ES2281463T3 - Usos de sarp-1 para el tratamiento y/o prevencion de la esclerodermia. - Google Patents

Abstract

El uso de una sustancia seleccionada a partir del grupo que consiste en: (a) SARP-1 maduro; (b) un fragmento de SARP-1 que comprende su dominio Frizzled rico en cisteína; (c) un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2; (d) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 21 a 295 de SEQ ID NO: 2; (e) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 24 a 295 de SEQ ID NO:2; (f) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 25 a 295 de SEQ ID NO: 2; (g) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 26 a 295 de SEQ ID NO: 2; (h) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 27 a 295 de SEQ ID NO: 2; (i) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 28 a 295 de SEQ ID NO 2; (j) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 37 a 295 de SEQ ID NO: 2; (k) una muteina de cualquiera de (a) a (j), en la que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 90% a al menos una de las secuencias en (c) a (j); que tiene al menos la misma actividad que la SARP-1 silvestre; (l) una muteina de cualquiera de (a) a (j) que está codificada por una secuencia de ADN que hibrida al complemento de la secuencia de ADN nativa que codifica cualquiera de (a) a (j) en condiciones moderadamente rigurosas o en condiciones altamente rigurosas; (m) una muteina de cualquiera de (a) a (j) en la que cualquier cambio de la secuencia de aminoácidos son sustituciones de aminoácido conservadoras en las secuencias de aminoácidos en (c) a (j); y (n) una sal o una isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, o fracción activa de cualquiera de (a) a (m). para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia.

Description

Uso de SART-1 para el tratamiento y/o prevención de la esclerodermia.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la esclerodermia. Más específicamente, la invención se refiere al uso de SARP-1 para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia, en particular, de la esclerosis sistémica.

Antecedentes de la invención

La esclerodermia es una enfermedad del tejido conjuctivo caracterizada por la fibrosis de la piel y de los órganos internos, conduciendo al fallo del órgano y a la muerte (Black et al., 1998; Clements y Furst, 1996). La esclerodermia tiene un espectro de manifestaciones y una variedad de implicaciones terapéuticas. Comprende la esclerodermia localizada, la esclerosis sistémica, trastornos del tipo esclerodermia, y la esclerodermia de Sine (Smith, 2000). Mientras que la esclerodermia localizada es una enfermedad dermatológica rara asociada a la fibrosis y a las manifestaciones limitadas a la piel, la esclerosis sistémica es una enfermedad multisistemática con riesgo variable en cuanto a la implicación de los órganos internos y la variación en el grado de la dermatosis. La esclerosis sistémica puede ser difusa o limitada. La esclerosis sistémica limitada se llama también CREST (calcinosis, disfunción esofágica de Raynaud, esclerodérmica, telangiectasia). Los trastornos del tipo esclerodermia, según se cree, están relacionados con la exposición ambientes industriales. En la enfermedad de Sine, hay implicación de los órganos internos sin cambios en la piel.

Las manifestaciones principales de la esclerodermia y, en particular, de la esclerosis sistémica son la inadecuada excesiva síntesis de colágeno y su deposición, disfunción endotélica, espasmos, colapso y destrucción por fibrosis.

La esclerodermia es una enfermedad rara con una incidencia estable de aproximadamente 19 casos por 1 millón de personas. La causa de la esclerodermia es desconocida. Sin embargo, la predisposición genética es importante. Las anormalidades implican la autoinmunidad y la alteración de células endotélicas y la función de los fibroblastos. En realidad, la esclerosis sistémica es probablemente la más severa de las enfermedades autoinmunes con una mortalidad del 50% a los 5 años del diagnóstico (Silman, 1991).

En términos de diagnóstico, un parámetro clínico importante es el hinchamiento de la piel proximal a las uniones metacarpofalángicas. El fenómeno de Raynaud es un componente frecuente, casi universal, de la esclerodermia. Es diagnosticado por cambios en el color de la piel bajo la exposición al frío. La isquemia y el hinchamiento de la piel son los síntomas de la enfermedad de Raynaud.

Varios procesos biológicos subyacentes están implicados en la iniciación, la severidad y la progresión de la enfermedad e incluyen la disfunción vascular, la activación y el daño de las células endoteliales, la acumulación de leucocitos, la producción de autoanticuerpos y crucialmente, una respuesta fibrótica incontrolada que puede conducir a la muerte (Clements y Furst, 1996). Los fibroblastos tienen un papel crucial en la patogénesis de esta enfermedad. Los fibroblastos primarios obtenidos a partir de pacientes con esclerodermia exhiben muchas de las propiedades características de la enfermedad vista in vivo, especialmente una mayor síntesis y deposición de matriz extracelular, especialmente de colágeno y fibronectina, y un factor del crecimiento alterado y la producción de citoquinas tales como TGF\beta y CTGF (Strehlow y Korn, 1998 y LeRoy, 1974).

No hay ningún tratamiento curativo de la esclerodermia. Una terapia innovadora, pero de alto riesgo, proponía el autotrasplante de células madres (Martini et al., 1999). En particular, no hay actualmente ningún tratamiento para la esclerodermia que aborde el proceso fibrótico (Wigley y Boling, 2000).

La identificación de los genes asociados con el riesgo de enfermedad y la progresión de la esclerodermia puede conducir al desarrollo de estrategias eficaces para la intervención en varias etapas de la enfermedad.

La SARP-1 (proteína 1 secretada relacionada con la apoptosis) es un miembro de una familia de proteínas secretadas conocidas como proteínas relacionadas Frizzled secretadas, basado en su homología al dominio rico de cisteína (dominio CRD) encontrado en la familia Frizzled de 7 receptores de transmembrana (Rattner et al., 1997). Los genes Frizzled fueron identificados originariamente en drosófila y la polaridad del tejido control (Adler et al., 1987). Las proteínas Frizzled son los receptores para la familia Wnt altamente conservada de al menos 16 moléculas de señalización secretadas que regulan interacciones célula-a-célula durante la embriogenesis (Smalley y Dale, 1999). Las ideas sobre los mecanismos de acción de Wnt han surgido a partir de varios sistemas: genética en Drosófila y C. elegans; bioquímica en cultivo celular; y expresión génica ectópica en embriones de Xenopus. Muchos genes de Wnt en ratón han sido transformados, conduciendo a defectos muy específicos del desarrollo. La ruta de señalización de Wnt que está provocada por la interacción de Wnt con proteínas Frizzled, está mediada por varios componentes de transmisión citoplásmicos, y funciona para suprimir la actividad del complejo de recambio de la multiproteína \beta-catenina, permitiendo así un aumento de la \beta-catenina citosólica que entonces entra en el núcleo y forma un complejo con TCF para activar la transcripción de genes con blanco Wnt (Miller et al., 1999; Kühe et al., 2000).

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Las interacciones Wnt-Frizzled pueden ser moduladas por la expresión restringida de proteínas de unión de Wnt distintas, las proteínas relacionadas Frizzled secretadas (sFRP). Las SFRP son capaces de unirse a Wnt a través del dominio CRD del extremo N-terminal. Por lo tanto pueden secuestrar Wnt lejos de sus receptores y antagonizar así sus efectos (Bafico et al., 1999).

Las SARP-1 se conocen bajo varios nombres alternativos, tales como SDF-5, PRO697, ATG-1622, HLHDY31, SFRP-2. Las secuencias de proteínas y/o ácidos nucleicos de longitud parcial o completa de SARP-1 murino o humano han sido descritas en varias solicitudes de patente, por ejemplo, WO 98/35043, WO 98/13493, EP 0 879887, WO 99/46281.

En términos de función, las proteínas relacionadas Frizzled secretadas (SFRP) parecen actuar como moduladores solubles de la señalización de Wnt compitiendo con receptores Frizzled de la membrana unidos para la unión de ligandos de Wnt secretados. Aparte de SARP-1, las proteínas humanas de esta familia hasta ahora conocidas comprenden SARP-2 (SFRP-1) y SARP-3 (SFRP-5). La SARP-1 murina, y SARP-2 y -3 humanas han sido descritas por tener la capacidad de sensibilizar a las células para la apoptosis o inhibir la respuesta apoptótica (Melkonyan et al., 1997). Cuando se expresan en una línea celular de adenocarcinoma de pecho, las SARP-1 de ratón y SARP-2 humanas exhibieron efectos opuestos en la sensibilidad de células frente a estímulos pro-apoptóticos. Mientras que las células con SARP-1 tenían una resistencia más alta, las células que expresaban SARP-2 fueron sensibilizadas frente a la apoptosis inducida por el factor de necrosis tumoral y la ceramida. La expresión de SARP-1 o SARP-2 modificaron los niveles intracelulares de \beta-catenina, un indicador de la transducción de la señal mediada por Wnt, sugiriendo que las SARP interferían con la ruta de señalación de Wnt-Frizzled (Melkonyan et al., 1997).

El análisis de Northern blot reveló que los genes de SARP tenían un modelo de expresión distinto (Leimeister et al., 1998). La SARP-1 existe como transcripciones de 2,2- y 1,3 kilobytes en varios tejidos humanos, con los niveles más altos en colon y el intestino delgado. Chang et al., 1999 han publicado que SARP-1 o SARP-2 son altamente expresados y preferencialmente en la retina bovina en todas partes de la capa nuclear interior. Dentro de la retina, SARP-3, o SFRP-5, se expresa específicamente en el epitelio del pigmento retinal.

Por el análisis de híbridos de células somáticas, Melkonyan et al. (1997) mapeó el gen de SARP-1 en el cromosoma humano 4. Chang et al. (1999) afinó la posición del mapa en 4q31.3 utilizando el análisis híbrido de radiación.

Hay también pruebas de montaje de que una expresión de SARP-1 alterada está asociada con el cáncer (documento WO 98/13493).

Sumario de la invención

La invención está basada en el hallazgo de un efecto beneficioso de SARP-1 en un modelo de animal establecido de esclerodermia.

Por lo tanto un primer objeto de la invención es usar SARP-1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia y, en particular, de la esclerosis sistémica. Un segundo objeto de la invención es usar células que expresan SARP-1 o un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de SARP-1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia, en particular, la esclerosis sistémica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden SARP-1 en combinación con ciertos agentes de antiesclerodermia están también en la amplitud de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la expresión de mRNA de SARP-1 en fibroblastos normales a partir de 7 pacientes enfermos de esclerodermia como se determina por análisis de filtro de genes. Se proporciona el nivel de expresión promedio para cada clase de muestras (normal o anormal) en (A) y se proporciona la mediana en (B).

La figura 2 muestra la relación de la expresión de mRNA de SARP-1 de fibroblastos enfermos/normales (número de paso bajo, <5 pasos) de 8 pacientes con esclerodermia determinados por PCR en tiempo real.

La figura 3 muestra el análisis PCR en tiempo real de la expresión de mRNA de SARP-1 en fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) en relación con la expresión de mRNA de GAPDH.

La figura 4 muestra el análisis PCR en tiempo real de la expresión de mRNA de SARP-1 en biopsias de la piel humanas clínicamente normales (n=6) comparado con biopsias de la piel anormales de pacientes con esclerodermia (n=2) en relación con GAPDH.

La Figura 5 A y B son contiguas y muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de cDNA de SARP-1. Las posiciones de división predichas para el péptido señal son indicadas por flechas.

La figura 6 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de SARP-1 humanas y murinas. Se destacan los restos no idénticos entre las dos secuencias (gris).

