ES2281963T3 - Medio y procedimiento de fermentacion para producir acidos alfa, omega-alcanodicarboxilicos. - Google Patents
Medio y procedimiento de fermentacion para producir acidos alfa, omega-alcanodicarboxilicos. Download PDFInfo
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Abstract
Un medio de biofermentacion para la producción de ácidos alfa,omega-alcanodicarboxílicos que apoya el crecimiento de la levadura, comprende: a) jarabe de maíz que proporciona una concentración de glucosa de 30 a 60 g/l; b) una fuente orgánica del nitrógeno seleccionada del grupo, constituida por licor escarpado de maíz a una concentración de 4 a 15 g/l y del extracto de levadura de cerveza en una concentración de 1 a 5 g/l; c) una fuente de nitrógeno inorgánico; d) una fuente de fosfato; e) opcionalmente una fuente de elementos traza; f) un cultivo de la levadura productora de ácidos alfa,omega-alcanodicarboxílicos, seleccionado de C. tropicalis AR40 (ATCC No. 209 87) y; g) un sustrato que la levadura puede convertir en un ácido alfa,omega-alcanodicarboxílico, en donde dicho sustrato tiene de 6 a 22 átomos de carbono y es seleccionado a partir de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos y alcanos.
Description
Medio y procedimiento de fermentación para
producir ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos.
Esta invención fue hecha con la ayuda del
Gobierno bajo el Contrato de Gobierno No.
93-COOP-1-9547,
concedido por el Ministerio de Agricultura. El Gobierno tiene
ciertos derechos en esta invención.
La actual invención se relaciona con el campo de
la producción biofermentativa de ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos. Particularmente, la
invención proporciona un medio y un procedimiento que alcanza una
producción específica superior de ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos a un bajo costo usando
una levadura biocatalizadora.
Los ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos de cadena larga (es
decir, ácidos alcanodicarboxílicos con un número de carbonos de
nueve o mayor) se utilizan como materias primas en la síntesis de
una variedad de productos químicos y de materiales de polímero.
Por ejemplo, el ácido dodecanodioico se utiliza como un comonomero
con el bisfenol A para producir un copoliestercarbonato, un
termoplástico de ingeniería particularmente deseable el cual
retiene fuerza de alto impacto, el sello distintivo de la resina
policarbonatada, mientras que presenta una viscosidad más baja al
derretirse. Esta característica da lugar a una productividad mejor
del moldeado que la resina policarbonatada convencional,
permitiendo la producción de piezas plásticas livianas, fuertes, de
paredes delgadas.
Diácidos con números de carbono mayores de
cuatro (de aquí en adelante designados como diácidos) son
producidos actualmente casi exclusivamente por procesos de
conversión no biológicos. El ácido de dodecanodioico es
manufacturado a través de la trimerización cíclica catalizada con
níquel, del butadieno, seguido por la hidrogenación a
ciclododecano, la oxidación con aire a una mezcla de ciclododecanona
y el ciclododecanol, y finalmente, oxidación con ácido nítrico a
ácido dodecanodioico. Estos tipos de procesos químicos para la
producción de diácidos tienen un número de limitaciones y de
desventajas. Cada proceso se restringe a la producción de los
diácidos de longitudes de cadena de carbono específicas, basados en
el material inicialmente utilizado. Por ejemplo, el proceso del
ácido dodecanodioico comienza con butadieno, por lo tanto los
productos de este proceso de reacción se limitan a los ácidos con
longitudes de cadena en múltiplos de cuatro. En la práctica,
únicamente un solo diácido, el ácido dodecanodioico, es hecho por
este proceso. Adicionalmente, los procesos se basan en las
materias de base petroquímicas no renovables, y el proceso de
conversión de multireacciones produce subproductos indeseados que
dan lugar a pérdida de productividad, basuras de metal pesado, y
óxidos de nitrógeno que se deben destruir en un horno de
reducción.
