ES2281976T3 - Enzimas subtilasas de los subgrupos i-s1 y i-s2 que tienen un residuo aminoacido adicional en la region del bucle del sitio activo. - Google Patents

Enzimas subtilasas de los subgrupos i-s1 y i-s2 que tienen un residuo aminoacido adicional en la region del bucle del sitio activo. Download PDF

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Abstract

Enzima subtilasa aislada de los subgrupos I-S1 y I-S2 que tiene al menos un residuo aminoácido adicional en la posición 99 de la región del bucle del centro activo (b) desde la posición 95 a 103, donde dicha enzima subtilasa comprende una modificación seleccionada del grupo que consiste en: S99ST, S99SS, S99SP, S99SG, S99SI, S99SA, S99TP, S99TN, S99TQ y S99SQ.

Description

Enzimas subtilasas de los subgrupos I-S1 y I-S2 que tienen un residuo aminoácido adicional en la región del bucle del sitio activo.
Campo técnico
Esta invención se refiere a nuevas enzimas subtilasas de los subgrupos I-S1 y I-S2 que tienen al menos un residuo aminoácido adicional en la posición 99 de la región del bucle del centro activo (b) desde la posición 95 a 103. Estas proteasas son útiles presentando un rendimiento de lavado excelente o mejorado cuando se usan en detergentes; composiciones para la limpieza y de detergentes. La invención también se refiere a genes que codifican para la expresión de dichas enzimas cuando se insertan en una célula huésped adecuada u organismo no humano; y a estas células huéspedes transformadas con ellos y capaces de expresar dichas variantes enzimáticas, y a los métodos para producir las nuevas enzimas.
Antecedentes de la invención
En la industria de los detergentes, las enzimas han sido implementadas durante más de 30 años en formulaciones para el lavado. Las enzimas usadas en tales formulaciones comprenden proteasas, lipasas, amilasas, celulasas, así como otras enzimas, o mezclas derivadas. Las enzimas comercialmente más importantes son las proteasas.
Un número en aumento de proteasas comercialmente usadas son las variantes de proteínas creadas genéticamente de proteasas de tipo salvaje de origen natural, p. ej. DURAZYM® (Novo Nordisk NS), RELASE® (Novo Nordisk NS), MAXAPEM® (Gist-Brocades N.V.), PURAFECT® (Genencor Internacional, Inc.).
Además varias variantes de la proteasa están descritas en la técnica, así como en EP 130756 (GENENTECH) (correspondiente a la patente reemitida estadounidense nº. 34,606 (GENENCOR)); EP 214435 (HENKEL); WO 87/04461 (AMGEN); WO 87/05050 (GENEX); EP 260105 (GENENCOR); Thomas, Russell, y Fersht (1985) Nature 318 375-376; Thomas, Russell, y Fersht (1987) J. Mol. Biol. 193 803-813; Russel y Fersht Nature 328 496-500 (1987); WO 88/08028 (Genex); WO 88/08033 (Amgen); WO 95/27049 (SOLVAY S.A.); WO 95/30011 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/30010 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY); US 5.543.302 (SOLVAY S.A.); EP 251 446 (GENENCOR); WO 89/06279 (NOVO NORDISK NS); EP 525 610 A1 (SOLVAY); y WO 94/02618 (GIST-BROCADES N.V.).
También, WO 91/00345 (NOVO NORDISK NS) expone subtilisinas mutadas donde la carga electrostática de la red ha sido cambiada modificando los residuos aminoácidos de la enzima en al menos un número de posiciones indicadas.
No obstante, aunque varias variantes de la proteasa útiles han sido descritas, hay además una necesidad de nuevas proteasas mejoradas o variantes de proteasa para varios usos industriales.
En consecuencia, un objeto de la presente invención, es proporcionar proteasas mejoradas o variantes de proteasas creadas genéticamente por proteínas, especialmente para el uso en la industria de los detergentes.
Resumen de la invención
Los presentes inventores han encontrado que las subtilisinas en las que al menos uno de los bucles del centro activo es más largo que los actualmente conocidos, presentan unas propiedades de rendimiento del lavado mejoradas en composiciones de detergentes. La identificación de éstas fue realizada en la construcción de variantes de subtilisina, especialmente de la subtilisina 309 (BLSAVI o Savinase®), presentando propiedades del rendimiento de lavado mejoradas en composiciones de detergentes relativas a la enzima madre de tipo salvaje. Esto ha sido descrito en nuestra solicitud anterior DK1332/97.
Se ha encontrado ahora que ciertas subtilasas o variantes de las mismas de los subgrupos I-S1 ("subtilisinas" reales) y I-S2 (subtilisinas muy alcalinas) que tienen al menos un residuo aminoácido adicional en la posición 99 (o más bien entre las posiciones 99 y 100) de la región del bucle del centro activo (b) desde la posición 95 a 103, presentan un rendimiento de lavado sorprendentemente mejorado en comparación con aquellas actualmente conocidas y con aquellas descritas en dicha aplicación.
Las proteasas mejoradas según la invención pueden ser obtenidas por aislamiento de recursos naturales o por la introducción de al menos otro residuo aminoácido (una inserción) en el bucle del centro activo (b) entre las posiciones 99 y 100 en una subtilasa de tipo salvaje (para una definición de los bucles del centro activo y la numeración de posiciones ver más abajo).
Aunque este hallazgo fue realizado en la subtilisina 309 se ha preestablecido que será posible producir o aislar subtilasas similares ventajosas o variantes de subtilasa.
\newpage
Además será posible visualizar específicamente los productos aislados naturales para identificar nuevas subtilasas de tipo salvaje que comprenden un bucle del centro activo (b) que sea más largo que el bucle del centro activo correspondiente en las subtilisas conocidas de tipo salvaje, tales como subtilisina 309, se puede considerar que estas subtilasas tienen un residuo aminoácido insertado entre las posiciones 99 y 100, y presentan un rendimiento de lavado excelente en un detergente, en comparación con la subtilisina conocida más relacionada, tal como la subtilisina
309.
En lo que se refiere al alineamiento y numeración se hace referencia a las Figs. 1,1a, 2 y 2a más abajo mostrando alineamientos entre la subtilisina BPN' (BASBPN)(a) y la subtilisina 309 (BLSAVI)(b), y los alineamientos entre subtilisina BPN'(a) (BASBPN) y subtilisina Carlsberg (g). En las Figs. 1 y 2 los alineamientos fueron establecidos por el uso de rutina GAP del paquete GCG como se ha indicado más abajo, mientras que los alineamientos de las Figs. la y 2a son los mismos que en WO 91/00345. Estos alineamientos son usados en esta solicitud de patente como una referencia para numerar los residuos.
Los siete bucles del centro activo (a) a (g) (incluyendo ambos los residuos aminoácidos terminales indicados) están aquí definidos por comprender los residuos aminoácidos en los segmentos dados a continuación
(a) la región entre el residuo aminoácido 33 y 43;
(b) la región entre el residuo aminoácido 95 y 103;
(c) la región entre el residuo aminoácido 125 y 132;
(d) la región entre el residuo aminoácido 153 y 173;
(e) la región entre el residuo aminoácido 181 y 195;
(f) la región entre el residuo aminoácido 202 y 204;
(g) la región entre el residuo aminoácido 218 y 219.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención se refiere a un producto aislado de enzimas subtilasas (es decir superior al 10% de pureza) de los subgrupos I-S1 y I-S2 que tienen al menos un residuo aminoácido adicional en la posición 99 de la región del bucle del centro activo (b) desde la posición 95 a 103, en la cual dicho(s) residuo(s) aminoácido(s) adicional(es) corresponden a la inserción de al menos un residuo aminoácido entre las posiciones 99 y 100.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a una secuencia de ADN aislada que codifica una variante de subtilasa según la invención.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN aislada que codifica una variante de subtilasa según la invención.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a una célula huésped microbiana transformada con un vector de expresión según el cuarto aspecto.
En otro aspecto, la invención se refiere a la producción de las enzimas subtilisinas según la invención.
Las enzimas según la invención pueden generalmente ser producidas bien mediante el cultivo de una cepa microbiana a partir de la cual se ha aislado la enzima y la recuperación de la enzima en forma substancialmente pura; o mediante la inserción de un vector de expresión según el cuarto aspecto de la invención en un huésped microbiano adecuado, el cultivo del huésped para expresar la enzima subtilasa deseada, y la recuperación del producto enzimá-
tico.
Además la invención se refiere a una composición que comprende una subtilasa o variante de subtilasa según la invención.
Además la invención se refiere incluso al uso de las enzimas según la invención para varios usos industriales relevantes, en particular para el uso en composiciones de limpieza y composiciones de limpieza que comprenden las enzimas mutantes, especialmente composiciones de detergentes que comprenden las enzimas subtilisinas mutan-
tes.
Definiciones
Antes de discutir esta invención con más detalle, se definirán en primer lugar los términos siguientes y convenciones.