La figura 7 muestra el nivel de apoptosis en células transfectadas de SARP-1 y transfectadas de simulación comparado con controles. *** es una reducción estadísticamente significativa.

La figura 8 muestra el efecto del tratamiento de SARP-1 sobre la actividad de MMP-1 total en medio acondicionado cultivado a partir de cultivos de fibroblasto dérmicos humanos. Los fibroblastos fueron derivados a partir de individuos de tejido enfermo (A, D, F) o sano (B, C), o a partir de áreas no enfermas de un paciente con esclerodermia (E).

La figura 9 muestra el efecto de cotransfección de SARP-1 sobre la actividad del promotor de colágeno en células NIH3T3 no estimuladas y estimuladas con TGF\beta. (A) indica las unidades de luminescencia medidas en el ensayo de reportero, (B) proporciona el porcentaje de luminescencia con respeto al control.

La figura 10 muestra el recuento de fibrosis por pulmón en un modelo de fibrosis pulmonar inducido por bleomicina. Se muestran los recuentos medidos en ratones que han recibido vehículo, células transfectadas con SARP-1, células transfectadas de simulación o terapia anti-TGF. *** es una reducción estadísticamente significativa.

Descripción de la invención

Conforme a la presente invención se ha encontrado que la expresión de la proteína secretada SARP-1 es considerablemente inferior en fibroblastos enfermos derivados a partir de pacientes con esclerodermia según se compara con células controlar. La tecnología de micromatriz de filtro de genes de ADN ha sido usada para identificar genes expresados diferencialmente en fibroblastos de la piel aislados a partir de lesiones fibróticas obtenidas a partir de pacientes con esclerodermia comparado con fibroblastos aislados a partir de áreas clínicamente no afectadas de la piel de los mismos pacientes. La expresión de SARP-1 fue desregulada en los fibroblastos lesionales en 5 de los 7 pacientes analizados. Además de esto, el análisis RT-PCR a tiempo real del ARN total aislado a partir de las muestras enteras de biopsia de piel anormal de pacientes con esclerodermia indicó niveles inferiores de mRNA de SARP-1 comparado con la biopsias de control compatibles en edad, sexo y anatomía clínicamente normales.

En apoyo de los resultados anteriores, un método estadístico que compara los niveles de expresión de todos los genes contenidos en la micromatriz de filtro de genes indicó que la desregulación de SARP-1 tenía una probabilidad del 95% de estar asociada con las lesiones fibróticas en los pacientes, sugiriendo una asociación con la progresión clínica de la enfermedad.

El efecto beneficioso de SARP-1 en la esclerodermia fue confirmado en un modelo murino de esclerodermia bien establecido, el modelo de fibrosis pulmonar inducido por bleomicina. En este modelo, la administración de células que expresaban SARP-1 reducía considerablemente la proporción de fibrosis pulmonar.

Por lo tanto, la invención se refiere al uso de SARP-1 maduro en sí mismo o a cualquier fragmento de SARP-1 que comprenda el dominio Frizzled rico en cisteína para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia.

Un receptor que ha sido sugerido para SARP-1 es la proteína wnt, que se une supuestamente al dominio Frizzled rico en cisteína (frz) de SARP-1 (Lin et al., 1997). La sustancia de acuerdo con la invención también puede ser por lo tanto un fragmento de SARP-1 que comprenda su dominio Frizzled rico en cisteína.

Preferiblemente, la sustancia usada para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia se selecciona a partir del grupo que consiste en:

(a) SARP-1 maduro;

(b) un fragmento de SARP-1 que comprende su dominio Frizzled rico en cisteína;

(c) un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2;

(d) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 21 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(e) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 24 a 295 de SEQ ID NO:2;

(f) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 25 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(g) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 26 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(h) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 27 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(i) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 28 a 295 de SEQ ID NO 2;

(j) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 37 a 295 de SEQ ID NO: 2;

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(k) Una muteina de cualquiera de (a) a (j), en la que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 90% a al menos una de las secuencias en (c) a (j); que tiene al menos la misma actividad que la SARP-1 silvestre;

(l) una muteina de cualquiera de (a) a (j) que está codificada por una secuencia de ADN que hibrida al complemento de la secuencia de ADN nativa que codifica cualquiera de (a) a (j) en condiciones moderadamente rigurosas o en condiciones altamente rigurosas;

(m) una muteina de cualquiera de (a) a (j) en la que cualquier cambio de la secuencia de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos conservadoras en las secuencias de aminoácidos en (a) a (j); y

(n) una sal o una isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, o fracción activa de cualquiera de (c) a (m).

El cDNA de longitud completa de SARP-1 humano ha sido clonado y se representa en la figura 5 así como la SEQ ID NO: 1 del listado de secuencia adjunto. Se proporciona la secuencia de aminoácidos correspondiente en la figura 5 y la SEQ ID NO: 2 del listado de secuencia adjunto. Como se muestra en los ejemplos siguientes, se ha encontrado que el extremo N-terminal de SARP-1 es altamente heterólogo. El péptido señal de SARP-1 se ha predicho que atraviesa desde los aminoácidos 25 a 295 de SEQ ID NO: 2 o desde los aminoácidos 21 a 295. Las secuencias del extremo N-terminal de SARP-1 recombinante humano purificado expresadas en células HEK 293 han revelado otras secuencias del extremo N-terminal que conducen a la SARP-1 madura empezando en los aminoácidos 24, 25, 26, 27, 28 ó 37 de la SEQ ID NO: 2.

El término "SARP-1", como se usa en este documento, se refiere a algunas o todas las sustancias consideradas anteriormente en de (a) y (c) a (n).

La expresión "tratamiento y/o prevención" como se usa en este documento abarca cualquier atenuación, reducción, o prevención parcial, sustancial o completa o bloqueo de la formación de la enfermedad, desarrollo, progresión o de la formación, desarrollo o progresión de algunos o varios o todos los síntomas de la enfermedad.

El término "esclerodermia" como se usa en este documento comprende la esclerodermia en cualquier clasificación y definición, así como uno o varios de los síntomas de la esclerodermia, como se describe detalladamente en la introducción. El término "esclerodermia" además se refiere a las enfermedades conocidas que se asocian a la esclerodermia, tales como las descritas en el documento de Smith (2000), por ejemplo, que se incorpora totalmente como referencia en este documento.

Otras enfermedades o trastornos tratables con SAPR-1 comprenden enfermedades de cicatrización, en particular, cicatrización en el pulmón, comprendiendo la inflamación crónica del pulmón y en última instancia la fibrosis o la cicatrización de superficies pulmonares. Los trastornos que implican la inflamación del pulmón comprenden, por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopática, sarcoidosis, displasia broncopulmonar, ARDS fibroproliferativa, así como manifestaciones pulmonares o enfermedades sistémicas tales como la artritis reumatoide (Krein et al., 2001).

El término "esclerodermia" se refiere preferiblemente a la esclerodermia localizada, sistémica, limitada y difusa así como a síndromes mixtos.

La esclerodermia localizada afecta principalmente a la piel, aunque también puede afectar a los músculos subyacentes y a los huesos. Sin embargo, no afecta a los órganos internos. La esclerodermia localizada es relativamente suave, y puede estar relacionada con la esclerodermia sistémica en términos de síntomas superficiales similares, tal como el aspecto de la biopsia de la piel bajo el microscopio.

La esclerodermia sistémica comprende varios tipos de síntomas o grupos de síntomas, tales como CREST, limitada y difusa. También se conoce a la esclerodermia sistémica como la esclerosis sistémica. También puede llamarse esclerosis sistémica progresiva, o esclerosis sistémica progresiva familiar. La esclerodermia sistémica puede, por ejemplo, afectar a la piel, vasos sanguíneos, y/o órganos internos. Cuando afecta a la piel, puede hacer que la piel se endurezca, más comúnmente en las manos y/o en la cara. Cuando afecta a los vasos sanguíneos, puede causar la enfermedad de Raynaud. Las formas más graves de la esclerosis sistémica afecta a los órganos internos, y pueden causar incapacidad o hasta la muerte. Entre otros, la esclerosis sistémica comprende: enfermedad pulmonar esclerodérmica, crisis renal esclerodérmica, manifestaciones cardíacas, debilidad muscular incluyendo fatiga o CREST limitada, dismovilidad gastrointestinal y espasmos, y anormalidades en el sistema nervioso central, periférico y autonómico. Con respeto a las anormalidades del sistema nervioso, el síndrome de túnel carpiano seguido de la neuralgia de trigémino son las más comunes.

La esclerodermia limitada puede limitarse a las manos, aunque la cara y el cuello también puedan estar implicados.

La esclerodermia difusa comprende la constricción de la piel y también ocurre por encima de las muñecas (o codos). Hay varias subcategorías de esclerosis sistémica difusa, tales como la "esclerodermia Sine esclerodermia" en la que hay fibrosis de órganos internos, pero no ocurre ninguna constricción de la piel; y la esclerosis sistémica progresiva familiar, una forma rara que ocurre en familias.

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Los síndromes mixtos se refieren a si un paciente con esclerodermia también tiene otra enfermedad autoinmune (tal como lupus, artritis reumatoide, etc.), como, por ejemplo, en la esclerodermia difusa mixta con lupus. Los síntomas de la esclerodermia también pueden ser parte de una enfermedad del tejido conjuctivo mixta (MCTD), o enfermedad del tejido conjuctivo indiferenciada (UCTD).

El término "SARP-1" como se usa en este documento, se refiere a una proteína que comprende todo o una parte de la secuencia de SEQ ID NO: 2 (humana) o SEQ ID NO: 5 (murina) del listado de secuencias incluido, independientemente de la designación de tal proteína, incluyendo, pero no limitado a las denominaciones más conocidas SDF-5, PRO697, ATG-1622, HLHDY31, SFRP-2 o FRP-2, así como a las sales, isoformas, muteinas, fracciones activas, y sus derivados funcionales.

Preferiblemente, el término "SARP-1" se refiere a una proteína madura que carece del péptido señal. El péptido señal se predice que contenga los primeros 20 o los primeros 23, 24, 25, 26, 27 ó 36 aminoácidos de SARP-1 como se define en la SEQ ID NO: 2, lo que significa que la proteína madura comprendería los aminoácidos de 21 a 295 o de 24, 25, 26, 27, 28 ó 37 a 295 de SEQ ID NO: 2.

Como se muestra en la figura 6 más abajo, la secuencia de aminoácidos humana de SARP-1 es altamente homóloga con la secuencia murina (SEQ ID NO: 5). Por lo tanto, también puede usarse SARP-1 murino de acuerdo con la invención, así como proteínas derivadas de otras especies, siempre que haya una identidad suficientemente alta entre las proteínas para permitir que la proteína exhiba su actividad biológica, y sin provocar una respuesta inmune sustancial en un ser humano.

El término "SARP-1" se refiere además a cualquier fragmento, parte, dominio o subdominio de SEQ ID NO: 2 ó 5 que muestra la actividad deseada en esclerodermia. Pueden usarse fragmentos proteicos o uno o varios dominios de la proteína de acuerdo con la invención, siempre que exhiban algún efecto beneficioso sobre la esclerodermia, siendo preferible un efecto al menos comparable con la proteína de longitud completa. El efecto beneficioso puede ser medido en uno de los análisis in vitro o in vivo descritos en los ejemplos siguientes, o en cualquier otro ensayo adecuado para demostrar un efecto en la esclerodermia. Por ejemplo, SARP1 comprende un dominio Frizzled rico en cisteína, y un dominio tipo netrina, también llamado módulo de NTR, que es homólogo a los inhibidores de tejido de metaloproteinasas (TIMP) (Banyai y Patthy, 1999). Por lo tanto, son fragmentos preferidos un fragmento que comprenda el dominio Frizzled de SARP-1, o un fragmento que comprenda el módulo de NTR de acuerdo con la invención.