Los procesos biológicos de conversión para la
producción de diácidos tienen un número de ventajas potenciales en
relación a los procesos no-biológicos existentes de
conversión. Primordialmente entre éstos esta el uso de materias de
base renobables como materiales iniciales y la capacidad de producir
el diácido sin la generación de los subproductos químicos
peligrosos que necesitan procesos costosos de disposición de
desechos. Otra ventaja importante alcanzada usando un proceso
biológico es que tal proceso se puede adaptar fácilmente para
producir una variedad amplia de diácidos usando el mismo
biocatalizador y el mismo equipo. Debido a que las síntesis
químico orgánicas actuales son únicamente apropiadas para la
producción de un solo diácido, la síntesis de varios diácidos
diversos requeriría el desarrollo de un nuevo esquema de síntesis
para cada diácido. Por otra parte, un biocatalizador de levadura
se puede utilizar para producir diácidos de diversas longitudes,
usando el mismo equipo, medios y protocolos, simplemente
proporcionando un sustrato diferente a la levadura.
Varias levaduras naturales son conocidas por
producir diácidos cuando son provistas de ácidos grasos, ésteres
del ácido graso o los alcanos como substratos. Las levaduras
pertenecientes al género Candida, tal como C. albicans, C.
cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C. lipolytica, C. maltosa,
C. parapsilosis, C. zeylenoides y C. tropicalis, ha sido
reportado que producen diácidos. No obstante estas levaduras tienen
un número de limitaciones evitando su uso para la producción
comercial de diácidos. Producen una producción total ineficiente
de diácido en relación al ácido graso o los alcanos utilizados como
material inicial, y también producen cantidades relativamente
grandes de subproductos indeseados.
En la levadura, los substratos
n-alcano son transportandos hacia la célula, son
hidroxilados a alcoholes grasos por un sistema específico del
citocromo P450, y después son adicionalmente oxidados por una
oxidasa de alcohol y una oxidasa de aldehido para formar un ácido
graso. Los ácidos grasos se oxidan de la misma forma para formar
el diácido correspondiente. Ambos, ácidos grasos y diácidos se
pueden degradar, sin embargo, a través del proceso peroxisimal de
la oxidación, subsecuente a la activación a un éster de
acil-CoA. Esto conduce a la reducción de la cadena
en unidades de dos. Así, los diácidos producidos en levaduras son a
menudo reducidos en grados diferentes.
Cepas de Candida tropicalis, modificadas
genéticamente, han sido desarrolladas de modo que superan algunos
de estos obstáculos para la producción comercial rentable de
diácidos. La patente de los Estados Unidos de América 5,254,466
divulga la modificación genética de cepas de C. tropicalis.
En esta cepa de levadura, el proceso de la
beta-oxidación se bloquea, dando por resultado la
producción del diácido substancialmente puro sin la conversión
indeseada del substrato en cadenas más cortas de diácidos y biomasa,
y en la producción substancialmente cuantitativa con respecto al
material inicial. Un organismo particular bloqueado para
oxidaciones es C. tropicalis H5343 (ATCC No. 20962).
EP-A-0316702 divulga un proceso para
la conversión, por medio de fermentación, de las mezclas del éster
del ácido graso que contienen por lo menos algunos ésteres del
ácido láurico en los ácidos dicarboxílicos con un número igual de
los átomos de carbono basados en la división del ácido graso y hace
uso de un microorganismo que presenta una proporción más alta de la
transformación para los compuestos C12 que para los homólogos más
altos de estos. Esto es alcanzado realizando la conversión en
presencia de una cepa del microorganismo Candida tropicalis
DC2-C2009 (DSM 4277) y/o de los mutantes y/o de las
variantes de este, que tienen la capacidad de convertir el metil
laureato, en una proporción más alta de transformación, que sus
homólogos más altos, en ácidos alfa,
omega-dicarboxílicos.
La C. tropicalis ha sido modificada más a
fondo, según lo descrito en la patente 5,620,878 de los Estados
Unidos de América. Esta referencia divulga la amplificación de los
genes codificando la citocromo P450 monooxigenasa y la reductasa
del NADPH, lo que resulta en la actividad creciente de
4-hydroxylase y así el incremento en la
productividad específica (gramos de diácido/lt/hr) de diácidos. El
organismo particular responsable de ampliar los componentes del
citocromo P450 monooxigenasa y de la reductasa de NADPH se conoce
como C. tropicalis AR40 (ATCC No. 20987), depositada por la
Corporación Henkel, Plymouth Meeting, Pa, USA el 9 de marzo de
1990.
