JP2000515760A - 基質トラッププロテインチロシンホスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 不変なアスパラギン残基がアラニン残基に置換され、チロシンリン酸化基質に結合かつ触媒的に減じられる新規プロテインチロシンホスファターゼが記載される。さらに、記載されたプロテインチロシンホスファターゼと複合体化するチロシンリン酸化タンパク質を同定する方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 基質トラッププロテインチロシンホスファターゼ 発明の背景 プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーの酵素は、共通に高 く保存された２５０アミノ酸のＰＴＰ触媒ドメインを有するが、それらの非触媒 セグメントにおいて顕著な変異を示す、５００を超える構造的に多様なタンパク 質からなる〔シャルボヌー（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ）およびトンクス（Ｔｏｎ ｋｓ），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：４６３−４９３（１９ ９２）；トンクス（Ｔｏｎｋｓ），Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４：３ ７３−４５３（１９９３）〕。この構造的な多様性は、恐らく、個々のＰＴＰフ ァミリーのメンバーの生理学的役割の多様性を反映し、そのことは、ある場合に は、増殖、発生および分化における特異的な機能を有することを示していた〔デ ザイ（Ｄｅｓａｉ）ら，Ｃｅｌｌ ８４：５９９−６０９（１９９６）；キシハ ラ（Ｋｉｓｈｉｈａｒａ）ら，Ｃｅｌｌ ７４：１４３−１５６（１９９３）； パーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）ら，Ｃｅｌｌ ７０：２２５−２３６（１９９２ ）；ピンゲル（Ｐｉｎｇｅｌ）およびトーマス（Ｔｈｏｍａｓ），Ｃｅｌｌ ５ ８ ：１０５５−１０６５，（１９８９）；シュルツ（Ｓｈｕｌｔｚ）ら，Ｃｅｌ ｌ ７３：１４４５−１４５４（１９９３）〕。近年の研究は、さらにＰＴＰｓ の構造、発現および制御に関する有意な情報も生みだしたが、ＰＴＰｓがそれら の効果を発揮するチロシンリン酸化基質の性質は決定すべきままである。限られ た数の合成ホスホペプチド基質による研究は、異なるＰＴＰｓの基質選択性にお ける幾つかの差を示し〔チョウ（Ｃｈｏ）ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：９ ７７−９８４（１９９３）；デケルト（Ｄｅｃｈｅｒｔ）ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ． ２３１：６７３−６８１（１９９５）〕、リン酸化チロシン残 基の周辺の特定位置の一定のアミノ酸残基を好むことを示唆した〔ルッツェン（ Ｒｕｚｚｅｎｅ）ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１１：２８９−２９５ （１９９３）；ツァング（Ｚｈａｎｇ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３： ２２８５−２２９０（１９９４）〕。これらの研究で使用された基質の生理学的 な関連性は不明であるが、このことは、ＰＴＰｓがイン・ビトロにおける一定レ ベルの基質選択性を呈示することを示す。発明の要旨 本明細書記載のように、哺乳類プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ ）の基質特異性は、哺乳類ＰＴＰの変異体または改変型−基質トラップＰＴＰｓ ともいう−を用い、ＰＴＰの１以上の基質を結合（トラップ）する新規な基質ト ラップアプローチを用いて調べられた。基質トラップＰＴＰとＰＴＰの基質との 結合は、容易に観察でき、所望により、単離し、キャラクタライズできる複合体 の形成を生じる。ＰＴＰｓの変異体型は、野生型ＰＴＰに比べて触媒活性を減ず る（触媒活性を欠く、または減少した触媒活性を有する）が、野生型ＰＴＰの１ または複数のチロシンリン酸化基質を結合する能力を残す。 本発明の方法は、本明細書では、ホスファターゼＰＴＰ１ＢおよびＰＴＰ−Ｐ ＥＳＴに関して具体的に説明される；しかしながら、本発明はこれらの特定のＰ ＴＰｓに限定されず、ＰＴＰファミリーの全てのメンバーに適用しうる。ＰＴＰ １ＢおよびＰＴＰ−ＰＥＳＴの潜在的な基質を同定するため、触媒的には減ずる が、基質を結合する能力を保持したＰＴＰ１ＢおよびＰＴＰ−ＰＥＳＴの変異体 （即ち改変されたまたは基質をトラップする）型を生成させた。これらの変異体 ＰＴＰｓは、それぞれｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌおよびｐ１３０^casとしてイム ノブロッティングにより同定されたタンパク質との安定な複合体に会合した。こ れらの会合は、複数の細胞株由来のライゼートおよびトランスフェクトしたＣＯ Ｓ細胞に観察され、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌおよびｐ１３０^casは主要な生理 学的に関連するＰＴＰ１ＢおよびＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質を示す。 これらの結果は、本質的に限定されたイン・ビボにおける基質特異性を有する ＰＴＰｓの最初の証明を提供する。ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌおよびｐ１３０^{ca s} をＰＴＰ１ＢおよびＰＴＰ−ＰＥＳＴのそれぞれに特異的な基質として同定す るために使用された方法は、近年約５００メンバーが報告されている、いかなる ＰＴＰファミリーのメンバーにも一般的に適用可能であり、ＰＴＰファミリーの 他のメンバーの生理学的基質を決定するために使用することができる。 本発明の１つの態様は、不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変 化を生じないが、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じ させるアミノ酸と置換される新規な変異ＰＴＰｓに関する。これらのＰＴＰｓは 、ＰＴＰｓのチロシンリン酸化基質と複合体を形成するまたは結合する能力を保 持するが、触媒的に減ずる。１つの態様として、本発明は、１８１位の不変なア スパラギン酸残基がアラニンと置換される（Ｄ１８１Ａ）ホスファターゼＰＴＰ １Ｂに関する。他の態様として、本発明は、１９９位の不変のアスパラギン酸残 基がアラニンに置換される（Ｄ１９９Ａ）ホスファターゼＰＴＰ−ＰＥＳＴに関 する。本発明の他の態様は、２３１位のシステイン残基がセリン（Ｃ２３１Ｓ） に置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴホスファターゼに関する。さらに本発明は、不変 のアスパラギン酸残基がアラニンなどの他のアミノ酸に置換もしくは改変される 他の変異体または基質トラップＰＴＰｓに関する。ＰＴＰヌクレオチド配列を不 変なアスパラギン酸残基の位置が知られているＰＴＰのヌクレオチド配列で整列 化することにより、他のＰＴＰｓにおいて不変なアスパラギン酸残基を同定する ことができる。 さらに本発明は、プロテインチロシンホスファターゼのチロシンリン酸化基質 を同定する方法に関する。本発明の１つの態様によれば、目的のチロシンリン酸 化タンパク質は、不変なアスパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な変化を引き起 こさないか、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じさせ るアミノ酸に置換される１以上のＰＴＰ（ｓ）と組み合わされ、該タンパク質と １もしくは複数のＰＴＰとの複合体の存在または非存在が決定される。該組み合 わせにおける複合体の存在は、チロシンリン酸化タンパク質が、ＰＴＰの基質で あることを示唆する。ＰＴＰ ＤＡ変異体は、その基質と結合または複合体化す るが、それを脱リン酸化せず（または非常に遅くリン酸化する）、それにより複 合体を観察すること、任意に単離および同定することを可能にする。本発明の特 別な態様として、不変なアスパラギン酸はアラニン残基に置換される（ＰＴＰ ＤＡ変異または改変）。 本発明の別の態様としては、不変のアスパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な 変化を引き起こさないが、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減 少を生じさせるアミノ酸に置換される目的のＰＴＰは１以上のチロシンリン酸化 タンパク質と組み合わされ、１もしくは複数のタンパク質と該ＰＴＰとの複合体 の存在または非存在が決定される。ＰＴＰ ＤＡ変異体は、その基質と結合また は複合体化するが、それを脱リン酸化せず（または非常に遅くリン酸化する）、 それにより複合体を観察すること、ならびに任意に単離および同定することを可 能にする。本発明の１つの態様として、不変なアスパラギン酸はアラニン残基に 置換される（ＰＴＰ ＤＡ変異または改変）。 さらに本発明は、１を超える目的のチロシンリン酸化タンパク質が、不変のア スパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な変化を引き起こさないが、１分あたり１ 未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸に置換される（ 例えば、不変なアスパラギン酸がアラニン残基に置換される）１を超える目的の ＰＴＰと組み合わされる、プロテインチロシンホスファターゼのチロシンリン酸 化基質を同定する方法に関する。該組み合わせで形成した複合体を単離すること かでき、成分ＰＴＰと基質とを同定することができる。 さらに本発明は、不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化を引 き起こさないが、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じ させるアミノ酸に置換され（例えば、不変なアスパラギン酸がアラニン残基に置 換される）、チロシンリン酸化タンパク質との複合体を形成するＰＴＰの哺乳類 への投与を含む、チロシンリン酸化タンパク質の活性を減少させる方法に関する 。ＰＴＰ変異体は、リン酸化タンパク質を脱リン酸化することなく、リン酸化タ ンパク質と結合し、それにより該タンパク質の活性を阻害し、その下流の効果を 減少させる。 例えば、本発明は、野生型ＰＴＰ−ＰＥＳＴまたは不変なアスパラギン酸がア ラニン残基に置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴの哺乳類への投与を含む、ＰＴＰ−Ｐ ＥＳＴの基質であるｐ１３０^casに関連したオンコジーンの形質転換効果を減少 させる方法に関する。野生型ＰＴＰ−ＰＥＳＴはｐ１３０^casに結合し、脱リン 酸化して、それによりその下流の効果を負に制御する。ＰＴＰ−ＰＥＳＴのＤＡ 変異体は、ｐ１３０^casと結合するが、脱リン酸化しない（または減少した速度 で脱リン酸化する）；したがって、基質はＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質トラップ型と の複合体に結びつき、その下流の効果を発揮できない。同様に、本発明は、野生 型ＰＴＰ−ＰＥＳＴまたは不変なアスパラギン酸残基がアラニン残基に置換され るＰＴＰ−ＰＥＳＴの哺乳類への投与を含む、ｐ１３０^casに関連したシグナル 伝達複合体、特に分裂促進経路を誘導するシグナル伝達複合体の形成を減少させ る方法に関する。 さらに本発明は、ＰＴＰとそのリン酸化基質との相互作用を変化、例えば増大 または阻害する試薬を同定するためのアッセイに関する。これらのアッセイによ り同定された試薬は、ＰＴＰ活性のアゴニスト（例えば、ＰＴＰの活性を促進ま たは増加させる試薬等）またはアンタゴニスト（例えば、ＰＴＰの活性を阻害ま たは減少させる試薬等）であってもよい。該試薬は、内因性の生理学的物質であ ってもよく、あるいは小さい有機分子を含む、天然または合成薬物であってもよ い。 例えば、ＰＴＰのチロシンリン酸化基質を本明細書記載の方法により同定する ことができる。野生型ＰＴＰを用いる酵素活性アッセイは、試験対象の試薬の存 在下に行なうことができ、得られた酵素活性量を試験対象の試薬の非存在下の酵 素活性の量と比較することができる。試験対象の試薬の存在下の酵素活性の減少 は、該試薬がＰＴＰとその基質間の相互作用を阻害することを示唆する。逆に、 試験対象の試薬の存在下の酵素活性の増加は、該試薬がＰＴＰとその基質間の相 互作用を促進させることを示す。 一方、競合結合アッセイは、試験対象の試薬の存在下に変異ＰＴＰを利用して ことにより行なうことができ、生じた変異ＰＴＰとその基質との結合の程度を試 験対象の試薬の非存在下における結合の程度と比較することができる。試験対象 の試薬の存在下の結合の程度の減少は、ＰＴＰとその基質間の相互作用を阻害す ることを示す。逆に、試験対象の試薬の存在下の結合の程度の増加は、ＰＴＰと その基質間の相互作用を促進させることを示唆する。 したがって、本明細書記載の組成物および方法は、ホスファターゼのＰＴＰフ ァミリーのメンバーのチロシンリン酸化基質を同定すること、ならびに同定され た基質の活性を制御することに有用である。さらに、本明細書記載の組成物およ び方法は、特定の疾患または不調、および治療の投与における使用のために、Ｐ ＴＰ／基質相互作用を促進または阻害するモジュレーターのスクリーニング方法 に関するチロシンリン酸化タンパク質を同定するために有用である。図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂは、ＰＴＰｓの触媒ドメインの多重配列整列を示す。図１Ａ においては、細胞質の真核生物のＰＴＰｓおよびＲＰＴＰｓのドメイン１を１つ のグループに、ＲＰＴＰｓのドメイン２を第２グループに、エルニシア（Ｙｅｒ ｓｉｎｉａ）ＰＴＰを３番目に組み合わせる。３つの全てのグループに渡って所 有された不変残基を赤で示す。グループ内に不変でおよび高度に保存された残基 は、それぞれ青および緑で示した。エルニシアＰＴＰ配列内で、細胞質およびＲ ＰＴＰドメイン配列間に不変または高度に保存された残基を、それぞれ青および 緑で色付けする。該ペプチドと相互作用するＰＴＰ１Ｂの残基の位置を赤矢印で 示し、整列の下に番号を付した残基はＰＴＰ１Ｂの残基に対応する。図１Ｂは色 つけした領域を標識した矢印で示す図１Ａの白黒の光学コピーである。 図２はＲＣＭＬに対する多種のＰＴＰ１Ｂ変異体のＶｍａｘおよびＫｍを示す 。発明の詳細な説明 酵素のＰＴＰファミリーは、ＰＴＰ触媒ドメインとして知られている約２５０ アミノ酸の共通の進化的に保存されたセグメントを含む。全ＰＴＰｓに渡って不 変である独自の特有の配列モチーフ、〔Ｉ／Ｖ）ＨＣＸＡＧＸＸＲ〔Ｓ／Ｔ〕Ｇ はこの保存されたドメイン内にある。