ES2358680T3 - Elementos de expresión mejorados. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado que comprende: a. una isla CpG extendida exenta de metilación que comprende más de 3000 nucleótidos contiguos desde la región promotora de un gen rps3 de mamífero; b. un promotor heterólogo; y c. una secuencia de ácidos nucleicos transcribible adyacente al promotor heterólogo, en el que la transcripción de dicha secuencia de ácidos nucleicos transcribible desde dicho promotor heterólogo se mejora en presencia de dicha isla CpG extendida exenta de metilación con respecto a la transcripción en ausencia de dicha isla CpG extendida exenta de metilación.
Description
La presente invención se refiere a polinucleótidos
que comprenden elementos que confieren una expresión
mejorada a unidades de transcripción unidas de manera
operable. Estos elementos están asociados de manera
natural a las regiones promotoras de genes de proteínas
ribosómicas y, en construcciones de ADN recombinante,
confieren niveles de expresión génica elevados y
reproducibles. La presente invención también se refiere a
vectores que comprenden dichas secuencias de
polinucleótidos, a células hospedadoras que comprenden
dichos vectores y al uso de dichos polinucleótidos,
vectores o células hospedadoras en terapia, para la
producción de proteínas recombinantes en cultivos
celulares y otras aplicaciones biotecnológicas.
El modelo actual de la estructura de la cromatina en
eucariotas superiores postula que los genes están
organizados en quot;dominios" (Dillon, N. & Grosveld, F.
Chromatin domains as potential units of eukaryotic gene
function. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 260-264 (1994);
Higgs, D.R. Do LCRs open chromatin domains? Cell 95, 299302 (1998)). Se contempla que los dominios de la cromatina
se encuentren en un estado condensado, "cerrado",
transcripcionalmente silente, o en una configuración
descondensada, "abierta" y transcripcionalmente
competente. El establecimiento de una estructura abierta
de la cromatina caracterizada por una sensibilidad a la
DNasa I, una hipometilación del ADN y una hiperacetilación
de las histonas incrementadas se considera un requisito
previo para el comienzo de la expresión génica.
La naturaleza abierta y cerrada de regiones de la
cromatina está reflejada en el comportamiento de
transgenes que se integran aleatoriamente en el genoma de
la célula hospedadora. Construcciones idénticas
proporcionan diferentes patrones de expresión específica
de tejido y de expresión específica de la fase de
desarrollo cuando se integran en localizaciones diferentes
del genoma de ratón (Palmiter, R.D. & Brinster, R.L. Ann.
Ref. Genet. 20, 465-499 (1986); Allen, N.D. y col. Nature
333, 852-855 (1988); Bonnerot, C., Grimber, G., Briand, P.
& Nicolas, J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6331-6335
(1990)).
El modelo de organización génica del dominio de la
cromatina sugiere que los elementos de control genético
que son capaces de establecer y mantener una estructura
abierta de la cromatina transcripcionalmente competente
deben estar asociados a regiones activas del genoma.
Las Regiones para el control del locus (LCRs) son una
clase de elementos reguladores transcripcionales con una
capacidad de reestructuración de la cromatina de largo
alcance. Las LCR se definen funcionalmente en ratones
transgénicos por su capacidad para conferir niveles de
expresión fisiológicos que dependen del número de copias
del transgen y que es independiente del sitio de
integración sobre un gen unido en cis, especialmente en
transgenes de una sola copia (Fraser, P. & Grosveld, F.
Curr. Opin. Cell Biol 10, 361-365 (1998); Li, Q., Harju,
S. & Peterson, K.R. Trends Genet. 15: 403-408 (1999). De
manera crucial, dicha expresión es específica de tejido.
Las LCRs son capaces de impedir la dispersión de la
heterocromatina, evitar la PEV (Kloussis, D. &
Festenstein, R. Curr, Opin. Genet. Dev. 7, 614-619 (1997))
y constan de una serie de sitios hipersensibles (HS) a la
DNasa I que pueden estar localizados en 5' o 3' de los
genes que regulan (LI, Q., Harju, S. & Peterson, K.R.
Trends Genet. 15: 403-408 (1999)).
La generación de líneas celulares de mamífero en
cultivo que producen niveles elevados de un producto
proteico terapéutico es una gran industria en desarrollo.
Los efectos de la posición de la cromatina lo convierten
en un proceso difícil, que requiere tiempo y caro. El
enfoque más habitual usado para la producción de dichas
"factorías celulares" de mamífero depende de la
amplificación génica inducida por una combinación de un
gen de resistencia a fármacos (por ejemplo, DHFR,
glutamina sintetasa (Kaufman RJ. Methods Enzymol 185, 537566 (1990)), y el mantenimiento de una presión rigurosa y
selectiva. El uso de vectores que contienen LCRs
procedentes de dominios génicos muy expresados, usando
células derivadas del tejido adecuado, simplifica
enormemente el procedimiento, dando una elevada proporción
de líneas celulares clonales que presentan unos niveles de
expresión elevados y estables (Needham M, Gooding C,
Hudson K, Antoniou M, Grosveld F y Hollis M. Nucleic Acids
Res 20, 997-1003 (1992); Needham M, Egerton M, Millest A,
Evans S, Popplewell M, Cerillo G, McPheat J, Monk A, Jack
A, Johnstone D y Hollis M. Protein Expr Purif 6,124-131
(1995).
No obstante, la especificidad de tejido de las LCR,
aunque es útil en algunas circunstancias, también es una
limitación importante para muchas aplicaciones, por
ejemplo, cuando no se conocen LCR para el tejido en el que
se requiere la expresión, o cuando se requiere la
expresión en muchos, o en todos los tejidos.
El documento US 6.689.606 y la solicitud de patente
copendiente WO 00/0539, incorporadas en el presente
documento por referencia, describen elementos que son
responsables, en su contexto cromosómico natural, del
establecimiento de una estructura de cromatina abierta a
lo largo de un locus que consta exclusivamente de genes
domésticos que se expresan de manera ubicua. Estos
elementos no proceden de una LCR y comprenden islas CpG
extendidas exentas de metilación.
En ADN de mamífero, el dinucleótido CpG es reconocido
por una enzima ADN-metiltransferasa que metila la citosina
a 5-metilcitosina. No obstante, la 5-metilcitosina es
inestable y se convierte en timina. Como resultado, los
dinucleótidos CpG se producen mucho menos frecuentemente
de lo que cabría esperar por azar. Sin embargo, algunas
secciones de ADN genómico presentan una frecuencia de CpG
cercana a la esperada, y estas secuencias se conocen como
"islas CpG". Como se usa en el presente documento una
"isla CpG" se define como una secuencia de ADN, de al
menos 200 pb, que tiene un contenido en GC de al menos el
50% y una relación de contenido en CpG observada/esperada
de al menos 0,6 (es decir, un contenido en dinucleótidos
CpG de al menos el 60% de lo que cabría esperar por azar)
(Gardiner-Green M y Frommer M. J Mol Biol 196, 261-282
(1987); Rice P, Longden I y Bleasby A Trends Genet 16,
276-277 (2000)).
