ES2281915T3

ES2281915T3 - Proteina tirosina fosfatasas de captura de sustrato.

Info

Publication number: ES2281915T3
Application number: ES97937017T
Authority: ES
Inventors: Nicholas Tonks; Andrew J. Flint
Original assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Current assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Priority date: 1996-07-25
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2007-10-01
Anticipated expiration: 2017-07-24
Also published as: AU728405B2; DE69737290D1; CA2262440A1; EP0918867B1; WO1998004712A3; DE69737290T2; US5912138A; ATE352625T1; AU5939598A; EP0918867A2; US5951979A; WO1998004712A2; JP2000515760A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS FOSFATASAS DE PROTEINA TIROSINA, EN LAS QUE EL RESIDUO DE ASPARTATO INVARIABLE SE SUSTITUYE POR UN RESIDUO DE ALANINA, LAS CUALES SE UNEN A UN SUSTRATO DE TIROSINA FOSFORILADA Y POSEEN UNA ACTIVIDAD CATALITICA ATENUADA. ASIMISMO, SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS DE IDENTIFICACION DE PROTEINAS DE TIROSINA FOSFORILADAS, QUE FORMAN COMPLEJOS CON LAS FOSFATASAS DE PROTEINA TIROSINA DESCRITAS ANTERIORMENTE.

Description

Proteína tirosina fosfatasas de captura de sustrato.

Antecedentes de la invención

La familia de enzimas denominada proteína tirosina fosfatasas (PTP) consiste en más de 500 proteínas estructuralmente diversas que tienen en común el dominio catalítico de PTP de 250 aminoácidos muy conservado, pero que presentan una variación considerable en sus segmentos no catalíticos (Charbonneau y Tonks, Annu, Rev. Cell Biol. 8: 463-493 (1992); Tonks Semin. Cell. Biol, 4: 373-453 (1993)). Esta diversidad estructural presumiblemente refleja la diversidad de papeles fisiológicos de los miembros individuales de la familia PTP, que en ciertos casos han demostrado tener funciones específicas en el crecimiento, desarrollo y diferenciación (Desai et al., Cell 84: 599-609 (1996); Kishihara et al., Cell 74: 143-156 (1993); Perkins et al., Cell 70: 225-236 (1992); Pingel y Thomas, Cell 58: 1055-1065 (1989); Schultz et al., Cell 73: 1445-1454 (1993)). Aunque ciertos estudios recientes también han generado una información considerable con respecto a la estructura, expresión y regulación de las PTP, aún no se ha determinado la naturaleza de los sustratos fosforilados en tirosina a través de los cuales las PTP ejercen sus efectos. Ciertos estudios realizados con un número limitado de sustratos fosfopeptídicos sintéticos han demostrado algunas diferencias en la selectividad por el sustrato de diferentes PTP (Cho et al., Protein Sci. 2: 977-984 (1993); Dechert et al., Eur. J. Biochem. 231: 673-681 (1995)), y han indicado preferencias por ciertos restos aminoacídicos en posiciones particulares próximas al resto de tirosina fosforilado (Ruzzene et al., Eur. J. Biochem. 211: 289-295 (1993); Zhang et al., Biochemistry 33: 2285-2290 (1994)). Esto indica que las PTP presentan un cierto nivel de selectividad por el sustrato in vitro, aunque no está clara la relevancia fisiológica de los sustratos usados en estos estudios.

Protein Science, vol. 5, nº 1, enero de 1996; 5-12 describe que se cree que en el mecanismo de reacción de las proteína tirosina fosfatasas (PTPasas) y las proteína fosfatasas de especificidad doble está implicado un resto de ácido aspártico catalítico. Se ha descrito que el ácido aspártico 383 se ha identificado como un posible candidato para el ácido catalítico en la proteína fosfatasa Cdc25A humana, usando alineamiento de secuencias, información estructural y mutagénesis de localización dirigida. Un mutante D383N presenta una reducción de 150 veces en el valor de K_{cat}, llegando el valor de K_{m} a más del doble. Usando análisis de homología de secuencias y basándose en el alineamiento de restos catalíticos y elementos de estructura secundaria, se presenta un modelo tridimensional de la región nuclear de Cdc25 y se propone una arquitectura general de la región nuclear de las proteína fosfatasas que incluye el motivo del bucle del sitio activo HCXXXXXR y el resto catalítico de ácido aspártico.

Compendio de la invención

Como se describe en este documento, la especificidad por el sustrato de proteína tirosina fosfatasas (PTP) de mamífero se ha investigado usando una nueva estrategia de captura de sustrato en la que se usan formas mutantes o alteradas de la PTP de mamífero, también denominadas PTP de captura de sustrato, para unirse a (capturar) uno o más sustratos de la PTP. La unión de la PTP de captura de sustrato con un sustrato de la PTP tiene como resultado la formación de un complejo que puede observarse fácilmente y, si se desea, aislarse y caracterizarse. Las formas mutantes de las PTP tienen una actividad catalítica atenuada (no tienen actividad catalítica o tienen una actividad catalítica reducida) con respecto a la PTP de tipo silvestre, pero conservan la capacidad de unirse a uno o más sustratos fosforilados en tirosina de la PTP de tipo silvestre.

Los métodos de la presente invención se ejemplifican específicamente en este documento con respecto a las fosfatasas PTP1B y PTP-PEST; sin embargo, se entiende que la invención no se limita a estas PTP específicas, sino que es aplicable a todos los miembros de la familia PTP. Para identificar posibles sustratos de PTP1B y PTB-PEST, se generaron formas mutantes (es decir, alteradas o de captura de sustrato) de PTP1B y PTP-PEST que estaban catalíticamente atenuadas pero conservaban su capacidad de unirse a sustratos. Estas PTP mutantes se asociaron en complejos estables con proteínas que se identificaron por inmunotransferencia como p210 bcr:abl y p130^{cas}, respectivamente. Estas asociaciones se observaron en lisados de varias líneas celulares y en células COS transfectadas, indicando que p210 bcr:abl y p130^{cas} representan sustratos importantes y fisiológicamente relevantes para PTP1B y PTP-PEST.

Estos resultados demuestran por primera vez la existencia de PTP que tienen una especificidad por el sustrato intrínsecamente restringida in vivo. Los métodos usados para identificar p210 bcr:abl y p130^{cas} como sustratos específicos para PTP1B y PTP-PEST, respectivamente, se pueden aplicar generalmente a cualquier miembro de la familia PTP, de la cual se han presentado aproximadamente 500 miembros, y pueden usarse para determinar los sustratos fisiológicos de otros miembros de la familia PTP.

Una realización de la invención se refiere a nuevas PTP mutantes en las que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima pero que tiene como resultado una reducción en el valor de Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}). Estas PTP retienen la capacidad de formar un complejo con, o de unirse a sus sustratos fosforilados en tirosina, pero están catalíticamente atenuadas. En una realización, la invención se refiere a la fosfatasa PTP1B en la que el resto de aspartato constante en la posición 181 se ha reemplazado por alanina (D181A). En otra realización, la invención se refiere a la fosfatasa PTP-PEST en la que el resto de aspartato constante en la posición 199 se ha reemplazado por una alanina (D199A). Otra realización de la invención se refiere a una fosfatasa PTP-PEST en la que el resto de cisteína en la posición 231 se ha reemplazado por una serina (C231S). La invención también se refiere a otras PTP mutantes o de captura de sustrato en las que el resto de aspartato constante se ha reemplazado o se ha cambiado por otro resto aminoacídico, tal como alanina. El resto de aspartato constante puede identificarse en otras PTP alineando la secuencia de nucleótidos de PTP con la secuencia de nucleótidos de una PTP para la que se conoce la localización del resto de aspartato constante.

La invención también se refiere a un método para identificar un sustrato fosforilado en tirosina de una proteína tirosina fosfatasa. De acuerdo con una realización de la presente invención, una proteína fosforilada en tirosina de interés se combina con una o más PTP en las que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima, pero que ocasiona una reducción en el valor de Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}), y se determina la presencia o ausencia del complejo entre la proteína y la PTP. La presencia de un complejo en la combinación indica que la proteína fosforilada en tirosina es un sustrato de la PTP. El mutante PTP DA se une o forma complejos con su sustrato, pero no lo desfosforila (o lo hace muy lentamente), permitiendo de esta manera observar el complejo y, opcionalmente, su aislamiento e identificación. En una realización particular de la invención, el aspartato constante se reemplaza por un resto de alanina (una mutación o alteración PTP DA).

En una realización alternativa de la presente invención, una PTP de interés en la que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima pero que ocasiona una reducción de la Kcat a menos 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}), se combina con una o más proteínas fosforiladas en tirosina, y se determina la presencia o ausencia del complejo entre la proteína o proteínas y la PTP. La presencia de un complejo en la combinación indica que la proteína fosforilada en tirosina es un sustrato de la PTP. El mutante PTP DA se une o forma complejos con su sustrato, pero no lo desfosforila (o lo hace muy lentamente), permitiendo de esta manera la observación del complejo y, opcionalmente, su aislamiento e identificación. En una realización de la invención, el resto de aspartato constante se reemplaza por un resto de alanina (una mutación o alteración PTP DA).

La presente invención también se refiere a un método para identificar un sustrato fosforilado en tirosina de una proteína tirosina fosfatasa, donde más de una proteína fosforilada en tirosina de interés se combina con más de una PTP de interés en la que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima pero que ocasiona una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}) (por ejemplo, el aspartato constante se reemplaza por un resto de alanina). Los complejos formados en la combinación pueden aislarse y pueden identificarse el componente PTP y el sustrato.

La invención también se refiere a un método para reducir la actividad de una proteína fosforilada en tirosina, que comprende administrar a un mamífero una PTP en la que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima pero que ocasiona una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}) (por ejemplo, el aspartato constante se reemplaza por un resto de alanina) y que forma un complejo con la proteína fosforilada en tirosina. El mutante de PTP se une a la proteína fosforilada sin desfosforilarla, inhibiendo de esta manera la actividad de la proteína y reduciendo sus efectos corriente abajo.

Por ejemplo, la invención se refiere a un método para reducir los efectos de transformación de oncogenes asociados con p130^{cas}, un sustrato de PTP-PEST, que comprende administrar a un mamífero PTP-PEST de tipo silvestre o PTP-PEST en la que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un resto de alanina. La PTP-PEST de tipo silvestre se une y desfosforila p130^{cas}, regulando de esta manera de forma negativa sus efectos corriente abajo. Los mutantes DA de PTP-PEST se unen pero no desfosforilan p130^{cas} (o la desfosforilan a una velocidad reducida); de esta manera el sustrato se une en el complejo con la forma de captura de sustrato de PTP-PEST y no puede ejerce sus efectos corriente abajo. De manera similar, la invención se refiere a un método para reducir la formación de complejos de señalización asociados con p130^{cas}, particularmente los complejos de señalización que inducen rutas mitogénicas, que comprende administrar a un mamífero PTP-PEST de tipo silvestre o PTP-PEST donde el restos de aspartato constante se ha reemplazado por un resto de alanina.

