ES2282889T3 - Optimizacion biotecnologica del proceso en la obtencion de aceite. - Google Patents
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Abstract
REIVINDICACIONES 1.- Procedimiento para la producción de aceite a partir de masas de aceitunas y/o de componentes de aceitunas, que abarca los pasos siguientes: a.- puesta a disposición de una masa de aceitunas y/o de componentes de aceitunas, sin la separación de los huesos de las aceitunas; b.- adición de una enzima o de una mezcla de enzimas que contiene por lo menos una pectina esterasa, en forma líquida o sólida; c.- mezclado conjunto de la masa y de la mezcla de enzimas; d.- separación de la fase de aceite de la masa, con ayuda de un decantador de tres fases.
Description
Optimización biotecnológica del proceso en la
obtención de aceite.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de aceite a partir de masas de
aceitunas y/o de componentes de aceitunas, utilizándose una enzima
o una mezcla de enzimas.
El aceite de oliva se obtiene de los frutos del
olivo (árbol de la clase de las dicotiledóneas, orden de los
oleales, familia de las oleáceas, especie: Olea europaea). El fruto
del olivo (aceituna) tiene una forma redonda, de sección
transversal oval, y es un fruto carnoso de hueso con sabor amargo.
Las propiedades físicas y químicas de los frutos del olivo dependen
de muchos factores, como, por ejemplo, el tipo o variedad, el grado
de maduración, el momento de la cosecha, la situación geográfica o
las condiciones del crecimiento. Desde el punto de vista
estructural, puede dividirse el fruto del olivo en dos componentes
esenciales, que son el pericarpio y el endocarpio. El pericarpio
abarca el epicarpio (exocarpio) y el mesocarpio (pulpa), que rodean
el endocarpio (hueso de madera), en el cual, nuevamente, se halla
incluida la semilla.
La producción de aceite a partir de los frutos
del olivo es de gran importancia económica. De acuerdo con los
datos del Concejo Internacional del Aceite de Oliva (International
Olive Oil Council, IOOC), para el año de producción 2003/2004 se
espera una cantidad mundial total de más de 2,8 millones de
toneladas de aceite de oliva. Esta cantidad se elabora mediante los
métodos tecnológicos más diversos, y abarca diversas calidades. Es
posible una subdivisión de los métodos de producción sobre la base
de dos principios, a saber, por una parte la tecnología
mecánico-física como, por ejemplo, prensado,
percolación, así como procedimientos de dos o tres fases, y por
otra parte, procedimientos basados en disolventes en forma de
tecnología química-extractiva.
La tecnología empleada y el tipo de conducción
del proceso, determinan, entre otros, el rendimiento en aceite de
oliva. Para la elaboración en los procedimientos
mecánico-físicos, se procede en primer lugar a
triturar o desmenuzar las aceitunas, por ejemplo, mediante muelas
de molino o molinos de martillo, seguido por un paso en el que se
somete a incubación la pasta de aceitunas durante un tiempo
determinado (típicamente durante 30-90 minutos)
bajo agitación horizontal, eventualmente bajo adición de agua, para
un mayor desmenuzado y maceración. A ello le sigue una obtención
del aceite a partir de la suspensión obtenida, típicamente mediante
presión (prensado) y/o mediante fuerza centrífuga.
En el primer paso de aislación, descrito en lo
que precede, es decir en el paso en el que las aceitunas trituradas
ingresan directamente, se aísla, en función del procedimiento,
típicamente entre 50 y 85% de la totalidad del aceite contenido. La
masa de aceitunas (pulpa de aceitunas) obtenida después del primer
paso de aislación presenta por consiguiente todavía un
significativo contenido residual de aceite, siendo posible causar su
reducción mediante la repetición única o múltiple del primer paso
del proceso, eventualmente bajo la modificación de determinados
parámetros del proceso como, por ejemplo la temperatura, fuerza
centrífuga aplicada, adición de agua, etc. Sin embargo, la
aislación del aceite mediante métodos
mecánicos-físicos puede llevarse a cabo de una
manera económicamente conveniente solamente hasta un determinado
contenido residual de aceite. Por ello, a efectos de reducir más
aún el contenido residual de aceite y con ello elevar el rendimiento
en aceite, se recurre a procedimientos químicos de extracción. A
tal efecto se seca la pulpa de aceituna, eventualmente se la
extruye y extrae con un disolvente como, por ejemplo, hexano. El
aceite se obtiene del extracto por separación del disolvente, por
ejemplo por evaporación. Además del rendimiento, también la calidad
del aceite de oliva es influida por el tipo de procedimiento y por
la conducción del proceso. Es económicamente conveniente la
elección de aquellos procedimientos que provean aceite de alta
calidad, ya que la calidad se correlaciona positivamente con el
precio a obtenerse. A tal efecto son especialmente adecuados los
procedimientos mecánico-físicos. También por razones
ambientales y de seguridad laboral existe un empeño de renunciar en
todo lo posible a los procedimientos
químico-extractivos, a favor de los
procedimientos
mecánico-físicos.
mecánico-físicos.
La utilización de enzimas se conoce también de
la bibliografía. Las enzimas son polipéptidos funcionales que están
en condiciones de catalizar el desdoblamiento de sustratos definidos
o la síntesis de determinados productos. Con referencia al proceso
de la producción del aceite de oliva, en el pasado se han descrito
preferentemente aquellas enzimas o mezclas de enzimas que están en
condiciones de tener un efecto de degradación sobre determinadas
estructuras celulares del fruto del olivo.
El empleo de enzimas que degradan las paredes de
las células en la producción del aceite de oliva ya se ha descrito
en 1954 por Soroa y Pineda (de Soroa y Pineda, J. M. (1954)
Oleagineux 9, 865-868. Emploi des enzymes dans
l'extraction de l'huile d'olive). Por otra parte, del estado la
técnica se conoce el empleo de enzimas endógenas o exógenas como
las poligalacturonasas (EC 3.2.1.15 (endo-) o EC 3.2.1.67
(exo-)), las pectina esterasas (EC 3.1.1.11), la pepsina (EC
3.4.23.1), la papaína (EC 3.4.22.2), las celulasas (EC 3.2.1.4), la
\alpha-amilasa (EC 3.2.1.1.), las proteasas (EC
3.4.2x.yz), la \beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21), la
\beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23), las
\alpha-arabinosidasas (EC 3.2.1.55), la
\alpha-mannosidasa ((EC 3.2.1.24), las
\beta-xilosidasas (EC 3.2.1.37), la
\beta-N-acetilglucoamidasa (EC
3.2.1.52), la
\alpha-D-galactosidasa (EC
3.3.1.22), las pectina-liasas (EC 4.2.2.10) y la
pectato-liasa (EC 4.2.2.2). Los números de EC
indicados se refieren a la nomenclatura de las enzimas conforme a
las Recommendations of the Nomenclature Committee of the
International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the
Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalysed
Reactions (Recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión
Internacional de Bioquímica y de Biología Molecular sobre la
Nomenclatura y Clasificación de Reacciones Catalizadas mediante
Enzimas (www. chem.qmul.ac-uk/iubmb/enzyme).El
documento EP 0 616 024 describe un procedimiento específico para la
producción de aceite de oliva a partir de frutos de olivo
deshuesados mediante la utilización de una celulasa.
Sin embargo, en este sentido los sistemas
descritos en la bibliografía no son óptimos, ya que sólo elevan de
manera relativamente reducida el rendimiento en aceite en la
producción del aceite de oliva. Además, falta una optimización
biotecnológica del proceso del procedimiento de la producción de
aceite, en especial en relación con las masas de aceitunas
previamente desaceitadas.
Por ello la misión de la invención consistió en
poner a disposición un procedimiento mejorado para la producción de
aceite bajo la utilización de una enzima, o de una mezcla de
enzimas, con cuya ayuda sea posible elevar de manera significativa
el rendimiento del proceso de la producción del aceite y además de
ello facilitar el proceso de la separación del aceite.
La misión se resuelve mediante el procedimiento
conforme a la reivindicación 1. En las reivindicaciones secundarias
se indican formas de realización ventajosas.
En primer lugar, se prepara una composición o
masa, de aceitunas o de componentes de aceituna. En este caso,
puede emplearse cualquier masa de aceitunas o de componentes de
aceituna usual para la persona experta, tratándose por lo general
de una masa de aceitunas o de componentes de aceitunas, previamente
trituradas. En este caso, en principio pueden encontrarse presentes
diversos componentes del fruto de olivo en proporciones arbitrarias.
Por lo general, en la práctica de la producción del aceite se trata
de una masa de aceitunas o de una pulpa de aceitunas, que contiene
las porciones de pericardio del fruto de olivo, es decir el
epicarpio y el mesocarpio. Se trata preferiblemente de una masa en
la que las aceitunas, o los componentes de las aceitunas, ya han
sido trituradas mediante procedimientos mecánicos tales como
molienda. Se ha descubierto de manera sorprendente que el
procedimiento conforme a la invención es especialmente adecuado y
eficiente para la producción de aceite a partir de masas de
aceitunas o de componentes de aceitunas, de las cuales no se han
retirado o separado los huesos. Por lo tanto, también se encuentran
contenidas porciones de endocarpio. Esto posibilita un procedimiento
simplificado, pudiéndose lograr un rendimiento y una calidad de
aceite muy buenos.