Las cepas conocidas, modificadas genéticamente,
demuestran distintas ventajas sobre cepas de levadura previamente
disponibles para la producción de diácidos. Esta tecnología ha dado
lugar a organismos que pueden producir las cantidades grandes de
producto necesarias para desarrollar un proceso comercialmente
factible. La producción descrita usa estos procedimientos de
invención anteriores, sin embargo, incluye el uso de medios
preferidos de fermentación los cuales contienen componentes
relativamente costosos. El costo del medio en los procesos de
biofermentación es demasiado alto para ser usado en la práctica, en
la producción del diácido en escala comercial. Por ejemplo, la
forma de realización preferida de la patente 5,620,878 de los
Estados Unidos de América, describe un medio que abarca 3 g/l de
peptona, 6 g/l de extracto de levadura, 6,7 g/l de base del
nitrógeno de la levadura (Difco), 3 g/l de acetato de sodio, 7,2 g/l
de K_{2}HPO_{4}-3H_{2}O, 9,3g/l de
KH_{2}PO_{4}, y 75 g/l de glucosa. Éstos son ingredientes
convenientes para la práctica en laboratorio, pero no para la
fermentación en escala industrial.
Por lo tanto, continúa la necesidad de medios
de biofermentación completa de bajo costo, que proporcionen la
suficiente ayuda nutriente al biocatalizador de la levadura de modo
que permita la alta productividad específica de diácidos a partir
de material inicial adecuado de ácido graso o alcano.
\vskip1.000000\baselineskip
Por consiguiente, los inventores han
desarrollado un medio y un proceso de fermentación económico para la
fabricación de ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos. La invención es un
medio de biofermentacion para la producción de ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos, que contribuye al
crecimiento de la levadura, comprende: (a) jarabe de maíz que
provee una concentración de glucosa de cerca de 30 a 60 g/l; (b) una
fuente de nitrógeno orgánico seleccionada del grupo, formada por
licor escarpado de maíz a una concentración de entre 4 a
aproximadamente 15 g/l y del extracto de levadura de cerveza en una
concentración de entre 1 a aproximadamente 5 g/l; (c) una fuente de
nitrógeno inorgánico; (d) una fuente de fosfato; (e) opcionalmente
una fuente de elementos traza; (f) un cultivo de levadura generador
de ácido \alpha, \omega-alcanodicarboxílico; y
(g) un sustrato que la levadura puede convertir en un ácido
\alpha, \omega-alcanodicarboxílico. Con el uso
de fuentes nutrientes alternativas, de bajo costo, que apoyan el
crecimiento de la levadura, la invención proporciona un medio que
permite la producción comercial de diácidos importantes, en cantidad
grande, utilizando un proceso biológico de conversión que no
requiere material de inicio petroquímico o que produzca una
corriente de desechos peligrosos. La invención proporciona un
medio y un procedimiento que, aunque menos costoso que los medios
del arte anteriores, da lugar a la producción de diácidos, por lo
menos tan alta como los procedimientos del arte anterior por medio
de las células de la levadura.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención proporciona los medios de cultivo
para el crecimiento y el mantenimiento de C. tropicalis AR40
y cepas similares de la levadura. Estos medios incorporan fuentes
nutrientes que proporcionan un caldo de cultivo rico en nutrientes,
que promueve el buen crecimiento de las células de la levadura, pero
que también son menos costosos que los medios divulgados en el arte
anterior y deriva en alta productividad específica del diácido por
las células de la levadura.
