ES2281905T3 - Promotor homologo intenso obtenido de hamster. - Google Patents
Promotor homologo intenso obtenido de hamster. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2281905T3 ES2281905T3 ES96937224T ES96937224T ES2281905T3 ES 2281905 T3 ES2281905 T3 ES 2281905T3 ES 96937224 T ES96937224 T ES 96937224T ES 96937224 T ES96937224 T ES 96937224T ES 2281905 T3 ES2281905 T3 ES 2281905T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- promoter
- sequence
- gene
- baselineskip
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 title claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 51
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 21
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 11
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 5
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 claims description 4
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 claims description 4
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 4
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 3
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims 2
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 101001115218 Homo sapiens Ubiquitin-40S ribosomal protein S27a Proteins 0.000 abstract 1
- 102100023341 Ubiquitin-40S ribosomal protein S27a Human genes 0.000 abstract 1
- 101000849522 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 40S ribosomal protein S13 Proteins 0.000 description 71
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 24
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 10
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 7
- 108010068086 Polyubiquitin Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 102100030246 Transcription factor Sp1 Human genes 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 2
- 101710085924 Transcription factor Sp1 Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 1,25-Dihydroxy-vitamin D3' Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CC(O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100023361 SAP domain-containing ribonucleoprotein Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010053551 Sp1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710139423 THO complex subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 description 1
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000464 effect on transcription Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000001069 large ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N manganese dioxide Chemical compound O=[Mn]=O NUJOXMJBOLGQSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000004708 ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000006663 ubiquitin-proteasome pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
LA INVENCION TRATA DE UN PROMOTOR HOMOLOGO E INTENSO OBTENIDO DE HAMSTERS. SE TRATA DE UN PROMOTOR DEL GEN QUE CODIFICA LA PROTEINA DE FUSION UBIQUITIN S27A. EL PROMOTOR PUEDE EMPLEARSE PARA LA PRODUCCION DE PRODUCTOS GENETICOS HETEROLOGOS EN CELULAS DE CULTIVO, EN ESPECIAL CELULAS CHO.
Description
Promotor homólogo intenso obtenido de
hámster.
La invención se refiere a un promotor homólogo
intenso obtenido de hámster, a los ácidos nucleicos, que contienen
las secuencias de promotor y/o reguladoras del gen S27a de la
ubiquitina, así como a procedimientos para la obtención de
productos genéticos heterólogos empleando dichos ácidos
nucleicos.
Para la fabricación económicamente importante de
proteínas mediante la expresión de genes recombinantes en células
hospedantes eucariotas, por ejemplo células CHO, se han empleado
hasta ahora sistemas de expresión heterólogos, es decir, que por
ejemplo los elementos promotor/intensificador y de terminación son
de origen vírico. El uso de promotores no víricos en lugar de
secuencias víricas en sistemas de expresión sería ventajoso con
respecto a la actitud de la opinión pública frente a la tecnología
genética y biológica y además contribuiría a la bioseguridad de los
sistemas de vectores, que se emplean para la expresión de genes en
cultivos celulares de animales.
La ubiquitina es polipéptido muy conservado que
tiene 76 aminoácidos, que se encuentra en gran número en todas las
células eucariotas y que se codifica con un diverso grupo de genes
(ver una recensión en: Jentsch y col., 1991; Schlesinger &
Bond, 1987). Con la modificación de proteínas diana, la ubiquitina
desempeña un papel importante en un gran número de procesos
biológicos, p. ej. en la degradación de proteínas dependiente del
ATP a través de la vía de las proteosomas de ubiquitina
(Ciechanover, 1994). En función de su estructura, los genes de la
ubiquitina pueden subdividirse en dos grupos. En el cebador grupo se
contemplan los genes de poliubiquitina, en los que se alinean las
unidades codificadoras de ubiquitina de un tamaño de 228 bp (= 76
aminoácidos) en un ordenamiento de cabeza a cola (Jentsch y col.,
1991; Schlesinger & Bond, 1987). El número de unidades varía de
una especie a otra, pero en la mayor parte de organismos se
encuentran dos genes de poliubiquitina de diferente longitud
(Fornace y col., 1989; Wiborg y col., 1985). Las regiones de
promotor de estos genes contiene una caja ("box") TATA y
elementos promotor/intensificador para un inductor de choque térmico
(Schlesinger & Bond,
1987).
1987).
Los genes de fusión de la ubiquitina se incluyen
en el segundo grupo. Se trata de fusiones entre una unidad de
ubiquitina y una proteína ribosómica (Jentsch y col., 1991;
Schlesinger & Bond, 1987). Los dos genes de fusión conocidos de
la ubiquitina pueden identificarse gracias a las diferencias en la
longitud y secuencia de la proteína ribosómica. En este caso se
trata de una proteína ribosómica de la subunidad ribosómica grande
que tiene una longitud de 52 aminoácidos (Baker y col., 1991) y en
el otro caso se trata de una proteína ribosómica de la subunidad
pequeña (que en los mamíferos se llama proteína S27a) que tiene una
longitud, variable según las especies, comprendida entre 76 y 81
aminoácidos (Redman & Rechsteiner, 1989). La porción de
ubiquitina en estas proteínas de fusión favorece al parecer la
integración eficiente de las proteínas ribosómicas en el ribosoma
(Finley y col., 1989).
Los genes individuales de ubiquitina se expresan
en diversos grados en los tejidos más diversos de un organismo y en
los diversos estadios de desarrollo. Los genes de poliubiquitina,
por ejemplo, se expresan constitutivamente en un nivel bajo, que
solamente se eleva de modo considerable cuando interviene el estrés
(Fornace y col., 1989; Schlesinger & Bond, 1987). Los genes de
fusión de la ubiquitina se potencian sobre todo en la fase de
crecimiento exponencial. En cambio, en las células de diferenciación
terminal y de crecimiento interrumpido, la expresión se regula a la
baja (Schlesinger & Bond, 1987; Shimbara y col., 1993; Wong y
col., 1993).
El cometido, que se pretende abordar con la
presente invención, consiste en el desarrollo de promotores intensos
no víricos para el procedimiento de obtención de productos
genéticos heterólogos en cultivos celulares, en especial en células
de hámster.
De modo sorprendente se ha encontrado un
promotor de un gen, que tiene actividad equivalente al promotor
vírico SV40, sobre todo en células CHO. Este gen codifica a la
proteína de fusión de la ubiquitina Ub/S27a. El promotor de la
Ub/S27a de un hámster es un objeto de esta invención.
Otro objeto de la presente invención es una
molécula de ácido nucleico, que contiene las secuencias de promotor
y/u otras secuencias reguladoras del gen Ub/S27a. Estas secuencias
de promotor y/u otras secuencias reguladoras se derivan del gen
Ub/27a del hámster. Es objeto de la invención en particular una
molécula de ácido nucleico recombinante, que contiene las
secuencias de promotor y/u otras secuencias reguladoras, que forman
parte de la secuencia representada en la figura 5.
Constituyen un objeto preferido de la invención
las moléculas de ácido nucleico, que contienen secuencias de la
región, que corresponde a las posiciones de -161 a -45 de la figura
5. Es incumbencia de los expertos la obtención de moléculas de
ácido nucleico con los métodos que se describen en el ejemplo 4, que
contienen secuencias parciales de las secuencias de la invención,
en especial una secuencia parcial de la región de -161 a -45, que
pueden conferir también una intensa actividad de promotor. Estas
secuencias parciales son también objeto de la invención.
Es también incumbencia de los expertos modificar
la secuencia de promotor mediante la sustitución, inserción,
deleción o adición de una, dos o tres bases con respecto a la
secuencia de la figura 5, sin por ello reducir significativamente
la actividad del promotor, que puede medirse con el método descrito
en el ejemplo 4. Se entiende por reducción significativa de la
actividad del promotor una reducción del valor en más del 50%,
valor que se obtiene para el fragmento de deleción 272 bp de la
tabla 1 en el ensayo CAT del ejemplo 4 en condiciones comparables.
Tales variantes de la secuencia del promotor están contempladas, por
tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones de la
invención.
En las moléculas de ácido nucleico de la
invención, las secuencias de promotor y/o reguladoras se hallan con
ventaja unidas funcionalmente a un gen, de modo que este gen pueda
expresarse bajo el control de estas secuencias. Tal gen puede
codificar por ejemplo a un activador de plasminógeno en tejidos (EP
0093619), un activador de plasminógeno de segunda generación, p.
ej. tnk-t-PA (WO 93/24635), un
interferón, p. ej. interferón \alpha (EP 0595241), interferón
\beta (EP 0041313, EP 0287075), interferón \gamma (EP 0146354) o
interferón \omega (EP 0170204), un factor de necrosis tumoral (EP
0168214), la eritropoyetina (WO 86/03520), el factor de estimulación
de colonias de granulocitos (EP 0220520, EP 0237545) o la dismutasa
de superóxido de manganeso (EP 0282899), que ya son conocidos por
el estado de la técnica. Puede ser también un en que codifique a una
cadena de inmunoglobulina, a un dominio variable de una cadena de
inmunoglobulina, a un anticuerpo humanizado (EP 0230400, EP
0451216), a un anticuerpo de cadena simple, etc. Dicho gen puede en
especial codificar a una cadena de inmunoglobulina humanizada, que
sea específica del CD44 variante (WO 95/33771). De modo conveniente,
tal molécula de ácido nucleico puede ser un vector de expresión
(Sambrook y col., 16.3-16.29, 1989). Son objeto de
la invención en especial aquellos vectores de expresión, que,
después de la introducción en una célula hospedante eucariota, se
integran en su genoma.
Otro aspecto de la presente invención es una
célula hospedante, en la que se haya introducido una de las
moléculas de ácido nucleico mencionadas. En tal célula hospedante
se introduce con preferencia un vector de expresión, que contiene
el gen para obtener un producto genético heterólogo en combinación
con el promotor del gen Ub/S27a y/u otras secuencias reguladoras.