Conforme a la presente invención, SARP-1 puede ser una proteína que se de naturalmente, es decir nativa, o una proteína recombinante. La producción recombinante puede ser llevada a cabo en células eucariotas, tales como células de levadura o células CHO, en células de fibroblasto humanas o líneas celulares. Además puede ser producido en células procariotas tales como E. coli.

Preferiblemente, SARP-1 está glicosilado en uno o varios sitios. También puede no estar glicosilado, dependiendo de las necesidades dadas y de la fuente de producción o del aislamiento de la proteína.

El término "sales" se refiere en este documento a ambas sales de grupos carboxilo y a las sales de adición ácidas de los grupos amino de la molécula SARP-1 o sus análogos. Las sales de un grupo carboxilo pueden formarse por medios conocidos en la técnica e incluir sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, férrico o cinc, y similares, y sales con bases orgánicas tales como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y otras similares. Las sales de adición ácidas incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Por supuesto, cualquier tal sal debe conservar la actividad biológica de SARP-1 relevante para la presente invención, es decir, para ejercer un efecto beneficioso sobre la esclerodermia.

Los isoformas o variantes de empalme de SARP-1 también pueden usarse de acuerdo con la invención, siempre que sean capaces de inhibir la progresión de la enfermedad de esclerodermia y/o los síntomas de aquella enfermedad. Las dos transcripciones de 1,3 kilobytes y de 2,2 kilobytes encontradas que se expresan diferencialmente en tejidos humanos pueden representar, por ejemplo, isoformas diferentes de SARP-1, que podrían ser útiles de acuerdo con la invención.

Como se usa en este documento, el término "muteinas" se refiere a análogos de un SARP-1, en el que uno o varios de los restos de aminoácidos de un SARP-1 natural son sustituidos por restos de aminoácidos diferentes, o son suprimidos, o uno o varios restos de aminoácidos son añadidos a la secuencia natural de SARP-1, teniendo preferiblemente al menos la misma actividad que SARP-1 silvestre o teniendo hasta una actividad mucho más potente. Estas muteinas se preparan por síntesis conocidas y/o por técnicas de mutagénesis dirigida, o cualquier otra técnica conocida asociada adecuada.

Cualquier tal muteina tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos suficientemente copiable a la de SARP-1, como se describe en la SEQ ID NO: 2, tal que tiene al menos una actividad sustancialmente similar a SARP-1. La actividad de un mutante de SARP-1 puede ser analizada por ensayos conocidos en la técnica, y en particular utilizando los ensayos explicados en los ejemplos de más abajo. La medición de la cantidad de síntesis de colágeno (ejemplo 7) en fibroblastos es una prueba adecuada para evaluar la actividad de muteinas de SARP-1, por ejemplo.

Las muteinas conforme a la presente invención incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como un ADN o ARN, que se hibrida al ADN o al ARN, que codifica SARP-1, conforme a la presente invención, en condiciones rigurosas. La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones de hibridación y de lavado subsecuentes, que los expertos ordinarios en la técnica llaman de manera convencional "rigurosas". Véase Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", supra, Interscience, N. Y., 6.3 y 6.4 (1987, 1992), y Sambrook et al. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Sin restricción, los ejemplos en condiciones rigurosas incluyen condiciones de lavado de 12-20ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido bajo estudio en, por ejemplo, 2 x SSC y SDS del 0,5% durante 5 minutos, 2 x SSC y SDS del 0,1% durante 15 minutos; 0,1 x SSC y SDS del 0,5% a 37ºC durante 30-60 minutos y luego, 0,1 x SSC y SDS del 0,5% a 68ºC durante 30-60 minutos. Los expertos ordinarios en esta técnica sobrentienden que las condiciones de rigurosidad también dependen de la longitud de las secuencias de ADN, sondas de oligonucleótido (tales como 10-40 bases) o sondas de oligonucleótido mezcladas. Si se usan sondas mezcladas, es preferible usar cloruro de tetrametil-amonio (TMAC) en vez de SSC. Véase Ausubel, supra.

Cualquier tal muteina tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos suficientemente copiable de la de SARP-1, tal que tiene una actividad biológica sustancialmente similar, o aún mejor, como la de SARP-1.

Una actividad fácilmente medible de SARP-1 es su capacidad de reducir la síntesis de colágeno. Un ensayo para medir esta actividad se describe detalladamente en el ejemplo 6 más abajo. Siempre que la muteina tenga una actividad reductora de colágeno sustancial, puede considerarse que tiene una actividad sustancialmente similar a la de SARP-1. Así, puede ser determinado si una muteina dada tiene, al menos sustancialmente, la misma actividad que SARP-1 mediante la experimentación rutinaria que comprende someter a tal muteina, por ejemplo, a un ensayo simple como se describe en el ejemplo 7.

En una realización preferida, cualquier tal muteina tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia de SEQ ID NO: 2 del listado de secuencia adjunto.

La identidad refleja una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, determinadas comparando las secuencias. En general, la identidad se refiere a un nucleótido exacto al nucleótido o aminoácido al aminoácido correspondiente de los dos polinucleótidos o de las dos secuencias de polipéptidos, respectivamente, siendo comparadas respecto a la longitud de las secuencias.

Para secuencias donde no haya ninguna correspondencia exacta, puede ser determinada una "identidad en %". En general, las dos secuencias que se comparan se alinean para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir insertar "huecos" en una o en ambas secuencias, para realzar el grado de alineación. Una identidad en % puede ser determinada respecto a la longitud entera de cada una de las secuencias que se comparan (la denominada alineación global), que es particularmente adecuada para las secuencias de la misma longitud o muy similar, o respecto a longitudes definidas más cortas, (la denominada alineación local), que es más adecuada para las secuencias de longitud desigual.

Los métodos para comparar la identidad y la homología de dos o más secuencias son conocidos en la técnica. Así, por ejemplo, pueden usarse programas disponibles en el Paquete de Análisis de Secuencias Wisconsin, versión 9.1 (Devereux J, et al. 1984), por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, para determinar la identidad en % entre dos polinucleótidos y la identidad en % y la homología en % entre dos secuencias de polipéptidos. El BESTFIT usa el algoritmo de la "homología local" de Smith y Waterman (1981) y encuentra la mejor región única de semejanza entre dos secuencias. También se conocen otros programas para determinar la identidad y/o la semejanza entre secuencias en la técnica, por ejemplo, la familia de programas BLAST (Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, accesible a través de la página de inicio del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson
1988).

Las muteinas de SARP-1, que pueden ser usadas conforme a la presente invención, o los ácidos nucleicos que las codifican, incluyen un grupo finito de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos de sustitución o polinucleótidos que pueden ser obtenidos rutinariamente por un experto ordinario en la técnica, sin una experimentación excesiva, basado en las enseñanzas y la guia presentada en este documento.

Cambios preferidos para las muteinas conforme a la presente invención son los conocidos como sustituciones "conservadoras". Las sustituciones de aminoácidos conservadoras de polipéptidos o proteínas de SARP-1, pueden incluirse aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoquímicas suficientemente similares a la sustitución entre miembros del grupo, conservarán la función biológica de la molécula (Grantham, 1974). Es claro que las inserciones y las deleciones de aminoácidos también pueden ser hechas en las secuencias definidas anteriormente sin cambiar su función, particularmente si las inserciones o deleciones sólo implican unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta, y preferiblemente menos de diez, y no eliminan ni desplazan los aminoácidos que son críticos a una conformación funcional, por ejemplo, restos de cisteína. Las proteínas y muteinas producidas por tales deleciones y/o inserciones vienen dentro del articulado de la presente invención.

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Preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla I. Más preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla II; y más preferiblemente los grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la Tabla III.

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TABLA I Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos

1

TABLA II Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos

2

TABLA III Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos

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3

Los ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en las proteínas que pueden ser usados para obtener las muteinas de polipéptidos o proteínas SARP-1, para uso en la presente invención incluyen cualquier etapa conocida del método, tal como se presenta en las patentes de EE.UU. 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, Mark et al.; 5.116.943 de Koths et al., 4.965.195 de Namen et al.; 4.879.111 de Chong et al.; y 5.017.691 de Lee et al.; y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de EE.UU. Nº. 4.904.584 (Shaw et al.).

La expresión "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende SARP-1, o su muteina, fusionado con otra proteína, que, por ejemplo, tiene un mayor tiempo de residencia en fluidos corporales. Las proteínas de fusión que comprenden todo o una parte funcional de SARP-1 fusionadas a todo o a una parte funcional de una proteína capaz de mejorar las actividades biológicas de la molécula, como la semivida en el cuerpo humano, por ejemplo, son preferidas de acuerdo con la invención. En una realización preferida la proteína fusionada comprende una fusión de inmunoglobulina (Ig). Las proteínas de fusión que comprenden todo o parte de SARP-1 fusionado a todo o parte de una inmunoglobulina son altamente preferidas. Pueden ser monoméricas o multiméricas, hetero- o homo-multiméricas. Ventajosamente, la proteína fusionada comprende la región constante de una inmunoglobulina, en particular, de la parte Fc de la inmunoglobulina. Las realizaciones en las cuales la inmunoglobulina es del isotipo IgG1 o IgG2 son más preferidas de acuerdo con la invención.

La SARP-1 puede ser así fusionada a otra proteína, polipéptido o similar, por ejemplo, a una inmunoglobulina o su fragmento. La fusión puede ser directa, o vía un péptido enlazador corto que puede ser tan corto como de 1 a 3 restos de aminoácidos en longitud o más largo, por ejemplo, de 13 restos de aminoácidos en longitud. Dicho enlazador puede ser un tripéptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una secuencia enlazadora de 13 aminoácidos que comprenda Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introducida entre la secuencia de SARP-1 y la secuencia de la inmunoglobulina.

"Derivados funcionales" como se usan en este documento cubren los derivados de SARP-1, y sus muteinas y proteínas fusionadas, que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que se dan como cadenas laterales sobre los restos o los grupos del extremo N- o C-terminal, por medios conocidos en la técnica, y están incluidos en la invención siempre que permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad de la proteína que es al menos sustancialmente similar a la actividad de SARP-1, y que no confieran propiedades tóxicas en las composiciones que los contienen. Por lo tanto, en una realización preferida el derivado funcional comprende al menos un resto unido a uno o varios grupos funcionales que se dan como una o varias cadenas laterales en los restos de aminoácidos.

Conforme a la presente invención, las cadenas laterales de polietilenglicol (PEG) son restos altamente preferidos. Las cadenas laterales de PEG pueden enmascarar los sitios antigénicos y ampliar la residencia de la sustancia a la que ellos están unidos en los fluidos corporales. Otros derivados incluyen ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los restos de aminoácidos formados con restos acilo (por ejemplo, grupos alcanoílo o aroilo carbocíclicos) o los derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de restos serilo o treonilo) formados con restos acilo.

Las "fracciones activas" de SARP-1 y sus muteinas y proteínas fusionadas, cubren cualquier fragmento o precursores de la cadena de polipéptido de la molécula proteica sola o junto con moléculas asociadas o restos unidos a ello, por ejemplo, restos de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula proteica o los restos de azúcar por sí mismos, a condición de que dicha fracción activa tenga al menos una actividad sustancialmente similar a la de
SARP-1.

