ES2282797T3 - Anticuerpo monoclonal humano que une ep-cam y su uso en la terapia delcancer. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal humano que puede unirse a Ep-CAM humano caracterizado porque el anticuerpo comprende: a). una región de CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos GGTFSSY, una región de CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos IPIFGT, una región de CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos DPFLHY, una región de CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos RSSQSLLHSNGYNYLD, una región de CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos LGSNRAS, y una región de CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos MQALQTFTF, b). una región de CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos GGTFSSY, una región de CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos IPIFGT, una región de CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos DPFLHY, una región de CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos RASQTISNNYLA, una región de CDR2 de cadena ligera que tienela secuencia de aminoácidos AASSRAT, y una región de CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos AQGELYPRQF, o c). una región de CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos GGTFSSY, una región de CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos VPIFGT, una región de CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos DPFLHY, una región de CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos RASQSVSSYLA, una región de CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos GASSRA, y una región de CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos AQGELYPRQF.

Description

Anticuerpo monoclonal humano que une Ep-CAM y su uso en la terapia del cáncer.

La invención se refiere al campo de la biotecnología. Más particularmente la invención se refiere al campo de los anticuerpos y usos de los mismos. Uno de tales usos se refiere a los usos médicos de anticuerpos.

La exposición a un entorno sumamente diverso y continuamente cambiante requiere un sistema inmunitario dinámico que pueda adaptarse rápidamente para responder adecuadamente a microorganismos potencialmente dañinos. Los organismos superiores han desarrollado mecanismos moleculares especializados para asegurar la puesta en práctica de repertorios clonalmente distribuidos, sumamente diversos de moléculas receptoras de antígenos expresadas por células del sistema inmunitario: moléculas de inmunoglobulina (Ig) en linfocitos B y receptores de células T en linfocitos T. Para linfocitos B, un repertorio primario de (generalmente baja afinidad) receptores de Ig se establece durante la diferenciación de células B en la médula como resultado de una reordenación de segmentos de gen codificados por línea germinal. Tiene lugar un refinamiento adicional de la especificidad y afinidad del receptor de Ig en los órganos linfoides periféricos en los que los linfocitos B estimulados por antígeno activan una maquinaria de hipermutación somática que selecciona específicamente como diana las regiones variables (V) de inmunoglobulina. Durante este proceso, los clones de células B con receptores de Ig mutantes de afinidad superior por el antígeno incitador se estimulan en proliferación clonal y maduración en de células de plasma que segregan anticuerpos (revisado en 1).

En los últimos años, se ha usado la tecnología de ADN recombinante para imitar muchos aspectos del proceso que gobierna la generación y selección de repertorios de anticuerpos humanos naturales (revisado en 2, 3). Se ha desarrollado la construcción de grandes repertorios de fragmentos de anticuerpos expresados sobre la superficie de partículas de fago filamentosas y la selección de fagos mediante apelmazamiento en antígenos como un método rápido y versátil para obtener anticuerpos de especificidades deseadas (revisado en 4, 5). Se ha logrado la optimización adicional de la afinidad de anticuerpos de fagos individuales creando repertorios de anticuerpos mutantes que se expresan sobre partículas de bacteriófago y se toman como muestra para detectar mutantes de afinidad superior mediante la selección para unirse al antígeno en condiciones rigurosas (revisado en 6). Se han usado diversos enfoques para crear repertorios de anticuerpos mutados, incluyendo mezcla de cadena (7, 8), PCR propensa a error (9), uso de cepas mutágenas de E. Coli (10) o enfoques dirigidos más específicamente a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la molécula de anticuerpo, tales como mutagénesis parsimoniosa y paseo de CDR (11-13).

Para seleccionar mutantes de afinidad superior a partir de una biblioteca de fragmentos de anticuerpo mutagenizados, presentados por fago, se han realizado selecciones sobre antígeno inmovilizado purificado o antígeno biotinilado en disolución, seguido de la captura de fago unido sobre perlas magnéticas de estreptavidina (14-16). Se ha demostrado que la selección de fragmentos de un anticuerpo Fv de cadena sencilla (scFv) de afinidad superior específicos para el antígeno c-erb-2 a partir de las bibliotecas de fago de mutantes de esos scFv era dependiente de la disponibilidad del antígeno purificado en la disolución. El antígeno capturado sobre una fase sólida dio como resultado el aislamiento de falsos positivos con mayor avidez más que afinidad debida a la dimerización y oligomerización del scFv sobre le fago. Además, se demostró que era crucial para el aislamiento de scFv de afinidad superior el realizar rondas posteriores de selecciones de fago con concentraciones cuidadosamente controladas y decrecientes de antígeno en la disolución (14). Aunque se han aislado scFv de muy alta afinidad con estos enfoques, no pueden aplicarse fácilmente cuando el antígeno diana es difícil de expresar como una molécula recombinante o tedioso de purificar en cantidades suficientes sin perder su configuración nativa. Ejemplos de estos tipos de moléculas son proteínas con siete sesiones transmembrana, moléculas de membrana insolubles modificadas con lípidos y moléculas proteínicas modificadas tras la traducción que son específicas para tipos de célula particulares o estados de enfermedad. Por tanto un procedimiento de selección de fragmentos de anticuerpo mutante de afinidad superior, sin necesidad del antígeno purificado, representaría una extensión importante de las estrategias de maduración de afinidad para los anticuerpos presentados por fagos.

La invención se basa en seleccionar un miembro a partir de una biblioteca de moléculas proteínicas que comprende proporcionar células y/o un equivalente funcional de las mismas, con al menos parte de dicha biblioteca en condiciones que permitan la unión de cualquier miembro a un epítopo en y/o sobre dichas células y/o dichos equivalentes funcionales de las mismas, eliminar moléculas proteínicas no unidas y seleccionar dicho miembro, en el que dicha biblioteca comprende al menos un mutante de molécula proteínica que puede unirse a dicho epítopo. Preferiblemente un mutante comprende una o más mutaciones que afectan a la capacidad de unión del mutante a dicho epítopo de forma positiva o negativa, comparado con la molécula proteínica no mutada. La capacidad puede verse afectada por una afinidad de unión alterada o una constante de disociación alterada o ambas.

Un miembro de la biblioteca es una molécula proteínica presente en dicha biblioteca y/o una molécula proteínica seleccionada a partir de dicha biblioteca. Un miembro seleccionado comprende normalmente la capacidad de unirse a dicho epítopo. Una vez seleccionado y caracterizado un miembro también puede generarse de otra manera, por ejemplo, artificialmente, mediante técnicas de biología molecular tales como, pero sin limitarse a, síntesis de péptidos o la expresión de un ácido nucleico que codifica para dicha molécula proteínica. Una molécula proteínica puede ser un péptido, un polipéptido o una proteína. Los péptidos son cadenas de aminoácidos unidas mediante un enlace peptídico. Aunque no está definido precisamente, los péptidos comprenden normalmente entre 2 y 50 aminoácidos. Los polipéptidos son péptidos más largos que pueden contener hasta miles de aminoácidos unidos mediante enlace peptídico. Las palabras polipéptido y proteína se usan a menudo indistintamente para describir cadenas polipeptídicas sencillas y largas. Además, las proteínas pueden consistir en múltiples cadenas polipeptídicas que colectivamente forman la base de una estructura tridimensional compleja. Un péptido, un polipéptido y/o una proteína pueden comprender modificaciones tales como aquellas generadas por una maquinaria célula de modificación de proteína. Un mutante de una molécula proteínica es una molécula proteínica que comprende uno o más cambios comparada con la molécula proteínica sin mutar. Un cambio puede comprender por ejemplo un intercambio, una deleción, una inserción o una adición de uno o más aminoácidos o una combinación de estos cambios. Preferiblemente pero no necesariamente, dicha mutación se genera por un cambio en un ácido nucleico que codifica para dicha molécula proteínica.