Nomenclatura de aminoácidos
A = Ala = Alanina
V = Val = Valina
L = Leu = Leucina
I = Ile = Isoleucina
P = Pro = Prolina
F = Phe = Fenilalanina
W = Trp = Triptófano
M = Met = Metionina
G = Gly = Glicina
S = Ser = Serina
T = Thr = Treonina
C = Cys = Cisteina
Y = Tyr = Tirosina
N = Asn = Asparraguina
Q = Gln = Glutamina
D = Asp = Ácido aspártico
E = Glu = Ácido glutámico
K = Lys = Lisina
R = Arg = Arginina
H = His = Histidina
X = Xaa = Cualquier aminoácido
Nomenclatura de ácidos nucleicos
A = Adenina
G = Guanina
C = Citosina
T = Timina (sólo en ADN)
U = Uracilo (sólo en ARN)
Nomenclatura y convenciones para la designación de variantes
Al describir las distintas variantes enzimáticas producidas o contempladas según la invención, se han adaptado las siguientes nomeclaturas y convenciones para facilitar la referencia:
Un marco de referencia está definido en primer lugar alineando la enzima aislada o genitora de tipo salvaje con la subtilisina BPN' (BASBPN).
La alineación puede ser obtenida por rutina GAP del paquete GCG versión 9.1 para numerar las variantes usando los siguientes parámetros: penalización por creación de espacios = 8 y penalización por extensión de espacios = 8 y todos los demás parámetros mantenidos en sus valores por defecto.
Otro método es usar alineamientos conocidos reconocidos entre las subtilasas, tales como el alineamiento indicado en WO 91/00345. En la mayoría de los casos las diferencias no tendrán importancia.
Los alineamientos de este tipo entre la subtilisina BPN' (BASBPN) y la subtilisina 309 (BLSAVI) y la subtilisina Carlsberg (BLSCAR), respectivamente están indicados en las Figs. 1,1a, 2, y 2a. Con ello varias deleciones e inserciones serán definidas en relación con BASBPN. En la Fig. 1 la subtilisina 309 tiene 6 deleciones en las posiciones 36, 58, 158, 162, 163, y 164 en comparación con BASBPN, mientras que en la Fig. 1a la subtilisina 309 tiene las mismas deleciones en las posiciones 36, 56, 159, 164, 165, y 166 en comparación con BASBPN. En la Fig. 2 la subtilisina Carlsberg tiene una deleción en la posición 58 en comparación con BASBPN, mientras que en la Fig. 2a la subtilisina Carlsberg tiene la primera deleción en la posición 56 en comparación con BASBPN. Estas deleciones están indicadas en las Figs. 1,1a, 2, y 2a por asteriscos (*).
Las distintas modificaciones realizadas en una enzima de tipo salvaje están indicadas en general usando tres elementos como sigue:
Aminoácido de posición sustituida del aminoácido original
La notación G195E significa por lo tanto una sustitución de una glicina en la posición 195 con un ácido glutámico.
En el caso en el que el residuo aminoácido original puede ser cualquier residuo aminoácido, se puede usar a veces una notación corta indicando sólo la posición y el aminoácido sustituido.
Aminoácido de posición sustituida
Tal notación es particularmente relevante en relación con la(s) modificación(es) en las subtilasas homólogas (véase abajo).
De forma similar cuando la identidad de la sustitución del(los) residuo(s) aminoácido(s) es irrelevante,
Posición del aminoácido original
Cuando tanto el(los) aminoácido(s) original(es) como el(los) aminoácido(s) sustituido(s) puede(n) comprender cualquier aminoácido, entonces sólo se indica la posición, p. ej.: 170.
Cuando el(los) aminoácidos) original(es) y/o aminoácido(s) sustituido(s) puede(n) comprender más de uno, pero no todos los aminoácidos, entonces los aminoácidos seleccionados son indicados entre paréntesis {}.
Posición del aminoácido original {aminoácido_{1} sustituido, ..., aminoácido_{n} sustituido}
Para variantes específicas los códigos específicos de tres o de una letra son usados, incluso los códigos Xaa y X para indicar cualquier residuo aminoácido.
Sustituciones
La sustitución del ácido glutámico por glicina en la posición 195 está designada como:
Gly195Glu o G195E
o la sustitución de cualquier ácido del residuo aminoácido por glicina en la posición 195 está designada como:
Gly195Xaa o G195X
o
Gly195 o G195
La sustitución de serina por cualquier residuo aminoácido en la posición 170 será entonces designada
Xaa170Ser o X170S.
o
170Ser o 170S
Tal notación es particularmente relevante en relación con la(s) modificación(es) en las subtilasas homólogas (véase infra). 170Ser debe entonces comprender p. ej. tanto una modificación Lys170Ser en BASBPN como una modificación Arg170Ser en BLSAVI (cf. Fig. 1).
Para una modificación en la que el(los) aminoácido(s) original(es) y/o aminoácido(s) sustituido(s) puede(n) comprender más de uno, pero no todos los aminoácidos, la sustitución de glicina, alanina, serina o treonina por arginina en la posición 170 será indicada por
Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr} o R170{G,A,S,T}
para indicar las variantes
R170G, R170A, R170S, y R170T.
Deleciones
Una deleción de glicina en la posición 195 será indicada por:
Gly195* o G195*
De manera correspondiente, la deleción de más de un residuo aminoácido, tal como la deleción de glicina y leucina será designada en las posiciones 195 y 196
Gly195*+Leu196* o G195*+L196*
Inserciones
La inserción de un residuo aminoácido adicional tal como p. ej. una lisina después de G195 es:
Gly195GlyLys o G195GK; o
cuando más de un residuo aminoácido es insertado, tal como p. ej. Lys, Ala y Ser después de G195 entonces es:
Gly195GlyLysAlaSer o G195GKAS
En estos casos el(los) residuo(s) aminoácido(s) insertado(s) son numerados añadiendo letras minúsculas al número de la posición del residuo aminoácido que precede al(los) aminoácido(s) insertado(s). En el ejemplo anterior, las secuencias 194 a 196 serán:
100
En los casos en los que un residuo aminoácido idéntico al residuo aminoácido existente es insertado es evidente que surge una degeneración en la nomenclatura. Si por ejemplo una glicina está insertada después de la glicina en el ejemplo anterior ésta sería indicada por G195GG. El mismo cambio real podría al mismo tiempo ser indicado como A194AG para el cambio de
101
102
Ejemplos de este tipo serán evidentes para un experto en la técnica, y la indicación G195GG y las indicaciones correspondientes para este tipo de inserciones significan por tanto que comprenden este tipo de indicaciones degeneradas equivalentes.
Relleno de un espacio
Cuando existe una deleción en una enzima en comparación de la referencia con la secuencia de la subtilisina BPN' usada para la numeración, una inserción en esta posición se indica como:
*36Asp o *36D
para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36.
Modificaciones múltiples
Las variantes que comprenden modificaciones múltiples son separadas por sumas, p. ej.:
Arg170Tyr+Gly195Glu o R170Y+G195E
que representan modificaciones en las posiciones 170 y 195 que sustituyen la tirosina y el ácido glutámico por arginina y glicina, respectivamente.
o p. ej. Tyr167{Gly,Ala,Ser,Thr}+Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr} designa las variantes
Tyr167Gly+Arg170Gly, 
\hskip0,3cm
Tyr167Gly+Arg170Ala,
Tyr167Gly+Arg170Ser, 
\hskip0,3cm
Tyr167Gly+Arg170Thr,
Tyr167Ala+Arg170Gly, 
\hskip0,3cm
Tyr167Ala+Arg170Ala,
Tyr167Ala+Arg170Ser, 
\hskip0,3cm
Tyr167Ala+Arg170Thr,
Tyr167Ser+Arg170Gly, 
\hskip0,3cm
Tyr167Ser+Arg170Ala,
Tyr167Ser+Arg170Ser, 
\hskip0,3cm
Tyr167Ser+Arg170Thr,
Tyr167Thr+Arg170Gly, 
\hskip0,3cm
Tyr167Thr+Arg170Ala,
Tyr167Thr+Arg170Ser, y 
\hskip0,2cm
Tyr167Thr+Arg170Thr.
Esta nomenclatura es particularmente relevante con respecto a las modificaciones dirigidas a sustituir, reemplazar, insertar o delecionar residuos aminoácidos que tienen propiedades específicas comunes, tales como residuos de carga positiva (K, R, H), carga negativa (d, e), o modificación(es) de aminoácidos conservadora(s) de p. ej. Tyr167{Gly,Ala,Ser,Thr}+Arg170{Gly,Ala,Ser,Thr}, lo cual significa substituir un pequeño aminoácido por otro pequeño aminoácido. Ver sección "Descripción detallada de la invención" para detalles adicionales.
Proteasas
Las enzimas que seccionan los enlaces de la amida en sustratos proteínicos se clasifican como proteasas, o peptidasas (de forma intercambiable) (ver Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capítulo 3).
Numeración de posiciones/residuos de los aminoácidos
Si no se menciona nada más la numeración de los aminoácidos usada aquí corresponde a aquella de la secuencia de la subtilasa BPN' (BASBPN). Para una descripción adicional de la secuencia BPN' ver Figs. 1 y 2, o Siezen et al., Protein Engng.4 (1991) 719-737.
Serina proteasas
Una serina proteasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos, y en la que hay un residuo de serina esencial en el centro activo (White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, págs. 271-272).