La invención además se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia, en el que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en:

(a) SARP-1 maduro;

(b) un fragmento de SARP-1 que comprende su dominio Frizzled rico en cisteína;

(c) un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2;

(d) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 21 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(e) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 24 a 295 de SEQ ID NO:2;

(f) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 25 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(g) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 26 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(h) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 27 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(i) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 28 a 295 de SEQ ID NO 2;

(j) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 37 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(k) Una muteina de cualquiera de (a) a (j), en la que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 90% a al menos una de las secuencias en (c) a (j); que tiene al menos la misma actividad que la SARP-1 silvestre;

(l) una muteina de cualquiera de (a) a (j) que está codificada por una secuencia de ADN que se hibrida al complemento de la secuencia de ADN nativa que codifica cualquiera de (a) a (j) en condiciones moderadamente rigurosas o en condiciones altamente rigurosas;

(m) una muteina de cualquiera de (a) a (j) en el que cualquier cambio de la secuencia de aminoácidos son sustituciones de aminoácido conservadoras en las secuencias de aminoácidos en (c) a (j);

(n) una sal o una isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, o fracción activa de cualquiera de (a) a (m).

Conforme a la presente invención, también puede ser administrada SARP-1 al cuerpo humano en forma de un vector que comprenda dicha molécula de ácido nucleico. Por lo tanto, la invención se refiere además al uso de un vector que comprenda dicha molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia. Preferiblemente, el vector es un vector de expresión, que comprende a un promotor operativamente unido a todo o parte de la secuencia de codificación de SARP-1. En una realización más preferida, el vector es un vector de terapia génica. Se conocen vectores de terapia génica en la técnica, la mayor parte de ellos son vectores viralmente derivados, tales como los vectores adenovirales o lentivirales.

De acuerdo con la invención, también puede ser administrada SARP-1 al cuerpo humano en la forma de células que producen y/o secretan SARP-1. Por lo tanto, la invención además se refiere al uso de una célula que exprese SARP-1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia, es decir, la terapia celular para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia. La célula puede ser una célula que produzca naturalmente SARP-1 y/o transfectada que produzca SARP-1 recombinante. Son preferidas las células que expresan y secretan altas cantidades de la proteína, tal como células que sobreexpresen que lleven altos números de copia de un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica SARP-1.

Como los fibroblastos representan la maquinaria de la fibrosis, son las células más adecuadas para la terapia de esclerodermia y anti-fibrótica. Por lo tanto, preferiblemente, los fibroblastos que expresan SARP-1 son usados conforme a la presente invención.

La invención además se refiere al uso de una célula que comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica todo o parte de SARP-1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia. El uso de una célula que haya sido modificada genéticamente para producir un polipéptido de acuerdo con la invención está también en la amplitud de la presente invención.

El uso de un vector de expresión para inducir y/o realzar la producción endógena de SARP-1 en una célula normalmente silente o que exprese cantidades del inhibidor que no sean suficientes, también se contempla de acuerdo con la invención. Así, la invención hace uso de una tecnología conocida como activación génica endógena (EGA) para la producción de la proteína deseada.

La esclerosis sistémica es una de las enfermedades más serias dentro de la esclerodermia, que conducen a menudo a la incapacidad y la muerte. Por lo tanto, una realización más preferida de la invención se refiere a la esclerosis sistémica, que es una indicación dentro de la enfermedad de esclerodermia, que se caracteriza principalmente por la participación de órganos internos, como se describe antes detalladamente.

Varios tratamientos de combinación pueden ser contemplados, preferiblemente:

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Interferón, en particular, interferón-\beta

\bullet

un antagonista del factor de necrosis tumoral (TNF), en particular, TBPI y/o TBP II

\bullet

otro agente antiesclerodermia

\bullet

un agente antiesclerodermia seleccionado a partir del grupo que consiste en inhibidores de ACE, bloqueantes del canal de calcio, inhibidores de la bomba de protón, NSAID, inhibidores de COX, corticosteroides, tetraciclina, pentoxifilina, bucilamina, inhibidores de geranilgeranilo transferasa, rotterlin, inhibidores de prolil-4-hidroxilasa, inhibidores de c-proteinasa, inhibidores de lisil-oxidasa, relaxin, halofuginona, prostaglandinas, prostaciclinas, endotelina-1, óxido nítrico, inhibidores de angiotensina II y antioxidantes.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una sustancia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en combinación con un agente antiesclerodermia seleccionado a partir del grupo que consiste en inhibidores de ACE, bloqueantes del canal de calcio, inhibidores de la bomba de protón, NSAID, inhibidores de COX, corticosteroides, tetraciclina, pentoxifilina, bucilamina, inhibidores de geranilgeranil-transferasa, rotterlin, inhibidores de prolil-4-hidroxidasa, inhibidores de c-proteinasa, inhibidores de lisil-oxidasa, relaxina, halofuginona, prostaglandinas, prostaciclinas, endotelina-1, óxido nítrico, inhibidores de angiotensina II y antioxidantes.

Todos los tratamientos son requeridos para uso simultáneo, secuencial o separado.

Aunque no haya en este momento ninguna cura para la esclerodermia, se usan varios agentes o tratamientos en la actualidad para tratar los síntomas de la esclerodermia. Tales agentes anti-esclerodermia, que pueden ser usados como una terapia de combinación de acuerdo con la invención, son resumidos, por ejemplo, en Leighton (2001) o Wigley y Sule (2001), que se incorporan totalmente como referencia en este documento.

Predominantemente se sabe que los interferones tienen efectos inhibitorios en la replicación viral y la proliferación celular. El interferón-\gamma, por ejemplo, juega un papel importante en la promoción de respuestas inmunes e inflamatorias. El interferón \beta (IFN-\beta, un interferón tipo1), como se dice, juega un papel antinflamatorio.

SARP-1 podría ser usado en combinación con un antagonista de TNF. Los antagonistas de TNF ejercen su actividad de varios modos. Primero, los antagonistas pueden unirse o secuestrar la molécula de TNF por sí mismo con afinidad suficiente y especificidad para neutralizar parcialmente o sustancialmente el epítopo de TNF o los epítopos responsables de la unión del receptor de TNF (en lo sucesivo en este documento llamado "antagonistas secuestrantes"). Un antagonista secuestrante puede ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra TNF.

De forma alternativa, los antagonistas de TNF pueden inhibir la ruta de señalización de TNF activada por el receptor de membrana celular después de la unión de TNF (en lo sucesivo en este documento llamados "antagonistas de señalización"). Los antagonistas de TNF son identificados y evaluados fácilmente por un rastreo de rutina de candidatos por su efecto en la actividad de TNF natural sobre líneas celulares susceptibles in vitro, por ejemplo células B humanas, en las cuales el TNF causa la proliferación y la secreción de inmunoglobulina. El ensayo contiene la formulación de TNF en diluciones variables de antagonista candidato, por ejemplo, de 0,1 a 100 veces la cantidad molar de TNF usada en el ensayo, y controles sin TNF o sólo antagonista (Tucci et al., 1992).

Los antagonistas secuestrantes son los antagonistas de TNF preferidos que se usan de acuerdo con la presente invención. Entre los antagonistas secuestrantes, los polipéptidos que se unen a TNF con alta afinidad y que poseen una inmunogenicidad baja son los preferidos. Las moléculas del receptor de TNF solubles y los anticuerpos neutralizantes de TNF son particularmente preferidos. Por ejemplo, las formas solubles de TNF-RI (p55) y TNF-RII (p75) son útiles en la presente invención. Las formas truncadas de estos receptores, que comprenden los dominios extracelulares de los receptores o sus partes funcionales, son las preferidas, más particularmente los antagonistas de acuerdo con la presente invención. Receptores de TNF tipo-I y tipo-II solubles truncados se describen en el documento EP914431, por ejemplo.

Las formas truncadas de los receptores de TNF son solubles y han sido detectadas en la orina y el suero como proteínas de unión inhibitorias de TNF de aproximadamente 30 kDa o 40 kDa, que se llaman TBPI y TBPII, respectivamente (Engelmann et al., 1990). El uso simultáneo, secuencial, o separado de SARP-1 con el antagonista de TNF y/o un interferón es el preferido, de acuerdo con la invención.

TBPI y TBPII son los antagonistas de TNF preferidos que se usan en combinación con una SARP-1. Los derivados, fragmentos, regiones y las partes biológicamente activas de las moléculas del receptor imitan funcionalmente a las moléculas del receptor que también pueden ser usadas. Tal equivalente biológicamente activo o derivado de la molécula de receptor se refiere a la parte de polipéptido, o de la secuencia que codifica la molécula del receptor, que es de tamaño suficiente y capaz de unirse al TNF con tal afinidad que la interacción con el receptor de TNF unido a la membrana es inhibida o bloqueada.

El TNF-RI soluble humano (TBPI) puede ser el antagonista de TNF que se use. Las moléculas del receptor de TNF naturales y recombinantes solubles y los métodos de su producción han sido descritos en las patentes europeas EP 308378, EP 398327 y EP 433900.

Aunque puede ser beneficioso bloquear el TNF-\alpha en las primeras etapas de la enfermedad, se ha mencionado que en las últimas etapas, el TNF por sí mismo puede ejercer un efecto beneficioso sobre la esclerodermia (Abraham et al., 2000). La combinación de SARP-1 y TNF-\alpha para el tratamiento o la prevención de la esclerodermia, en particular, en las etapas avanzadas de la enfermedad, por lo tanto, también se menciona.

Se conocen inhibidores de COX en la técnica. Inhibidores de COX-2 específicos se describen en el documento WO 01/00229, por ejemplo.

Una composición farmacéutica que comprende SARP1, opcionalmente junto con uno o varios vehículos farmacéuticamente aceptables, diluyentes o excipientes, puede ser usada para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia, en particular, la esclerosis sistémica. La composición farmacéutica puede comprender además cualquiera de los otros componentes identificados anteriormente y, en particular, un interferón, un inhibidor de TBP o COX.

La composición farmacéutica también puede comprender un vector que comprenda una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, o una célula que exprese SARP-1.

Los ingredientes activos de los agentes farmacéuticos, es decir, los polipéptidos, ácidos nucleicos o células, o sus combinaciones, así como las combinaciones de las sustancias mencionadas anteriormente, pueden ser administrados a un individuo de muchas maneras. Las rutas de administración incluyen rutas intradérmica, transdérmica (por ejemplo, en formulaciones de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural, tópica, e intranasal. Cualquier otra ruta terapéuticamente eficaz de administración puede ser usada, por ejemplo la absorción por tejidos epiteliales o endoteliales o por terapia génica en la que una molécula de ADN que codifica al agente activo es administrada al paciente (por ejemplo, vía un vector) que hace que el agente activo sea expresado y se secrete in vivo. Además, la(s) proteína(s) de acuerdo con la invención puede(n) ser administrada(s) junto con otros componentes de agentes biológicamente activos tales como tensioactivos, excipientes, vehículos, diluyentes y vehículos farmacéuticamente aceptables.

La definición de "farmacéuticamente aceptable" se propone para abarcar a cualquier vehículo, que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que no sea tóxico para un huésped al cual sea administrado. Por ejemplo, para la administración parenteral, la(s) proteína(s) activa(s) puede(n) ser formulada(s) en una forma de dosificación unitaria para la inyección en vehículos tales como una solución salina, solución de dextrosa, albúmina de suero y solución de Ringer.