Una biblioteca comprende al menos un mutante de una molécula proteínica que puede unirse a un epítopo. Normalmente, una biblioteca comprenderá más de 100 mutantes diferentes de dicha molécula proteínica. Tal biblioteca puede usarse por sí misma o puede combinarse con una o más de otras bibliotecas que comprenden al menos un mutante de otra molécula proteínica que puede unirse a al menos una parte de dicho epítopo. Una ventaja de tal combinación es que aumenta la complejidad de los mutantes aumentando por tanto las probabilidades de encontrar un mutante particularmente favorable. Por supuesto, también puede combinarse una biblioteca con otras bibliotecas o molécula proteínicas. Puede ocasionarse una combinación de este tipo por el deseo de proporcionar una biblioteca que comprende una serie de mutantes de diferentes moléculas proteínicas que pueden unirse a diferentes epítopos presentes sobre una molécula diana dada.

Un epítopo según la invención está normalmente presente en y/o sobre una proteína producida por una célula. Un epítopo es un sitio de unión que puede unirse a dicha molécula proteínica. Un epítopo puede ser (parte de) cualquier tipo de molécula. Normalmente, un epítopo comprende un péptido, un polipéptido, una proteína y/o una modificación tal como se produce mediante maquinaria célula de modificación de proteína.

Las células a las que se proporciona al menos parte de la biblioteca pueden ser células vivas y/o células muertas. Normalmente las células se obtienen de un cultivo. Las células pueden tratarse antes de que se les proporcione al menos parte de la biblioteca. Por ejemplo, con fines de fijación y/o permeabilización. Un equivalente funcional de las células es un extracto celular bruto. En un extracto de este tipo la estructura de las células normalmente está deformada de tal manera que las células individuales pueden esencialmente no reconocerse por medios microscópicos. Un extracto bruto puede haber experimentado varias etapas para eliminar uno o más componentes no deseados. Sin embargo, los extractos que comprenden esencialmente sólo una molécula proteínica que comprende dicho epítopo no se consideran extractos brutos. La línea divisoria entre lo que puede considerarse un extracto bruto y lo que debe considerarse como un extracto purificado es difícil de trazar. Sin embargo, los extractos que comprenden más o menos orgánulos intactos son funcionalmente equivalentes a células. Un equivalente funcional de una célula debe comprender la mayor parte del epítopo en una forma esencialmente similar a una forma que tiene el epítopo cuando está presente en y/o sobre una célula intacta que comprende dicho epítopo.

La eliminación de la parte de la biblioteca que no está unida a las células y/o el equivalente funcional de las mismas, puede lograrse mediante lavado de las células y/o el equivalente funcional de las mismas con una disolución adecuada tal como solución isotónica tamponada. Las células pueden lavarse fácilmente sometiendo a sedimentación a las células y suspendiendo las células en una disolución adecuada. Para la eliminación de esa parte de la biblioteca que no está unida a un equivalente funcional de las células, tal como un extracto de células, resulta ventajoso unir el equivalente funcional de las mismas a un vehículo permitiendo así una manipulación fácil del equivalente funcional. Por supuesto, también pueden unirse las células a un vehículo. Un método preferido para eliminar moléculas proteínicas no unidas es por medio de una o más etapas de lavado. Resulta ventajoso proporcionar una o más etapas de lavado riguroso para eliminar la moléculas proteínicas que están unidas con una afinidad baja eventualmente no deseada. Para células o partes de las mismas tales como orgánulos y/o partículas membranosas no se requiere la unión a un vehículo, aunque todavía puede resultar ventajoso. Un método de la invención comprende normalmente más de 10.000 células o equivalentes funcionales de las mismas. Sin embargo, también pueden usarse cantidades inferiores de células o equivalentes de las mismas. La invención puede realizarse, incluso, usando sólo una célula.

Una molécula proteínica puede ser una molécula proteínica que puede unirse a un epítopo. Ejemplos de una molécula proteínica de este tipo son un anticuerpo (artificial o natural), un fragmento FAB (artificial o natural), un fragmento Fv de cadena sencilla, un receptor de célula T, un ligando, un receptor, un péptido seleccionado preferiblemente a partir de una biblioteca para determinar la capacidad de unión a epítopo específica o una proteína de unión a matriz. Por supuesto, también pueden usarse los equivalentes funcionales de dichas moléculas proteínicas. Tal equivalente funcional comprende la misma actividad de unión a epítopo en tipo pero no necesariamente en cantidad. Un equivalente funcional puede ser una parte, un derivado, y/o un análogo de dicha molécula proteínica. Normalmente un derivado se obtiene mediante una sustitución de aminoácido. Se dice que una molécula proteínica puede unirse a un epítopo cuando se encuentra que las células que comprenden dicho epítopo, con exposición a dicha molécula proteínica seguido por una o más etapas de lavado, pueden retener dicha molécula proteínica hasta un grado significativamente mayor que otras células, esencialmente que no comprenden dicho epítopo.

Dicha molécula proteínica puede comprender un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) y/o un fragmento FAB, o un equivalente funcional del mismo. Un equivalente funcional de dicho fragmento scFv y/o dicho FAB es una parte, un derivado y/o un análogo de dicho scFv y/o dicho FAB que comprende esencialmente la misma actividad de unión que dicho fragmento scFv y/o dicho FAB en tipo pero no necesariamente en cantidad.

Cada uno de dichos mutantes de una molécula proteínica puede estar unido físicamente a un vehículo que comprende ácido nucleico que codifica para dicha molécula proteínica mutante. Esto tiene la ventaja de que cuando dicho miembro se recupera a partir de dichas células y/o equivalentes funcionales de las mismas, se recupera simultáneamente el ácido nucleico que codifica para dicha molécula proteínica. Dicho ácido nucleico está entonces disponible para multiplicación, análisis, subclonación y/o expresión en una célula.

Preferiblemente, dicho vehículo comprende una partícula tipo virus tal como una cápsida de fago o un equivalente funcional de la misma. Se prefiere una partícula tipo virus porque puede condensar ácido nucleico en una forma manejable. También se prefiere una partícula tipo virus por la razón de que puede usarse para introducir eficazmente el ácido nucleico del miembro seleccionado dentro de una célula. Esto resulta particularmente ventajoso cuando el ácido nucleico, una vez introducido en la célula, puede multiplicarse, permitiendo así por ejemplo el aislamiento fácil de cantidades relativamente grandes de dicho ácido nucleico.

Dicho epítopo puede comprender un epítopo asociado a tumor. Un epítopo asociado a tumor es un epítopo esencialmente característico para células tumorales en un organismo. Dicho epítopo puede estar presente en otras células siempre que no esté presente en dichas otras células de la misma manera que en células tumorales. Por ejemplo, un epítopo es un epítopo asociado a tumor cuando está presente sobre la superficie de un célula tumoral y esencialmente no presente sobre la superficie de células no tumorales debido a, por ejemplo, pero sin limitarse, una expresión sustancialmente menor de dicho epítopo en células no tumorales. Dicho epítopo también puede estar presente sobre otras células siempre que dichas células no coexistan normalmente con las células tumorales en el mismo organismo. Un ejemplo típico es un epítopo asociado a tumor presente sobre las células fetales pero esencialmente no presente sobre células adultas normales. Un epítopo asociado a tumor puede determinarse individualmente, es decir, un epítopo asociado a tumor para un individuo puede no ser un epítopo asociado a tumor en otro individuo de la misma especie. Un epítopo asociado a tumor también puede ser parte de una proteína que está presente sobre células normales pero en el que la glucosilación de la proteína en células normales es distinta de la glucosilación de la proteína en células tumorales.