Las serina proteasas bacterianas tienen pesos moleculares en la gama de 20.000 a 45.000 dalton. Éstas son inhibidas por diisopropilfluorofosfato. Hidrolizan ésteres terminales simples y son similares en actividad a la quimiotripsina eucariótica, también una serina proteasa. Un término más concreto, la proteasa alcalina, que abarca un subgrupo, refleja el pH alto óptimo de algunas serina proteasas, desde un pH 9.0 a 11.0 (para revisión, ver Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753).
Subtilasas
Un subgrupo de las serina proteasa designadas de forma tentativa subtilasas ha sido propuesto por Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Se definen por análisis de homología superior a 170 secuencias de aminoácidos de serina proteasas a las que se ha hecho referencia previamente como proteasas de tipo subtilisina. Una subtilisina ha sido definida previamente frecuentemente como una serina proteasa producida por bacterias Gram-positivas u hongos, y según Siezen et al. ahora se trata de un subgrupo de las subtilasas. Una amplia variedad de subtilasas han sido identificadas, y la secuencia de aminoácidos de varias subtilasas ha sido determinada. Para una descripción más detallada de las subtilasas de este tipo y sus secuencias de aminoácidos se hace referencia a Siezen et al. (1997).
Un subgrupo de las subtilasas, I-S1 o "subtilisinas reales", comprende las subtilisinas "clásicas", tales como la subtilisina 168 (BSS168), subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, NOVO NORDISK NS), y subtilisina DY (BSSDY).
Otro subgrupo de las subtilasas, I-S2 o subtilisinas muy alcalinas, es reconocido por Siezen et al (supra). Las proteasas del subgrupo I-S2 están descritas como subtilisinas muy alcalinas y comprenden enzimas tales como subtilisina PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Gist-Brocades NV), subtilisina 309 (SAVINASE®, NOVO NORDISK NS), subtilisina 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVO NORDISK NS), y elastasa alcalina YaB (BSEYAB).
Lista de acrónimos para las subtilasas
I-SI
Subtilisina 168, BSS168 (BSSAS (amilosacárido de la subtilisina), BSAPRJ (subtilisina J), BSAPRN (subtilisina NAT), BMSAMP (Mesentericopeptidasa),
Subtilisina BPN', BASBPN,
Subtilisina DY, BSSDY,
Subtilisina Carlsberg, BLSCAR (BLKERA (Queratinasa), BLSCA1, BLSCA2; BLSCA3),
BSSPRC, serina proteasa C
BSSPRD, serina proteasa D
\vskip1.000000\baselineskip
I-S2
Subtilisina Sendai, BSAPRS
Subtilisina ALP 1, BSAPRQ,
Subtilisina 147, Esperase® BLS147 (BSAPRM (subtilisinAprM), BAH101),
Subtilisina 309, Savinase®, BLS309/BLSAVI (BSKSMK (M-proteasa), BAALKP (Subtilisina PB92, proteasa alcalina alcalofílica de Bacillus), BLSUBL (subtilisina BL)),
Elastasa alcalina YaB, BYSYAB,
"SAVINASE®"
SAVINASE® está comercializada por NOVO NORDISK NS. Es la subtilisina 309 de B. Lentus y difiere de BAALKP sólo en una posición (N87S, ver Fig. 1 aquí). SAVINASE® tiene la secuencia de aminoácidos designada b) en la Fig. 1.
Subtilasa genitora
Los términos "subtilasa genitora" describen una subtilasa definida según Siezen et al. (1991 y 1997). Para detalles adicionales ver descripción de "SUBTILASAS" justo arriba. Una subtilasa genitora puede también ser una subtilasa aislada de una fuente natural, donde la modificación posterior ha sido hecha mientras que se mantiene la característica de una subtilasa. De forma alternativa el término "subtilasa genitora" puede ser denominada "subtilasa de tipo salvaje".
Modificación(es) de una variante de subtilasa
El término "modificación(es)" usado aquí se define por incluir modificación química de una subtilasa así como una manipulación genética del ADN que codifica una subtilasa. La(s) modificación(es) puede(n) ser reemplazo(s) de la(s) cadena(s) secundaria(s) del aminoácido, sustitución(es), deleción(es) y/o inserciones en o en el(los) aminoácido(s) de interés.
Variante de subtilasa
En el contexto de esta invención, el término variante de subtilasa o subtilasa mutada significa una subtilasa que ha sido producida por un organismo que está expresando un gen mutante derivado de un microorganismo genitor que poseía un gen original o genitor y que produjo una enzima genitora correspondiente, este gen genitor ha sido mutado para producir el gen mutante donde dicha proteasa de la subtilasa mutada es producida cuando se expresa en un huésped adecuado.
Secuencias homóloqas de subtilasa
Las regiones específicas del bucle del centro activo, y las inserciones de aminoácidos en dichos bucles de subtilasa SAVINASE® son identificadas para la modificación para obtener una variante de subtilasa según la invención.
No obstante, la invención no está limitada a modificaciones de esta subtilasa particular, pero se extienden a otras subtilasas genitoras (de tipo salvaje), que tienen una estructura primaria homóloga a aquella de SAVINASE®. La homología entre dos secuencias de aminoácidos en este contexto está descrita por el parámetro "identidad".
Para determinar el grado de identidad entre dos subtilasas la rutina GAP del paquete GCG versión 9.1 puede ser aplicada (infra) usando los mismos ajustes. El resultado de la rutina es, además del alineamiento del aminoácido, el cálculo del "porcentaje de identidad" entre las dos secuencias.
En base a esta descripción es una rutina para un experto en la técnica el hecho de identificar las subtilasas homólogas y las regiones homólogas del bucle del centro activo, que pueden ser modificadas según la invención.
Rendimiento del lavado
La capacidad de una enzima para catalizar la degradación de varios sustratos de origen natural presentes en los objetos para ser limpiados durante p. ej. el lavado o la limpieza de una superficie dura es frecuentemente llamada capacidad de lavado, capacidad para lavar, detergencia, o rendimiento del lavado. En toda esta solicitud, el término rendimiento del lavado se usará incluyendo esta propiedad.
Secuencia de ADN aislada
El término "aislado", aplicado a una molécula de la secuencia de ADN, indica que la secuencia de ADN ha sido eliminada de su ambiente natural genético y por lo tanto está libre de otras secuencias de codificación indeseadas o extrañas, y está en una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de producción de proteínas creados genéticamente. Estas moléculas aisladas son aquellas que han sido separadas de su medio natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los cuales están normalmente asociadas, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural tales como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para un experto en la técnica (ver por ejemplo, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985). Los términos "secuencia de ADN aislada" pueden de forma alternativa ser denominados "secuencia de ADN clonada".
Proteína aislada
Cuando se aplica a una proteína, el término "aislada" indica que la proteína ha sido eliminada de su medio original.
En una forma preferida, la proteína aislada está sustancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas homólogas (es decir "impurezas homólogas" (ver más abajo)).
Una proteína aislada tiene más del 10% de pureza, preferiblemente más del 20% de pureza, más preferiblemente más del 30% de pureza, según está determinado por SDS-PAGE. Además se prefiere suministrar la proteína en una forma muy purificada, es decir, con más del 40% de pureza, más del 60% de pureza, más del 80% de pureza, más preferiblemente más del 95% de pureza, e incluso más preferiblemente más del 99% de pureza, según ha sido determinado por SDS-PAGE.
El término "proteína aislada" puede de forma alternativa ser denominado "proteína purificada".
Impurezas de homólogos
Los términos "impurezas de homólogos" se refieren a cualquier impureza (p. ej. otro polipéptido distinto al polipéptido de la invención) que provenga de la célula homóloga a partir de la cual el polipéptido de la invención ha sido obtenido originalmente.
Obtenido de
Los términos "obtenido de" según se utiliza en este caso en relación con una fuente específica microbiana, se refiere al polinucleótido y/o polipéptido producido por la fuente específica, o por una célula donde un gen de la fuente ha sido insertado.
Sustrato
El término "sustrato" usado con respecto a un sustrato para una proteasa debería ser interpretado en su forma más general como comprendiendo un compuesto que contiene al menos un enlace peptídico susceptible de hidrólisis por una proteasa de subtilisina.
Producto
El término "producto" usado con respecto a un producto derivado de una reacción enzimática de la proteasa debería en el contexto de esta invención ser interpretado como incluyendo los productos de una reacción de la hidrólisis que implica una proteasa de subtilasa. Un producto puede ser el sustrato en una reacción posterior de hidrólisis.
Breve descripción del dibujo
La Fig. 1 muestra un alineamiento entre la subtilisina BPN' (a) y SAVINASE® (b) usando la rutina GAP mencionada arriba.
La Fig. 1a muestra el alineamiento entre la subtilisina BPN' y SAVINASE® según se ha indicado en WO 91/00345.
La Fig. 2 muestra un alineamiento entre la subtilisina BPN' y la subtilisina Carlsberg usando la rutina GAP mencionada arriba.
La Fig. 2a muestra el alineamiento entre la subtilisina BPN' y la subtilisina Carlsberg según se ha indicado en WO 91/00345.