Las islas CpG exentas de metilación son muy conocidas
en la materia (Bird y col. (1985) Cell 40: 91-99, Tazi y
Bird (1990) Cell 60: 909-920) y se pueden definir como
islas CpG en las que una proporción sustancial de los
restos de citosina no están metilados y que normalmente se
extienden más allá de los extremos 5' de dos genes
transcritos de manera divergente muy próximos en el
espacio (0,1-3 kb). Se ha informado de que estas regiones
de ADN permanecen hipometiladas en todos los tejidos
durante el desarrollo (Wise y Pravtcheva (1999) Genomics
- 60:
- 258-271). A menudo están asociadas a los extremos 5' de genes expresados de manera ubicua, así como en un 40% de los genes que presentan un perfil de expresión restringido a determinados tejidos (Antequera, F. & Bird,
- A.
- Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1195-11999 (1993); Cross, S.H. & Bird, A.P. Curr. Opin, Genet. Dev. 5, 309314 (1995)) y son conocidas por tener regiones localizadas de cromatina activa (Tazi, J. & Bird, A. Cell 60, 909-920 (1990)).
Una isla CpG "extendida" exenta de metilación es una
isla CpG exenta de metilación que se extiende a través de
una región que engloba más de un sitio de inicio de la
transcripción y/o que se extiende más de 300 pb y
preferentemente más de 500 pb. Los límites de la isla CpG
extendida exenta de metilación se definen funcionalmente
con el uso de la PCR sobre la región, en combinación con
enzimas endonucleasas de restricción, cuya capacidad para
digerir (cortar) el ADN en su secuencia de reconocimiento
es sensible al estado de metilación de cualquier resto de
CpG que haya presente. Una de esas enzimas es la HpaII,
que reconoce y digiere el sitio CCGG, que se encuentra
habitualmente dentro de las islas CpG, pero sólo si los
restos de CG centrales no están metilados. Por tanto, la
PCR llevada a cabo con ADN digerido con HpaII y sobre una
región que alberga sitios HpaII, no proporciona un
producto de amplificación debido a la digestión de HpaII
si el ADN está sin metilar. La PCR sólo proporcionará un
producto amplificado si el ADN está metilado. Por tanto,
más allá de la región exenta de metilación el HpaII no
digerirá el ADN y se observará un producto amplificado por
la PCR, definiendo así los límites de la "isla CpG
extendida exenta de metilación".
Se ha demostrado (documento WO 00/05393) que regiones
que se extienden sobre islas CpG exentas de metilación que
engloban promotores dobles transcritos de manera
divergente desde los loci de los genes de la proteína de
unión a la caja TATA humana (TBP)/proteosoma componente-B1
(PSMBI) y la ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2/B1
(hnRNPA2)/heterocromatina proteína 1H• (HP1HS•) proporcionan
niveles fisiológicos reproducibles de expresión génica y
que son capaces de prevenir un patrón de expresión veteado
y el silenciamiento que se produce normalmente con la
integración de transgenes dentro de la heterocromatina
centromérica.
Se sabe que las islas CpG exentas de metilación
asociadas a promotores que se transcriben activamente
poseen la capacidad de reestructurar la cromatina y así,
se cree que son un determinante primordial en el
establecimiento y el mantenimiento de un dominio abierto
en loci de genes domésticos (documento WO 00/05393) y que
esos elementos confieren un aumento en la proporción de
eventos de consecución de genes productivos con mejoras en
el nivel y la estabilidad de la expresión de transgenes.
Los ribosomas son grandes complejos de ARN y
proteínas responsables de la traducción del ARNm en
polipéptidos. Cada ribosoma está constituido de
moléculas de ARN ribosómico (ARNr) y un gran número de
proteínas ribosómicas (actualmente se piensa que son 79 en
las células de mamífero). Las proteínas ribosómicas tienen
funciones que incluyen el facilitar el plegamiento del
ARNr, la protección frente a las ribonucleasas celulares,
y la coordinación de la síntesis de proteínas. Algunas
proteínas ribosómicas presentan funciones
extrarribosómicas adicionales (Wool, 1996, TIBS 21: 164165). Dadas las similitudes estructurales y funcionales de
los ribosomas entre especies, no sorprende que la
conservación de la secuencia de aminoácidos de las
proteínas ribosómicas sea elevada, y entre los mamíferos,
las secuencias de la mayoría de proteínas ribosómicas son
casi idénticas (Wool y col., 1995, Biochem Cell Biol 73:
933-947).
Hay dos proteínas ribosómicas que parecen atípicas,
puesto que se expresan en forma de propéptidos (proteínas
con extensión carboxi) fusionados a ubiquitina. La
ubiquitina es un polipéptido de 76 aminoácidos muy
conservado involucrado en una variedad de funciones
celulares, incluyendo la regulación de la descomposición
intracelular de proteínas, la regulación del ciclo celular
y la respuesta al estrés (Hershko & Ciechanover, 1992,
Annu Rev Biochem 61: 761-807; Coux y col., 1996, Annu Rev
Biochem 65: 801-847).
La ubiquitina está codificada por dos clases de genes
diferentes. Uno es un gen de poli-ubiquitina que codifica
un polímero lineal de repeticiones de ubiquitina. El otro
comprende genes que codifican proteínas de fusión
naturales en las que una sola molécula de ubiquitina está
unida a la proteína ribosómica rps27A o rpL40 (Finley y
col., 1989, Nature 338: 394-401; Chan y col., 1995,
Biochem Biophys Res Commun 215: 682-690; Redman & Burris,
1996, Biochem J 315: 315-321).
Las características estructurales comunes de los
promotores de proteínas ribosómicas han sido descritas por
Perry (2005, BMC Evolutionary Biology 5: 15). Los
promotores se pueden clasificar según la naturaleza de los
motivos de la caja TATA, el número y el tipo de sitios de
unión a factores de transcripción y la localización de los
codones de iniciación AUG. No obstante, esa clasificación
no parece predecir la fuerza del promotor y hay evidencias
que sugieren que algunos de esos promotores probados
presentan una actividad transcripcional equivalente a la
medida para la expresión de un gen informador unido
(Hariharan y col., 1989, Genes Dev 3: 1789-800).
La patente de EE.UU. 6.063.598 describe el promotor
de la ubiquitina de hámster/S27a y su uso para conseguir
un nivel de producción elevado de proteínas recombinantes.
No obstante, no hace ninguna sugerencia en cuanto a su uso
en la mejora de la expresión de un gen transcrito
principalmente a partir de otro promotor (es decir, uno
distinto del promotor de la ubiquitina de hámster/S27a).
La solicitud de EE.UU. US 2004/0148647 describe un
ensayo informador usando un vector de expresión que
comprende un promotor de la ubiquitina de hámster/S27a
unido de manera funcional a un gen para un producto de
interés y una proteína informadora fluorescente. De nuevo,
la aplicación sólo describe construcciones en las que la
transcripción del gen de interés se produce a partir del
propio promotor de la ubiquitina de hámster/S27a.