La invención proporciona huMabS de afinidad superior que se unen al antígeno Ep-CAM asociado a tumor, obtenidos construyendo pequeñas bibliotecas de presentación de fago de fragmentos de anticuerpo scFv mutante derivado a partir del scFv UBS-54 anti-Ep-Cam original. Estas bibliotecas se apelmazaron posteriormente sobre células tumorales positivas para Ep-Cam intactas. Las etapas de lavado riguroso durante las selecciones de fago dieron como resultado el aislamiento de scFv C52, que se convirtió en un huMab IgG1 intacto con una mejora de la afinidad de 15 veces y una KD = 4*10^{-10} M. La mejora de la afinidad resultó principalmente a partir de una k_{off} (o constante de disociación) inferior. La mezcla de cadenas ligeras y de ADN se empleo para introducir mutaciones en las regiones V del anticuerpo. El aumento de aproximadamente cuatro veces de la afinidad logrado con cada uno de estos enfoques mutagénicos fueron comparables a los resultados logrados por la maduración de afinidad de anticuerpo usando otras técnicas de mutagénesis y de selección de presentación de fago (11, 14, 33). En la presente invención se demuestra que la selección por afinidad puede realizarse sobre células fijadas intactas, descartando la necesidad de purificar o expresar el antígeno diana como una molécula recombinante. Procedimientos de selección previos para el aislamiento de variantes de anticuerpo de afinidad superior a partir de bibliotecas de presentación de fago han usado antígeno soluble purificado o antígeno inmovilizado sobre una fase sólida como dianas para las selecciones de fago. Se ha observado que la selección sobre antígeno unido a fase sólida da como resultado la selección preferente de scFv dimérico sobre monomérico, debido a la avidez, interfiriendo así con la selección de scFv de afinidad realmente superior (14). La selección en disolución reduce el efecto de la avidez pero requiere la reducción por etapas y cuidadosa de la concentración de antígeno diana en posteriores rondas de selección (14). Tal como se ha observado para otros scFv, scFv UBS-54 en disolución es una mezcla de dímeros (30%) y monómeros (70%). Se mantuvo esta razón en los mutantes A37, B43, y C52, mostrando que la selección sobre células intactas no dio como resultado una selección predispuesta por los dímeros (datos no mostrados). Se ha realizado la selección de aglutinantes de afinidad superior a partir de una combinación de fagos seleccionados clasificando los scFv mutantes según una k_{off} inferior tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial (6). Aunque se intentó clasificar nuestros scFv según este método, se encontró que los datos experimentales con las preparaciones de scFv periplásmico brutas eran difíciles de evaluar debido a la complejidad de los gráficos de afinidad (RU frente al tiempo), resultantes a partir de las mezclas de monómeros, dímeros y agregados. Por tanto, se decidió buscar clones que dominasen las poblaciones de fago tras tres rondas de selección. Obsérvese que el dominio de los clones de fago en las selecciones no se determina totalmente por afinidad sino que también está influenciado por el nivel de expresión de scFv, la eficacia de plegamiento y el nivel de toxicidad frente a E. Coli. Aunque en los análisis la presencia de clones dominantes se correlacionó con scFv de afinidad superior, no se puede excluir que otros clones de afinidad superior pero menos dominantes estuvieran presentes en las combinaciones de fago seleccionadas.

La mezcla de cadenas ligeras dio como resultado la sustitución de la cadena ligera Vk2 original por la cadena ligera Vk3 en el mutante A37. El análisis estructural reveló que la estructura canónica de la cadena ligera Vk3 en A37 consistía en un bucle mucho más corto, creando una superficie de interacción más amplia. Termodinámicamente, es atractivo para las interacciones antígeno-anticuerpo para tener una superficie de interacción grande y próxima porque se excluyen más moléculas de agua (ganancia en la entropía del disolvente) y, lo que es más importe, pueden tener lugar muchas interacciones simultáneas (enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals y dipolo-dipolo) entre epítopo y paratopo (contribuyendo a la entalpía de unión) (23). Estructuralmente, esto da como resultado un sitio de unión de cara amplia del anticuerpo que es complementario a un epítopo igualmente amplio sobre una proteína de interacción grande. Por otro lado, los sitios de unión que consisten en hendiduras profundas que rodean ajustadamente el antígeno están generalmente asociados con ligandos pequeños tales como péptidos y moléculas orgánicas de bajo peso molecular (23).

La mezcla de ADN de la región VL pero no de la región VH dio como resultado el aislamiento de anticuerpos de afinidad superior. La estructura modelada de huMab C52 de alta afinidad indicó que sólo una de las siete mutaciones dentro de la región VL, Asn^{L30A} \rightarrow Ser, es ls que más probablemente afecte directamente la interacción con Ep-CAM. Las otras mutaciones pueden dar como resultado una optimización más sutil de los sitios de unión a anticuerpo mediante enlaces de hidrógeno adicionales e interacciones de compactación mejoradas, tal como se notificó previamente (21), más que una interacción específica mejorada entre uno de los residuos de anticuerpo mutados y el antígeno Ep-Cam. De hecho, la mutación de Ser^{L31} da como resultado un enlace de hidrógeno adicional con Val^{L29} que estabiliza el bucle LCDR1. La principal ganancia en afinidad parece estar provocada por mutaciones localizadas en la periferia del sitio de combinación del antígeno en CDR1, asemejándose a la distribución de mutaciones encontradas en las regiones V mutadas somáticamente in vivo (34).

La destrucción in vivo mediada por anticuerpo de tumores sólidos es un proceso complejo que implica células efectoras que llevan el receptor de Fc del sistema inmunitario, factores de complemento y acontecimientos de señalización que resultan de la interacción entre el anticuerpo y su diana. La importancia relativa y la contribución a este proceso por las características relacionadas con el anticuerpo tales como afinidad e isótopo están volviéndose el centro de la investigación de anticuerpos, demostrado por los recientes éxitos de los anticuerpos obtenidos mediante ingeniería en el hospital. Se han aprovechado los huMabs anti-Ep-CAM de alta y baja afinidad obtenidos mediante ingeniería para estudiar los dos aspectos de los procesos dependientes de la afinidad del anticuerpo: destrucción de células tumorales y penetración de anticuerpos dentro de agrupaciones de células tumorales imitando micrometástasis.

Se encontró que UBS-54 de baja afinidad penetraba más rápidamente en el centro del esferoide multicelular, dando como resultado una distribución homogénea del huMab. Esta observación apoya otros estudios que muestran que afinidades muy altas de anticuerpos (>10^{9} M^{-1}) conducen al atrapamiento del anticuerpo en el borde del tumor y ralentizan su penetración en el interior del tumor (31, 32, 35, 36).