La Fig. 3 muestra la estructura tridimensional de Savinase (entrada en el Protein data bank (PDK, banco de datos de proteínas) 1SVN). En la Figura se indica el bucle del centro activo (b).
Descripción detallada de la invención
Las subtilasas de la invención en un primer aspecto se refieren a una enzima subtilasa aislada (es decir con más del 10% de pureza) de los subgrupos I-S1 y I-S2 que tienen al menos un residuo aminoácido adicional en la posición 99 de la región del bucle del centro activo (b) desde la posición 95 a la 103, donde dicho(s) residuo(s) aminoácido(s) adicional(es) corresponde(n) con la inserción de al menos un residuo aminoácido entre las posiciones 99 y 100.
En otras palabras las subtilasas de la invención están caracterizadas porque que comprenden una región del bucle del centro activo (b) superior a 9 residuos aminoácidos y donde el residuo aminoácido adicional es o puede ser considerado como insertado entre las posiciones 99 y 100 en comparación con la subtilasa genitora o una de tipo salvaje conocida.
Una subtilasa según el primer aspecto de la invención puede ser una subtilasa genitora o de tipo salvaje identificada y aislada de la naturaleza.
Esta subtilasa genitora de tipo salvaje puede ser específicamente seleccionada por técnicas estándar conocidas en la técnica.
Una forma preferida de hacerlo puede ser amplificando por PCR específicamente las regiones del ADN conocidas para codificar bucles del centro activo en las subtilasas de numerosos microorganismos diferentes, preferiblemente diferentes cepas de Bacillus.
Las subtilasas son un grupo de enzimas conservadas, en el sentido de que su ADN y secuencias de aminoácidos son homólogos. Por consiguiente es posible construir cebadores relativamente específicos que flanqueen los bucles del centro activo.
Una manera de hacerlo es investigando un alineamiento de diferentes subtilasas (ver p. ej. Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523). A partir del trabajo rutinario de un experto en la técnica se construyen cebadores de la PCR que flanquean el bucle del centro activo correspondiente al bucle del centro activo (b) entre los residuos aminoácidos 95 a 103 en cualquiera de los grupos I-S1 o I-S2, así como a partir de BLSAVI. Usando estos cebadores de la PCR para amplificar el ADN de varios microorganismos diferentes, preferiblemente cepas de Bacillus diferentes, seguido de la secuenciación del ADN de dichos fragmentos de la PCR amplificados, será posible identificar las cepas que producen subtilasas de estos grupos que comprenden una región del centro activo más larga, en comparación con p. ej. BLSAVI, correspondiente a la región del bucle del centro activo desde las posiciones 95 a 103, y donde se puede considerar que existe una inserción entre las posiciones 99 y 100. Una vez identificada la cepa y una secuencia de ADN parcial de tal subtilasa de interés, un trabajo rutinario para un experto en la técnica es el hecho de completar la clonación, expresión y purificación de tal subtilasa de la invención.
No obstante, se prevé que una enzima subtilasa de la invención predominantemente es una variante de una subtilasa genitora.
Por consiguiente, en una forma de realización la invención se refiere a una enzima subtilasa aislada según el primer aspecto de la invención, donde dicha enzima subtilasa es una variante construida que tiene un bucle del centro activo más largo (b) que su enzima genitora que tiene al menos una inserción del aminoácido entre los residuos aminoácidos 99 y 100.
Las subtilasas de la invención presentan un excelente rendimiento del lavado en un detergente, y si la enzima es una variante construida presentan un rendimiento del lavado mejorado en un detergente en comparación con su subtilasa más cercana, tal como la subtilisina 309.
Diferentes productos de la subtilasa muestran un rendimiento del lavado diferente en diferentes tipos de composiciones de detergentes. Una subtilasa de la invención tiene un rendimiento mejorado del lavado, en comparación con su pariente más cercano en la mayoría de los diferentes tipos de tales composiciones de detergentes.
Preferiblemente una enzima subtilasa según la invención tiene un rendimiento de lavado mejorado, en comparación con su pariente más cercano en la composición de detergente mostrada en el ejemplo 3 aquí (véase más abajo).
Para determinar si una secuencia dada de aminoácidos de la subtilasa (independientemente de si dicha secuencia de la subtilasa es una secuencia de la subtilasa genitora de tipo salvaje o una secuencia de la variante de subtilasa producida por cualquier otro método distinto de la mutagénesis sitio dirigida) está dentro del campo de la invención, el procedimiento siguiente puede ser usado:
i) alinear dicha secuencia de la subtilasa con la secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN' (ver sección "Definiciones" en la presente (véase arriba);
ii) en base al alineamiento realizado en la fase i) identificar el bucle del centro activo (b), en dicha secuencia de la subtilasa correspondiente a la región del bucle del centro activo (b) de la subtilisina BPN' que comprende la región (ambos aminoácidos terminales incluidos) entre los residuos aminoácidos desde 95 a 103;
iii) determinar si el bucle del centro activo (b) en dicha secuencia de la subtilasa, identificada en la fase ii) es más largo que el bucle del centro activo correspondiente en BLSAVI y si dicha prolongación corresponde con la inserción de al menos un residuo aminoácido entre las posiciones 99 y 100.
Si este es el caso la subtilasa investigada es una subtilasa dentro del campo de la presente invención.
El alineamiento realizado en la fase i) anterior se realiza según el modo descrito anteriormente usando la rutina GAP.
En base a esta descripción es normal para un experto en la técnica el hecho de identificar el bucle del centro activo (b) en una subtilasa y determinar si la subtilasa en cuestión está dentro del campo de la invención. Si una variante es construida por mutagénesis sitio dirigida, se sabrá de antemano si la variante de la subtilasa está dentro del campo de la invención.
Una variante de subtilasa según la invención puede ser construida por técnicas estándar conocidas en la técnica tales como la mutagénesis sitio dirigido/aleatoria o la redistribución del ADN de diferentes secuencias de la subtilasa. Ver sección "Producción de una variante de subtilasa" y Materiales y métodos de la presente (véase más abajo) para detalles adicionales.
En otra forma de realización, la invención se refiere a una enzima de la subtilasa aislada según la invención, donde dicha inserción entre las posiciones 99 y 100 comprende al menos dos aminoácidos, en comparación con el bucle del centro activo correspondiente en BLSAVI.
En formas de realización adicionales, la invención se refiere a una enzima subtilasa aislada que comprende al menos una inserción, elegida del grupo que comprende (en la numeración BASBPN):
S99SA
S99ST
S99SG
S99SS
S99SQ
S99SI
S99TP
S99TQ
S99TN
S99SP
Además la invención se refiere a las subtilasas que comprenden las múltiples inserciones siguientes en la posición 99
S99SSG
o cualquiera de las combinaciones siguientes
S99ASG+S101T
S99TG+S101G
Es bien conocido en la técnica que se prevé que una substitución denominada conservadora de un residuo aminoácido a un residuo aminoácido similar produzca sólo un cambio mínimo en la característica de la enzima.
La Tabla III a continuación enumera los grupos de sustituciones de aminoácidos conservadoras.
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TABLA III Sustituciones de aminoácidos conservadoras
Propiedad común Aminoácido
Básica (carga positiva) K = lisina
H = histidina
Acídica (carga negativa) E = ácido glutámico
D = ácido aspártico
Polar Q = glutamina
N = asparraguina
Hidrofóbica L = leucina
I = isoleucina
V = valina
M = metionina
Aromática F = fenilalanina
W = triptófano
Y = tirosina
Pequeña G = glicina
A = alanina
S = serina
T = treonina
Según este principio, se prevé que las variantes de la subtilasa que comprenden sustituciones conservadoras, tales como G97A+A98AS+S99G, G97S+A98AT+S99A presenten características que no sean drásticamente distintas unas de otras.
En base a las variantes de la subtilasa descritas y/o ejemplificadas en la presente, es normal para un experto en la técnica el hecho de identificar modificación(es) adecuada(s) conservadora(s) para estas variantes para obtener otras variantes de subtilasa que presenten de forma similar un rendimiento de lavado mejorado.
Según la invención las subtilasas de la invención pertenecen a los subgrupos I-S1 y I-S2, especialmente al subgrupo I-S2, tanto para aislar enzimas nuevas de la invención de la naturaleza o de la creación artificial de diversidad, y para diseñar y producir variantes a partir de una subtilasa genitora.
En relación con las variantes del subgrupo I-SI, se prefiere elegir una subtilasa genitora del grupo que comprende BSS168 (BSSAS, BSAPRJ, BSAPRN, BMSAMP), BASBPN, BSSDY, BLSCAR (BLKERA, BLSCA1, BLSCA2, BLSCA3), BSSPRC, y BSSPRD, o variantes funcionales de las mismas que hayan retenido la característica del subgrupo I-SI.
En relación con las variantes del subgrupo I-S2 se prefiere elegir una subtilasa genitora del grupo que comprende BSAPRQ, BLS147 (BSAPRM, BAH101), BLSAVI (BSKSMK, BAALKP, BLSUBL), BYSYAB, y BSAPRS, o variantes funcionales de las mismas que hayan retenido la característica del subgrupo I-S2.
