ES2282266T3 - Produccion combinatoria de analogos de nucleotidos y de nucleosidos "(xitp)". - Google Patents
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Abstract
Compuestos de fórmula general I (Ver fórmula) en la que - el grupo R1 representa un grupo elegido entre los grupos fosfato, difosfato o trifosfato y los grupos protectores como el DMT. - R2 y R2¿ se eligen independientemente el uno del otro entre H, OH, la fosforamidita y sus derivados, el Hfosfonato y un terminador de alargamiento T, R3 se elige entre H, OH, los halógenos (F, Br, Cl, I), un grupo alquilo lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono y un grupo O-R5, representando R5 un grupo alquilo lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono, - R3¿ se elige entre OH, los halógenos (F, Br, Cl, I), un grupo alquilo lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono y un grupo O-R5, representando R5 un grupo alquilo lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono, - R4 representa un heterociclo sustituido por un grupo de fórmula (Ver fórmula) cuyo grupo está ligado al heterociclo, bien directamente, bien por intermedio de un brazo espaciador E constituido por una cadena carbonada de 1 a 20 átomos de carbono saturada o no, que comprende o no heteroátomos y/o eventualmente sustituido; estando seleccionado dicho heterociclo entre: R4 está seleccionado entre a) los heterociclos sustituidos de 5 átomos de fórmula: (Ver fórmula) en la que E es un brazo espaciador como se ha definido anteriormente o que no existe , en la que X representa independientemente los unos de los otros - un grupo CH - un grupo C-R6, R6 está elegido entre los halógenos (F, Br, Cl, I), un grupo alquilo lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono.
Description
Producción combinatoria de análogos de
nucleótidos y de nucleósidos "(XiTP)".
Esta invención se refiere a nuevos análogos de
nucleótidos que comprenden una función reactiva hidrazida (fórmula
II) que sirve de sintones de partida para la preparación de
compuestos (fórmula I) que pueden inducir mutaciones o que son
capaces de inhibir una ADN polimerasa o una quinasa. La invención se
refiere igualmente a los ácidos nucleicos que comprenden dichos
análogos de nucleósidos y nucleótidos.
Los inhibidores nucleótidos actualmente
disponibles (aciclovir, ganciclovir, AZT, ddC, d4T, 3TC) presentan
efectos secundarios no deseables con el tratamiento de larga
duración y de administraciones repetidas. Por una parte, la
toxicidad intrínseca de estos análogos de nucleótidos proviene
particularmente del hecho de que pueden carecer de especificidad
frente a una polimerasa o de una transcriptasa inversa dada. Por
otra parte, al cabo de un cierto tiempo, los virus se hacen
resistentes a estos inhibidores incluso si se aumentan las
dosis.
Otros análogos de nucleótidos se citan en la
literatura por tener efectos antivirales (Witkowski, J.T et
al., 1972, J. Med. Chem., 15(11):
1150-1154) o antitumorales (Nedorezova, T.P. et
al., 1986, Khim-Farm. Zh
20(11):1299-1302). Se han descrito
diferentes vías de síntesis de análogos de nucleótidos (García
López. M.T et al., 192, J. Heterocyclic. Chem.,
19:233-235), Shingarova, I.D. et al., 1987,
Khim, Geterotsikl, Soedin. (2):231-235),(Shingarova,
I.D et al., 1987, Khim. Geterotsikl, Soedin.
(7):937-940). Sin embargo, estos últimos no permiten
generar una gran diversidad de compuestos que pueden inducir la
inhibición de polimerasas o de quinasas.
La síntesis de nuevos inhibidores nucleótidos
representa un desafío importante para renovar los métodos de
tratamientos de infecciones virales como el HIV, CMV y el HSV.
Hutchinson, 1990 muestra que existen numerosas dificultades ligadas
a la síntesis de vastas colecciones de nucleótidos modificados. Por
ejemplo, parece necesario proteger las funciones reactivas de las
bases o de las ribosas con cualquier adición o modificación de
grupos.
La invención permite paliar estas dificultades
gracias a un sinton de base que permite la obtención de una sola
etapa de una biblioteca de análogos de nucleótidos o de nucleósidos.
Gracias a estas bibliotecas, se puede, por ejemplo, cribar
inhibidores altamente específicos de la transcriptasa inversa del
HIV.
La preparación de nuevos nucleótidos a los
apareamientos ambiguos, es decir, capaces de incorporarse al tallo
cebo en respuesta a más de una entre las cuatro bases A, C, G, T en
el tallo matriz, se impone igualmente para perfeccionar los
procedimientos de mutagénesis (Sala et al., 1996; Zaccolo
et al., 1996; Pochet et al., 1997). El agente
mutágeno último consistiría en un monómero del ADN que puede
aparearse a las cuatro bases canónicas en el estado de
incorporación como trifosfato, después de su copia como matriz. El
desoxinucleosido trifosfato de una base así ambigua permitiría
sustituir cualquier base canónica por no importa cuál de las otras
bases cuando se replica por una ADN polimerasa. Además, un
procedimiento de hipermutagénesis in vivo vía la
incorporación de la base ambigua simplificaría y aceleraría los
protocolos de evolución dirigida de los genes llevados por
plásmidos, evitando el recurso a las manipulaciones costosas de la
PCR errónea. Un resumen justificando el uso de bases ambiguas en
otras aplicaciones se encuentra en las referencias Bergstrom et
al., 1995; Loakes et al., 1995; Hill
et al., 1998.
et al., 1998.