このモチーフの中のシステイン残基は該フ ァミリーのメンバーにおいて不変であり、触媒に必須であることが知られている 。それは、入ってくる基質のリン酸部分を攻撃する求核分子として作用する。部 位特異的変異導入により、システイン残基をセリン（ＣＳ変異体）またはアラニ ン（ＣＡ変異体）に変えた場合、得られるＰＴＰは触媒的に減ずるが、少なくと もイン・ビドロで、その基質と複合体化または結合する能力を保持している。こ れらの結果は、ＰＴＰファミリーのメンバーであるＭＫＰ−１〔サン（Ｓｕｎ） ら，Ｃｅｌｌ ７５：４８７−４９３（１９９３）〕、ならびに他のＰＴＰｓに 比較して確認されている。しかしながら、これらのＣＳ変異体は、一般的にイン ・ビトロでホスホチロシル基質に効果的に結合することができるが、多くの場合 、かかる複合体はイン・ビボで単離することができない。したがって、該ＣＳ変 異体は、それらの適用性において限定され、ＰＴＰｓと基質との全ての組合わせ を単離するために使用されえない。 ＰＴＰ１Ｂ単独〔バーフォード（Ｂａｒｆｏｒｄ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６ ３ ：１３９７−１４０４（１９９４）〕およびホスホチロシン−含有ペプチドと の複合体〔ジア（Ｊｉａ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７５４−１７５８ （１９９５）〕の結晶構造が最近決定された。２７の不変残基を示したこれら の構造〔バーフォード（Ｂａｒｆｏｒｄ）ら，１９９４〕のうち、１つはアスパ ラギン酸残基である。このアスパラギン酸残基は、ＰＴＰファミリーメンバーの 触媒ドメインにわたって不変である。即ち、ＰＴＰファミリーメンバーのアミノ 酸配列を整列させると、多様なＰＴＰ配列の整列に対して、整列を極大化するこ とを要求するシフトによって位置番号は異なるであろうが、アスパラギン酸残基 は、各ＰＴＰ中、対応する位置に存在する〔図（バーフォード（Ｂａｒｆｏｒｄ ）ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ． ２：１０４３−１０５３（１９ ９５）由来）を参照のこと）。整列がいまだに公表されていない配列は、例えば 、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳなどの入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、 他の公知のＰＴＰ配列で直ちに整列化しうる。 したかって、本明細書に具体的に記載されたもの以外の変異体ＰＴＰｓは、Ｐ ＴＰ触媒ドメインのアミノ酸配列を本明細書に記載されたものと整列化し、不変 のアスパラギン酸残基を同定し、該残基を部位特異的変異導入により変えること により直ちに作製されうる。本明細書に記載のＰＴＰ変異体の具体例はアスパラ ギン酸からアラニンへの変異体（ＤＡ変異体）であるが、本発明はアスパラギン 酸からアラニンへの改変に限定されない。不変のアスパラギン酸残基は、例えば 、部位特異的変異導入方法等により、酵素のＫｍの顕著な変化を引き起こさない か、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じさせるいかな るアミノ酸にも変化させることができる。例えば、不変のアスパラギン酸残基を 、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、 トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チ ロシン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、またはヒスチジンに 改変または変異することができる。 本明細書記載のように、過バナジウム酸−処理細胞をチロシンリン酸化タンパ ク質の豊富な供給源として用いて、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質特異性を調べた。Ｐ ＴＰ−ＰＥＳＴは、哺乳類組織中でユビキタスに発現〔イー（Ｙｉ）ら，Ｂｌｏ ｏｄ ７８：２２２２−２２２８（１９９１）〕する８８ｋＤａ細胞質ＰＴＰ〔 チャレスト（Ｃｈａｒｅｓｔ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ３０８：４２５−４ ３２（１９９５）；デン ハートッグ（ｄｅｎ Ｈｅｒｔｏｇ）ら，Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １８４：１２４１−１２４９ （１９９２）；タケカワ（Ｔａｋｅｋａｗａ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １８９：１２２３−１２３０（１９９２）；ヤ ング（Ｙａｎｇ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：６６２２−６６２８ （１９９３）；ヤング（Ｙａｎｇ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：１ ７６５０（１９９３）〕であり、それは人工的なチロシンリン酸化基質を用いて イン・ビトロでアッセイした場合、高い比活性を発揮する〔ガートン（Ｇａｒｔ ｏｎ）およびトンクス（Ｔｏｎｋｓ），ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３７６３−３７ ７１（１９９４）〕。ＰＴＰ−ＰＥＳＴがイン・ビトロおよびイン・ビボにおけ るＳｅｒ３９のリン酸化を介する制御に付されることが明らかに示された。この 修飾は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ ）の両方により触媒され、脱リン酸化反応のＫｍにおける増加の結果として減少 した酵素活性を生じる（ガートン（Ｇａｒｔｏｎ）およびトンクス（Ｔｏｎｋｓ ），ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：３７６３−３７７１（１９９４）〕。本酵素はチロ シンキナーゼの細胞質基質のチロシンリン酸化段階に有意に負の影響を発揮する ことが期待されるので、さらなる制御機構がＰＴＰ−ＰＥＳＴに存在することが 明らかであろう。１つの可能性はこの影響がＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質特異性によ り制限することができることである。 ＰＴＰ１Ｂの基質特異性は、細胞を過バナジウム酸で処理しないことを除いて 、ＰＴＰ−ＰＥＳＴのために概説された同じ方法を用いて調べられた。イン・ビ トロにおける脱リン酸化と基質トラップ実験との組み合わせを用いて、ＰＴＰ１ ＢとＰＴＰ−ＰＥＳＴとの相互作用を研究した。本明細書に概説された基質トラ ップ方法は、共有された不変のアスパラギン酸残基によって、一般的にいかなる ＰＴＰにも適用可能であり、したがって、他のＰＴＰファミリーメンバーの基質 選択を詳述することに有用であることを証明するであろう。特に、変異体、触媒 的に減じたＰＴＰｓを用いて、潜在的な基質をトラップし、それにより単離する ことは、個々のＰＴＰＴｓの生理学的に重要な基質をすこぶる同定し易くし、細 胞内の過程の制御におけるこれらの酵素の役割の理解を進歩させるであろう。 本発明の１つの態様は、不変なアスパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な変化 を起こさないが、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じ させるアミノ酸に置換される新規なＰＴＰｓに関する。これらのＰＴＰｓはそれ らのチロシンリン酸化基質と複合体化または結合する能力を残しているが、触媒 的に減ずる。本明細書記載のように、「減じられた」活性は、ホスファターゼが 野生型のホスファターゼのＫｍと類似のＫｍを保持しているが、野生型の酵素に 比較して少なくとも１０⁴の係数により減少されたＶｍａｘを有することを意味 することを意図する。これは、野生型ＰＴＰに比較して減少または完全に破壊さ れた触媒活性を含む。例えば、不変なアスパラギン酸残基はアラニン、バリン、 ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチ オニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン 、グルタミン、リジン、アルギニンまたはヒスチジンに変えるまたは変異させる ことができる。 不変なアスパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な変化を起こさないが、１分あ たり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸に置換さ れる、本明細書記載の新規ＰＴＰｓは、さらに、他の変異、具体的には、ＰＴＰ ／基質複合体を安定化することを助けるものを含有することができる。例えば、 特有のモチーフにおける〔セリン／スレオニン〕残基のアラニン残基への変異は 、遷移状態の形成から遷移状態の破壊への脱リン酸化反応の律速段階を変え、そ れによりＰＴＰ／基質複合体を安定化させる。かかる変異は、不変なアスパラギ ン酸残基の置換、具体的には、複合体の安定化を助けること、複合体の観察およ び単離をし易くすることとを価値評価可能に組み合わせてもよい。 本発明に使用するために適切なＰＴＰｓは対応する位置に不変なアスパラギン 酸残基を有するいかなるＰＴＰをも含む。本明細書で規定するように、特有のモ チーフ、〔Ｉ／Ｖ）ＨＣＸＡＧＸＸＲ〔Ｓ／Ｔ〕Ｇを含む場合、ホスファターゼ は、ＰＴＰファミリーのメンバーである。２重の特異性ＰＴＰｓ、即ち、リン酸 化チロシンとリン酸化セリンまたはスレオニンとの両方を脱リン酸化するＰＴＰ ｓは、さらに、本発明における使用に適切である。適切なＰＴＰｓとしては、限 定されないか、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ −１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、ＰＴＰＸ１０およびＰＴＰＨ１が挙げられる。 １つの態様として、本発明は、１８１位のアスパラギン酸残基がアラニンに置 換されるホスファターゼＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ）に関する。別の態様として、 本発明は、１９９位の不変なアスパラギン酸残基がアラニンに置換されるホスフ ァターゼＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）に関する。本発明の別の態様は、２３ １位のシステイン残基がセリンに置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴホスファターゼ（ Ｃ２３１Ｓ）に関する。 さらに本発明は、特定のプロテインチロシンホスファターゼの基質であるチロ シンリン酸化タンパク質を同定する方法に関する。本発明の１つの態様によれば 、目的のチロシンリン酸化タンパク質は、不変なアスパラギン酸残基が、酵素の Ｋｍの顕著な変化を引き起こさないが、１分あたり１未満（１分^-1未満）までの Ｋｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸（例えば、アラニン残基）に置換される少 なくとも１つのＰＴＰと組み合わされ、タンパク質とＰＴＰとの複合体の存在ま たは非存在が決定される。該組み合わせにおける複合体の存在は、チロシンリン 酸化タンパク質がＰＴＰの基質であることを示す。ＰＴＰ ＤＡ変異体（基質ト ラップ変異体）はその基質と結合または複合体化するが、それを脱リン酸化せず （または非常に遅くリン酸化する）、それにより、複合体を単離することおよび 同定することが可能になる。 リン酸化タンパク質／ＰＴＰ複合体は、塩析、クロマトグラフィー、電気泳動 、ゲル濾過、分画、吸着、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集、またはそれ らの組み合わせを含む、米国特許第５，３５２，６６０号明細書に記載の慣用の 単離技術により単離することができる。さらにタンパク質／ＰＴＰ複合体の存在 の決定を行ないやすくするために、ＰＴＰまたはリン酸化タンパク質に対する抗 体、ならびに標識ＰＴＰｓおよび／または標識リン酸化基質を使用することがで きる。ＰＴＰまたはリン酸化タンパク質は、様々な酵素、蛍光物質、発光物質お よび放射活性物質で標識できる。適切な酵素としては、限定されないが、例えば 、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリホスファターゼ、β−ガラ クトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼなどが挙げられる。適切な蛍光 物質としては、限定されないが、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、 フルオレセイン イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミ ン フルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリスリンなどが挙げられる。 適切な発光物質としては、ルミノールが挙げられ、適切な放射活性物質としては 放射活性リン³²Ｐ、ヨードＩ¹²⁵、Ｉ¹³¹またはトリチウムが挙げられる。 あるいは、本発明は、不変なアスパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な変化を 引き起こさないが、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生 じさせるアミノ酸（例えば、アラニン残基）に置換される目的のＰＴＰと少なく とも１種のチロシンリン酸化タンパク質とを組み合わせ、それによりコンビネー ションを生じる工程：およびチロシンリン酸化タンパク質とＰＴＰとのコンビネ ーションにおける複合体の存在がチロシンリン酸化タンパク質がＰＴＰの基質で あることを示唆するものである、該コンビネーションにおける複合体の存在また は非存在を決定する工程を含む、ＰＴＰの基質であるチロシンリン酸化タンパク 質を同定する方法に関する。 さらに、本発明の基質トラップＰＴＰｓを野生型ＰＴＰｓの代わりに用いて、 ソンギャン（Ｓｏｎｇｙａｎｇ）ら〔Ｎａｔｕｒｅ ３７３：５３６−５３９（ １９９５）；Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８（１９９３）〕に記載のようにＰ ＴＰに結合するペプチドのホスホチロシルペプチドライブラリーをスクリーニン グすることもできる。ついで、かかるペプチドライブラリーから同定されたペプ チドは、これらのペプチドを含むチロシンリン酸化タンパク質が天然に存在する かどうかを決定するために評価されうる。 本発明において、いかなるチロシンリン酸化タンパク質も潜在的な基質として 適切である。