La célula hospedante de la presente invención es con preferencia una
célula de mamífero. La célula hospedante puede ser con preferencia
una célula de hámster, p. ej. una célula CHO (CHO = Chinese hamster
ovary; Urlaub y Chasin, 1980; véase también Kaufman, 1987 y las
referencias que contiene, así como Sambrook y col.,
16.28-16.29, 1989), una célula BHK (BHK = Baby
hamster kidney) o una célula de hibridoma, con preferencia especial
una célula CHO.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para la obtención de un producto genético heterólogo
en una célula hospedante eucariota, con preferencia en una célula de
hámster, con preferencia en una célula CHO, caracterizado porque
una de las moléculas de ácido nucleico mencionadas se introduce en
la célula hospedante eucariota, se cultiva la célula hospedante y
se aísla el producto genético sintetizado. Con el procedimiento de
la invención, el producto genético heterólogo se expresa bajo el
control de las secuencias de promotor y/o secuencias reguladoras
del gen Ub/S27a, con preferencia procedentes del hámster. Para
semejante procedimiento pueden utilizarse con ventaja las moléculas
de ácido nucleico, que contienen las secuencias de promotor y/u
otras secuencias reguladoras representadas en la figura 5. Es
preferido en particular un procedimiento, en el que las secuencias
de promotor están contenidas dentro de la secuencia que corresponde
a las posiciones de -161 a -45 de la figura 5. También en este caso
es incumbencia de los expertos la obtención de secuencias parciales
que tengan actividad del promotor o variantes equivalentes de las
secuencias publicadas.
De este modo se prepara por cebadora vez un
promotor homólogo intenso del hámster, que es muy ventajoso para la
obtención de productos genéticos heterólogos en células de hámster,
en especial en células CHO. La invención se refiere en particular a
un promotor homólogo intenso del hámster, que en las células CHO en
un ensayo CAT descrito en el ejemplo 4 despliega una actividad
mayor que el promotor de timidina-quinasa procedente
del Herpes simplex. Tal promotor presenta con ventaja una
actividad de transcripción, que es por lo menos del mismo orden que
la del promotor SV40. Del mismo orden significa en este caso que el
promotor de la invención tiene por lo menos el 50%, mejor todavía
por lo menos el 80%, con mayor preferencia por lo menos el 90% de
la actividad del promotor SV40 en el ensayo CAT descrito en el
ejemplo 4. Con preferencia, tal promotor está caracterizado porque
tiene por lo menos una de las propiedades siguientes: región de
secuencia con abundancia de GC, sitio de unión Sp1, elemento de
polipirimidina, ausencia de una caja TATA. Es preferido en especial
un promotor, que presenta un sitio de unión Sp1 y ausencia de caja
TATA. Es también preferido un promotor que se active
constitutivamente y sea activo de igual manera en condiciones de
cultivo celular con suero, con poco contenido de suero y sin suero.
En otra forma de ejecución se trata de un promotor inducible, en
especial de un promotor, que se activa con la privación de suero.
Una forma de ejecución especialmente preferida es un promotor que
tiene una secuencia descrita en la figura 5. Es preferida en
especial una secuencia contenida en la secuencia que corresponde a
las posiciones de -161 a -45 de la figura 5.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para la expresión de un producto genético heterólogo
en células de hámster dentro del alcance de las reivindicaciones,
con preferencia células CHO, que está caracterizado porque el
producto genético se expresa bajo el control de un promotor homólogo
intenso de hámster. En las formas preferidas de ejecución, tal
promotor se distingue por las características definidas en el
párrafo precedente.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de un promotor, descrito en lo que antecede, para la obtención de
un producto genético heterólogo en células de hámster, con
preferencia en células CHO o BHK.
Las secuencias de promotor descritas pueden
alojarse en un cassette de expresión en relación funcional con
otras secuencias reguladoras. Por ejemplo pueden unirse
funcionalmente con secuencias de intensificador (enhancer) y de
este modo incrementar la actividad de transcripción. Puede ser uno o
varios intensificadores y/o varias copias de una secuencia de
intensificador. Por ejemplo, puede emplearse un intensificador CMV-
o SV40. El intensificador CMV humano pertenece a los
intensificadores más potentes identificados hasta el momento. Un
ejemplo de intensificador inducible es el intensificador de
metalotioneína, que puede estimularse con glucocorticoides o
metales pesados. Otra posible modificación sería p. ej. la
introducción de múltiples sitios de unión Sp1. Las secuencias de
promotor pueden combinarse además con secuencias reguladoras, que
permiten un control/regulación de la actividad de transcripción. De
este modo puede hacerse que un promotor se reprimible/inducible.
Esto puede efectuarse por ejemplo uniendo secuencias, que
constituyen sitios de unión para factores de transcripción
reguladores positivos o negativos. Por ejemplo, el factor de
transcripción SP-1 ya mencionado tiene una
influencia positiva en la actividad de transcripción. Otro ejemplo
es el sitio de unión de la proteína de activador
AP-1, que puede desplegar un efecto en la
transcripción tanto de modo positivo como negativo. La actividad de
la AP-1 puede regularse con los factores más
diversos, p. ej. factores de crecimiento, citocinas y suero, (Faisst
y Meyer, 1992, y referencias que allí se citan). La eficacia de la
transcripción puede incrementarse también modificando la secuencia
de promotor con una mutación (sustitución, inserción, deleción) de
una, dos, tres o más bases y después midiendo con el ensayo CAT
descrito en el ejemplo 4, si con ello ha aumentado la actividad del
promotor. Con las medidas descritas en este párrafo se puede obtener
un cassette de expresión optimizado, que es muy útil para la
expresión de productos genéticos heterólogos, en especial en células
CHO. Es también
objeto de la invención un cassette de expresión obtenido con la aplicación de una o varias medidas de este tipo.
objeto de la invención un cassette de expresión obtenido con la aplicación de una o varias medidas de este tipo.
Con los análisis "footprint" de la DNasa I
y de mutación puede estudiarse que factores influyen en la expresión
y si la actividad del promotor puede incrementarse todavía mediante
la deleción de los elementos de control negativos eventualmente
existentes y mediante la introducción de otros elementos positivos
de control. Además, los estudios realizados por otros grupos de
trabajo han puesto de manifiesto que la expresión del gen Ub/S27a
puede regularse evidentemente con factores diversos. El grupo de
Shimbara ha puesto de manifiesto, por ejemplo, que en el caso de la
diferenciación terminal "in vitro" de líneas celulares
de leucemia humana (HL-60, K562, U937, THO1) puede
regularse a la baja la expresión del gen Ub/S27a (Shimbara y col.,
1993) con la adición de diversas sustancias, por ejemplo el TPA
(12-O-tetra-decanoilforfol-13-acetato),
DMSO, ácido retínico y la 1,25-dihidroxivitamina
D3, al medio de cultivo. Y el grupo de Wong constató la
sobreexpresión del gen Ub/S27a en células de carcinoma del
intestino recto (Wong y col., 1993). La expresión genética guarda
buena relación con los estadios tumorales clínicos de expresión
elevada en el caso de cáncer avanzado.
La ejecución de la invención es posible para los
expertos que conozcan el contenido publicado en esta solicitud, los
métodos de por sí conocidos y los descritos en los ejemplos.
El gen Ub/S27a completo, la región 5' no
traducida del gen Ub/S27a y los fragmentos seleccionados del mismo
pueden obtenerse por diversos métodos estándar conociendo las
secuencias representadas en las figuras 1, 2 y 5. A partir de la
secuencia de la figura 5 puede sintetizarse químicamente un
fragmento idóneo y una sonda de oligonucleótido, que tenga la
secuencia de este fragmento (Sambrook y col.,
11.3-11.44, 1989). Con semejante sonda y mediante
la hibridación de una biblioteca genómica del hámster (Sambrook y
col., 9.4-9.62, 11.45-11.61, 1989)
puede clonarse el gen Ub/S27a o su región no traducida. La región 5'
no traducida o fragmentos especiales de la misma pueden obtenerse
también fácilmente por amplificación PCR con los cebadores
correspondientes a partir de una biblioteca genómica (Sambrook y
col., 14.5-14.35, 1989). Este método es idóneo en
especial para la obtención de fragmentos seleccionados de la región
del promotor, por ejemplo la región de -161 a -45 o un fragmento de
esta región. Los fragmentos de la región 5' sin traducir, por
ejemplo los recogidos en la tabla 1, pueden obtenerse también por
digestión limitada de la exonucleasa III a partir de fragmentos
mayores de DNA (Sambrook y col., 15.14-15.19;
5.84-5.85, 1989). Tales moléculas de DNA pueden
sintetizarse también químicamente o pueden generarse por ligación a
partir de fragmentos sintetizados químicamente. El gen Ub/S27a de
otra especie, con preferencia de una especie de mamífero, o su
región 5' sin traducir puede aislarse por hibridación cruzada con
sondas de con de sondas de la porción S27a del gen Ub/S27a de
hámster.
En el estado de la técnica se dispone de un gran
número de vectores de expresión que pueden emplearse en relación
con de la presente invención. Las secuencias de promotor y/o
reguladoras de la presente invención pueden integrarse al sitio que
ocupan los elementos de promotor existentes en estos vectores y, de
este modo, regular la expresión del gen correspondiente, que va a
expresarse con este vector. Los vectores comercialmente disponibles,
que son idóneos para la integración del promotor de la invención,
son por ejemplo el vector pCAT-Basic (Promega;
secuencia compilada accesible a través del número de registro X65322
de EMBL) o el vector intensificador pCAT, que contiene además un
intensificador SV40 (Promega; secuencia compilada accesible a través
del número de registro X65319 de EMBL). Un ejemplo de vector sin
promotor es el plásmido pBL-CAT6 (Boshart y col.,
1992; ver también Luckow y Schütz, 1987). Las secuencias de
promotor de la invención pueden ligarse a los sitios de restricción
HindIII, SphI, PstI, SalI, XbaI, BamHI, BglII o XhoI de este vector
y, de este modo, unirse funcionalmente con el gen de
cloranfenicol-transferasa (CAT) existente en este
vector. En lugar del gen de la CAT puede integrarse también en este
vector otro gen, por ejemplo de activador de plasminógeno de
tejidos. El gen de la CAT puede eliminarse del vector
pBL-CAT6 p. ej. por doble digestión con las enzimas
de restricción XhoI y ClaI. La región 3' no traducida de SV40, que
de este modo sufre deleción y que contiene la secuencia de intrón y
la señal de poliadenilación, puede eventualmente (es decir, en el
supuesto de que su función no haya sido asumida por las secuencias
3' propias del gen) integrarse de nuevo a continuación, para ello p.
ej. se amplifica esta región SV40 mediante PCR y al mismo tiempo se
dota de los sitios de restricción idóneos en ambos extremos, con lo
cual se facilitan las reclonaciones posteriores, p. ej. con
introducción de otro gen que se desee. Otra estrategia para el
intercambio del gen CAT por otro gen consiste en que en primer lugar
se introduce mediante una PCR y oligonucleótidos mutágenos idóneos
un sitio de restricción singular del extremo 5' de la región SV40
en el vector pBL-CAT6, lo cual permite seguidamente
eliminar selectivamente el gen de la CAT. Otra posibilidad consiste
en el uso del vector pLUC, que en principio tiene la misma
estructura que el pBL-CAT6, pero en lugar del gen
CAT contiene un gen informante (reporter) de luciferasa. Este puede
eliminarse fácilmente por doble digestión con XhoI/EcoNI, con lo
cual la secuencia SV40 permanece en el vector.