Además, el descubrimiento de estructuras
químicas simplificadas pero dotadas de las mismas capacidades de
apareamiento unívoco que cada una de las cuatro bases del ADN, en
otros términos de los sucedáneos de A, C, G, T, hace posible la
preparación de nuevas sondas o cebos nucleicos que pueden utilizarse
en diversas técnicas de amplificación y de detección de ácidos
nucleicos diana.
Por otra parte, sobre el sinton de partida de
fórmula II (véase aquí más adelante), es posible injertar moléculas
reactivas situándose por ejemplo en la familia de los aminoácidos,
lo que permite por consiguiente funcionalizar el ADN.
Desoxinucleósidos que llevan una purina
simplificada en un simple núcleo imidazol diferentemente sustituido
en las posiciones 4 y 5 se han descrito en Pochet et al,
1998. Estos nucleósidos son intrínsecamente capaces de formar
enlaces de hidrógeno con las cuatro bases canónicas por rotación
alrededor del enlace glicosídico (conformaciones sin y anti) y del
enlace carboximida ("A-like" y
"G-like") (Pochet et al., 1995; Pochet
et al., 19). La incorporación por las ADN polimerasas de
estos nucleósidos (LeBec et al., 1997) y los efectos
mutágenos de sus apareamientos se describen en Sala et al.,
1996; Pochet et al., 1997.
En el marco de esta invención, agrupamientos
laterales variables pueden injertarse en el monómero del ADN
simplificado, designado aquí a continuación por X_{0}, vía un
grupo carbohidrazida. Este sinton de partida permite preparar
múltiples sustratos de las ADN polimerasas en una etapa. El grupo
carbohidrazida constituye una función muy reactiva capaz de
condensarse con cualquier aldehido o cetona. Además derivados
hidrazonos, en adelante llamados X_{1}, pueden por tanto formarse
a partir de X_{0}. Lo mismo derivados hidrazinas, en adelante
llamadas X_{0}, pueden obtenerse por reducción de X_{1}.
\newpage
Así, esta invención trata sobre compuestos de
fórmula general I:
en la
que:
- el grupo R1 representa un hidrógeno o un grupo
elegido de entre los grupos fosfato, difosfato o trifosfato y los
grupos protectores como DMT.
- R2 y R2' se eligen independientemente uno del
otro entre H, OH, la fosforamidita y sus derivados, el
H-fosfonato y un terminador de alargamiento T,
- R3 se elige de entre H, OH, los halógenos (F,
Br, Cl, I), un grupo alquilo lineal o ramificado que comprende 1 a
6 átomos de carbono y un grupo O-R5, R5 que
representa un grupo alquilo lineal o ramificado que comprende 1 a 6
átomos de carbono,
- R3' se elige de entre OH, los halógenos (F,
Br, Cl, I), un grupo alquilo lineal o ramificado que comprende de 1
a 6 átomos de carbono y un grupo O-R5, R5 representa
un grupo alquilo lineal o ramificado que comprende de 1 a 6 átomos
de carbono, R4 representa un heterociclo sustituido por un grupo de
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
dicho grupo está unido al
heterociclo, ya sea directamente, ya sea por medio de un brazo
espaciador E formado por una cadena carbonada de 1 a 20 átomos de
carbonos saturada o no, que comprende o no heteroátomos y/o
eventualmente
sustituido.
R4 se selecciona entre:
a) los heterociclos sustituidos de 5 átomos de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que E es un brazo espaciador
como se definió antes o que no existe, en la que X representa
independientemente unos de
otros
- un grupo CH,
- un grupo C-R6, R6 se elige de
entre los halógenos (F, Br, Cl, I), un grupo alquilo lineal o
ramificado que comprende de 1 a 6 átomos de carbono,
- un grupo O-R7 o
S-R7, R7 que representa un hidrógeno o un grupo
alquilo lineal o ramificado que comprende 1 a 6 átomos de carbono,
o
\newpage
- N, los heterociclos se eligen entonces entre
los siguientes:
R4 es preferentemente
b) los ciclos de 6 átomos,
particularmente las piridinas de
fórmula:
en la que E es un brazo espaciador
como se definió anteriormente o no
existe,
c) los análogos de purinas de fórmula:
en la
que:
- E es un brazo espaciador como se definió antes
o no existe,
- Y1 representa NH2 (designado por el sinton Xo)
o un grupo:
- Y2 y Y3 se eligen independientemente uno del
otro de entre H, OH, O, NH_{2}, los halógenos (F, Br, Cl, I),
SCH_{3}, SH, una función amida ligada por el átomo de nitrógeno o
un alcoxi lineal o ramificado que comprende de 1 a 6 átomos de
carbono,
- Z1 y Z2 se eligen independientemente una de la
otra de entre H y un grupo orgánico.
Respecto a los términos "purinas" y
"pirimidinas" nos referiremos a la definición dada en el Oxford
Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford Press,
1997. Ejemplos de vías de síntesis de estos compuestos se describen
en las páginas 546 y 547 de este documento.
Respecto a los compuestos B, el ejemplo de
síntesis presentado en la figura 2 es válido para los nucleósidos
en serie ribo, desoxi y para los derivados fosforilados. Cuando X es
CONHNH_{2}, se obtiene un sinton X_{0} según la invención que
comprende un brazo espaciador CH=CHCONH(CH2)n, en la
que n=6 en este ejemplo.