En particular dicha subtilasa genitora es BLSAVI (SAVINASE® NOVO NORDISK NS), y una variante de subtilasa preferida de la invención es por consiguiente una variante de SAVINASE®.
La presente invención también comprende cualquiera de las subtilasas de la invención anteriormente mencionadas en combinación con cualquier otra modificación de la secuencia de aminoácidos derivada. Especialmente, se prevén las combinaciones con otras modificaciones conocidas en la técnica para proporcionar propiedades mejoradas a la enzima. La técnica describe varias variantes de subtilasa con diferentes propiedades mejoradas y varias de ellas están mencionadas en la sección "Antecedentes de la invención" de la presente (vide supra). Estas referencias están descritas aquí como referencias para identificar una variante de subtilasa, que ventajosamente puede ser combinada con una variante de subtilasa según la invención.
Las combinaciones de este tipo comprenden las posiciones: 222 (mejora de la estabilidad a la oxidación), 218 (mejora de la termoestabilidad), sustituciones en los sitios de unión al Ca que estabilizan la enzima, p. ej. posición 76, y muchas otras evidentes a partir de la técnica anterior.
En formas de realización adicionales, una variante de subtilasa de la invención puede ventajosamente ser combinada con una o más modificación(es) en cualquiera de las posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
Específicamente las siguientes variantes BLSAVI, BLSUBL, BSKSMK, y BAALKP están consideradas apropiadas para la combinación: K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101G, S103A, V104A, V104I, V104N, V104Y, H120D, N123S, Y167;R170;Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L y T274A.
Además las variantes que comprenden cualquiera de las variantes S101G+V104N, S87N+S101G+V104N, K27R+
V104Y+N123S+T274A, N76D+S103A+V104I o N76D+V104A u otras combinaciones de estas mutaciones (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A) en combinación con una o más de la(s) modificación(es) anteriormente mencionada(s) presentan propiedades mejoradas.
Incluso las variantes de subtilasas adicionales con el(los) aspecto(s) principal(es) de la invención son preferiblemente combinadas con una o más modificación(es) en cualquiera de las posiciones 129, 131, 133 y 194, preferiblemente como las modificaciones 129K, 131H, 133P, 133D y 194P, y más preferiblemente como las modificaciones P129K, P131 H, A133P, A133D y A194P. Se prevé que cualquiera de estas modificación(es) proporcionen un nivel de expresión más alto de una variante de subtilasa de la invención en la producción de la misma.
Por consiguiente, incluso una forma de realización adicional de la invención se refiere a una variante según la invención, donde dicha modificación es elegida del grupo que comprende:
Producción de una variante de subtilasa
Muchos métodos para la clonación de una subtilasa de la invención y para introducir inserciones en genes (p. ej. genes de la subtilasa), son bien conocidos en la técnica, cf. referencias citadas en la sección "Antecedentes de la invención".
En general, se pueden utilizar los procedimientos estándar para la clonación de genes y para la introducción de inserciones (aleatorias y/o sitio dirigidas) en dichos genes para obtener una variante de subtilasa según la invención. Para una descripción adicional de las técnicas adecuadas se hace referencia a los Ejemplos aquí (véase abajo) y (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (Eds) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990); y WO 96/
34946.
Además una variante de subtilasa de la invención puede ser construida por técnicas estándar para la creación artificial de diversidad, tal como por redistribución de ADN de diferentes genes de subtilasa (WO 95/22625; Stemmer WPC, Nature 370:389-91 (1994)). La redistribución del ADN de p. ej. el gen que codifica Savinase® con una o más secuencias de la subtilasa parciales identificadas en la naturaleza por comprender unas regiones del bucle del centro activo (b) más largas que el bucle del centro activo (b) de Savinase®, después de la selección posterior para variantes del rendimiento del lavado mejorado, proporcionarán variantes de la subtilasa según la invención.
Vectores de expresión
Un vector de expresión recombinante que comprende un constructo de ADN que codifica la enzima de la invención puede ser cualquier vector que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante.
La elección del vector frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que será introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma alternativa, el vector puede ser uno que al introducirse en una célula huésped se integre en el genoma de la célula huésped en parte o en totalmente y se replique con el(los) cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado.
El vector es preferiblemente un vector de expresión donde la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención está operativamente enlazada a segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión está derivado del ADN plásmido o vírico, o puede contener elementos de ambos. El término, "operativamente enlazado" indica que los segmentos están dispuestos de modo que funcionen en concierto para sus objetivos previstos, p. ej. la transcripción se inicia en un promotor y continua a través de la secuencia de ADN codificando para la enzima.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que presente actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede derivar de los genes que codifican proteínas bien homólogas o heterólogas a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en células huéspedes bacterianas incluyen el promotor del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, el gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de proteasa alcalina de Bacillus subtilis, o el gen de xilosidasa de Bacillus pumilus, o los promotores P_{R} o P_{L} del fago Lambda o los promotores lac, trp o tac de E. coli.
La secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención puede también, en caso de necesidad, ser operativamente conectada a un terminador adecuado.
El vector recombinante de la invención puede además comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped en cuestión.
El vector puede también comprender un marcador seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto implemente un defecto en la célula huésped, o un gen que codifique la resistencia p. ej. a los antibióticos como la canamicina, el cloranfenicol, la eritromicina, la tetraciclina, la espectinomicina, o similares, o la resistencia a los metales pesados o herbicidas.
Para dirigir una enzima de la presente invención en la vía secretora de las células huéspedes, una secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia guía, secuencia prepro o secuencia pre) puede ser proporcionada en el vector recombinante. La secuencia señal secretora está unida a la secuencia de ADN que codifica la enzima en el marco de lectura correcto. Las secuencias señales secretoras son situadas de forma común en 5' en la secuencia de ADN que codifica la enzima. La secuencia señal secretora puede ser aquella normalmente asociada con la enzima o puede provenir de un gen que codifica otra proteína segregada.
Los procedimientos usados para enlazar las secuencias de ADN que codifican para esta enzima, el promotor y opcionalmente el terminador y/o secuencia señal secretora, respectivamente, o para ensamblar estas secuencias por esquemas de amplificación por PCR adecuados, y para insertarlos en vectores adecuados conteniendo la información necesaria para la replicación o integración, son conocidos por los expertos en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook et Al., op.cit.).
Célula huésped
La secuencia de ADN que codifica la presente enzima introducida en la célula huésped puede ser bien homóloga o heteróloga al huésped en cuestión. Si fuera homóloga a la célula huésped, es decir producida por la célula huésped en la naturaleza, normalmente será operativamente conectada a otra secuencia del promotor o, si fuera aplicable, a otra secuencia señal secretora y/o secuencia de terminación distinta de la de su medio natural. El término "homóloga" se destina a incluir una secuencia de ADN que codifica una enzima nativa al organismo huésped en cuestión. El término "heteróloga" se destina a incluir una secuencia de ADN no expresada por la célula huésped en la naturaleza. Así, la secuencia de ADN puede ser de otro organismo, o puede ser una secuencia sintética.
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La célula huésped en la que se introduce el constructo de ADN o el vector recombinante de la invención puede ser cualquier célula que sea capaz de producir esta enzima e incluye bacterias, levadura, hongos y células eucarióticas superiores, incluidas las plantas.
Ejemplos de células huéspedes bacterianas que, durante el cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son las bacterias gram-positivas tales como las cepas de Bacillus, tales como cepas de B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium o B. thuringiensis, o cepas de Streptomyces, tales como S. lividans o S. murinus, o bacterias gram-negativas tales como Escherichia Coli.
La transformación de las bacterias puede ser efectuada por transformación del protoplasto, electroporación, conjugación, o usando células competentes conocidas per se (cf. Sambrook et al., supra).
Cuando se expresa la enzima en bacterias tales como E. coli, la enzima puede ser retenida en el citoplasma, normalmente como gránulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión), o pueden ser dirigidos al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En este caso, las células son lisadas y los gránulos son recuperados y desnaturalizados tras lo cual la enzima es redoblada diluyendo el agente desnaturalizante. En este caso, la enzima puede ser recuperada del espacio periplásmico interrumpiendo las células, p. ej. por sonicación o choque osmótico, para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la enzima.
Al expresarse la enzima en bacterias gram-positivas tales como cepas de Bacillus o Streptomyces, la enzima puede ser retenida en el citoplasma, o puede ser dirigida al medio extracelular por una secuencia de secreción bacteriana. En este caso, la enzima puede ser recuperada del medio como se describe abajo.
Método para producir subtilasa
La presente invención proporciona un método para producir una enzima aislada según la invención, donde una célula huésped adecuada, que ha sido transformada con una secuencia de ADN que codifica la enzima, es cultivada bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es recuperada del cultivo.
Cuando un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la enzima es transformada en una célula huésped heteróloga es posible permitir la producción heteróloga recombinante de la enzima de la invención.
De ese modo es posible hacer una composición de subtilasa muy purificada, caracterizada por estar libre de impurezas del homólogo.
En este contexto impurezas del homólogo se refieren a cualquier impureza (p. ej. otros polipéptidos distintos de la enzima de la invención) que se origina a partir de la célula homóloga a partir de la cual se obtiene la enzima de la invención originalmente.