Para la generación de líneas celulares estables,
con alta expresión del gen heterólogo, se elige con ventaja un
vector que permita la selección de los transformandos, que han
integrado al vector en su cromosoma y han amplificado al gen
integrado heterólogo. Los vectores de tales procedimientos de
selección/amplificación, como es el procedimiento de
DHFR/metotrexato en las líneas celulares deficientes de DHFR (p. ej.
CHO-DUKX) son también del estado de la técnica
(Sambrook y col., 16.9-16.15;
16.28-16.29, 1989).
Los expertos en la materia podrán consultar los
procedimientos para la inserción de los vectores obtenidos en las
células hospedantes así como la selección y el cultivo de los
transformandos en los manuales correspondientes (p. ej. Sambrook y
col., 16.3-16.81, 1989).
Prescindiendo de la optimización del promotor,
existir además un aspecto totalmente diferente de la mejora del
rendimiento en producto, a saber, a través del efecto de la dosis
del gen (número de veces que el gen está presente en el núcleo de
una célula). A medida que aumenta el número de copias del constructo
del vector integrado en el genoma, debería aumentar también la
cantidad de transcritos producidos. Se puede conseguir una
amplificación espontánea de los constructos introducidos, que da
lugar a una integración estable de un gran número de copias,
mediante el uso de una secuencia que tenga propiedades favorables a
la amplificación, son las llamadas "amplification promoting
sequences". Una secuencia de este tipo, que posee un contenido
muy elevado de AT, se ha aislado p. ej. a partir de la región
inter-genes no transcrita de los genes ribosómicos
de ratón (Wegner y col., 1989) y ya se ha empleado con éxito para la
inhibición estable y eficiente de la replicación del
HIV-1 mediante un RNA antisentido (Meyer y col.,
1993). Un segmento de la secuencia, de un tamaño de 49 bp, de la
región 5' no traducida del gen Ub/S27a 5' (posiciones de -1477 a
-1429; figura 4) con un contenido elevado de AT, a saber del 88%,
presenta una gran homología con las secuencias que favorecen la
amplificación, recién descritas, del ratón. Que este segmento de la
secuencia de CHO posee también estas propiedades, puede demostrarse
con el uso de constructos de promotor de Ub/S27a, cuya secuencia CHO
ocupa una posición previa.
Figura
1
Comparación de la secuencia del cDNA del CHO
Ub/S27a con la secuencia del cDNA humano (Adams y col., 1992). Se
señalan las identidades dentro de la secuencia con un asterisco
"*". Se marca la porción de ubiquitina con doble línea a lo
largo de la secuencia. Se marcan las posiciones de los tres intrones
con triángulos.
___ señal de poli-A
\hskip0.5cm::: codón de inicio
\hskip0.5cm+++ codón de paro
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Comparación de la secuencia de aminoácidos
Ub/S27a derivada de la secuencia de cDNA de CHO con la secuencia
humana de aminoácidos (Adams y col., 1992). Se señalan las
identidades dentro de la secuencia con un asterisco "*". La
unidad de ubiquitina de 76 aminoácidos se destaca con doble línea a
lo largo de la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
En un gel de agarosa que contiene formaldehído
se separa por electroforesis el RNA total citoplasmático
desnaturalizado (10 \mug) de células CHO cultivas con y sin suero
y se transfiere a una membrana de poliamida (Nylon). Como sonda de
hibridación se utiliza el cDNA de Ub/S27a marcado con P (508 bp)
procedente de CHO. El tiempo de exposición de la película
radiológica es de 3 horas.
1 + 3 células CHO cultivadas con suero
2 + 4 células CHO cultivadas sin suero
5 células CHO cultivadas con suero, después se
cultivan en medio sin suero durante 24 horas
6 células CHO cultivadas sin suero, después se
cultivan en un medio que contiene suero durante 24 horas
\newpage
Figura
4
Se representa esquemáticamente la región 5' sin
traducir del gen Ub/S27a, que tiene un tamaño de 2,5 kb. Se
secuencian tanto los fragmentos de restricción subclonados, como los
clones de deleción generados por digestión con exonucleasa III. Se
indica el grado y la dirección de las secuenciaciones con una
flecha.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
- _______
- sitio de restricción
- ->
- extremo 5' del clon de deleción del promotor
- *
- extremo 3' del clon de deleción del promotor
\circun{5} \hskip0.9cmhomología de las secuencias que favorecen la amplificación
- ''''''''''
- segmento de secuencia con abundancia de polipirimidina
- :::
- codón de inicio
- +1, +13
- sitios de inicio de transcripción determinados por mapeado de nucleasa S1
- +85
- extremo 5' obtenido por extensión de cebador
- \may{5}
- sitio de unión Sp1
\vskip1.000000\baselineskip
Se numeran los nucleótidos en relación al sitio
de inicio de la transcripción, que se indica con +1. Se destacan de
la secuencia con un subrayado los sitios de restricción de SacII y
EagI, que son específicos de segmentos de secuencia ricos en GC,
así como los sitios de restricción requeridos para fines de
subclonación de la EcoRI, HincII y HindIII. Se emplean letras
minúsculas para marcar la secuencia del intrón. Se reproduce la
secuencia de aminoácidos debajo de la secuencia del DNA.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
El análisis de la extensión del cebador se
realiza con 5 \mug de RNA citoplasmático total de células CHO
cultivadas en suero (pista 1). Como control se emplean 5 \mug de
levadura tRNA (pista 2). El cebador, cuyo extremo se ha marcado con
P^{32}, se hibrida con la porción S27a del mRNA de Ub/S27a
(nucleótidos de +256 a +276 de la secuencia del cDNA). Se separan
los productos de la extensión en un gel de poliacrilamida
desnaturalizada del 6%. Como marcador de tamaño se emplea una
reacción de secuenciación. La longitud del producto de extensión,
cuya posición se marca con una flecha, fue de 304 nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
7
Se hibrida una sonda de hebra simple, cuyo
extremo se ha marcado con P^{32}, correspondiente a la secuencia
de la hebra opuesta, que abarca la totalidad del segmento de la
región 5' sin traducir (de -2289 a +176), se hibrida con 5 \mug
de RNA total (pista 2) o bien con RNA citoplasmático total (pista 3)
células CHO cultivadas en suero. Como control se emplean 5 \mug
de levadura tRNA (pista 1). En un gel de poliacrilamida
desnaturalizada del 8% se separan los fragmentos protegidos de la
degradación con la nucleasa S1. Como marcador de tamaño se emplea
una reacción de secuenciación, en la que se secuencia la hebra de
DNA que es complementaria de la sonda de hibridación empleada. El
cebador empleado para la secuenciación se hibridó con la secuencia
de nucleótidos de +157 a +176. En la secuencia destacada se marcan
con una flecha los fragmentos de DNA protegidos contra la
degradación. La posición de nucleótido +1 se subordina al punto
distal de inicio de la transcripción.
\newpage
Figura
8
Los constructos vectoriales, en los que se han
fusionado deleciones en serie de la región que flanquea a 5' del
gen Ub/S27a en ambas orientaciones con gen informante de la CAT, se
emplean para la transfección transitoria de células de CHO
cultivadas en suero. Como control se emplean plásmidos, en los que
el gen informante de CAT se halla bajo el control de un promotor
vírico. En total se realizan cuatro ensayos de transfección,
independientes entre sí.
La actividad CAT relativa de los diversos
constructos vectoriales se indica en forma de porcentaje de la
actividad CAT en células CHO transfectadas en pCMVtkCAT, a las que
se atribuye el valor 100%, y se presenta el valor promedio
(desviación estándar en todos los casos \leq 5%) de los cuatro
ensayos de transfección. Las actividades totales de CAT se corrigen
atendiendo a la cantidad de proteína empleada y a la eficacia de la
transfección, que se determina con la medición de la actividad de
la galactosidasa \beta del plásmido de control
co-transfectado
pCMVtklacZ.
pCMVtklacZ.
- \Box
- plásmido de control: sin promotor ni promotores víricos (tk, SV40)
- \blacksquare
- región 5' sin traducir del Ub/S27a: orientación 5'-3' en pBL-CAT6
\hskip1.3cmregión 5' sin traducir del Ub/S27a: orientación 3'-5' en pBL-CAT6
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
9
- \Box
- plásmido de control: sin promotor ni promotores víricos (tk, SV40)
- \blacksquare
- región 5' sin traducir del Ub/S27a: orientación 5'-3' en pBL-CAT6
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
10
Se representa la actividad CAT en células que se
han transfectado de modo estable con el vector pCMVtkCAT
(tk-promotor/CMV-intensificador) o
con el vector pBL-CAT5 (tk-promotor)
(véase ejemplos/plásmidos, ejemplo 6). Se presentan en cada caso
varios clones distintos. La actividad CAT se normaliza con respecto
a la actividad del clon pCMVtkCAT6, que presenta la actividad
máxima (que se toma como el 100%). La gráfica se emplea para
comparar las figura 11 y 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
11
Se representa la actividad CAT de diversos
constructos vectoriales en forma de porcentaje de la actividad CAT
del clon 6 de las células CHO transfectadas con pCMVtkCAT de la
figura 10. Los fragmentos de la región del promotor según la tabla
1 se integran en el pBL-CAT6 en una orientación
5'\rightarrow3'. Las abscisas indican qué fragmento se ha
empleado. Se representa la actividad de varios clones distintos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
12
Se representa la actividad CAT de diversos
constructos vectoriales en forma de porcentaje de la actividad CAT
del clon 6 de las células CHO transfectadas con pCMVtkCAT de la
figura 10. Los fragmentos de la región del promotor según la tabla
1 se integran en el pBL-CAT6 en una orientación
5'\rightarrow3'. Las abscisas indican qué fragmento se ha
empleado. Se representa la actividad de varios clones distintos.
\newpage
Figura
13
Esta figura contiene una recopilación de datos
de las figuras de 10 a 12. Se presentan los clones de células con
la expresión CAT máxima y mínima de cada constructo vectorial, que
se haya empleado en el ensayo (solamente plásmidos del promotor
Ub/S27a que tienen la orientación 5'\rightarrow3').