Sorprendentemente, huMab UBS-54 de afinidad inferior medió una lisis de una célula tumoral específica persistentemente superior con PBMC como fuente efectora comparado con el mutante C52 de afinidad superior. Se obtuvieron los mismos resultados con células diana transfectadas con un constructo de ADNc de Ep-CAM al que le faltaba la cola citoplásmica, lo que sugiere que la señalización por medio de Ep-CAM no desempeño un papel en la destrucción de células tumorales. Aunque muchos Fc\gammaR pueden desencadenar ADCC, la Fc\gammaRI de alta afinidad parece ser la molécula desencadenante más eficaz (37, 38). Se propone que las diferencias cuantitativas en la activación de células efectoras mediadas por medio de la unión de anticuerpos a Fc\gammaRI de alta afinidad pueden afectar a su capacidad para destruir en ADCC. Aunque no se ha elucidado el mecanismo para Fc\gammaRI, experimentos recientes con Fc\varepsilonR, otro miembro de alta afinidad de la familia receptora de reconocimiento inmunitario multicadena, han mostrado que la agregación de este receptor por un exceso de ligando de baja afinidad conduce al secuestro de la cinasa Lyn asociada al receptor (39). Como consecuencia, un menor número de agregados inducidos simultáneamente por un ligando de afinidad superior se vuelve carente de Lyn y por tanto no puede iniciar la cascada de señalización (38). En este modelo, la escasez de una cinasa asociada a receptor evita que las interacciones de baja afinidad activen la cascada de señalización completa (40, 41). Basándose en nuestros datos de destrucción de células tumorales in vitro, se plantea la hipótesis de que el desencadenamiento por receptor Fc\gammaRI extenso por anticuerpos de muy alta afinidad también puede dar como resultado un secuestro de cinasas asociadas a receptor y consecuentemente dar como resultado una inducción mediada por Fc\gammaRI menos eficaz de la cascada de acontecimientos que conducen a la activación de células efectoras.

Los experimentos CDCC mostraron una lisis de célula tumoral específica significativamente superior con huMab C52 comparado con huMab UBS-54, lo que indica una ventaja de anticuerpos de afinidad superior para activar el sistema complemento. Aunque la capacidad mejorada del mutante de afinidad superior para activar el sistema complemento es evidente in vitro, varios estudios indican que CDCC puede desempeñar un papel marginal en la destrucción in vivo de células tumorales. La mayor parte de células tumorales expresan reguladores que inhiben complemento que protegen las células frente a la lisis por complemento autólogo (42-46). Además, se ha encontrado que los anticuerpos monoclonales específicos de células tumorales son igualmente eficaces para erradicar los tumores en ratones deficientes en factor de complemento C5 como en ratones de control (47). Por tanto, ADCC puede ser el mecanismo inmunológico dominante para destruir células tumorales, lo que sugiere que UBS-54 de afinidad inferior con su capacidad superior para destruir en ADCC puede ser favorable para inmunoterapia pasiva.

Ejemplos Materiales y Métodos Mutagénesis y maduración por afinidad

El scFv UBS-54, aislado a partir de una biblioteca semisintética de presentación de anticuerpo de fago, está codificado por miembros de las familias de genes de región variable de cadena pesada y ligera VH1 y Vk2 (17, 48). Para mezclas de cadena ligera, se aisló el ARN total a partir de células B de sangre periférica de una combinación de 15 donantes, se convirtió en ADNc mediante cebado de oligo(dT) y se amplificó mediante PCR usando cebadores específicos de la familia de genes Vk2 con sitios de restricción Nco-I y Xho-I: Vk2-NCO-I (5'-GCCTCCACCTC
CATGGGATATTGTGATGACTCAGTCT-3')(SEQ ID NO: 1) y Vk2-XHO-I (5'-GCCTCCACCTCTCGAGCTGCT
GACGTAATAAGTTGCAAAATC-3') (SEQ ID NO: 2). Se purificaron los productos amplificados, se digirieron con enzimas de restricción adecuadas, se clonaron en vector pPv que contenía la cadena pesada de UBS-54 original, se transformaron en bacteria XL-1blue y se colocaron en placas sobre placas 2TY que contemplan ampicilina tal como se describe (48). La biblioteca mezclada resultante contenía 2*10^{7} clones individuales.

Para selecciones de fago, se lavaron células de carcinoma de colon LS174T en PBS y se fijaron en paraformaldehído al 1% durante 15 min a 4ºC. Para la selección de mutantes de afinidad superior se incubaron 10^{6} células fijadas y la biblioteca mezclada durante 2 horas a 4ºC y se lavaron las células 3 veces en 50 ml de medio enfriado con hielo. El procedimiento de lavado riguroso consistió en la incubación de células fijadas en BSA al 1%/PBS que contenía tween 80 al 0,5% a 37ºC. Cada 15 minutos se lavaron las células y se transfirieron a un nuevo tubo eppendorf, se repitió este procedimiento 16 veces. Finalmente, se lavaron las células dos veces en PBS, y se eluyeron los fagos mediante resuspensión del sedimento celular final en 500 \mul de HCl 100 mM durante 5 minutos, seguido por neutralización con 250 \mul de Tris/HCl 1 M pH 7,4. Se propagaron los fagos y se realizaron 2 rondas adicionales de selección usando el mismo procedimiento salvo que el número de ciclos de lavado aumentó en tres cada ronda posterior. Tras la última ronda de selección, se eligieron aleatoriamente 70 colonias y se usaron para análisis de secuencias de nucleótidos.

Se realizó la mezcla del ADN del gen de VH, según un procedimiento descrito en detalle en otra parte (18, 19). En resumen, se amplificó el ADNc de células B de sangre periférica usando cebadores específicos para la familia de genes VH1: NCO-I-VH1:

5'GCCTCCACCTCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG3'

(SEQ ID NO: 3)

y XHO-I de VH de pan:

5'GCCTCCACCTCTCGAGTCTCGCACAGTAATACACGGCCG3'

(SEQ ID NO: 4).

Tras la purificación, se trataron 2 \mug de producto de PCR con ADNasa I (Sigma, St. Louis, MO) para generar fragmentos de ADN que oscilaban en tamaño entre 50 y 100 pares de bases. Se reagruparon estos fragmentos en un volumen de 100 \mul con dNTP 800 \muM, 0,2 unidades de Taq polimerasa (Supertaq, HT biotechnology Ltd. Cambridge, RU) en el tampón recomendado por el fabricante en ausencia de cebadores. La PCR de reagrupación consistió en 40 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 50ºC y dos min a 72ºC. El producto de PCR de reagrupación se usó en una dilución 1/30 en una PCR posterior (20 ciclos) con el cebador NCO-VH1 y adiciones conocidas del cebador XHO-HCDR3-UBS-54: 5' GCCTCCACCTCTCGAGACGGTGACCAGGGTACCTTGGCCCCA [ATA(CAT/AGG/ACC)] [GTG(AAA/CTT/GGC)][AAG(CTA/AGT/ACC)][AAA(CTT/AGG/ACC)][CGG(AAA/CTT/CCC)]][GTA(AAT/
CGG/GCC)]TCTTGCACAGTAATACACGGCCGTGTC3' (SEQ ID NO: 5). Los nucleótidos entre paréntesis comprenden el 10% de la mezcla. Las adiciones conocidas de oligo cebador de HCDR3 introdujeron una sustitución promedio de 2 de los 6 aminoácidos en el HCDR3 original de UBS-54. Se digirió el producto de PCR con NcoI y XhoI y se clonó en vector pPV que contenía la cadena ligera A37. Esto dio como resultado una biblioteca de 4*10^{7} clones. Se incubó la biblioteca con células LS174T fijadas a temperatura ambiente durante 2 horas y se sometieron al procedimiento de lavado riguroso. Tras 3 rondas de selección se analizó la secuencia de nucleótidos de 64 clones.