Sigue siendo un objetivo en materia de expresión de
genes recombinantes la obtención de niveles de expresión
más elevados y más exactos, particularmente para
aplicaciones terapéuticas in vivo y ex vivo y para la
producción de proteínas recombinantes in vitro.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones
de esta solicitud, las palabras "comprenden" y "contienen"
y sus variaciones, por ejemplo, "que comprende" y
"comprende", significa "que incluye, pero no limitado a",
y no se pretende que se excluyan (y no se hace) otros
restos, aditivos, componentes, pasos o etapas.
Definiciones
Como se usa en el presente documento, una región
promotora se define como una secuencia genómica de
nucleótidos que consta de un promotor y un sitio de inicio
de la transcripción junto con 5 kb de la secuencia en 5'
aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción y 500
pb de la secuencia en 3' aguas abajo del extremo distal
del primer exón.
Una región en 5' sin traducir significa una región en
5' del inicio de la traducción codificada en la secuencia
genómica o de ADNc. Se toma para que incluya todos los
elementos reguladores en la dirección 5'. Una secuencia en
5' aguas arriba se usa para referirse a una secuencia en
5' al inicio de la transcripción codificado en la
secuencia genómica.
Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico
transcribible" significa un ácido nucleico que, cuando
está unido de manera operable a un promotor funcional u
otras secuencias reguladoras, puede ser transcrito para
dar una molécula de ARN funcional, tal como ARNm. Estas
secuencias pueden comprender marcos de lectura abiertos,
que codifican secuencias de polipéptidos traducibles.
Alternativamente, el ARN funcional puede tener otra
función, tal como ARN ribosómico, ribozimas o ARN no
codificante.
"Gen" normalmente significa la combinación de la
región codificante del ácido nucleico transcribible, junto
con el promotor a partir del cual se transcribe y otras
secuencias reguladoras tales como potenciadores y señales
de poliadenilación en 3'. Los genes de ADN genómico
también contienen intrones. "Unidad de transcripción" a
veces se usa para describir una combinación funcional de
al menos un promotor y secuencias reguladoras mínimas con
un ácido nucleico transcribible, a menudo derivado de ADNc
a partir del cual se han procesado los intrones. "Cistrón"
se define como un ácido nucleico que codifica un único
polipéptido junto con las señales funcionales de
iniciación y terminación. "Transgen" implica un gel que ha
sido transferido de un genoma a otro, aunque el término se
puede aplicar más libremente a cualquier gen o incluso a
un ácido nucleico transcribible comprendido en una
construcción de ADN recombinante tal como un vector.
Promotor y potenciador son términos muy conocidos en
la materia e incluyen las siguientes características que
se proporcionan sólo a modo de ejemplo, y no a modo de
limitación. Los promotores son secuencias reguladoras en
5' que actúan en cis unidas directamente al sitio de
inicio de la transcripción. Los elementos promotores
incluyen las secuencias denominadas caja TATA y la
selección de iniciación de la ARN polimerasa (RIS) cuya
función es seleccionar un sitio de inicio de la
transcripción. Estas secuencias también se unen a
polipéptidos cuya función, entre otras, es facilitar la
selección del inicio de la transcripción por parte de la
ARN polimerasa.
En términos sencillos, los promotores son elementos
direccionales que actúan para iniciar la transcripción de
secuencias situadas a menos de 100 (y normalmente a menos
de 50) pares de bases (pb) de nucleótidos en dirección 3'.
Contienen una serie de secuencias cortas de nucleótidos
consenso que actúan como sitios de unión para diversas
proteínas que participan en el inicio de la transcripción
y en el ensamblaje de un complejo multi-subunidad conocido
como complejo de pre-iniciación (McKnight y Tjian, 1987,
Cell 46: 795-805). En la mayoría de los genes, esto se
produce en una secuencia muy ampliamente conservada
conocida como caja TATA (TATAAA) a la cual se une la
proteína de unión a la caja TATA (TBP, una subunidad del
factor de transcripción general TFIID). A continuación se
produce el ensamblaje ordenado de más de 10 factores de
transcripción adicionales para formar en último término el
complejo de la holoenzima Pol II. La transcripción del ARN
en realidad comienza en el sitio de iniciación
aproximadamente 25-30 bases en dirección 3' (Breathnach y
Chambon, 1981, Annu Rev Biochem 50: 349-393) al cual
también se une la TBP.
La mayoría de promotores funcionales contienen
elementos promotores adicionales en dirección 5' (UPEs),
de los cuales los más conservados son la caja CAAT (CCAAT,
el sitio de unión para los factores de transcripción CBF,
C/EBP y NF-1), aproximadamente 70-200 pb en dirección 5',
y la caja GC (GGGCGG, sitio de unión para el factor de
transcripción general Sp-1) a una distancia similar en
dirección 5'. Aunque se producen niveles basales de
transcripción con la caja TATA sola, para la mayoría de
promotores son necesarias al menos las cajas CAAT y GC
para unos niveles óptimos de transcripción.
Los potenciadores son secuencias que actúan no
direccionalmente para incrementar la transcripción de
promotores situados localmente, pero no de manera
necesaria inmediatamente adyacentes (hasta varias
kilobases de distancia (Kadonaga (2004) Cell 116: 247257)). Los potenciadores contienen secuencias consenso
cortas (8-12 pb) que representan los sitios de unión para
una amplia variedad de proteínas activadoras de la
transcripción (Ondek y col., 1988, Science 236: 1237-1244)
incluyendo algunas, tales como NF-1 y SP-1 que también
están asociadas a elementos promotores. A menudo estas
secuencias están duplicadas en tándem o en repeticiones
invertidas.
En algunas unidades de transcripción naturales,
incluyendo las unidades de transcripción génica
inmediata/temprana muy activas de muchos virus de ADN
tales como citomegalovirus, los elementos potenciadores y
promotores se pueden combinar funcionalmente en lo que es
efectivamente un elemento extendido en dirección 5'.
Los promotores pueden estar regulados, que responden
al tipo celular, a la temperatura, a iones metálicos u
otros factores; o ser constitutivos, que producen una
transcripción que no responde a esos factores. Para muchos
propósitos es muy ventajoso un promotor constitutivo que
dé niveles de transcripción elevados y consistente en
muchos, si no en todos, los tipos celulares. Durante
muchos años, el elemento potenciador/promotor que conduce
la expresión génica inmediata/temprana en citomegalovirus
humano se ha usado muy ampliamente para conducir la
expresión de genes heterólogos en vectores de expresión
eucariotas (Foecking & Hoffstetter, 1986, Gene 45: 101105).
Se propuso la hipótesis de que regiones promotoras de
genes de proteínas ribosómicas podrían tener una actividad
útil en la potenciación y estabilización de la expresión
de transgenes unidos y que las regiones reguladoras
procedentes de genes muy expresados muy probablemente
podrían contener elementos que son muy eficaces en el
mantenimiento de la cromatina en una conformación
transcripcionalmente activa. La unión de dichos elementos
a un promotor heterólogo podría generar por tanto un
entorno de la cromatina más abierto en los alrededores del
promotor, lo que daría como resultado una expresión
incrementada. Alguien experto en la materia entenderá que
los promotores derivados de genes de proteínas ribosómicas
se deben distinguir de los promotores ribosómicos, que son
promotores que dependen de la ARN-polimerasa de tipo I a
partir de la cual se transcribe el ARNr.