El medio usado para cultivar las células huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para que crezcan las células huéspedes en cuestión. La subtilasa expresada puede convenientemente ser segregada en el medio de cultivo y puede ser recuperada de éste por procedimientos bien conocidos incluyendo la separación de las células del medio por centrifugado o filtración, precipitación de los componentes proteínicos del medio y mediante una sal tal como sulfato amónico, seguido de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio fónico, cromatografía de afinidad, o similares.
Uso de una variante de subtilasa según la invención
Una variante de proteasa de subtilasa de la invención puede ser usada para varias aplicaciones industriales, en particular para la industria de los detergentes.
Además la invención se refiere a una composición enzimática, que comprende una variante de subtilasa de la invención.
Un resumen de las aplicaciones preferidas industriales y de las composiciones enzimáticas correspondientes están descritas más abajo.
Este resumen no está de ninguna manera destinado a ser una lista completa de aplicaciones adecuadas de una variante de subtilasa de la invención. Unas variantes de subtilasa de la invención pueden ser usadas en otras aplicaciones industriales conocidas en la técnica por incluir el uso de una proteasa, en particular una subtilasa.
Composiciones de detergentes que comprenden las enzimas mutantes
La presente invención comprende el uso de las enzimas mutantes de la invención en composiciones de limpieza y de detergentes y composiciones que comprenden las enzimas subtilisinas mutantes. Las composiciones de limpieza y de detergentes de este tipo están bien descritas en la técnica y se hace referencia a WO 96/34946; WO 97/07202; WO 95/30011 para una descripción adicional de las composiciones de limpieza y de detergentes adecuadas.
Además el(los) ejemplo(s) sucesivos demuestran las mejoras en el rendimiento del lavado para varias variantes de subtilasa según la invención.
Composiciones de detergentes
La enzima de la invención puede ser añadida y así volverse un componente de una composición de detergente.
La composición de detergente de la invención puede por ejemplo ser formulada como una composición para el lavado a mano o a máquina incluyendo una composición aditiva adecuada para el pretratamiento de tejidos teñidos y una composición de suavizante de tejidos añadida al enjuague, o puede ser formulada como una composición de detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general, o puede ser formulada para operaciones de lavavajillas a mano o a máquina.
En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo de detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo de detergente al igual que la composición de detergente puede comprender una o más enzimas tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, p. ej., una lacasa, y/o una peroxidasa.
En general, las propiedades de la(s) enzima(s) elegida(s) deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) debería(n) estar presente(s) en cantidades eficaces.
Proteasas: las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metalo proteasa, preferiblemente una proteasa alcalina microbiana o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, p. ej., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina - 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (p. ej. de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583.
Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
Enzimas proteásicas preferidas comercialmente disponibles incluyen Alcalase^{TM}, Savinase^{TM}, Primase^{TM}, Durala-
se^{TM}, Esperase^{TM}, y Kannase^{TM} (Novo Nordisk NS), Maxatase^{TM}, Maxacal^{TM}, Maxapem^{TM}, Properase^{TM}, Purafect^{TM}, Purafect OxP^{TM}, FN2^{TM}, y FN3^{TM} (Genencor International Inc.).
Lipasas: las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humacola (sinónimo Thermomyces), p. ej. de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o de H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, p. ej. de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1, 372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, p. ej. de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422).
Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como aquellas descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.
Las enzimas lipasas preferidas comercialmente disponibles incluyen Lipolase^{TM} y Lipolase Ultra^{TM} (Novo Nordisk NS).
Amilasas: las amilasas adecuadas (\alpha y/o \beta) incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Las amilasas incluyen, por ejemplo, \alpha-amilasas obtenidas de Bacillus, p. ej. una cepa especial de B. licheniformis, descrita con más detalle en GB 1,296,839.
Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444.
Las amilasas comercialmente disponibles son Duramyl^{TM}, Termamyl^{TM}, Fungamyl^{TM} y BAN^{TM} (Novo Nordisk NS), Rapidase^{TM} y Purastar^{TM} (de Genencor International Inc.).
Celulasas: las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej. las celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259.
Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios en el cuidado de los colores. Ejemplos de celulasas de este tipo son las celulasas descritas en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como aquellas descritas en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
Las celulasas comercialmente disponibles incluyen Celluzyme^{TM} y Carezyme^{TM} (Novo Nordisk NS), Clazinase^{TM}, y Puradax HA^{TM} (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)^{TM} (Kao Corporation).
Peroxidasas/oxidasas: las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Los mutantes modificados químicamente o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen las peroxidasas de Coprinus, p. ej. de C. cinereus, y variantes de las mismas como aquellas descritas en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257.
Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen Guardzyme^{TM} (Novo Nordisk NS).
La(s) enzima(s) para detergente(s) pueden ser incluidas en una composición de detergente añadiendo aditivos separados que contienen una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprenda todas estas enzimas. Un aditivo de detergente según la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado p. ej. como un granulado, un líquido, una pasta, etc. Las formulaciones del aditivo de detergente preferidas son granulados, en particular granulados no pulverulentos, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o
mezclas.
Los granulados no pulverulentos pueden ser producidos, p. ej., como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 y pueden opcionalmente ser revestidos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento encerado son productos de poli(etileno óxido) (polietilenoglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados con de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes etoxilados grasos donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman películas adecuadas para la aplicación por técnicas de lecho fluidificado están proporcionados en GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenoglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según los métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden ser preparadas según el método descrito en EP 238,216.
La composición de detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, p. ej., una barra, una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, normalmente conteniendo hasta un 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso.
La composición de detergente comprende uno o más agentes tensoactivos, que pueden ser no iónicos incluso semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los agentes tensoactivos están normalmente presentes a un nivel del 0.1% al 60% en peso.
Cuando se incluyen en ellos el detergente normalmente contendrá de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 40% de un agente tensoactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, alquil sulfato (sulfato de alcohol graso), alcohol etoxisulfato, alcanosulfonato secundario, éster metílico del ácido alfa-sulfo graso, ácido o jabón alquil- o alquenilsuccínico.
Cuando se incluye en ellos el detergente normalmente contiene de aproximadamente 0,2% a aproximadamente el 40% de un agente tensoactivo no iónico tal como alcohol etoxilato, nonilfenol etoxilato, alquilpoliglicósido, alquildimetilaminóxido, monoetanolamida del ácido graso etoxilado, monoetanolamida del ácido graso, amida del ácido polihidroxi alquil graso, o derivados N-acil N-alquil de glucosamina ("glucamidas").
El detergente puede contener 0-65% de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil- o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).
El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli (etilenglicol), poli(vinil alcohol), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico y copolímeros de ácido de metacrilato/acrílico.
El detergente puede contener un sistema blanqueante que puede comprender una fuente de H_{2}O_{2} tal como perborato o percarbonato que puede ser combinada con un activador de la decoloración formador de perácido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. De forma alternativa, el sistema blanqueante puede comprender peroxiácidos p. ej. del tipo amida, imida, o sulfona.
La(s) enzima(s) de la composición de detergente de la invención puede(n) ser estabilizada(s) usando agentes convencionales estabilizantes, p. ej., un poliol tal como propilenoglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado del ácido bórico, p. ej., un éster del borato aromático, o un derivado del ácido fenil borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico, y la composición puede ser formulada como se describe en p. ej. WO 92/19709 y WO 92/19708.
El detergente puede también contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como p. ej. acondicionadores del tejido que incluyen arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de la suciedad, agentes de antirreposición de la suciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrótropos, inhibidores de la decoloración, o perfumes.
Está actualmente contemplado que en las composiciones de detergentes cualquier enzima, en particular la enzima de la invención, puede ser añadida en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, preferiblemente 0,05-5 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, en particular 0,1-1 mg de enzima proteína por litro de solución de lavado.
La enzima de la invención puede adicionalmente ser incorporada en las formulaciones de detergentes descritas en WO 97/07202 que están incorporadas en la presente como referencia.
Aplicaciones en la industria del cuero
Una subtilasa de la invención puede ser usada en la industria del cuero, en particular para el uso en la depilación de pieles.
En dicha aplicación una variante de la subtilasa de la invención es preferiblemente usada en una composición enzimática que además comprende otra proteasa.
Para una descripción más detallada de otras proteasas adecuadas ver sección acerca de enzimas adecuadas para el uso en una composición de detergente (véase arriba).
Aplicaciones de la industria de la lana
Una subtilasa de la invención puede ser usada en la industria de la lana, en particular para el uso en la limpieza de la ropa que comprende lana.
En dicha aplicación una variante de la subtilasa de la invención es preferiblemente usada en una composición enzimática que además comprende otra proteasa.
Para una descripción más detallada de otras proteasas adecuadas ver sección sobre enzimas adecuadas para el uso en una composición de detergente (véase arriba).
La invención está descrita con más detalle en los siguientes ejemplos que no están de ninguna manera destinados a limitar el objetivo de la invención según se reivindica.
Materiales y métodos Cepas
B. subtilis DN1885 (Diderichsen et Al., 1990).
B. lentus 309 y 147 son cepas específicas de Bacillus lentus, depositadas con el NCIB y a las que se les ha acordado los números de accesión NCIB 10309 y 10147, y descritas en la patente estadounidense nº. 3,723,250 incorporada aquí por referencia.