Para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), la(s) proteína(s) activa(s) puede(n) ser formulada(s) como una solución, suspensión, emulsión o pueden estar liofilizadas en polvo en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua, solución salina, solución de dextrosa) y aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o estabilizadores químicos (por ejemplo, conservantes y tampones). La formulación se esteriliza por técnicas comúnmente usadas.

La biodisponibilidad de la(s) proteína(s) activa(s) de acuerdo con la invención también puede(n) ser mejorada(s) usando procedimientos de conjugación que aumenten la semivida de la molécula en el cuerpo humano, por ejemplo, uniendo la molécula al polietilenglicol, como se describe en la solicitud de patente PCT WO 92/13095.

La cantidad terapéuticamente eficaz de la(s) proteína(s) activa(s) será una función de muchas variables, incluyendo el tipo de receptor, la afinidad de la sustancia de acuerdo con la invención a su receptor, cualquier actividad citotóxica residual exhibida con ella, la ruta de administración, la condición clínica del paciente.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es tal que cuando se administra, la sustancia de acuerdo con la invención causa la activación del receptor de SARP-1, o la inactivación de un ligando que estimula al receptor in vivo. La dosificación administrada, como dosis solas o múltiples, a un individuo variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo las propiedades farmacocinéticas de SARP-1, la ruta de administración, condiciones del paciente y características (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), grado de los síntomas, tratamientos simultáneos, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de intervalos de dosificación establecidos están bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

La dosis del polipéptido de acuerdo con la invención requerida variará de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg o de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg o de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg o de aproximadamente 1 a 3 mg/kg, aunque como se dice anteriormente esto esté sometido a mucha discreción terapéutica.

Por lo general las dosis diarias se proporcionan en dosis divididas o en formas de liberación sostenida eficaces para obtener los resultados deseados. Las administraciones segundas o subsecuentes pueden ser realizadas en una dosificación, que sea igual, menor o mayor que la dosis inicial o una dosis previa administrada al individuo. Una administración segunda o subsecuente puede ser administrada durante o antes del inicio de la enfermedad.

El vector de expresión puede ser administrado sistémicamente. Preferiblemente el vector de expresión se administra por inyección intramuscular. Una ruta de administración más preferida es la inhalación, en particular, si la fibrosis pulmonar está implicada en la enfermedad.

La referencia a etapas de método conocidas, etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es de ningún modo una admisión de que cualquier aspecto, descripción o realización de la presente invención sea descrito, enseñado o sugerido en la técnica relevante.

La descripción precedente de las realizaciones específicas revelarán totalmente la naturaleza general de la invención que otros pueden, aplicando el conocimiento de los expertos en la técnica (incluyendo el contenido de las referencias citadas en este documento), modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones de tales realizaciones específicas, sin una experimentación excesiva, sin abandonar el concepto general de la presente invención. Por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones son requeridas para que estén dentro del significado de un rango de equivalentes de las realizaciones descritas, basadas en la enseñanza y la guía presentada en este documento. Debe ser entendido que la fraseología o la terminología en este documento tienen el objeto de una descripción y no de limitar, tal que la terminología o la fraseología de la memoria descriptiva presente deben ser interpretadas por el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas y la guía presentadas en este documento, en combinación con el conocimiento de un experto ordinario en la técnica.

Habiendo descrito así la invención, será entendida más fácilmente por los ejemplos siguientes que son proporcionados para su ilustración y que no son requeridos para limitar la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 SARP-1 se expresa diferencialmente en fibroblastos de la piel de pacientes con esclerodermia Métodos Muestras de paciente

Dos biopsias de punción mm3 fueron tomadas a partir de piel lesional o no-lesional (por lo general a partir de piel del antebrazo) de pacientes de nueve años y compatibilizados en sexo con esclerosis sistémica cutánea difusa (SSc). Todos los pacientes cumplían los criterios del Colegio Americano de Reumatología para el diagnóstico de la esclerosis sistémica.

Cultivos de fibroblasto

Fueron obtenidos fibroblastos a partir de biopsias por cultivo in vitro como se describe previamente (Abraham et al., 1991). Brevemente, las biopsias fueron cortadas en trozos y colocadas en platos de plástico estériles o matraces. Después de 15 minutos de secar a temperatura ambiente los trozos de la biopsia fueron adherentes al plástico del cultivo de tejido y fueron entonces cultivados en medio de crecimiento de fibroblasto (FGM) que consistía en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero de becerro fetal del 10% (FCS), L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, 100 unidades por ml de penicilina, 100 \mug por ml de estreptomicina, 50 \mug por ml de gentamicina y 2,5 \mug por ml de anfotericina B. Después de 2-3 semanas de incubación en una atmósfera humedecida de CO_{2} del 5% en aire, los brotes de fibroblasto fueron separados por un breve tratamiento con tripsina y fueron recultivados en FGM sin gentamicina y anfotericina B. En los experimentos, fueron usados los fibroblastos entre los pasos 2 y 5. El fenotipo del fibroblasto fue confirmado por su morfología típica en cultivos de gel de colágeno de monocapas y tridimensionales.

Aislamiento de ARN

El ARN total fue aislado de los fibroblastos de esclerodermia confluente en un paso inicial o a partir de cultivos primarios (paso 1-3) de fibroblastos (prepucio) dérmicos normales humanos (comprado en Promocell) usando Trizol (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El pelet de ARN final fue resuspendido en agua estéril tratada con DEPC a una concentración de 1 \mug/\mul y fue almacenado a -80ºC.

Síntesis de sonda de cDNA

2 \mug de ARN total fueron mezclados con 1,3 \mul de cebadores específicos de citoquina (Nº. de cat. de R&D Systems GAC11) y fueron incubados a 70ºC durante 2 minutos en un tubo eppendorf de 0,5 ml. Los tubos entonces fueron enfriados a 50ºC durante 2 minutos después de cuyo tiempo de reacción fue añadida una mezcla que contenía 2 \mul de tampón de reacción 5X (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM y MgCl_{2} 15 mM), 1 \mul de mezcla de 10X dNTP (dGTP 5 mM, dCTP 5 mM y dTTP 5 mM), 3,5 \mul de \alpha^{32}P-dATP (3000 Ci/mmol, Nº. de cat. Amersham PB10204), 0,5 \mul de DTT (100 mM) y 1 \mul de Superscript II (Life Technologies). La mezcla de reacción fue mezclada brevemente pipeteando y fue incubada a 50ºC durante 25 minutos. La reacción fue parada por la adición de 1 \mul de EDTA 0,1 M, pH 8,0, que contenía 1 mg/ml de glucógeno. El cDNA marcado entonces fue purificado de desoxinucleótidos no incorporados usando una columna Chromaspin-200 DEPC-H20 (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cDNA que contenía las fracciones fue identificado por recuento de Czerenkov. La fracción máxima (normalmente la fracción 2 de un total de 6 recogidas) fue tratada con 0,1 volúmenes de NaOH 1 M que contenía EDTA 1 mM durante 20 minutos a 70ºC para hidrolizar el ARN, y luego fue neutralizada con un volumen igual de NaH_{2}PO_{4} 1 M que contenía 2,5 \mug de ADN Cot-1 humano (Life Technologies) durante 20 minutos a 70ºC. La sonda de cDNA neutralizada tratada con calor entonces fue añadida directamente a la mezcla de hibridación.

Hibridación a micromatrices de filtro de genes

Fueron prehibridadas micromatrices de filtro de genes (matriz de expresión de citoquina humana, Nº. de cat. de R&D Systems GA001) a 68ºC durante 2 h en 5 ml de solución de Express Hybridation (Clontech) que contenía 0,5 \mug/ml de ADN de esperma de salmón (Life Technologies) en botellas Roller, en una estufa de hibridación Hybaid (MWG Biotech). Después de este tiempo, la solución de prehibrización fue sustituida con una solución de hibridación recién preparada que contenía la preparación de la sonda de cDNA a una actividad específica de entre 0,25 a 1 x 10^{6} cpm/ml. La hibridación fue durante 16-20 h a 68ºC. Después de la hibridación, los filtros fueron lavados 4 veces con 2X SSC/SDS del 1% a 68ºC durante 20 minutos por lavado y dos veces con 0,1X SSC/SDS del 0,5% durante 15 minutos por lavado. Los filtros entonces fueron sellados en wrap® de Saran y fueron expuestos a una pantalla de imagimática de fósforo de almacenaje del Tipo K (Biorad) para tiempos variables (de 4 h hasta 4 días) a temperatura ambiente.

Análisis de imagen

Las pantallas de imagimática fueron exploradas a una resolución de 50 \mum utilizando un Phosphoimager FX Personal de Biorad. El archivo digital de 16 bit resultante fue convertido en un formato TIF y la imagen fue analizada usando el software Arrayvision (Imaging Research Inc.). Para cada muestra, se midió la intensidad de pixel de los 384 genes manchados en dos ejemplares sobre el filtro. La señal de fondo fue restada y fue generada una intensidad de pixel promedio para cada par de manchas en la matriz (= nivel de expresión).

Confirmación de los resultados de micromatriz en genes seleccionados por RT-PCR

1 \mug de ARN total de cada muestra de paciente fue transcrita inversa utilizando un cebador oligo dT (Promega) en un volumen de reacción de 20 \mul que contenía MgCl_{2} 5 mM, Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, Triton X-100 del 0,1%,1 mM cada uno de dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0,5 unidades del inhibidor de ribonucleasa Rnasin recombinante (Promega) y 15 unidades de transcriptasa inversa de AMV (Promega). La mezcla de reacción fue incubada a 42ºC durante 60 minutos, fue calentada a 95ºC durante 5 minutos, y después se diluyó hasta 200 ml con agua estéril. Las diluciones de la reacción de la transcriptasa inversa entonces fueron sometidas a análisis PCR en tiempo real en un Taqman (PE Applied Biosystems 7700) utilizando pares de cebador específicos diseñados para cada gen usando el software Primer Express (PE Applied Biosystems) basado en el número de entrada de la base de datos dada por el fabricante del filtro de genes. Los resultados fueron normalizados respecto a la expresión de la gluceraldehído 3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) del gen de distribución en cada muestra y son expresados como cambios en veces, determinado dividiendo el valor de la expresión de la muestra anormal del paciente por la muestra correspondiente normal del paciente.

Método estadístico para predecir genes asociados a la esclerodermia

El método estadístico para predecir los genes asociados con la esclerodermia ha sido llevado a cabo por análisis vecino y predictor de clase como se describe detalladamente en Golub et al., 1999, que se incorpora totalmente como referencia en este documento.

Resultados

El análisis de micromatriz de filtro de genes fue realizado en muestras de fibroblasto normales y anormales de 7 pacientes con esclerodermia. Se muestra el nivel de expresión promedio de cDNA de SARP-1 para cada muestra de paciente en la figura 1 A, y la mediana de la expresión en la figura 1 B. Los valores de promedio y de mediana se diferencian considerablemente entre células normales y anormales, siendo el nivel de expresión normal de SARP-1 más alto que el nivel de expresión anormal. Las medianas se usan comúnmente cuando se trata con muestras de pacientes porque reducen al mínimo el efecto de un individuo ampliamente variante dentro del grupo. En este documento, los fibroblastos anormales expresaron niveles considerablemente menores de mRNA de SARP-1 comparado con los fibroblastos normales en 5 de los 7 pacientes analizados.