Para comprobar esta hipótesis, se obtuvo ARN
procedente de líneas celulares CHO-K1 y NS0 en la fase de
crecimiento exponencial y se llevó a cabo un análisis de
micromatrices frente a 13.443 genes murinos. Limitamos
nuestro análisis a elementos que tienen un contenido
elevado en islas CpG y una probabilidad de promotores
bidireccionales. Usando criterios basados en la secuencia
efectiva mínima de la región reguladora hnRNPA2, se
amplificaron por PCR aproximadamente 3 kb de ADN
procedente de una selección de estos genes a partir de ADN
genómico de NS0. A continuación, estas secuencias se
clonaron en vectores de expresión EGFP y se transfectaron
a células CHO-K1 junto con las versiones control de
hnRNPA2 del mismo vector.
Se encontró que las secuencias derivadas de las
regiones promotoras de dos proteínas ribosómicas
proporcionaban de manera consistente niveles de expresión
elevados de la secuencia informadora heteróloga en el
ensayo utilizado. En cada caso, la región promotora
comprendía una secuencia rica en GC que se extiende desde
la región en 5' aguas arriba de los elementos promotores
reales hasta bien entrado en el primer exón y, de hecho,
en el primer intrón. Esta secuencia rica en GC cumplía los
criterios de ser una isla CpG extendida, como se define en
el presente documento puesto que se extiende más de 300
pb.
Por consiguiente, la invención proporciona un
polinucleótido aislado que comprende:
- a.
- una isla CpG extendida exenta de metilación que comprende más de 3000 nucleótidos contiguos desde la región promotora de un gen rps3 de mamífero;
b. un promotor heterólogo; y
- c.
- una secuencia de ácidos nucleicos transcribible adyacente al promotor heterólogo, en el que la transcripción de dicha secuencia de ácidos nucleicos transcribible desde dicho promotor heterólogo se
mejora en presencia de dicha isla CpG extendida exenta de
metilación con respecto a la transcripción en ausencia de
dicha isla CpG extendida exenta de metilación.
Los nucleótidos contiguos se seleccionan del área del
promotor, que se extiende desde un punto 5 kb aguas arriba
(en dirección 5' con respecto a la hebra codificante) del
sitio de inicio de la transcripción hasta un punto 500 pb
aguas abajo (en dirección 3' con respecto a la hebra
codificante) del extremo distal (3') del primer exón.
También se prefiere que dicha isla CpG comprenda el
promotor del gen rps3 y desde el cual se inicia
naturalmente la transcripción del gen rps3. Ese promotor,
a menudo se denomina promotor endógeno. En una forma de
realización preferida, la isla CpG comprende
adicionalmente uno o varios exones de dicho gen rps3.
El gen rps3 es un gen de mamífero, aunque esos genes
y sus promotores y las secuencias 5' aguas arriba están
muy conservadas entre especies, y alternativamente también
pueden estar descritos genes de insectos, nematodos y
levaduras. No obstante, preferentemente es un gen humano o
de roedor y lo más preferentemente es un gen de ratón.
En una forma de realización muy preferida, el
polinucleótido aislado de la invención comprende los
nucleótidos 38 a 3154 de la secuencia de nucleótidos rps3
de ratón representada en la SEQ ID NO: 1. También se
describen los nucleótidos 12 a 3032 de la secuencia de
nucleótidos rps11 de ratón como se presenta en la SEQ ID
NO: 2.
En un aspecto, además del elemento descrito, el
polinucleótido comprende adicionalmente un promotor no
asociado de manera natural a dicho elemento procedente de
un gen de una proteína ribosómica. En esta forma de
realización, un promotor heterólogo (distinto del promotor
endógeno que puede o puede no estar presente en el primer
elemento) está situado en una posición adyacente y unido
de manera operable en dirección 3' del elemento que
contiene la secuencia en 5' derivada del gen de la
proteína ribosómica. En esta disposición, la expresión
dirigida por este promotor heterólogo se mejora por el
efecto del elemento del gen de la proteína ribosómica.
En una forma de realización, dicho promotor es un promotor constitutivo, más preferentemente seleccionado de la lista constituida por el promotor temprano/inmediato de citomegalovirus, SV40, EF-1α, las LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), o las LTR del VIH2 o combinaciones de secuencias derivadas de ellos. Más preferentemente, el promotor es un promotor inmediato/temprano de CMV. Más preferentemente, es el promotor inmediato/temprano de CMV en ratón o conejillo de indias.
Alternativamente, dicho promotor puede ser un
promotor específico de tejido, que dirige la expresión en
un espectro limitado de tejidos. Dichos promotores son muy
conocidos en la materia e incluyen aquellos derivados de
•-globina, las cadenas ligeras de inmunoglobulinas • y •,
la cadena pesada de inmunoglobulinas, desmina, tirosinasa,
CD2, IL-3, la cadena ligera de la miosina, el promotor del
gen de la actividad inhibitoria del melanoma humano y
queratinas. En una forma de realización particularmente
preferida el promotor es un promotor selectivo de tumores,
que dirige preferentemente la expresión de uno o más tipos
tumorales. Ejemplos de dichos promotores incluyen los
promotores del antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno
prostático específico (PSA), ciclooxigenasa-2 (COX-2),
alfa-fetoproteína (AFP), tirosinasa, y los promotores
basados en los factores 1-4 de linfocitos T (TCF).
El ácido nucleico transcribible puede codificar
cualquier polipéptido útil para la expresión in vitro y
preferentemente se selecciona de la lista constituida por
un anticuerpo, un fragmento funcional de un anticuerpo que
se une a un epítopo, un factor de crecimiento, una
citoquina, una proteína quinasa, un receptor soluble, un
receptor unido a membrana, o un factor de coagulación
sanguíneo. Alternativamente, el ácido nucleico
transcribible puede codificar un gen terapéutico para su
uso en terapia génica in vivo o ex vivo. Dicho ácido
nucleico terapéutico puede actuar sustituyendo o
suplementando la función de un gen defectuoso que provoca
una enfermedad como la fibrosis quística, talasemia,
anemia falciforme, anemia de Fanconi, hemofilia,
inmunodeficiencia combinada severa (SCID), fenilcetonuria
(PKU), deficiencia en antitripsina alfa-1, distrofia
muscular de Duchenne, deficiencia en ornitina
transcarbamilasa u osteogénesis imperfecta.
Alternativamente, puede codificar un agente citotóxico o
una enzima conversora de un profármaco expresada
selectivamente en una célula diana, como una célula de
cáncer maligno, con el fin de acabar con él. Estas
aplicaciones, y muchas otras, son muy conocidas por
aquellos expertos en la materia y la importancia de la
presente invención en la mejora de la expresión de los
ácidos nucleicos terapéuticos será evidente para dichos
profesionales cualificados.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector
que comprende el polinucleótido de la invención como se
describe anteriormente. Preferiblemente, dicho vector es
un vector de expresión adaptado para la expresión de genes
eucariotas.