Para la mezcla de ADN de la cadena ligera, se usaron los siguientes cebadores: NCO Vk2 y Vk2-XHO. Tras el tratamiento con ADNasa I y la PCR de reagrupación, se amplificó el producto reagrupado usando los mismos cebadores, se digirió con SacI y NotI y se clonó en el vector pPV que contenía el gen VH del clon B43. Excepto por el número aumentado de ciclos de lavado, las selecciones de fago con esta biblioteca de 1*10^{7} clones fueron idénticas a las descritas anteriormente. Tras 3 rondas de selección, se eligieron 70 clones para el análisis de la secuencia de nucleótidos, dando como resultado la identificación de un clon dominante único (31/70 clones) denominado clon C52.

Construcción y evaluación de huMab intactos

Se eliminaron las regiones VH y VL que codifican para los scFv A37, B43 y C52 y volvieron a clonarse en vectores de expresión para la síntesis de moléculas IgG1/K humanas completas tal como se describe en detalle en otra parte (17, 49). En un procedimiento de clonación de dos etapas, se insertaron en primer lugar las regiones VH y VL que codifican para los scFv en el vector pLEADER para unirse a la secuencia peptídica líder HAVT de cadena \alpha del receptor de célula T y un sitio donador de corte y empalme. En la segunda etapa de clonación, las regiones VH o VL, que contienen sitios donadores de corte y empalme líder y, se subclonaron en los vectores de expresión pNUT-C\gamma1 o pNUT-Ck usando sitios de restricción apropiados. Posteriormente se transfectaron de manera estable los constructos en células BHK. En resumen, se mantuvieron las células a 37ºC en un incubador humidificado con CO_{2} al 5% en medio de Dulbeocco modificado por Iscove que contenía FCS al 10%, glutamina 2 mM y gentamicina 10 \mug/ml (medio completo). Se transfectaron células a una densidad del 70-80% de confluencia usando precipitación de ADN de plásmido de fosfato de calcio durante 4 h a 37ºC, seguido por un choque con glicerol al 15% durante 1 min. Se inició la selección añadiendo metotrexato 80 \muM (Sigma, St. Louis, MO). Tras 2 semanas, se eligieron colonias de células resistentes y se cultivaron en medio que contenía metotrexato. Se determinó la producción de huMabs en el sobrenadante mediante ELISA cuantitativo. Se determinó la integridad de huMab recombinantes purificados por proteína A mediante SDS/PAGE y mediante tinción con azul brillante de Coomassie de los geles. Se determinó la concentración de huMab purificado mediante espectrofotometría a \lambda 280 nm. Para la tinción de inmunofluorescencia, se usaron 10 \mul de IgG1 huMab purificado a una concentración de 10 \mul/ml. Se detectaron los huMab mediante IgG de cabra anti-humana conjugada con FITC (Southern Biotechology Associates, Birmingham, AL). La línea celular de fibroblasto L929 y las células L929 transfectadas con ADNc de Ep-CAM (LME-6) fueron un generoso regalo del Dr. S. Litvinov (Universidad de Leiden, Países Bajos) (50).

Mediciones de afinidad

En células de flujo BIAcore separadas, se acoplaron aproximadamente 160, 1565 y 4154 unidades de resonancia de Ep-CAM recombinante purificado producido en células de insectos (generosamente proporcionadas por el Dr. D. Herlyn, Wistar institute, Filadelfia, PA) (25 \mug/ml) en tampón acetato 10 mM (pH 4,0) con un chip detector de CM5 usando química combinatoria NHS/EDC. Se midieron la asociación y la disociación en condiciones de flujo continuo de 30 ml/min usando un intervalo de concentración de desde 100 hasta 1 nM.

Análisis estructural

Tras el alineamiento secuencial y estructural inicial usando la clasificación automática descrita por Martin y Thornton (51), se eligió estructura 1GC1 (52), depositada en el Banco de Datos de Proteínas (Protein Data Bank) (53), como estructura principal para la cadena pesada de todos los modelos. Para crear una estructura principal para los CDR H3 no canónicos, se realizó una búsqueda de bucle con el programa SYBYL v.6.5 (Tripos Inc., St. Louis, Missouri, EE.UU.) entre residuos de Gly^{94} y Phe^{100y} de 1GC1. Estas posiciones, desviándose relativamente poco en los ángulos de torsión (26), preceden a una parte más variable del CDR H3. Además, las regiones 92-94 y 100y-104 muestran una alta similitud de secuencia con 1GC1. Se usó la estructura 1NQB (54) con el bucle L3 CDR de 1JRH (55) como estructura principal para la cadena ligera del anticuerpo UBS-54. Se usó la estructura 1FIG (56) como estructura principal para las cadenas ligeras para los modelos A37 y C52. Se realizó la modelización real con el módulo BLDPIR de WHAT IF v. 19970813-1517 (57). Se comprobó la calidad con el PROCHECK v. 3.3 (58) y el módulo WHATCHECK de WHAT IF. Pueden encontrarse las coordenadas atómicas de los modelos en http://wwwcmc.pharm.uu.nl/moret/pub/. Se creó una base de conocimiento mediante el análisis de los siguientes complejos antígeno-anticuerpo, seleccionados del Banco de Datos de Proteínas: 1BAF, 1CBV, 2GCR, 1CLZ, 1DBB, 1EAP, 1FIG, 1FLR, 1GAF, 1HYX, 1IBG, 1IGJ, 1IND, 1KEL, 1KNO, 2MCP, 1MFA, 1MRD, 1MPA (clase hapteno), 1ACY, 1TET, 1FPT, 1FRG, 1GGI, 2IGF (clase péptido), 1AFV, 1DVF, 1FBI, 1VFB, 3HFL, 3HFM, 1LAI, 1IKF, 1JEL, 1JHL, 1MLC, 1NCD, 1NMB, 10SP (clase proteína). Los programas usados para el análisis son: HBPLUS (59) "AS INTEGRATED IN LIGPLOT" v.3.0 (60), NACCESS v.2.1.1 (Hubbard, S.J., y Thornton, J.M. 1993. "NACCES", Programa informático, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, University College London), DISCOVER v.97.0 (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA, EE.UU.) y SYBYL. El análisis de la secuencia de proteínas se llevó a cabo con el programa BLAST v.2.0 (61).