E. coli MC 1000 (M.J. Casadaban y S.N. Cohen (1980); J. Mol. Biol. 138 179-207), fue hecha r^{-},m^{+} por métodos convencionales y está también descrita en la solicitud de patente estadounidense serie nº. 039,298.
Plásmidos
pJS3: vector transportador de E. coli - B. Subtilis que contiene una codificación del gen sintético para subtilasa 309. (Descrito por Jacob Schi\diameterdt et al. en Protein and Peptide letters 3:39-44 (1996)).
pSX222: vector de expresión de B. subtilis (descrito en WO 96/34946).
Métodos de biología molecular general
A menos que se indique lo contrario las manipulaciones y transformaciones del ADN fueron realizadas usando métodos estándar de biología molecular (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (Eds) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Las enzimas para manipulaciones del ADN fueron usadas según las especificaciones de los proveedores.
Enzimas para manipulaciones de ADN
A menos que se indique lo contrario todas las enzimas para manipulaciones de ADN, tales como p. ej. endonucleasas de resticción, ligasas etc., son obtenidas de New England Biolabs, Inc.
Actividad proteolítica
En el contexto de esta invención la actividad proteolítica está expresada en Kilo NOVO unidades de proteasa (KNPU). La actividad está determinada con respecto a una enzima estándar (SAVINASE®), y la determinación se basa en la digestión de una solución de dimetil caseína (DMC) por la enzima proteolítica en condiciones estándar, es decir 50ºC, pH 8.3,9 min. tiempo de reacción, tiempo de medición 3 min.. Una carpeta AF 220/1 está disponible bajo pedido a Novo Nordisk NS, Dinamarca, la cual está incluida en la presente por referencia.
Una GU es una unidad de glicina, definida como la actividad enzimática proteolítica que, bajo condiciones estándar, durante una incubación de 15 minutos a 40ºC, con N-acetil caseína como sustrato, produce una cantidad del grupo NH_{2} equivalente a 1 mmol de glicina.
La actividad enzimática puede también ser medida usando el ensayo de PNA, según la reacción con el sustrato soluble succinil-alanina-alanina-prolina-fenil-alanina-para-nitro-fenol, que está descrito en la revista Journal of American Oil Chemists Society, Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., and Smith, L.A., (1988).
Fermentación
Las fermentaciones para la producción de enzimas subtilasas fueron realizadas a 30ºC en una mesa de vibración giratoria (300 r.p.m.) en frascos de Erlenmeyer de 500 ml disipados que contenían 100 ml de medio BPX durante 5 días.
Por consiguiente con el objetivo de hacer un caldo de p. ej. 20 frascos de Erlenmeyer de 2 litros fueron fermentados simultáneamente.
Medios
Composición de Medio BPX (por litro)
Almidón de patata 100 g
Cebada molida 50 g
Harina de soja 20 g
Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O 9 g
Plurónico 0.1 g
Caseinato sódico 10 g
El almidón en el medio es licuado con \alpha-amilasa y el medio es esterilizado calentando a 120ºC durante 45 minutos. Después de la esterilización el pH del medio es ajustado a 9 por adición de NaHCO_{3} a 0.1 M.
Ejemplo 1 Construcción y expresión de variantes enzimáticas Mutagénesis sitio dirigida
Las variantes sitiodirigidas de Subtilasa 309 según la invención que comprenden inserciones específicas en el bucle del centro activo (b) entre las posiciones 99 y 100 fueron hechas por clonación tradicional de fragmentos de ADN (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989) producidos por PCR de oligos que contienen las inserciones deseadas (ver más abajo).
El ADN plásmido del molde fue pJS3, o un análogo de éste conteniendo una variante de subtilasa 309.
Se introdujeron inserciones por mutagénesis oligo dirigida a la construcción de las variantes de inserción S99SX (X = cualquier residuo aminoácido insertado entre las posiciones 99 y 100) dando como resultado variantes S99SX de subtilasa 309.
Las variantes de subtilasa 309 fueron transformadas en E. coli. El ADN purificado de un cultivo durante la noche de estos transformantes fue transformado en B. subtilis por digestión de la endonucleasa de restricción, purificación de fragmentos de ADN, ligadura, transformación de B. subtilis. La transformación de B. subtilis fue realizada como se describe por Dubnau et Al., 1971, J. Mol. Biol. 56, págs. 209-221.
Mutagénesis aleatoria localizada para insertar inserciones aleatorias en una región localizada
La estrategia global para ser usada para desempeñar la mutagénesis aleatoria localizada fue:
un cebador mutagénico (oligonucleótido) fue sintetizado correspondiente a la secuencia de ADN que flanquea el sitio de inserción, separado por los pares de bases del ADN que definen la inserción.
Posteriormente, el cebador mutagénico resultante fue usado en una reacción PCR con un cebador adecuado opuesto. El fragmento de la PCR resultante fue purificado y extendido en una segunda reacción de PCR, antes de ser digerido por endonucleasas y clonado en el vector transportador de E. coli - B. subtilis (ver más abajo).
De forma alternativa, y en caso de necesidad, el resultante fragmento de la PCR se usa en una segunda reacción PCR como un cebador con un segundo cebador adecuado opuesto para permitir la digestión y la clonación de la región mutagenizada en el vector transportador. Las reacciones de la PCR son realizadas en condiciones normales.
Según esta estrategia una biblioteca aleatoria localizada fue construida en SAVINASE donde se introdujeron inserciones en la región del bucle del centro activo entre las posiciones 99 y 100.
Las mutaciones fueron introducidas por cebadores mutagénicos (ver más abajo), de modo que los 20 aminoácidos estuvieran representados (N = 25% de A, T, C, y G; siendo S = 50% de C y G. El fragmento de PCR producido fue extendido hacia el-N- terminal de SAVINASE por otra PCR por combinación de una secuencia superpuesta con un fragmento de la PCR producido por amplificación por PCR con los cebadores; 5' CTA AAT ATT CGT GGTGGC GC 3' (sentido) y 5' GAC TTT AAC AGC GTA TAG CTC AGC 3' (antisentido). Los fragmentos de ADN extendidos fueron clonados en el los sitios Hind III- y Mlu I del plásmido pJS3 modificado (ver más arriba), y después las colonias de E. coli fueron elegidas de forma aleatoria fueron ordenadas para confirmar las mutaciones diseñadas.
El cebador mutagénico (5' GTT AAA GTC CTA GGG GCG AGC NNS GGT TCA GGT TCG GTC AGC TCG 3' (sentido) fue usado en una reacción PCR con un cebador antisentido adecuado opuesto, situado hacia abajo del sitio Mlu I en pJS3 (p. ej. 5'- CCC TTT AAC CGC ACA GCG TTT -3' (antisentido) y el plásmido pJS3 como molde. Este producto resultante de la PCR fue clonado en el vector transportador pJS3 usando las enzimas de restricción Hind III y Mlu I.
La biblioteca aleatoria fue transformada en E. coli por técnicas bien conocidas.
La biblioteca preparada contenía aproximadamente 100.000 clones individuales/biblioteca.
Diez colonias elegidas de forma aleatoria fueron ordenadas para confirmar las mutaciones diseñadas.
Para purificar una variante de subtilasa de la invención, el plásmido de expresión pJS3 de B. subtilis que comprende una variante de la invención fue transformado en una cepa competente de B. subtilis. y fue fermentado según el modo descrito anteriormente en un medio conteniendo 10 \mug/ml de cloranfenicol (CAM).
Ejemplo 2 Purificación de variantes enzimáticas
Este procedimiento se refiere a la purificación de una fermentación a escala de 2 litros para la producción de las subtilasas según la invención en una célula huésped de Bacillus.
Aproximadamente 1,6 litros de caldo de fermentación fueron centrifugados a 5000 rpm durante 35 minutos en un vaso de precipitación de 1 litro. Los sobrenadantes fueron ajustados a pH 6.5 usando el 10% de ácido acético y filtrados en placas de filtración Seitz Supra S100.
Los productos filtrados fueron concentrados hasta aproximadamente 400 ml usando una unidad de UF Amicon CH2A equipada con un cartucho de UF Amicon S1Y10. El concentrado de UF fue centrifugado y filtrado antes de la absorción a la temperatura ambiente en una columna de afinidad de Bacitracina a pH 7. La proteasa fue eluida de la columna de bacitracina a la temperatura ambiente usando el 25% de 2-propanol y 1 M de cloruro sódico en una solución tamponada con 0,01 ácido dimetilglutárico, 0,1 M de ácido bórico y 0,002 M de cloruro de calcio ajustado a pH 7.
Las fracciones con actividad proteasa de la fase de purificación de bacitracina fueron combinadas y aplicadas a una columna de 750 ml Sephadex G25 (5 cm diám.) equilibrada con un tampón conteniendo 0,01 ácido dimetilglutárico, 0,2 M de ácido bórico y 0,002 M de cloruro de calcio ajustado a pH 6.5.