Normalmente, dicha adaptación incluye, a modo de
ejemplo y no de limitación, la provisión de secuencias
para el control de la transcripción (secuencias
promotoras) que median en la expresión específica de
células/tejido. Las adaptaciones también incluyen la
provisión de marcadores seleccionables y secuencias de
replicación autónomas que facilitan el mantenimiento de
dicho vector en la célula eucariota o en el hospedador
procariota. Los vectores que se mantienen de manera
autónoma se denominan vectores episomales. Se prefieren
los vectores episomales puesto que son auto-replicativos y
de esta forma persisten sin necesidad de integración.
Vectores episomales de este tipo se describen en el
documento WO 98/07876.
Las adaptaciones que facilitan la expresión de genes
codificados en vectores incluye la provisión de secuencias
de terminación de la transcripción/poliadenilación. Esto
también incluye la provisión de sitios internos de entrada
de ribosomas (IRES) cuya función es maximizar la expresión
de los genes codificados en los vectores dispuestos en
casetes de expresión bicistrónicos o multi-cistrónicos.
Estas adaptaciones son muy conocidas en la materia.
Hay una cantidad importante de bibliografía publicada con
respecto a la construcción de vectores de expresión y a
las técnicas de ADN recombinante, en general. Por favor,
véase, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold
Spring Harbour, NY y las referencias allí citadas;
Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical
Approach Vol III 1RL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M
Ausubel y col., Current Protocols In Molecular Biology,
John Wiley & Sons, Inc.(1994).
El vector puede ser un vector episomal o un vector de
integración. Preferentemente, el vector es un plásmido.
Alternativamente, el vector puede ser un virus, tal como
un adenovirus, virus asociado a adenovirus, un
herpesvirus, virus de la vacuna, un lentivirus, u otro
retrovirus.
Alternativamente, ese vector puede comprender:
- a.
- un elemento que comprende más de 3000 nucleótidos contiguos desde la región promotora de un gen rps3 de mamífero;
b. un promotor heterólogo; y
- c.
- un sitio de clonación múltiple, en el que una secuencia de ácidos nucleicos transcribible insertada en el sitio de clonación múltiple puede ser transcrita desde el promotor heterólogo y el nivel de
transcripción se mejora mediante el elemento.
En un aspecto adicional, la invención proporciona una
célula hospedadora que comprende el polinucleótido o el
vector aislado como se describe en el presente documento.
Preferentemente, dicha célula hospedadora es una célula de
mamífero, más preferentemente seleccionada de la lista
constituida por células CHO, NS0, BHK, HeLa, HepG2.
Además, la invención proporciona un procedimiento de
expresión de un polipéptido que comprende la inserción de
un vector de expresión que contiene el polinucleótido de
la invención en una célula hospedadora apropiada como se
describe en el presente documento y el cultivo de dicha
célula hospedadora en condiciones adecuadas para permitir
su expresión. Preferentemente, dicho polipéptido es un
polipéptido terapéuticamente útil.
En un aspecto adicional la invención proporciona una
preparación farmacéutica que comprende el polinucleótido,
el vector o la célula hospedadora como se describe en el
presente documento y un vehículo, excipiente, tampón o
medio farmacéuticamente aceptable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra un plásmido con el mapa del vector rps3-1005-EGFP (véase Ejemplo 1) La Figura 2 muestra un plásmido con el mapa del vector rps11-1005-EGFP (véase Ejemplo 2)
La Figura 3 muestra la expresión del informador EGFP como se expresa por diversas construcciones de rps3 en células CHO-K1 analizadas mediante análisis FACS, 8 días después de la transfección. La Figura A muestra la fluorescencia media, y la Figura B indica el porcentaje de células que expresan el gen informador a un nivel detectable (% de células positivas). Véase Ejemplo 1.
La Figura 4 muestra la expresión del gen informador de construcciones de rps11 en células CHO-K1, 7 días después de la transfección (analizadas por FACS). A y C son las cuentas totales, de B a E son los resultados basados sólo en las células que expresan dentro de la población. La Figura A muestra la fluorescencia media de células en el fondo de reserva seleccionado de manera estable, y la Figura B muestra el porcentaje (%) de células positivas. Véase Ejemplo 2.
La Figura 5 muestra el nivel de expresión de un gen informador en células NS0 transfectadas de manera estable cuando se lleva a cabo por el promotor hCMV sin elementos adicionales presentes o cuando se coloca un elemento hnRNPA2 de 8 kb o un elemento RPS3 de 3 kb inmediatamente en 5' al promotor de hCMV. La Figura A muestra la intensidad de fluorescencia media de los fondos de reserva estables a los 28 días y la Figura B muestra el porcentaje (%) de células positivas.
La Figura 6 muestra datos similares a la Figura 5 para construcciones de rps11. La Figura A muestra los valores de la intensidad de fluorescencia media para fondos de reserva estables generados con construcciones de hCMV o construcciones idénticas con un elemento hnRNPA2 de 8 kb o un elemento RPS3 de 3 kb inmediatamente en 5' al promotor. La Figura B muestra el porcentaje de células positivas dentro del fondo de reserva que expresan el gen informador (porcentaje (%) de células positivas).
Se extrajo el ARN total de células CHO-K1
confluentes al ~80% usando el kit de extracción RNeasy
RNA (Qiagen, Crawley, RU) según el protocolo del
fabricante. El ARN total (2 µg/µl) se sometió a análisis
de expresión en micromatrices usando un banco de
oligonucleótidos de ratón de oligómeros de 70 unidades
(Operon V.1) que representa 13.443 transcritos conocidos.
El laboratorio de Genómica y micromatrices de la
- Universidad
- de Cincinnati realizó el análisis de
- micromatrices
- según los protocolos de referencia
- (http://microarray.uc.edu).
Las secuencias de los transcritos génicos se
clasificaron según su fluorescencia creciente. Puesto que
nuestros estudios previos detallaban los loci
HNRPA2B1/CBX3 como un elemento de reestructuración de la
cromatina y que confiere beneficios al hCMV, el
transcrito HNRPA2 fue identificado como el nivel de
expresión basal. No obstante, usando el análisis de
micromatrices disponible, el transcrito HNRPA2 apenas fue
detectable. Puesto que el nivel de expresión del
transcrito HNRPA2 era mínimo, usando HNRPA2 como
referencia identificamos 3829 secuencias para su
potencial análisis. Por tanto, se identificaron
secuencias del 2% superior (76 secuencias) de los
transcritos ordenados y expresados según los criterios de
inclusión de una isla CpG y uno o más sitios de inicio de
la transcripción conocidos/putativos (véase Tabla 1). La
posición de las islas CpG, el tamaño y las relaciones
GC:CG se verificaron usando GrailEXP
(http://compbio.ornl.gov). Los sitios de inicio de la
transcripción conocidos/putativos se identificaron a
partir del análisis NIX blast (http://www.hamp.mrc.ac.uk)
y las bases de datos de Ensembl (http://www.ensembl.org).
CpG
Los oligonucleótidos de la PCR estaban diseñados
para amplificar fragmentos de 3 kb aproximadamente que
contienen la isla CpG completa embebida en la región
promotora y que incluyen 500 pb aproximadamente de
secuencia codificante según la estructura de la secuencia
codificante conocida o predicha (véase Tabla 2).