チロシンリン酸化タンパク質は、当該分野において良く熟知されて いる。適切な基質の具体例としては、限定されないが、例えば、ｐ１３０^cas、 ＥＧＦレセプター、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ、ＭＡＰキナーゼ、インシュリン レセプターなどが挙げられる。哺乳類疾患または不調に係わるチロシンリン酸化 タンパク質は、特に興味深いものである。 さらに本発明は、不変なアスパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な変化を引き 起こさないが、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じさ せるアミノ酸（例えば、アラニン残基）に置換され、それがチロシンリン酸化タ ンパク質との複合体を形成するＰＴＰを哺乳類に投与する工程を含む、チロシン リン酸化タンパク質の活性を減少させる方法に関する。ＰＴＰ ＤＡ変異体は、 リン酸化タンパク質を脱リン酸化することなく（または非常に減少した速度で脱 リン酸化する）、該リン酸化タンパク質と結合し、それによりタンパク質の活性 を阻害し、その下流の効果を減少させる。本明細書に用いられるように、「減少 させる」は、例えば、リン酸化タンパク質の１以上の活性または機能の減少と完 全な破壊との両方を含む。 例えば、本発明は、哺乳類への、野生型ＰＴＰ−ＰＥＳＴまたは不変なアスパ ラギン酸残基がアラニン残基に置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴを投与する工程を含 む、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質であるｐ１３０^casに関連したオンコジーンの形質 転換効果を減少させる方法に関する。野生型ＰＴＰ−ＰＥＳＴはｐ１３０^casに 結合し、脱リン酸化し、それにより、その下流の効果を負に制御する。ＰＴＰ− ＰＥＳＴのＤＡ変異体は、ｐ１３０^casと結合するが、脱リン酸化しない（また は非常に減少した速度で脱リン酸化する）；したがって、基質はＰＴＰ−ＰＥＳ Ｔの基質トラップ型との複合体に結びつき、その下流の効果を発揮できない。同 様に、本発明は、野生型ＰＴＰ−ＰＥＳＴまたは不変なアスパラギン酸がアラニ ン残基に置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴを哺乳類へ投与する工程を含有する、ｐ１ ３０^casに関連したシグナル伝達複合体、特に分裂促進経路を誘導するシグナル 伝達複合体の形成を減少させる方法に関する。ＰＴＰはｐ１３０^casと結合およ ひ／または脱リン酸化し、それによりその下流のｐ１３０^casの効果を負に制御 し、ｐ１３０^casに関連したシグナル伝達複合体の形成を減少させる。 本発明の基質トラップ変異体ＰＴＰｓは、対応する野生型ＰＴＰの代わりにま たは加えて、実質的にいかなる適用にも使用されうる。かかる使用の利点は、変 異体ＰＴＰが野生型酵素の機能を疑似する能力、例えば、野生型ＰＴＰの投与ま たは過剰発現で共通して観察される有害な細胞毒性効果を誘導することなく、そ のチロシンリン酸化基質の活性を減少させることにある。したがって、本発明は 、野生型ＰＴＰの投与または過剰発現に関連する細胞毒性効果を減少させる方法 に関する。例えば、潜在的に有害な副作用を誘導することなく、ＭＫＰ−１ＣＳ 変異体は野生型ＭＫＰ−１と同じ機能的な効果を有することが示された。したが って、不変なアスパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な変化を引き起こさないが 、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸 （例えば、アラニン残基）に置換される、本明細書記載のＰＴＰｓは、対応する 野生型酵素の代わりの多くの適用に使用されうる。本明細書記載のように、「対 応する」酵素は変異体ＰＴＰと同じもの（例えば、ＰＴＰ−ＰＥＳＴおよびＰＴ Ｐ−ＰＥＳＴ Ｄ１９９Ａ）、または変異体ＰＴＰと異なるが、変異体ＰＴＰと 同じ基質を認識するものである。 さらに本明細書記載の変異体ＰＴＰｓは、本明細書記載の変異体ＰＴＰ、また はそのチロシンリン酸化基質への結合能力を保持している変異体ＰＴＰの機能部 分を患者に導入するおよび患者の中で該変異体ＰＴＰを発現する遺伝子治療など により、チロシンリン酸化タンパク質の活性を治療的に減少するために使用され うる。該変異体ＰＴＰは、通常生産される野生型ＰＴＰと部分的にもしくは全体 的に置き換えるまたは野生型ＰＴＰの基質への結合に競合する。例えば、特定の 疾患または不調に係わる、特別のチロシンリン酸化タンパク質（プロテインチロ シンキナーゼなど）を同定しうる。本発明の選択されたチロシンリン酸化タンパ ク質を脱リン酸化する作用をする少なくとも１種のＰＴＰを本明細書記載の方法 により同定しうる。チロシンリン酸化基質とタイアップまたは結合するため、Ｐ ＴＰの野生型または変異体型を処置の必要な患者に投与し、それによりリン酸化 タンパク質の機能を阻害または減少することができる。好ましい態様として、野 生型酵素の過剰発現に関連した細胞毒性効果を減少させるために、変異体ＰＴＰ を野生型酵素の代わりに投与する。遺伝子治療の手法は、当該分野に公知であり （アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）らに付与された米国特許第５，３９９，３ ４６号明細書を参照のこと）、当該分野に公知の方法により改変し、本発明の特 別の変異体および野生型ＰＴＰｓを適切に発現されうる。 本発明は、さらに、ＰＴＰとそのリン酸化基質との相互作用を変える、例えば 、促進するまたは阻害する試薬を同定するためのアッセイに関する。これらのア ッセイにより同定された試薬は、ＰＴＰ活性のアゴニスト（例えば、ＰＴＰの活 性を促進または増加させる試薬等）またはアンタゴニスト（例えば、ＰＴＰの活 性を阻害または減少させる試薬等）であってもよい。該試薬は、内因性の生理学 的物質であってもよく、あるいは小さい有機分子を含む、天然または合成薬物で あってもよい。 例えば、ＰＴＰのチロシンリン酸化基質を本明細書記載の方法により同定する ことができる。野生型ＰＴＰを用いる酵素活性アッセイは、試験対象の試薬の存 在下に行なうことができ、酵素活性の得られた量を試験対象の試薬の非存在下の 酵素活性の量と比較することができる。酵素の活性アッセイは当該分野に公知で ある；例えば、チロシンリン酸化³²Ｐ−標識基質を用いるＰＴＰ活性のアッセイ は、フリント（Ｆｌｉｎｔ）ら〔ＥＭＢＯ Ｊ． １２：１９３７−１９４６（ １９９３）〕に記載される。試験対象の試薬の存在下の酵素活性の減少は、該試 薬がＰＴＰとその基質の相互作用を阻害することを示唆する。逆に、試験対象の 試薬の存在下の酵素活性の増加は、該試薬がＰＴＰとその基質間の相互作用を促 進させることを示す。 一方、競合結合アッセイは、試験対象の試薬の存在下に変異ＰＴＰを使用する ことにより行なうことができ、生じた変異ＰＴＰとその基質との結合の程度を試 験対象の試薬の非存在下における結合の程度と比較することができる。競合結合 アッセイは当該分野に公知である；例えば、パウソン（Ｐａｗｓｏｎ）に付与さ れた米国特許第５，３５２，６６０明細書は、本発明における使用に適切な方法 を記載する。試験対象の試薬の存在下の結合の程度の減少は、ＰＴＰとその基質 間の相互作用を阻害することを示す。逆に、試験対象の試薬の存在下の結合の程 度の増加は、ＰＴＰとその基質間の相互作用を促進させることを示唆する。 本発明によれば、ソンギャン（Ｓｏｎｇｙａｎｇ）らの方法〔Ｎａｔｕｒｅ ３７３ ：５３６−５３９（１９９５）；Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８（１９ ９３）〕によるペプチドライブラリー由来の変異ＰＴＰｓで同定されたチロシン リン酸化ペプチドを、本明細書において競合結合アッセイの完全なチロシンリン 酸化タンパク質の代わりに用いうる。 さらに本発明は、不変なアスパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な変化を引き 起こさないが、１分あたり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じさ せるアミノ酸（例えば、アラニン残基）に置換されるＰＴＰを含有した医薬組成 物に関する。例えば、本発明のＰＴＰを、生理学的に許容されうる媒質で処方し て、医薬組成物を調製することができる。具体的な生理学的媒質は、限定されな いが、水、緩衝化生理学的食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピ レングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびデキストロース溶液 が含まれてもよい。選択した媒質における１または複数の活性成分の至適濃度は 、医薬化学者に良く熟知された手法により、経験的に決めることができ、かつ最 終的な所望の医薬処方に依存するであろう。処置の部位への外来ＰＴＰｓの導入 方法としては、限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、 および鼻腔内が挙げられる。さらに、他の適切な導入方法としては、再装薬可能 なまたは生分解可能なデバイスおよび除放性の重合体のデバイスを含むことがで きる。さらに、本発明の医薬組成物は、他の試薬との組み合わせの治療法の一部 としても投与しうる。 下記実施例は本発明を説明する目的のために提示されるが、本発明の範囲を限 定することを意図したものではない。本明細書に述べられた全ての参考文献の教 示は、その全てにおいて参照により本明細書に取り込まれる。実施例 試薬と方法 以下は、本明細書記載の研究に用いられた試薬と方法の記載である。変異体ＰＴＰタンパク質の生成、発現および精製 ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ，Ｃ２３１Ｓ）およびＰＴＰ１Ｂ（Ｄ１８１Ａ ，Ｃ２１５Ｓ）の触媒ドメイン内の点変異を、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ^TMイン・ビト ロ ミュータジェネシスキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を 用いた部位特異的変異により導入した。ついで、要求される点変異を含む領域を 適当な発現ベクター内の野生型配列と交換し、置換した変異領域を、その全部に 渡ってシークエンスし、さらなる変異がないことを証明した。 全長のＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質（野生型、およびＡｓｐ１９９からＡｌａ またはＣｙｓ２３１からＳｅｒへの変異を含む変異体タンパク質）ならびに野生 型ＰＴＰ−ＰＥＳＴ触媒ドメイン（アミノ酸１−３０５）を、組み換えバキュロ ウイルス（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TM，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ ｏ，ＣＡ）を用いて、Ｓｆ９細胞で発現し、ガートン（Ｇａｒｔｏｎ）およびト ンクス（Ｔｏｎｋｓ）〔ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３７６３−３７７１（１９９４ ）〕に記載のように精製した。さらに、末端がない野生型およびＰＴＰ−ＰＥＳ Ｔのアミノ酸残基１−３０５を含有する変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質をｐ ＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｓａ ｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のＧＳＴの下流にフレームを合わせてＰＴＰ−ＰＥＳＴＤ ＮＡのサブクローニングの後、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＧＳＴ融合タンパク質として発 現した。適当なベクターで形質転換した２５ｍｌのＥ．ｃｏｌｉを対数増殖（ｌ ｏｇ）期（ＯＤ₆₀₀約０．５）まで生育させた。ついで融合タンパク質発現を０ ．２ｍＭイソプロピル−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドの添加により誘 導し、該菌体を２−４時間３０℃で生育させた。菌体を遠心分離により集め、５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ 、１ｍＭ ベンズアミジン、５ｍｇ／ｍｌ ロイペプシン、５ｍｇ／ｍｌ アプ ロチニン、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１５０ｍＭ ＮａＣｌを 含む３ｍｌ緩衝液中５０ｍｇ／ｍｌリゾチームとインキュベートし、ついで、音 波処理（３×１０秒）により溶解した。遠心分離（３００，０００×ｇで、２０ 分）により不溶性物質の除去を行なったのち、融合タンパク質を１００ｍｌグル タチオン−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）とともに４℃で３０分間のインキュベーシ ョンにより分離し、ついで該ビーズを遠心分離により集め、緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ベンズアミジン ，１ｍｇ／ｍｌ ロイペプシン，１ｍｇ／ｍｌ アプロチニン，１０％ ギリセ ロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００ｍＭ ＮａＣｌ）で３回 洗浄した。この手法により、本質的に均一の融合タンパク質を１ｍｇタンパ ク質／ｍｌグルタチオン−セファロースビーズの濃度で得た。アミノ酸１−３２ １を含有するＰＴＰ１Ｂタンパク質（野生型および変異体型）をＥ．ｃｏｌｉ内 で発現し、バーフォード（Ｂａｒｆｏｒｄ）ら〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２３ ９ ：７２６−７３０（１９９４）〕に記載のように均一まで精製した。細胞培養、トランスフェクション、ライゼートの調製および分画 ＨｅＬａおよびＣＯＳ細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ の改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で生育した；Ｗｉ２８、Ｃ２Ｃ１２およびＭｖ Ｌｕ細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで生育した；２９３細胞を１０％子ウシ 血清を含むＤＭＥＭで生育した；ＭＣＦ１０Ａ細胞を５％ウマ血清、２０ｎｇ／ ｍｌ表皮成長因子、１０ｍｇ／ｍｌインシュリン、０．５ｍｇ／ｍｌハイドロコ ルチゾンおよび０．２５ｍｇ／ｍｌファンギゾンを含む５０％ＤＭＥＭ、５０％ ハムのＦ−１２で生育した。