La presente invención también se refiere a ensayos para identificar agentes que alteran, por ejemplo, potencian o inhiben, la interacción entre una PTP y su sustrato fosforilado. Los agentes identificados por estos ensayos pueden ser agonistas (por ejemplo, agentes que potencian o aumentan la actividad de la PTP) o antagonistas (por ejemplo, agentes que inhiben o reducen la actividad de la PTP) de la actividad PTP. El agente puede ser una sustancia fisiológica endógena o puede ser un fármaco natural o sintético, incluyendo moléculas orgánicas pequeñas.

Por ejemplo, el sustrato fosforilado en tirosina de una PTP puede identificarse por los métodos descritos en este documento. Puede realizarse un ensayo de la actividad enzimática que utiliza la PTP de tipo silvestre en presencia de un agente a ensayar, y la cantidad resultante de actividad enzimática puede compararse con la cantidad de actividad enzimática en ausencia del agente a ensayar. Una reducción en la actividad enzimática en presencia del agente a ensayar indica que el agente inhibe la interacción entre la PTP y su sustrato. Por el contrario, un aumento en la actividad enzimática en presencia del agente a ensayar indica que el agente potencia la interacción entre la PTP y su sustrato.

Como alternativa, puede realizarse un ensayo de unión competitiva utilizando el mutante de PTP en presencia de un agente a ensayar, y el grado resultante de unión del mutante de PTP con su sustrato puede compararse con el grado de unión en ausencia del agente a ensayar. Una reducción en el grado de unión en presencia del agente a ensayar indica que el agente inhibe la interacción entre la PTP y su sustrato. Por el contrario, un aumento en el grado de unión en presencia del agente a ensayar indica que el agente potencia la interacción entre la PTP y su sustrato.

De esta manera, las composiciones y métodos descritos en este documento son útiles para identificar los sustratos fosforilados en tirosina de miembros de la familia PTP de fosfatasas, así como para regular la actividad de los sustratos identificados. Las composiciones y métodos descritos en este documento también son útiles para identificar proteínas fosforiladas en tirosina que están relacionadas con una enfermedad o trastorno particular, y se proporcionan métodos de selección de moduladores que potencien o inhiban la interacción PTP/sustrato para uso en aplicaciones terapéuticas.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1E muestran un alineamiento múltiple de secuencias de los dominios catalíticos de PTP (SEC ID Nº 1-35). Las PTP eucariotas citosólicas y el dominio 1 de RPTP se combinan en un grupo, los dominios 2 de RPTP están en un segundo grupo y la PTP de Yersinia está en un tercer grupo. En minúsculas se muestran los restos constantes compartidos por los tres grupos. Los restos constantes y muy conservados dentro de un grupo se muestran en cursiva y en negrita, respectivamente. Dentro de la secuencia de PTP de Yersinia, los restos que son constantes o están muy conservados entre la secuencia citosólica y la secuencia del dominio de RPTP se muestran en cursiva y en negrita, respectivamente. La posición de los restos de PTP1B que interaccionan con el péptido se indican con una punta de flecha pequeña, y la numeración de restos en la parte inferior del alineamiento corresponde a la de PTP1B.

La Figura 2 muestra los valores de Vmax y Km de diversos mutantes de PTP1B hacia RCML.

Descripción detallada de la invención

La familia de enzimas PTP contiene un segmento común conservado evolutivamente de aproximadamente 250 aminoácidos conocido como dominio catalítico de PTP. Dentro de este dominio conservado hay un solo motivo de secuencia característico, [I/V] HCXAGXXR[S/T]G (SEC ID Nº 36), que es constante entre todas la PTP. El resto de cisteína en este motivo es constante en miembros de la familia y se sabe que es esencial para la catálisis. Funciona como un nucleófilo para atacar el resto fosfato del sustrato entrante. Si el resto de cisterna se ha alterado por mutagénesis de localización dirigida y se ha cambiado por una serina (mutantes CS) o alanina (mutantes CA), la PTP resultante está atenuada catalíticamente pero conserva su capacidad de formar complejos o de unirse a su sustrato, al menos in vitro. Estos resultados se han confirmado en relación con la MKP-1, un miembro de la familia PTP (Sun et al., Cell 75: 487-493 (1993)), así como con otras PTP. Sin embargo, aunque en general estos mutantes CS pueden unirse de forma eficaz a fosfotirosil sustratos in vitro, en muchos casos estos complejos no pueden aislarse in vivo. De esta manera, los mutantes CS están limitados en su aplicabilidad y no pueden usarse para aislar todas las combinaciones de PTP y sustratos.

Recientemente se han determinado las estructuras cristalinas de PTP1B sola (Barford, et al., Science 263: 1397-1404 (1994)) y en un complejo con un péptido que contiene fosfotirosina (Jia et al., Science 268: 1754-1758 (1995)). Estas estructuras indicaban veintisiete restos constantes (Barford et al., 1994), de los cuales uno es un resto de aspartato. Este resto de aspartato es constante a lo largo de los dominios catalíticos de los miembros de la familia PTP. Es decir, si las secuencias de aminoácidos de los miembros de la familia PTP están alineadas, el resto de aspartato está presente en todas las PTP en una localización correspondiente, aunque los números de posición pueden ser diferentes debido a los cambios requeridos para maximizar el alineamiento (véase en la Figura (de Barford et al., Nature Struc. Biol. 2: 1043-1053 (1995)) un alineamiento de diversas secuencias de PTP). Las secuencias para las que aún no se ha publicado el alineamiento pueden alinearse fácilmente con otras secuencias de PTP conocidas, por ejemplo, utilizando un software informático disponible tal como GENEWORKS.

De esta manera, pueden obtenerse fácilmente PTP mutantes distintas de las descritas específicamente en este documento alineando la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de PTP con las descritas en este documento, identificando el resto de aspartato constante y cambiando el resto por mutagénesis de localización dirigida. Aunque los ejemplos específicos de mutantes de PTP descritos en este documento son mutantes de aspartato a alanina (mutantes DA), se entiende que la invención no se limita a cambios de aspartato por alanina. El resto de aspartato constante puede cambiarse, por ejemplo, por mutagénesis de localización dirigida, por cualquier aminoácido que no produzca una alteración significativa de la Km de la enzima pero que ocasione una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}). Por ejemplo, el resto de aspartato constante puede cambiarse o mutarse por una alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, lisina, arginina o histidina.

Como se describe en este documento, se usaron células tratadas con pervanadato como una fuente abundante de proteínas fosforiladas en tirosina para investigar la especificidad por el sustrato de PTP-PEST. PTP-PEST es una PTP citosólica de 88 kDa (Charest et al., Biochem. J. 308: 425-432 (1995); den Hertog et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 184: 1241-1249 (1992); Takekawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 1223-1230 (1992); Yang et al., J. Biol. Chem. 268: 6622-6628 (1993); Yang et at., J. Biol. Chem. 268: 17650 (1993)) que se expresa de forma ubicua en los tejidos de mamífero (Yi et al., Blood 78: 2222-2228 (1991)) y que presenta una alta actividad específica cuando se ensaya in vitro usando sustratos fosforilados en tirosina artificiales (Garton y Tonks, EMBO J. 13: 3763-3771 (1994)). Previamente se ha demostrado que PTP-PEST está sometida a una regulación por la fosforilación de Ser39 in vitro e in vivo. Esta modificación se cataliza tanto por la proteína quinasa C (PKC) como por la proteína quinasa (PKA) y tiene como resultado una reducción de la actividad enzimática como consecuencia de un aumento en la Km de la reacción de desfosforilación (Garton y Tonks, EMBO J. 13: 3763-3771 (1994)). Parece probable que exista un mecanismo regulador adicional para PTP-PEST, ya que sería de esperar que esta enzima ejerciera una influencia negativa considerable sobre el estado de fosforilación de tirosina de sustratos citosólicos de tirosina quinasas. Una posibilidad es que esta influencia pueda limitarse por la especificidad por el sustrato de PTP-PEST.

La especificidad por el sustrato de PTP1B se investigó utilizando los mismos métodos indicados para PTP-PEST, con la excepción de que las células no se trataron con pervanadato. Se usó una combinación de experimentos de desfosforilación in vitro y experimentos de captura de sustrato para estudiar las interacciones de sustratos de PTP1B y PTP-PEST. Los métodos de captura de sustrato indicados en este documento se pueden aplicar en general a cualquier PTP gracias a su resto de aspartato constante compartido, y por lo tanto debe resultar útil para delinear la preferencia de sustrato de otros miembros de la familia PTP. En particular, el uso de PTP mutantes impedidas catalíticamente para capturar, y de esta manera aislar, posibles sustratos facilitará en gran medida la identificación de sustratos fisiológicamente importantes para PTP individuales, mejorando la comprensión de los papales de estas enzimas en la regulación de procesos celulares.

Una realización de la invención se refiere a nuevas PTP en las que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima, pero que ocasiona una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}). Estas PTP conservan la capacidad de formar un complejo con, o de unirse a sus sustratos fosforilados en tirosina, pero están catalíticamente atenuadas. Como se define en este documento, se entiende que la actividad "atenuada" significa que la fosfatasa conserva una Km similar a la de la fosfatasa de tipo silvestre, pero tiene un valor de Vmax que está reducido en un factor de al menos 10^{4} con respecto a la enzima de tipo silvestre. Esto incluye la actividad catalítica que se ha reducido o anulado con respecto a la PTP de tipo silvestre. Por ejemplo, el resto de aspartato constante puede cambiarse o mutarse a una alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, lisina, arginina o histidina.

Las nuevas PTP descritas en este documento, en las que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima pero que ocasiona una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}), también pueden comprender otras mutaciones, particularmente las que ayudan a estabilizar el complejo PTP/sustrato. Por ejemplo, una mutación del resto [serina/treonina] en el motivo característico por un resto de alanina cambia la etapa determinante de la velocidad de la reacción de desfosforilación desde la formación del estado de transición hasta la descomposición del estado de transición, estabilizando de esta manera el complejo PTP/sustrato. Estas mutaciones pueden combinarse de forma valiosa con el reemplazo del resto de aspartato constante, particularmente ayudando a estabilizar el complejo y facilitando la observación y aislamiento del complejo.

Las PTP adecuadas para uso en la invención incluyen cualquier PTP que tenga un resto de aspartato constante en una posición correspondiente. Como se define en este documento, una fosfatasa es un miembro de la familia PTP si contiene el motivo característico [I/V] HCXAGXXR[S/T]G (SEC ID Nº 36). También son adecuadas para uso en la invención PTP de especificidad doble, es decir, PTP que desfosforilan tanto la tirosina fosforilada como la serina o treonina fosforiladas. Las PTP apropiadas incluyen, pero sin limitación, PTP1B, PTP-PEST, PTP_{\gamma}, MKP-1, DEP-1, PTP_{\mu}, PTPX1, PTPX10 y PTPH1.

En una realización, la invención se refiere a la fosfatasa PTP1B en la que el resto de aspartato en la posición 181 se ha reemplazado por alanina (D181A). En otra realización, la invención se refiere a la fosfatasa PTP-PEST en la que el resto de aspartato constante en la posición 199 se ha reemplazado por una alanina (D199A). Otra realización de la invención se refiere a una fosfatasa PTP-PEST en la que el resto de cisteína en la posición 231 se ha reemplazado por una serina (C231S).