Entre los sintones X_{0} X_{1} y X_{2}, la
invención pretende particularmente análogos de nucleósidos y
análogos de nucleótidos trifosfatos que se designará por X_{0}TP,
X_{1}TP y X_{2}TP. Los análogos de nucleótidos según la
invención serán preferentemente utilizados cuando el objetivo
implique su incorporación en un ácido nucleico. Se utilizará
preferentemente un análogo de nucleósido según la invención para
inhibir una polimerasa in situ en una célula,
particularmente para la fabricación de un medicamento.
En los compuestos de fórmula I, el grupo R1
representa preferentemente un grupo trifosfato o un hidrógeno en
función del objetivo evocado antes.
Igualmente, según el objetivo buscado, al menos
uno de los grupos R2 y R2' puede representar un grupo OH, lo que
permite el seguimiento del alargamiento por una polimerasa o un
grupo terminador T en el caso en el que se desee obtener
inhibidores de las polimerasas. Así, al menos uno de los grupos R2 y
R2' puede representar el grupo T, que se selecciona preferentemente
entre F, Br, Cl, I, N_{3}, y un grupo alquilo lineal o ramificado
que comprende de 1 a 6 átomos de carbono. Por supuesto, cualquier
grupo equivalente que funciona como un terminador de alargamiento
se dirige a la preparación del compuesto que inhibe las
transcriptasas inversas de retrovirus.
Ventajosamente, cuando Y1 es NH_{2}, la
invención tiene por objeto los sintones de partida de fórmula
general II (sinton X_{0}):
en las que R1, R2, R2', R3, R3' y E
corresponden a los grupos de la fórmula I. Entre tales compuestos,
la invención se dirige particularmente al compuesto llamado dXoTP
en el que R1 es un grupo trifosfato, y R3 y R3' representan
H.
Los compuestos de fórmula II antes explicitados
pueden utilizarse como sinton de partida para la preparación de
biblioteca de análogos de nucleótidos y/o de nucleósidos. Su grupo
carbohidrazida permite en efecto conjugar en una sola etapa estos
compuestos con toda molécula que comprende una función aldehido o
cetona que da los sintones X_{1} después de condensación o X_{2}
después de reducción.
Por condensación de los compuestos de fórmula II
(Sintons X_{0} y X_{o}TP) con cualquier molécula que comporte
una función aldehido o cetona, se obtiene un compuesto de fórmula I
en la que el grupo Y1 representa la fórmula general:
Z1 y Z2 representan
independientemente uno del otro un hidrógeno o un grupo orgánico.
Estos compuestos se designarán por X_{1}TP (análogos de
nucleótido trifosfato) o X_{1} (análogos de
nucleósidos).
Se pueden reducir tales compuestos y obtener los
compuestos de fórmula I (sinones X_{2} y X_{2}TP) en la que el
grupo Y1 representa la fórmula general:
Se puede citar por ejemplo, los compuestos en
los que al menos uno de los grupos Z1 y Z2 se selecciona de entre
los grupos aromáticos, particularmente de entre los grupos de
fórmula:
Al menos uno de los grupos Z1 y Z2 pueden
igualmente seleccionarse de entre los grupos tiol, alquilo,
arbonilo, amino, alcohol, arilo y aminoácido.
En otro aspecto, los compuestos de la invención
pueden caracterizarse porque Z1 o Z2 forman un ciclo con Y3.
En un modo particular de realización, la
invención se refiere a los compuestos precitados en los que Z1 o Z2
comprenden un marcador fluorescente o fosforescente, particularmente
la fluorescamina o la fluoresceína. Por ejemplo, se puede hacer
reaccionar la fluorescamina para marcar el compuesto o bien para
detectar su presencia en el seno de un ácido nucleico.
Se puede preparar por tanto compuestos con un
brazo espaciador y un marcador, por ejemplo un compuesto de
fórmula:
Ventajosamente, los compuestos precitados son
sustratos de una polimerasa y pueden formar apareamientos con las
bases naturales, de una transcriptasa inversa y/o de una nucleótido
quinasa.
Además, dichos compuestos pueden introducir
mutaciones en un ácido nucleico o bloquear la síntesis de ADN o de
ARN, particularmente por las ADN polimerasas, las transcriptasas
inversas de retrovirus y las quinasas. De entre las quinasas, se
pretende designar a cualquier quinasa capaz de fosforilar los
nucleótidos mono o difosfato in vivo o in vitro. Se
puede citar más particularmente las desoxicitidina quinasas,
particularmente la DCK2 humana descrita en US 5.914.258, las
desoxiguanosina quinasas y las timidina quinasas.
Así, se puede utilizar un compuesto según la
invención en el que Y1 es NH_{2} como sinton de partida para la
preparación de bibliotecas de análogos de nucleótidos y/o de
nucleósidos, e identificar entre dichos análogos a los que puedan
inducir mutaciones y/o bloquear la síntesis de ADN o de ARN.