Los resultados obtenidos en las micromatrices fueron además corroborados por análisis PCR en tiempo real de muestras de pacientes usando cebadores de PCR específicos a SARP-1. Se muestran los resultados en la figura 2 y se expresan como el cambio en veces del nivel de expresión (anormal dividido por normal). En 6 de los 8 pacientes analizados, la SARP-1 fue desregulada al menos 2 veces en fibroblastos enfermos comparado con los fibroblastos normales tomados del mismo paciente. En los 2 pacientes restantes, el nivel de expresión fue comparable en los fibroblastos normales y los anormales.

Las diferencias de la expresión observada entre fibroblastos normales y anormales del mismo paciente no son debidas a diferencias en las condiciones de cultivo entre las dos poblaciones ya que la expresión de mRNA de SARP-1 en cultivos primarios de fibroblastos dérmicos humanos normales no cambia considerablemente en el paso de las células (figura 3). Además el análisis RT-PCR en tiempo real del ARN total aislado de las muestras de biopsia enteras de piel anormal de pacientes con esclerodermia indicó niveles inferiores de mRNA de SARP-1 comparado con las biopsias de control de compatibilidad de edad, sexo y anatómicas clínicamente normales (figura 4).

Además de esto, la desregulación de SARP-1 fue mostrada que tenía una probabilidad del 95% de asociación con la progresión de la esclerodermia usando métodos estadísticos.

Conclusión

Los resultados descritos anteriormente muestran que hay una carencia de SARP-1 en el tejido enfermo derivado de pacientes con esclerodermia comparado con el tejido sano, indicando que la restauración de un nivel normal de SARP-1 puede ayudar a la curación de la enfermedad. Así, SARP-1 puede representar una nueva medicina para alcanzar la inhibición parcial o completa de la enfermedad o de al menos de uno o varios síntomas de la esclerodermia, o para la inhibición de la progresión de la enfermedad.

Ejemplo 2 Clonación del ADN completo que codifica la secuencia de SARP-1 humana Materiales y Métodos

Búsquedas de BLAST secuencial fueron realizadas en la dbEST de humanos (base de datos de EST pública) comenzando con la secuencia de codificación parcial de SARP-1 (número de entrada de la EMBL AF017986) y fueron recuperados los EST relevantes usando ENTREZ en http://www.ncbi.nlm.gov/Web/Search/index.html. Los EST siguientes entonces fueron montados con la secuencia de AF017986 para generar la secuencia de codificación completa de consenso de SARP-1: AW580647, AW608301, AA976403, y W92531.

El cDNA de longitud completa que codifica para la secuencia de SARP-1 entonces fue clonado por la PCR con transcriptasa inversa usando los siguientes cebadores basados en la secuencia de consenso obtenida más arriba: SARP-1 5' GCC AAG CTT CCC ACG ATG CTG CAG GGC CCT (SEQ ID NO: 3) y SARP-1R 5' GCG CTC GAG CTA GCA CTG CAG CTT GCG GAT (SEQ ID NO: 4) a 50 pmoles cada uno en una mezcla de reacción de 50 \mul que contenía dNTPs 0,3 mM, MgSO_{4} 1 mM, 5 \mul de plantilla de cDNA de fibroblasto (prepucio) dérmico humano normal (preparado como se describe anteriormente) 5 \mul de tampón de amplificación 10X Pfx (Life Technologies) y 1 \mul de ADN polimerasa Pfx Platinum (Life Technologies). La mezcla de reacción fue calentada a 94ºC durante 2 minutos, entonces fue sometida a 35 ciclos de PCR como sigue: 94ºC 15 s, 55ºC durante 30 s y 68ºC durante 1 minuto. Los productos de amplificación fueron analizados en geles de agarosa del 1% en tampón 1 X TAE (Life Technologies) y los productos de la PCR que emigraban a la masa molecular predicha (906 bp) fueron purificados del gel usando el kit de purificación de PCR de Wizard (Promega).

100 ng de ADN purificado por gel fueron digeridos con las enzimas de restricción HindIII y XhoI (Pharmacia), de acuerdo con las condiciones del fabricante, fueron purificados de nuevo como se describe anteriormente y ligados al plásmido pcDNA3.1(+) (Invitrogen) HindIII/XhoI-digerido utilizando T4 DNA ligasa (Biolabs de Nueva Inglaterra) de acuerdo con técnicas de biología molecular estándar. Los productos de ligadura fueron transformados en la cepa de E. coli TOP 10 F' (Invitrogen) por electroporación usando un pulsado génico de Biorad. El ADN del plásmido fue aislado de cultivos de 5 ml cultivados a partir de las colonias resultantes y fue sometido a análisis de secuencia automatizado en un secuenciador 3700 de Applied Biosystems usando los cebadores T7 y pcDNA3.1AS (Invitrogen) para confirmar la secuencia de SARP-1.

Resultados

Para caracterizar la actividad de SARP-1 in vitro e in vivo fue clonado el cDNA humano completo que codificaba la secuencia. La secuencia de cDNA parcial de SARP-1 humano (Número de catálogo EMBL AF017986) fue usada para identificar la coincidencia de los EST en la base de datos dbEST pública usando el programa BLAST. El ADN completo que codificaba la secuencia fue montado a partir de los números de entrada de secuencia siguientes: AF017986, AW580647, AW608301, AA976403, y W92531. Se muestran la secuencia de ADN de cadena entera y la secuencia de aminoácidos deducida de SARP-1 en la Figura 5A y B (A y B deberían ser leídas continuamente). El cDNA que codifica la secuencia de SARP-1 fue clonado por PCR con transcriptasa inversa usando los cebadores que flanqueaban los codones de inicio y de terminación predichos. El análisis de secuencia de los clones de cDNA de SARP-1 resultantes reveló una identidad del 93% al nivel del nucleótido respecto a la secuencia de SARP-1 publicada de ratón (Melkonyan et al., 1997) y una identidad del 95% de la secuencia de ratón al nivel del aminoácido. Las secuencias de aminoácido humana y de ratón alineadas de SARP-1 son representadas en la figura 6. La secuencia de la proteína predicha tiene 295 aminoácidos con un péptido señal predicho de 20 ó 24 aminoácidos usando los programas SIGNALASE (Von Heijne, 1986) o SIGNALP respectivamente, véanse las flechas en la figura 5 A. Las diferencias de amino entre las secuencias humanas y de ratón son destacadas en la figura 6 y residen en el péptido señal del extremo N-terminal (4 aminoácidos) y en la secuencia de la proteína madura (2 aminoácidos).

La SEQ ID NO: 1 del listado de secuencia incluido contiene la cadena de codificación de cDNA de SARP-1 humano y la SEQ ID NO: 2 contiene la secuencia de aminoácidos de SARP-1 humano. La secuencia de aminoácidos murina es ilustrada en la SEQ ID NO: 5 del listado de secuencia incluido.

Ejemplo 3 Secuencia del extremo N-terminal de SARP-1 humano

El péptido señal de SARP-1 predicho tiene 20 ó 24 aminoácidos (véase la figura 5A). Para verificar el extremo N-terminal correcto del SARP-1 maduro, fue expresado SARP-1 recombinante que contenía un marcador de seis restos de histidina en células HEK-293 y fue purificado en una columna de quelato de níquel. La proteína purificada emigra como una banda de 32 kDa en SDS-PAGE, correspondiente a la masa medida por MS, que fue de
34313 Da.

Las secuencias del extremo N-terminal de la proteína recombinante purificada fueron obtenidas usando un secuenciador de proteínas en fase líquida pulsado modelo 494 de Applied Biosystems con un analizador de aminoácidos de feniltiohidantoina en línea modelo 148C de acuerdo con Maundrell et al. (1997). Brevemente, el SARP-1 purificado fue digerido por una incubación de una noche a 37ºC en 90 \mul de Tris-HCl 100 mM, pH 8,5, que contenía urea 1 M, metilamina 20 mM, ditiotreitol 1 mM, y 5 \mug de tripsina (Boehringer Mannheim, calidad de secuenciación). Los péptidos fueron separados por HPLC de fase inversa (HP1090 de Hewlett-Packard) con una columna C18 de Brownlee (220 x 2,1 mm). Los péptidos fueron eluidos con un gradiente de acetonitrilo (en ácido trifluoroacético del 0,1%) de 0 a 55% en 60 minutos, seguido de 55-70% en 5 minutos. Las fracciones de elución fueron recogidas, y fueron secuenciados fosfopéptidos radiactivos marcados con ^{33}P identificados por espectrometría de centelleo por degradación de Edman usando un secuenciador de proteínas de fase líquida pulsado modelo 494 de Applied Biosystems con un analizador de aminoácidos de feniltiohidantoina en línea modelo 148C.

La secuencia GLFLFGQPDFSYK fue obtenida por espectrometría de masas tándem en una digestión tripsínica de la proteína reducida y alquilada. Los análisis fueron realizados en un espectrómetro de masas Q-TOF (Micromass UK Limited, Manchester, Reino Unido) equipado con una fuente de iones de nano-pulverización esencialmente como se describe en Cavalli et al., 2001. Brevemente, un microgramo de la proteína purificada fue resuelto en SDS-PAGE del 10%. Las bandas de la proteína fueron separadas en gel de tinción de plata y fueron digeridas en gel con tripsina (Shevchenko et al., 1996). La mezcla del péptido extraída fue analizada por secuenciación espectrométrica de masas en tándem (Wilm et al., 1996) utilizando un espectrómetro de masas Q-TOF (Micromass, Manchester, Reino Unido) equipado con una fuente de iones de nano-electropulverización.

\newpage

Resultados

La secuencia teórica del extremo N-terminal de SARP-1 inmaduro fue como sigue:

4

La posición del 2º sitio de división de señal predicho está entre el resto 24 y 25 (G y L).

En los experimentos de secuenciación llevados a cabo, fue encontrada una heterogeneidad considerable del extremo N-terminal de SARP-1.

En un experimento, dos secuencias principales fueron encontradas, una comenzando con FGQPD, es decir, empezando en el aminoácido 28 de SEQ ID NO: 2, otra empezando con LFGQPD, es decir comenzando en el aminoácido 27 de SEQ ID NO: 2.

Aunque, además en un lote purificado diferente, fueron encontradas las 4 secuencias:

LFLFGQPDFS

(empezando en el aminoácido 25)

FLFGQPDFS

(empezando en el aminoácido 26)

LFGQPD

(empezando en el aminoácido 27)

FGQPD

(empezando en el aminoácido 28).

Hay también otra secuencia que comienza en el aminoácido 37: RSNCKPIPAN. Esta secuencia es debida a una división después de un resto de Lisina (división tipo tripsínica).

Además otro experimento reveló una secuencia que comenzaba en la posición 24:

GLFLFGQPDFSYK

Así, el extremo N-terminal parece ser muy heterogéneo, lo que también podría ser debido a la actividad de endopeptidasa o proteasa inherente en SARP-1. SARP-1 maduro puede darse en varias variantes diferentes con extremos N-Terminales diferentes.