Para la realización del conjunto de
manipulaciones genéticas se emplea el vector pBluescript SK
(Stratagene Cloning Systems, Stratagene GmbH, Heidelberg,
Alemania). Para el análisis de expresión se emplean vectores de
expresión eucariotas, que, como gen informante, contienen el gen de
la cloranfenicol-acetiltransferasa bacteriana
(CAT). El gen CAT se fusiona para ello con diversos promotores
víricos. En el pBL-CAT5 es el promotor de la
timidina-quinasa (tk) del virus del Herpes
simplex (Boshart y col., 1992; secuencia compilada accesible a
través del número M80483 del Gen-Bank), en el
pCMVtkCAT el promotor tk en combinación con un intensificador del
virus de la citomegalia humana (CMV) (Christoph Winkler, Würzburg) y
en el pKSSV2CAT el promotor SV40 (Tsonis y col., 1988). El
pBL-CAT6 se utiliza como control negativo y contiene
un gen CAT sin promotor (Boshart y col., 1992; secuencia compilada
accesible a través del número M80484 del Gen-Bank).
En el vector pCMVtklacZ, la expresión del gen de la
\beta-galactosidasa bacteriana está controlada por
una combinación de intensificador CMV/promotor tk (Christoph
Winkler, Würzburg).
Se suplementan las células
CHO-DUKX (Urlaub y Chasin, 1980) en un medio del
tipo mezcla 1:1 de medio Dulbecco's Modified Eagle's/medio Ham's
F12 con un 5% de suero bovino fetal, en frascos Roux, en un armario
de incubación que puede gasearse con CO_{2} y tiene una humedad
ambiental del 90%, 37ºC y un 5% de CO_{2}. Para el cultivo sin
suero se emplean células CHO-DUKX, que se habían
adaptado lentamente al cultivo en un medio sin suero y ahora se
cultivan de modo permanente en un medio sin suero. Estas células se
cultivan en suspensión en frascos de Spinner en un medio del tipo
mezcla 1:1 de medio Iscove's Modified Dulbecco's/medio Ham's F12,
suplementado con peptona de bajo peso molecular (Aldag, Hamburgo),
insulina y transferrina (Canada Packars).
Empleando mRNA poliadenilados de células CHO,
que se han cultivado en suero o sin suero, se preparan en primer
lugar dos bancos genéticos de cDNA en \lambdaZAPII, que constan de
4,2 x 10^{6} ó 2,9 x 10^{5} clones de fagos recombinantes.
El RNA citoplasmático se prepara de células
lisadas en NP40 y purificadas con extracciones de fenol/cloroformo
(Nicolaides y Stoeckert, 1990). El mRNA poliadenilado de células
CHO, cultivadas con o sin suero, se obtiene por cromatografía de
afinidad en una columna Oligo(dT)-Celulosa
(Sambrook y col., 1989). Para obtener el cDNA se emplea el kit de
síntesis de cDNA de Pharmacia LKB, empleando para la síntesis de la
primera hebra un cebador del tipo Oligo (dT). Se clona el cDNA con
el vector \lambdaZAPII digerido en EcoRI (Strategene Cloning
Systems). Se exploran mediante hibridación diferencial los
duplicados de filtro del banco genético de cDNA de CHO no
amplificadas procedentes de células CHO cultivadas sin suero. Como
sonda se utiliza el cDNA total de células CHO cultivadas con suero
y cultivadas sin suero, que se habían marcado mediante "random
priming" (Prime a Gene labelling Kit; Promega Cooperation,
Promega Biotec, Madison, WI, USA) con dCTP
(\alpha-P^{32}) (6000 Ci/mmol; Amersham
International plc, Amersham-Buchler, Braunschweig,
Alemania). La hibridación se realiza del modo descrito en el
análisis Northern Blot (véase entre otros el ejemplo 2). Se aíslan
las placas de fagos, que presentan hibridación intensa con las dos
sondas de cDNA, y se someten de nuevo a una hibridación diferencial.
De los fagos \lambdaZAPII recombinantes se obtienen fagémidos por
escisión "in vivo" empleando el fago auxiliar R408
(instrucciones de uso del \lambdaZAPII cloning kit; Stratagene
Cloning Systems).
De este modo se exploran unos 6000 clones de
fago. Se aíslan un total de 12 clones de fago recombinantes, que
presentan una hibridación especialmente intensa con las dos sondas
de cDNA total.
Las secuencias de DNA se determinan por el
método didesoxi empleando el kit de secuenciación T7 de Pharmacia
LKB. Como cebador se emplean tanto los cebadores de promotor T3 y T7
como cebadores específicos de genes. En todos los casos se marcan
las sonda de DNA con dATP [\alpha-S^{35}] o con
dCTP [\alpha-S^{35}] (10 \muCi; Amersham
International plc). Los productos de la reacción se separan por
electroforesis a través de un gel de secuenciación de
poliacrilamida del 6%. Para el análisis de las secuencias se emplean
los bancos de datos GenBank y EMBL.
Uno de los clones de cDNA aislado codifica a una
proteína de fusión, la Ub/S27a, que consta de una unidad monómera
de ubiquitina y una proteína ribosómica de la subunidad pequeña,
S27a (figura 1). La mayor homología es la existente con la
secuencia de la Ub/S27a humana (Adams y col., 1992) que tiene una
homología del 92,2% en el plano del cDNA y una homología del 100%
en el plano de los aminoácidos. El cDNA aislado de CHO Ub/S27a
tiene un tamaño de 508 bp y abarca la totalidad de la región de
codificador así como una señal de poliadenilación en la región 3'
no traducida y dos elementos de iniciación de traducción que se
solapan mutuamente en la región 5' no traducida (figura 1). En base
a la secuencia de cDNA se pone también de manifiesto que se trata de
un verdadero gen de fusión, es decir, ambas porciones de proteína
se codifican con un único gen. La secuencia de la proteína de
fusión resultante está muy conservada, los primeros 76 aminoácidos
de la proteína que tiene un tamaño de 156 aminoácidos abarcan la
porción de la ubiquitina (figura 2).
Se estudia el grado de la expresión del gen
Ub/S27a mediante ensayos Northern Blot, en los que se emplea el RNA
citoplasmático total de las células CHO cultivadas con suero y
cultivadas sin suero.
El RNA citoplasmático se prepara a partir de
células lisadas con NP40 y se purifica con extracciones de
fenol/cloroformo (Nicolaides y Stoeckert, 1990). Se separa el RNA
(10 \mug) por electroforesis en un gel de
agarosa-formaldehído, se transfiere a una membrana
de poliamida (Hybond N, Amersham International plc) (Sambrook y
col., 1989) y se reticula con la membrana con formación de un
enlace covalente mediante una irradiación UV (254 nm) de 5 minutos.
Se hibridan los filtros de RNA a 65ºC durante una noche en una
solución que contiene 4 x SSC, 10 x Denhardt, 0,1% SDS y 1 x
10^{6} cpm/ml de sonda de cDNA marcada con P^{32}. Se marcan los
fragmentos de cDNA empleando un "random primer" (cebador
aleatorio) (Prime a Gene labeling kit; Promega Corporation), la
actividad específica de las sondas de DNA es de 4-8
x 10^{8} cpm/\mug de DNA. Después de la hibridación se lavan
los filtros dos veces con 0,2 x SSC/0,1% SDS a 65ºC durante 20
minutos. Sobre los filtros envueltos con una lámina doméstica se
coloca una película radiológica (Curix; Agfa-Gevaert
N.V.) y se efectúa una autorradiografía a -70ºC durante 3 horas.
Tanto en las células CHO cultivadas con suero en
condiciones estándar como en las células CHO adaptadas al cultivo
en un medio sin suero se han podido detectar transcritos de Ub/S27a
de una longitud de aproximadamente 600 nucleótidos, en gran número
y cantidades iguales (figura 3). Los dos transcritos adicionales de
aprox. 1500 y 2800 nucleótidos son transcritos de poliubiquitina,
en los que se han fusionado entre sí varias unidades monómeras de
ubiquitina. Los transcritos de poliubiquitina, que en estas
condiciones de cultivo se expresan en un nivel notablemente
inferior, se hibridan con la porción de ubiquitina del cDNA de
Ub/S27a empleado como sonda en los análisis Northern Blot. El nivel
de transcritos de Ub/S27a continúa siendo invariablemente alto,
cuando las células de CHO, que fueron cultivadas en medio sin suero,
se cultivan durante 24 h en un medio que contiene suero (figura 3).
Un resultado diferente es el que se obtiene cuando las células de
CHO cultivadas en suero en condiciones estándar se trasladan a un
medio sin suero durante 24 h. El número de transcritos de Ub/S27a
disminuye considerablemente (figura 3). Esto se debe a que la mayor
parte de las células CHO ya no se dividen durante esta fase de
cultivo de 24 horas en un medio sin suero, presentando además una
reducción de su volumen celular. En las células que alcanzan este
estadio tiene lugar solamente una escasa transcripción, suponiendo
que se dé.
Para aislar la región de promotor del gen
Ub/S27a se prepara en primer lugar un banco genético de CHO genómico
con un millón de clones de fagos recombinantes, empleando para ello
el DNA genómico de células CHO cultivadas en suero.
Se obtiene el DNA genómico de células lisadas
con NP40 con arreglo al método propuesto por Nicolaides y Stoeckert
(Nicolaides & Stoeckert, 1990). A diferencia del método descrito
de precipitación por salificación, después de la digestión con la
proteinasa K1 se extrae el DNA tres veces con fenol/cloroformo.
Los extremos del DNA genómico parcialmente
digerido con Sau3AI, que tienen un tamaño medio de fragmento de 20
kb, se rellenan por media cara empleando dGTP y dATP y se ligan con
el vector \lambdaGEM-12 digerido con XhoI
(extremos de DNA rellenados por media cara con dTTP y dCTP; Promega
Corporation). Para la encapsidación se emplean extractos
comerciales (Gigapack II Plus packaging extracts; Stratagene Cloning
Systems).
Este banco de genes genómicos se hibrida
solamente con la fracción S27a del cDNA de Ub/S27a, con el fin de
evitar la hibridación cruzada con los genes de la poliubiquitina.
Uno de los clones genómicos aislados, de una longitud total de 14
kb, contiene entre otras la región codificadora completa y una
región 5' no traducida de 2,5 kb. La región codificadora se
interrumpe con tres intrones de secuencias correctas de consenso en
las zonas de transición exón/intrón e intrón/exón (Breathnach &
Chambon, 1981), dos de estos intrones están localizados en la
porción de la ubiquitina y el tercer intrón se halla en la porción
del S27a (figura 1).
Las dos hebras de DNA de la región 5' sin
traducir se secuencian por completo (método: véase ejemplo 1). Esto
se realiza por secuenciación de los fragmentos de restricción
subclonados y por secuenciación de los clones de deleción
solapados, que se generan por digestión con la exonucleasa III
(figura 4). La región del promotor potencial no contiene ninguna
caja TATA, pero sí una región de secuencia rica en CpG (67% de GC de
-144 a +129), en la que existen también los sitios de unión
singulares para el factor de transcripción Sp1 (Dynan & Tjian,
1983) y en cada caso un sitio de restricción para EagI y SacII, que
son específicos de tales regiones ricas en GC, así como regiones de
secuencia ricas en polipirimidina (figura 5).