Las reacciones de PCR contenían grupos de
oligonucleótidos específicos de cada fragmento genómico
(2 pmol de cada cebador; Tabla 2). La amplificación por
PCR se consiguió usando las premezclas Failsafe™ PCR A-F
(Cambio, RU), 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Promega,
RU) y 200 ng de ADN no codificante. La desnaturalización
inicial se realizó a 96°C durante 2 minutos, mientras que
la amplificación por PCR se llevó a cabo durante 35
ciclos (94°C durante 1 min, 55-60°C durante 1 min, 72°C
durante 5 min). Se incluyó una etapa de extensión final
(72°C durante 10 min).
Los productos de la PCR se purificaron en gel,
usando columnas de purificación GFX DNA (Amersham, RU)
según el protocolo del fabricante, y se sometieron al
proceso de clonación TOPO TA cloning® según el protocolo
del fabricante (TOPO; Invitrogen, RU). Se obtuvieron las
orientaciones en sentido directo y en sentido contrario
para cada fragmento que contiene islas CpG clonadas en
vectores TOPO (Invitrogen, RU).
Construcción del vector de expresión
Se construyó un vector de expresión control
(denominado CET1005EGFP, SEQ ID NO: 20) con la inserción
de un hCMVIEGFP/sv40 pA (sitio de clonación múltiple
NheI/AgeI borrado) procedente de pEGFP-N1 en CET 900,
seguido de la inserción del casete AscI de este vector en
el sitio AscI de CET 1005.
Todos los fragmentos con islas CpG se eliminaron de
TOP02.1 (Invitrogen, RU) a menos que se indique otra
cosa. El fragmento Terf2ip Acc65I/EcoRV se insertó en
Acc65I/Swal de 1005. GAPDH Spel/SnaBI se insertó en
PmeI/XbaI de 1005. El fragmento RPS3 XbaI/SpeI se insertó
en XbaI de 1005. Los fragmentos romos RPS11 y TUBA1 EcoRI
se eliminaron de TOPO4.0 y TOPO2.1, respectivamente
(Invitrogen, RU) y se insertaron en PmeI de 1005. Por
último, los fragmentos A430106P18Rik (EcoRV) y
2510006D16Rik (BstXI) también se insertaron en Pmel de
1005. Todos los fragmentos que contienen islas CpG se
insertaron en ambas orientaciones en sentido directo y en
sentido contrario inmediatamente en 5' del promotor hCMV.
Líneas celulares y transfecciones.
Las células CHO-K1 se crecieron en HAMS F12
(Invitrogen, Paisley, RU) más 4500 mg/l de L-ananil-Lglutamina, 10 µg/ml de cada una de penicilina y
estreptomicina, y el 10% (v/v) de suero fetal bovino
inactivado por calor (FCS; Invitrogen, Paisley, RU). La
transfección se llevó a cabo por electroporación usando
aproximadamente 107 células procedentes de cultivos
confluentes al 80% y un set Gene Pulser II™ de BioRad
para proporcionar un único pulso de 975 µF a 250 V. Las
transfecciones requirieron 2 µg de plásmido CET1005EGFP
linealizado y cantidades molares equivalentes para
vectores de expresión de diferentes tamaños. Las células
transfectadas de manera estable se seleccionaron y se
mantuvieron en medio de crecimiento que contiene 12,58
µ/ml de sulfato de puromicina (Sigma, RU).
Cuantificación de la expresión transgénica
El análisis de las células transfectadas con las
construcciones informadoras EGFP se realizó con un
Becton-Dickinson.
El FACScan se realizó usando la línea celular CHO-K1
parental como control de fondo autofluorescente.
Tabla 1. Secuencias analizadas
- Locus
- Acc. #a Descripciónb Factor 2 que se unea repeticionesteloméricas queinteracciona con la Isla CpGc pb % CG GC/CG
- Tert2ip
- AB041557proteína1 (proteínatelomérica Rap1 queinteracciona con 968 64,56 0,90
- TRF2).Gliceraldehído-3
- Gapdd RPS3
- M32599 fosfato deshidrogenasa NM012052 RPS3 -proteínaribosómica S3 de 40S. 1187 60,50 0,84 419 60,39 0,87
- Cadena de la
- TUBA 1 RPS11
- M13445 tubulina alfa-1 (Alfa-tubulina 1). AK011207 RPS11 -proteínaribosómica S11 de 40S. 850 66,30 0,91 957 59,71 0,95
A430106Pl8RikAK020778Marcaje de lasecuencia expresada 982 63,62 0,93 2510006D16RikAK010915Marcaje de la
secuencia expresada 679 67,69 0,75 aNº de acceso del Genbank bDescripción del Enseml (http://www.ensembl.org/)cGrailexp (http://compbio.ornl).gov/orailexp)dGapd - derivado de la secuencia humana
Tabla 2. Oligonucleótidos de la PCR y tamaños de los
Locus Sentido directo Sentido contrario Amplicón
gtagtttctgacttggaaataactgacctgccatgcca
Terf2ip 2995 pb
gt (SEQ ID NO: 3) ttc (SEQ ID NO: 4)
gagcagtccggtgtcacta gcagagaagcagacagtt
Gapd 3096 pb
(SEQ ID NO: 5) atg (SEQ ID NO: 6)
cagagcatcaagtacctgtgtaaccactaagccatctc
RPS3 3056 pb
a (SEQ ID NO: 7) tcc (SEQ ID NO: 8) taaaacccacagcactgt
caagaacaaggaagctggcc
TUBA1 aggg (SEQ ID NO: 3049 pb
(SEQ ID NO: 9)
10) aagactgtttgcctcatgcc ggatgacaatggtcctct
RPS11 3020 pb
(SEQ ID NO: 11) gc (SEQ ID NO: 12)
atggttgtagg
A430106P18 atccctcacattgccaag
ttcacgtcc (SEQ ID 3128 pb
Rik cc (SEQ ID NO: 14)
NO: 13)
acttaagacct
2510006D16 gctagcttacataggcag
gatgcctcc (SEQ ID 2997 bp
Rik cc (SEQ ID NO: 16)
NO: 15)
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia clonada RPS3
5 (nucleótidos 38 a 3154); la SEQ ID NO: 17 muestra la
secuencia completa del plásmido pRPS3-1005-EGFP; la SEQ
ID NO: 18 muestra la secuencia completa del plásmido
pCET1015-EGFP.
Se investigaron los niveles de expresión de EGFP, 8
10 días después de la transfección, en fondos de reserva de
CHO-K1 que contienen hCMV solo (construcción control;
plásmido pCET1005-EGFP, linealizado con Pmel antes de la
transfección), construcciones que contienen un fragmento
RNPA2 de 8 kb (plásmido pCET1015-EGFP, linealizado con
15 Pmel antes de la transfección) y Rps3 (plásmido pRPS31005-EGFP; linealizado con Pmel antes de la
transfección).
Los fondos de reserva generados con construcciones que
contienen Rps3 presentan un incremento significativo en
20 los niveles de expresión de EGFP comparados con las
construcciones control. La adición de la secuencia Rps3
en 5' del promotor hCMV dio como resultado un incremento
de 5,5 ó 1,5 veces en la intensidad de fluorescencia
media con respecto a construcciones que contienen el
elemento de control o el elemento hnRNPA2,
respectivamente (Figura 3A).