Un medio preferido de la fermentación del arte
anterior para el diácido que produce la levadura, incluye una
fuente del carbono tal como glucosa, una fuente orgánica del
nitrógeno tal como extracto de levadura, sales, amortiguadores, y
una fuente de aminoácidos, vitaminas, y minerales traza, tales como
la Levadura en Base de Nitrógeno (Difco). Ver la tabla 1. Estos
medios, mientras que son exitosos en el laboratorio, no son
convenientes para la producción comercial de los diácidos debido al
alto costo de sus ingredientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Asombrosamente, los inventores han encontrado
que la substitución de las fuentes nutrientes de un costo más bajo
no reducen la viabilidad del cultivo de la levadura, ni reducen la
producción específica de los diácidos deseados.
Los medios inventivos utilizan el jarabe de maíz
como fuente principal de carbohidratos. El jarabe de maíz sin
refinar en los medios OPT1 y OPT2, ver las tablas 2 y 3, es una
fuente mucho más barata de glucosa que la glucosa altamente
purificada usada en los medios típicos del arte anterior para la
producción de diácidos de levadura. También creemos que el jarabe
de maíz sin refinar es un ingrediente preferido porque también
contiene nutrientes traza, que la glucosa altamente purificada no
contiene, aunque el jarabe de maíz refinado o el jarabe de maíz
modificado puede ser substituido. Los nutrientes traza específicos
responsables de las mejoras en los resultados vistos con jarabe de
maíz sin refinar, en relación con glucosa pura, son desconocidos.
El jarabe de maíz sin refinar contiene niveles bajos de minerales y
de sales de metales, tales como calcio, magnesio y hierro, pero el
papel específico de éstos es desconocido. Adicionalmente, los
inventores han descubierto que cuando se utilizan los medios
inventivos, una concentración eficaz de 40 g/l de la glucosa
proporciona una suficiente fuente de energía, mientras que, en el
arte anterior fue descrito que se utilizaba cerca de 75 g/l de
glucosa. Esta substitución reduce substancialmente el costo de la
fuente de carbohidrato en el medio.
Mientras que los medios del arte anterior
contienen los extractos de levadura estandardizados y/o suplidos
que son semipurificados y diseñados para el uso estándar del
laboratorio como fuente de aminoácidos, el licor escarpado de maíz
y el extracto de levadura fermentada proporcionan estos nutrientes
en los medios inventivos. Las fuentes nutrientes típicas del
nitrógeno y traza en el arte anterior son extracto de levadura de
Difco, un extracto de levadura estandarizado que contiene los
aminoácidos, vitaminas, minerales, y elementos traza, y base del
nitrógeno de la levadura de Difco, una fórmula media preparada en
laboratorio que contiene sulfato de amonio, sales de fosfato,
magnesio, sodio, y calcio, junto con los aminoácidos, vitaminas, y
elementos traza. Éstas son fuentes nutrientes relativamente
costosas, puesto que contienen niveles cuidadosamente controlados
de ingredientes tales como vitaminas B. Los medios inventivos
contienen menos componentes definidos que puedan proporcionar la
nutrición equivalente a un costo menor total. Los medios preferidos
contienen el jarabe de maíz, que proporciona una concentración de
la glucosa de entre 30 a aproximadamente 60 g/l, una fuente orgánica
del nitrógeno (licor escarpado de maíz, aproximadamente de
4-15 g/l ó de extracto de levadura de cerveza,
aproximadamente 1-5 g/l), una fuente inorgánica de
nitrógeno, una fuente de fosfato, y opcionalmente una fuente de
elementos traza.
Los medios para el uso con esta invención se
pueden utilizar con cualquier levadura que produce diácido, y una
variedad amplia de sustratos. Cualquier ácido graso, éster del
ácido graso, o sustrato de alcano, saturado o no saturado, puede
ser utilizado. El sustrato deseable tiene 6-22
átomos de carbono, aunque los ácidos grasos deseables tienen
10-22 átomos de carbono. Los sustratos preferidos
son ácido láurico, ácido miristico, ácido palmitico, ácido
esteárico, ácido oleico ácido palmitoleico y los ésteres metílicos
de estos, y dodecano, tridecano, y tetradecano.