Por otra parte, puede tratarse de una masa de
antes o después del primer desaceitado (obtención de aceite). Sin
embargo, se ha demostrado de manera sorprendente que se obtienen
resultados especialmente buenos en el marco de la presente
invención, cuando en el caso de la masa se trata de una masa ya
previamente desaceitada, es decir, que ya ha tenido lugar por lo
menos el primer paso de producción del aceite. De acuerdo con una
forma de realización especialmente preferida conforme a la
invención, se emplea en este caso una pulpa de aceituna previamente
desaceitada, almacenada (que frecuentemente recibe también la
denominación de "orujo"), que no ha sido expuesta a un paso
adicional de separación en el que se separan huesos y pulpas, sino
que se expone directamente a otro paso de desaceitado.
A la masa de aceitunas y/o de componentes de
aceitunas, anteriormente mencionada, se añade una enzima o una
mezcla de enzimas que contiene al menos una pectina esterasa. La
adición puede tener lugar en una forma arbitraria, líquida o
sólida. Sin embargo, en virtud de la dosificabilidad se recomienda
la preparación de una solución de enzimas, es decir, de una mezcla
líquida de enzimas, antes de la adición a la masa de aceitunas o de
componentes de aceitunas. En este caso, es posible partir de una
solución madre concentrada de la mezcla de enzimas, que se
prediluye poco antes de la adición a la masa. La adición de enzimas
puede tener lugar en un momento arbitrario; sin embargo
preferentemente antes o durante un paso para el entremezclado y/o
triturado de la masa de aceitunas o de componentes de aceitunas.
Una adición especialmente preferida es la que tiene lugar en los
recipientes de mezclado con barras de agitación verticales u
horizontales.
En términos generales, el entremezclado de
la(s) enzima(s) y de la masa de aceitunas puede
efectuarse con todos los medios usuales y conocidos de la persona
experta (por ejemplo, mediante agitación), pudiendo también tener
lugar de manera simultánea una trituración (adicional) de las
aceitunas (de los componentes de las aceitunas), por ejemplo, en un
molino.
El tiempo y la temperatura de incubación óptimos
para cada caso individual, pueden ser determinados por la persona
experta de manera sencilla mediante ensayos de rutina. Por lo
general, las temperaturas entre 20 y 60ºC, preferentemente de
25-55ºC, en especial de 30-50ºC, y
preferentemente los tiempos de incubación entre 5 y 120 min,
preferentemente de 10-100 min, en especial de
30-90 min, conducirán a buenos resultados. Sin
embargo, también pueden ser convenientes duraciones esencialmente
más cortas o más prolongadas. También es eventualmente posible
prescindir por completo de una fase de incubación propia.
Seguidamente, y como ya se expuso en lo que
precede, debe separarse el aceite de la mezcla. La obtención del
aceite bajo separación de la fase de aceite puede tener lugar de
cualquier manera usual para la persona experta, remitiéndose
también, por ejemplo, a los procedimientos indicados en la
introducción de la presente memoria descriptiva. Se trata
preferentemente de un procedimiento mecánico-físico,
es decir, a diferencia del procedimiento
químico-extractivo, para la extracción del aceite no
se utiliza ningún agente disolvente como por ejemplo, hexano.
Dentro de los alcances de la invención se ha
descubierto ahora de manera sorprendente, que gracias al empleo
conforme a la invención de la enzima, o de la mezcla de enzimas que
contiene al menos una pectina esterasa, se posibilita una
producción de aceite especialmente eficiente mediante la utilización
de un decantador de tres fases.
En el denominado procedimiento de tres fases,
mediante el empleo de al menos un decantador de tres fases se
separa la masa introducida, por ejemplo, la pulpa de aceituna que
contiene aceite (en un paso de trabajo) en una fase líquida de
aceite, una fase acuosa (también denominada frecuentemente
"papilla") y una suspensión (de sólidos) parcialmente
desaceitada y parcialmente deshidratada (que muchas veces recibe
también la denominación de "alperujo"). Sin embargo, debido a
la limitada capacidad de separación del decantador de tres fases, se
encuentra convencionalmente una cantidad significativa de aceite en
la papilla. Este aceite se aísla habitualmente de la papilla, en un
paso posterior del proceso. Mediante el procedimiento conforme a la
invención, se eleva ahora inesperadamente la capacidad de
separación del decantador de tres fases, caso éste en que se eleva
en especial el rendimiento en aceite y es posible reducir
considerablemente la proporción de aceite en la papilla. De manera
sorprendente, con la ayuda del procedimiento conforme a la
invención, es posible lograr en la mayoría de los casos que sean
superfluos los pasos de proceso eventualmente subsiguientes para
aíslar el aceite de la papilla. Al respecto, los decantadores de
tres fases son conocidos como tales por la persona experta; pueden
utilizarse modelos cualesquiera.
Según otro aspecto de la presente invención, se
ha descubierto que no solamente en el procedimiento de tres fases,
antes descrito, sino también en la utilización de otros
procedimientos físicos, o mecánico-físicos, en
especial del denominado procedimiento de dos fases, es decir, en el
cual gracias al empleo de decantadores de dos fases la pulpa de
aceite se separa en una suspensión de fuerte contenido de sólidos
(que también recibe la denominación de "alperujo") y en una
emulsión agua/aceite, y se obtiene el aceite por centrifugación a
partir de esta emulsión, mediante el empleo conforme a la invención
de enzimas, puede hacerse superfluo la interposición de amasadoras,
es decir, los piletones de agitación usuales para la persona experta
provistos de barras de agitación horizontales, y/o de piletones de
agitación, también usuales para la persona experta, con barras de
agitación verticales. De una manera especialmente preferida,
conforme a la invención, es posible omitir las amasadoras en el
procedimiento. En este caso es evidente, sin que por ello la
invención se limite a la exactitud de esta suposición, que tiene
lugar un mejoramiento de la coalescencia debido a las enzimas
solamente. Gracias a la posibilidad de omitir las amasadoras, es
posible incrementar considerablemente la rentabilidad económica del
proceso.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se ha descubierto que las ventajas, descritas en la
presente, del procedimiento para la producción del aceite son
especialmente grandes cuando la mezcla de enzimas presenta una
determinada composición. Así, se ha descubierto de manera
sorprendente que para una relación entre la actividad de
la(s) pectina esterasa(s) y la actividad de
la(s) endo-poligalacturonasas(s) de al menos
0,13, se obtienen propiedades especialmente ventajosas en la
producción de aceite. Además, se ha descubierto de manera
inesperada que una relación entre la actividad de la(s)
pectina esterasa(s) y la actividad de la(s)
exo-poligalacturonasa(s), de al menos 0,3, es
especialmente favorable. Si se respetan estas relaciones, los
efectos positivos sobre la liberación del aceite de la masa de
aceitunas o de componentes de aceitunas, y sobre la liberación y
separación de la proporción acuosa (de la fase acuosa) en el proceso
de la producción del aceite, son especialmente marcados. En su
conjunto, es posible incrementar de manera sorprendente el
rendimiento en aceite.
Conforme a la invención, por una pectina
esterasa (PEasa) se entiende una enzima del Grupo de Clasificación
EC 3.1.1.11. En principio, es posible determinar la actividad de
esta enzima mediante métodos estándar usuales para la persona
experta. En el siguiente capítulo, relacionado con los métodos, se
indica un método utilizado conforme a la invención. Por lo tanto,
la mezcla de enzimas empleada conforme a la invención contiene al
menos una (actividad de) PEasa.
Por una endo-poligalacturonasa
(endo-PGasa, endo-pectinasa) se entiende conforme a la
invención una enzima del Grupo de Clasificación EC 3.2.1.15. En
principio, la actividad de esta enzima puede determinarse con la
ayuda de los métodos estándar usuales para la persona experta. El
método empleado conforme a la invención se indica en el siguiente
capítulo, relacionado con los métodos (ácido pectínico (PGA) como
substrato). Por consiguiente, la mezcla de enzimas empleada
conforme a la invención contiene al menos una (actividad de)
endo-PGasa.
Conforme a una forma de realización
especialmente ventajosa, la relación entre la pectina esterasa
(PEasa) y la actividad de la endo-poligalacturonasa, es de al
menos 0,15, preferentemente de al menos 0,16.
La mezcla de enzimas empleada conforme a la
invención contiene además al menos una exo-poligalacturonasa
(exo-PGasa, exo-pectinasa), siendo la relación entre
la actividad de la(s) pectina esterasa(s) y la
actividad de las exo-poligalacturonasa(s), al menos
igual a 0,3. Se prefiere especialmente una relación entre las
actividades, de al menos 0,33. Conforme a la invención, por
exo-PGasa se entiende una enzima del Grupo de Clasificación
EC 3.2.1.67. En principio, es posible determinar la actividad de
esta enzima con ayuda de los métodos estándar usuales para la
persona experta. En el siguiente capítulo, relacionado con los
métodos, se indica un método empleado conforme a la
invención.
invención.