Citotoxicidad celular dependiente de complemento y anticuerpo

Se evaluó la actividad citolítica de células polimorfonucleares (PMN) y células mononucleares (PBMC) de sangre periférica humana en un ensayo convencional de liberación de ^{51}Cr (62). En resumen, se marcaron las células tumorales diana se marcaron con 150 \muCi de ^{51}Cr (Amersham, Buckinghamshire, RU) durante 2 h a 37ºC. Tras lavado extenso, se colocaron en placas las células diana en placas de microtitulación con fondo en U a una concentración de 5*10^{3} células/pocillo. Se añadieron PMN y PBMC humanas aisladas a cada pocillo a una razón efector:diana de 80:1. Se incubaron las células a 37ºC en presencia de varias concentraciones de anticuerpos purificados en un volumen final de 200 \mul. Para los ensayos ADCC de sangre completa, se añadieron 50 \mul/pocillo de sangre periférica heparinizada como fuente de células efectoras. Se realizó la lisis mediada por complemento con 50 \mul de suero. Tras 4 h, se determinó la liberación de ^{51}Cr por triplicado. Se calculó el porcentaje de citotoxicidad celular según la fórmula: % de lisis específica = ([cpm experimental-cpm basal]/[cpm máxima-cpm-basal]) * 100%, determinándose la máxima liberación de ^{51}Cr tras lisar las células diana con Zapoglobina al 10% (Coulter, Pittsburgh, PA), y midiéndose la liberación basal tras incubar células diana con medio solo. Se recogió la sangre periférica heparinizada de voluntarios sanos. Se aislaron PMN y PBMC mediante centrifugación a gradiente discontinuo de Ficoll-Histopaque, tal como se describió previamente (63). Se eliminaron los eritrocitos contaminantes mediante choque hipotónico con NaCl al 0,2%. Las células efectoras eran puras en más de un 95%, tal como se determina mediante preparaciones de citospina y viables en más de un 95% tal como se evalúan mediante exclusión con azul trypan. Para los experimentos ADCC y CDCC, se usaron como células diana células tumorales LS174T y células HCA transfectadas con Ep-CAM humano (HCE) o con Ep-CAM humano con cola citoplásmica delecionada (HCM), ambas bajo control transcripcional de un promotor de metalotionina (64). Las células HCE y HCM fueron generosamente proporcionadas por el Dr. S. Litvinov (Dept. de Patología, Universidad de Leiden, Países Bajos).

Penetración de anticuerpos en esferoides multicelulares

Se marcaron los anticuerpos purificados UBS-54 y C52 mutante con FITC según procedimientos convencionales. Se incubaron varias veces esferoides multicelulares que se producen de manera natural de línea celular del carcinoma GLC-8 Ep-CAM + durante diversos tiempos con huMab marcados con FITC y se analizaron usando un CLSM MRC-1000 de Bio-Rad (BioRad, Hercules, CA). Se registraron las imágenes confocales tras 10-15 minutos de incubación en el centro del esferoide multicelular tal como se describe (65).

Resultados Generación y selección de bibliotecas mutantes

Recientemente, se ha descrito el aislamiento de scFv dirigidos contra la molécula de Ep-CAM asociada a tumor y su conversión en un anticuerpo IgG1 humano funcional, intacto con una afinidad de 5 nM (19). Se sustituyó la cadena ligera Vk2 de la línea germinal de este anticuerpo por las cadenas ligeras Vk obtenidas mediante amplificación por PCR de ADNc extraído a partir de linfocitos de sangre combinada de 15 individuos sanos. Se generó una biblioteca de representación de fago de 2x10^{7} clones y posteriormente se colocó en una bandeja de células de carcinoma de colon LS174T Ep-Cam + fijadas en paraformaldehído. Obsérvese que 24 clones elegidos aleatoriamente de la biblioteca no seleccionada se unieron todos a la línea celular LME-6 transfectada por Ep-CAM pero no a la línea celular L929 original en análisis de citometría de flujo, mostrando el papel dominante del gen de VH para determinar la especificidad de Ep-CAM. Se incubaron las células con fagos unidos a 37ºC y se lavaron cada 15 minutos con PBS/tween (0,5%) durante 16 ciclos. En experimentos preliminares, se determinó que los fagos que expresan el scFv de UBS-54 no podían detectarse por citometría de flujo en células de carcinoma de colon LS174 tras estos procedimientos de lavado riguroso. Pudieron recuperarse aproximadamente 10^{7} fagos tras la primera, segunda y tercera rondas de selección, mientras que el número de ciclos de lavado aumentaba en 3 cada ronda posterior. El análisis de la secuencia de nucleótidos de clones elegidos aleatoriamente de la tercera ronda de selección reveló una secuencia de Vk idéntica en aproximadamente el 50% de los clones. Este clon se denominó A37.

Estudios cristalográficos y de injerto de CDR han mostrado de manera convincente que ambas mutaciones en las regiones de CDR y framework de las regiones V pueden contribuir a la mejora de la afinidad de los anticuerpos (20, 21). Por tanto, se ha seleccionado la mezcla de ADN como segunda estrategia de mutagénesis porque da como resultado la introducción de mutaciones en ambas regiones de CDR y framework. La mezcla de ADN introduce mutaciones puntuales e intercambio de extensiones de ADN entre genes homólogos, imitando así la evolución natural de la proteína (18, 19). Además, esta estrategia de mutación, introduce potencialmente bloques de CDR que ya han sido seleccionados para aminoácidos favorables tales como Tyr, Trp, Ser, y Asp. Los aminoácidos Tyr, Trp, Ser, y Asp son favorables para la unión a antígeno porque tienen una bajo grado conformacional de libertad (menos entropía que perder) y participan en una variedad de interacciones moleculares, tales como enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones dipolo-dipolo, y apilamiento p aromático (Tyr y Trp) (22, 23). Se mezcló el gen de VH1 que codifica para scFv UBS-54 con segmentos de gen de VH1 amplificados de la combinación donantes sanos. Se usaron fragmentos de 50-100 pares de bases obtenidos tras la digestión con ADNasa I en una PCR de reagrupación, y se amplificaron posteriormente con un cebador en 5' específico de VH1 y un cebador CDR3 de adición conocida. El cebador de oligonucleótido de adición conocida se diseñó para introducir una baja tasa de mutaciones en la región CDR3 de los segmentos del gen de VH1. Se construyó una pequeña biblioteca de 4*10^{7} clones mutagenizados de VH1 ligando material amplificado por PCR en el constructo que contiene la cadena ligera A37. Se seleccionó posteriormente esta biblioteca sobre células fijadas intactas. El análisis de secuencia de 24 clones elegidos aleatoriamente de la biblioteca mezclada de ADN sin seleccionar demostró un promedio de aproximadamente 18 mutaciones en el gen de VH entero con un promedio de 2,6 mutaciones en la región CDR3. Este número de mutaciones disminuyó hasta aproximadamente 4 mutaciones en cada gen de VH tras tres rondas de selección. Obsérvese que todos los clones analizados tras tres rondas de selección contenían la región CDR3 del UBS-54 original. Como no pudo detectarse ningún clon único dominante tras tres rondas de selección para unirse a las células de carcinoma LST174, se eligió aleatoriamente el clon B43 para un análisis adicional. Esta elección se basó en la observación de que contenía un número de mutaciones frecuentemente observadas en otros clones de esta colección. Posteriormente se realizó la mezcla de ADN con la cadena ligera usando la colección de segmentos de gen de Vk usados para la construcción de la biblioteca mezclada de cadena ligera. La biblioteca resultante comprendía 1*10^{7} clones y se selección para unirse a las células intactas en condiciones rigurosas. Tras tres rondas de selección, se realizó el análisis de secuencia y reveló un único clon dominante (31 secuencias de 70), denominado clon C52.

Reconstrucción de huMab intactos

Se clonaron de nuevo las regiones V de scFv A37, B43 y C52 mutantes en vectores de expresión eucariotas para la producción de huMab de IgG1 en células BHK (17). Se purificó la inmunoglobulina a partir del sobrenadante de líneas celulares transfectadas de manera estable usando cromatografía de afinidad de proteína A tal como se describe (17). Aunque pudieron aislarse huMabs intactos y funcionales a partir del sobrenandante de clon B43 (datos no mostrados), no reveló mejora significativa de la afinidad para el Ep-CAM recombinante en análisis BiaCore (véase el siguiente párrafo). Por tanto se centró la atención en UBS-54 original y los mutantes A37 y C52. Se confirmó la integridad de huMab de IgG1/K A37 y C52 mediante tinción con Coomassie de geles SDS/PAGE usados en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes (figura 1). Los huMabs A37 y C52 purificados, conservaron su especificidad tal como se determina mediante unión a la línea celular LME-6 transfectada con Ep-CAM pero no la línea celular original L929 no transfectada (figura 1).