さらに全ての培地は、ペニシリンおよびストレプト ンマイシンをそれぞれ１００Ｕ／ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌで含み、全細胞を ３７℃で生育した。カルシウムホスフェート−媒介トランスフェクションを用い 、野生型および変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質をコードするｃＤＮＡをＣＯ Ｓ細胞に導入した。これらは、発現がアデノウイルス主要後期プロモーターによ り制御されるプラスミドＰＭＴ２にサブクローン化されたＰＴＰ−ＰＥＳＴ ｃ ＤＮＡによりコードされた；各１０ｃｍプレートの細胞のトランスフェクション のために２０ｍｇのＤＮＡを用いた。ＰＴＰ−ＰＥＳＴ構築物の発現のレベルは 全ケースで類似していた。 細胞溶解に先立ち、７０−９０％コンフルエント培養細胞を０．１ｍＭ過バナ ジウム酸塩（５０ｍＭ メタバナジウム酸ナトリウム（ＮａＶＯ₃）および５０ ｍＭ Ｈ₂Ｏ₂を含む２０ｍｌの新鮮な溶液を１０ｍｌ培地に添加した）で３０分 間処理した。恐らくバナジウム酸塩による細胞内ＰＴＰの阻害により、過バナジ ウム酸塩とＨ₂Ｏ₂による細胞の処理は、ホスホチロシンレベルにおける共同 的増加を導く。過バナジウム酸塩とＨ₂Ｏ₂との共同作用により、バナジウム酸塩 自体と比較した場合、細胞内に得られた酸化バナジウム酸（過バナジウム酸）の 向上した蓄積の結果が以前示唆されている〔ヘッフェッツ（Ｈｅｆｆｅｔｚ）ら ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：２８９６−２９０２（１９９０）〕。細 胞ライゼートの調製の間、ＰＴＰ作用におけるバナジウム酸の阻害効果が失われ るように希釈がおこることに注意することが重要である。未処理の細胞は、実際 に検出できないレベルのホスホチロシンを含んだが（データ未開示）、過バナジ ウム酸塩処理は、全細胞型において、少なくとも５０の顕著なホスホチロシンタ ンパク質バンドの出現に帰した。 細胞のＰＴＰを不可逆的に阻害するために、５ｍＭヨード酢酸を含む緩衝液Ａ 中で細胞を溶解した。４℃で３０分間のインキュベーションののち、１０ｍＭ ＤＴＴを添加し、いかなる未反応のヨード酢酸をも不活化した。ついで不溶性物 質を２０分間３００，０００×ｇの遠心分離により除去した。−７０℃での長期 間（数ヶ月）保存の間および外来の添加したＰＴＰｓの非存在下での延長した（ 少なくとも２０時間）４℃のインキュベーションの間、得られたライゼートは、 それらのホスホチロシン含有量に関して安定であった。 ＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、アニオン交換 クロマトグラフィーで過バナジウム酸−処理ＨｅＬａ細胞ライゼートを分画した 。ローディングに先立ち、試料（緩衝液Ａ中、３ｍｇ／ｍｌで５０ｍｇの全タン パク質）を３倍量の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ベンズアミジン，１ｍｇ／ｍｌロイペプシン，１ｍｇ／ ｍｌ アプロチニンおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で希釈した。 タンパク質を１ｍｌ／分の流速で緩衝液Ｂ中０−０．５Ｍ ＮａＣｌのリニアグ ラジェントで２０画分（１ｍｌ画分体積）にわたって溶出し、ついで緩衝液Ｂ中 ０．５−１．０Ｍ ＮａＣｌの２次グラジエントを５画分にわたって行なった。 ホスホチロシン含有タンパク質を抗ホスホチロシンイムノブロッティングにより 、フラクション７−２１内で検出した。細胞を過バナジウム酸塩で処理しないこ とを除いて、同じ手法をＰＴＰ１Ｂで行なった。脱リン酸化反応 チロシンリン酸化タンパク質を含む過バナジウム酸塩処理ＨｅＬａ細胞のライ ゼート（１−２ｍｇタンパク質／ｍｌ）を２ｎＭの濃度の精製した活性ＰＴＰｓ の非存在下または存在下に氷上でインキュベートした。脱リン酸化をＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ試料緩衝液へアリコート（３０ｍｇタンパク質）を除去することにより終 了し、脱リン酸化の程度をモノクローナル抗体Ｇ１０４を用いたイムノブロッテ ィングにより決定した。チロシンリン酸化³²Ｐ−標識ＲＣＭ−リゾチームを基質 として用いたＰＴＰ活性のアッセイをフリント（Ｆｌｉｎｔ）ら〔ＥＭＢＯ Ｊ ． １２：１９３７−１９４６（１９９３）〕記載のように行なった。抗体およびイムノブロッティング ＰＴＰ−ＰＥＳＴモノクローナル抗体ＡＧ２５をバキュロウイルス−発現精製 全長ＰＴＰ−ＰＥＳＴに対して生じさせた。抗原として、最初にカンプス（Ｋａ ｍｐｓ）およびセフトン（Ｓｅｆｔｏｎ）〔Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２：３０５−３ １５，（１９９８）〕に記載された方法でカギアナカサガイのヘモシアニン存在 下に１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドで１： １：１の割合で重合させたホスホチロシン、アラニンおよびグリシンを用いて、 抗ホスホチロシンモノクローナル抗体Ｇ１０４を生成した。ｐ１３０^casモノク ローナル抗体はトランスダクション ラボラトリーズ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏ ｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｙ）製であった。Ｐ ＴＰ１Ｂに対するモノクローナル抗体ＦＧ６はデビッド・ヒル（Ｄａｖｉｄ Ｈ ｉｌｌ）博士〔Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）により提供された。イムノブロッ ティングによるタンパク質の視覚化は、ＨＲＰ−コンジュゲート２次抗体（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈ ｅｉｇｈｔｓ，Ｉ１）とスーパーシグナル^TMＣＬ−ＨＲＰ基質システム（Ｐｉｅ ｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ）とを用いて、エンハンスドケミルミネッセン ス（ＥＣＬ）により達成された。免疫沈降および基質トラップ 化学クロスリンキング試薬であるジメチルピメルイミデート〔シュナイダー（ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５７：１０７６６−１ ０７６９（１９８２）〕を用いたプロテインＡ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）への モノクローナル抗体ＡＧ２５の共有結合的なカップリングを行なった後、トラン スフェクトＣＯＳ細胞由来のＰＴＰ−ＰＥＳＴの免疫沈降を行なった。まず、１ ｍｇ／ｍｌビーズ体積の濃度でプロテインＡ−セファロースに抗体を結合させ、 ついで未結合物質を０．２Ｍ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ ９で３回洗浄により除 去した。０．２Ｍ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ ９中２０ｍＭ ジメチルピメルイ ミデートの存在下、室温で３０分間のインキュベーションにより、共有結合的な カップリングを達成した。ついで、ビーズを１時間、０．２Ｍ エタノールアミ ン，ｐＨ８の過剰量でインキュベートして、いかなる未反応クロスーリンカーを もブロックし、４℃での保存に先立ち、ＰＢＳで３回洗浄した。１０ｍｌのＡＧ ２５ビーズを用い、約０．３７５ｍｇのタンパク質を含むライゼート由来のトラ ンスフェクトＰＴＰ−ＰＥＳＴを沈澱させた。 種々のＰＴＰアフィニティーマトリックスを用いて基質トラップを行なった。 全長のＰＴＰ−ＰＥＳＴマトリックスは、精製バキュロウイルス−発現ＰＴＰ− ＰＥＳＴタンパク質を結合した共有結合的にカップリングしたＡＧ２５−プロテ インＡ−セファロースビーズを利用した。ＡＧ２５ビーズのアリコート（１０ｍ ｌ）を２時間４℃で５ｍｇの精製ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（野生型または変異体型）の 存在下に１００ｍｌの緩衝液Ａでインキュベートした；ついで、未結合のＰＴＰ −ＰＥＳＴを１ｍｌ緩衝液Ａで３回洗浄することにより除去した。得られたＰＴ Ｐ−ＰＥＳＴ−ＡＧ２５−プロテインＡ−セファロースビーズは、１０ｍｌアリ コートあたり約２ｍｇのＰＴＰ−ＰＥＳＴを含んだ。さらに基質トラップを、細 菌で発現した、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの触媒ドメインを含むＧＳＴ融合タンパク質に 結合したグルタチオン−セファロースで行なった。 さらに、ＰＴＰ１Ｂを基質トラップ実験に使用した。この場合、モノクロナー ル抗体ＦＧ６をクロスリンカーの非存在下にプロテインＡ−セファロースと予め カップリングし（２ｍｇ抗体／１０ｍｌビーズ）、ついで、精製したＰＴＰ１Ｂ タンパク質を過剰に添加し、４℃で２時間インキュベートした。未結合のＰＴＰ １Ｂの除去ののち、１０ｍｌビーズは約２ｍｇのＰＴＰ１Ｂを含んだ。 過バナジウム酸塩−処理細胞ライゼート、またはカラムフラクションは、基質 トラップ実験のためのホスホチロシン含有タンパク質の供給源として使用した。 一般的に、０．５ｍｌ緩衝液Ａ（５ｍＭヨード酢酸，１０ｍＭ ＤＴＴを含む） 中０．２５−０．５ｍｇのタンパク質を含むライゼートを約２ｍｇの適当なＰＴ Ｐタンパク質を含む１０ｍｌのアフィニティーマトリックスの存在下、４℃で２ 時間インキュベートした。ついで、未結合のタンパク質を１ｍｌ緩衝液Ａで３回 洗浄することにより試料から除去し、結合物質を５０ｍｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試 料緩衝液を添加した後、９５℃で５分間の加熱により集めた；ついで、ビーズに 結合したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、イムノブロッティングすることによ り解析した。結果 下記に、前記のように行なわれた本明細書記載の研究の結果を詳述する。ＰＴＰ１Ｂおよびｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ 慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、ＰＴＫをコードする染色体９上のｃ−Ａｂｌ プロト−オンコジーンが染色体２２上のｂｃｒ遺伝子に結合するようになる、フ ィラデルフィア染色体によりキャラクタライズされる造血幹細胞のクローン異常 である。このことは、ＰＴＫ活性がｃ−Ａｂｌの活性に比較して促進されるｂｃ ｒ：ａｂｌｅ融合タンパク質であるｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌの生成に帰する。 現在のデータは、この細胞遺伝学的な異常性がＣＭＬにおける初期かつ単独の原 因となる事象であることを示唆する。ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌの発現は、ＣＭ Ｌの特徴である造血幹細胞の異常な成熟に起因するチロシンリン酸化の異常なパ ターンを生じる。 ＰＴＰ１Ｂ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、Ｒａｔ１、Ｍｏ７およびＢ ａＦ３細胞におけるｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ発現の結果として促進される。酵 素タンパク質における変化と比例した、ＰＴＰ１Ｂ活性における変化も観察され た。これらの変化は、ＰＴＰ１Ｂに特異的であり、密接に関連したホモログ（６ ５％の同一性）ＴＣ−ＰＴＰまたは、ＳＨＰ−１、ＬＳＨＰ−２およびＰＴＰ− ＰＥＳＴを含む他の試験されたＰＴＰｓには見られなかった。さらに、ＣＭＬ患 者由来のＰｈ＋ Ｂ−リンパ系細胞において、同じ患者由来のＰｈ− 細胞と比 較してＰＴＰ１Ｂの発現増加が観察された。 ＰＴＰ１Ｂレベルにおける変化は、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌにより特異的に 誘導され、ｖ−ａｂｌ、ｖ−ｓｒｃ、またはｍｙｃなどの他のオンコプロテイン を含む他のＰＴＫｓを発現する細胞に見られなかった。Ｒａｔ１細胞におけるｐ ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌのリジンからアルギニンへの不活性な変異体型の発現が 、ＰＴＰ１Ｂレベルを変えなかったので、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌのＰＴＫ活 性は、ＰＴＰ１Ｂの発現増加に必須であった。ＰＴＰ１Ｂレベルにおける増加は 、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌの誘導に対する迅速な応答である。ｐ２１０ ｂｃ ｒ：ａｂｌの温度感受性変異体型を発現するＢａＦ３細胞が、ＰＴＫに関して許 容される温度へシフトされる場合、ＰＴＰ１Ｂレベルは、ＰＴＫの活性型の出現 に一致して１２〜２４時間以内に増加することが観察された。これらの（ＴＨｅ ｓｅ）データはＰＴＰ１Ｂレベルを変えることが、細胞の長期順応より、むしろ ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌの出現に対する相対的に迅速な応答であることを示す 。 ＣＯＳ細胞における一過性コトランスフェクション実験において、ＰＴＰ１Ｂ は、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌを脱リン酸化するが、ｖ−ａｂｌを脱リン酸化し ない。ＰＴＰ１Ｂ Ｄ１８１Ａ変異体をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、 精製し、（ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌを過剰発現する）Ｍｏ７−ｐ２１０細胞の ライゼートとインキュベートした場合、変異体ＰＴＰとｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂ ｌとの複合体が単離された。対照的に、ライゼートにも存在するチロシンリン酸 化ｃ−ａｂｌは変異体ＰＴＰと結合しなかった。ＰＴＰ１Ｂとｐ２１０ ｂｃｒ ：ａｂｌとの相互作用は、バナジウム酸によりブロックされ、該相互作用がＰＴ Ｐの活性部位に関与することを示唆した。 ＣＯＳ細胞における一過性共発現ののち、ＰＴＰ１Ｂ Ｄ１８１Ａはｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌと複合体を形成した。初期のデータは、ｐ２１０ ｂｃｒ：ａ ｂｌのＹ１７７Ｆ変異体型がＰＴＰ１ｂ Ｄ１８１Ａと相互作用しなかったこと を示し、このチロシン残基がＰＴＫにおける結合部位の構成要素であることを示 唆した。ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌにおけるこのチロシン残基は、イン・ビボで リン酸化され、かつＧＲＢ２に対するドッキング部位として役に立つことを示し た。ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌにおけるｐＴｙｒとＧＲＢ２のＳＨ２ドメインに おける直接の相互作用は、ＰＴＫの形質転換活性に必須である。ＰＴＰ１Ｂ Ｄ １８１Ａとｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌとの相互作用は、ＰＴＫとＧＲＢ２との関 連に干渉する。要約すると、これらのデータはｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌがＰＴ Ｐ１Ｂの生理学的基質であり、ＰＴＰ１Ｂがイン・ビボでオンコプロテインＰＴ Ｋのアンタゴニストとして機能するであろうことを示唆する。ＲＣＭＬに対する ３７ｋＤａ ＰＴＰ１Ｂ変異体のＶｍａｘ、ＫｍおよびＫｃａｔを図２に示す。ＰＴＰ１ＢおよびＥＧＦレセプター ＣＯＳ細胞におけるＰＴＰ１Ｂ Ｄ１８１Ａの発現は、１８０ｋＤａタンパク 質ならびに１２０および７０ｋＤａのタンパク質におけるチロシル残基の促進さ れたリン酸化を導く。ＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂ Ｄ１８１Ａ融合タンパク質をＣＯＳ 細胞で発現し、グルタチオン−セファロースで沈澱した場合、１８０ｋＤａ、な らびにより少量のｐ１２０およびｐ７０を共沈殿した。該ｐ１８０タンパク質を イムノブロッティングにより、上皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターとして同定し た。該ｐ１２０およびｐ７０タンパク質の同定は明らかではない；しかしながら 、後者はｓｒｃ、ｐ６２またはパキシリンではない。 ＣＯＳ細胞におけるＰＴＰ１Ｂ Ｄ１８１Ａの発現は、そのリガンドであるＥ ＧＦの非存在下にＥＧＦレセプターのチロシンリン酸化を誘導し、変異体ＰＴＰ がインタクト細胞において、その効果を発揮し、溶解後には発揮していないこと を示唆する。均等なＤ１９９Ａ ＰＴＰ−ＰＥＳＴ変異体はＥＧＦレセプターと 相互作用せす、この基質相互作用の特異性を示唆する。 ＥＧＦレセプターの自己リン酸化はＰＴＰ１Ｂ Ｄ１８１Ａとの相互作用のた めに要求される。キナーゼが作用しないまたは自己リン酸化部位が欠失されたレ セプターの変異体はＰＴＰ１Ｂ Ｄ１８１Ａと相互作用しない。ｖ−ｓｒｃ発現 細胞において、過度のチロシンリン酸化タンパク質が観察されたが、ＥＧＦレセ プターのリン酸化は検出されなかった。これらの条件下で、ＰＴＰ１Ｂ Ｄ１８ １Ａは、７０ｋＤａチロシンリン酸化タンパク質に優勢に結合した。 本研究の結果、ＰＴＰ１Ｂは、おそらく乳癌を含む多くの疾患の経路を含む、 ＥＧＦ誘導シグナル伝達経路を調節することができると思われる。ＰＴＰ−ＰＥＳＴによる１３０ｋＤａホスホチロシン含有タンパク質の選択的な 脱リン酸化 イン・ビトロのＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質特異性を調べるため、過バナジウム酸 塩処理ＨｅＬａ細胞ライゼートのアリコートを氷上でインキュベートし、モノク ローナル抗ホスホチロシン抗体Ｇ１０４を用いて細胞ライゼートのイムノブロッ ティングにより判断されたように５０−１００の異なるホスホチロシン含有タン パク質を生じた。ついで、精製全長ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（組換えバキュロウイルス を用いてＳｆ９細胞で発現した）、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ触媒ドメイン、またはＰＴ Ｐ１Ｂ触媒ドメイン（３７ｋＤａ型）をライゼートに添加し、アリコートを種々 の時点で除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ホスホチロシンイムノブロッティング により解析した。 他のすべてのバンドの強度は、６０分のＰＴＰ−ＰＥＳＴとのインキュベーシ ョン後でさえ、基本的には変化しなかったが、驚くべきことに、顕著な１３０ｋ Ｄａホスホチロシンバンド（ｐ１３０）が、１０分以内にＰＴＰ−ＰＥＳＴによ り選択的に脱リン酸化された。より高濃度（１００倍を超える）のＰＴＰ−ＰＥ ＳＴとの長いインキュベーションは、ライゼートから全ホスホチロシンバンドの 完全な除去に帰した。しかしながら、試験した全条件下で、ｐ１３０が他のすべ ての存在するバンドよりも迅速に脱リン酸化されることが見出された。 さらに、ＰＴＰ−ＰＥＳＴによるｐ１３０の選択的な脱リン酸化は、基本的に 酵素の触媒ドメインのみを含むホスファターゼの末端型（アミノ酸残基１−３０ ５）を用いて観察された。この結果は、この解析でＰＴＰ−ＰＥＳＴにより呈示 された厳密な基質選択性がホスファターゼ触媒ドメインの本質的な性質であるこ とを示唆し、一方Ｃ−末端の５００アミノ酸残基は酵素の基質特異性への認識で きる影響をほとんどもたない。 ＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０との相互作用の特異性が、脱リン酸化反応におけ るＰＴＰ１Ｂの触媒ドメイン（アミノ酸残基１−３２１）を用いて扱われた。Ｐ ＴＰ−ＰＥＳＴに使用された濃度と同様のモル濃度で添加した場合、ＰＴＰ１Ｂ は、完全かつ迅速に（１５分以内に）過バナジウム酸塩処理ＨｅＬａライゼート に存在するホスホチロシン含有タンパク質の多くを脱リン酸化することが見出さ れた。さらに、ｐ１３０の脱リン酸化のタイムコースは、ＰＴＰ１Ｂにより脱リ ン酸化された他のホスホチロシンのタイムコースよりも、有意により迅速ではな かった。しかしながら、これらのイン・ビトロでの脱リン酸化の結果は、複数の 理由のため、イン・ビボでのＰＴＰＢ１の基質特異性の本当の説明ではないこと を注意すべきである。まず、単離された触媒サブユニットのみを、この特別実験 に用いた。さらに、イン・ビボの基質特異性は、ＰＴＰと潜在的な基質の両方の 細胞内分布によって、かなり異なるであろう。すなわち、イン・ビトロでの脱リ ン酸化実験は、ＰＴＰは脱リン酸化することができるが、イン・ビボで接近する ことができないであろう基質を利用するであろう。異なる生理学的な情況に依存 して基質特異性が相違する現象は、このデータとＰＴＰ１Ｂが３つのタンパク質 のみに特異性を示した前記イン・ビボでのＰＴＰ１Ｂの研究との比較により説明 される。ｐ１３０^casとしてのホスホチロシン含有ｐ１３０タンパク質の基質トラップに よる同定 過バナジウム酸塩処理ＨｅＬａ細胞ライゼートをアニオン交換クロマトグラフ ィーで分画し、画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ホスホチロシンまた は抗ｐ１３０^cas抗体とのイムノブロッティングにより解析した。ついで、解析 した全試料のアリコートを、共有結合的にカップリングしたプロテインＡ−セフ ァロース／抗体（ＡＧ２５）ビーズと結合した、Ａｓｐ１９９をアラニンに改変 した全長ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）を含有した、基質トラップＰＴＰ−Ｐ ＥＳＴ変異体を含むアフィニティーマトリックスとインキュベートした。ついで 、ＰＴＰ−ＰＥＳＴに関連したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ホスホチ ロシンまたは抗ｐ１３０^cas抗体とのイムノブロッティングにより解析した。 カラム画分の抗ホスホチロシンイムノブロッティングにより、ｐ１３０ホスホ チロシンタンパク質バンドが画分１１−１４（約０．３Ｍ ＮａＣｌ）で１つの ピークとして溶出したことが示された。ＨｅＬａライゼートにおけるチロシンリ ン酸化ｐ１３０の発生量の観点から、おそらくｐ１３０が以前に同定されたホス ホチロシン含有１３０ｋＤａタンパク質を示すであろうと思われる。複数の潜在 的な候補が、文献で同定され、フォーカルアドヒーションキナーゼｐ１２５^FAK 、ｒａｓ−ＧＡＰ、ｇｐ１３０およびｐ１３０^casを含む。これらの候補のなか で、ｐ１３０^casは、ｖ−ｃｒｋ〔マイヤー（Ｍａｙｅｒ）およびハナフサ（Ｈ ａｎａｆｕｓａ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２ ６３８−２６４２（１９９０）；マイヤー（Ｍａｙｅｒ）ら，Ｎａｔｕｒｅ ３ ３２ ：２７２−２７５（１９８８）〕およびｓｒｃ〔カンナー（Ｋａｎｎｅｒ） ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３３２８−３３３２ （１９９０）；レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ ｌ． ９：３９５１−３９５８（１９８９）〕形質転換繊維芽細胞、インテグリ ン媒介細胞接着〔ノジマ（Ｎｏｊｉｍａ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７ ０ ：１５３９８−１５４０２（１９９５）；ペッチ（Ｐｅｔｃｈ）ら，Ｊ．Ｃｅ ｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：１３７１−１３７９（１９９５）；ブオリ（Ｖ ｕｏｒｉ）およびルオスラーチ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ． ２７０：２２２５９−２２２６２（１９９５）〕およびＰＤＧＦ刺激３Ｔ ３細胞〔ランキン（Ｒａｎｋｉｎ）およびロゼンガート（Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ） ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：７０４−７１０（１９９４）〕を含む広 く多様な系で特定の顕著なホスホチロシンバンドとして同定された。 したがって、ｐ１３０^casに対応するｐ１３０ホスホチロシンバンドをｐ１３ ０^casに対する抗体を用いてＭｏｎｏＱ画分をイムノブロットすることにより試 験した。ｐ１３０^casに対応する１３０ｋＤａバンドはｐ１３０チロシンリン酸 化バンドとして同じ画分に溶出し、類似のみかけの分子量を呈示し、それらが同 じタンパク質を示すであろうと示唆される。さらに、これらの画分由来の免疫沈 降したｐ１３０^casは、チロシル残基でリン酸化されることが見出された。 ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）の変異体型は、部位特異的変異導入により生 成され、該変異体酵素は組み換えバキュロウイルスを用いて発現後、精製された 。基質として、チロシンリン酸化ＲＣＭ−リゾチームを用いてアッセイした場合 、精製変異体酵素は、野生型酵素の比活性〔ガートン（Ｇａｒｔｏｎ）およびト ンクス（Ｔｏｎｋｓ）ら，未公開データ〕よりも約１０，０００倍低い比活性を 示した。この精製タンパク質を、プロテインＡ−セファロースビーズに共有結合 的にカップリングした抗ＰＴＰ−ＰＥＳＴモノクローナル抗体（ＡＧ２５）を含 有したアフィニティーマトリックスと結合し、ついで各ＭｏｎｏＱ画分とインキ ュベートした。インキュベーション４５分後、変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴに関連す るタンパク質を遠心分離により回収し、ビーズを洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料 緩衝液を添加した。ついで、関連タンパク質をモノクローナル抗ホスホチロシン 抗体Ｇ１０４を用いてイムノブロッティングにより解析した。 変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質は、ｐ１３０^casと一致する分子量（１３ ０ｋＤａ）およびＭｏｎｏＱ溶出画分（画分１１−１４）の単一のホスホチロシ ン含有タンパク質と関連することが見出された。ｐ１３０^cas抗体を用いたＰＴ Ｐ−ＰＥＳＴ関連タンパク質のイムノブロッティングは、変異体ＰＴＰ−ＰＥＳ Ｔによりトラップされた１３０ｋＤａチロシンリン酸化タンパク質が実際にｐ１ ３０^casであることを示した。さらに、これらのデータは、ｐ１３０^casが潜在的 に生理学的に関連するＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質であるという仮説を支持する。チロシンリン酸化ｐ１３０^casとの特異的な相互作用に関するＰＴＰ−ＰＥＳＴ の構造的特徴の決定 さらに、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの種々の精製した変異体型を用いた基質トラップ実 験で、過バナジウム酸塩処理ＨｅＬａライゼート由来のタンパク質を沈澱させて 、ｐ１３０^casとＰＴＰ−ＰＥＳＴとの相互作用を調べた。複数のアフィニティ ーマトリックスを過バナジウム酸処理ＨｅＬａ細胞ライゼートとインキュベート し、ブーズに関連するタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ホスホチロシンまた は抗ｐ１３０^cas抗体でイムノブロッティングすることにより解析した。 野生型全長ホスファターゼは、チロシンリン酸化ｐ１３０^casとの安定な関連 ができないことが見出されたが、一方、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）変異体 タンパク質と活性部位システイン残基を欠く（Ｃ２３１Ｓ）変異体の両方がライ ゼート由来のｐ１３０^casを特異的に沈澱した。野生型ホスファターゼがチロシ ンリン酸化ｐ１３０^casを沈澱させることができないことは、ｐ１３０^casがＰＴ Ｐ−ＰＥＳＴにより脱リン酸化されてすぐ終わるであろうＰＴＰ−ＰＥＳＴとチ ロシンリン酸化ｐ１３０^casとの正常の相互作用の一過性の性質をおそらく反映 するであろう。 ＰＴＰ−ＰＥＳＴの末端の５００アミノ酸は、ｓｒｃホモロジー−３（ＳＨ３ ）ドメイン結合配列と似た複数のプロリン−リッチ領域を含むので、ＰＴＰ−Ｐ ＥＳＴとｐ１３０^casとの相互作用の特異性がこれらのセグメントのｐ１３０^cas のＳＨ３ドメインとの関連にある程度依存するであろうことがもっともらしい。 したがって、ＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０^casとの観察された特異的な相互作用 におけるＰＴＰ−ＰＥＳＴのＣ−末端セグメントの可能な貢献は、野生型と変異 体（Ｄ１９９Ａ）型との両方において、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの触媒ドメインのみを 含むＧＳＴ融合タンパク質を用いたさらなる基質トラップ実験で扱われた。野生 型融合タンパク質とＧＳＴ単独の両方がｐ１３０^casを沈澱しなかったが、ＧＳ Ｔと融合したＰＴＰ−ＰＥＳＴの変異体触媒ドメインは、ｐ１３０^casホスホチ ロシンバンドを特異的に沈澱することが見出された。