro del tejido capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman y donde la sonda de temperatura y el analito están suficientemente próximos entre sí como para que la energía depositada en uno por absorción de radiación se transfiera al otro;

(b) recoger los espectros Raman emitidos por el tejido; y

(c) analizar los espectros recogidos midiendo los espectros Raman asociados con el analito y determinando la diferencia entre los espectros Raman recogidos en el estado lleno de sangre y vacío de sangre para determinar una concentración de analito presente en el tejido.

5. El método de la reivindicación 4, donde los espectros Raman analizados comprenden espectros anti-Stokes.

6. El método de la reivindicación 1 ó 4, donde el tejido es sangre.

7. El método de la reivindicación 1 ó 4, que comprende además la etapa de determinar el volumen de sangre.

8. El método de la reivindicación 1 ó 4, donde la primera longitud de onda de excitación es de aproximadamente 647 a aproximadamente 400 nm.

\newpage

9. El método de la reivindicación 1 ó 4, donde la primera longitud de onda de excitación es de aproximadamente 550 a aproximadamente 400 nm.

10. El método de la reivindicación 1 ó 4, donde la primera longitud de onda de excitación tiene una amplitud de banda de aproximadamente 0,03 nm a aproximadamente 0,000003 nm.

11. El método de la reivindicación 1 ó 4, donde la sonda de temperatura es hemoglobina.

12. El método de la reivindicación 1 ó 4, donde el analito es glucosa.

13. El método de la reivindicación 1 ó 4, donde el analito es creatinina, piruvato o urea.

14. El método de la reivindicación 1, donde el analito es glucosa, la sonda de temperatura es hemoglobina, la primera longitud de onda de excitación es de aproximadamente 550 a 400 nm, la etapa (a) se realiza mientras el tejido está en un estado lleno sangre, los espectros Raman recogidos comprenden espectros Stokes y anti-Stokes, el análisis comprende determinar los espectros Raman asociados con la hemoglobina, y que además comprende:

(d) poner en contacto el tejido con radiación electromagnética que tiene una segunda longitud de onda de excitación, donde la segunda longitud de onda de excitación es de aproximadamente 9 a 11 \mum,

y donde el tejido está en un estado lleno de sangre;

(e) recoger los espectros Raman emitidos por el tejido en respuesta a la segunda longitud de onda de excitación, donde los espectros Raman comprenden espectros Stokes y anti-Stokes;

(f) analizar los espectros recogidos en la etapa (e) para determinar los espectros asociados con la glucosa;

(g) repetir las etapas (a)-(f) mientras el tejido está en un estado vacío de sangre;

(h) determinar los espectros netos emitidos en respuesta a la primera y segunda longitudes de onda de excitación, donde los espectros netos comprenden la diferencia entre los espectros obtenidos en el estado lleno de sangre y el estado vacío de sangre;

(i) determinar el cambio de temperatura entre la temperatura, en grados Kelvin, asociada con la dispersión Raman emitida por la hemoglobina en respuesta a la primera y segunda longitudes de onda de excitación y la temperatura asociada con la dispersión Raman emitida por la hemoglobina en respuesta a la primera longitud de onda de excitación en ausencia de la segunda longitud de onda de excitación; y

(j) determinar la concentración de glucosa a partir del cambio de temperatura determinado en la etapa (i).

15. El método de la reivindicación 14, donde la concentración de glucosa se determina de acuerdo con la siguiente relación:

C_{G} = \Delta T / (C_{P}I_{G}\varepsilon_{G}\Delta t);

donde C_{G} es la concentración de glucosa;

donde C_{P} es la capacidad calorífica del tejido;

16. El método de la reivindicación 1, donde el analito es glucosa, la sonda de temperatura es hemoglobina, la primera longitud de onda de excitación es de aproximadamente 550 a 400 nm, la etapa (a) se realiza mientras el tejido está en un estado lleno de sangre, los espectros Raman recogidos comprenden espectros anti-Stokes, el análisis comprende determinar los espectros Raman asociados con la glucosa, y que además comprende:

(d) repetir las etapas (a)-(c) mientras el tejido está en un estado vacío de sangre;

(e) determinar los espectros netos emitidos en respuesta a la primera longitud de onda de excitación, donde los espectros netos comprenden la diferencia entre los espectros obtenidos en el estado lleno de sangre y el estado vacío de sangre, para obtener un valor representativo de la concentración de glucosa.

17. Un aparato para medir un analito en un tejido de un sujeto, que comprende:

(a) una primera fuente de luz (100) que emite luz que tiene una primera longitud de onda de excitación que es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción de una sonda de temperatura dentro del tejido capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman;

(b) una segunda fuente de luz (110) que emite luz que tiene una segunda longitud de onda de excitación que es sustancialmente igual a una longitud de onda de absorción del analito capaz de hacer que se produzca dispersión de resonancia Raman;

(c) un detector (120) que se dispone para recibir espectros Raman dispersados por el tejido en respuesta a la irradiación con la primera y segunda longitudes de onda de excitación y que produce señales de salida representativas de los espectros Raman dispersados;

(d) un ordenador (130) acoplado para recibir las señales de salida producidas por el detector que procesa las señales de salida para obtener un valor indicativo de la concentración de analito en el tejido a partir de una comparación de señales de salida representativas de los espectros Raman dispersados en respuesta a la primera y segunda longitudes de onda de excitación.

18. El aparato de la reivindicación 17, donde el tejido es sangre.

19. El aparato de la reivindicación 17, donde la sonda de temperatura es hemoglobina.

20. El aparato de la reivindicación 17, donde el analito es glucosa.

21. El aparato de la reivindicación 17, donde la primera longitud de onda de excitación es de aproximadamente 550 a aproximadamente 400 nm.

22. El aparato de la reivindicación 17, donde la segunda longitud de onda de excitación es de aproximadamente 0,98, aproximadamente 1,42, aproximadamente 1,89, aproximadamente 2,15 o aproximadamente 9 a aproximadamente 11 \mum.

23. El aparato de la reivindicación 17, donde el detector (120) comprende un espectrógrafo de selección de longitudes de onda y una serie de dispositivos de cargas interconectadas.

24. El aparato de la reivindicación 17, donde el ordenador (130) procesa las señales de salida de acuerdo con la siguiente relación:

C_{A} = \Delta T / (C_{P}I_{A}\varepsilon_{A}\Delta t);

donde C_{A} es la concentración de analito;

donde C_{P} es la capacidad calorífica del tejido;