Se investigó la actividad de las construcciones en
células NS0. El incremento en la intensidad de
fluorescencia media en fondos de reserva estables cuando
el elemento RPS3 o los elementos hnRNPA2 están incluidos
en las construcciones, comparado con el promotor hCMV
solo, fue de 28 ó 18 veces, respectivamente (Figura 5A).
En ambos tipos de células CHO-K1 y NS0, el porcentaje de
células positivas se incrementó significativamente con el
elemento hnRNPA2, pero este incremento fue superior con
el elemento RPS3 (Figuras 3B y 5B).
Ejemplo 2: Expresión conducida por el elemento rps11
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia clonada RPS11
(nucleótidos 12 a 3032); la SEQ ID NO: 19 muestra la
secuencia completa de pRPS11-1005-EGFP.
Los vectores que contienen Rps11 y el control (Pmel
linealizado) se transfectaron en líneas celulares CHO-K1
y NS0 y se generaron fondos de reserva estables mediante
la selección con puromicina. Los niveles de expresión
media de EGFP se valoraron mediante análisis FACscan.
La adición del elemento Rps11 en dirección 5' del
hCMV dio como resultado un incremento de 1,2 veces en los
niveles de expresión media de EGFP, en fondos de reserva
de CHO-K1, comparados con una construcción que contiene
el fragmento RNPA2 descrito previamente (Fig 4A).
Líneas celulares NS0 transfectadas de manera estable
con construcciones que contienen Rps11 mostraron un
incremento de 1,8 y 1,5 veces (respectivamente), en los
niveles de expresión media de EGFP comparados con las
construcciones de hCMV y RNPA2 (Fig 6A).
Se observó un incremento en el porcentaje de células
positivas para líneas celulares CHO-K1 transfectadas con
construcciones Rps11 comparadas con construcciones RNPA2
(Fig 4B). Además, se observó un incremento en el
porcentaje de células positivas en fondos de reserva de
NS0 transfectadas con construcciones Rps11 comparadas
tanto con hCMV como con RNPA2 (Fig 6B).
<110> serologicals Investment company
<120> Elementos de expresión mejorados
<130> P108872WO
<160> 20
10 <170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 3145
<212> ADN
<213> Mus musculus rps3
15 <400> 1
<210> 2
<211> 3039
<212> ADN
<213> Mus musculus rps11
<400> 2 60
<210> 3
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
10 <210> 4
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
15 <223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<211> 19
<212> ADN
20 <213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<210> 6
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<210> 7
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 9
<210> 10
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 10
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 11
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 12
<210> 13
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 13
<210> 14
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 14
<210> 15
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 15
<210> 16
<211> 20
10 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético de la PCR
<400> 16
<210> 17
<211> 8691
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Vector pRPS3 1005 EGFP
<400> 17
<210> 18
<211> 13827
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Vector pCET 1015 EGFP
<400> 18
<210> 19
<211> 8585
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Vector pRPS11 1005 EGFP
<400> 19
<210> 20
<211> 5546
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sector pCET 1005 EGFP
<400> 20
Esta lista de referencias citadas por el solicitante pretende únicamente servir de ayuda al lector y no forma parte del documento de patente europeo. Aun cuando se ha puesto el máximo esmero en su elaboración, no pueden excluirse errores u omisiones y la EPO declina toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patente citados en la descripción
- •
- US 6689606 B [0008] • US 6063598 A [0018]
- •
- WO 000539 A [0008]
- •
- WO 0005393 A [0012] [0013]
Bibliografía distinta de descripción
- •
- Dillon, N. ; Grosveld,
F. Chromatin domains as potential units of eukaryotic gene function. Curr. Opin. Genet. Dev., 1994, vol. 4, 260-264
[0002]
• Higgs, D.R. Do LCRs open chromatin domains? Cell, 1998, vol. 95, 299-302
[0002]
• Palmiter, R.D. ; Brinster, R.L. Ann. Ref. Genet., 1986, vol. 20, 465-499 [0003]
• Allen, N.D. et al.
Nature, 1988, vol. 333, 852-855 [0003]
- •
- Bonnerot, C. ; Grimber,
- G.
- ; Briand, P. ; Nicolas,
J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 6331-6335 [0003]
- •
- US 20040148647 A [0019]
- •
- WO 9807876 A [0044]
patentes citada en la
• Fraser, P. ; Grosveld,
F. Curr. Opin. Cell Biol, 1998, vol. 10, 361-365
[0005]
• Li, Q. ; Harju, S. ;Peterson, K.R. Trends Genet., 1999, vol. 15, 403-408 [0005]
• Kloussis, D. ; Festenstein, R. Curr, Opin. Genet. Dev., 1997, vol. 7, 614-619 [0005]
• LI, Q. ; Harju, S. ;Peterson, K.R. Trends Genet, 1999, vol. 15, 403408 [0005]
• Kaufman RJ. Methods Enzymol, 1990, vol. 185, 537-566 [0006]
• Needham M ; Gooding C ;Hudson K ; Antoniou M ; Grosveld F ; Hollis M.
Nucleic Acids Res, 1992, vol. 20, 997-1003 [0006]
• Needham M ; Egerton M ;Millest A ; Evans S ; Popplewell M ; Cerillo G ;McPheat J ; Monk A ; Jack A ; Johnstone D. Protein Expr Purif, 1995, vol. 6, 124-131 [0006]
• Gardiner-Green M ; Frommer M. J Mol Biol, 1987, vol. 196, 261-282
[0009]
• Rice P ; Longden I ;Bleasby A. Trends Genet, 2000, vol. 16, 276-277
[0009]
- •
- Bird y col. Cell, 1985, vol. 40, 91-99 [0010]
- •
- Tazi; Bird. Cell, 1990, vol. 60, 909-920 [0010]
• Wise; Pravtcheva.
Genomics, 1999, vol. 60, 258-271 [0010]
• Antequera, F. ; Bird. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 119511999 [0010]
• Cross, S.H. ; Bird, A.P.
Curr. Opin, Genet. Dev., 1995, vol. 5, 309-314
[0010]
• Tazi, J. ; Bird, A.
Cell, 1990, vol. 60, 909920 [0010]
• Wool. TIBS, 1996, vol.
21, 164-165 [0014]
• Wool y col. Biochem Cell Biol, 1995, vol. 73, 933947 [0014]
• Hershko ; Ciechanover.
Annu Rev Biochem, 1992, vol. 61, 761-807 [0015]
- •
- Coux y col. Annu Rev Biochem, 1996, vol. 65, 801-847 [0015]
- •
- Finley y col. Nature, 1989, vol. 338, 394-401
[0016]
- •
- Chan y col. Biochem Biophys Res Commun, 1995, vol. 215, 682-690 [0016]
- •
- Redman ; Burris. Biochem J, 1996, vol. 315, 315-321
[0016]
• Perry. BMC Evolutionary Biology, 2005, vol. 5, 15
[0017]
- •
- Hariharan y col. Genes Dev, 1989, vol. 3, 1789800 [0017]
- •
- McKnight ; Tjian. Cell, 1987, vol. 46, 795-805
[0027]
• Breathnach ; Chambon.