Se supone, sin que la invención se limite a este
mecanismo teórico, que debido a la proporción de pectina esterasa,
relativamente elevada, en especial en el caso de una presencia
simultánea de endo- y exo-PGasa(s), se logra
un desintegración especialmente eficiente de las estructuras
polisacáridas de elevado peso molecular, en las cuales se halla
"incluido" el aceite a producir. También se supone que gracias
a las pectina esterasas se mejora la accesibilidad a los substratos
de endo- y exo-PGasas como también de otras enzimas
que desdoblan polisacáridos. Por ello es manifiestamente también
posible acelerar la descomposición de estructuras de elevado peso
molecular, con los cuales está asociado el aceite a producir. Por
definición, la exo-PGasa cataliza la liberación de monómeros
D-galactouronato a partir de polímeros
1,4-alfa-D-galacturónicos
por desdoblamiento de enlaces O-glicósidos en
posición extrema. Si se emplea pectina como substrato, será
necesario, lo mismo que en el caso de la endo-PGasa, que los
eventuales ésteres de ácido metílico de los ácidos
poligalacturónicos se conviertan en primer término en el ácido
libre, o en la sal del mismo, para que se encuentren a disposición
como substrato para la exo-PGasa. En este contexto, el ajuste
de la relación (mínima) conforme a la invención entre pectina
esterasa y exo-PGasa es de manera evidente, especialmente
ventajoso. El desdoblamiento de los ésteres de ácido por las
pectina esterasas a lo largo de la cadena de polisacáridos tiene
lugar de manera por demás estadística. De esta manera, en el primer
paso, la cadena se vuelve accesible como substrato para la PGasa, y
el substrato divide seguidamente la cadena en oligosacáridos. Es
posible que en este caso la exo-PGasa ya lleve a cabo un
desdoblamiento en posición terminal, pero solamente hasta que se
encuentre nuevamente con un éster de ácido metílico en la cadena.
Entonces, una nueva descomposición en posición terminal de la cadena
podría tener lugar solamente si este éster de ácido metílico se
transforma en el ácido. La relación mínima, conforme a la
invención, entre PEasa y endo-PGasa puede proporcionar que el
desdoblamiento estadístico de los ésteres de ácido metílico por la
PEasa se sintonice con la actividad de exo-PGasa, de modo tal
que el mismo puede trabajar con una eficiencia especialmente
elevada sin que se presente una restricción de la conversión debida
a ésteres metílicos bloqueantes. Es también posible imaginar otras
interacciones favorables entre las actividades enzimáticas
anteriormente
mencionadas.
mencionadas.
Se prefiere especialmente que la relación entre
la actividad de la pectina esterasa y la actividad de la
endo-poligalacturonasa no sea mayor que aproximadamente 1,
en especial no mayor que aproximadamente 0,5, y que la relación
entre la actividad de la pectina esterasa y la actividad de la
exo-poligalacturonasa no sea mayor que aproximadamente 1, en
especial no mayor que aproximadamente 0,6.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida, la mezcla de enzimas empleada contiene además al menos
una laminarinasa
(\beta-1,3-glucanasa). Conforme a
la invención, por laminarinasa se entiende una enzima del Grupo de
Clasificación EC 3.2.1.39. En principio, es posible determinar la
actividad de esta enzima mediante los métodos estándar usuales para
la persona experta. En el siguiente capítulo de los métodos se
indica un método empleado conforme a la invención. Es preferible
que la relación entre la actividad de la pectinerasa y la actividad
de la laminarinasa sea al menos 20, preferentemente al menos 30.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida conforme a la invención, la mezcla de enzimas empleada
contiene además al menos una celulasa, en especial una celulasa C1.
Por celulasa C1 se entiende conforme a la invención una enzima del
Grupo de Clasificación EC 3.2.1.91. En principio, es posible
determinar la actividad de esta enzima mediante los métodos
estándar usuales para la persona experta. En el siguiente capítulo
de los métodos se indica un método empleado conforme a la
invención. Es especialmente preferible que la relación entre la
actividad de la PEasa y la actividad de la celulasa C1 sea de al
menos 20, preferentemente de al menos 30.
Conforme a una forma de realización
especialmente preferida, la mezcla de enzimas abarca por ello al
menos seis actividades individuales distintas, teniendo las
relaciones preferidas de las actividades individuales de manera
sorprendente un efecto positivo sobre el rendimiento en aceite
obtenido y sobre la separabilidad de las fases. A continuación se
da nuevamente una lista de las actividades enzimáticas
preferentemente contenidas:
| Exo-poligalacturonasa | (EC 3.2.1.67) |
| Endo-poligalacturonasa | (EC 3.2.1.15) |
| Pectina liasa | (EC 4.2.2.10) |
| Pectina esterasa | (EC 3.1.1.11) |
| Celulasa-C1 | (EC 3.2.1.91) |
| Laminarinasa | (EC 3.2.1.39) |
Sin embargo, puede haber también otros
componentes contenidos en la mezcla de enzimas conforme a la
invención. En relación a los componentes enzimáticos de la mezcla
de enzimas puede haber por ejemplo otras enzimas contenidas que
degradan las estructuras de las células, o las estructuras de las
paredes celulares, como por ejemplo, pero no a título limitativo,
las xilanasa(s) (EC 3.2.1.8), o también las enzimas
proteolíticas (cfr. la introducción a la memoria descriptiva y el
listado de enzimas de la capítulo de los métodos; de acuerdo con una
forma de realización conforme a la invención, no contenidas en la
mezcla de enzimas). Tampoco se excluyen otros componentes en la
mezcla de la masa de aceitunas y de la mezcla de enzimas. Tales
aditivos son usuales para la persona experta en la especialidad, y
abarcan por ejemplo sales, cofactores, inhibidores o activadores
para enzimas, agentes de estabilización como
glicerina, etc.
glicerina, etc.
Como ya se mencionó, la mezcla de enzimas
utilizadas conformes a la invención es especialmente ventajosa para
la elevación del rendimiento en la obtención de aceite de oliva a
partir de frutos de olivo o de sus partes componentes, en especial
en los procesos de producción mecánico-físicos.
\newpage
Conforme a la invención, se prefieren
especialmente las siguientes actividades de enzima, que pueden
determinarse como se indica en el siguiente capítulo de métodos:
- a.-
- pectina esterasa: más de 300 U/ml, en especial, más de 320 U/ml
- b.-
- exo-poligalacturonasa: menos de 1.000 U/ml
- c.-
- endo-poligalacturonasa: entre 1.500 y 2.500 U/ml
- d.-
- laminarinasa: menos de 15 U/ml, en especial, menos de 12 U/ml
- e.-
- celulasa-C1: menos de 3,3 U/ml
- f.-
- pectina liasa: entre aproximadamente 25.000 y 150.000 U/ml.
Las enzimas individuales pueden obtenerse en el
comercio (por ejemplo, las provistas por la Firma
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Alemania). A
continuación, antes del capítulo de los métodos, se indican a título
de ejemplo, fuentes de enzimas. Sin embargo, es por supuesto
también posible emplear enzimas procedentes de otras fuentes, con
la condición de que presenten la actividad indicada en lo que
antecede. Conforme a una forma de realización preferida, las
enzimas se obtienen a partir de cultivos, o del material
sobrenadante de cultivos de microorganismos, en especial de
bacterias y hongos, levaduras incluidas. Una fuente preferida
consiste en cultivos de Aspergillus, en especial de cepas de
Aspergillus Níger, que presentan varias de las actividades
de enzimas contenidas en la mezcla de enzimas conforme a la
invención, o aún la totalidad de dichas actividades.
Referido a la masa de aceitunas o de partes
componentes de aceitunas, se emplean conforme a la invención de
manera especialmente preferida al menos 50 ml, en especial, entre
aproximadamente 50 y 400 ml, preferentemente entre 100 y 300 ml; de
manera especialmente preferida, entre 125 y 250 ml de la mezcla de
enzimas anteriormente mencionada, por tonelada de masa. En muchos
casos, son preferentemente ventajosas entre 100 y 175 ml, en
especial entre 125 y 150 ml, de la mezcla de enzimas anteriormente
descrita, por tonelada de masa. En la presente memoria
descriptiva,
la expresión "mezcla de enzimas" también debería emplearse en el caso del uso de una sola enzima (PEasa).
la expresión "mezcla de enzimas" también debería emplearse en el caso del uso de una sola enzima (PEasa).
En este caso, es preferible que la concentración
de proteínas o de enzimas en la mezcla de enzimas empleada sea de
aproximadamente 2 a 20 mg/l, preferentemente entre 2 y 12 mg/ml, en
especial entre 3 y 10 mg/l. Es posible determinar la concentración
de proteínas con la ayuda de procedimientos estándar, por ejemplo,
mediante fotometría. A partir de esto es posible calcular de manera
sencilla las actividades conjuntas absolutas preferidas de las
enzimas individuales contenidas, por tonelada de masa de aceitunas o
de partes componentes de aceitunas.
De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención se refiere a la utilización de una mezcla de enzimas como
antes definida, para el tratamiento de masas de aceitunas o de
componentes de aceitunas, en especial de masas desaceitadas en la
producción de aceite. De manera sorprendente, ha resultado ser
especialmente ventajosa la utilización en el caso de la producción
física o mecánica del aceite. Como se señaló inicialmente, es
posible obtener aceites de elevada calidad con estos
procedimientos, por lo que el rendimiento en aceite, incrementado
conforme a la presente invención, se presenta como especialmente
productivo.