したがって、これらの実験 で観察されたＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０^casとの特異的な相互作用は、 ＰＴＰ−ＰＥＳＴの触媒ドメインの固有の性質であるように思われ、イン・ビト ロでのｐ１３０^casの脱リン酸化に対して活性なＰＴＰ−ＰＥＳＴ触媒ドメイン の観察された選択性を推定する。変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴとチロシンリン酸化ｐ１３０^casとの相互作用の特異性 過バナジウム酸塩処理ＨｅＬａ細胞ライゼートにおけるチロシンリン酸化ｐ１ ３０^casの相対的な豊富さの観点から、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ不活性変異体タンパク 質とｐ１３０^casとの観察された選択的結合が、酵素に指示された（ＰＴＰ−Ｐ ＥＳＴの本来の基質選択性を反映する）よりむしろ基質に指示された（ライゼー トに存在する他のホスホチロシン含有タンパク質と比較してこの潜在的な基質の 豊富さを反映する）可能性が考えられた；この可能性が２つの方法で扱われた。 まず、ＰＴＰ１Ｂの触媒ドメインの不活性な変異体型を用いて、過バナジウム酸 塩処理ＨｅＬａライゼート由来の酵素の潜在的な基質をトラップした。再び、Ｐ ＴＰ１Ｂホスファターゼドメイン（ＰＴＰ−ＰＥＳＴのものと類似したＣｙｓま たはＡｓｐ変異を含有した）の変異体改変体は、多くのチロシンリン酸化タンパ ク質と関連したが、野生型ホスファターゼがいかなるホスホチロシン含有タンパ ク質との安定な相互作用をできないことが見出された。これは、類似の効力を有 するライゼート由来の全ホスホチロシン含有タンパク質を基本的に沈澱するよう に思われるＰＴＰ１Ｂのアスパラギン酸変異体（Ｄ１８１Ａ）に対して特に明ら かである。これらのデータは、全ＰＴＰの触媒ドメインにより共有された特徴よ りもむしろＰＴＰ−ＰＥＳＴ触媒ドメインに独特の性質であると思われるＰＴＰ −ＰＥＳＴとｐ１３０^casとの相互作用の特別の性質を強調する。 さらに、ＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０^casとの相互作用の特異性は、複数の異 なる細胞株（Ｗｉ３８、２９３、ＣＯＳ、ＭＣＦ１０Ａ、Ｃ２Ｃ１２、ＭｖＬｕ ）の過バナジウム酸塩処理後に扱い、それぞれの場合におけるチロシンリン酸化 タンパク質の異なる整列を生じた；得られたライゼートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後 、抗ホスホチロシンイムノブロッティングにより解析した。アリコートをＰＴＰ −ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）アフィニティーマトリックスまたは対照マトリックス とインキュベートし、ＰＴＰ−ＰＥＳＴと関連するチロシンリン酸化タンパク質 は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと前記抗ホスホチロシンまたは抗ｐ１３０^cas抗体でのイ ムノブロッティングで解析した。 それぞれの場合、アフィニティーマトリックス単独ではいかなるホスホチロシ ン含有タンパク質をも沈澱しないが、Ｄ１９９Ａ変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパ ク質は、ことなる細胞株において、１２０〜１５０ｋＤａの間の見かけの分子量 を有する１つの幅広いホスホチロシンバンドを沈澱した。 ｐ１３０^cas抗体との沈殿物のイムノブロッティングは、全ての細胞ライゼー ト由来の沈澱したタンパク質がｐ１３０^casに対応したことを表した；異なる細 胞株間の観察された分子量の多様性は、おそらくｐ１３０^casの分子量の種間の 相違または異なる一方のスプライスされた型の発現のいずれかを反映するだろう 〔サカイ（Ｓａｋａｉ）ら，ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３７４８−３７５６（１９ ９４）〕。 ＰＴＰ−ＰＥＳＴ沈殿物におけるチロシンリン酸化ｐ１３０^casの相対的な発 生量は、ライゼートにおけるｐ１３ｏca’タンパク質の発生量とおおよそ関連す るように思われる（データ未開示）。驚くべきことに、ライゼート中のチロシン リン酸化ｐ１３０^casの発生量にもかかわらず、ほとんどｐ１３０^casタンパク質 を含まないが、他の過剰なチロシンリン酸化タンパク質の広い多様性を呈示した ２９３細胞ライゼートにおいてさえ、ｐ１３０^casは、不変に、沈殿物中の唯一 のホスホチロシン含有タンパク質であった。同様に、（ライゼートの抗ホスホチ ロシンイムノブロッティングにより検出できない量で、チロシンリン酸化ｐ１３ ０^casを含む）過バナジウム酸塩処理２９３細胞のライゼートを活性なＰＴＰ− ＰＥＳＴとインキュベートした場合、いかなるホスホチロシンバンドの目に見え る脱リン酸化をも生じなかった〔ガートン（Ｇａｒｔｏｎ）およびトンクス（ Ｔｏｎｋｓ），未公開データ〕。これらの結果は、ＰＴＰ−ＰＥＳＴのｐ１３０^cas に対するアフィニティーが存在するいかなる他の基質に対するよりも実質的 に大きいことを示し、さらに、ＰＴＰ−ＰＥＳＴのｐ１３０^casに対する驚くべ き基質選択性を強調する。変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴに関連するチロシンリン酸化ｐ１３０^casのバナジウム 酸塩阻害 本研究の一貫した観察は、不活性な変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴとは対照的に、野 生型酵素がチロシンリン酸化ｐ１３０^casとの安定な複合体に関連せず、観察さ れた関連が活性な部位特異的であることを示した。この可能性を調べるため、変 異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）を、過バナジウム酸塩処理ＨｅＬａ細胞ラ イゼートの添加に先立ち、種々の濃度でＰＴＰ阻害剤バナジウム酸塩とインキュ ベートした。ついで、ｐ１３０^casのＰＴＰ−ＰＥＳＴとの関連の程度を解析し た。共有結合的にカップリングしたプロテインＡ−セファロース／抗体（ＡＧ２ ５）ビーズと結合した全長ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（Ｄ１９９Ａ）を含有したＰＴＰ- ＰＥＳＴアフィニティーマトリックスを、様々に変化させた濃度のオルトバナジ ウム酸ナトリウムの存在下に氷上で１０分間インキュベートした。ついで試料を アリコートの過バナジウム酸塩処理ＨｅＬａ細胞ライゼートでインキュベートし た；関連タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ホスホチロシンまたは抗ｐ１３ ０^cas抗体とのイムノブロッティングで解析した。さらに、野生型ＰＴＰ−ＰＥ ＳＴの活性をチロシンリン酸化³²Ｐ標識ＲＣＭ−リゾチームを基質として用いて 同じ条件下に決定した。 関連は、野生型ＰＴＰ−ＰＥＳＴのバナジウム酸塩阻害の濃度依存性と同様の 濃度依存性で、バナジウム酸塩により強く破壊されることが見出され、完全な破 壊は１０ｍＭバナジウム酸塩で観察された。バナジウム酸塩によるＰＴＰ阻害は 、おそらくバナジウム酸と酵素の活性部位システイン残基との直接の相互作用に 起因するので〔デニュ（Ｄｅｎｕ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ９３：２４９３−２４９８（１９９６）〕、この結果は、変異体ＰＴ Ｐ−ＰＥＳＴとチロシンリン酸化ｐ１３０^casとの安定な関連がＰＴＰ−ＰＥＳ Ｔの中の活性部位残基、具体的には活性部位システイン残基とｐ１３０^cas内の ホスホチロシン部分との直接の相互作用により仲介されるという仮説を支持する 。ＣＯＳ細胞中における内因性ｐ１３０^casとトランスフェクト変異体ＰＴＰ−Ｐ ＥＳＴとの関連 前記記載の研究はｐ１３０^casがＰＴＰ−ＰＥＳＴの潜在的で生理学的に有意 な基質を表わすことを強く示唆する。インタクト細胞において、ＰＴＰ−ＰＥＳ Ｔがｐ１３０^casと相互作用するかどうかを評価するために、ＣＯＳ細胞をＰＴ Ｐ−ＰＥＳＴの野生型または変異体型（Ｄ１９９ＡまたはＣ２１５Ｓ）をコード するプラスミドでトランスフェクトした。溶解に３０分先立ち、過バナジウム酸 塩で該細胞を処理し、ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質を免疫沈降させ、得られた沈 降物の抗ホスホチロシンイムノブロッティングにより関連チロシンリン酸化タン パク質を解析した。さらに、ライゼートを共有結合的にカップリングしたプロテ インＡ−セファロース／抗ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（ＡＧ２５）ビーズとインキュベー トし、関連タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥと抗ホスホチロシン抗体でのイムノブ ロッティングとで解析した。 これらの条件下で、ｐ１３０^casに対応するホスホチロシン含有バンドは、再 びＣ２３１Ｓ ＰＴＰ−ＰＥＳＴタンパク質と関連する能力に特有であり、ｐ１ ３０^casが多くの別の可能な基質の存在下での細胞内情況において基質としてＰ ＴＰ−ＰＥＳＴにより特異的に選択されうることが示唆された。ＰＴＰ−ＰＥＳ Ｔの野生型またはＤ１９９Ａ型のいずれも過バナジウム処理ＣＯＳ細胞でのチロ シンリン酸化ｐ１３０^casと安定な相互作用ができなかった。 これらの条件下に野生型およびＤ１９９Ａ ＰＴＰ−ＰＥＳＴの両方のチロシ ンリン酸化ｐ１３０^casとの結合は、ｐ１３０^casのホスホチロシン残基の結合を 効果的に排除する、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの活性部位システイン残基に結合した過バ ナジウム酸の存在により、ほとんど妨げられるようである〔デニュー（Ｄｅｎｕ ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２４９３−２４ ９８（１９９６）〕。Ｃ２３１Ｓ変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴが過バナジウム酸の存 在下のｐ１３０^casとの安定な複合体で会合する能力は、この変異体タンパク質 が過バナジウム酸塩により大きく影響を受けないことを示唆し、バナジウム酸イ オンによるＰＴＰｓの阻害の通常段階が、バナジウム酸とＰＴＰ活性部位のシス テイン残基のチオレートアニオンとの直接的な相互作用に決定的に依存すること を示唆する。したがって、これらの考察は、完全な活性な部位指向性であると思 われ、それゆえにｐ１３０^casに対するＰＴＰ−ＰＥＳＴの本来の本質的な高度 に限定された基質選択性を反映するＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ１３０^casとの排他的 相互作用の存在へのさらなる支持を与える。 本明細書記載の結果は、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの生理学的に関連した基質としてｐ １３０^casに係わる。さらに、広く多様な細胞株におけるＰＴＰ−ＰＥＳＴとｐ １３０^casとの相互作用の観察されたストリンジェンシーおよび排他性は、他の 有意なＰＴＰ−ＰＥＳＴ基質が存在するであろう可能性が現時点では除外できな いが、ＰＴＰ−ＰＥＳＴに対する特有の高度なアフィニティー基質であろうこと を示唆する。特に、過バナジウム酸塩処理細胞が、総ての可能なチロシンリン酸 化タンパク質の完全なスペクトラムを呈示するかどうかは明らかではない；過バ ナジウム酸塩処理が、細胞内では、ある程度まで構成的にリン酸化されるが通常 迅速に脱リン酸化されるタンパク質のチロシンリン酸化における増加にのみ、お そらく帰するであろうため、実際に、これは有りそうにもない。したがって、過 バナジウム酸塩処理細胞から欠如された潜在的な基質は、リガンド刺激レセプタ ーＰＴＫｓ、最近述べられたカルシウム制御キナーゼＰＹＫ２〔レヴ（Ｌｅｖ） ら，Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７３７−７４５（１９９５）〕などの通常不活性状 態で存在するタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫｓ）の基質を含むであろう。 これらの考察に関わらず、少なくとも１００個の異なる潜在的な基質（その多く がおそらく多数のリン酸化の部位を含む）を組み合わせた総数を含むいくつかの 異なる細胞株のライゼートから１つの基質としてｐ１３０^casを排他的に選択す るＰＴＰ−ＰＥＳＴの能力は、ＰＴＰ−ＰＥＳＴの基質特異性が高度に限定され ることを明らかに示す。 多くの細胞内ＰＴＰは、特定の細胞下の位置内での厳格な制限により、それら の基質の利用可能性が限定される；例えば、小胞体の細胞質表面に局在するＰＴ Ｐ１Ｂ〔フランジョーニ（Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ）ら，Ｃｅｌｌ ６８：５４５− ５６０（１９９２）〕およびどちらのオルタナティブスプライス型が発現される かに依存する、核のＴＣＰＴＰ〔ティルマン（Ｔｉｌｌｍａｎ）ら，Ｍｏｌ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １４：３０３０−３０４０（１９９４）〕または小胞体に 局在するＴＣＰＴＰ〔ローエンゼン（Ｌｏｒｅｎｚｅｎ）ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂ ｉｏｌ． １３１：６３１−６４３（１９９５）〕が挙げられる。一方、あるＰ ＴＰｓは、高度に制御されるようであり、認めうる活性を示すことができる前の 活性化が要求される。例えば、ＳＨ２ドメイン含有ＰＴＰｓ、ＳＨＰ１およびＳ ＨＰ２は、イン・ビトロで相対的に低い活性を呈示するが、Ｃ−末端切断〔ザオ （Ｚｈａｏ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２８１６−２８２０（１ ９９３）〕、一定のリン脂質の付加〔ザオ（Ｚｈａｏ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４２５１−４２５５（１９９３）〕、また は適切なホスホチロシン含有ペプチドのＳＨ２ドメイン媒介結合〔レクライダー （Ｌｅｃｈｌｅｉｄｅｒ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２１４７８ −２１４８１（１９９３）〕を含む、複数の機構により有意に活性化されうる。 しかしながら、、ＰＴＰ−ＰＥＳＴは、イン・ビトロで高い比活性（３５，０ ００Ｕ／ｍｇ）を呈示し、細胞内で優勢な（９０−９５％）可溶性ＰＴＰである 〔ガートン（Ｇａｒｔｏｎ）およびトンクス（Ｔｏｎｋｓ），未公開データ〕； したがって、原則として、細胞質に接近しうるいかなる基質にも潜在的に作用す るであろう。この接近能は、ＰＴＰ−ＰＥＳＴが本質的に不自然な基質特異性を 有する必要性に一部に従うであろう。