Análisis Biacore

Se determinaron las tasas cinéticas de asociación y disociación del huMab UBS-54 original y de los huMab A37 y C52 mutantes mediante resonancia de plasmón superficial (tabla 1). Se usaron el huMab UBS-54 original y el anticuerpo murino anti-Ep-CAM 323/A3 como controles, revelando una KD promedio de 6 nM y 0,5 nM respectivamente. El huMab A37 con la cadena ligera de Vk mezclada demostró una afinidad de 1,6 nM (aumento de \sim4 veces). Se mejoró la afinidad de unión del huMab C52 que contenía la cadena ligera de Vk mezclada de ADN 15 veces si se compara con el huMab UBS-54 original, dando un huMab con una KD = 4 *10^{-10} nM. La mejora fue esencialmente el resultado de una constante de disociación inferior.

Análisis estructural

El análisis de secuencia muestra que la cadena ligera seleccionada en A37 mutante representa sólo el 54% de homología de secuencia con la cadena ligera original en UBS-54 y tiene una secuencia CDR1 más corta (figura 2). La cadena ligera de A37 es un miembro de la familia de genes de Vk3 con el mayor grado de homología con el segmento génico de la línea germinal DPK22/A27 (24). Aunque el cebador de Vk se hibrida preferentemente con los genes de Vk2, se observó que los genes de Vk3 también estaban presentes en la biblioteca mezclada. El bucle de CDR1 más corto en C52 parece que sobresale en menor grado en el sitio de unión a antígeno, creando una superficie de contacto plana, que es favorablemente energética en anticuerpos anti-proteína (23; figura 3).

La afinidad del mutante C52 maduro difiere de la del A37 por tres cambios de aminoácidos en la cadena pesada (las mutaciones de B43 de VH, introducidas por mezcla de ADN de VH) y por ocho mutaciones adicionales en la cadena ligera (las mutaciones de C52 de VL, introducidas por mezcla de ADN de VL) (figura 2 y figura 3). Las mutaciones Ser^{H16} \rightarrow Ala, Arg^{H19} \rightarrow Lys, Arg^{L40} \rightarrow Pro, Ser^{L65} \rightarrow Thr y Glu^{L105} \rightarrow Asp se localizan dentro de la región framework, lejos del sitio de combinación y es probable que no estén implicadas en la estabilización de la conformación de los bucles CDR. La mutación Ile^{H52} \rightarrow Val en H2 de CDR puede dar como resultado la eliminación de la interacción estérica de repulsión del átomo de Cd de Ile^{H52}. Sin embargo, dado que el B43 mutante con las mismas mutaciones no muestra aumento significativo en la afinidad de unión a antígeno (datos no mostrados), el efecto global de esta mutación parece ser pequeño. El residuo L50 (mutación Ala^{L50} \rightarrow Gly) está frecuentemente implicado en el contacto de antígeno según la base de conocimiento. Un cambio en la conformación de la estructura principal de L2 de CDR, debido a la libertad conformacional superior de Gly no es probable, dado que el L2 de CDR ha conservado la estructura canónica (25). Supuestamente, debido a la distancia relativamente grande entre la parte superior de L2 de CDR y la superficie del anticuerpo, que incluye el sitio de unión a antígeno, las interacciones de alta energía parecen estar reservadas para aminoácidos con grandes cadenas laterales.

Cuatro mutaciones están localizadas en la L1 de CDR, Thr^{L28} \rightarrow Ser, Ile^{L29} \rightarrow Val, Asn^{L30A} \rightarrow Ser y Asn^{L31} \rightarrow Ser (figura 2 y figura 3). La base de conocimiento revela que las posiciones de anticuerpo L28, L29 y L31 interaccionan en casos muy poco frecuentes en complejos de proteína-anticuerpo, al contrario que la posición L30A. En el caso de la posición L28 (mutación Thr^{L28} \rightarrow Ser), esta se debe probablemente a su localización periférica.

La cadena lateral Ile^{L29} de A37 se incrusta dentro de la L1 de CDR, estabilizando el bucle mediante interacciones de compactación, que imita el Val^{L29} de C52. La cadena lateral Asn^{L31} de A37 parece estar girada hacia fuera del sitio de unión. La mutación Ser^{L31} de C52 permite un enlace de hidrógeno adicional entre sus grupos hidroxilo y el grupo carbonilo de la cadena principal de Val^{L29}, estabilizando adicionalmente el bucle de L1 de CDR. Es muy probable que la mutación de punto caliente ("Hotspot") Asn^{L30A} \rightarrow Ser afecte a la interacción con Ep-CAM directa-
mente.

Análisis funcional

La disponibilidad de dos huMab anti-tumorales con la misma especificidad de epítopo pero distintas afinidades permitió evaluar de manera precisa la influencia de la afinidad sobre la capacidad de destrucción de células tumorales in vitro en ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y complemento (ADCC y CDCC respectivamente). ADCC con células diana tumorales LS174T y PBMC como fuente de células efectoras dio consistentemente como resultado una lisis de células tumorales un ~10% inferior con el huMab C52 de alta afinidad comparado con el huMab UBS54 original (figura 4). La lisis de células tumorales persistentemente inferior mediada por huMab C52 se produce a concentraciones de anticuerpo saturadas, indicadas mediante la forma de meseta en la curva (figura 4). Basándose en estudios en animales y la actuación mejorada de anticuerpos monoclonales de humano/ratón quiméricos en pacientes, se considera que ADCC es un mecanismo inmunológico importante en la destrucción de células tumorales (26, 28). Un efecto inhibidor directo de los anticuerpos terapéuticos sobre el crecimiento de células tumorales o la inducción de apoptosis de células tumorales, mediado por la unión de anticuerpos a sus receptores diana, también puede contribuir a la eficacia clínica (29, 30). Para evaluar si la lisis de células tumorales menos eficaz mediada por C52 era independiente de la transducción de señales por medio de Ep-Cam, se realizó ADCC con líneas celulares HMA transfectadas con ADNc de Ep-CAM de longitud completa o con un ADNc de Ep-CAM mutante que carece de cola citoplásmica. Con ambos transfectantes, se observó de manera reproducible la misma destrucción de células tumorales menos eficaz del huMab mutante C52, lo que sugiere que la diferencia observada en la capacidad de destrucción entre UBS54 y C52 no está influenciada por variaciones el la transducción de señales por medio de Ep-CAM (datos no
mostrados).

Los mismos experimentos realizados con sangre completa en lugar de PBMC purificada como fuente de células efectoras demostraron una lisis de células tumorales significativamente más eficaz con el huMab C52 mutante de alta afinidad (figura 4). Se planteó la hipótesis de que el rendimiento mejorado de huMab C52 de alta afinidad estaba provocado por una CDCC más eficaz. De hecho, huMab C52 mediaba más eficazmente la destrucción de células tumorales en ausencia de células efectoras y con suero como fuente de complemento (figura 4). Aparentemente, la tasa de disociación inferior de huMab C52 mutante da como resultado una reticulación más eficaz del fragmento de complemento C1q.