En el siguiente método para la determinación de
la actividad de la endo-PGasa, es también posible emplear
como substrato, pectina en lugar de ácido pectínico (PGA). De esta
manera es posible determinar una actividad total de la enzima que
degrada la pectina. En este caso, en el marco de una forma de
realización alternativa de la presente invención, se ha comprobado
que se presentan propiedades especialmente ventajosas en la
producción de aceite, cuando en la mezcla de enzimas aplicada la
relación entre la PEasa y la actividad total, determinada como
antes descrito, de la enzima que degrada la pectina, presente en la
mezcla de enzimas, es de al menos 0,035, preferentemente de al
menos 0,04, en especial, de al menos 0,05. Conforme a una forma de
realización alternativa, por ello la presente invención se refiere
también a una composición que contiene una masa de aceitunas o de
componentes de aceitunas y una mezcla de enzimas, en donde la
relación entre la PEasa y la actividad total, determinada como
antes descrito, de la enzima que degrada la pectina, presente en la
mezcla de enzimas, es de al menos 0,035, preferentemente de al
menos 0,04, en especial, de 0,05.
En este caso, la actividad conjunta de la enzima
que degrada la pectina, tiene preferentemente un valor inferior a
8.000 U/ml, en especial, inferior a 7.000 U/ml. Los valores de la
actividad de las otras enzimas son como se indicó anteriormente.
También las relaciones entre las actividades de la PEasa y de la
exo-PGasa, de la PEasa y de la laminarinasa, y de la PEasa y
de la celulosa C1, son preferentemente como se indicó en lo que
precede. Pueden aplicarse las mismas cantidades de mezcla de enzimas
como antes descrito.
Otro aspecto conforme a la invención, es el que
se refiere a la utilización de una mezcla de enzimas como
anteriormente se expuso en uno de los procedimientos descritos en la
presente para el tratamiento de masas de aceitunas o de componentes
de aceitunas, o en un procedimiento para la producción de aceite. En
este caso, conforme a una forma de realización de la invención, es
posible mejorar la separación de sólidos/líquidos durante la
producción de aceite. Aquí, una utilización preferida es la que se
refiere al desaceitado de una masa, previamente desaceitada, de
aceitunas o de componentes de aceitunas.
Conforme a una forma de realización
especialmente preferida, la separación de sólidos/líquidos tiene
exclusivamente lugar con ayuda de al menos un decantador de tres
fases.
De acuerdo con otro aspecto de utilización de la
presente invención, se eleva el rendimiento en aceite durante la
separación de sólidos/líquidos, se reduce el contenido en aceite del
desagüe acuoso desde el decantador de tres fases, se eleva la
cantidad de agua separada en el desagüe acuoso, y/o se reduce el
contenido de aceite y/o de agua de la fase sólida obtenida con la
ayuda del decantador de tres fases.
Conforme a otro aspecto de utilización de la
presente invención, se hace posible reducir la temperatura del
proceso durante la producción de aceite, manteniendose al menos
igual el rendimiento en aceite.
En el proceso de la producción del aceite de
oliva también existe el empeño de producir la máxima cantidad
posible de aceite de alta calidad, para poder obtener de esta manera
un precio lo más elevado posible en el mercado. En el sistema de
producción aplicado existe en primera aproximación una correlación
entre cantidad de aceite y calidad: si se opera un instalación con
una eficiencia de separación la más elevada posible, es decir, si
se optimiza la cantidad de aceite, se reduce la calidad, e
inversamente. Mediante la utilización de la mezcla de enzimas
conforme a la invención es posible lograr de manera sorprendente un
aceite de gran calidad junto con un elevado rendimiento.
Uno de los parámetros que define la calidad de
un aceite, es por ejemplo el contenido de ácido. Los productores de
aceite se esfuerzan en mantener el mismo lo más bajo posible.
Además, cabe observar, como descrito arriba, que si bien mediante
un centrifugación enérgica se eleva el rendimiento en aceite, de
esta manera también ingresan productos secundarios indeseados en el
aceite. Estos productos secundarios se depositan lentamente en
forma de sedimentos. Puede darse por cierto que los productores de
aceite se empeñan en mantener el volumen de este sedimento lo más
pequeño posible, la textura lo más uniforme posible, y los colores
los más neutros posibles. Con la ayuda de la presente invención se
influye de manera positiva sobre los parámetros mencionados.
Por lo tanto, conforme a otro aspecto, la
presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de
enzimas como definida en la presente en el procedimiento conforme a
la invención descrito en la presente, para la mejora de la calidad
del aceite obtenido, en especial la reducción del contenido de
ácidos, la reducción de la concentración de dienos o trienos
conjugados, la reducción de sustancias peroxídicas, la reducción de
esteroles o de ceras y/o la reducción del contenido de ácidos grasos
libres en el aceite obtenido. Otra utilización preferida se
caracteriza porque debido al tratamiento con la composición de
enzimas conforme a la invención, no tiene lugar ninguna influencia
negativa sobre el contenido de colesterol, brassicaesterol,
estigmaesterol, \Delta-estigmaesterol y
trilinoleína.
- a. EC 3.2.1.15
- endo-PGasa, por ejemplo, la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo- Nº P4716, de A. Níger
- b. EC 3.2.1.67
- exo-PGasa (Kobayashi, T., Higaki, N. , Yajima, N., Suzumatsu, A., Hagibara, H., Kawai, H., e Ito, S. (2001), Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, Págs. 842-848) o de ASA Spezialenzyme GmBH, Wolfenbüttel, Alemania, en forma de soluciones de enzimas que contienen exo-PGasa.
- c. EC 3.1.1.11
- pectina esterasas, por ejemplo, de la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo - Nº 5400, a partir de cáscaras de naranja.
- d. EC 3.4.23.1
- pepsina, por ejemplo de la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo Nº P7012, a partir de mucosa gástrica de cerdo
- e. EC 3.4.22.2
- papaína, por ejemplo, de la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo Nº P4762, a partir de papaya
- f. EC 3.2.1.4
- celulasa, por ejemplo de la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo Nº C1184, a partir de A. niger
- g. EC 3.2.1.1
- \alpha-amilasa, por ejemplo de la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo Nº A6211, a partir de A. oryzae
- h. EC 3.4.2x.yz
- proteasas, por ejemplo pepsina y papaína, arriba mencionadas
- i. EC 3.2.1.21
- \beta-glucosidasa, por ejemplo de la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo Nº G6906, recombinante
- j. EC 3.2.1. 22
- \alpha-galactosidasa, por ejemplo de la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo Nº G4408, a partir de A. Níger
- k. EC 3.2.1.23
- \beta-galactosidasa, por ejemplo de la Firma Sigma-Aldrich, Catalogo Nº G3522, a partir de A. niger
- l. EC 3.2.1.55
- \alpha-arabinosidasa
- m. EC 3.2.1.24
- \alpha-mannosidasa, por ejemplo, de la Firma Sigma, Catálogo Nº M7257, a partir de habas
- n. EC 3.2.1.37
- \beta-xilosidasa, por ejemplo, de la Firma Sigma, catálogo Nº X3501, a partir de A. Níger
- o. EC 3.2.1.52
- \beta-N-acetilglucosaminidasa, por ejemplo, de la Firma Sigma, Catálogo Nº A2264, a partir de habas.
- p. EC 4.2.2.10
- pectina-liasa, por ejemplo, de la Firma Sigma, Catálogo Nº PP7052, a partir de A. niger
- q. EC 3.2.1.6
- laminarinasa, por ejemplo, de la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo Nº L5272, a partir de Trichoderma spec.
- r. EC 3.2.1.8
- xilanasa, por ejemplo, de la Firma Sigma-Aldrich, Catálogo N` X3876, de Trichoderma veride
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se indique otra cosa, dentro del
marco de la invención se determinan las actividades de las enzimas
de acuerdo con los procedimientos indicados en el siguiente Capítulo
de Métodos.
(Medición del azúcar
reductor)
\vskip1.000000\baselineskip
La exo-poligalacturonasa
(exo-PGasa) se desdobla a partir de unidades ácido
galacturónico de pectina de citrus saponificadas, que debido a los
grupos aldehído reductores pudieron detectarse por fotometría
después de la reaccion con ácido
3,5-dinitrosalicílico (DNSS).
Al calentarse ácido
3,5-dinitrosalicílico (DNSS) con azúcares reductores
en medio alcalino, se forma ácido
3-amino-5-nitro-salicílico
(Ecuación 1). En este caso se reduce un grupo nitro en forma de
grupo amino, mientras que el grupo aldehído del monosacárido se
oxida en forma de grupo carboxilo (Kakác y Vejdelek, 1974).
Diferentes azúcares dan como resultado diversas
coloraciones cuya absorción máxima se encuentra entre 500 y 550 nm.
De esta manera, con este ensayo es también posible detectar mono-,
di-, oligo- y polisacáridos así como metilpentosas y
O-metilsacáridos.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivo DNSS-fenol:
- Solución A:
Introducir por pesada 38,55 g de tartrato de K y
Na en una copa de vidrio de 200 ml, y disolver en 125 ml de agua
destilada; en la solución se disuelven 2,425 g de NaOH
(galleta).
- Solución B:
Disolver 1,325 g de ácido
3,5-dinitrosalicílico (C_{7}H_{4}N_{2}O_{7};
ácido
2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico)
en una botella de rosca marrón, en 125 ml de agua destilada.