La invención también se refiere a un método para identificar una proteína fosforilada en tirosina que es un sustrato de una proteína tirosina fosfatasa particular. De acuerdo con una realización de la presente invención, una proteína fosforilada en tirosina de interés se combina con al menos una PTP en la que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima pero que ocasiona una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}) (por ejemplo, un resto de alanina), y se determina la presencia o ausencia del complejo entre la proteína y la PTP. La presencia de un complejo en la combinación indica que la proteína fosforilada en tirosina es un sustrato de la PTP. El mutante PTP DA (mutante de captura de sustrato) se une o forma complejos con su sustrato pero no lo desfosforila (o lo hace muy lentamente), permitiendo de esta manera el aislamiento e identificación del complejo.

El complejo proteína fosforilada/PTP puede aislarse por técnicas de aislamiento convencionales como las descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 5.352.660 de Pawson, incluyendo desplazamiento salino, cromatografía, electroforesis, filtración en gel, fraccionamiento, absorción, electroforesis en gel de poliacrilamida, aglutinación o combinaciones de las mismas. Además, para facilitar la determinación de la presencia del complejo proteína/PTP, pueden usarse anticuerpos contra la PTP o la proteína fosforilada, así como PTP marcadas y/o sustratos fosforilados marcados. La PTP o la proteína fosforilada puede marcarse con diversas enzimas, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen, pero sin limitación, peroxidasa de rábano picante, biotina, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa y acetilcolinesterasa. Los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen, pero sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina.

Los materiales luminiscentes apropiados incluyen luminol y los materiales radiactivos adecuados incluyen fósforo radiactivo ^{32}P, yodo I^{125}, I^{131} o tritio.

Como alternativa, la invención se refiere a un método para identificar una proteína fosforilada en tirosina que es un sustrato de una PTP, que comprende combinar una PTP de interés en la que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima pero que ocasiona una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}) (por ejemplo, un resto de alanina), con al menos una proteína fosforilada en tirosina, produciendo de esta manera una combinación; y determinar la presencia o ausencia de un complejo en la combinación, donde la presencia de un complejo en la combinación entre una proteína fosforilada en tirosina y la PTP indica que la proteína fosforilada en tirosina es un sustrato de la PTP.

Las PTP de captura de sustrato de la presente invención también pueden usarse en lugar de las PTP de tipo silvestre para seleccionar en bibliotecas de fosfotirosil péptidos los péptidos que se unen a la PTP como se describe en Songyang et al., (Nature 373: 536-539 (1995); Cell 72: 767-778 (1993)). Los péptidos identificados a partir de tales bibliotecas peptídicas pueden evaluarse para determinar si las proteínas fosforiladas en tirosina que contienen estos péptidos existen de forma natural.

Cualquier proteína fosforilada en tirosina es adecuada como posible sustrato en la presente invención. Las proteínas fosforiladas en tirosina son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos específicos de sustratos apropiados incluyen, sin limitación, p130^{cas}, el receptor de EGF, p210 bcr:abl, MAP quinasa y el receptor de la insulina. Tienen un interés particular proteínas fosforiladas en tirosina que se han implicado en una enfermedad o trastorno de mamífero.

La invención también se refiere a un método para reducir la actividad de una proteína fosforilada en tirosina, que comprende administrar a un mamífero una PTP en la que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima, pero que ocasiona una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}) (por ejemplo, un resto de alanina) y que forma un complejo con la proteína fosforilada en tirosina. El mutante PTP DA se une a la proteína fosforilada sin desfosforilarla (o causando una desfosforilación a una velocidad muy reducida), inhibiendo de esta manera la actividad de la proteína y reduciendo sus efectos corriente abajo. Como se usa en este documento, "reducción" incluye tanto la reducción como la anulación completa, por ejemplo, de una o más actividades o funciones de la proteína fosforilada.

Por ejemplo, la invención se refiere a un método para reducir los efectos de transformación de oncogenes asociados con p130^{sac}, un sustrato de PTP-PEST, que comprende administrar a un mamífero PTP-PEST de tipo silvestre o PTP-PEST donde el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un resto de alanina. La PTP-PEST de tipo silvestre se une y desfosforila p130^{cas}, regulando de esta manera de forma negativa sus efectos corriente abajo. Los mutantes DA de PTP-PEST se unen pero no desfosforilan p130^{cas} (o lo hacen a una velocidad muy reducida); de esta manera el sustrato se une en el complejo con la forma de captura de sustrato de PTP-PEST y no puede ejercer sus efectos corriente abajo. De manera similar, la invención se refiere a un método para reducir la formación de complejos de señalización asociados con p130^{cas}, particularmente los complejos de señalización que inducen rutas mitogénicas, que comprende administrar a un mamífero PTP-PEST de tipo silvestre o PTP-PEST donde el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un resto de alanina. La PTP se une y/o desfosforila p130^{cas}, regulando de esta manera de forma negativa los efectos corriente abajo de p130^{cas} y reduciendo la formación de complejos de señalización asociados con p130^{cas}.

Las PTP mutantes de captura de sustrato de la presente invención pueden usarse prácticamente en cualquier aplicación en lugar o además de la PTP de tipo silvestre correspondiente. Las ventajas de esta utilidad se basan en la capacidad de la PTP mutante de imitar la función de la enzima de tipo silvestre, por ejemplo, reducir la actividad de su sustrato fosforilado en tirosina, sin inducir los efectos citotóxicos perjudiciales observados comúnmente con la administración o sobreexpresión de la PTP de tipo silvestre. De esta manera, la invención también se refiere a un método para reducir los efectos citotóxicos asociados con la administración o sobreexpresión de PTP de tipo silvestre. Por ejemplo, se ha demostrado que los mutantes CS de MKP-1 tienen el mismo efecto funcional que la MKP-1 de tipo silvestre sin la inducción de efectos secundarios potencialmente perjudiciales. De esta manera, las PTP descritas en este documento, en las que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alternación significativa de la Km de la enzima pero que ocasiona una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos 1 min^{-1}) (por ejemplo, un resto de alanina), pueden usarse en muchas aplicaciones en lugar de la enzima de tipo silvestre correspondiente. Como se usa en este documento, una enzima "correspondiente" es una que es igual que la PTP mutante (por ejemplo, PTP-PEST y PTP-PEST D199A) o una que es diferente de la PTP mutante pero reconoce el mismo sustrato que la PTP mutante.

Las PTP mutantes descritas en este documento también pueden usarse terapéuticamente para reducir la actividad de una proteína fosforilada en tirosina, tal como por medio un método de terapia génica en el que la PTP mutante descrita en este documento, o una parte funcional de la misma que retiene la capacidad de unirse a su sustrato fosforilado en tirosina, se introduce en un sujeto en el cual se expresa la PTP mutante. La PTP mutante reemplaza, parcial o totalmente, la enzima de tipo silvestre que se produce normalmente o compite con la PTP de tipo silvestre por la unión al sustrato. Por ejemplo, puede identificarse una proteína fosforilada en tirosina específica que esté implicada en una enfermedad o trastorno particular (tal como una proteína tirosina quinasa). Por los métodos descritos en este documento puede identificarse al menos una PTP que actúa desfosforilando la proteína fosforilada en tirosina seleccionada de la presente invención. El tipo silvestre o la forma mutante de la PTP puede administrarse a un sujeto que necesite tratamiento para ligarse o unirse al sustrato fosforilado en tirosina, inhibiendo o reduciendo de esta manera la función de la proteína fosforilada. En una realización preferida, la PTP mutante se administra en lugar de la enzima de tipo silvestre para reducir los efectos citotóxicos asociados con la sobreexpresión de la enzima de tipo silvestre. En la técnica se conocen procedimientos para terapia génica (véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.399.346 de Anderson et al.) y pueden modificarse por métodos conocidos en la técnica para expresar de manera apropiada las PTP mutantes específicas y de tipo silvestre de la presente invención.

Por ejemplo, el sustrato fosforilado en tirosina de una PTP puede identificarse por los métodos descritos en este documento. Puede realizarse un ensayo de la actividad enzimática que utiliza la PTP de tipo silvestre en presencia de un agente a ensayar, y la cantidad resultante de actividad enzimática puede compararse con la cantidad de actividad enzimática en ausencia del agente a ensayar. En la técnica se conocen ensayos de la actividad enzimática; por ejemplo, se describen ensayos de la actividad PTP usando un sustrato marcado con ^{32}P y fosforilado en tirosina en Flint et al. (EMBO J. 12: 1937-1946 (1993)). Una reducción en la actividad enzimática en presencia del agente a ensayar indica que el agente inhibe la interacción entre la PTP y su sustrato. Por el contrario, un aumento en la actividad enzimática en presencia del agente a ensayar indica que el agente potencia la interacción entre la PTP y su sustrato.

Como alternativa, puede realizarse un ensayo de unión competitiva utilizando la PTP mutante en presencia de un agente a ensayar, y el grado resultante de unión de la PTP mutante a su sustrato puede compararse con el grado de unión en ausencia del agente a ensayar. En la técnica se conocen ensayos de unión competitiva; por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.352.660 de Pawson describe métodos adecuados para uso en esta invención. Una reducción en el grado de unión en presencia del agente a ensayar indica que el agente inhibe la interacción entre la PTP y su sustrato. Por el contrario, un aumento en el grado de unión en presencia del agente a ensayar indica que el agente aumenta la interacción entre la PTP y su sustrato.

De acuerdo con la presente invención, en este documento pueden usarse péptidos fosforilados en tirosina identificados con PTP mutantes a partir de bibliotecas peptídicas por los métodos de Songyang et al. (Nature 373: 536-539 (1995); Cell 72: 767-778 (1993)) en lugar de la proteína fosforilada en tirosina completa en ensayos de unión competitiva.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una PTP en la que el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que no produce una alteración significativa de la Km de la enzima pero que ocasiona una reducción en la Kcat a menos de 1 por minuto (menos de 1 min^{-1}) (por ejemplo, un resto de alanina). Por ejemplo, la PTP de la presente invención puede formularse con un medio fisiológicamente aceptable para preparar una composición farmacéutica. El medio fisiológico particular puede incluir, pero sin limitación, agua, solución salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y soluciones de dextrosa. La concentración óptima del ingrediente o ingredientes activos en el medio elegido puede determinarse empíricamente, de acuerdo con procedimientos bien conocidos por los especialistas en química medicinal, y dependerá de la formulación farmacéutica final deseada. Los métodos de introducción de PTP exógenas en el sitio de tratamiento incluyen, pero sin limitación, la vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral e intranasal. Otros métodos de introducción adecuados también pueden incluir dispositivos recargables o biodegradables y dispositivos poliméricos de liberación lenta. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden administrarse como parte de una terapia combinatoria con otros agentes.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar la presente invención y no deben considerarse limitantes del alcance de esta invención. Las enseñanzas de todas las referencias citadas en este documento se incorporan como referencia en su totalidad.

Ejemplos Materiales y Métodos

A continuación se proporciona una descripción de los materiales y métodos usados en el trabajo descrito en este documento.

Generación, Expresión y Purificación de Proteínas PTP Mutantes

Se produjeron mutaciones puntuales dentro de los dominios catalíticos de PTP-PEST (D199A, C231S) y PTP1B (D181A, C215S) por mutagénesis de localización dirigida usando el kit de mutagénesis in vitro Muta-Gene^{TM} (Bio-Rad, Richmond, CA). Después se cambiaron regiones que contenían la mutación puntual requerida por las secuencias de tipo silvestre dentro de vectores de expresión apropiados, y las regiones mutantes reemplazadas se secuenciaron en su totalidad para verificar la ausencia de mutaciones adicionales.