Annu Rev Biochem, 1981, vol. 50, 349-393 [0027]
- •
- Kadonaga. Cell, 2004, vol. 116, 247-257 [0029]
- •
- Ondek y col. Science, 1988, vol. 236, 1237-1244
[0029]
• Foecking ; Hoffstetter.
Gene, 1986, vol. 45, 101105 [0031]
• Sambrook y col.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory, 1989 [0046]
- •
- Marston, F. DNA Cloning Techniques: A Practical Approach. RL Press, 1987, vol. III 1 [0046]
- •
- Current Protocols. F M Ausubel y col. Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc, 1994 [0046]
Claims (23)
- REIVINDICACIONES1. Un polinucleótido aislado que comprende:
- a.
- una isla CpG extendida exenta de metilación que comprende más de 3000 nucleótidos contiguos desde la región promotora de un gen rps3 de mamífero;
b. un promotor heterólogo; y- c.
- una secuencia de ácidos nucleicos transcribible adyacente al promotor heterólogo, en el que la transcripción de dicha secuencia de ácidos nucleicos transcribible desde dicho promotor heterólogo se mejora en presencia de dicha isla CpG extendida exenta de metilación con respecto a la transcripción en ausencia de dicha isla CpG extendida exenta de metilación.
-
- 2.
- El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la isla CpG extendida exenta de metilación comprende adicionalmente uno o varios exones del gen rps3 de mamífero.
-
- 3.
- El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el gen rps3 de mamífero es un gen rps3 humano.
-
- 4.
- El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el gen rps3 de mamífero es un gen rps3 de roedor.
-
- 5.
- El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el gen de roedor es un gen rps3 de ratón.
-
- 6.
- El polinucleótido según la reivindicación 5, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
-
- 7.
- El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el promotor heterólogo es un promotor constitutivo.
-
- 8.
- El polinucleótido según la reivindicación 7, en el que el promotor constitutivo se selecciona del grupo constituido por el promotor temprano/inmediato de citomegalovirus, SV40, EF-1α, las LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), o las LTR del VIH2.
-
- 9.
- El polinucleótido según la reivindicación 10, en el que el promotor constitutivo es el promotor temprano/inmediato de citomegalovirus.
-
- 10.
- El polinucleótido según la reivindicación 9, en el
que el promotor constitutivo es un promotor temprano/inmediato de citomegalovirus en conejillo de indias. -
- 11.
- El polinucleótido según la reivindicación 9, en el que el promotor constitutivo es un promotor temprano/inmediato de citomegalovirus en ratón.
-
- 12.
- El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el promotor heterólogo es un promotor específico de tejido.
-
- 13.
- El polinucleótido según la reivindicación 12, en el que el promotor heterólogo es un promotor selectivo de tumores.
-
- 14.
- El polinucleótido según la reivindicación 13, en el que el promotor se selecciona del grupo constituido por promotores del antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico (PSA), ciclooxigenasa-2 (COX-2), alfa-fetoproteína (AFP), tirosinasa, y los promotores basados en los factores 1-4 de linfocitos T (TCF).
-
- 15.
- El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico transcribible codifica un polipéptido seleccionado del grupo constituido por un anticuerpo, un fragmento funcional de un anticuerpo que se une a un epítopo, un factor de crecimiento, una citoquina, una proteína quinasa, un receptor soluble, un receptor unido a membrana y un factor de coagulación sanguíneo.
-
- 16.
- Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
-
- 17.
- El vector según la reivindicación 16, en el que el vector es un vector de expresión en eucariotas.
-
- 18.
- Un vector de expresión en eucariotas que comprende:
imagen1 - a.
- un elemento que comprende más de 3000 nucleótidos contiguos desde la región promotora de un gen rps3 de mamífero;
b. un promotor heterólogo; y- c.
- un sitio de clonación múltiple, en el que una secuencia de ácidos nucleicos transcribible
imagen2 insertada en el sitio de clonación múltiple puede ser transcrita desde el promotor heterólogo y el nivel de transcripción se mejora con el elemento. -
- 19.
- Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el vector de la reivindicación 16, 17 ó 18.
-
- 20.
- La célula hospedadora según la reivindicación 19, en la que las células se seleccionan del grupo constituido por CHO, NS0, BHK, HeLa, HepG2.
-
- 21.
- Un procedimiento de expresión de un polipéptido codificado por un ácido nucleico transcribible que comprende la inserción de un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en una célula hospedadora adecuada y el cultivo de la célula hospedadora en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.
-
- 22.
- Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 o la célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
-
- 23.
- Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 o la célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 para su uso como medicamento.
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| MX377591B (es) * | 2014-10-15 | 2025-03-10 | Amgen Inc | Elementos promotores y reguladores para mejorar la expresión de genes heterólogos en células hospederas. |
| CA2995248A1 (en) * | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of prostate cancer |
| WO2018206168A1 (en) * | 2017-05-11 | 2018-11-15 | Zentrum Für Forschungsförderung In Der Pädiatrie Gmbh | Concept for the treatment of monogenetic disorders |
| CA3109101A1 (en) | 2018-08-09 | 2020-02-13 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Promoter of hspa8 gene |
| WO2020223160A1 (en) | 2019-04-30 | 2020-11-05 | Chan Zuckerberg Biohub, Inc. | A novel chromatin-opening element for stable long term gene expression |
| CN111249457A (zh) * | 2020-04-13 | 2020-06-09 | 吉林大学 | 核糖体蛋白sa抗体在免疫调节中的医用用途 |
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| CN116064663A (zh) * | 2022-09-15 | 2023-05-05 | 思鹏生物科技(苏州)有限公司 | 利用rps基因促进载体稳定表达的方法及其功能基因 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5583009A (en) * | 1992-12-08 | 1996-12-10 | University Of Washington | Method of preparing recombinant proteins in transgenic animals containing metallothionein gene elements that bestow tissue-independent copy number-dependent, position-indepedent gene expression |
| US5610053A (en) * | 1993-04-07 | 1997-03-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells |
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| JP2000516472A (ja) | 1996-08-16 | 2000-12-12 | メディカル リサーチ カウンシル | 組織特異的遺伝子発現を与える自己複製型エピソーム性発現ベクター |
| ATE539161T1 (de) * | 1998-07-21 | 2012-01-15 | Millipore Corp | Ein ein allgegenwärtiges chromatin-öffnendes element (ucoe) enthaltendes polynucleotid |
| AU771111B2 (en) * | 1998-07-21 | 2004-03-11 | Emd Millipore Corporation | A polynucleotide comprising a ubiquitous chromatin opening element (UCOE) |
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| JP2005500019A (ja) * | 2001-04-05 | 2005-01-06 | エムエル ラボラトリーズ ピーエルシー | 改良された遺伝子発現 |
| US7812148B2 (en) | 2001-04-05 | 2010-10-12 | Millipore Corporation | Vectors comprising CpG islands without position effect varigation and having increased expression |
| KR20040032105A (ko) * | 2001-06-04 | 2004-04-14 | 엠엘 래보러토리즈 피엘씨 | 재조합 단백질의 조성물 및 재조합 단백질의 고수준대규모 생산방법 |
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-
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