La invención se refiere igualmente a un
procedimiento de preparación de compuestos de fórmula general II
descritos anteriormente caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
a) preparación del nucleósido que tiene un
heterociclo imidazol de fórmula:
en la que X representa
independientemente unos de otros un grupo CH, C-R6,
o N, R6 se elige de entre los halógenos (F, Br, Cl, I), un grupo
alquilo lineal o ramificado que comprende de 1 a 6 átomos de carbono
y un grupo O-R7 o S-R7, R7
representa un hidrógeno o un grupo alquilo lineal o ramificado que
comprende de 1 a 6 átomos de
carbono,
b) protección del alcohol en 5' y transformación
de la función éster etílico en función carbohidrazida por la acción
de la hidrazina,
c) protección de la función amina del grupo
carbohidrazida por un grupo protector como el grupo
benziloxicarbonilo, acetilación del alcohol en 3',
d) fosforilación después de desprotección del
alcohol en 5',
e) e hodrogenólisis del grupo
benziloxicarbonilo.
Preferentemente, la etapa a) se realiza por
medio de una N-transdesoxiribosilasa en el caso de
desoxiribosa y la etapa d) consiste en la fosforilación de
nucleósido por el cianoetil-fosfato en presencia de
diciclohexilcarbodiimida; liberación concomitante en medio básico
del alcohol 3' y del grupo cianoetilo del 5' fosfato; después
condensación de pirofosfato al 5' fosfato activado bajo forma de
morfolidato.
A partir de estos compuestos de fórmulas
generales II, se puede preparar un compuesto de fórmula general I
descrito antes aquí por condensación de un compuesto de fórmula
general II con un aldehído o una cetona, seguido eventualmente de
una reducción.
Es posible hacer reaccionar uno o varios
compuesto(s) de fórmula general II con una biblioteca de
aldehídos y/o de cetonas, seguido eventualmente de una reducción,
de forma que se obtenga una biblioteca de compuestos de
fórmula I.
fórmula I.
La vía de síntesis descrita en la figura 1
ilustra un modo de realización particular del procedimiento según
la invención. El éster etílico del ácido
imidazol-4-carboxílico se transformó
en su desoxinucleósido por acción de la
N-transdesoxiribosilasa, utilizada sin purificación
bajo forma de un extracto proteico del Lactobacilus leichmannii,
tomando la timidina como fuente de desoxiribosa. Después de
protección del alcohol en 5' por un grupo dimetoxitritilo, el
nucleósido que lleva la función éster etílica se convirtió a su vez
en su derivado carbohidrazida por acción de la hidrazina. La
función amina del grupo carbohidrazida por acción de la hidrazina.
La función amina del grupo carbohidrazida se protege a continuación
por condensación de un grupo benziloxicarbonlo. Después de la
acetilación del alcohol en 3' y liberación del alcohol en 5', el
sinton obtenido se sometió a las siguientes etapas de
fosforilación, a saber: fosforilación por el
cianoetil-fosfato en presencia de
diciclohexilcarbodiimida; liberación concomitante en medio básico
del alcohol 3' y del 5' fosfato; condensación de pirofosfato al 5'
fosfato activado bajo forma de morfolidato. La producción del sinton
reactivo desoxinucleósido trifosfato de la carbohidrazida
dX_{o}TP se consiguió por hidrogenólisis del grupo
benciloxicarbonilo.
La condensación de carbohidrazida dX_{o}TP con
Z1-CHO y Z1-CO-Z2
conduce a los derivados hidrazonos dX_{1}TP, después a los
compuestos dX_{2}TP después de reducción.
Otro aspecto de la invención se refiere a los
compuestos susceptibles de obtenerse a partir de los procedimientos
aquí explicitados y a las bibliotecas de compuestos de fórmula
general I susceptibles de obtenerse cuando se hace reaccionar uno o
varios compuestos de fórmula general II con una biblioteca de
aldehídos y/o de cetonas.
La invención se refiere igualmente a un
procedimiento de identificación de compuestos capaces de introducir
una mutación en un ácido nucleico que comprende las etapas que
consisten en i) incorporar en un oligonucleótido sintético un
compuesto de fórmula I en la que Y1 es NH_{2}, ii) hacer
reaccionar dicho compuesto por condensación con al menos un
aldehido y/o una cetona, eventualmente seguido de una reducción,
iii) replicar dicho oligonucleótido con ayuda de una polimerasa y
determinar si una mutación se ha introducido en el tallo nuevamente
sintetizado.
Así, en otro modo de realización, la invención
se refiere a un procedimiento de mutación puntual de un ácido
nucleico caracterizado por que i) se prepara un oligonucleótido
sintético que comprende al menos un compuesto según la invención,
ii) se replica dicho oligoncleótido con ayuda de una polimerasa.
En otra alternativa, la invención se dirige a un
procedimiento de mutación aleatoria de un ácido nucleico que
comprende las etapas que consisten en utilizar una mezcla de
reacción que comprende al menos un compuesto precitado para la
amplificación de un ácido nucleico. Tal procedimiento de mutagénesis
aleatoria es particularmente útil para modificar la actividad de un
polipéptido de interés.
Para el alargamiento, la replicación y la
amplificación, se puede utilizar una ADN polimerasa exo-, como por
ejemplo, la Taq polimerasa, el fragmento de Klenow y la Vent
polimerasa.
Sin embargo, es posible utilizar ADN pol exo+ en
el caso en el que se desee cribar compuestos según la invención que
serán resistentes a la actividad exonucleásica. Tales compuestos son
particularmente útiles en los procedimientos de detección de
mutaciones.