Se expresaron proteínas PTP-PEST de longitud completa (proteínas de tipo silvestre y mutantes, que contenían mutaciones de Asp199 a Ala o Cys231 a Ser) y el dominio catalítico de PTP-PEST de tipo silvestre (aminoácidos 1-305) en células Sf9 usando baculovirus recombinante (BaculoGold^{TM}, Pharmingen, San Diego, CA) y se purificaron como se describe en Garton y Tonks (EMBO J. 13: 3763-3771 (1994)). También se expresaron formas truncadas de las proteínas PTP-PEST de tipo silvestre y mutante, que comprendían los restos aminoacídicos 1-305 de PTP-PEST en E. coli como proteínas de fusión con GST después de la subclonación del ADN de PTP-PEST en fase cadena abajo de GST en vectores pGEX (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, Suecia). Veinticinco ml de células E. coli transformadas con el vector apropiado se dejaron crecer hasta la fase logarítmica (DO_{600} aproximadamente 0,5). Después se indujo la expresión de la proteína de fusión por la adición de isopropil-1-tio-b-D-galactopiranósido 0,2 mM, y las células se cultivaron durante 2-4 horas a 30ºC. Las células se recogieron por centrifugación, se incubaron con 50 mg/ml de lisozima en 3 ml de tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 1 mM, 5 mg/ml de leupeptina, 5 mg/ml de aprotinina, Triton X-100 al 0,1% y NaCl 150 mM, y después se lisaron por sonicación (3 x 10 s). Después de retirar el material insoluble por centrifugación (20 minutos a 300.000 x g), las proteínas de fusión se aislaron por incubación durante 30 min a 4ºC con 100 ml de perlas de glutatión-Sepharose (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, Suecia), y las perlas después se recogieron por centrifugación y se lavaron tres veces con tampón A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM, benzamidina 1 mM, 1 mg/ml de leupeptina, 1 mg/ml de aprotinina, glicerol al 10%, Triton X-100 al 1% y NaCl 100 mM). Este procedimiento produjo una proteína de fusión esencialmente homogénea a una concentración de 1 mg de proteína/ml de perlas de glutatión-Sepharose. Se expresaron proteínas PTP1B (tipo silvestre y formas mutantes) que comprendían los aminoácidos 1-321 en E. coli y se purificaron hasta la homogeneidad como se describe en Barford et al. (J. Mol. Biol. 239: 726-730 (1994)).

Cultivo Celular, Transfección, Preparación de Lisados y Fraccionamiento

Se cultivaron células HeLa y COS en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 5%; se cultivaron células Wi38, C2C12 y MvLu en DMEM que contenía FBS al 10%; se cultivaron células 293 en DMEM que contenía suero bovino al 10%; se cultivaron células MCF10A en DMEM al 50%, F-12 de Ham al 50% que contenía suero de caballo al 5%, 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, 10 mg/ml de insulina, 0,5 mg/ml de hidrocortisona y 0,25 mg/ml de fungizona. Todos los medios también contenían penicilina y estreptomicina a 100 U/ml y 100 mg/ml respectivamente, y todas las células se cultivaron a 37ºC. Se usó transfección mediada por fosfato cálcico para introducir ADNc que codificaba las proteínas PTP-PEST de tipo silvestre y mutante en células COS. Estas proteínas se codificaban por ADNc de PTP-PEST subclonado en el plásmido PMT2, a partir del cual se dirigió la expresión por un promotor tardío principal de adenovirus; se usaron 20 mg de ADN para la transfección de cada placa de 10 cm de células. El nivel de expresión de las construcciones PTP-PEST fue similar en todos los casos.

Antes de la lisis de las células, se trataron cultivos de células con una confluencia de 70-90% durante 30 minutos con pervanadato 0,1 mM (20 ml de una solución reciente que contenía metavanadato sódico (NaVO_{3}) 50 mM y H_{2}O_{2} 50 mM a 10 ml de medio). El tratamiento de las células con H_{2}O_{2} y vanadato conduce a un aumento sinérgico en los niveles de fosfotirosina, supuestamente debido a la inhibición de las PTP intracelulares por vanadato. Previamente se ha sugerido que la sinergia entre H_{2}O_{2} y vanadato se debe a la mejor acumulación del vanadato oxidado resultante (pervanadato) dentro de las células en comparación con el propio vanadato (Heffetz et al., J. Biol. Chem. 265: 2896-2902 (1990)). Es importante indicar que durante la preparación de los lisados celulares, se produce dilución de tal forma que se pierde el efecto inhibidor del vanadato sobre la acción de la PTP. El tratamiento con pervanadato ocasionó la aparición de al menos 50 bandas proteicas de fosfotirosina prominentes en todos los tipos celulares, mientras que las células no tratadas contenían niveles prácticamente indetectables de fosfotirosina (datos no mostrados).

Las células se lisaron en tampón A que contenía ácido yodoacético 5 mM, que se incluyó para inhibir irreversiblemente las PTP celulares. Después de la incubación a 4ºC durante 30 minutos, se añadió DTT 10 mM para inactivar todo el ácido yodoacético que no había reaccionado. El material insoluble después se retiró por centrifugación durante 20 minutos a 300.000 x g. Los lisados resultantes fueron estables con respecto a su contenido de fosfotirosina durante el almacenamiento a largo plazo (durante varios meses) a -70ºC y durante una incubación prolongada (de al menos 20 horas) a 4ºC, en ausencia de PTP exógenas añadidas.

El lisado de células HeLa tratado con pervanadato se fraccionó por cromatografía de intercambio aniónico usando una columna de FPLC Mono Q (Pharmacia). La muestra (50 mg de proteína total a 3 mg/ml en tampón A) se diluyó en tres volúmenes de tampón B (tris-HCl 20 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, benzamidina 1 mM, 1 mg/ml de leupeptina, 1 mg/ml de aprotinina y Triton X-100 al 0,1%) antes de la carga. Las proteínas se eluyeron a un caudal de 1 ml/min con un gradiente lineal de NaCl 0-0,5 M en tampón B en 20 fracciones (volumen de la fracción 1 ml), seguido de un segundo gradiente de NaCl 0,5-1,0 M en tampón B durante 5 fracciones. Se detectaron proteínas que contenían fosfotirosina dentro de las fracciones 7-21 de acuerdo con la inmunotransferencia anti-fosfotirosina. Se siguieron los mismos procedimientos para PTP1B, con la excepción de que las células no se trataron con pervanadato.

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Reacciones de Desfosforilación

Se incubaron en hielo lisados de células HeLa tratadas con pervanadato (1-2 mg de proteína/ml) que contenían proteínas fosforiladas en tirosina en ausencia o presencia de PTP activas purificadas a una concentración de 2 nM. La desfosforilación se terminó por la eliminación de alícuotas (30 mg de proteína) en un tampón de muestra de SDS-PAGE y el grado de desfosforilación se determinó por inmunotransferencia usando el anticuerpo monoclonal G104. Los ensayos de actividad PTP usando RCM-lisozima marcada con ^{32}P fosforilada en tirosina como sustrato se realizaron como se describe en Flint et al. (EMBO J. 12: 1937-1946 (1993)).

Anticuerpos e Inmunotransferencia

El anticuerpo monoclonal PTP-PEST AG25 se indujo contra PTP-PEST de longitud completa purificada y expresada en baculovirus. El anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina G104 se generó usando como antígeno fosfotirosina, alanina y glicina en una relación 1:1:1, polimerizada en presencia de hemocianina de lapa californiana con 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida, un método descrito originalmente en Kamps y Sefton (Oncogene 2: 305-315 (1988)). El anticuerpo monoclonal p130^{cas} procedía de Transduction Laboratories (Lexington, Ky). El anticuerpo monoclonal FG6 contra PTP1B se proporcionó por Dr David Hill (Calbiochem Oncogene Research Products, Cambridge, MA). La visualización de las proteínas por inmunotransferencia se consiguió aumentando la quimioluminiscencia (ECL) usando anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, II) y el sistema de sustrato CL-HRP SuperSignal^{TM} (Pierce, Rockford, II).

Inmunoprecipitación y Captura de Sustrato

La inmunoprecipitación de PTP-PEST a partir de células COS transfectadas se realizó después del acoplamiento covalente del anticuerpo monoclonal AG25 a perlas de proteína A-Sepharose (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, Suecia) usando el agente de entrecruzamiento químico pimelimidato de dimetilo (Schneider et al., J. Biol. Chem. 257: 10766-10769 (1982)). Primero se unió el anticuerpo a proteína A-Sepharose a una concentración de 1 mg/ml de volumen de perlas, y después se retiró el material no unido por tres lavados con borato sódico 0,2 M, pH 9. El acoplamiento covalente se consiguió por incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos en presencia de pimelimidato de dimetilo 20 mM en borato sódico 0,2 M, pH 9. Después, las perlas se incubaron durante 1 hora con un exceso de etanolamina 0,2 M, pH 8, para bloquear todo el agente de entrecruzamiento que no había reaccionado, y se lavaron tres veces con PBS antes del almacenamiento a 4ºC. Se usaron 10 ml de perlas AG25 para precipitar la PTP-PEST introducida por transfección de los lisados que contenían aproximadamente 0,375 mg de proteína.

La captura del sustrato se realizó usando varias matrices de afinidad de PTP. La matriz de PTP-PEST de longitud completa utilizó perlas AG25-proteína A-Sepharose acopladas covalentemente a las que se había unido proteína PTP-PEST expresada en baculovirus purificada. Se incubaron alícuotas (10 ml) de perlas AG25 durante 2 horas a 4ºC en 100 ml de tampón A en presencia de 5 mg de PTP-PEST purificada (formas de tipo silvestre o mutantes); y después se retiró la PTP-PEST no unida lavando tres veces con 1 ml de tampón A. Las perlas de PTP-PEST-AG25-proteína A-Sepharose resultantes contenían aproximadamente 2 mg de PTP-PEST por alícuota de 10 ml. La captura de sustrato también se realizó con perlas de glutatión-Sepharose unidas a proteínas de fusión de GST expresadas en bacterias que contenían el dominio catalítico de PTP-PEST.

En los experimentos de captura de sustrato también se usó PTP1B. En este caso, el anticuerpo monoclonal FG6 se preacopló a proteína A-Sepharose en ausencia de agente de entrecruzamiento (2 mg de anticuerpo/10 ml de perlas), después se añadieron proteínas PTP1B purificadas en exceso y se incubaron a 4ºC durante 2 horas. Después de retirar la PTP1B no unida, 10 ml de perlas contenían aproximadamente 2 mg de PTP1B.

Como fuente de proteínas que contenían fosfotirosina para los experimentos de captura de sustrato se usaron lisados celulares, o fracciones de columna, tratados con pervanadato. En general, se incubaron lisados que contenían 0,25-0,5 mg de proteína en 0,5 ml de tampón A (que incluía ácido yodoacético 5 mM, DTT 10 mM) a 4ºC durante 2 horas en presencia de 10 ml de matriz de afinidad que contenía aproximadamente 2 mg de la proteína PTP apropiada. Después se retiraron las proteínas no unidas de las muestras lavando tres veces con 1 ml de tampón A, y el material unido se recogió por la adición de 50 ml de tampón de muestra SDS-PAGE seguido de calentamiento a 95ºC durante 5 minutos; las proteínas unidas a las perlas después se analizaron por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia.