- Solución C:
Disolver 1,05 g de fenol en 12,5 ml de agua
destilada. Añadir consecutivamente 0,25 g de NaOH (galleta) y 1,05 g
de Na_{2}SO_{4}, y disolver bajo agitación.
- Solución de Uso:
La solución A y la solución B se vierten (sin
enjuague ulterior) en la solución C, y se homogeneiza durante 10
min. Dejar la solución en reposo durante al menos una noche antes
del uso, y conservar siempre en la oscuridad.
- Solución del substrato:
Solución de pectina de citrus saponificada al
2,2% en citrato de Na 0,1 M, pH 4,4; método de saponificación:
protocolo según Boehringer Ingelheim, Pág. 3.
- Solución estándar:
12,0 g/l de ácido galacturónico (GA) en agua
destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras:
Mezclar 0,9 ml de solución de substrato con 0,1
ml de solución de enzimas, someter a incubación a 30ºC durante 30
min, y a continuación colocar de inmediato en el baño de hielo.
Añadir 2,0 ml de reactivo DNSS-fenol y hervir
durante 5 min. Enfriar la mezcla durante 5 min en el baño de hielo,
y medir la extinción a temperatura ambiente y a 492 nm.
Valores por defecto:
Mezclar 0,9 ml de solución de substrato con 0,1
ml de agua, añadir 2,0 ml de reactivo DNSS-fenol, y
hervir durante 5 min. Enfriar la mezcla durante 5 min en el baño de
hielo, y medir la extinción a temperatura ambiente y a 492 nm.
Estándar:
Mezclar 1,0 ml de solución estándar diluida con
2,0 ml de reactivo DNSS-fenol y hervir durante 5
min. Enfriar la mezcla durante 5 min en el baño de hielo, y medir la
extinción a temperatura ambiente y a 492 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Diluciones de la solución estándar para el
trazado de las rectas de calibración:
| C (GA) en g/l | Solución estándar en \mul | Agua destilada en \mul |
| 0,6 | 50 | 950 |
| 1,2 | 100 | 900 |
| 1,8 | 150 | 850 |
| 3,0 | 250 | 750 |
| 4,5 | 375 | 625 |
| 6,0 | 500 | 500 |
Actividad de
exo-PGasa [U/ml] = \frac{\Delta c(GA)}{M(GA)}
\cdot \frac{V_{solución \ reactiva}}{V_{enzimas} \cdot
t_{reacción}} \cdot Diluc
\cdot
M(GA) = 194 g/mol
T_{reacción} = 30 min
\vskip1.000000\baselineskip
Se ajusta a 35ºC una botella de 250 ml en un
baño de agua, y en la misma se instala un agitador con motor de
agitación. En esto, 2,2 g de pectina de citrus, esterificado en más
de 80% (provisto por Herbstreith und Fox KG, Pektin Classic CF 201,
00302026 de 30.04.03) se humedecen con 4 ml de alcohol puro bajo
agitación lenta. Bajo un movimiento de agitación más intensivo,
sobre esto se vierten 50 ml de agua destilada en el medio del
remolino de agitación, y se continúa la agitación durante otros 20
min. Cabe tener presente que en este caso debe formarse una
solución viscosa lisa sin grumos. Seguidamente, y tomándose nota del
tiempo para la saponificación, mediante un embudo de goteo se añade
rápidamente gota a gota 20 ml de una lejía de sosa 0,5 N en un
intervalo de 5 minutos. Después de un tiempo total de saponificación
de exactamente 6 min a 35ºC bajo agitación constante, se detiene la
reaccion mediante la adición de ácido cítrico al 10% desde una
pipeta de varilla. Mediante la adición de 3 ml de solución de ácido
cítrico se ajusta el pH a 4,4. No puede corregirse posteriormente el
valor del pH mediante la adición posterior de lejía.
A continuación se transfiere el contenido de la
copa de vidrio bajo enjuague con solución tampón, a una probeta
graduada de 100 ml. Después de haber enfriado la solución a 20ºC, se
completa el volumen con tampón citrato pH 4,4, hasta obtener un
volumen total de 100 ml. Antes del uso se filtra la solución
terminada de ácido pectínico sobre lana de vidrio.
\vskip1.000000\baselineskip
Una unidad específica de endo-PGasa
corresponde al valor recíproco, multiplicado con 100 ml, de la
cantidad de enzimas en g, que en 30 min reduce la viscosidad (-
equivalente en agua) de 1 litro de una solución de ácido pectínico
al 2,2% *) en 3/5; (referida a una viscosidad relativa de 0,4), a
30ºC y para un pH óptimo de 4,4.
*) Ácido pectínico puro
Fluka AG, Chemische Fabrik,
CH-9470 Buchs SG
\vskip1.000000\baselineskip
Medición de la degradación de la viscosidad de
la solución fermentada de ácido pectínico de Fluka en el
viscosímetro de Ostwald.
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- viscosímetro según Ostwald 30 ml; valor de agua aproximadamente 40 seg en baño a 30ºC.
- b)
- termostato-Ultra con baño de agua y dispositivos de suspensión para tubos de ensayo
- c)
- baño de agua con termostato de suspensión
- d)
- motor de agitación con agitador de paletas
- e)
- copas de vidrio de 600 y 800 ml
- f)
- matraces graduados de 100 y 500 ml
- g)
- pipetas graduadas de 3, 20 y 30 ml
- h)
- tubos de ensayo, de 18 x 180 mm
- i)
- botella de succión, frita de vidrio con manguito de goma y lana de vidrio, probeta graduada de 100 y 250 ml
- j)
- cronómetros, división 0,1 seg.
- k)
- aparato de pH y electrodo de vidrio, y
- l)
- agitador magnético con varillas
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- ácido pectínico puro (Fluka AG, Chem. Fabrik, Buchs, SG)
- -
- ácido cítrico monohidratado, DAB 6
- -
- lejía de sosa 1N, 0,5 N, 0,1 N
- -
- ácido clorhídrico 0,1 N
- -
- Alcohol absoluto p.A.
\vskip1.000000\baselineskip
a) solución de tampón citrato pH 4,4 (0,1
molar)
Solución de base:
Disolver 21,01 g de ácido cítrico monohidratado
en un matraz graduado de 1 litro, en aproximadamente 100 ml de agua
destilada.
A esto añadir mediante pipeta 200 ml de lejía de
sosa 1 N y mezclar bien, completar hasta la marca de graduación
Utilización de la solución:
De la solución de base se introducen
aproximadamente 350 ml en una copa de vidrio de 800 ml, y se sumerge
un electrodo de vidrio con un aparato de pH acoplado. Bajo
agitación (agitador magnético) se añade ahora lentamente ácido
clorhídrico 0,1 N hasta lograr pH = 4,4.
\vskip1.000000\baselineskip
b) solución de ácido pectínico (al 2,2%)
Se colocan 11 g de ácido pectínico en una copa
de vidrio de 600 ml (forma plana), y se mezcla con 20 ml de alcohol
(etanol p.A.). Se deja hinchar durante 30 minutos. Seguidamente se
fija la copa de vidrio en un baño de agua con termostato de
suspensión regulado a 35ºC, y sobre esto se instala un motor de
agitación con agitador de paletas de modo tal que el agitador de
paletas quede colgado lo más cerca posible arriba del fondo de la
copa de vidrio.
Bajo un fuerte movimiento de agitación se
vierten 240 ml de agua destilada en la copa de vidrio, y
seguidamente se continúa la agitación durante exactamente 20 min,
manteniendose una velocidad de agitación constante y fuerte.
Cabe tener presente que ha de formarse una
solución viscosa lisa sin grumos. Seguidamente se ajusta el valor
del pH de la solución con lejía de sosa (primero 0,5 N y después 0,1
N) a exactamente pH = 4,4 (medidor de pH).No se debe sobretitular,
¡ya que con valores de pH superiores a pH = 4,4 se forman grumos por
formación de gel! Después del ajuste del pH se transfiere el
contenido de la copa de vidrio bajo un buen lavado final con la
solución tampón de citrato pH 4,4, a un matraz graduado de 500 ml, y
después de enfriamiento a 20ºC se completa con tampón citrato hasta
la marca.
Antes de la utilización se filtra la solución de
ácido pectínico terminada, sobre lana de vidrio.
\vskip1.000000\baselineskip
De la solución de ácido pectínico recién
preparada se introducen mediante pipeta volumétrica, en función de
la cantidad de muestras de enzima, cada vez 30 ml en copas de
vidrio, y antes de la fermentación en el termostato Ultra para
tubos de ensayo regulado a 30ºC - se calienta durante
aproximadamente 5 min a 30ºC. La adición del fermento de en cada
caso 3 ml (vaciar por soplado la pipeta volumétrica) a la solución
de 30 ml de ácido pectínico templado tiene lugar registrándose los
tiempos por opresión de un cronometro. En el caso de haber varias
muestras de enzimas se añaden las soluciones de enzima
correspondientes a intervalos de en cada caso 4 min. Después de un
tiempo de fermentación de al menos de 30 min a 30ºC, se retira la
muestra de reaccion del baño de agua y con la misma se llena el
viscosímetro de Ostwald, también templado a 30ºC. La solución en el
viscosímetro se eleva inmediatamente por succión, específicamente de
manera tal que en la salida del líquido pasa por la marca superior
exactamente a los 30 min después del inicio de la fermentación. El
tiempo de pasada entre las marcas de graduación se toma con un
segundo cronometro, y se registra como viscosidad final. En este
caso, si hay varias muestras de fermentación, también debe
respetarse exactamente la separación de en cada caso 4 min entre
cada una de las mediciones.