Un aspecto suplementario se refiere a un
procedimiento de identificación de un compuesto capaz de inhibir
una enzima seleccionada entre una polimerasa, particularmente un
transcriptasa inversa, y/o una quinasa, particularmente cualquier
quinasa capaz de de fosforilar los nucleótidos mono o
di-fosfatoo in vivo o in vitro
(desoxicitidina quinasas, desoxiguanosina quinasas y timidina
quinasas) caracterizado porque se ensaya la actividad de dicha
enzima e presencia de al menos un compuesto según la invención.
En este procedimiento, se pude ensayar el efecto
de al menos uno de dichos compuestos sobre células infectadas por
un retrovirus, encontrándose dicho compuesto en forma de un análogo
de nucleósido. En efecto, los nucleósidos pueden atravesar la
membrana de las células, lo que no es el caso de los nucleótidos a
causa de la carga negativa de los grupos fosfatos. Se puede
efectuar por consiguiente un cribado a gran escala utilizando una
biblioteca según la invención y por un proceso iterativo con
fracciones de la biblioteca, se llega por experimentos de rutina a
la identificación de uno o varios compuesto(s) que bloquean
la replicación de virus.
La invención se dirige a los compuestos
susceptibles de obtenerse a partir del procedimiento precitado.
Por otra parte, los compuestos de la invención
pueden utilizarse en cebos o sondas para la amplificación y/o para
la detección de un ácido nucleico diana.
Una "sonda" o un "cebo" se define, en
el sentido de la invención, como un fragmento nucleótido que
comprende por ejemplo de 10 a 100, particularmente de 15 a 35
nucleótidos naturales o modificados, que comprenden al menos un
compuesto que responde a la fórmula I descrita aquí antes y poseen
una especificidad de hibridación en condiciones determinadas para
formar un complejo de hibridación con un ácido nucleico diana. Las
sondas según la invención, sean o no específicas, pueden
inmovilizarse, directa o indirectamente, sobre un soporte sólido;
se habla entonces de "sonda de captura". Por otra parte, dichas
sondas pueden llevar un agente marcador que permite su detección; se
habla entonces de "sonda de detección".
Una "sonda de captura" es inmovilizada o
inmovilizable sobre un soporte sólido por cualquier medio apropiado,
por ejemplo por covalencia, por adsorción o por síntesis directa
sobre un soporte sólido. Estas técnicas se describen
particularmente en la solicitud de patente WO 92/10092. El método
más general consiste en inmovilizar el ácido nucleico extraído de
células de diferentes tejidos o de células en cultivo sobre un
soporte (como la nitrocelulosa, el nylon™, el poliestireno) y en
incubar, en condiciones bien definidas, el ácido nucleico diana
inmovilizado con la sonda. Después de la hibridación, el exceso de
sonda se elimina y las moléculas híbridas formadas se detectan por
el método apropiado (medición de la radioactividad, de la
fluorescencia o de la actividad enzimática ligada a la sonda).
Una "sonda de detección" puede marcarse por
medio de un marcador elegido, por ejemplo, los isótopos radiactivos,
enzimas, en particular enzimas susceptibles de actuar sobre un
sustrato cromógeno, fluorígeno o luminescente (particularmente una
peroxidasa o una fosfatasa alcalina), compuestos químicos
cromóforos, compuestos cromógenos, fluorígenos o luminiscentes,
análogos de base nucleóticos y ligandos como la biotina. El marcado
de los cebos o de las sondas obtenidas según la invención se
realiza por elementos radioactivos o por moléculas no radiactivas.
Las entidades no radiactivas se seleccionan entre los ligandos como
la biotina, la avidina, la estreptavidina, la dioxigenina, los
haptenos, los colorantes, los agentes luminiscentes como los agentes
radioluminiscentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes,
fluorescentes (fluoresceína isotiocianato FITC,
R-ficoeritrina PE, Quantum Red™, SIGMA y
fluorescamina, Molecular Bioprobes) y fosforescentes.
En un modo de realización particular la
invención trata sobre los compuestos de fórmula I marcados. Como se
indicó anteriormente, se puede condensar un compuesto de fórmula II
con una molécula que comprende una función aldehido o cetona. En
este caso, dichas moléculas llevan un marcador del tipo cromóforos,
compuestos cromógenos, fluorígenos o luminiscentes o ligandos como
la biotina.
Los ácidos nucleicos que comprenden al menos un
compuesto de fórmula I son objeto de esta invención. Pueden ponerse
en marcha en las técnicas de tipo PCR (Erlich, 1989; Innis et
al., 1990, et Roles et al., 1991). Esta técnica necesita
la elección de pares de cebos oligonucleotídicos que encuadran el
fragmento que debe amplificarse. Se puede, por ejemplo, referirse a
la técnica descrita en la patente americana US nº 4.683.202. Otras
técnicas de amplificación pueden emplearse ventajosamente como
alternativa a la PCR (PCR like) con ayuda del par de cebos según la
invención. Por PCR-like se pretende designar a todos
los métodos que ponen en marcha reproducciones directas o
indirectas de las secuenciaa de ácidos nucleicos o bien en las que
los sistemas de marcaje se han amplificado, siendo técnicas bien
conocidas por los expertos en la técnica.
La invención se refiere igualmente a un kit para
la amplificación y/o la detección de un ácido nucleico diana y una
composición farmacéutica que comprende un compuesto según la
invención o un ácido nucleico según la invención. Se refiere
igualmente a la utilización de un ácido nucleico descrito aquí como
ribozima. Se entiende por "ribozima" en el sentido de la
invención, un ácido nucleico, un derivado de ácido nucleico o un
híbrido químico entre ácido nucleico y péptido que presenta
propiedades catalíticas, de modulación de la actividad o de la
expresión de una proteína, de un polipéptido, de un péptido o de un
gen. Un ácido nucleico según la invención puede sustituirse en una
enzima.