Resultados

A continuación se proporcionan detalles de los resultados del trabajo descrito en este documento realizado como se ha descrito anteriormente.

PTP1B y p210 bcr:abl

La leucemia mielógena crónica (CML) es un trastorno clonal de las células madre hematopoyéticas que se caracteriza por el cromosoma Philadelphia, en el que el proto-oncogén c-Abl en el cromosoma 9, que codifica una PTK, se une al gen bcr del cromosoma 22. Esto tiene como resultado la generación de una proteína de fusión bcr:able, p210 bcr:abl, en la que la actividad PTK está potenciada con respecto a la de c-Abl. Los datos actuales indican que esta anomalía citogenética es el acontecimiento causante principal y único de la CML. La expresión de p210 bcr:abl produce patrones anormales de fosforilación en tirosina que tienen como resultado la maduración aberrante de la célula madre hematopoyética que es característica de la CML.

La expresión del ARNm y de la proteína PTP1B está aumentada como consecuencia de la expresión de p210 bcr:abl en células Rat1, Mo7 y BaF3. También se observaron cambios en la actividad de PTP1B, que correspondían al cambio en la proteína enzimática. Estos cambios son específicos para PTP1B y no se ven en el homólogo muy relacionado TC-PTP (con una identidad de 65%) o en otras PTP ensayadas, incluyendo SHP-1, SHP-2 y PTP-PEST. También se observó el aumento de expresión de PTP1B en células linfoides B Ph+ procedentes de un paciente con CML con respecto a las células Ph del mismo paciente.

Los cambios en los niveles de PTP1B se indujeron específicamente por p210 bcr:abl y no se observaron en células que expresaban otras PTK incluyendo v-abl, v-src u otras oncoproteínas tales como myc. La actividad PTK de p210 bcr:abl fue esencial para el aumento en la expresión de PTB1B, ya que la expresión de una lisina inactiva a una forma mutante de arginina de p210 bcr:abl en células Rat1 no alteraba los niveles de PTP1B. El aumento de los niveles de PTP1B es una respuesta rápida a la inducción de p210 bcr:abl. Cuando se cambiaron células BaF3 que expresaban una forma mutante sensible a la temperatura de p210 bcr:abl a la temperatura permisiva para la PTK, se observó que los niveles de PTP1B aumentaban en 12-24 horas, lo cual coincidía con la aparición de la forma activa de la PTK. Estos datos indican que la alteración en los niveles de PTP1B es una respuesta relativamente rápida a la aparición de p210 bcr:abl, en lugar de una respuesta adaptativa a largo plazo de las células.

En experimentos de cotransfección transitoria en células COS, PTP1B desfosforila p210 bcr:abl pero no v-abl. Cuando el mutante PTP1B D181A se expresó como una proteína de fusión de GST, se purificó y se incubó con lisados de células Mo7-p210 (que sobreexpresa p210 bcr:abl), se aisló un complejo del mutante PTP y p210 bcr:abl. Por el contrario, c-abl fosforilada en tirosina, que también estaba presente en los lisados, no se unía a la PTP mutante. La interacción entre PTP1B D181A y p210 bcr:abl se bloqueó por vanadato, lo que sugería que la interacción estaba implicada en el sitio activo de PTP.

Después de la coexpresión transitoria en células COS, PTP1B D181A formó un complejo con p210 bcr:abl. Los datos preliminares indican que la forma mutante Y177F de p210 bcr:abl no interaccionaba con PTP1b D181A, lo que sugería que este resto de tirosina es un componente del sitio de unión en la PTK. Este resto de tirosina en p210 bcr:abl se fosforila in vivo y se ha demostrado que sirve como sitio de acoplamiento para GRB2. La interacción directa de la pTyr en p210 bcr:abl y el dominio SH2 de GRB2 es esencial para la actividad de transformación de la PTK. La interacción de PTP1B D181A con p210 bcr:abl interfiere con la asociación de la PTK con GRB2. Considerados conjuntamente, estos datos sugieren que p210 bcr:abl es un sustrato fisiológico de PTP1B y que PTP1B puede funcionar como antagonista de la oncoproteína PTK in vivo. En la Figura 2 se muestran los valores de Vmax, Km y Kcat de mutantes PTP1B de 37kDa hacia RCML.

PTP1B y el Receptor de EGF

La expresión de PTP1B D181A en células COS conduce a un aumento de la fosforilación de restos de tirosilo en una proteína de 180 kDa y en proteínas de 120 y 70 kDa. Cuando una proteína de fusión GST-PTP1B D181A se expresó en células COS y se precipitó en Glutatión-Sepharose, coprecipitaron la proteína de 180 kDa y cantidades más pequeñas de p120 y p70. La proteína p180 se identificó como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) por inmunotransferencia. La identidad de las proteínas p120 y p70 no está clara; sin embargo, esta última no es src, p62 o paxilina.

La expresión de PTP1B D181A en células COS induce la fosforilación de tirosina del receptor de EGF en ausencia de su ligando, EGF, indicando que la PTP mutante ejerce sus efectos en la célula intacta y no después de la lisis. El mutante D199A PTP-PEST equivalente no interacciona con el receptor de EGF, indicando la especificidad de esta interacción con el sustrato.

Se requiere la autofosforilación del receptor de EGF para la interacción con PTP1B D181A. Los mutantes del receptor con actividad quinasa inactiva o en los que se han delecionado los sitios de autofosforilación no interaccionan con PTP1B D181A. En células que expresan v-src, se observó una gran cantidad de proteínas fosforiladas en tirosina, pero no se detectó la fosforilación del receptor de EGF. En estas condiciones, PTP1B D181A se unía predominantemente a una proteína fosforilada en tirosina de 70 kDa.

Como resultado de este trabajo, parece ser que PTP1B puede modular las rutas de señalización inducidas por EGF, quizás incluyendo las rutas de muchas enfermedades, incluyendo el cáncer de mama.

Desfosforilación Preferente de una Proteína de 130 kDa que Contiene Fosfotirosina por PTP-PEST

Para investigar la especificidad de sustrato de PTP-PEST in vitro, se incubaron en hielo alícuotas de lisados de células HeLa tratadas con pervanadato, produciendo 50-100 proteínas que contenían fosfotirosina distintas a juzgar por la inmunotransferencia del lisado celular usando el anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina G104. Después se añadieron al lisado PTP-PEST de longitud completa purificada (expresada en células Sf9 usando baculovirus recombinante), el dominio catalítico de PTP-PEST o el dominio catalítico de PTP1B (forma de 37 kDa), y se retiraron alícuotas a diversos puntos de tiempo para el análisis por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia anti-fosfotirosina.

Sorprendentemente, una banda de fosfotirosina de 130 kDa prominente (p130) se desfosforiló selectivamente por PTP-PEST en 10 minutos, mientras que la intensidad de las demás bandas permaneció esencialmente sin cambios incluso después de 60 minutos de incubación con PTP-PEST. Las incubaciones prolongadas con mayores concentraciones de PTP-PEST (mayores de 100 veces) dieron como resultado la eliminación completa de todas las bandas de fosfotirosina del lisado. Sin embargo, en todas las condiciones ensayadas, se descubrió que p130 se desfosforilaba más rápidamente que todas las demás bandas presentes.

También se observó la desfosforilación selectiva de p130 por PTP-PEST usando una forma truncada de la fosfatasa (restos aminoacídicos 1-305) que esencialmente contiene sólo el dominio catalítico de la enzima. Este resultado sugiere que la preferencia de sustrato sorprendente presentada por PTP-PEST en este análisis es una propiedad intrínseca del dominio catalítico de la fosfatasa, mientras que los 500 restos aminoacídicos C-terminales tienen poco efecto apreciable sobre la especificidad de sustrato de la enzima.

La especificidad de la interacción entre PTP-PEST y p130 se abordó usando el dominio catalítico de PTP1B (restos aminoacídicos 1-321) en reacciones de desfosforilación. Cuando se añadió a una concentración molar similar a la usada para PTP-PEST, se descubrió que PTP1B desfosforilaba completa y rápidamente (dentro de un período de 15 minutos) la mayoría de las proteínas que contenían fosfotirosina presentes en el lisado de células HeLa tratadas con pervanadato. Además, el transcurso de tiempo de desfosforilación de p130 no fue significativamente más rápido que el de las otras bandas de fosfotirosina desfosforiladas por PTP1B. Sin embargo, debe indicarse que estos resultados de desfosforilación in vitro no son realmente ilustrativos de la especificidad por el sustrato de PTP1B in vivo por varias razones. En primer lugar, en este experimento en particular sólo se usó la subunidad catalítica aislada. Además, la especificidad por el sustrato in vivo puede ser bastante diferente debido a la distribución intracelular tanto de PTP como de los posibles sustratos. Es decir, los experimentos de desfosforilación in vitro pueden utilizar sustratos que la PTP puede desfosforilar, pero a los que no tendría acceso in vivo. El fenómeno de la diferente especificidad de sustrato que depende de los diferentes contextos fisiológicos se ilustra por una comparación de estos datos con el trabajo de PTP1B in vivo descrito anteriormente, donde PTP1B mostró especificidad sólo por tres proteínas.

Identificación de Proteína p130 que Contiene Fosfotirosina como p130^{cas} por Captura de Sustrato

Se fraccionó lisado de células HeLa tratadas con pervanadato por cromatografía de intercambio aniónico y se analizaron alícuotas de las fracciones por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina o anti-p130^{cas}. Después se incubaron alícuotas de todas las muestras analizadas con una matriz de afinidad que contenía un mutante PTP-PEST de captura de sustrato, que comprendía PTP-PEST de longitud completa donde la Asp199 se había cambiado por alanina (D199A), unido a perlas de proteína A-Sepharose/anticuerpo (AG25) acopladas covalentemente. Las proteínas asociadas con PTP-PEST después se analizaron por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina o anti-p130^{cas}.

La inmunotransferencia anti-fosfotirosina de las fracciones de columna demostró que la banda de fosfotirosina p130 eluía como un solo pico en las fracciones 11-14 (NaCl aproximadamente 0,3 M). En vista de la abundancia de p130 fosforilada en tirosina en los lisados de células HeLa, parecía probable que p130 representara una proteína de 130 kDa que contenía fosfotirosina identificada previamente. En la bibliografía se identificaron varios posibles candidatos, incluyendo la quinasa de adhesión focal p125^{FAK}, ras-GAP, gp130 y p130^{cas}. De estos candidatos, p130^{cas} se ha identificado como una banda de fosfotirosina particularmente prominente en una amplia diversidad de sistemas, incluyendo fibroblastos transformados con v-crk (Mayer y Hanafusa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2638-2642 (1990); Mayer et al., Nature 332: 272-275 (1988)) y src (Kanner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3328-3332 (1990); Reynolds et al., Mol. Cell. Biol. 9: 3951-3958 (1989)), adhesión celular mediada por integrina (Nojima et al., J. Biol. Chem. 270: 15398-15402 (1995); Petch et al., J. Cell Science 108: 1371-1379 (1995); Vuori y Ruoslahti, J. Biol. Chem. 270: 22259-22262 (1995)) y células 3T3 estimuladas con PDGF (Rankin y Rozengurt, J. Biol. Chem. 269: 704-710 (1994)).