La viscosidad inicial se determina en el mismo
viscosímetro, midiéndose el tiempo de pasada de 30 ml de solución
de ácido pectínico a 30ºC, pero añadiéndose ahora, en lugar de
solución de fermento, 3 ml de solución tampón citrato pH 4,4. Debe
determinarse la viscosidad inicial inmediatamente antes de la
viscosidad final. Si se investiga una serie completa de muestras de
enzimas, se determina la viscosidad inicial antes y después de la
serie de medición, adoptándose el valor promedio.
| Medición en el mismo viscosímetro | |
| Valor equivalente en agua | |
| Tiempo de pasada de agua destilada | \rightarrow W |
| Viscosidad inicial | |
| Tiempo de pasada de la solución de ácido pectínico + 3 ml de tampón pH 4,4 | \rightarrow A |
| Viscosidad final | |
| Tiempo de pasada de la solución fermentada | \rightarrow E |
La viscosidad relativa de la solución fermentada
corresponde a la relación entre la viscosidad final (valor
equivalente en agua) y la viscosidad inicial (-valor equivalente en
agua).
Viscosidad
relativa = \frac{E - W}{A -
W}
El valor de la viscosidad relativa debería estar
entre 0,36 y 0,45. De no cumplirse este requisito, debe repetirse
la medición con una cantidad aplicada de enzima,
correspondientemente modificada. Para la determinación de la nueva
pasada puede emprenderse una valoración de la actividad con ayuda de
la "curva de calibración sobre un amplio intervalo", y
aplicarse las unidades así calculadas como valor normativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad de la
endo-poligalacturonasa [U/ml] = \frac{k \cdot x \cdot V_{T}
\cdot x \cdot
V_{F}}{V_{E}}
k = 1.100; valor de curva de la
curva de calibración bajo una viscosidad relativa de 0,40 (obtenida
con una enzima
estándar)
V_{T} = volumen de ensayo
V_{F} = factor de dilución
V_{E} = volumen de la solución de enzima
[ml]
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de la viscosidad se lleva a cabo con
diversas concentraciones de una enzima estándar (Panzym Combi
285/12, Boehringer Ingelheim). La concentración de la enzima, que
conduce a una viscosidad relativa de 0,40, se iguala con el valor de
curva 1.100.
De acuerdo con la forma de realización
alternativa de la invención, en el protocolo precedente, en lugar de
ácido pectínico (PGA) se empleó pectina de manzana (Sigma, Nº de
Catálogo: P8471). Esto permite una determinación paralela de la
viscosidad de las siguientes actividades de enzimas: pectina
esterasa, pectina liasa, endo- y exo-
poligalacturonasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante el desdoblamiento de la pectina por la
pectina liasa, se forma un enlace doble entre los átomos C -4 y
C-5 de la extremidad no reductora, recién formada,
de la cadena. El enlace doble conduce a una absorción de la luz a
235 mm. La velocidad, con la cual aumenta la extinción, sirve como
medida de la actividad de la liasa.
\vskip1.000000\baselineskip
0,41 g de pectina de manzana B (pectina de
citrus, de Herbstreith & Fox KG Nº 00302026 del 30.04.03) se
disuelven sobre 100 ml con tampón citrato 0,1 n, pH 5,0, y se filtra
(por ejemplo, a través de un filtro de vidrio G2).
\vskip1.000000\baselineskip
En la cubeta con un espesor de capa de 1 cm se
aplican mediante pipeta 2,9 ml de solución de substrato (templada a
30ºC) y 0,1 ml de dilución de enzima a 30ºC y a 235 nm. Se mide el
incremento de extinción a lo largo del tiempo en comparación con
una muestra de cero de 2,9 ml de substrato y 0,1 ml de dilución de
enzima previamente desactivada mediante calor.
En el inicio de la reaccion, el incremento de la
extinción debería estar en el intervalo de entre 0,005 y 0,05 por
minuto; en caso contrario, deberá repetirse la medición con una
enzima diluida en mayor o menor grado.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de la liasa resulta de los valores
de incremento medidos de la extinción por minuto (\DeltaExt.), al
inicio de la reaccion:
Actividad de la
pectina liasa en U/ml = \frac{\Delta Ext \cdot x \cdot 1 . 000
\cdot x \cdot 30 \cdot x \cdot
V_{F}}{5,5}
V_{F} = factor de dilución
\vskip1.000000\baselineskip
Una unidad específica de pectina esterasa
(PEasa-E) corresponde a la cantidad de enzima en g,
que en un minuto desdobla a 30ºC y con el pH óptimo de 4,4, un
microequivalente de grupos éster metílico en una solución de pectina
que contiene 550 mg de pectina de citrus altamente esterificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Titulación alcalimétrica de la solución de
pectina durante el proceso de enzimación a 30ºC y manteniendose
constante el valor de pH de 4,4 con una lejía de sosa 0,02 N. Los
primeros 5 minutos después de la adición de la enzima a la solución
de pectina, sirven para el ajuste del valor teórico del pH. La
titulación propiamente dicha de aproximadamente 20 minutos empieza
después de este tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- aparato de pH con electrodo de vidrio y equipo de titulación
- b)
- baño de agua con termostato de suspensión
- c)
- motor de agitación con agitador de paletas…
- d)
- dos microburetas de 10 ml, automáticos
- e)
- matraces graduados de 100 ml, de 1 litro
- f)
- pipetas volumétricas de 10 ml, de 100 ml
- g)
- copas de vidrio de 200 ml, de 1 litro
- h)
- cronómetro
- i)
- frasco de aspiración, de 1 litro; frita de vidrio con manguito de goma
- j)
- lana de vidrio o vellón de filtro de vidrio Microlith de tipo OR 80 N (Vidriería Schuller, Westheim)
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- pectina seca de citrus, esterificada en aproximadamente 74% (Pemosin, Frankfurtt/M)
- -
- lejía de sosa 0,1 N, Tritisol
\vskip1.000000\baselineskip
a) lejía de sosa 0,01 N
2 x 100 ml de lejía de sosa 0,1 N se introducen
mediante pipeta en un matraz graduado de 1 litro, y se completa con
agua destilada hasta la marca.
\vskip1.000000\baselineskip
b) solución de pectina (al 0,55%)
Se fija una copa de vidrio de 100 ml en un baño
de agua con termostato de suspensión -ajustado a 30ºC-, y sobre el
mismo se instala un motor de agitación con agitador de paletas de
manera que el agitador de paletas cuelgue lo más cerca posible por
encima del fondo de la copa de vidrio.
Se introducen aproximadamente 700 ml de agua
destilada (H_{2}O destilada) en la copa de vidrio, y seguidamente
se introducen 5,5 g de la pectina seca de citrus altamente
esterificada bajo fuerte agitación durante aproximadamente 2 min en
el medio del remolino de agitación. A continuación se reduce la
velocidad de la agitación, y para todas las investigaciones
ulteriores se lleva a cabo una agitación adicional bajo un r.p.m.
constante durante exactamente 30 min.
Cabe observar que en este caso debe formarse una
solución viscosa lisa sin grumos.
El contenido de la copa de vidrio se transfiere
bajo lavado final junto con una pequeña cantidad de agua destilada
en un matraz graduado de 1 litro, y se completa a 20ºC hasta la
marca.
Antes del uso se filtra sobre lana de vidrio la
solución terminada de pectina.
\vskip1.000000\baselineskip
En un baño de agua con termostato de suspensión
- ajustado a 30ºC - se fija una copa de vidrio (de 200 ml) de
manera que queda sumergida en el mismo hasta la mitad. Se añaden 20
ml de la solución de pectina en la copa de vidrio, y se templa
durante exactamente 15 min.
Dentro de este intervalo de tiempo se fija un
electrodo de vidrio, acoplado a un medidor de pH con equipo de
titulación, de modo que quede sumergido en la solución de pectina en
la copa de vidrio. También se instalan un agitador de paletas y las
dos tuberías de alimentacion de las autoburetas con NaOH 0,1N y 0,01
N.
Después de trascurrido los 15 minutos se añaden
mediante pipeta 2 ml de solución de enzima en la solución de
pectina, y se mantienen bajo agitación constante.
Ahora se cambia a la autobureta con NaOH 0,01 N,
al mismo tiempo se pone en marcha el cronómetro y además se
mantiene constante el valor del pH en pH = 4,4 mediante la adición,
gota a gota, del NaOH 0,04 N. Al cabo de exactamente 10 min después
de la toma de tiempo, se determina por lectura la cantidad consumida
de NaOH 0,01 N.