En otro aspecto, la invención se refiere a
oligonucleótidos antisentido que comprenden al menos un compuesto
de fórmula I. Por antisentido, se pretende designar un
oligonucleótido complementario de un ADN o ARN diana que bloquea la
transcripción o la traducción. Ejemplos de aplicación se ofrecen
particularmente en WO9954463, WO9838204, WO9829448, WO9735960,
WOO9710840 Y WO9625497.
Por consiguiente, dicho ácido nucleico según la
invención es útil como medicamento y en métodos de tratamiento.
La invención se refiere igualmente a la
utilización de un compuesto descrito anteriormente para la
fabricación de un medicamento, particularmente para la fabricación
de un medicamento destinado al tratamiento de las infecciones
retrovirales y del cáncer.
Las síntesis de trifosfato 1 implica la
introducción de un grupo temporal de protección sobre la función
hidrazina que puede liberarse en condiciones neutras. Con este fin,
se ha seleccionado el grupo benziloxicarbonilo. La cadena
trifosfato se ha introducido en tres etapas, conforme a los
procedimientos descritos por Tener et Moffatt. El nucleótido 3 se
ha obtenido a partir del compuesto 2 por transglicosilación
enzimática utilizando la N-desoxiribosiltransferasa
como describe anteriormente Pochet et al., 1995.
La 5'-dimetoxitritilación del
compuesto 3 en la piridina ha permitido la obtención del compuesto 4
con un rendimiento de 73%. El tratamiento del compuesto 4 con un
gran exceso de hidrato de hidrazina a 60ºC ha conducido al
compuesto 5 que puede utilizarse en las siguientes etapas sin
purificación suplementaria.
El grupo benziloxicarbonilo se ha introducido
haciendo reaccionar el compuesto 5 con el
benziloxicabonilsuccinimidato que conduce al compuesto 6 en un
rendimiento de 81%. La acilación con el anhídrido acético en la
piridina produce una mezcla de dos compuestos mayores que
corresponden al compuesto
3'-O-acetilado 7 (24%) y al
compuesto 3'-O, N-diacetilado 8
(38%). La acetilación completa se ha obtenido rápidamente en el
acetonitrilo utilizando el anhídrido acético (2.2 eq.) en presencia
de trietilamina catalizada por el DMAP que permite obtener el
compuesto 8 con un rendimiento de 80%. Después de la destritilación
del compuesto 8, la condensación del compuesto 9 con el
cianoetilfosfato en la piridina en presencia de DCC, seguida por un
tratamiento con una solución de 2% de metilato de sodio en el
metanol, el procedimiento ha conducido al compuesto 5'monofosfato 11
(52%). El compuesto trifosfato 13 se ha obtenido en dos etapas
pasando por el compuesto morfolidato 12 con un rendimiento de 50%.
La supresión del grupo protector benziloxicarbonilo se ha llevado a
cabo por hidrogenólisis sobre Pd/C en presencia de H_{2}. Así, el
tratamiento de los compuestos 11 y 13 ha permitido obtener los
derivados monofosfato 14 y trifosfato 1.
La derivatización de la función hidrazina se ha
efectuado utilizando aldehídos aromáticos y alifáticos:
primeramente, el compuesto monofosfato 14 se ha tratado con el
3-metiltiopropionaldehído y el benzaldehído en
H_{2}O/metanol para dar los compuestos 15a y 15b. Estos productos
se han aislado por HPLC en fase inversa y se han caracterizado por
la técnica de espectrometría de masa y por RMN. De la misma manera,
el compuesto 1 en el tampón TEAA (PH 7,5) se ha tratado a 4ºC con
un exceso de aldehídos en metanol para dar los compuestos 16a y 16b.
La estructura de los derivados trifosfatos se ha confirmado por
espectrometría de masa.
Se ha añadido al compuesto 1 en 0,2 ml de 0,1M
TEAA un aldehído (25 \mul en 0,1 mL de metanol). Después de 2
horas, la solución se ha concentrado y purificado por HPLC a
\lambda=230 nm (0 a 25% acetonitrilo en 10 mM TEAA). Las
fracciones que contienen el producto puro se han liofilizado y
pasado a través de una columna intercambiadora de cationes (Dowex)
para dar los trifosfatos bajo forma de sales de sodio.
Los análogos (dX_{0}TP y dX_{1}TP(a)
y dX_{1}TP(b)) se han sometido a experimentos de
alargamiento de cebo catalizados por el fragmento de Klenow exo-.
Un cebo se marcó en su extremidad 5' por reacción de un
[\lambda-^{32}P] utilizando la T4
polinoucleótido quinasa. Las matrices apropiadas y los cebos
marcados se han incubado a 75ºC durante 15 minutos, después se han
enfriado lentamente a temperatura ambiente durante 1 hora. En
diferentes mezclas reactivas, se ha realizado el alargamiento del
cebo con una ADN polimerasa en presencia de los dX_{1}TP dados.
Las muestras se han desnaturalizado a continuación, después se
cargaron sobre un gel de poliacrilamida (20% 7M de urea). Después
de electroforesis, los geles se visualizaron por autorradiografía
con ayuda de un Phosporimager™.