Para la localización del punto de inicio de la
transcripción se realizan tanto la extensión del cebador como un
mapeado de la nucleasa S1 en RNA total de células CHO cultivadas en
suero. Para evitar la extensión de transcritos de poliubiquitina se
emplea un cebador para la extensión, que se hibrida con la porción
S27a del mRNA de Ub/S27a (complementaria de los nucleótidos
+256-276 bp de la secuencia del cDNA).
Se hibrida un oligonucleótido de secuencia
5'-GTGGTGTAGGACTTCTTCTTC-3',
complementaria de los nucleótidos de +256 a +276 de la secuencia
del cDNA del Ub/S27a, con 5 \mug de RNA citoplasmático total de
células CHO cultivadas en suero y se prolonga (Ausubel y col.,
1987).
Se obtiene por PCR del modo descrito a
continuación la sonda de hebra simple utilizada para el mapeado de
la nucleasa S1, sonda que abarca la región de -2289 a +176 de la
secuencia genómica del Ub/S27a. Se clona la región 5' sin traducir
de la secuencia genómica del Ub/S27a (de -2289 a +240) en la
orientación 5'-3' en el vector pBluescript SK -
(Stratagene Cloning Systems). Se emplea este plásmido híbrido como
molde para la PCR. Para la amplificación se emplea un cebador
promotor T3 biotinilado y un cebador específico de Ub/S27a marcado
con ATP [\gamma-P^{32}]
(5'-CTCGAGCGTGATCGTTTTCC-3',
complementario de los nucleótidos de +157 a +176 de la secuencia
genómica del Ub/S27a). La obtención de la hebra simple,
complementaria de la secuencia de RNA, se realiza por
desnaturalización alcalina del producto de PCR fijado sobre
esferillas magnéticas de estreptavidina (instrucciones de uso de
las Dynabeads M-280 Streptavidin; Dynal A.S.,
Noruega). Se hibridan 2 x 10^{5} cpm de la sonda de hebra simple
con 5 \mug de RNA total de células CHO cultivadas en suero a 55ºC
durante una noche y a continuación se tratan los productos de la
hibridación con nucleasa S1 (Ausubel y col., 1987).
El producto obtenido por extensión con cebador
presenta una longitud de 304 nucleótidos (figura 6), por lo cual el
punto de inicio de la transcripción estaría situado 44 bp en sentido
ascendente (de 5' a 3') del codón de inicio dentro de un elemento
de polipirimidina (figura 5). Sin embargo, este punto de inicio no
se ha podido verificar con el mapeado de nucleasa S1. Con el
mapeado de la nucleasa S1 se han hallado dos puntos de inicio de
transcripción (figura 7), que están situados 128 bp y 116 bp en
sentido ascendente del codón de inicio dentro de la secuencia de
polipirimidina y sus posiciones se indican a continuación como
posición +1 y +13 (figura 5, figura 7). La explicación más
verosímil de la discrepancia observada entre los dos métodos de
mapeado estriba en la terminación prematura de la reacción de
extensión del cebador. Debido a la posición del cebador en la
secuencia S27a, la longitud del producto de extensión esperado es
superior a 300 bases y por ello se sitúa por encima de la longitud
óptima, cifrada en torno a 100 bases. Cuanto mayor es la distancia
entre la posición del cebador y el punto de inicio de transcripción
deseado, tanto mayor será la probabilidad de la interrupción
prematura de la transcripción inversa causada por secuencias ricas
en GC y formaciones estructurales secundarias dentro del mRNA. En
cambio, para el mapeado de la nucleasa S1 se emplea una sonda de
hebra simple que abarca la región total 5' no traducida (región de
secuencia de +2289 a +176; figura 5), que se obtiene a partir de un
producto de PCR, con lo cual se soslayan los problemas que aparecen
en la extensión de cebador durante la transcripción inversa de
secuencias ricas en GC.
Nuestros estudios de la región 5' no traducida,
de un tamaño de 2,5 kb, indican que el posible promotor no posee
una caja TATA ni una caja CAAT. La secuencia situada en sentido
ascendente (de 5' a 3') del codón de inicio se caracteriza por un
alto contenido en GC. Dentro de esta secuencia se encuentra un sitio
de unió singular para el factor de transcripción Sp1. Con el
mapeado de nucleasa S1 se identifican dos puntos prominentes de
inicio de transcripción, situados dentro de una secuencia de
polipirimidina 128 y 116 bp en sentido ascendente del codón de
inicio.
Por digestión con exonucleasa III se obtiene una
serie de clones de deleción 5' (tabla 1). Para ello se clona en
ambas direcciones la región 5' sin traducir del gen Ub/S27a (de
-2289 a +240) en el sitio de restricción HincII del vector
pBluescript SK (Stratagene Cloning Systems). Para la introducción de
deleciones unidireccionales se digieren estos plásmidos híbridos
con KpnI y XhoI y se tratan con la exonucleasa III, del modo
descrito en las instrucciones de uso de los kits
"Erase-a-base" (Promega
Corporation). Los fragmentos de DNA resultantes se integran como
fragmentos BamHI en el sitio de restricción singular BamHI del
vector pBL-CAT6.
Antes de iniciar la digestión con la exonucleasa
III puede modificarse el vector pBluescript Sk, incluso con la
introducción de adaptadores, que contengan sitios de restricción
idóneos, con el fin de facilitar los siguientes ensayos de
clonación de genes. Pueden utilizarse por ejemplo, además del BamHI,
otros sitios de restricción enzimática para fines de clonación, p.
ej. según el esquema:
\vskip1.000000\baselineskip
La indicación de la posición se refiere a la
numeración de la secuencia genómica de Ub/S27a representada en la
figura 5.
Todos los clones de deleción tienen un extremo
3' común (posición +111), situado entre los sitios de inicio de
transcripción y el codón de inicio (figura 5). El fragmento mayor
abarca 1,7 kb y el fragmento menor 150 bp (tabla 1). Este último es
el único fragmento que no contiene el sitio de unión singular Sp1.
Antes que el gen CAT sin promotor, que actúa como gen informante,
se clonan estas regiones de promotor potencial en el vector
eucariota de expresión pBL-CAT6 y se utilizan para
la transfección transitoria de células CHO cultivadas en suero.
El día antes de la transfección se siembran 2 x
10^{5} células en cada placa de 20 cm^{2}. Se transfectan las
células con 10 \mug de DNA plásmido (constructo de informante CAT)
y 500 ng del plásmido pCMVtklacZ empleando un método modificado de
precipitación con fosfato cálcico (Chen & Okayama, 1987). Se
recurre a la actividad de la \beta-galactosidasa
para determinar la eficacia de la transfección. Después de una
incubación a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 4 horas se elimina el
exceso de DNA precipitado por lavado con PBS.
Después de un período de incubación de 48 horas
se lavan las células en primer lugar con PBS. Después se añaden en
cada caso 1 ml del tampón NTE enfriado con hielo (0,1 M NaCl, 10 mM
Tris-HCl, pH 7,8, 1 mM EDTA) a las placas, se
sueltan las células de las placas con un rascador y se trasladan a
un matraz Eppendorf. Se centrifugan las células a 9000 rpm durante
3 minutos, se obtiene un culote que se suspende de nuevo en 70
\mul de 0,25 M Tris-HCl, de pH = 7,8, y se
almacenan a -70ºC. Para la determinación de la actividad de la
cloranfenicol-acetiltransferasa por el método de
Sleigh se emplean en cada caso 30 \mul de la suspensión celular
(Sleigh, 1986). Se efectúa la normalización de la actividad CAT
relativa de cada transfección en base a la actividad de la
\beta-galactosidasa determinada por el método de
Norton y Coffin (Norton & Coffin, 1985). Para este ensayo se
emplean en cada caso 10 \mul de la suspensión celular. En todos
los casos se realiza también una corrección teniendo en cuenta la
cantidad de proteína utilizada. Esta concentración de proteína se
determina por el método de Bradford (Ausubel y col. 1987).
En el histograma de la figura 8 se representan
los resultados de cuatro ensayos de expresión transitoria realizados
con independencia entre sí. Para el control se emplean plásmidos,
en los que la expresión del gen CAT se regula con un promotor
vírico constitutivo. En el pBL-CAT5, se emplea el
promotor de la timidina-quinasa del virus del
Herpes simplex. En el pCMVtkCAT se emplea este promotor en
combinación con un intensificador del virus de la citomegalia
humana y en el pKSSV2CAT se emplea el promotor SV40. El
pBL-CAT6 se emplea como control negativo y contiene
el gen CAT sin promotor.
\newpage
Con excepción del fragmento de 156 bp, todos los
fragmentos de Ub/S27a, clonados en orientación 5'-3'
antes del gen CAT sin promotor, presentan una intensa actividad de
promotor, que es de 2,5 a 3 mayor que la del promotor tk del virus
del Herpes simplex (figura 8). La actividad más intensa de
promotor, que es comparable con la del promotor SV40 en el
pKSSV2CAT, es la que presentan los fragmentos de 483 bp y 272 bp.
Solamente la combinación de intensificador CMV/promotor tk en el
pCMVtkCAT da lugar a una actividad CAT todavía mayor, del orden del
10%. Con una deleción que alcanza hasta la posición -45 (fragmento
de 156 bp), que abarca también el sitio singular de unión Sp1, ya
no se detecta ninguna actividad CAT (figura 8). La región 5' no
traducida del Ub/S27a 5', suficiente para conferir una intensa
actividad de promotor, puede delimitarse, pues, a la región
comprendida entre -161 del extremo 5' del fragmento de 272 bp y -45
del extremo 5' del fragmento de 156 bp. Dentro de esta región, que
comprende 117 bp, existe también un sitio de unión Sp1 singular.
Un resultado inesperado fue la observación de
que los fragmentos más cortos de la orientación
3'-5' presentan también actividad de promotor
(figura 8). De todos modos, este promotor localizado en la hebra
opuesta no es tan intenso como el promotor Ub/S27a, sino que tiene
una reducción del 42%. También en este caso, los fragmentos de 482
bp y 272 bp son los que presentan la actividad mayor. Esta actividad
es comparable con la del promotor tk en el
pBL-CAT5. El gen en cuestión, cuya expresión se
regula desde este promotor de la hebra opuesta, no ha podido
identificarse hasta la fecha presente. La región de promotor de 117
bp mencionada antes podría ser incluso una región de promotor
bidireccional.