La cantidad consumida de NaOH 0,01 N debería
estar situada entre 1,6 y 4 ml. Si éste no es el caso, debe
repetirse la medición con una cantidad correspondientemente
modificada de la cantidad, o de la dilución, de la enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad de la
pectina esterasa [U/ml] = \frac{A \cdot x \cdot M \cdot x \cdot
V_{F}}{V_{E} \cdot x \cdot
t}
A = consumo de NaOH 0,01 N [ml]
M = molaridad de la solución de titulación
[\mumol/ml]
VF = factor de dilución
VE = volumen de la solución de enzima [ml]
t = duración de la reacción [min].
\newpage
(Medición del azúcar
reductor)
\vskip1.000000\baselineskip
La celulasa desdobla el enlace
\beta-1,4 entre las unidades glucosa dentro de una
molécula de almidón. La glucosa que se libera con ello se detecta
fotométricamente con ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNSS).
Durante el calentamiento de ácido
3,5-dinitrosalicílico (DNSS) con azúcar reductor en
medio alcalino se forma ácido
3-amino-5-nitrosalicílico
(Ecuación 1). En este caso se reduce un grupo nitro, obteniéndose un
grupo amino, mientras que el grupo aldehído del monosacárido se
oxida en forma de grupo carboxilo (Kakác y Vejdelek, 1974).
Distintos azúcares resultan en diversas
coloraciones, cuya absorción máxima se encuentra entre 500 y 550 nm.
De esta manera, mediante este ensayo, también pueden detectarse
mono-, di-, oligo- y polisacáridos, así como metilpentosas y
O-metilsacáridos.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivo DNSS-fenol:
- Solución A:
Introducir por pesada 38,55 g de tartrato de
K-Na en una copa de vidrio de 200 ml, y disolver en
125 ml de agua destilada. Seguidamente se disuelven 2,425 g de NaOH
(galleta).
- Solución B:
Disolver 1,325 g de ácido
3,5-dinitrosalicílico (C_{7}H_{4}N_{2}O_{7};
ácido
2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico)
en una botella de rosca, marrón, en 125 ml de agua destilada.
- Solución C:
Disolver 1,05 de fenol en 12,5 ml de agua
destilada. Añadir consecutivamente 0,25 g de NaOH (galleta) y 1,05 g
de Na_{2}SO_{4}, y disolver bajo agitación.
- Solución de Uso:
La solución A y la solución C se vierten en la
solución B, sin enjuague posterior, y se homogeneiza durante 10 min.
Dejar en reposo la solución antes de su uso durante al menos una
noche, y conservar siempre en la oscuridad.
Substrato: 2,0 g de Avicel en 90 ml de
tampón
Tampón: tampón citrato de Na, 0,1 M, pH 4,5
Solución estándar: 2,0 g/l de glucosa en agua
destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Someter a incubación (¡retirar bajo agitación!)
1,5 ml de solución substrato durante 10 min a 50ºC, seguidamente
añadir 0,5 ml de preparado en enzima líquido (para el valor por
defecto tampón 0,5 M). Después de exactamente 20 min de tiempo de
reacción se enfría la mezcla en baño de hielo, y se centrifuga
durante 20 min a 4.200 rpm. Se mezcla 1,0 ml de material
sobrenadante con 2,0 ml de reactivo DNSS-fenol, y se
hierve durante 5 min en el baño de agua en ebullición. Enfriar la
mezcla durante aproximadamente 5 min en el baño de hielo, y medir la
extinción a temperatura ambiente y bajo 546 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
En lugar de solución de substrato de enzima, en
el ensayo se emplean 2 ml de solución estándar. Diluciones de la
solución estándar para el trazodo de las rectas de calibración:
| C (glucosa) en g/l | Solución estándar en \mul | agua destilada en \mul |
| 0,1 | 100 | 1.900 |
| 0,125 | 120 | 1.880 |
| 0,16 | 160 | 1.840 |
| 0,22 | 220 | 1.780 |
| 0,24 | 240 | 1.760 |
| 0,28 | 280 | 1.720 |
| 0,3 | 300 | 1,700 |
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad de
Celulasa-C1 [U/ml] =
\frac{c(Glucosa)}{M(Glucosa)} \cdot \frac{V_{solución
\ reactiva}}{V_{enzim} \cdot t_{reacción}} \cdot Diluc
\cdot
M (Glucosa) = 180 g/mol
T_{reacción} = 20 min
\vskip1.000000\baselineskip
(Medición del azúcar
reductor)
\vskip1.000000\baselineskip
La laminarinasa desdobla el enlace
\beta-1,3 entre las unidades glucosa dentro de la
laminarina. La glucosa que se libera con ello se detecta
fotométricamente con ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNSS).
Durante el calentamiento del ácido
3,5-dinitrosalicílico (DNSS) con azúcares reductores
en medio alcalino, se forma ácido
3-amino-5-nitrosalicílico
(Ecuación 1). En este caso, se reduce un grupo nitro, obteniéndose
un grupo amino, mientras que el grupo aldehído del monosacárido se
oxida en forma de grupo carboxilo (Kakác y Vejdelek, 1974).
Distintos azúcares dan como resultado diversas
coloraciones, cuya absorción máxima se encuentra entre 500 y 550
nm. De esta manera, mediante este ensayo, también pueden detectarse
mono-, di-, oligo- y polisacáridos, así como metilpentosas y
O-metilsacáridos.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivo DNSS-fenol:
Solución A:
Introducir por pesada 38,55 g de tartrato de
K-Na en un vaso de vidrio de 200 ml, y disolver en
125 ml de agua destilada. Seguidamente se disuelven 2,425 g de NaOH
(galleta).
\global\parskip0.950000\baselineskip
\newpage
Solución B:
Disolver 1,325 g de ácido
3,5-dinitrosalicílico (C_{7}H_{4}N_{2}O_{7};
ácido
2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico)
en una botella marrón, de rosca, en 125 ml de agua destilada.
Solución C:
Disolver 1,05 de fenol en 12,5 ml de agua
destilada. Añadir consecutivamente 0,25 g de NaOH (galleta) y 1,05 g
de Na_{2}SO_{4}, y disolver bajo agitación.
Solución de Uso:
La solución A y la solución C se vierten en la
solución B, sin enjuague posterior, y se homogeneiza durante 10
min. Dejar en reposo la solución antes de su uso durante al menos
una noche, y conservar siempre en la oscuridad.
Substrato: laminarina al 0,5% en tampón citrato
de sodio 0,1 M, pH 4,5: calentar el tampón a aproximadamente 40ºC,
añadir laminarina bajo agitación.
Tampón: tampón citrato de Na, 0,1 M, pH 4,5
Solución estándar: 2,0 g/l de glucosa en agua
destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Sondas:
Mezclar 0,8 ml de solución de substrato con 0,1
ml de solución de enzima; someter a incubación a 40ºC durante 15
min, colocar seguidamente de inmediato en baño de hielo. Añadir a
ello 2,0 ml de reactivo DNSS-fenol y hervir durante
5 min en el baño de agua en ebullición. Enfriar la mezcla durante
aproximadamente 5 min en baño de hielo, y medir la extinción a
temperatura ambiente y bajo 546 nm.
Valores por defecto:
Mezclar 0,9 ml de solución estándar con 0,1 ml
de agua. A ello añadir 2,0 ml de reactivo DNSS - fenol, y hervir
durante 5 min en el baño de agua en ebullición. Enfriar la mezcla
durante aproximadamente 5 min en el baño de hielo, y medir la
extinción a temperatura ambiente y a 546 nm.
Solución estándar:
Mezclar 1,0 ml de solución estándar diluida con
2,0 ml de reactivo DNSS - fenol, y hervir durante 5 min. Enfriar la
mezcla durante aproximadamente 5 min en el baño de hielo, y medir la
extinción a temperatura ambiente y a 546 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Diluciones de la solución estándar para el
trazado de la recta de calibración:
| C (glucosa) en g/l | Solución estándar en \mul | agua destilada en \mul |
| 0,092 | 50 | 950 |
| 0,110 | 60 | 940 |
| 0,147 | 80 | 920 |
| 0,221 | 120 | 880 |
| 0,258 | 140 | 860 |
| 0,294 | 160 | 840 |
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad de
laminarinasa [U/ml] = \frac{c(Glucosa)}{M(Glucosa)}
\cdot \frac{V_{solución \ reactiva}}{V_{enzim} \cdot t_{reacción}}
\cdot Diluc
\cdot
M (Glucosa) = 180 g/mol
T_{reacción} = 20 min
\global\parskip1.000000\baselineskip
(Medición del azúcar
reductor)
\vskip1.000000\baselineskip
La xilanasa desdobla el enlace
\beta-1,4 entre las unidades xilosa dentro de una
molécula de xilano. La xilosa que se libera con ello se detecta
fotométricamente con ácido 3,5-dinitrosalicílico
(DNSS).
Durante el calentamiento del ácido
3,5-dinitrosalicílico (DNSS) con azúcar reductor en
medio alcalino se forma ácido
3-amino-5-nitrosalicílico
(Ecuación 1). En este caso se reduce un grupo nitro, obteniéndose un
grupo amino, mientras que el grupo aldehído del monosacárido se
oxida en forma de grupo carboxilo (Kakác y Vejdelek, 1974).
Distintos azúcares resultan en diversas
coloraciones, cuya absorción máxima se encuentra entre 500 y 550 nm.