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Claims (39)
1. Compuestos de fórmula general I
en la
que
- el grupo R1 representa un grupo elegido entre
los grupos fosfato, difosfato o trifosfato y los grupos protectores
como el DMT.
- R2 y R2' se eligen independientemente el uno
del otro entre H, OH, la fosforamidita y sus derivados, el
H-fosfonato y un terminador de alargamiento T, R3 se
elige entre H, OH, los halógenos (F, Br, Cl, I), un grupo alquilo
lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono y un grupo
O-R5, representando R5 un grupo alquilo lineal o
ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono,
- R3' se elige entre OH, los halógenos (F, Br,
Cl, I), un grupo alquilo lineal o ramificado que comporta 1 a 6
átomos de carbono y un grupo O-R5, representando R5
un grupo alquilo lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de
carbono,
- R4 representa un heterociclo sustituido por un
grupo de fórmula
cuyo grupo está ligado al
heterociclo, bien directamente, bien por intermedio de un brazo
espaciador E constituido por una cadena carbonada de 1 a 20 átomos
de carbono saturada o no, que comprende o no heteroátomos y/o
eventualmente sustituido; estando seleccionado dicho heterociclo
entre:
R4 está seleccionado entre
a) los heterociclos sustituidos de 5 átomos de
fórmula:
en la que E es un brazo espaciador
como se ha definido anteriormente o que no existe , en la que X
representa independientemente los unos de los
otros
- un grupo CH
- un grupo C-R6, R6 está elegido
entre los halógenos (F, Br, Cl, I), un grupo alquilo lineal o
ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono,
- un grupo O-R7 o
S-R7, R7 representa un hidrógeno o un grupo alquilo
lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono, o
- N, los heterociclos están elegidos entre los
siguientes:
siendo R4 de
preferencia
los ciclos de 6 átomos,
principalmente las pirimidinas de
fórmula:
en la que E es un brazo espaciador
como se ha definido anteriormente o que no
existe,
b) los análogos de purinas de fórmula:
en la
que:
- E es un brazo espaciador como se ha definido
anteriormente o que no existe,
- Y1 representa NH_{2} (designado por el
sinton X_{0}) o un grupo:
Y2 e Y3 se eligen independientemente el uno del
otro entre H, OH, O, NH_{2}, los halógenos (F, Br, Cl, I),
SCH_{3}, SH, una función amida ligada por un átomo de nitrógeno o
un alcoxi lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono,
y Z1 y Z2 se eligen independientemente uno de otro entre H y un
grupo orgánico.
2. Compuesto según la reivindicación 1,
caracterizado porque el grupo R1 es un grupo trifosfato.
3. Compuestos según una de las reivindicaciones
1 a 2 caracterizados porque al menos uno de los grupos R2 y
R2' representa un grupo OH.
4. Compuestos según una de las reivindicaciones
1 a 3 caracterizados porque T se selecciona de preferencia
entre F, Br, Cl, I, N_{3}, y un grupo alquilo lineal o ramificado
que comporta 1 a 6 átomos de carbono.
5. Compuestos según una de las reivindicaciones
1 a 4 caracterizados porque Y1 es NH_{2} que corresponde a
los sintones de fórmula general II (sinton X_{0}):
en las que R1, R2, R2', R3, R3' y E
corresponden a los grupos de la fórmula
I.
6. Compuestos según una de las reivindicaciones
1 a 4 caracterizados porque Y1 representa un grupo elegido
entre el grupo:
Z1 y Z2 representan
independientemente uno del otro un hidrógeno o un grupo orgánico
(sintones X_{1} y
X_{1}TP).
7. Compuestos según una de las reivindicaciones
1 a 4 caracterizados porque Y1 representa un grupo elegido
entre el grupo:
Z1 y Z2 representan
independientemente uno del otro un hidrógeno o un grupo orgánico
(sintones X_{2} y
X_{2}TP).
8. Compuestos según una de las reivindicaciones
6 y 7 caracterizados porque al menos uno de los grupos Z1 y
Z2 se selecciona entre los grupos aromáticos, principalmente entre
los grupos de fórmula:
9. Compuestos según una de las reivindicaciones
6 a 7 caracterizados porque al menos uno de los grupos Z1 y
Z2 se selecciona entre los grupos tiol, alquilo, carbonil, amina,
alcohol, arilo y aminoácido.
10. Compuestos según una de las reivindicaciones
6 y 7 caracterizados porque Z1 o Z2 forman un ciclo con
Y3.
11. Compuestos según una de las reivindicaciones
6 y 7 caracterizados porque Z1 o Z2 comprenden un marcado
fluorescente o fosforescente, principalmente la fluorescamina.
12. Utilización de un compuesto según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 como sustrato de una
polimerasa, de una transcriptasa inversa y/o de una nucleótido
quinasa.
13. Utilización de un compuesto según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para formar apareamientos
con las bases naturales.
14. Utilización de un compuesto según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para inhibir una
polimerasa, principalmente una transcriptasa inversa de retrovirus
y/o una quinasa.