Por lo tanto, la posibilidad de que la banda de fosfotirosina p130 corresponda a p130^{cas} se ensayó por inmunotransferencia de las fracciones de Mono Q usando un anticuerpo contra p130^{cas}. La banda de 130 kDa correspondiente a p130^{cas} eluyó en las mismas fracciones que la banda fosforilada en tirosina de p130 y presentó un peso molecular aparente similar, sugiriendo que las dos bandas podrían representar la misma proteína. Además, la p130^{cas} inmunoprecipitada a partir de estas fracciones se consideró fosforilada en restos de tirosilo.

Se generó una forma mutante de PTP-PEST (D199A) por mutagénesis de localización dirigida, y la enzima mutante se purificó después de la expresión usando baculovirus recombinante. Cuando se ensayó usando RCM-Lisozima fosforilada en tirosina como sustrato, la enzima mutante purificada presentó una actividad específica que era aproximadamente 10.000 veces menor que la de la enzima de tipo silvestre (Garton y Tonks, datos no publicados). Esta proteína purificada se unió a una matriz de afinidad que comprendía un anticuerpo monoclonal anti-PTP-PEST (AG25) acoplado covalentemente a perlas de Proteína A-Sepharose, y después se incubó con cada una de las fracciones de Mono Q. Después de 45 minutos de incubación, se recogieron por centrifugación las proteínas que se asociaban con la PTP-PEST mutante, las perlas se lavaron y se añadió tampón de muestra de SDS-PAGE. Después se analizaron las proteínas asociadas por inmunotransferencia usando el anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina G104.

Se descubrió que la proteína PTP-PEST mutante se asociaba con una sola proteína que contenía fosfotirosina, cuyo peso molecular (130 kDa) y posición de elución de Mono Q (fracciones 11-14) coincidían con las de p130^{cas}. La inmunotransferencia de las proteínas asociadas con PTP-PEST usando el anticuerpo p130^{cas} demostró que la proteína fosforilada en tirosina de 130 kDa atrapada por la PTP-PEST mutante efectivamente es p130^{cas}. Estos datos confirman adicionalmente la hipótesis de que p130^{cas} es un posible sustrato fisiológicamente relevante para PTP-PEST.

Determinación de Características Estructurales de PTP-PEST Implicadas en la Interacción Específica con p130^{cas} Fosforilada en Tirosina

La interacción entre p130^{cas} y PTP-PEST se investigó adicionalmente en experimentos de captura de sustrato usando diversas formas mutantes purificadas de PTP-PEST para precipitar proteínas a partir de lisados de células HeLa tratadas con pervanadato. Se incubaron varias matrices de afinidad con lisado de células HeLa tratadas con pervanadato y las proteínas asociadas con las perlas se analizaron por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina o anti-p130^{cas}.

Se descubrió que la fosfatasa de longitud completa de tipo silvestre no podía asociarse de manera estable con p130^{cas} fosforilada en tirosina, mientras que tanto la proteína mutante PTP-PEST (D199A) como un mutante que carecía del resto de cisteína del sitio activo (C231S) precipitaban específicamente p130^{cas} a partir del lisado. La incapacidad de la fosfatasa de tipo silvestre de precipitar p130^{cas} fosforilada en tirosina supuestamente refleja la naturaleza transitoria de la interacción normal entre PTP-PEST y p130^{cas} fosforilada en tirosina, que probablemente concluirá en cuanto p130^{cas} se desfosforile por PTP-PEST.

Como los 500 aminoácidos C-terminales de PTP-PEST contienen varias regiones ricas en prolina que se parecen a secuencias que se unen al dominio de homología src de tipo 3 (src homology-3) (SH3), parece plausible que la especificidad de la interacción entre PTP-PEST y p130^{cas} dependa en alguna medida de la asociación de estos segmentos con el dominio SH3 de p130^{cas}. Por lo tanto, la posible contribución del segmento C-terminal de PTP-TESP en la interacción específica observada de PTP-PEST con p130^{cas} se abordó en experimentos de captura de sustrato adicionales usando proteínas de fusión de GST que contenían el dominio catalítico de PTP-PEST solo, tanto en la forma de tipo silvestre como en la forma mutante (D199A). Se descubrió que el dominio catalítico mutante de PTP-PEST fusionado a GST precipitaba la banda de fosfotirosina de p130^{cas} específicamente, mientras que tanto la proteína de fusión de tipo silvestre como la GST sola no podían precipitar p130^{cas}. Por lo tanto, la interacción específica entre PTP-PEST y p130^{cas} observada en estos experimentos parece ser una propiedad intrínseca del dominio catalítico de PTP-PEST, emulando la preferencia observada del dominio catalítico de la PTP-PEST activa para la desfosforilación de p130^{cas} in vitro.

Especificidad de la Interacción entre PTP-PEST Mutante y p130^{cas} Fosforilada en Tirosina

En vista de la abundancia relativa de p130^{cas} fosforilada en tirosina en el lisado de células HeLa tratadas con pervanadato, se consideró la posibilidad de que la unión selectiva observada de proteínas mutantes inactivas PTP-PEST a p130^{cas} estuviera dirigida por el sustrato (reflejando la abundancia de este sustrato potencial con respecto a las otras proteínas que contienen fosfotirosina presentes en el lisado) en lugar de dirigido por la enzima (reflejando una preferencia de sustrato genuina de PTP-PEST); esta posibilidad se trató de dos maneras. En primer lugar, se usaron formas mutantes inactivas del dominio catalítico de PTP1B para capturar posibles sustratos para esta enzima a partir de los lisados de células HeLa tratadas con pervanadato. De nuevo, se descubrió que la fosfatasa de tipo silvestre no podía interaccionar de forma estable con ninguna proteína que contenía fosfotirosina, mientras que las variantes mutantes del dominio fosfatasa de PTP1B (que comprendían mutaciones en Cys o Asp análogas a las descritas anteriormente para PTP-PEST) se asociaban con muchas proteínas fosforiladas en tirosina. Esto fue especialmente evidente para el mutante de ácido aspártico de PTP1B (D181A), que parecía precipitar esencialmente todas las proteínas que contenían fosfotirosina a partir del lisado con una eficacia similar. Estos datos subrayan la naturaleza específica de la interacción entre PTP-PEST y p130^{cas}, que parece ser una propiedad peculiar para el dominio catalítico de PTP-PEST, en lugar de una característica compartida por todos los dominios catalíticos de PTP.

La especificidad de la interacción entre PTP-PEST y p130^{cas} se abordó adicionalmente después del tratamiento con pervanadato de varias líneas celulares diferentes (Wi38, 293, COS, MCF10A, C2C12, MvLu), produciendo una serie diferente de proteínas fosforiladas en tirosina en cada caso; los lisados resultantes se analizaron por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia anti-fosfotirosina. Se incubaron alícuotas con una matriz de afinidad con PTP-PEST (D199A) o una matriz de control, y las proteínas fosforiladas en tirosina que se asociaban con PTP-PEST se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina o anti-p130^{cas} como se ha descrito anteriormente.

En cualquier caso, la proteína PTP-PEST mutante de D199A precipitaba una sola banda de fosfotirosina ancha con un peso molecular aparente comprendido entre 120 y 150 kDa en diferentes líneas celulares, mientras que la matriz de afinidad sola no precipitaba ninguna proteína que contuviera fosfotirosina. La inmunotransferencia de los precipitados con un anticuerpo p130^{cas} reveló que la proteína precipitada a partir de todos los lisados celulares correspondía a p130^{cas}; la variación observada de peso molecular entre las diferentes líneas celulares supuestamente refleja diferencias de especie en el peso molecular de p130^{cas} o la expresión de diferentes formas unidas de forma alternativa (Sakai et al., EMBO J. 13: 3748-3756 (1994)).

La abundancia relativa de p130^{cas} fosforilada en tirosina en los precipitados de PTP-PEST parecía estar relacionada de manera general con la abundancia de proteína p130^{cas} en los lisados (datos no mostrados). Sorprendentemente, independientemente de la abundancia de p130^{cas} fosforilada en los lisados, p130^{cas} era invariablemente la única proteína que contenía fosfotirosina en los precipitados, incluso en lisados de células 293 que contenían muy poca proteína p130^{cas} pero que presentaban una amplia diversidad de otras proteínas fosforiladas en tirosina de manera abundante. De forma similar, cuando se incubaron lisados de células 293 tratadas con pervanadato (que contenían p130^{cas} fosforilada en tirosina en cantidades que son indetectables por inmunotransferencia anti-fosfotirosina del lisado) con PTP-PEST activa, no se produjo ninguna desfosforilación visible de ninguna banda de fosfotirosina (Garton y Tonks, datos no publicados). Estos resultados indican que la afinidad de PTP-PEST por p130^{cas} es sustancialmente mayor que para cualquier otro sustrato presente, y subraya adicionalmente la extraordinaria selectividad de sustrato de PTP-PEST por p130^{cas}.

Inhibición por Vanadato de la Asociación de p130^{cas} Fosforilada en Tirosina con PTP-PEST Mutante

Una observación consecuente de este trabajo fue que, a diferencia de la PTP-PEST mutante inactiva, la enzima de tipo silvestre no podía asociarse en un complejo estable con p130^{cas} fosforilada en tirosina, lo que sugería que la asociación observada está dirigida al sitio activo. Para investigar esta posibilidad, se incubó PTP-PEST mutante (D199A) con el inhibidor de PTP vanadato a diversas concentraciones antes de la adición del lisado de células HeLa tratadas con pervanadato. Después se analizó el grado de asociación de p130^{cas} con PTP-PEST. Se incubó una matriz de afinidad de PTP-PEST, que comprendía PTP-PEST (D199A) de longitud completa unida a perlas de proteína A-Sepharose/anticuerpo (AG25) acopladas covalentemente, durante 10 minutos en hielo en presencia de concentraciones variables de ortovanadato sódico. Las muestras después se incubaron con alícuotas de lisado de células HeLa tratadas con pervanadato; las proteínas asociadas se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina o anti-p130^{cas}. La actividad de PTP-PEST de tipo silvestre también se determinó en las mismas condiciones, usando RCM-lisozima marcada con ^{32}P fosforilada en tirosina como sustrato.

Se descubrió que la asociación se interrumpía de manera potente por vanadato, con una dependencia de la concentración similar a la de la inhibición por vanadato de la PTP-PEST de tipo silvestre, y observándose la interrupción completa a una concentración 10 mM de vanadato. Como la inhibición de PTP por vanadato supuestamente se debe a una interacción directa del vanadato con el resto de cisteína del sitio activo de la enzima (Denu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2493-2498 (1996)), este resultado confirma la hipótesis de que la asociación estable de la PTP-PEST mutante con p130^{cas} fosforilada en tirosina está mediada por interacciones directas entre restos del sitio activo dentro de PTP-PEST, en particular el resto de cisteína del sitio activo, y restos de fosfotirosina dentro de p130^{cas}.