Los siguientes ejemplos describen medios según
la invención y su uso en la producción de ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos. Un ejemplo
comparativo que usa el medio que contenía los ingredientes
enumerados en la tabla 1 (con glucosa en 60 g/l), también es
incluido. Este ejemplo comparativo demuestra que los medios de esta
invención apoyan el crecimiento y la producción específica de
ácidos \alpha, \omega-alcanodicarboxílicos tal
como medios del arte anterior, bajo las mismas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
El licor escarpado de maíz, el sulfato de amonio
y las sales de fosfato enumerados en la tabla 2 en las cantidades
suficientes para obtener las concentraciones finales indicadas
fueron disueltos en agua desionizada y esterilizados, calentando a
121°C y 15 libras por pulgada cuadrada de presión, (psig). El
extracto de maíz sin refinar, así como la solución de glucosa al
50%, fue esterilizado por separado calentando de la misma forma.
Las soluciones concentradas de las sales minerales restantes y de
los elementos traza, fueron preparadas individualmente y
esterilizadas con filtro, por filtración por separado. El extracto
de maíz, las sales, y las soluciones de los elementos traza fueron
agregados a la solución enfriada que contenía el licor escarpado de
maíz, para rendir las concentraciones indicadas. El medio
resultante entonces fue elevado a un pH de 6,5. El extracto de
maíz sin refinar utilizado en los medios OPT1 y OPT2 era jarabe de
maíz de dextrosa al 95%, sin refinar, Cargill CLEARSWEET™. El licor
escarpado de maíz era Cargill Heavy Steepwater.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio OPT2 contiene los componentes
enumerados en la tabla 3, y se hace según lo descrito en el ejemplo
1, substituyendo el Extracto de Levadura de Cerveza por el Licor
Escarpado de Maíz. El extracto de levadura de cerveza usado en
este medio fue Amberex™ 1003.
La C. tropicalis AR40 fue hecha crecer
bajo condiciones estériles en el Medio OPT1 en un fermentador con
agitador, aireado, con un volumen de líquido inicial de 2,5 l. El
medio de cultivo estéril fue inoculado con un inoculo del 10% de
C. tropicalis AR40 y crecido en 30°C, pH 6,5, con un índice
de la aireación de 1 wm (aire) por 18 horas. En este tiempo,
después de que el crecimiento de las células ha alcanzado la
densidad máxima de la célula, la fase de la conversión fue iniciada
comenzando a agregar el sustrato del metil miristato. Al mismo
tiempo, el pH del cultivo fue elevado a 8,2 con el hidróxido de
sodio 6N. El pH fue mantenido en 8,2 para las primeras 30 horas de
la fase de conversión y en 8,7 después de eso, con la adición
controlada de la solución del hidróxido del sodio. Durante la fase
de conversión, el jarabe de maíz sin refinar fue agregado
continuamente al medio de cultivo en el índice de 2,0
glucosa/l/hora. El sustrato fue agregado en una proporción
suficiente para proveer un exceso del sustrato, en relación al
índice de la conversión del sustrato, al producto del diácido.
Sobre el período de la conversión de 49 horas, el ácido
1,14-tetradecanodioico fue producido, en un índice
medio de 0,76 g/l/hr.
\vskip1.000000\baselineskip
La fermentación descrita en el ejemplo 3 fue
repetida con las siguientes diferencias de menor importancia. El pH
fue controlado a un pH 8,2 para las primeras 32,5 horas de la
conversión y 8,7 después de eso. Durante la fase de la conversión,
jarabe de maíz sin refinar fue agregado en un índice de 1,89
glucosa/l/hr. En un período de conversión de 50 horas, el ácido
1,14-tetradecanodioico fue producido en un índice
medio de 0,99 g/l/hr.
\vskip1.000000\baselineskip
La fermentación descrita en el ejemplo 4 fue
repetida, substituyendo el medio OPT2 por el medio OPT1 y en un pH
levemente diferente. El pH fue controlado a pH 8,1 para las
primeras 29,5 horas y a 8,7 después de eso. En un período de
conversión de 50 horas, el ácido
1,14-tetradecanodioico fue producido en un índice
medio de 0,84 g/l/hr.