15. Procedimiento de preparación de compuestos
de fórmula general II según la reivindicación 5 caracterizado
porque comprende las etapas siguientes:
a) preparación del nucleósido que tiene por
heterociclo un heterociclo imidazol de fórmula:
en la que X representa
independientemente los unos de los otros un grupo CH, C, R6, o N,
eligiendo R6 entre los halógenos (F, Br, Cl, I), un grupo alquilo
lineal o ramificado que comporta 1 a 6 átomos de carbono, y un grupo
O-R7 o S-R7, R7 que representa un
hidrógeno o un grupo alquilo lineal o ramificado que comporta 1 a 6
átomos de
carbono,
b) protección del alcohol en 5' y transformación
de la función éster etílico en función carbohidrazida por la acción
de la hidracina,
c) protección de la función amina del grupo
carbohidrazida por un grupo protector como el grupo
benciloxicarbonilo, acetilación del alcohol en 3',
d) fosforilación después de desprotección del
alcohol en 5',
e) e hidrogenolisis del grupo
benciloxicarbonilo.
16. Procedimiento de preparación según la
reivindicación 15, caracterizado porque la etapa a) se
realiza por medio de una N'transdesoxiribosilasa.
17. Procedimiento de preparación según una de
las reivindicaciones 15 a 16, caracterizada porque la etapa
d) consiste en la fosforilación del nucleósido por el
cianoetilfosfato en presencia de diciclohexilcarbodiimida;
liberación concomitante en medio básico del alcohol 3' y del grupo
cianoetilo del fosfato 5'; después condensación de pirofosfato al
fosfato 5' activado bajo forma de morfolidato.
18. Procedimiento de preparación de un compuesto
de fórmula general I según una de las reivindicaciones 6 a 11,
caracterizado porque un compuesto de fórmula general II según
la reivindicación 5 se condensa con un aldehido o una cetona.
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
caracterizado porque se hace reaccionar uno o varios
compuestos de fórmula general II según la reivindicación 5 con una
biblioteca de aldehidos o cetonas, seguido eventualmente de una
reducción.
20. Procedimiento de identificación de
compuestos capaces de introducir una mutación en un áciod nucleico
que comprende las etapas que consisten en i) incorporar en un
oligonucleótido sintético un compuesto según la reivindicación 1 en
la que Y1 es un grupo NH_{2}, ii) hacer reaccionar dicho compuesto
conforme al procedimiento según la reivindicación 18 ó 19,
eventualmente seguido de una reducción, iii) replicar dicho
oligonucleótido con ayuda de una polimerasa y determinar si una
mutación se ha introducido en el tallo recientemente
sintetizado.
21. Procedimiento de mutación puntual de un
ácido nucleico caracterizado porque i) se prepara un
oligonucleótido sintético que comprende al menos un compuesto según
una de las reivindicaciones 1 a 11, ii) se replica ese
oligonucleótido con ayuda de una polimerasa.
22. Procedimiento de mutación aleatoria de un
ácido nucleico que comprende al menos un compuesto según una de las
reivindicaciones 1 a 11 para la amplificación de un ácido
nucleico.
23. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque se utiliza una
ADN polimerasa exo-.
24. Procedimiento de identificación de un
compuesto capaz de inhibir una enzima seleccionada entre una
polimerasa, principalmente una transcriptasa inversa y una quinasa,
caracterizado porque se ensaya la actividad de esa enzima en
presencia de al menos un compuesto según una de las reivindicaciones
1 a 11.
25. Procedimiento de identificación de un
compuesto capaz de inhibir una transcriptasa inversa de un
retrovirus caracterizado porque se ensaya el efecto de al
menos un compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 11 sobre
células infectadas por un retrovirus, encontrándose dicho compuesto
bajo la forma de de un análogo de nucleósido.
26. Procedimiento según las reivindicaciones 21
a 25 caracterizado porque se utiliza una biblioteca de
compuestos de fórmula general I según una de las reivindicaciones 1
a 11, susceptible de obtenerse a partir del procedimiento según la
reivindicación 19.
27. Ácido nucleico que comprta al menos un
compuesto según una de las reivindicaciones 1 a 11.
28. Utilización de un compuesto según una de las
reivindicaciones 1 a 11, en un procedimiento de mutagénesis
aleatoria.
29. Utilización de un compuesto según una de las
reivindicaciones 1 a 11, como base ambigua.
30. Utilización de un compuesto según una de las
reivindicaciones 1 a 11, en un cebo o una sonda para la
amplificación y/o detección de un ácido nucleico diana.
31. Utilización según la reivindicación 30,
caracterizada porque dicho compuesto está marcado.
32. Kit para la amplificación y/o la detección
de un ácido nucleico diana que comprende un compuesto según una de
las reivindicaciones 1 a 11, o un ácido nucleico según la
reivindicación 27.
33. Utilización de un ácido nucleico según la
reivindicación 27, para la fabricación de un medicamento.
34. Utilización según la reivindicación 33,
caracterizada porque dicho ácido nucleico se utiliza como la
ribozima.
35. Utilización según la reivindicación 33,
caracterizada porque dicho ácido nucleico se utiliza como
antisentido.
36. Utilización de un compuesto según una de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que Y1 es NH_{2} como sinton de
partida para la preparación de bibliotecas análogas de nucleótidos
y/o nucleósidos.
37. Utilización de un compuesto según una de las
reivindicaciones 1 a 11, para la fabricación de un medicamento.
38. Utilización de un compuesto según una de las
reivindicaciones 1 a 11, para la fabricación de un medicamento
destinado al tratamiento de las infecciones retrovirales.
39. Utilización de un compuesto según una de las
reivindicaciones 1 a 11, para la fabricación de un medicamento
destinado al tratamiento del cáncer.
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