Resumiendo se puede decir que el promotor
Ub/S27a aislado de las células CHO por los inventores de la presente
invención se dispone por primera vez de un promotor homólogo
constitutivo muy intenso del hámster. Los estudios de células CHO
cultivadas en suero y transfectadas de modo estable confirman que el
promotor Ub/S27a es extraordinariamente activo incluso después de
su integración en el genoma celular y favorece una expresión muy
intensa del gen informante CAT.
Los constructos de informante CAT, que contienen
diversos fragmentos de la región de promotor del Ub/S27a, se
integran en células BHK-21 (ATCC CCL 10) y se
determina la actividad CAT de los transfectantes. En la figura 9 se
representa que con las secuencias de promotor de la invención pueden
conseguirse grados de expresión extraordinariamente altos incluso en
células BHK.
Se preparan transfectantes estables del modo
siguiente. El día previo a la transfección se siembran 200.000
células en cada plaquita de 20 cm^{2}. Se transfectan las células
con 10 \mug de DNA plásmido (constructo de informante CAT) y 500
ng del plásmido pSV2pac (Vara y col., 1986) empleando un método
modificado de precipitación con fosfato cálcico (Chen &
Okayama, 1987). El plásmido pSV2pac lleva el gen que codifica a la
puromicina-N-acetil-transferasa
(pac) y confiere por tanto resistencia contra el antibiótico que
inhibe la biosíntesis de la proteína. Después de una incubación a
37ºC y 5% de CO_{2} durante 4 horas se elimina el precipitado de
DNA en exceso por lavado con PBS. Después de 24 horas más se inicia
la selección de los transfectantes por adición de 10 \mug/ml de
puromicina. Cada dos o tres días se efectúa el cambio de medio por
un medio que contiene puromicina. Después de la clonación en
dilución de los transfectantes seleccionados se obtienen los clones
individuales.
En las figuras 10-12 se
representan los grados de expresión CAT de diversos clones de
transfectantes estables con respecto al clon 6 de pCMVtkCAT (clon 6
es el clon celular transfectado con pCMVtkCAT que tiene la mayor
actividad CAT).
\vskip1.000000\baselineskip
Adams, S.M., Sharp, M.G.,
Walker, R.A., Brammar, W.J. & Varley, J.M.
(1992)
Differential expression of
translation-associated genes in benign and malignant
human breast tumours
Br. J. Cancer 65,
65-71
\vskip1.000000\baselineskip
Ausubel, F.M., Brent, R.,
Kingston, R.E., Moore, D.D., Smith, J.A.,
Seidman, J.G. & Struhl, K. (1987)
Current protocols in molecular biology
Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience
\vskip1.000000\baselineskip
Baker, R.T. & Board, P.G.
(1991)
The human ubiquitin-52 amino
acid fusion protein gene shares several structural features with
mammalian ribosomal protein genes
Nucleic Acids Research 19,
1035-1040
\vskip1.000000\baselineskip
Boshart, M., Klüppel, M.,
Schmidt, A., Schütz, G. & Luckow, B.
(1992)
Reporter constructs with low background activity
utilizing the cat gene
Gene 110,
129-130
\vskip1.000000\baselineskip
Breathnach, R. & Chambon, P.
(1981)
Organization and expression of eukaryotic split
genes coding for proteins
Ann. Rev. Biochem. 50,
349-383
\vskip1.000000\baselineskip
Chen, C. & Okayama, H.
(1987)
High-efficiency transformation
of mammalian cells by plasmid DNA
J. Mol. Cell. Biol. 7,
2745-2752
\vskip1.000000\baselineskip
Ciechanover, A. (1994)
The ubiquitin-proteasome
proteolytic pathway
Cell 79, 13-21
\vskip1.000000\baselineskip
Dynan, W.S. & Tjian, R.
(1983)
The promoter-specific
transcription factor Sp1 binds to upstream sequences in the SV40
early promoter
Cell 35, 79-87
\vskip1.000000\baselineskip
Faisst, S. & Meyer, S.
(1992)
Compilation of
vertebrate-encoded transcription factors
Nucleic Acids Research 20,
3-26
\vskip1.000000\baselineskip
Finley, D., Bartel, B. &
Varshavsky, A. (1989)
The tails of ubiquitin precursors are ribosomal
proteins whose fusion to ubiquitin facilitates ribosome
biogenesis
Nature 333,
394-401
\vskip1.000000\baselineskip
Fornace, A.J., Alama, I.,
Hollander, M.C. & Lamoreaux, E. (1989)
Ubiquitin mRNA is a major
stress-induced transcript in mammalian cells
Nucleic Acids Research 17,
1215-1230
\newpage
Huxley, C. & Fried, M.
(1990)
The mouse rpL7a gene is typical of other
ribosomal protein genes in it's 5' region but differs in being
located in a tight cluster of CpG-rich islands
Nucleic Acids Research 18,
5353-5357
\vskip1.000000\baselineskip
Jentsch, S., Seufert, W. &
Hauser, H.-P. (1991)
Genetic analysis of the ubiquitin system
Biochimica et Biophysica Acta 1089, 127-139
\vskip1.000000\baselineskip
Kaufman, R. J. (1987)
High level production of proteins in mammalian
cells In: Genetic Engineering: Principles and methods (coordinador:
J.K. Setlow), tomo 9, página 155
Plenum Publishing, Nueva York
\vskip1.000000\baselineskip
Luckow, B., Schütz, G.
(1987)
CAT constructions with multiple unique
restriction sites for the functional analysis of eucaryotic
promoters and regulatory elements
Nucleic Acids Res. 15, 5490
\vskip1.000000\baselineskip
Luo, X. & Kim, K.-H.
(1990)
An enhancer element in the
house-keeping promoter for
acetyl-CoA carboxylase gene
Nucleic Acids Research 18,
3249-3254
\vskip1.000000\baselineskip
Meyer, J., Nick, S.,
Stamminger, T., Grummt, F., Jahn, G. &
Lipps, H.J. (1993)
Inhibition of HIV-1 replication
by a high-copy-number vector
expressing antisense RNA for reverse transcriptase
Gene 129,
263-268
\vskip1.000000\baselineskip
Nicolaides, N.C. & Stoeckert,
C.J. (1990)
A simple, efficient method for the separate
isolation of RNA and DNA from the same cells
BioTechniques 8,
154-155
\vskip1.000000\baselineskip
Norton, P.A. & Coffin, J.M.
(1985)
Bacterial \beta-galactosidase
as a marker of Rous Sarcoma virus gene expression and
replication
Mol. Cell. Biol. 5,
281-290
\vskip1.000000\baselineskip
Redman, K.L. & Rechsteiner, M.
(1989)
Identification of the long ubiquitin extension
as ribosomal protein S27a
Nature 338,
438-440
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
Sambrook, J., Fritsch, E.F. &
Maniatis, T. (1989)
Molecular cloning: A Laboratory Manual Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
\vskip1.000000\baselineskip
Schlesinger, M.J. & Bond, U.
(1987)
Ubiquitin genes
Oxf. Survey Euk. Genes 4,
77-91
\vskip1.000000\baselineskip
Shimbara, N., Sato, C.,
Takashina, M., Tanaka, T., Tanaka, K. &
Ichihara, A. (1993)
Down-regulation of ubiquitin
gene expression during differentiation of human leukemia cells
FEBS Letters 322,
235-239
\vskip1.000000\baselineskip
Sleigh, M.J. (1986)
A nonchromatographic assay for expression of the
chloramphenicol acetyl transferase gene in eukaryotic cells
Anal. Biochem. 156,
252-256
\vskip1.000000\baselineskip
Urlaub, G. & Chasin, L.A.
(1980)
Isolation of chinese hamster cell mutants
deficient in dihydrofolate reductase activity
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,
4216-4220
\vskip1.000000\baselineskip
Tsonis, P.A., Manes, T.,
Millan, J.L. & Goetinck, P.F. (1988)
CAT constructs with convenient sites for cloning
and generating deletions
Nucleic Acids Research 16,
7745
\vskip1.000000\baselineskip
Vara, J.A., Portela, A.,
Ortin, J. & Jiménez, A (1986)
Expression in mammalian cells of a gene from
Streptomyces alboniger conferring puromycin resistance
Nucleic Acids Research 14,
4617-4624
\vskip1.000000\baselineskip
Wegner, M., Zastrow, G.,
Klavinius, A., Schwender, S., Müller, F.,
Luksza, H., Hoppe, J., Wienberg, J. &
Grummt, F. (1989)
Cis-acting sequences from mouse
rDNA promote plasmid DNA amplification and persistence in mouse
cells: implication of HMG-I in their function
Nucleic Acids Research 17,
9909-9932
\vskip1.000000\baselineskip
Wiborg, O., Pedersen, M.S.,
Wind, A., Berglund, L.E., Marcker, K.A. &
Vuust, J. (1985)
The human ubiquitina multigene family: some
genes contain multiple directly repeated ubiquitin coding
sequences
EMBO J. 4,
755-759
\vskip1.000000\baselineskip
Wong, J.M., Mafune, K.,
Yow, H., Rivers, E.N., Ravikumar, T.S.,
Steele, G.D. & Chen, L.B. (1993)
Ubiquitin-ribosomal protein S27a
gene overexpressed in human colorectal carcinoma is an early growth
response gene
Cancer Research 53,
1916-1920
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) DATOS GENERALES
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Boehringer Ingelheim International GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Binger Str.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Ingelheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 55216
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 06132-772770
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 06132-774377
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Promotor homólogo intenso obtenido de hámster
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN LEÍBLE CON ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, version # 1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 508 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: doble
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 487 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: doble
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 156 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 156 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2529 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 117 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos diversos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = "primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTGTAGG ACTTCTTCTT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos diversos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = "primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCGAGCGTG ATCGTTTTCC
\hfill20
Claims (14)
1. Molécula de ácido nucleico que contiene la
secuencia de promotor del gen Ubiquitina-S27a del
hámster de la posición 2129 a 2400 según la SEQ ID NO: 5 o una
secuencia que, por sustitución, inserción o deleción de una, dos o
tres bases, pueda derivarse de esta, sin que por la sustitución,
inserción o deleción la actividad del promotor sufra una merma de
más de un 50% del valor que se obtiene para un promotor que posee la
secuencia de la posición 2129 a 2400 según la SEQ ID NO: 5.
2. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1, caracterizada porque contiene la secuencia
de promotor del gen de ubiquitina-S27a del hámster
de la posición 1918 a 2400 según la SEQ ID NO: 5 o una secuencia
que, por sustitución, inserción o deleción de una, dos o tres bases,
pueda derivarse de esta, sin que por la sustitución, inserción o
deleción la actividad del promotor sufra una merma de más de un 50%
del valor que se obtiene para un promotor que posee la secuencia de
la posición 2129 a 2400 según la SEQ ID NO: 5.
3. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque contiene la
secuencia de promotor del gen de ubiquitina-S27a del
hámster según la SEQ ID NO: 5 o una secuencia que, por sustitución,
inserción o deleción de una, dos o tres bases, pueda derivarse de
esta, sin que por la sustitución, inserción o deleción la actividad
del promotor sufra una merma de más de un 50% del valor que se
obtiene para un promotor que posee la secuencia de la posición 2129
a 2400 según la SEQ ID NO: 5.
4. Molécula de ácido nucleico según una de las
reivindicaciones de 1 a 3, caracterizada porque contiene uno
o varios intensificadores, que está o están unidos funcionalmente
con la secuencia de promotor del gen de
ubiquitina-S27a del hámster.
5. Molécula de ácido nucleico según una de las
reivindicaciones de 1 a 4, caracterizada porque las
secuencias del promotor están unidas funcionalmente con un gen.
6. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 5, caracterizada porque dicho gen se expresa
bajo el control de las secuencias de promotor.
7. Molécula de ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 5 ó 6, caracterizada porque dicho gen
codifica a un activador de plasminógeno de tejidos, un activador de
plasminógeno de segunda generación, un interferón, un factor de
necrosis tumoral la eritropoyetina, el factor de estimulación de
colonias de granulocitos, la dismutasa de superóxido de manganeso,
una cadena de inmunoglobulina, la región variable de una cadena de
inmunoglobulina, una cadena de inmunoglobulina humanizada, la región
variable de una cadena de inmunoglobulina humanizada, un anticuerpo
de cadena simple y/o un anticuerpo que es específico de un CD44
variable.
8. Molécula de ácido nucleico según una de las
reivindicaciones de 1 a 7, caracterizada porque es un vector
de expresión.
9. Célula hospedante, en la que se introduce una
molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones de 1 a
8.
10. Procedimiento para la obtención de un
producto genético heterólogo en una célula hospedante eucariota,
caracterizado porque se introduce una molécula de ácido
nucleico según una de las reivindicaciones de 1 a 8 en la célula
hospedante eucariota, se cultiva la célula hospedante y se aísla el
producto genético sintetizado.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque la célula hospedante es una célula de
hámster.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque la célula de hámster es una célula
CHO.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 10 a 12, caracterizado porque el gen
heterólogo codifica a un activador de plasminógeno de tejidos, un
activador de plasminógeno de segunda generación, un interferón, un
factor de necrosis tumoral la eritropoyetina, el factor de
estimulación de colonias de granulocitos, la dismutasa de superóxido
de manganeso, una cadena de inmunoglobulina, la región variable de
una cadena de inmunoglobulina, una cadena de inmunoglobulina
humanizada, la región variable de una cadena de inmunoglobulina
humanizada, un anticuerpo de cadena simple y/o un anticuerpo que es
específico de un CD44 variable.
14. Uso de una molécula de ácido nucleico que
contiene una secuencia de promotor según una de las reivindicaciones
de 1 a 8 para la obtención de un producto genético heterólogo en
células cultivadas de hámster, con preferencia en células CHO.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19539493A DE19539493A1 (de) | 1995-10-24 | 1995-10-24 | Starker homologer Promotor aus Hamster |
| DE19539493 | 1995-10-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2281905T3 true ES2281905T3 (es) | 2007-10-01 |
Family
ID=7775593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96937224T Expired - Lifetime ES2281905T3 (es) | 1995-10-24 | 1996-10-24 | Promotor homologo intenso obtenido de hamster. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6063598A (es) |
| EP (2) | EP1803815A3 (es) |
| JP (2) | JP3966903B2 (es) |
| AT (1) | ATE355370T1 (es) |
| CA (1) | CA2234071C (es) |
| DE (2) | DE19539493A1 (es) |
| DK (1) | DK0857211T3 (es) |
| ES (1) | ES2281905T3 (es) |
| MX (1) | MX9802764A (es) |
| PT (1) | PT857211E (es) |
| WO (1) | WO1997015664A1 (es) |
Families Citing this family (92)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0961830A1 (en) * | 1997-01-29 | 1999-12-08 | Neurosearch A/S | EXPRESSION VECTORS AND METHODS FOR $i(IN VIVO) EXPRESSION OF THERAPEUTIC POLYPEPTIDES |
| EP1624067A3 (en) * | 2000-09-18 | 2006-03-15 | Genzyme Corporation | Expression vectors containing hybrid ubiquitin promoters |
| AU2001290984A1 (en) * | 2000-09-18 | 2002-04-02 | Genzyme Corporation | Expression vectors containing hybrid ubiquitin promoters |
| ATE466941T1 (de) * | 2001-07-04 | 2010-05-15 | Chromagenics Bv | Dns-sequenzen mit anti-repressor-aktivität |
| US7384744B2 (en) | 2002-11-29 | 2008-06-10 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products |
| US7344886B2 (en) | 2002-11-29 | 2008-03-18 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Neomycin-phosphotransferase-genes and methods for the selection of recombinant cells producing high levels of a desired gene product |
| DE10256083A1 (de) | 2002-11-29 | 2004-08-12 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten und Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen |
| DE10338531A1 (de) | 2003-08-19 | 2005-04-07 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Verfahren zur Reklonierung von Produktionszellen |
| US8669109B2 (en) | 2003-08-19 | 2014-03-11 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Methods of producing proteins in Chinese hamster ovary (CHO) cells |
| US20050101017A1 (en) * | 2003-11-10 | 2005-05-12 | Wojtek Auerbach | Method of improving gene targeting using a ubiquitin promoter |
| GB0509965D0 (en) * | 2005-05-17 | 2005-06-22 | Ml Lab Plc | Improved expression elements |
| US9163257B2 (en) * | 2005-06-20 | 2015-10-20 | Cadila Healthcare Limited | Expression vector and methods of producing high levels of proteins |
| EP1806365A1 (en) | 2006-01-05 | 2007-07-11 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them |
| US20080124760A1 (en) * | 2006-07-26 | 2008-05-29 | Barbara Enenkel | Regulatory Nucleic Acid Elements |
| US8609820B2 (en) | 2011-10-28 | 2013-12-17 | Neotope Biosciences Limited | Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein |
| NZ629296A (en) | 2012-01-27 | 2016-06-24 | Prothena Biosciences Ltd | Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein |
| UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
| EP2938726B1 (en) | 2012-12-31 | 2017-09-27 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Heterologous intron within a signal peptide |
| WO2014102101A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Novel intron sequences |
| CA2902026C (en) | 2013-03-13 | 2023-08-29 | Prothena Biosciences Limited | Tau immunotherapy |
| US9989540B2 (en) | 2013-05-10 | 2018-06-05 | The Regents Of The University Of California | Diagnostic and monitoring system for Huntington's disease |
| US10513555B2 (en) | 2013-07-04 | 2019-12-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibody formulations and methods |
| US9951131B2 (en) | 2013-07-12 | 2018-04-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies that recognize IAPP |
| US9850302B2 (en) | 2013-07-12 | 2017-12-26 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies that recognize IAPP |
| EP3071974A2 (en) | 2013-11-19 | 2016-09-28 | Prothena Biosciences Limited | Monitoring immunotherapy of lewy body disease from constipation symptoms |
| EP3089760B1 (en) | 2013-12-31 | 2020-01-15 | ProteoNic Biotechnology IP B.V. | Construct and sequence for enhanced gene expression |
| PT3116911T (pt) | 2014-03-12 | 2019-09-04 | Prothena Biosciences Ltd | Anticorpos anti-mcam e métodos de utilização associados |
| KR20160131082A (ko) | 2014-03-12 | 2016-11-15 | 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 | Lg1-3에 특이적인 항-라미닌4 항체 |
| TW201623331A (zh) | 2014-03-12 | 2016-07-01 | 普羅帝納生物科學公司 | 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法 |
| US10059761B2 (en) | 2014-03-12 | 2018-08-28 | Prothena Biosciences Limited | Anti-Laminin4 antibodies specific for LG4-5 |
| JP6744856B2 (ja) | 2014-04-08 | 2020-08-19 | プロセナ・バイオサイエンシズ・リミテッド | α−シヌクレインを認識する抗体を含む血液脳関門シャトル |
| HRP20230405T8 (hr) | 2014-12-10 | 2023-09-29 | Opko Biologics Ltd. | Metode proizvodnje dugo djelujućih ctp-modificiranih polipeptida hormona rasta |
| TWI769570B (zh) | 2015-01-28 | 2022-07-01 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI786505B (zh) | 2015-01-28 | 2022-12-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI718121B (zh) | 2015-01-28 | 2021-02-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| WO2016186879A1 (en) | 2015-05-18 | 2016-11-24 | Zymtronix, Llc | Magnetically immobilized microbiocidal enzymes |
| EP3323166B1 (en) | 2015-07-15 | 2024-03-13 | ZYMtronix, Inc. | Automated bionanocatalyst production |
| WO2017046774A2 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
| WO2017046776A2 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
| WO2017149513A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| WO2017153953A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| WO2017153955A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| PE20190208A1 (es) | 2016-05-02 | 2019-02-07 | Prothena Biosciences Ltd | Anticuerpos que reconocen tau |
| CA3022515A1 (en) | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing tau |
| EP3452507B1 (en) | 2016-05-02 | 2022-10-19 | Prothena Biosciences Limited | Tau immunotherapy |
| WO2017208210A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| JP7017013B2 (ja) | 2016-07-02 | 2022-02-08 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗トランスサイレチン抗体 |
| WO2018007923A2 (en) | 2016-07-02 | 2018-01-11 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| WO2018007922A2 (en) | 2016-07-02 | 2018-01-11 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| MY206271A (en) | 2016-07-11 | 2024-12-06 | Opko Biologics Ltd | Long-acting coagulation factor vii and methods of producing same |