\vskip1.000000\baselineskip
La biofermentacion fue realizada cuatro veces
separadas usando el mismo biocatalizador y bajo esencialmente las
mismas condiciones que en el ejemplo 4, excepto que el medio
utilizado fue el medio representativo del arte anterior descrito en
la tabla 1 con glucosa a 60 g/l. También, para estos ejemplos,
según los procedimientos del arte anterior, la glucosa del grado
reactivo fue utilizada no solamente como la fuente del carbono
durante el crecimiento de la célula, sino también durante la fase
de la conversión. Durante la conversión, la glucosa fue agregada en
un índice de 1,8 +/- 0,3 g/l/hora, y el sustrato fue agregado al
fermentador en una proporción suficiente para proveer un exceso del
sustrato con respecto al índice de la conversión del sustrato al
diácido. La tarifa de la producción del diácido para estos
experimentos varia entre 0,58 y 0,80 g/L/h. El índice de producción
medio del diácido en 50 horas de conversión de los cuatro
experimentos fue 0,69 g/l/hr.
Claims (7)
1. Un medio de biofermentacion para la
producción de ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos que apoya el
crecimiento de la levadura, comprende:
- a)
- jarabe de maíz que proporciona una concentración de glucosa de 30 a 60 g/l;
- b)
- una fuente orgánica del nitrógeno seleccionada del grupo, constituida por licor escarpado de maíz a una concentración de 4 a 15 g/l y del extracto de levadura de cerveza en una concentración de 1 a 5 g/l;
- c)
- una fuente de nitrógeno inorgánico;
- d)
- una fuente de fosfato;
- e)
- opcionalmente una fuente de elementos traza;
- f)
- un cultivo de la levadura productora de ácidos \alpha, \omega-alcanodicarboxílicos, seleccionado de C. tropicalis AR40 (ATCC No. 209 87) y;
- g)
- un sustrato que la levadura puede convertir en un ácido \alpha, \omega-alcanodicarboxílico, en donde dicho sustrato tiene de 6 a 22 átomos de carbono y es seleccionado a partir de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos y alcanos.
2. Un medio de biofermentacion según la
reivindicación 1, en el que el jarabe de maíz proporciona una
concentración de la glucosa de 40 g/l, y la fuente de nitrógeno
orgánico es licor escarpado de maíz en una concentración de 9
g/l.
3. Un medio de biofermentacion según la
reivindicación 1, en el que el jarabe de maíz proporciona una
concentración de la glucosa de 40 g/l, y la fuente de nitrógeno
orgánico es extracto de levadura fermentada en una concentración de
3 g/l.
4. Un medio de biofermentacion según la
reivindicación 1, en el que el jarabe de maíz es jarabe de maíz sin
refinar.
5. Un procedimiento para producir ácidos
\alpha, \omega-alcanodicarboxílicos que
comprende la biofermentacion por levadura de un substrato que
contiene de 6 a 22 átomos de carbono seleccionados del grupo,
constituido por ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, y alcanos,
en el medio de biofermentacion según la reivindicación 1.
6. Un procedimiento de producir ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos según la
reivindicación 5, en el que el sustrato es un ácido graso que tiene
10 - 22 átomos de carbono.
7. Un procedimiento de producir ácidos \alpha,
\omega-alcanodicarboxílicos según la
reivindicación 5, en el que el substrato es seleccionado a partir
del grupo constituido por ácido láurico, ácido miristico, ácido
palmitico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido palmitoleico,
metil éster del ácido láurico, metil éster del ácido miristico,
metil éster del ácido palmitico, metil éster del ácido esteárico,
metil éster del ácido oleico, metil éster del ácido palmitoleico,
dodecano, tridecano y el tetradecano.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/152,386 US6004784A (en) | 1998-09-14 | 1998-09-14 | Fermentation medium and method for producing α, ω -alkanedicarboxylic acids |
| US152386 | 1998-09-14 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2281963T3 true ES2281963T3 (es) | 2007-10-01 |
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ID=22542700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99924529T Expired - Lifetime ES2281963T3 (es) | 1998-09-14 | 1999-05-27 | Medio y procedimiento de fermentacion para producir acidos alfa, omega-alcanodicarboxilicos. |
Country Status (6)
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|---|---|
| US (1) | US6004784A (es) |
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