多くの他のチロシンリン酸化タンパク質の 存在下に細胞内情況において、変異体ＰＴＰ−ＰＥＳＴが排他的にｐ１３０^cas と会合することができるという証明は、それらの基質がＰＴＰ−ＰＥＳＴに十分 に接近できるけれども、該酵素の狭い基質特異性が、細胞内のチロシンリン酸化 タンパク質の大部分のリン酸化段階にごくわずかな影響を有するＰＴＰ−ＰＥＳ Ｔに帰するという示唆である。 ｐ１３０^casのチロシンリン酸化のレベルとｃｒｋまたはｓｒｃの異なる型を 発現する細胞における形質転換の程度との一般的な相関関係があるが〔カンナー （Ｋａｎｎｅｒ）ら，ＥＭＢＯ Ｊ． １０：１６８９−１６９８（１９９１） ；マイヤー（Ｍａｙｅｒ）およびハナフサ（Ｈａｎａｆｕｓａ），Ｊ．Ｖｉｒｏ ｌ． ６４：３５８１−３５８９（１９９０）〕、ｖ−ｃｒｋおよびｖ−ｓｒｃ オンコジーンによる細胞内形質転換におけるｐ１３０^casの役割は不明である。 さらに、ｐ１３０^casの促進されたチロシンリン酸化も、ｃ−Ｈａ−ｒａｓおよ びオルニチンデカルボキシラーゼ過剰発現により形質転換された細胞において観 察されている〔オービネン（Ａｕｖｉｎｅｎ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ． １５：６５１３−６５２５（１９９５）〕。これらの細胞におけるｐ１３０^cas をコードするアンチセンスｃＤＮＡの発現は、形質転換された表現型の部分 的な復帰に帰する。これらの観察は、ｐ１３０^casの異常なチロシンリン酸化が 複数の異なる機構により形質転換された細胞の共通の特徴であることおよびｐ１ ３０^casが形質転換状態の完全な明示に要求されるであろうことを示唆する。し たがって、ＰＴＰ−ＰＥＳＴによるｐ１３０^casの脱リン酸化は、多様なオンコ ジーンの形質転換効果を打ち消す潜在的に重要な制御機構である。 ｐ１３０^casのチロシンリン酸化は、細胞該マトリックスタンパク質へのイン テグリン媒介細胞接着後の繊維芽細胞に観察された〔ノジマ（Ｎｏｊｉｍａ）ら ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：１５３９８−１５４０２（１９９５）； ペッチ（Ｐｅｔｃｈ）ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：１３７１− １３７９（１９９５）；ブオリ（Ｖｕｏｒｉ）およびルオスラーティ（Ｒｕｏｓ ｌａｈｔｉ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：２２２５９−２２２６２（ １９９５）〕。これらの条件下に、チロシンリン酸化ｐ１３０^casを優先的に認 識する抗体（４Ｆ４）〔カンナー（Ｋａｎｎｅｒ）ら，ＥＭＢＯ Ｊ． １０： １６８９−１６９８（１９９１）；ペッチ（Ｐｅｔｃｈ）ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓ ｃｉｅｎｃｅ １０８：１３７１−１３７９（１９９５）〕を用いて、リン酸化 ｐ１３０^casがフォーカルアドヘション〔ペッチ（Ｐｅｔｃｈ）ら，Ｊ．Ｃｅｌ ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８：１３７１−１３７９（１９９５）〕に局在される ことが示されたが、一方、分画研究により、非リン酸化ｐ１３０^casの大部分の 正常な細胞局在が細胞質ゾルであることが示された〔サカイ（Ｓａｋａｉ）ら，ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３７４８−３７５６（１９９４）〕。さらに、ｃｒｋ− 形質転換繊維芽細胞において、チロシンリン酸化ｐ１３０^casは不溶性画分にの み検出され〔サカイ（Ｓａｋａｉ）ら，ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３７４８−３７ ５６（１９９４）〕、ｐ１３０^casの細胞接着および形質転換の両方が媒介する リン酸化が細胞質ゾルからフォーカルアドヒージョンへのタンパク質の再分布に 関連することを示唆する。 チロシンリン酸化ｐ１３０^casの再分布が、Ｃ−末端フォーカルアドヒージョ ン標的ドメインによって構成的にフォーカルアドヒージョンに関連するであろう ＦＡＫとの会合により行なわれるであろう〔ヒルデブランド（Ｈｉｌｄｅｂｒａ ｎｄ），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２３：９９３−１００５（１９９３）； シャラー（Ｓｃｈａｌｌｅｒ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５１９２−５１９６（１９９２）〕。形質転換細胞と下記のイ ンテグリン媒介細胞接着との両方のフォーカルアドヒージョンにおけるチロシン リン酸化ｐ１３０^casの隔離は細胞のこの領域におけるシグナル伝達現象におけ るｐ１３０^casの役割を強く示唆する。チロシンリン酸化ｐ１３０^casの再分布の １つの結果は、豊富なプロテインチロシンキナーゼ活性を含有する細胞の領域へ のｐ１３０^casの局在化に加えて、おそらく該リン酸化タンパク質が細胞質ゾル のホスファターゼＰＴＰ−ＰＥＳＴに相対的に接近できないであろうことである 。これにより、ｐ１３０^casを脱リン酸化することにおけるＰＴＰ−ＰＥＳＴの 役割が、ｐ１３０^casの細胞質ゾルプールの適切でないチロシンリン酸化を阻害 することであろうという可能性を生じ、したがって、不適切な細胞の局在におけ るチロシンリン酸化ｐ１３０^casの周辺に集合したシグナル伝達複合体の形成を 阻害する。 複数の分裂促進因子は、潜在的にｐ１３０^casのチロシンリン酸化を刺激する 。これらはリゾホスファチジン酸〔ゼウファライン（Ｓｅｕｆｆｅｒｌｅｉｎ） およびローゼンガート（Ｒｏｘｅｎｇｕｒｔ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２ ６９ ：９３４５−９３５１（１９９４）〕、ブラジキニン〔リーブ−ランドバー グ（Ｌｅｅｂ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：２ ４３２８−２４３４４（１９９４）〕、およびボンベシン〔ザシャリー（Ｚａｃ ｈａｒｙ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１９０３１−１９０３４（ １９９２）〕などのヘテロ三量体Ｇタンパク質共役レセプターを介して作用する 試薬、ならびにレセプターチロシンキナーゼを活性化する成長因子、即ちＰＤＧ Ｆ〔ランキン（Ｒａｎｋｉｎ）およびローゼンガート（Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：７０４−７１０（１９９４）〕、ＥＧＦお よびＮＧＦ〔リボン（Ｒｉｂｏｎ）およびサルチエル（Ｓａｌｔｉｅｌ），Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：７３７５−７３８０（１９９６）〕を含む。こ れらの観察は、分裂促進シグナル伝達経路の制御におけるｐ１３０^casの役割を 示唆し、おそらくチロシンリン酸化ｐ１３０^casに基づくシグナル伝達複合体の 集合に関与するであろう。これらの複合体に関与するタンパク質の同定は行なわ れていないが、おそらくｃｒｋ〔リボン（Ｒｉｂｏｎ）およびサルチエル（Ｓａ ｌｔｉｅｌ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７３７５−７３８０（１９９ ６）〕およびその関連タンパク質〔フェラー（Ｆｅｌｌｅｒ）ら，Ｏｎｃｏｇｅ ｎｅ １０：１４６５−１４７３（１９９５）；ハセガワ（Ｈａｓｅｇａｗａ） ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １６：１７７０−１７７６（１９９６）； クヌドセン（Ｋｎｕｄｓｅｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：３２７ ８１−３２７８７（１９９４）；マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ． １４：５４９５−５５００（１９９４）；タナカ（Ｔａｎａｋ ａ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３４４３−３ ４４７（１９９４）〕などのＳＨ２ドメイン含有アダプタータンパク質が含まれ るであろう。したがってｐ１３０^casのチロシンリン酸化および脱リン酸化はか かる複合体の形成を制御することに潜在的に一定の役割をはたし、それにより分 裂促進シグナル伝達における下流の事象に影響する。均等物 当業者であれば単なる日常的な実験手段を用いることにより、本明細書記載の 本発明の具体的な態様に対する多くの均等物を認識し、確かめることができるで あろう。かかる均等物は、下記クレームにより包含されるものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年２月１２日（１９９８．２．１２） 【補正内容】 したがって、本明細書記載の組成物および方法は、ホスファターゼのＰＴＰフ ァミリーのメンバーのチロシンリン酸化基質を同定すること、ならびに同定され た基質の活性を制御することに有用である。さらに、本明細書記載の組成物およ び方法は、特定の疾患または不調、および治療の投与における使用のために、Ｐ ＴＰ／基質相互作用を促進または阻害するモジュレーターのスクリーニング方法 に関するチロシンリン酸化タンパク質を同定するために有用である。図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｅは、ＰＴＰｓの触媒ドメインの多重配列整列（配列番号：１〜３ ５）を示す。細胞質の真核生物のＰＴＰｓおよびＲＰＴＰｓのドメイン１を１つ のグループに、ＲＰＴＰｓのドメイン２を第２グループに、エルニシア（Ｙｅｒ ｓｉｎｉａ）ＰＴＰを３番目に組み合わせる。３つの全てのグループに渡って所 有された不変残基を小文字で示す。グループ内に不変でおよび高度に保存された 残基は、それぞれイタリックおよび太字で示した。エルニシアＰＴＰ配列内で、 細胞質およびＲＰＴＰドメイン配列間に不変または高度に保存された残基を、そ れぞれイタリックおよび太字で示す。該ペプチドと相互作用するＰＴＰ１Ｂの残 基の位置を小矢印で示し、整列の下に番号を付した残基はＰＴＰ１Ｂの残基に対 応する。 図２はＲＣＭＬに対する多種のＰＴＰ１Ｂ変異体のＶｍａｘおよびＫｍを示す 。発明の詳細な説明 酵素のＰＴＰファミリーは、ＰＴＰ触媒ドメインとして知られている約２５０ アミノ酸の共通の進化的に保存されたセグメントを含む。全ＰＴＰｓに渡って不 変である独自の特有の配列モチーフ、〔Ｉ／Ｖ〕ＨＣＸＡＧＸＸＲ〔Ｓ／Ｔ〕Ｇ （配列番号：３６）はこの保存されたドメイン内にある。このモチーフの中のシ ステイン残基は該ファミリーのメンバーにおいて不変であり、触媒に必須である ことが知られている。それは、入ってくる基質のリン酸部分を攻撃する求核分子 として作用する。部位特異的変異導入により、システイン残基をセリン（ＣＳ変 異体）またはアラニン（ＣＡ変異体）に変えた場合、得られるＰＴＰは触媒的に 減ずるが、少なくともイン・ビトロで、その基質と複合体化または結合する能力 を保持している。これらの結果は、ＰＴＰファミリーのメンバーであるＭＫＰ− １〔サン（Ｓｕｎ）ら，Ｃｅｌｌ ７５：４８７−４９３（１９９３）〕、なら びに他のＰＴＰｓに比較して確認されている。しかしながら、これらのＣＳ変異 体は、一般的にイン・ビトロでホスホチロシル基質に効果的に結合することがで きるが、多くの場合、かかる複合体はイン・ビボで単離することができない。し たがって、該ＣＳ変異体は、それらの適用性において限定され、ＰＴＰｓと基質 との全ての組合わせを単離するために使用されえない。 ＰＴＰ１Ｂ単独〔バーフォード（Ｂａｒｆｏｒｄ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６ ３ ：１３９７−１４０４（１９９４）〕およびホスホチロシン−含有ペプチドと の複合体〔ジア（Ｊｉａ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７５４−１７５８ （１９９５）〕の結晶構造が最近決定された。２７の不変残基を示したこれらの 構造〔バーフォード（Ｂａｒｆｏｒｄ）ら，１９９４〕のうち、１つはアスパラ ギン酸残基である。このアスパラギン酸残基は、ＰＴＰファミリーメンバーの触 媒ドメインにわたって不変である。即ち、ＰＴＰファミリーメンバーのアミノ酸 配列を整列させると、多様なＰＴＰ配列の整列に対して、整列を極大化すること を要求するシフトによって位置番号は異なるであろうが、アスパラギン酸残基は 、各ＰＴＰ中、対応する位置に存在する〔図（バーフォード（Ｂａｒｆｏｒｄ） ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ． ２：１０４３−１０５３（１９９ ５）由来）を参照のこと）。整列がいまだに公表されていない配列は、例えば、 ＧＥＮＥＷＯＲＫＳなどの入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、 他の公知のＰＴＰ配列で直ちに整列化しうる。 本明細書記載のように、「減じられた」活性は、ホスファターゼが野生型のホス ファターゼのＫｍと類似のＫｍを保持しているが、野生型の酵素に比較して少な くとも１０⁴の係数により減少されたＶｍａｘを有することを意味することを意 図する。これは、野生型ＰＴＰに比較して減少または完全に破壊された触媒活性 を含む。例えば、不変なアスパラギン酸残基はアラニン、バリン、ロイシン、イ ソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリ シン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン 、リジン、アルギニンまたはヒスチジンに変えるまたは変異させることができる 。 不変なアスパラギン酸残基が酵素のＫｍの顕著な変化を起こさないが、１分あ たり１未満（１分^-1未満）までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸に置換さ れる、本明細書記載の新規ＰＴＰｓは、さらに、他の変異、具体的には、ＰＴＰ ／基質複合体を安定化することを助けるものを含有することができる。例えは、 特有のモチーフにおける〔セリン／スレオニン〕残基のアラニン残基への変異は 、遷移状態の形成から遷移状態の破壊への脱リン酸化反応の律速段階を変え、そ れによりＰＴＰ／基質複合体を安定化させる。かかる変異は、不変なアスパラギ ン酸残基の置換、具体的には、複合体の安定化を助けること、複合体の観察およ ひ単離をし易くすることとを価値評価可能に組み合わせてもよい。 本発明に使用するために適切なＰＴＰｓは対応する位置に不変なアスパラギン 酸残基を有するいかなるＰＴＰをも含む。本明細書で規定するように、特有のモ チーフ、〔Ｉ／Ｖ〕ＨＣＸＡＧＸＸＲ〔Ｓ／Ｔ〕Ｇ（配列番号：３６）を含む場 合、ホスファターゼは、ＰＴＰファミリーのメンバーである。