| CA3031802A1 (en) | 2016-08-13 | 2018-02-22 | Zymtronix Catalytic Systems, Inc. | Magnetically immobilized biocidal enzymes and biocidal chemicals |
| CN110177869A (zh) | 2017-01-13 | 2019-08-27 | 加利福尼亚大学董事会 | 免疫改造的多能细胞 |
| CN110881274B (zh) | 2017-05-02 | 2024-11-15 | 普罗塞纳生物科学有限公司 | 识别tau的抗体 |
| JP2021502955A (ja) | 2017-09-28 | 2021-02-04 | プロセナ・バイオサイエンシズ・リミテッド | シヌクレイン病の治療のための投与レジメン |
| CN111757730A (zh) | 2017-10-06 | 2020-10-09 | 普罗塞纳生物科学有限公司 | 检测甲状腺素运载蛋白的方法 |
| CU20200042A7 (es) | 2017-11-29 | 2021-03-11 | Prothena Biosciences Ltd | Formulación liofilizada de un anticuerpo monoclonal contra la transtirretina |
| US20210263001A1 (en) | 2018-09-05 | 2021-08-26 | Zymtronix Catalytic Systems, Inc. | Immobilized enzymes and microsomes on magnetic scaffolds |
| SG11202104549TA (en) | 2018-11-08 | 2021-05-28 | Prothena Biosciences Ltd | Antibodies recognizing tau |
| CN119684457A (zh) | 2018-11-26 | 2025-03-25 | 四十七有限责任公司 | 针对c-kit的人源化抗体 |
| EP3935083A4 (en) | 2019-03-03 | 2022-11-30 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing tau |
| US11162079B2 (en) | 2019-05-10 | 2021-11-02 | The Regents Of The University Of California | Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells |
| WO2020231882A2 (en) | 2019-05-10 | 2020-11-19 | The Regents Of The University Of California | Modified pluripotent cells |
| US12391923B2 (en) | 2019-06-26 | 2025-08-19 | The Regents Of The University Of California | SIRPα-silenced natural killer (NK) cells |
| JP2022543112A (ja) | 2019-08-01 | 2022-10-07 | サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド | Ｄｕｘ４発現細胞およびそれらの使用 |
| AU2020336302A1 (en) | 2019-08-23 | 2022-03-03 | Sana Biotechnology, Inc. | CD24 expressing cells and uses thereof |
| AU2021207810A1 (en) | 2020-01-13 | 2022-08-04 | Sana Biotechnology, Inc. | Modification of blood type antigens |
| EP4585223A3 (en) | 2020-01-15 | 2025-07-30 | The Regents of the University of California | Transplanted cell protection via inhibition of polymorphonuclear cells |
| CA3165076A1 (en) | 2020-01-17 | 2021-07-22 | Ryan Clarke | Safety switches for regulation of gene expression |
| MX2022011831A (es) | 2020-03-25 | 2023-01-04 | Sana Biotechnology Inc | Células neurales hipoinmunogénicas para el tratamiento de trastornos y afecciones neurológicas. |
| CA3183994A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Philip James Dolan Iii | Antibodies recognizing sortilin |
| IL300516A (en) | 2020-08-13 | 2023-04-01 | Sana Biotechnology Inc | Methods for treating susceptible patients with hypoimmunogenic cells, and related methods and compounds |
| CA3200509A1 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Sonja SCHREPFER | Methods and compositions for modulating car-t activity |
| BR112023024231A2 (pt) | 2021-05-19 | 2024-01-30 | Sana Biotechnology Inc | Células t primárias rhd negativas hipoimunogênicas |
| AU2022283291A1 (en) | 2021-05-27 | 2023-11-02 | Sana Biotechnology, Inc. | Hypoimmunogenic cells comprising engineered hla-e or hla-g |
| KR20240046319A (ko) | 2021-07-14 | 2024-04-08 | 사나 바이오테크놀로지, 인크. | 저면역원성 세포에서의 y 염색체-연결 항원의 변경된 발현 |
| WO2023019226A1 (en) | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy |
| JP2024535677A (ja) | 2021-08-11 | 2024-10-02 | サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド | 即時血液媒介性炎症反応を減少させるための同種細胞療法を目的とした遺伝子改変細胞 |
| KR20240073006A (ko) | 2021-08-11 | 2024-05-24 | 사나 바이오테크놀로지, 인크. | 동종이계 세포 요법을 위한 유전자 변형된 1차 세포 |
| AU2022325231A1 (en) | 2021-08-11 | 2024-02-08 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions |
| KR20240155390A (ko) | 2022-02-17 | 2024-10-28 | 사나 바이오테크놀로지, 인크. | 조작된 cd47 단백질 및 이의 용도 |
| US20250101382A1 (en) | 2022-03-11 | 2025-03-27 | Sana Biotechnology, Inc. | Genetically modified cells and compositions and uses thereof |
| WO2023183313A1 (en) | 2022-03-22 | 2023-09-28 | Sana Biotechnology, Inc. | Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods |
| WO2024125597A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Providence Therapeutics Holdings Inc. | Compositions and methods for infectious diseases |
| WO2024151541A1 (en) | 2023-01-09 | 2024-07-18 | Sana Biotechnology, Inc. | Type-1 diabetes autoimmune mouse |
| WO2024229302A1 (en) | 2023-05-03 | 2024-11-07 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of dosing and administration of engineered islet cells |
| CN121604968A (zh) | 2023-05-22 | 2026-03-03 | 萨那生物科技公司 | 递送胰岛细胞的方法及相关方法 |
| AU2024328949A1 (en) | 2023-08-23 | 2026-03-12 | Sana Biotechnology, Inc. | Modified cd47 proteins and their uses |
| AU2024342922A1 (en) | 2023-09-15 | 2026-04-23 | Othair Prothena Limited | Cell penetrating agents and uses thereof |
| TW202525338A (zh) | 2023-09-15 | 2025-07-01 | 愛爾蘭商普羅希那生物科學有限公司 | 細胞穿透劑及其用途 |
| AR133828A1 (es) | 2023-09-15 | 2025-11-05 | Prothena Biosciences Ltd | Anticuerpos anti-tdp-43 y sus usos |
| AU2024342899A1 (en) | 2023-09-15 | 2026-04-23 | Prothena Platform Technologies Limited | Methods, compositions, and kits including cell-penetrating agents |
| WO2025166633A2 (en) | 2024-02-07 | 2025-08-14 | Westlake Genetech. Ltd. | Split gene editing systems and uses thereof |
-
1995
- 1995-10-24 DE DE19539493A patent/DE19539493A1/de not_active Ceased
-
1996
- 1996-10-24 ES ES96937224T patent/ES2281905T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 US US09/051,969 patent/US6063598A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 EP EP06126019A patent/EP1803815A3/de not_active Withdrawn
- 1996-10-24 CA CA002234071A patent/CA2234071C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 AT AT96937224T patent/ATE355370T1/de active
- 1996-10-24 EP EP96937224A patent/EP0857211B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 DK DK96937224T patent/DK0857211T3/da active
- 1996-10-24 JP JP51628897A patent/JP3966903B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 PT PT96937224T patent/PT857211E/pt unknown
- 1996-10-24 DE DE59611420T patent/DE59611420D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-10-24 WO PCT/EP1996/004631 patent/WO1997015664A1/de not_active Ceased
-
1998
- 1998-04-07 MX MX9802764A patent/MX9802764A/es active IP Right Grant
-
2006
- 2006-07-07 JP JP2006187719A patent/JP2006320330A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997015664A1 (de) | 1997-05-01 |
| EP0857211A1 (de) | 1998-08-12 |
| EP0857211B1 (de) | 2007-02-28 |
| DE19539493A1 (de) | 1997-04-30 |
| PT857211E (pt) | 2007-03-30 |
| ATE355370T1 (de) | 2006-03-15 |
| JPH11513572A (ja) | 1999-11-24 |
| EP1803815A3 (de) | 2007-08-29 |
| DK0857211T3 (da) | 2007-03-26 |
| MX9802764A (es) | 1998-11-30 |
| EP1803815A2 (de) | 2007-07-04 |
| CA2234071C (en) | 2003-01-21 |
| JP2006320330A (ja) | 2006-11-30 |
| DE59611420D1 (de) | 2007-04-12 |
| CA2234071A1 (en) | 1997-05-01 |
| JP3966903B2 (ja) | 2007-08-29 |
| US6063598A (en) | 2000-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2281905T3 (es) | Promotor homologo intenso obtenido de hamster. | |
| McBurney et al. | The mouse Pgk-1 gene promoter contains an upstream activator sequence | |
| ES2654205T3 (es) | Moléculas artificiales de ácido nucleico para la expresión mejorada de proteínas o péptidos | |
| Bouvagnet et al. | Multiple positive and negative 5′ regulatory elements control the cell-type-specific expression of the embryonic skeletal myosin heavy-chain gene | |
| Watanabe et al. | Cell-specific enhancer activity in a far upstream region of the human alpha-fetoprotein gene. | |
| Curatola et al. | Expression of the K-fgf proto-oncogene is controlled by 3′ regulatory elements which are specific for embryonal carcinoma cells | |
| Ishii et al. | Characterization of the promoter region of the human c-erbB-2 protooncogene. | |
| Resendez Jr et al. | Identification of highly conserved regulatory domains and protein-binding sites in the promoters of the rat and human genes encoding the stress-inducible 78-kilodalton glucose-regulated protein | |
| ES2291038T3 (es) | Sobreexpresion de proteinas deseadas en celulas eucariotas mediadas por sobreexpresion de ciclina d1. | |
| Noma et al. | Molecular cloning and structure of the human transforming growth factor-β2 gene promoter | |
| Villa-Garcia et al. | Isolation and characterization of a TATA-less promoter for the human beta 3 integrin gene | |
| ES2358680T3 (es) | Elementos de expresión mejorados. | |
| Tuteja et al. | Transcription efficiency of human apolipoprotein AI promoter varies with naturally occurring A to G transition | |
| Medina et al. | Tissue-specific N-terminal isoforms from overlapping alternate promoters of the human AE2 anion exchanger gene | |
| Sarkar et al. | Intragenic sequences affect the expression of the gene encoding glial fibrillary acidic protein | |
| Gavalas et al. | Coexpression of two closely linked avian genes for purine nucleotide synthesis from a bidirectional promoter | |
| Harrington et al. | Cloning and characterization of the murine promoter for the colony-stimulating factor-1-encoding gene | |
| Guo et al. | A critical role for C/EBPβ binding to the AABS promoter response element in the human iNOS gene | |
| Muchardt et al. | CREB regulation of cellular cyclic AMP-responsive and adenovirus early promoters | |
| US5912168A (en) | CD95 regulatory gene sequences | |
| Alterman et al. | Regulated expression of a chimeric histone gene introduced into mouse fibroblasts | |
| Park et al. | Analysis of signals controlling expression of the Chinese hamster ovary aprt gene | |
| Lee et al. | Regulatory elements mediating transcription of the human Ha-ras gene | |
| Zhou et al. | Posttranscriptional destabilization of the bradykinin B1 receptor messenger RNA: cloning and functional characterization of the 3′-untranslated region | |
| WO1998040506A1 (en) | Use of an acute phase serum amyloid a gene promoter (a-saa promoter) in the treatment of diseases in mammals |