Ejemplo 4 La transfección de SARP-1 induce la apoptosis in vitro Métodos

Líneas celulares de fibroblasto (células NIH3T3 de ratón y células AG1518 humanas) y los cultivos de fibroblasto primarios (paso 1-5 de fibroblastos dérmicos humanos normales) (Promocell) fueron transfectados con el plásmido pcDNA3.1 que contenía el cDNA de SARP-1 que codificaba la secuencia o pcDNA3.1 solo (vector vacío transfectado de simulación como control negativo) usando los reactivos de transfección Geneporter 2 (Gene Therapy Systems, San Diego) o Fugene 6 (Life Technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La apoptosis fue medida 24 h después de la transfección usando el kit de ensayo de apoptosis de 96 pocillos TiterTacs de R&D systems y las células fueron enumeradas usando el tinte CyQuant (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados

Para evaluar el efecto de SARP-1 en los fibroblastos, una línea celular de fibroblasto fue transfectada con cDNA de SARP-1 y el grado de apoptosis fue evaluado. Se muestran los resultados en la figura 7. La apoptosis en las células transfectadas de SARP-1 se redujo considerablemente (P=0,0009) comparado con las células transfectadas de simulación (pcDNA3.1) indicando que SARP-1 humano tenía una actividad similar a la publicada para su homólogo murino. El nivel básico de apoptosis fue determinado en las células no transfectadas. Células NIH 3T3 tratadas con nucleasa sirvieron como control positivo. La columna "no marcada" muestra el nivel de tinción de fondo, y el tratamiento con nucleasa ("tratado con nucleasa") sirvió como control positivo.

Ejemplo 5 Efecto de SARP-1 en la producción de TGF\beta1

TGFP\beta1 es una citoquina profibrótica que está sobre-regulada en la esclerodermia y que ha sido asociada anteriormente a la patogénesis de la esclerodermia (Kawakami et al., 1998). Para evaluar si SARP-1 desregula o inhibe la producción de TGFP\beta1 o la secreción por fibroblastos, puede ser añadido SARP-1 a cultivos de fibroblasto en forma de proteína purificada. De forma alternativa, un vector de expresión que comprende cDNA de SARP-1 puede ser transfectado en las células para conseguir una cantidad suficiente de SARP-1 en el cultivo celular. Otra posibilidad es añadir al medio células que expresen SARP-1, que pueden ser concentradas para alcanzar las cantidades suficientes de SARP-1, a cultivos de fibroblasto. Las líneas celulares de fibroblasto o fibroblastos primarios derivados de individuos sanos o enfermos o partes normales o enfermas de la piel de un paciente con esclerodermia pueden ser usados para este experimento.

La cantidad de TGFP\beta1 puede ser medida por ELISA en medio acondicionado a partir de células cultivadas usando el sistema ELISA Quantikine para TGFP\beta1 de R&D systems (Nº. de cat. DB100).

Ejemplo 6 Efecto de la administración de SARP-1 sobre la actividad de MMP-1 en fibroblastos humanos in vitro Métodos

Fue subclonado el cDNA para SARP-1 humano que contenía la secuencia de codificación para un marcador 6XHis en el extremo 3' en el vector de transferencia del baculovirus pDEST Fastbac. SARP-1 6XHis marcado del extremo C-terminal fue producido en células de insecto Sf5 infectadas por baculovirus recombinantes y fue purificado por cromatografía de afinidad de Ni-NTA.

Fueron tratados fibroblastos humanos de bajo número de paso (2-5) derivados de piel lesionada o no-lesionada de pacientes con esclerodermia o de sujetos normales con 0, 100 o 1000 ng/ml de SARP-1 recombinante durante 24 h. El medio acondicionado fue cultivado y los restos de las células fueron eliminados por centrifugación a 1200 revoluciones por minuto durante 10 minutos a 4ºC. Fue medida la actividad de MMP-1 en el medio de cultivo no diluido utilizando un kit de fluoroquina de MMP-1 (comprado en R&D systems) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La actividad de MMP-9 también fue medida en las mismas muestras.

Resultados

La MMP-1 es responsable de la degradación del colágeno tipo I, indicando que la disminución en la actividad de MMP-1 es un factor contribuyente en uno de los defectos subyacentes en la esclerodermia, lo que implica la excesiva deposición de colágeno.

Los fibroblastos dérmicos de pacientes con esclerodermia disminuyeron la expresión de MMP-1 tanto a nivel de mRNA como a nivel de las proteínas, en comparación con fibroblastos dérmicos normales y no lesionales aislados a partir del mismo paciente. Aunque la MMP-1 activa total detectable variaba considerablemente de paciente a paciente, los fibroblastos tratados con SARP-1 mostraron una actividad de MMP-1 más alta que los fibroblastos no tratados, ambos en fibroblastos anormales de pacientes con esclerodermia (figura 8 A, D, F) así como en fibroblastos derivados de piel no afectada, sana de un paciente con esclerodermia (figura 8 E) y en fibroblastos de individuos control clínicamente normales (figura 8 B y C). Los resultados mostrados son los promedios de determinaciones por triplicado. En contraste con MMP-1, ningún efecto de SARP-1 fue visto en la actividad de MMP-9 (datos no mostrados).

Ejemplo 7 La transfección de cDNA de SARP-1 disminuye la actividad del promotor tipo 1\alpha2 de colágeno en fibroblastos de NIH3T3 Materiales y métodos

Fueron colocadas en placas células NIH3T3 mantenidas en DMEM que contenía glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina y FCS del 10% en confluencia del 50% en placas de 96 pocillos de calidad de cultivo de tejido de fondo transparente y paredes blancas (Wallac). Al día siguiente, las células fueron co-transfectadas con SARP-1 de pcDNA3.1 y el vector pGL3 (Promega) que contenía el promotor de colágeno de 3.5 kilobytes y el gen indicador de luciferasa (amablemente proporcionado por el Doctor David Abraham, Hospital Royal Free), usando el reactivo de transfección de Geneporter de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Fue añadido TGF\beta (R&D systems, 5 ng/ml) 30 h después de la transfección. La actividad de luciferasa fue medida directamente en cada pocillo, 24-36 h más tarde usando el sistema de ensayo Bright-Glo comprado en Promega.

Resultados

Para evaluar si hubo alguna relación entre la sobre-expresión de SARP-1 y la síntesis de colágeno, fue examinado el efecto de transfección de cDNA de SARP-1 frente a la actividad del promotor de colágeno en fibroblastos de NIH3T3 co-transfectados con un constructo de reportero de promotor-luciferasa de aCol1\alpha2.

La cotransfección de cDNA de SARP-1 con un plásmido reportero promotor-luciferasa de colágeno indicó que SARP-1 era capaz de suprimir no sólo la actividad del promotor de colágeno de base, sino que también el TGF\beta inducía el aumento de la actividad del promotor de colágeno (figura 9). Estos resultados sugieren que el producto génico de SARP-1 puede estar implicado en la regulación de la actividad del promotor de colágeno in vitro directamente o indirectamente a través de acontecimientos de señalización mediados por SARP-1.

Otro modo para analizar el efecto de SARP-1 sobre la deposición de colágeno y/o la síntesis y/o la secreción en los fibroblastos es añadir SARP-1 purificado a cultivos de fibroblasto.

De forma alternativa, un vector de expresión que comprende cDNA de SARP-1 puede ser transfectado en fibroblastos para alcanzar una concentración suficiente de SARP-1 en el cultivo celular.

Otra posibilidad es añadir medio a partir de células que expresen SARP-1, que pueden ser concentrados para alcanzar las concentraciones suficientes de SARP-1, a cultivos de fibroblasto. Las líneas celulares de fibroblasto o los fibroblastos primarios derivados de individuos sanos o enfermos o partes normales o enfermas de la piel de un paciente con esclerodermia pueden ser usadas para este experimento.

La síntesis de colágeno puede ser medida in vitro en fibroblastos humanos cultivados usando un sistema de captura ELISA (anticuerpos comprados de Southern Biotechnology Associates Inc) como se describe en Shi-wen et al., 1997.

Ejemplo 8 Fibroblastos dérmicos humanos que sobreexpresan SARP-1 o tratados con SARP-1 recombinante humano muestran una expresión de mRNA alterada de genes asociados con la patología de la esclerodermia Materiales y Métodos

Fueron mantenidos fibroblastos dérmicos humanos normales (prepucio) en medio de cultivo de fibroblasto (Promocell). Los fibroblastos fueron tratados con SARP-1 humano recombinante (100 ng/ml) durante 4 ó 24 h en presencia y ausencia de TGF\beta1 humano. Las células fueron cultivadas después del período de tratamiento y el ARN total fue aislado usando el reactivo Trizol® (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una sonda de cDNA marcada con ^{32}P-dATP fue preparada a partir del ARN como se describe anteriormente y fue hibridada en una matriz de filtro de genes de citoquina humana de R&D systems y fue tratada como se describe anteriormente.

Resultados

Aunque SARP-1 fue inicialmente descrito como una proteína asociada a la apoptosis, su función exacta es desconocida. Para llegar a comprender bien el papel de SARP-1 en la esclerodermia, fue medido el efecto del tratamiento de fibroblastos dérmicos humanos pretratados con TGF\alpha, que imita el fenotipo de la esclerodermia, con SARP-1 en la expresión génica de fibroblastos.

La Tabla IV muestra los mRNA afectados por el tratamiento de fibroblastos con SARP-1 recombinante después de la estimulación anterior durante 4 h con TGF\alpha, que fue usado para imitar el fenotipo de esclerodermia. Las células fueron tratadas con SARP-1 durante 24 h. En estas condiciones, fueron desregulados TGF\alpha y FGF 5. La expresión disminuida de endoglina, una proteína de unión de TGF\beta1, y la expresión aumentada de furina, una proteasa asociada con la activación de metaloproteasas de matriz, fueron observadas. Otro mRNA que fue desregulado fue TARC. Esta quimiocina está asociada con el reclutamiento de células T originales de la piel en sitios inflamatorios. Es, por lo tanto, posible que la administración de SARP-1 pueda tener efectos antinflamatorios. La sobre-regulación del mRNA de la subunidad de TNFR1 también fue observada. La importancia de esta observación es confusa ya que parece haber mucha discrepancia en la literatura científica en cuanto a si el TNF tiene un papel patógeno o protector en la esclerodermia.

En un experimento separado (no mostrado), la regulación de genes en fibroblastos de pacientes con esclerodermia fue analizado en comparación con fibroblastos de control sanos. Destacadamente, los genes regulados indicados en la Tabla IV se encontró que estaban regulados en muestras de esclerodermia. Estos genes encontrados sobre-regulados en fibroblastos de esclerodermia fueron desregulados después de la expresión de SARP-1 en el modelo anterior, y los genes encontrados desregulados fueron encontrados sobre-regulados después de la expresión de SARP-1 en el modelo anterior, indicando además que SARP-1 puede tener un efecto beneficioso en el tratamiento de la esclerodermia.

TABLA IV

5

*La relación SARP-1/de simulación representa la relación TGF\alpha+SARP-1 tratado/TGF\alpha solo.

Los resultados mostrados están basados en dos experimentos independientes

Ejemplo 9 Evaluación de los efectos de SARP-1 in vivo en un modelo murino de enfermedad

El daño pulmonar inducido por bleomicina es un modelo aceptado para la esclerodermia. La administración intratraqueal de bleomicina induce la enfermedad (Hattori et al., 2000). Los ratones tratados desarrollan una respuesta inflamatoria en los pulmones (máximo alrededor del día 7) seguido de fibrosis que alcanza su punto máximo alrededor del día 14 después de la inducción. Este modelo fue usado para evaluar el efecto de la administración SARP-1 in vivo en el desarrollo de la fibrosis pulmonar. Un sistema de suministro de células (células NIH3T3 transfectadas con cDNA de SARP-1 de longitud completa), fue usado para generar SARP-1 in vivo.