Influencia de la afinidad del anticuerpo sobre la penetración en esferoides multicelulares de células tumorales

La percolación profunda y la distribución uniforme a través del tumor de anticuerpos monoclonales en inmunoterapia de tumores sólidos se considera que es importante para un efecto terapéutico óptimo. Estudios in vitro e in vivo han sugerido que el transporte de anticuerpos a través del intersticio tumoral se retrasa por su unión específica al antígeno tumoral. Esta denominada barrera de sitio de unión es una función de la afinidad de unión, concentración de antígeno y los coeficientes de transporte de anticuerpo (31, 32). Para determinar el efecto relativo de la barrera de sitio de unión de los huMab anti-tumorales de alta y baja afinidad, se empleó un sistema de modelo esferoide multicelular in vitro. Se incubó la línea celular de carcinoma de pulmón de célula pequeña, Glc-8, que expresa altos niveles de Ep-CAM y crece en esferoides multicelulares de aproximadamente 100 células, con 10 mg de C52 o UBS54 conjugado con FITC. La microscopía de barrido láser confocal de los esferoides tras 10-15 minutos de incubación reveló una barrera de sitio de unión con huMab de afinidad superior. En este punto de tiempo se observó la unión uniforme de huMab UBS-54 con células en los esferoides, mientras que la unión del mutante C52 de afinidad superior quedaba casi restringida a la capa celular externa (figura 5). Tras una hora de incubación, se observó la unión uniforme a todas las células en los esferoides para ambos anticuerpos (datos no mostrados).

Breve descripción de las figuras

Figura 1: análisis SDS/PAGE huMab purificados en condiciones reductoras (A) y no reductoras (B) (UBS-54, bandas 1 y 4; A37, bandas 2 y 5; C52, bandas 3 y 6). PM: marcadores de peso molecular en kilodaltones. Panel C: tinción de línea celular L929 original negativa para Ep-CAM (línea delgada) y células positivas para Ep-CAM transfectadas de mantera estable (línea gruesa) con huMab UBS-54, huMab A37, y huMab C52.

Figura 2: Comparación de secuencias del UBS-54 original y los mutantes A37 y C52 de afinidad superior. Obsérvese que la secuencia CDR1 más corta en la cadena ligera de Vk3 mezclada. Numeración según Chothia (25).

Figura 3: La modelización de UBS-54 original (A) y de las regiones V de anticuerpo mutagenizado de C52 (B) muestra la estructura canónica más corta de LCDR1 (flecha). El aumento (C) muestra las posiciones de los residuos mutados en LCDR1 (Thr^{L28} \rightarrow Ser, Ile^{L29} \rightarrow Val, Asn^{L30A} \rightarrow Ser y Asn^{L31} \rightarrow Ser). Lo más probable es que la posición Ser^{L30} afecte a la interacción con Ep-CAM. Un enlace de hidrógeno entre Ser^{L31} y Val^{L29} da como resultado la estabilización del bucle LCDR1.

Figura 4: Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad celular dependiente de complemento (CDCC) usando huMab UBS-54 (\sqbullet) y huMab C52 101 Los experimentos mostrados son representativos de al menos 6 experimentos realizados con células efectoras de distintos donantes.

Figura 5: Imágenes de microscopio láser de barrido confocal registradas en el centro los esferoides multicelulares Glc-8 con huMab UBS54 marcado (A) y huMab C52 con FITC marcado (B).

TABLA 1 Afinidades y cinética de unión de huMab UBS-54, A37 y C52. El error estándar de la media se indica entre paréntesis

100

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<110> Crucell Holland B.V.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Uso de un epítopo nativo para seleccionar miembros de unión desarrollados a partir de una biblioteca de mutantes de una proteína que puede unirse a dicho epítopo

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<130> 0053 EP 02 DIV

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<140> EP04102692.3

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<141> 14-06-2004

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP99204561.7

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<151> 27-12-1999

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 14

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador Vkappa2-NCO-I

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctccacct ccatgggata ttgtgatgac tcagtct

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Vkappa2-XHO-I

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcctccacct ctcgagctgc tgacagtaat aagttgcaaa atc

\hfill

43

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador NCO-I-VH1

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctccacct ccatggccca ggtgcagctg gtgcagtctg g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador VH XHO-I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctccacct ctcgagtctc gcacagtaat acacggccg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de adición conocida XHO-HCDR3-UBS-54

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

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<222> (43)..(60)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> en la que "n" en las posiciones 43, 44 y 45 representa ATA, CAT, AGG o ACC; en las posiciones 46, 47, 48 representa GTG, AAA, CTT o GGC; en las posiciones 49, 50 y 51 representa AAG, CTA, AGT o ACC; en las posiciones 52, 53 y 54 representa AAA, CTT, AGG o ACC; y en las posiciones 58, 59 y 60 representa GTA, AAT, CGG o GCC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

1

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<210> 6

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Región CDR3 de cadena pesada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Phe Leu His Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Región CDR3 de cadena ligera

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Met Gln Ala Leu Gln Thr Phe Thr Phe}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Región CDR2 de cadena pesada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Ile Pro Ile Phe Gly Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región CDR1 de cadena pesada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena pesada variable de UBS-54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

2

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<210> 11

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<211> 110

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena ligera variable de UBS-54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos de UBS-54

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

5

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 219

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos de A37

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<400> 13

7

8

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<210> 14

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<211> 218

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos de C52

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<400> 14

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9

10

Claims (12)

1. Anticuerpo monoclonal humano que puede unirse a Ep-CAM humano caracterizado porque el anticuerpo comprende:

a).

una región de CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos GGTFSSY, una región de CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos IPIFGT, una región de CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos DPFLHY, una región de CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos RSSQSLLHSNGYNYLD, una región de CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos LGSNRAS, y una región de CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos MQALQTFTF,

b).

una región de CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos GGTFSSY, una región de CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos IPIFGT, una región de CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos DPFLHY, una región de CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos RASQTISNNYLA, una región de CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos AASSRAT, y una región de CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos AQGELYPRQF, o

c).

una región de CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos GGTFSSY, una región de CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos VPIFGT, una región de CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos DPFLHY, una región de CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos RASQSVSSYLA, una región de CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos GASSRA, y una región de CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos AQGELYPRQF.

2. Anticuerpo monoclonal humano según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos GGTFSSY, una región de CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos IPIFGT, una región de CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos DPFLHY, una región de CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos RSSQSLLHSNGYNYLD, una región de CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos LGSNRAS, y una región de CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos MQALQTFTF.

3. Anticuerpo monoclonal humano según la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

4. Anticuerpo monoclonal humano según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

5. Anticuerpo monoclonal humano según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque el anticuerpo tiene una constante de afinidad para Ep-CAM humano de 6 nM.

6. Anticuerpo monoclonal humano según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque el anticuerpo tiene una actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpo que es superior a la actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpo de un anticuerpo monoclonal humano que puede unirse a Ep-CAM humano que tiene una constante de afinidad para Ep-CAM humano que es inferior a 6 nM.

7. Anticuerpo monoclonal humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el anticuerpo es una molécula de IgG1.

8. Anticuerpo monoclonal humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque el anticuerpo está marcado con fluorescencia.

9. Anticuerpo monoclonal humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso como un medicamento.

10. Uso de un anticuerpo monoclonal humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor.

11. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque el tumor es un tumor sólido.

12. Uso según la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el tumor es un carcinoma de colon.