Las fracciones con actividad proteolítica de la columna Sephadex G25 fueron combinadas y aplicadas a una columna de intercambio de cationes de 150 ml CM Sepharose CL 6B (5 cm diám.) equilibrada con un tampón conteniendo 0,01 M de ácido dimetilglutárico, 0,2 M de ácido bórico, y 0,002 M de cloruro de calcio ajustado a pH 6.5.
La proteasa fue eluida usando un gradiente lineal de 0-0,1 M de cloruro sódico en 2 litros del mismo tampón (0-0,2 M de cloruro sódico en el caso de la Subtilisina 147).
En una fase de purificación final, las fracciones que contenían proteasa de la columna CM Sepharose fueron combinadas y concentradas en una célula de ultrafiltración Amicon equipada con una membrana GR81 PP (de Danish Sugar Factories Inc.).
Usando las técnicas del Ejemplo 1 para la construcción y fermentación, y el procedimiento de aislamiento anterior, se produjeron y aislaron las siguientes variantes de la subtilisina 309:
S99ST
S99SS
S99SD
S99SE
S99SP
S99SG
S99SH
S99SI
S99SA
S99TP
S99TK
S99TN
S99TQ
S99TR
S99SSG
S99ST+Y167A
S99TG+S101G
S99ASG+S101T
S99TC+S101C
A98G+S99SQ
Estas variantes presentan mejor rendimiento de lavado que la SAVINASE en un ensayo preliminar.
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Ejemplo 3 Rendimiento del lavado de composiciones de detergentes que comprenden variantes de enzimas
Los ejemplos siguientes proporcionan resultados de varias pruebas de lavado que fueron realizadas según las condiciones indicadas
Mini lavado Condiciones del lavado
1 
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Detergentes
Los detergentes usados fueron bien un detergente modelo, llamado Detergente 95 u obtenido de supermercados en Dinamarca (OMO, datasheet ED-9745105) y en EEUU (Wisk, datasheet ED-9711893)-, respectivamente. Antes del uso toda la actividad enzimática en los detergentes fue inactivada por tratamiento por microondas.
Detergente 95 es una formulación modelo simple. El pH es ajustado a 10.5 que está dentro de la gama normal para un detergente en polvo. La composición de detergente modelo 95 es la siguiente:
25% STP (Na_{5}P_{3}O_{10})
25% Na_{2}SO_{4}
10% Na_{2}CO_{3}
20% LAS (Nansa 80S)
5.0% Agente tensoactivo no iónico (Dobanol 25-7)
5.0% Na_{2}Si_{2}O_{5}
0.5% Carboximetilcelulosa (CMC)
9.5% Agua
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Muestras
Las muestras usadas fueron EMPA116 y EMPA117, obtenidas de EMPA Testmaterialen, Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gall, Suiza.
Reflectancia
La medición de reflectancia (R) en el material de la prueba fue realizada a 460 nm usando un fotómetro Macbeth ColorEye 7000. Las mediciones fueron realizadas según el protocolo del fabricante.
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Evaluación
La evaluación del rendimiento del lavado de una subtilasa está determinada bien por el factor de mejora o bien por el factor del rendimiento para la subtilasa investigada.
El factor de mejora, IF_{Dosis/respuesta}, está definido como la proporción entre las inclinaciones de las curvas del rendimiento del lavado para un detergente que contiene la subtilasa investigada y el mismo detergente que contiene una subtilasa de referencia en la concentración asintótica de la subtilasa va a cero
IF_{Dosis/respuesta}= a/a_{ref}
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El rendimiento del lavado se calcula según la fórmula I:
(I);R = R_{0} + \frac{a \cdot \Delta R_{max} \cdot c}{\Delta R_{max} + a \cdot c}
donde
R es el rendimiento del lavado en unidades de reflectancia; R_{0} es el intercepto de la curva ajustada con el eje y (ciego); a es la pendiente de la curva ajustada si c \rightarrow 0; c es la concentración enzimática; y \DeltaR_{max} es el efecto de lavado máximo teórico si c \rightarrow \infty.
El factor del rendimiento, P, se calcula según la fórmula II
(II)P = \frac{R_{variante} - R_{blanco}}{R_{Savinase} - R_{blanco}}
donde
R_{variante} es la reflectancia del material de la prueba lavado con 10 nM de variante; R_{savinase} es la reflectancia del material de la prueba lavado con 10 nM de Savinase; R_{blanco} es la reflectancia del material de la prueba lavado sin enzima
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Detergente Modelo 95
3
US (detergente: US Wisk, muestra: EMPA117)
4
Se ve que las subtilasas de las invenciones muestran por tanto un rendimiento de lavado mejorado en comparación con Savinase®.
<110> Novo Nordisk A/S
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<120> Enzimas subtilasa de los subgrupos I-S1 y I-S2 con un residuo de aminoácidos adicional en una región del bucle del centro activo.
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<130> 5794.204
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<140>
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<141>
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<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 275
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<212> PRT
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<213> Bacillus lincheniformis 
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<400> 1
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5
6 
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<210> 2
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<211> 270
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<212> PRT
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<213> Bacillus lentus 
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<400> 2
7
8

Claims (25)

1. Enzima subtilasa aislada de los subgrupos I-S1 y I-S2 que tiene al menos un residuo aminoácido adicional en la posición 99 de la región del bucle del centro activo (b) desde la posición 95 a 103, donde dicha enzima subtilasa comprende una modificación seleccionada del grupo que cosiste en:
S99ST,
S99SS,
S99SP,
S99SG,
S99SI,
S99SA,
S99TP,
S99TN,
S99TQ y
S99SQ.
2. Enzima subtilasa aislada según la reivindicación 1, donde dicho al menos un residuo aminoácido adicional, comprende más de un residuo aminoácido adicional o insertado en el bucle del centro activo (b).
3. Enzima subtilasa aislada según la reivindicación 2, que comprende las modificaciones: S99SSG.
4. Enzima subtilasa aislada según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha(s) inserción(es) entre las posiciones 99 y 100 son combinadas con una o más modificación(es) adicional(es) en otra posición(es) cualquie-
ra.
5. Enzima subtilasa aislada según la reivindicación 4, donde dicha(s) modificación(es) adicional(es) está(n) en una o más de las posiciones 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 129, 131, 133, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
6. Enzima subtilasa aislada según la reivindicación 5, que comprende una de las modificaciones: S99ST+Y167A, S99TG+S101G, S99TC+S101C, A9BG+S99SQ o S99ASG+S101T.
7. Enzima subtilasa aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la enzima subtilasa pertenece al subgrupo I-SI.
8. Enzima subtilasa aislada según la reivindicación 7, que es elegida del grupo que cosiste en BSSDY y BLSCAR.
9. Enzima subtilasa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la subtilasa pertenece al subgrupo I-S2.
10. Enzima subtilasa aislada según la reivindicación 9, que está elegida del grupo que consiste en BLS309 y BAALKP.
11. Enzima subtilasa aislada de cualquiera de reivindicaciones 9-10, donde dicha(s) modificación(es) adicional(es)
es (son) elegida(s) del grupo que consiste en K27R, *36D, S57P, N76D, S87N, G97N, S101 G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, P129K, P131H, A133P, A133D, Y167X, R170X, A194P, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L y T274A.
12. Enzima subtilasa aislada según la reivindicación 11, donde dicha(s) modificación(es) adicional(es) es (son) elegida(s) del grupo que consiste en S101G+V104N, S87N+S101 G+V104N, K27R+V104Y+N123S+T274A, N76D+
S103A+V1041 o N76D+V104A, u otras combinaciones de estas mutaciones (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A), en combinación con una o más de las sustituciones y/o inserciones mencionada(s) en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
13. Enzima subtilasa aislada según la reivindicación 1, dicha enzima subtilasa pertenece al subgrupo I-S1 y tiene la secuencia de aminoácidos:
9
14. Enzima subtilasa aislada según la reivindicación 1, esta enzima subtilasa pertenece al subgrupo I-S2 y tiene la secuencia de aminoácidos:
10
15. Enzima subtilasa aislada según las reivindicaciones 13 o 14, donde X en la posición 99a está elegido del grupo que consiste en T, A, G, S y P.
16. Secuencia de ADN aislada que codifica una enzima subtilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. Vector de expresión que comprende una secuencia de ADN aislada según la reivindicación 16.
18. Célula huésped microbiana transformada con un vector de expresión según la reivindicación 17.
19. Huésped microbiano según la reivindicación 18, que es una bacteria, preferiblemente Bacillus, especialmente B. lentus.
20. Huésped microbiano según la reivindicación 18, que es un hongo o levadura, preferiblemente un hongo filamentoso, especialmente Aspergillus.
21. Método para la producción de una enzima subtilasa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde un huésped de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 es cultivado bajo condiciones propicias para la expresión y secreción de dicha enzima subtilasa, y se recupera la enzima subtilasa.
22. Composición que comprende una enzima subtilasa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
23. Composición según la reivindicación 22, que adicionalmente comprende una celulasa, lipasa, cutinasa, oxidorreductasa, otra proteasa, o una amilasa.
24. Composición según la reivindicación 22 o 23, donde la composición es una composición de detergente.
25. Uso de una enzima subtilasa aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o una composición enzimática según las reivindicaciones 22 o 23 en un detergente para la ropa y/o para lavavajillas.
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