Métodos Tratamientos del animal

Fue inducida fibrosis pulmonar en ratones (20-25 g) por la administración intra-traqueal de bleomicina (0,075 UI) en solución salina el día 1. Los ratones fueron divididos en 4 grupos separados de 10 animales. Un grupo recibió una inyección i. p. de 10^{6} células NIH3T3 transfectadas con SARP-1/pcDNA3.1. Un segundo grupo recibió 10^{6} de células NIH3T3 transfectadas de simulación (vector pcDNA3.1). El tercer grupo recibió 250 \mug de anticuerpo anti-TGF\beta (Anti PanTGF\beta: Nº. de cat. Sigma T9429) y los ratones en el grupo final recibieron solución salina. Todos los ratones fueron sacrificados el día 14 y los pulmones fueron fijados con formalina y embebidos en parafina para su estudio de histología. Las secciones pulmonares fueron teñidas con tri-cromo o rojo de picrosirius para el colágeno (Bancroft J. D. y Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques) y fue recogido el grado de fibrosis/pulmón.

Transfección de células NIH3T3

Fueron transfectadas células NIH 3T3 con SARP-1/pcDNA3.1 o pcDNA3.1 usando el reactivo Geneporter 2 como se describe antes. Veinticuatro horas después de la transfección el medio de cultivo fue retirado y las células fueron tratadas con solución salina de fosfato tamponada (PBS) que contenía EDTA 1 mM durante 5 minutos a 37ºC. Las células fueron separadas con cuidado con un raspador de células (Costar), fueron centrifugadas durante 5 minutos a 4ºC hasta hacer un pelet de células, y fueron resuspendidas en solución salina de calidad inyectable a una concentración de 10^{7} células/ml.

Resultados SARP-1 protege contra la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina

Los animales tratados con bleomicina solo, o con células NIH3T3 transfectadas de simulación desarrollaron una significativa fibrosis pulmonar (no mostrado). TGF\beta1, como se piensa, es uno de los agentes claves responsables de los cambios patológicos que conducen a la fibrosis. Se ha mostrado previamente que un anticuerpo policlonal antiTGF\beta1 que protege contra el desarrollo de la fibrosis pulmonar cuando se administra profilácticamente (Yamamoto et al., 1999) también reduce la fibrosis de la piel en el modelo GvHD de esclerodermia (McCormick et al., 1999). Por lo tanto, este anticuerpo fue usado como control positivo en estos experimentos. Los ratones tratados con anti-TGF\beta no desarrollaron una amplia fibrosis de los pulmones. Sin embargo, los ratones tratados con células transfectadas con SARP-1 tenían un número especialmente reducido de lesiones fibróticas en el pulmón cuando se compara con ratones tratados con bleomicina solo o con células transfectadas de simulación. El efecto fue comparable o aún mejor que el visto con el tratamiento con antiTGFp (no mostrado).

El análisis histológico de los pulmones muestra que los animales tratados con SARP-1 tenían casi una morfología normal de los pulmones con poco infiltrado inflamatorio y una arquitectura alveolar prácticamente normal. Esta morfología se parece a la morfología de los animales tratados con anti-TGF\beta y está en fuerte contraste con la morfología anormal vista en los pulmones de animales tratados con simulación y no tratados. En los 2 últimos grupos, los espacios alveolares están rellenos por infiltrados celulares y deposición de colágeno (no mostrado).

Las cantidades de lesiones fibróticas en los pulmones de los diferentes grupos experimentales son representadas en la figura 10. Los ratones tratados con SARP-1 contenían considerablemente menos lesiones fibróticas comparado con los ratones tratados con solución salina o anti-TGF\beta.

La administración de bleomicina puede conducir a una mayor mortalidad. Además de los efectos protectores de la administración de SARP-1 contra la fibrosis también fue notado que mayor número de ratones sobrevivieron al tratamiento (8/10 ratones) comparado con los ratones tratados con solución salina (6/10), ratones tratados con anti-TGF\beta (4/10) y ratones tratados de simulación (3/10). Por lo tanto, el tratamiento de SARP-1 hasta protege de la muerte en el modelo de fibrosis pulmonar, indicando que el tratamiento SARP-1 es claramente superior al tratamiento anti-TGF\beta en este grupo experimental.

En resumen, en este modelo de esclerodermia in vivo establecido, se ha demostrado un efecto beneficioso de SARP-1:

Además, los modelos in vivo pueden ser usados para analizar el efecto de la administración de SARP-1, tal como un modelo de enfermedad de injerto-contra-huésped de esclerodermatosis murina (Scl GVHD) para la esclerodermia. Este modelo reproduce propiedades importantes de la esclerodermia incluyendo el hinchamiento de la piel, la fibrosis pulmonar, y la sobre-regulación de mRNA de colágeno cutáneo, lo que es precedido por la infiltración de monocitos y la sobre-regulación de mRNA de TGF-\beta1 cutáneo. El modelo se describe detalladamente en McCormick LL et al., 1999.

Ejemplo 10 Administración sistémica de SARP-1 por inyección intramuscular de ADN de plásmido de expresión

Para demostrar el papel de SARP-1 como un factor protector en la esclerodermia, los ratones son transfectados in vivo con un plásmido que codifica al cDNA de SARP-1 murino y son comparados con los ratones transfectados con un plásmido vacío como control.

Los plásmidos son inyectados en ambos músculos craneales tibiales del ratón anestesiado como se ha descrito con anterioridad (Dimmeler et al., 1997; Mir et al., 1999). Brevemente, se suministram pulsos eléctricos transcutáneos (8 pulsos eléctricos de onda cuadrada de 200 V/cm, duración 20 msec a 2 Hz) mediante un electropulsator PS-15 utilizando dos electrodos de placa de acero inoxidable colocados a una distancia de 4,2 a 5,3 mm, en cada lado de la pierna.

Después, la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina es como se explica en el ejemplo anterior y el desarrollo de la enfermedad se observa tanto en los animales transfectados con SARP-1 como en los transfectados de simulación.

Referencias

1. Abraham D., Lupoli S., McWhirter A., Plater-Zyberk C., Piela T. H., Korn J. H., Olsen I. y Black C. (1991) Expression and function of surface antigens onscleroderma fibroblasts. Arthritis Rheum. 34,1164-1172.

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<110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.

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<120> Uso de SARP-1 en el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia

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<130> EP 469 Y

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<160> 5

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<170> PatentIn version 3.0

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<210> 1

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<211> 912

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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6

7

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<210> 2

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<211> 295

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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8

9

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<210> 3

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gccaagcttc ccacgatgct gcagggccct

\hfill

30

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<210> 4

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgctcgagc tagcactgca gcttgcggat

\hfill

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<210> 5

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<211> 295

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 5

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10

11

Claims (21)

1. El uso de una sustancia seleccionada a partir del grupo que consiste en:

(a) SARP-1 maduro;

(b) un fragmento de SARP-1 que comprende su dominio Frizzled rico en cisteína;

(c) un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2;

(d) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 21 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(e) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 24 a 295 de SEQ ID NO:2;

(f) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 25 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(g) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 26 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(h) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 27 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(i) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 28 a 295 de SEQ ID NO 2;

(j) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 37 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(k) una muteina de cualquiera de (a) a (j), en la que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 90% a al menos una de las secuencias en (c) a (j); que tiene al menos la misma actividad que la SARP-1 silvestre;

(l) una muteina de cualquiera de (a) a (j) que está codificada por una secuencia de ADN que hibrida al complemento de la secuencia de ADN nativa que codifica cualquiera de (a) a (j) en condiciones moderadamente rigurosas o en condiciones altamente rigurosas;

(m) una muteina de cualquiera de (a) a (j) en la que cualquier cambio de la secuencia de aminoácidos son sustituciones de aminoácido conservadoras en las secuencias de aminoácidos en (c) a (j); y

(n) una sal o una isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, o fracción activa de cualquiera de (a) a (m).

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sustancia está glicosilada en uno o varios sitios.

3. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína fusionada comprende una fusión de inmunoglobulina (Ig).

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el derivado funcional comprende al menos un resto unido a uno o varios grupos funcionales que se dan como una o varias cadenas laterales en los restos de aminoácido.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el resto es un resto de polietileno.

6. El uso de una molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia, en el que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en:

(a) SARP-1 maduro;

(b) un fragmento de SARP-1 que comprende su dominio Frizzled rico en cisteína;

(c) un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2;

(d) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 21 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(e) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 24 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(f) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 25 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(g) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 26 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(h) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 27 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(i) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 28 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(j) un polipéptido que comprende los aminoácidos de 37 a 295 de SEQ ID NO: 2;

(k) una muteina de cualquiera de (a) a (j), en la que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 90% a al menos una de las secuencias en (c) a (j); que tiene al menos la misma actividad que la SARP-1 silvestre;

(l) una muteina de cualquiera de (a) a (j) que se codifica por una secuencia de ADN que hibrida al complemento de la secuencia de ADN nativa que codifica cualquiera de (a) a (j) en condiciones moderadamente rigurosas o en condiciones altamente rigurosas;

(m) una muteina de cualquiera de (a) a (j) en la que cualquier cambio de la secuencia de aminoácidos son sustituciones de aminoácido conservadoras en las secuencias de aminoácidos en (c) a (j); y

(n) una isoforma, proteína fusionada o fracción activa de cualquiera de (a) a (m).

7. El uso de un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el vector es un vector de expresión.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7 ó 8, en el que el vector es un vector de terapia génico.

10. El uso de un vector para inducir y/o realzar la producción endógena de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 en una célula para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia.

11. El uso de una célula que comprende un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia.

12. El uso de una célula que expresa una sustancia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia.

13. El uso de una célula que ha sido modificada genéticamente para producir un polipéptido según la reivindicación 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la esclerodermia.

14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la esclerodermia es la esclerosis sistémica.

15. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende además un interferón, para uso simultáneo, secuencial, o separado.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el interferón es el interferón-\beta.

17. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende además un antagonista del Factor de Necrosis Tumoral (TNF) para uso simultáneo, secuencial, o separado.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el antagonista de TNF es TBPI y/o TBPII.

19. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medicamento comprende además a un agente anti-esclerodermia para uso simultáneo, secuencial, o separado.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el agente antiesclerodermia se selecciona a partir del grupo que consiste en inhibidores de ACE, bloqueantes del canal de calcio, inhibidores de la bomba de protón, NSAID, inhibidores de COX, corticosteroides, tetraciclina, pentoxifilina, bucilamina, inhibidores de geranilgeranil-transferasa, rotterlin, inhibidores de prolil-4-hidroxilasa, inhibidores de c-proteinasa, inhibidores de lisil-oxidasa, relaxina, halofuginona, prostaglandinas, prostaciclinas, endotelina-1, óxido nítrico, inhibidores de angiotensina II y antioxidantes.

21. La composición farmacéutica que comprende una sustancia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en combinación con un agente anti-esclerodermia seleccionado a partir del grupo que consiste en inhibidores de ACE, bloqueantes del canal de calcio, inhibidores de la bomba de protón, NSAID, inhibidores de COX, corticosteroides, tetraciclina, pentoxifilina, bucilamina, inhibidores de geranilgeranil-transferasa, rotterlin, inhibidores de prolil-4-hidroxilasa, inhibidores de c-proteinasa, inhibidores de lisil-oxidasa, relaxina, halofuginona, prostaglandinas, prostaciclinas, endotelina-1, óxido nítrico, inhibidores de angiotensina II y antioxidantes.