Asociación de p130^{cas} Endógena con PTP-PEST Mutante Transfectada en Células COS

El trabajo descrito anteriormente sugiere claramente que p130^{cas} representa un sustrato potencial fisiológicamente significativo para PTP-PEST. Para evaluar si PTP-PEST interacciona con p130^{cas} en células intactas, se transfectaron células COS con plásmidos que codificaban el tipo silvestre o formas mutantes de PTP-PEST (D199A o C215S). Las células se trataron con pervanadato 30 minutos antes de la lisis, las proteínas PTP-PEST se inmunoprecipitaron y las proteínas fosforiladas en tirosina asociadas se analizaron por inmunotransferencia anti-fosfotirosina de los precipitados resultantes. Los lisados también se incubaron con perlas de proteína A-Sepharose/anti-PTP-PEST (AG25) acopladas covalentemente y las proteínas asociadas se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo anti-fosfotirosina.

En estas condiciones, la banda que contenía fosfotirosina correspondiente a p130^{cas} de nuevo era única en su capacidad de asociarse con la proteína PTP-PEST C231S, indicando que p130^{cas} puede seleccionarse específicamente por PTP-PEST como sustrato en un contexto intracelular en presencia de un gran número de sustratos posibles alternativos. Ni la forma de tipo silvestre ni la forma D199A de PTP-PEST era capaz de presentar una interacción estable con p130^{cas} fosforilada en tirosina en células COS tratadas con pervanadato.

Lo más probable es que la unión de PTP-PEST de tipo silvestre y D199A a p130^{cas} fosforilada en tirosina en estas condiciones se prohiba por la presencia de pervanadato unido al resto de cisteína del sitio activo de PTP-PEST (Denu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2493-2498 (1996)), que excluye eficazmente la unión de restos de fosfotirosina de p130^{cas}. La capacidad del mutante de PTP-PEST C231S de asociarse en un complejo estable con p130^{cas} en presencia de pervanadato sugiere que esta proteína mutante apenas se vea afectada por el pervanadato, lo que indica que el modo normal de inhibición de PTP por iones vanadato depende de forma crítica de las interacciones directas entre el vanadato y el anión tiolato del resto de cisteína del sitio activo de PTP. Por lo tanto, estas observaciones confirman adicionalmente la existencia de una interacción exclusiva entre PTP-PEST y p130^{cas} que parece estar totalmente dirigida al sitio activo, y por lo tanto refleja la preferencia de sustrato genuina, intrínseca y muy restringida de PTP-PEST por p130^{cas}.

Los resultados descritos aquí implican a p130^{cas} como un sustrato fisiológicamente relevante para PTP-PEST. Además, la rigurosidad observada y la exclusividad de la interacción entre PTP-PEST y p130^{cas} en una amplia diversidad de líneas celulares sugiere que p130^{cas} puede ser un sustrato de alta afinidad único para PTP-PEST, aunque en el momento actual no puede excluirse la posibilidad de que existan otros sustratos de PTP-PEST significativos. En particular, no está claro si las células tratadas con pervanadato presentan un espectro completo de todas las proteínas fosforiladas en tirosina posibles; de hecho, esto parece poco probable ya que el tratamiento con pervanadato supuestamente produce únicamente un aumento en la fosforilación en tirosina de proteínas que en alguna medida están fosforiladas constitutivamente, pero que normalmente se desfosforilan de forma rápida dentro de la célula. Por lo tanto, los posibles sustratos ausentes en células tratadas con pervanadato supuestamente incluyen sustratos de proteína tirosina quinasas (PTK) que normalmente están presentes en un estado inactivo, tales como PTK de receptores estimulados por ligando, y la quinasa regulada por calcio descrita recientemente PYK2 (Lev et al., Nature 376: 737-745 (1995)). Independientemente de estas consideraciones, la capacidad de PTP-PEST de seleccionar p130^{cas} exclusivamente como sustrato a partir de lisados de varias líneas celulares diferentes, que contienen una combinación total de al menos cien sustratos potenciales diferentes (muchos de los cuales supuestamente contienen múltiples sitios de fosforilación), demuestra claramente que la especificidad de sustrato de PTP-PEST está muy restringida.

Muchas PTP intracelulares están limitadas en su disponibilidad de sustrato debido a la reclusión estricta dentro de una localización subcelular particular; los ejemplos incluyen PTP1B, que está localizada en la cara citoplásmica del retículo endoplásmico (Frangioni et al., Cell 68: 545-560 (1992)) y TCPTP que es nuclear (Tillmann et al., Mol. Cell. Biol. 14: 3030-3040 (1994)) o está localizada en el retículo endoplásmico, dependiendo de la forma de empalme alternativa que se exprese (Lorenzen et al., J. Cell. Biol. 131: 631-643 (1995)). Como alternativa, ciertas PTP parecen estar muy reguladas, requiriendo la activación antes de poder demostrar una actividad apreciable. Por ejemplo, las PTP que contienen el dominio SH2, SHP1 y SHP2, presentan una actividad relativamente baja in vitro, pero pueden activarse considerablemente por varios mecanismos incluyendo el truncamiento C-terminal (Zhao et al., J. Biol. Chem. 268: 2816-2820 (1993)), la adición de ciertos fosfolípidos (Zhao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4251-4255 (1993)), o la unión mediada por el dominio SH2 de péptidos que contienen fosfotirosina apropiados (Lechleider et al., J. Biol. Chem. 268: 21478-21481 (1993)).

Sin embargo, PTP-PEST presenta una alta actividad específica in vitro (35.000 U/mg), y es una PTP predominantemente (90-95%) soluble dentro de las células (Garton y Tonks, datos no publicados); por lo tanto, en principio puede actuar de forma potente sobre cualquier sustrato accesible al citoplasma. Esta accesibilidad puede sustentar parcialmente la necesidad de que PTP-PEST posea una especificidad de sustrato limitada intrínsecamente. La demostración de que la PTP-PEST mutante puede asociarse exclusivamente con p130^{cas} en un contexto intracelular en presencia de muchas otras proteínas fosforiladas en tirosina, es una indicación de que la estrecha especificidad de sustrato de la enzima puede dar como resultado una PTP-PEST que tenga una influencia insignificante sobre el estado de fosforilación de la mayoría de las proteínas fosforiladas en tirosina dentro de la célula, aunque esos sustratos sean muy accesibles para la PTP-PEST.

El papel de p130^{cas} en la transformación celular por los oncogenes v-crk y v-src no está clara, aunque hay una correlación general entre el nivel de fosforilación en tirosina de p130^{cas} y el grado de transformación en células que expresan diferentes formas de crk o src (Kanner et al., EMBO J. 10: 1689-1698 (1991); Mayer y Hanafusa, J. Virol. 64: 3581-3589 (1990)). Además, también se ha observado una fosforilación en tirosina potenciada de p130^{cas} en células transformadas por c-Ha-ras y por la sobreexpresión de ornitina descarboxilasa (Auvinen et al., Mol. Cell. Biol. 15: 6513-6525 (1995)). La expresión de ADNc antisentido que codifica p130^{cas} en estas células produce una reversión parcial del fenotipo transformado. Estas observaciones sugieren que la fosforilación en tirosina aberrante de p130^{cas} es una característica común de células transformadas por varios mecanismos dispares y que p130^{cas} puede requerirse para la manifestación completa del estado transformado. Por lo tanto, la desfosforilación de p130^{cas} por PTP-PEST es un mecanismo regulador potencialmente importante para contrarrestar los efectos de transformación de diversos oncogenes.

Se ha observado la fosforilación en tirosina de p130^{cas} en fibroblastos después de la adhesión celular mediada por integrina a proteínas de la matriz extracelular (Nojima et al., J. Biol. Chem. 270: 15398-15402 (1995); Petch et al., J. Cell Science 108: 1371-1379 (1995); Vuorl y Ruoslahti, J. Biol. Chem. 270: 22259-22262 (1995)). En estas condiciones, usando un anticuerpo (4F4) que reconoce predominantemente p130^{cas} fosforilada en tirosina (Kanner et al., EMBO J. 10: 1689-1698 (1991), Petch et at., J. Cell Science 108: 1371-1379 (1995)), se demostró que p130^{cas} fosforilada está localizada en adhesiones focales (Petch et al J. Cell. Science 108: 1371-1379 (1995)), mientras que los estudios de fraccionamiento han demostrado que la localización celular normal de la mayor parte de p130^{cas} no fosforilada es el citosol (Sakai et al., EMBO J. 13: 3748-3756 (1994)). Además, en fibroblastos transformados con crk, sólo se detecta p130^{cas} fosforilada en tirosina en fracciones insolubles (Sakai et al., EMBO J. 13: 3748-3756 (1994)), lo que sugiere que tanto la fosforilación mediada por la adhesión celular como la fosforilación mediada por transformación de p130^{cas} están asociados con la redistribución de la proteína desde el citosol a las adhesiones
focales.

Es plausible que la redistribución de p130^{cas} fosforilada en tirosina pueda dirigirse por su asociación con FAK, que está asociada constitutivamente con adhesiones focales debido a su dominio de dirección a adhesiones focales C-terminal (Hildebrand et al., J. Cell Biol 123: 993-1005 (1993); Schaller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5192-5196 (1992)). El secuestro de p130^{cas} fosforilada en tirosina en adhesiones focales tanto en las células transformadas como después de la adhesión celular mediada por integrina, sugiere claramente un papel para p130^{cas} en sucesos de señalización en esta región de la célula. Probablemente, una consecuencia de la redistribución de p130^{cas} fosforilada en tirosina es que, además de la localización de p130^{cas} en una región de la célula que contiene abundante actividad proteína tirosina quinasa, la proteína fosforilada será relativamente inaccesible a la fosfatasa citosólica PTP-PEST. Esto plantea la posibilidad de que el papel de PTP-PEST en la desfosforilación de p130^{cas} sea prevenir la fosforilación en tirosina inapropiada de las reservas citosólicas de p130^{cas}, previniendo de esta manera la formación de complejos de señalización ensamblados alrededor de p130^{cas} fosforilada en tirosina en localizaciones celulares
inapropiadas.

Varios factores mitogénicos estimulan de manera potente la fosforilación en tirosina de p130^{cas}. Éstos incluyen agentes que actúan a través de receptores acoplados a proteína G heterotriméricos tales como ácido lisofosfatídico (Seufferlein y Rozengurt, J. Biol. Chem. 269: 9345-9351 (1994)), bradicinina (Leeb-Lundberg et al., J. Biol. Chem. 269: 24328-24344 (1994)) y bombesina (Zachary et al., J. Biol. Chem. 267: 19031-19034 (1992)), así como factores de crecimiento que activan tirosina quinasas de receptores, particularmente PDGF (Rankin y Rozengurt, J. Biol. Chem. 269: 704-710 (1994)), EGF y NGF (Ribon y Saltiel, J. Biol. Chem. 271: 7375-7380 (1996)). Estas observaciones sugieren papeles para p130^{cas} en la regulación de rutas de señalización mitogénicas, que supuestamente implican el ensamblaje de complejos de señalización basados en p130^{cas} fosforilada en tirosina. Las identidades de las proteínas implicadas en estos complejos no se han establecido, pero probablemente incluyen proteínas adaptadoras que contienen el dominio SH2 tales como crk (Ribon y Saltiel, J. Biol. Chem. 271: 7375-7380 (1996)), y sus proteínas asociadas (Feller et al., Oncogene 10: 1465-1473 (1995); Hasegawa et al., Mol. Cell. Biol. 16: 1770-1776 (1996); Knudsen et al., J. Biol. Chem. 269: 32781-32787 (1994); Matsuda et al., Mol. Cell. Biol. 14: 5495-5500 (1994); Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3443-3447 (1994)). Por lo tanto, la fosforilación y desfosforilación en tirosina de p130^{cas} puede jugar un papel importante en la regulación de la formación de estos complejos, influyendo de esta manera en sucesos posteriores en la señalización mitogénica.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Harbor, Cold Spring

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína Tirosina Fosfatasas de captura de sustrato

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 36

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: HAMILTON, BROOK, SMITH & REYNOLDS, P.C.