２重の特異性ＰＴ Ｐｓ、即ち、リン酸化チロシンとリン酸化セリンまたはスレオニンとの両方を脱 リン酸化するＰＴＰｓは、さらに、本発明における使用に適切である。適切なＰ ＴＰｓとしては、限定されないが、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ、ＰＴＰγ、 ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、ＰＴＰＸ１０およびＰＴＰＨ １が挙げられる。 【図１】【図１】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 不変のアスパラギン酸残基が、 ａ） 酵素のＫｍの顕著な変化を生じさせないが、１分あたり１未満までのＫｃ ａｔの減少を生じさせる；または ｂ） アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニ ン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイ ン、チロシン、グルタミン、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群 より選ばれる アミノ酸（例えば、アラニン）と置換されるプロテインチロシンホスファターゼ であって、該ホスファターゼがチロシンリン酸化基質に結合し、触媒的に減じら れるプロテインチロシンホスファターゼ。 ２． ＰＴＰ１Ｂ（および、例えば不変なアスパラギン酸残基は１８１位に存在 する）、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ（および、例えば不変なアスパラギン酸残基は１９９ 位に存在する）、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰμ、ＰＴＰＸ１、 ＰＴＰＸ１０ならびにＰＴＰＨ１からなる群より選ばれた、請求項１（ａ）記載 のプロテインチロシンホスファターゼ。 ３． ２３１位のアミノ酸がセリン残基に置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴホスファ ターゼである、請求項１（ｂ）記載のプロテインチロシンホスファターゼ。 ４． ａ） 少なくとも１種のチロシンリン酸化タンパク質と、不変のアスパラ ギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化を生じさせないが、１分あたり１未満 までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸（例えば、アラニン）に置換され る少なくとも１種のプロテインチロシンホスファターゼとを、該チロシンリン 酸化タンパク質と該プロテインチロシンホスファターゼとの複合体の形成に適 する条件下に組み合わせ、それにより組み合わせ物を生じる工程；ならびに ｂ） 該組み合わせ物における複合体の存在または非存在を決定する工程、 を含み、組み合わせ物における複合体の存在が、該チロシンリン酸化タンパク質 が複合体を形成するブロテインチロシンホスファターゼの基質であることを示す 、プロテインチロシンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸化タンパク質 を同定する方法。 ５． 該プロテインチロシンホスファターゼが請求項１〜３いずれかで規定され たものである、請求項４記載の方法。 ６． 該チロシンリン酸化タンパク質が、ｐ１３０^cas、ＥＧＦレセプター、ｐ ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ、ＭＡＰキナーゼおよびインシュリンレセプターからな る群より選ばれた、請求項４または請求項５記載の方法。 ７． ａ） 不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化を生じさせ ないが、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸（例え ば、アラニン）に置換される少なくとも１種のプロテインチロシンホスファタ ーゼ；ならびに ｂ） プロテインチロシンホスファターゼとチロシンリン酸化タンパク質との複 合体の存在または非存在の検出の使用に適する助剤 を含有してなる、例えば、プロテインチロシンホスファターゼが請求項１〜３い ずれかで定義されたものである、プロテインチロシンホスファターゼのチロシン リン酸化タンパク質基質を同定するキット。 ８． ａ） プロテインチロシンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸化 タンパク質を同定する工程； ｂ） 該チロシンリン酸化タンパク質と該プロテインチロシンホスファターゼと 試験対象の試薬とを、チロシンリン酸化タンパク質とプロテインチロシンホス ファターゼとの相互作用に適する条件下に組み合わせ、それにより組み合わせ 物を形成する工程； ｃ） 該組み合わせ物中の酵素活性量を決定する工程；ならびに ｄ） チロシンリン酸化タンパク質とプロテインチロシンホスファターゼとの相 互作用に適する条件下で、（ｃ）で決定した酵素活性量と試験対象の試薬の非 存在下の酵素活性量とを比較する工程、 を含み、酵素活性量の差異は、該試薬が該プロテインチロシンホスファターゼと 該チロシンリン酸化タンパク質との相互作用を変えることを示す、プロテインチ ロシンホスファターゼとチロシンホスファターゼとの相互作用を変える試薬を同 定する方法。 ９． ａ） プロテインチロシンホスファターゼの基質であるチロシンリン酸化 タンパク質を同定する工程； ｂ） チロシンリン酸化タンパク質とプロテインチロシンホスファターゼとの相 互作用に適する条件下で、該チロシンリン酸化タンパク質と、不変のアスパラ ギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化を生じさせないが、１分あたり１未満 までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸（例えば、アラニン）に置換され るプロテインチロシンホスファターゼと、試験対象の試薬とを組み合わせ、そ れにより組み合わせ物を形成する工程； ｃ） 該組み合わせ物において、該チロシンリン酸化タンパク質と該プロテイン チロシンホスファターゼとの結合の程度を決定する工程；ならびに ｄ） チロシンリン酸化タンパク質とプロテインチロシンホスファターゼとの相 互作用に適する条件下で、（ｃ）で決定した結合の程度と試験対象の試薬の非 存在下での結合の程度とを比較する工程、 を含み、結合の程度の差異は、該試薬が該プロテインチロシンホスファターゼ、 該チロシンホスファターゼと該チロシンリン酸化タンパク質との相互作用を変え ることを示す、プロテインチロシンホスファターゼとプロテインチロシンホスフ ァターゼの基質であるチロシンリン酸化タンパク質との相互作用を変える試薬を 同定する方法。 １０． 酵素活性量または結合の程度が、それぞれ： ａ） 試験対象の試薬の存在下において、該試薬の非存在下よりもより大きい場 合、プロテインチロシンホスファターゼとチロシンリン酸化タンパク質との相 互作用を促進する；または ｂ） 試験対象の試薬の存在下において、該試薬の非存在下よりもより少ない場 合、プロテインチロシンホスファターゼとチロシンリン酸化タンパク質との相 互作用を阻害する である、請求項８または９記載の方法。 １１． 例えば、ａ） チロシンリン酸化タンパク質の活性の減少が表示される 条件の処置；および／または ｂ） チロシンリン酸化タンパク質の活性を減少させる；および／または ｃ） 不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化を生じさせないが 、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸に置換される プロテインチロシンホスファターゼを哺乳類（例えば、ヒトなど）に投与し、 それにより複合体の形成がチロシンリン酸化タンパク質の活性を減少させる工 程を含むチロシンリン酸化タンパク質の活性を減少させる方法；および／また は ｄ） ｐ１３０^casリン酸化と関連したオンコジーンの形質転換効果の減少が表 示される条件の処置；および／または ｅ） ｐ１３０^casリン酸化と関連したオンコジーンの形質転換効果を減少させ ること；および／または ｆ） ＰＴＰ−ＰＥＳＴもしくは不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕 著な変化を生じさせないが、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少を生じさ せるアミノ酸に置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴであるプロテインチロシンホスフ ァターゼを哺乳類（例えば、ヒトなど）に投与し、それによりＰＴＰがｐ１３ ０^casに結合および／またはｐ１３０^casを脱リン酸化する工程、ならびにｐ１ ３０^casリン酸化と関連したオンコジーンの形質転換効果を減少させる工程を 含む、ｐ１３０^casリン酸化と関連したオンコジーンの形質転換効果を減少さ せる方法；および／または ｇ） 癌（例えば、ｐ１３０^casリン酸化と関連した癌）の処置、治療、診断ま たは予防；および／または ｈ） オンコジーンの活性（例えば、ｖ−ｃｒｋ、ｖ−ｓｒｃおよび／またはｃ −Ｈａ−ｒａｓ活性と）と関連した条件の処置；および／または ｉ） ｐ１３０^casと関連したシグナル伝達複合体の形成の減少が表示される条 件の処置；および／または ｊ） ｐ１３０^casと関連したシグナル伝達複合体の形成を減少させること；お よび／または ｋ） ＰＴＰ−ＰＥＳＴもしくは不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕 著な変化を生じさせないが、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少を生じさ せるアミノ酸に置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴであるプロテインチロシンホスフ ァターゼを啼乳類（例えば、ヒトなど）に投与し、それによりＰＴＰがｐ１３ ０^casに結合および／またはｐ１ ３０^casを脱リン酸化する工程、ならびにｐ １３０^casと関連するシグナル伝達複合体の形成を減少させる工程を含む、ｐ １３０^casと関連するシグナル伝達複合体の形成を減少させる方法、および ／または ｌ） 分裂経路の誘導の妨害； ｍ） 分裂経路の誘導の妨害が表示される条件の処置； ｎ） プロテインチロシンホスファターゼ投与または過剰発現と関連した細胞毒 性効果の減少が表示される条件の処置；および／または ｏ） プロテインチロシンホスファターゼ投与または過剰発現と関連した細胞毒 性効果を減少させること；および／または ｐ） 対応する野生型プロテインチロシンホスファターゼの代わりに、不変のア スパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化を生じさせないが、１分あたり １未満までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸に置換されるプロテインチ ロシンホスファターゼを哺乳類（例えば、ヒトなど）に投与する工程を含む、 プロテインチロシンホスファターゼ投与または過剰発現と関連した細胞毒性効 果を減少させる方法；および／または ｑ） 請求項１３−２０いずれか記載の方法で 治療、予防または診断に使用される、例えば、請求項１〜３いずれかに規定され た、プロテインチロシンホスファターゼ。 １２． 処置、予防または診断のため（例えば、請求項１１に規定された処置に おける使用のため）の薬物の製造のためのプロテインチロシンホスファターゼの 使用。 １３． 不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化を生じさせない が、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸に置換される プロテインチロシンホスファターゼを哺乳類（例えば、ヒトなど）に投与し、そ れにより複合体の形成がチロシンリン酸化タンパク質の活性を減少させる工程を 含む、チロシンリン酸化タンパク質の活性を減少させる方法。 １４． 該チロシンリン酸化タンパク質が、ｐ１３０^cas、ＥＧＦレセプター、 ｐ２１０ ｂｃｒ：ａｂｌ、ＬＭＡＰキナーゼおよびインシュリンレセプターか らなる群より選ばれた、請求項１３記載の方法。 １５． プロテインチロシンホスファターゼが、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰ−ＰＥＳＴ 、ＰＴＰγ、ＭＫＰ−１、ＤＥＰ−１、ＰＴＰγ、ＰＴＰＸＩ、ＰＴＰＸ１０お よびＰＴＰＨ１からなる群より選ばれた、請求項１３記載の方法。 １６． ＰＴＰ−ＰＥＳＴもしくは不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの 顕著な変化を生じさせないが、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少を生じさ せるアミノ酸に置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴであるプロテインチロシンホスファ ターゼを哺乳類（例えば、ヒトなど）に投与し、それによりＰＴＰがｐ１３０^{ca s} に結合および／またはｐ１３０^casを脱リン酸化し、それによりｐ１３０^casの 下流の効果を負に制御する工程、ならびにｐ１３０^casリン酸化と関連したオン コジーンの形質転換効果を減少させる工程を含む、ｐ１３０^casリン酸化と関連 したオンコジーンの形質転換効果を減少させる方法。 １７． オンコジーンが、ｖ−ｃｒｋ、ｖ−ｓｒｃおよびｃ−Ｈａ−ｒａｓから なる群より選ばれた、請求項１６記載の方法。 １８． ＰＴＰ−ＰＥＳＴもしくは不変のアスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの 顕著な変化を生じさせないが、１分あたり１未満までのＫｃａｔの減少を生じさ せるアミノ酸に置換されるＰＴＰ−ＰＥＳＴであるプロテインチロシンホスファ ターゼを哺乳類（例えば、ヒトなど）に投与し、それによりＰＴＰがｐ１３０^{ca s} に結合および／またはｐ１３０^casを脱リン酸化し、それによりｐ１３０^cas の下流の効果を負に制御する工程、ならびにｐ１３０^casと関連したシグナル伝 達複合体の形成を減少させる工程を含む、ｐ１３０^casと関連したシグナル伝達 複合体の形成を減少させる方法。 １９． 分裂経路の誘導を妨げる、請求項１８記載の方法。 ２０． 対応する野生型プロテインチロシンホスファターゼの代わりに、不変の アスパラギン酸残基が、酵素のＫｍの顕著な変化を生じさせないが、１分あたり １未満までのＫｃａｔの減少を生じさせるアミノ酸に置換されるプロテインチロ シンホスファターゼを哺乳類（例えば、ヒトなど）に投与する工程を含む、プロ テインチロシンホスファターゼ投与または過剰発現と関連した細胞毒性効果を減 少させる方法。