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(B): CALLE: Two Militia Drive

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(C): CIUDAD: Lexington

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(D): ESTADO: MA

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(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02173

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(v): FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: PCT/US97/13016

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 24-JULIO-1997

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Warren, Lisa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 41,368

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: CSHL96-03 PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (781) 861-6240

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (781) 861-9540

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 196 amioácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 194 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 261 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 260 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 263 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

6

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 257 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

8

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 250 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 249 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 254 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 253 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

15

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 253 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 266 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 263 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 254 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 251 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 255 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 243 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 257 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 258 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 253 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 242 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 277 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

35

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 254 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

37

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 250 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

38

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 260 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

40

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 245 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 232 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 249 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 249 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

46

47

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 277 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

48

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 247 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 252 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 252 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CLASE DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

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52

53

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 278 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

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54

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 243 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

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56

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): CLASE DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): MOLÉCULA TIPO: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

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\sa{Xaa His Cys Xaa Ala Gly Xaa Xaa Arg Xaa Gly}

Claims

1. Una proteína tirosina fosfatasa mutante donde el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un aminoácido que:

a) atenúa la actividad catalítica de la fosfatasa y reduce el valor de Kcat a menos de 1 por minuto; y

b) se selecciona entre el grupo consistente en: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, glutamina, lisina, arginina e histidina,

donde la fosfatasa mutante retiene la capacidad de unirse a un sustrato fosforilado en tirosina, y donde el resto de aspartato constante a reemplazar se identifica por (i) alineamiento de la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico de fosfatasa de dicha fosfatasa con la secuencia de aminoácidos de al menos un dominio catalítico de proteína tirosina fosfatasa en las Figuras 1A a 1E, y (ii) localización del resto de aspartato constante de la fosfatasa en una posición correspondiente a la posición del resto de aspartato constante en al menos un dominio catalítico de proteína tirosina fosfatasa en las Figuras 1A a 1E.

2. Una proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con la reivindicación 1, que:

(I) se selecciona entre: PTP1B, donde el resto de aspartato constante está localizado en la posición 181; PTP-PEST, donde el resto de aspartato constante está localizado en la posición 199; PTP\gamma; MKP-1; DEP-1; PTP\mu; PTPX1; PTPX10; y PTPH1; o

(II) una fosfatasa PTP-PEST, donde el resto de aspartato constante está localizado en la posición 199, y donde el aminoácido en la posición 231 se ha reemplazado por un resto de serina.

3. La proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el resto de aspartato constante se ha reemplazado por un resto de alanina.

4. Un método para identificar una proteína fosforilada en tirosina que es un sustrato de una proteína tirosina fosfatasa, que comprende las etapas de:

a) combinar al menos una proteína fosforilada en tirosina con al menos una proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre la proteína fosforilada en tirosina y la proteína tirosina fosfatasa mutante, produciendo de esta manera una combinación;

b) determinar la presencia o ausencia de un complejo en la combinación, donde la presencia de un complejo en la combinación indica que la proteína fosforilada en tirosina es un sustrato de la proteína tirosina fosfatasa.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde la proteína fosforilada en tirosina se selecciona entre: p130^{cas}, el receptor de EGF, p210 bcr:abl, MAP quinasa y el receptor de la insulina.

6. Un kit para identificar un sustrato de proteína fosforilada en tirosina de una proteína tirosina fosfatasa, que comprende:

a) al menos una proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

b) reactivos auxiliares adecuados para uso en la detección de la presencia o ausencia de un complejo entre la proteína tirosina fosfatasa mutante y una proteína fosforilada en tirosina.

7. Un método para identificar un agente que altera la interacción entre una proteína tirosina fosfatasa y una proteína fosforilada en tirosina, que comprende las etapas de:

a) identificar de acuerdo con el método de la reivindicación 4 ó 5, una proteína fosforilada en tirosina que es un sustrato de una proteína tirosina fosfatasa;

b) combinar la proteína fosforilada en tirosina y la proteína tirosina fosfatasa de tipo silvestre y un agente a ensayar en condiciones adecuadas para la interacción entre la proteína fosforilada en tirosina y la proteína tirosina fosfatasa de tipo silvestre, formando de esta manera una combinación;

c) determinar la cantidad de actividad enzimática en la combinación; y

d) comparar la cantidad de actividad enzimática determinada en (c) con la cantidad de actividad enzimática en ausencia del agente a ensayar, en condiciones adecuadas para la interacción entre la proteína fosforilada en tirosina y la proteína tirosina fosfatasa de tipo silvestre,

donde una diferencia en la actividad enzimática indica que el agente altera la interacción entre la proteína tirosina fosfatasa de tipo silvestre y la proteína fosforilada en tirosina.

8. Un método para identificar un agente que altera la interacción entre una proteína tirosina fosfatasa y una proteína fosforilada en tirosina que es un sustrato de la proteína tirosina fosfatasa, que comprende las etapas de:

b) combinar la proteína fosforilada en tirosina, una proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un agente a ensayar en condiciones adecuadas para la interacción entre la proteína fosforilada en tirosina y la proteína tirosina fosfatasa mutante, formando de esta manera una combinación;

c) determinar el grado de unión entre la proteína fosforilada en tirosina y la proteína tirosina fosfatasa mutante en la combinación; y

d) comparar el grado de unión determinado en (c) con el grado de unión en ausencia del agente a ensayar, en condiciones adecuadas para la interacción entre la proteína fosforilada en tirosina y la proteína tirosina fosfatasa mutante,

donde una diferencia en el grado de unión indica que el agente altera la interacción entre la proteína tirosina fosfatasa y la proteína fosforilada en tirosina

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, donde si la cantidad de actividad enzimática o el grado de unión, respectivamente, es:

a) mayor en presencia del agente a ensayar que en ausencia del agente, el agente potencia la interacción entre la proteína tirosina fosfatasa y la proteína fosforilada en tirosina; o

b) menor en presencia del agente a ensayar que en ausencia del agente, el agente inhibe la interacción entre la proteína tirosina fosfatasa y la proteína fosforilada en tirosina.

10. Una proteína tirosina fosfatasa mutante como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en terapia, profilaxis o diagnóstico.

11. Una proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con la reivindicación 10, para uso en uno cualquiera de los siguientes objetivos:

a) reducir la actividad de una proteína fosforilada en tirosina que es un sustrato de la proteína tirosina fosfatasa; y/o

b) un método para reducir la actividad de una proteína fosforilada en tirosina que es un sustrato de la proteína tirosina fosfatasa, que comprende administrar a un mamífero una proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con lo que la formación de un complejo entre la proteína fosforilada en tirosina y la proteína tirosina fosfatasa mutante reduce la actividad de la proteína fosforilada en tirosina; y/o

c) reducir los efectos de transformación de oncogenes asociados con la fosforilación de p130^{cas}; y/o

d) un método para reducir los efectos de transformación de oncogenes asociados con la fosforilación de p130^{cas} que comprende administrar a un mamífero una proteína tirosina fosfatasa (PTP) que es PTP-PEST o PTP-PEST mutante de acuerdo con la reivindicación 2, con lo que la PTP se une y/o desfosforila p130^{cas}, reduciendo los efectos de transformación de oncogenes asociados con la fosforilación de p130^{cas}; y/o

e) el tratamiento, terapia, diagnóstico o profilaxis de cánceres, incluyendo cánceres asociados con la fosforilación de p130^{cas}; y/o

f) la reducción de la formación de complejos de señalización asociados con p130^{cas}; y/o

g) un método para reducir la formación de complejos de señalización asociados con p130^{cas} que comprende administrar a un mamífero una proteína tirosina fosfatasa (PTP) que es PTP-PEST o PTP-PEST mutante de acuerdo con la reivindicación 2, con lo que la PTP se une y/o desfosforila p130^{cas}, reduciendo la formación de complejos de señalización asociados con p130^{cas} y/o

h) la prevención de la inducción de rutas mitogénicas; y/o

i) la reducción de los efectos citotóxicos asociados con la administración o una sobreexpresión de proteína tirosina fosfatasa; y/o

j) un método para reducir los efectos citotóxicos asociados con la administración o una sobreexpresión de proteína tirosina fosfatasa que comprende administrar a un mamífero una proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en lugar de una proteína tirosina fosfatasa de tipo silvestre correspondiente.

12. Uso de una proteína tirosina fosfatasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico.

13. El uso de la reivindicación 12 para el tratamiento de un cáncer, donde el tratamiento:

(a) comprende administrar a un mamífero una proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con lo que la formación de un complejo entre la proteína tirosina fosfatasa mutante y una proteína fosforilada en tirosina que es un sustrato de la proteína tirosina fosfatasa reduce la actividad de la proteína fosforilada en tirosina; o

(b) reduce los efectos de transformación de oncogenes asociados con la fosforilación de p130^{cas}, que comprende administrar a un mamífero una proteína tirosina fosfatasa (PTP) que es PTP-PEST o PTP-PEST mutante de acuerdo con la reivindicación 2, con lo que la PTP se une y/o desfosforila p130^{cas}, regulando de esta manera negativamente los efectos corriente abajo de p130^{cas} y reduciendo los efectos de transformación de oncogenes asociados con la fosforilación de p130^{cas}; o

(c) reduce la formación de complejos de señalización asociados con p130^{cas}, que comprende administrar a un mamífero una proteína tirosina fosfatasa (PTP) que es PTP-PEST o PTP-PEST mutante de acuerdo con la reivindicación 2, con lo que la PTP se une y/o desfosforila p130^{cas}, regulando de esta manera negativamente los efectos corriente abajo de p130^{cas} y reduciendo la formación de complejos de señalización asociados con p130^{cas}; o

(d) reduce los efectos citotóxicos asociados con la administración o sobreexpresión de proteína tirosina fosfatasa, que comprende administrar a un mamífero una proteína tirosina fosfatasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en lugar de una proteína tirosina fosfatasa de tipo silvestre correspondiente.

14. El uso de la reivindicación 13(a) donde la proteína fosforilada en tirosina se selecciona entre el grupo consistente en: p130^{cas}, el receptor de EGF, p210 bcr:abl; MAP quinasa, y el receptor de la insulina, y/o la proteína tirosina fosfatasa se selecciona entre el grupo consistente en: PTP1B, PTP-PEST, PTP\gamma, MKP-1, DEP-1, PTP\mu, PTPX1, PTPX10 y PTPH1.

15. El uso de la reivindicación 13(b), donde el oncogén se selecciona entre el grupo consistente en: v-crk, v-src y c-Ha-ras.

16. El uso de la reivindicación 13(c), donde el tratamiento previene la inducción de rutas mitogénicas.

17. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 13 a 16, donde el mamífero es un ser humano.