De esta manera, mediante este ensayo, también pueden detectarse
mono-, di-, oligo- y polisacáridos, así como metilpentosas y
O-metilsacáridos.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivo DNSS-fenol:
Solución A:
Introducir por pesada 38,55 g de tartrato de
K-Na en una copa de vidrio de 200 ml, y disolver en
125 ml de agua destilada. Seguidamente se disuelven 2,425 g de NaOH
(galleta) en la solución.
Solución B:
Disolver 1,325 g de ácido
3,5-dinitrosalicílico (C_{7}H_{4}N_{2}O_{7};
ácido
2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico)
en una botella marrón, de rosca, en 125 ml de agua destilada.
Solución C:
Disolver 1,05 de fenol en 12,5 ml de agua
destilada. Añadir consecutivamente 0,25 g de NaOH (galleta) y 1,05 g
de Na_{2}SO_{4}, y disolver bajo agitación.
Solución de Uso:
La solución A y la solución C se vierten en la
solución B, sin enjuague posterior, y se homogeneiza durante 10 min.
Dejar en reposo la solución antes de su uso durante al menos una
noche, y conservar siempre en la oscuridad.
Substrato: 2,0 g de xilano en 90 ml de
tampón
Tampón: tampón citrato de Na, 0,1 M, pH 4,5
Solución estándar: 2,0 g/l de xilosa en agua
destilada.
\vskip1.000000\baselineskip
Someter a incubación (¡retirar bajo agitación!)
1,5 ml de solución substrato durante 10 min a 50ºC, seguidamente
añadir 0,5 ml de preparado de enzima líquido (para el valor por
default tampón 0,5 ml). Después de exactamente 20 min de tiempo de
reacción se enfría la mezcla en el baño de hielo, y se centrifuga
durante 20 min a 4.200 rpm. Se mezcla 1,0 ml de material
sobrenadante con 2,0 ml de reactivo DNSS-fenol, y se
hierve durante 5 min en el baño de agua en ebullición. Enfriar la
mezcla durante aproximadamente 5 min en el baño de hielo, y medir la
extinción a temperatura ambiente y bajo 546 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
En lugar de solución de substrato y enzima, en
el ensayo se emplean 2 ml de solución estándar. Diluciones de la
solución estándar para el trazado de la recta de calibración:
| C (glucosa) en g/l | Solución estándar en \mul | agua destilada en \mul |
| 0,1 | 100 | 1.900 |
| 0,125 | 120 | 1.880 |
| 0,16 | 160 | 1.840 |
| 0,22 | 220 | 1.780 |
| 0,24 | 240 | 1.760 |
| 0,28 | 280 | 1.720 |
| 0,3 | 300 | 1.700 |
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad de
xilanasa [U/ml] = \frac{c(xilosa)}{M(xilosa)} \cdot
\frac{V_{solución \ reactiva}}{V_{enzim} \cdot t_{reacción}}
\cdot Diluc
\cdot
M (Xilosa) = 150 g/mol
T_{reaccioon} = 20 min
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de la lipasa se determina mediante
el método pH-Stat. Como substrato se utiliza
trioleína. Se prepara una solución de substrato (30 ml) consistente
en 2% peso/volumen de goma arábiga, 5% volumen/volumen de substrato
en agua, y se emulsiona con un homogeneizador. A ello se añade 1 ml
de solución de enzimas. El ácido liberado en la reaccion se
retitula con lejía de sosa 0,01 M, a efectos de mantener el pH
constante. Se calcula la cantidad de ácido liberado a partir de la
cantidad de NaOH, y a continuación la actividad de la enzima. Para
la determinación de la autohidrólisis se reemplaza la solución de
enzimas con agua destilada. Las mediciones se llevan a cabo a 37ºC
y a pH 7,5 en cada caso, tres veces. Los valores de actividad
obtenidos en U/ml se convierten matemáticamente para la composición
total de aceitunas o de componentes de aceitunas y mezcla de
enzimas (es decir, la actividad en la mezcla de enzimas ya empleada
para la producción de aceite).
La actividad de la fosfolipasa-C
se lleva a cabo con p-nitrofenilfosforilcolina como
sustancia de ensayo. A 50 \mul de una solución de
N-nitrofenilfosforilcolina (100 mM en
bórax-HCl 50 mM, pH 7,5), se añaden 50 \mul de
solución de enzima. El p-nitrofenol formado por la
hidrólisis de p-nitrofenilfosforilcolina, se mide a
410 nm, mediante fotómetro. Como control negativo se reemplaza la
solución de enzimas con agua destilada. Para la calibración se
aplica una solución fresca de p-nitrofenol (100 mM
en Borax-HCl 50 mM, pH = 7,5). Mediante la
preparación de diluciones adecuadas y medición de estas soluciones a
410 nm en el fotómetro, es posible preparar una curva de
calibración. En cada caso, cada una de las mediciones se lleva a
cabo tres veces. Los valores de actividad obtenidos, expresados en
U/ml, se convierten por cálculo en equivalente de la mezcla de
enzimas. Partiendo de la base de que la
p-nitrofenil-fosforocolina no se
desdobla por las soluciones de enzimas, no hay ninguna actividad de
fosfolipasa-C presente.
A continuación se explica la invención con mayor
detalle con la ayuda de los ejemplos siguientes, que no son
limitantes.
Se introdujeron por pesada aproximadamente 900 g
de masa de aceituna previamente desaceitadas (Olea europea
hojiblanca cv., segunda etapa de madurez), se mezclaron con 50
ml de agua o de solución acuosa de enzimas, y se sometieron a
incubación durante 60 min a 40ºC en un vaso de vidrio de 2.000 ml
bajo agitación con un agitador en espiral (150 rpm). A continuación
se llevó a cabo una separación de sólidos-líquidos
mediante centrifugación en una copa de acero inoxidable de 500 ml
en un centrifugador Heräus de tipo KS IV (2.000 g, 20ºC). La
separación de líquidos/sólidos tuvo lugar en un embudo de separación
a temperatura ambiente durante la noche. Se drenó la fase acuosa,
se secó el material desaguado por enjugado, y se determinó
gravimétricamente la cantidad de aceite remanente. El rendimiento
relativo en aceite mediante adición exclusiva de agua sin mezcla de
enzima (muestra de comparación), fue de 0,41% (peso/peso), en el
caso de una adición de 10 \mul de una mezcla de enzimas conforme
a la invención (fuentes y procedencias de enzimas, como
anteriormente indicadas):
\newpage
| Exo-PGasa: | 900 U/ml |
| Pectina liasa: | 61.400 U/ml |
| Endo-PGasa: | 5.500 U/ml |
| (ensayo de viscosidad; substrato: pectina) | |
| Endo-PGasa: | 2.060 U/ml |
| (ensayo de viscosidad; substrato: PGA) | |
| Pectina esterasa: | 340 U/ml |
| Celulasa-C1 (Avicelasa): | 2,8 U/mL |
| Laminarinasa: | 9,3 U/ml |
| Xilanasa: | 1.820 U/ml |
el rendimiento fue de 1,11% (peso/peso), o de
270% de la muestra de comparación; para una adición de 50 \mul de
la mezcla de enzimas conforme a la invención, el rendimiento fue de
1,14% (peso/peso), o de 278% de la muestra de comparación; para una
adición de 100 \mul de la mezcla de enzimas conforme a la
invención, el rendimiento fue de 1,26% (peso/peso), o de 307% de la
muestra de comparación, y para una adición de 200 \mul de la
mezcla de enzimas conforme a la invención, el rendimiento fue de
1,45% (peso/peso), o de 354% de la muestra de comparación.
Se introdujeron por pesada aproximadamente 600 g
de masa de aceituna previamente desaceitada (Olea europea
hojiblanca cv., tercera etapa de madurez), y se sometieron a
incubación sin o con solución acuosa de enzimas durante 60 min a
35ºC en un recipiente de acero inoxidable bajo agitación con un
agitador en espiral (150 rpm). La separación de
sólidos-líquidos tuvo lugar mediante centrifugación
a 3.500 g durante 60 segundos. El rendimiento en aceite se
determinó volumétricamente en una probeta con pie después de una
separación de fases de una hora.
El rendimiento relativo en aceite sin adición de
enzimas (muestra de comparación) fue de 2,5 \pm 0,1% (peso/peso);
para una adición de 150 \mul de la mezcla de enzimas conforme a la
invención (cfr. lo que precede), el rendimiento relativo fue de 4.0
\pm 0,2% (peso/peso) o de 163,6 \pm 4,2% de la muestra de
comparación; para una adición de 250 \mul de la mezcla de enzimas
conforme a la invención, el rendimiento relativo fue de 4,3 \pm
0,2% (peso/peso), o de 177,3 \pm 3,9% (peso/peso) de la muestra
de comparación; para una adición de 350 \mul de la mezcla de
enzimas conforme a la invención, el rendimiento relativo fue de 4,8
\pm 0,1% (peso/peso), o de 195,5 \pm 2,0% de la muestra de
comparación; y para una adición de 450 \mul de la mezcla de
enzimas conforme a la invención, el rendimiento relativo fue de 4,9
\pm 0,1% (peso/peso) o de 200,0 \pm 2,0% (peso/peso) de la
muestra de comparación.
Se pesaron 1.500 kg de aceitunas de la especie
Olea europea hojiblanca cv., segunda etapa de madurez, se los
trituró (molino de martillos), y se sometieron a incubación con 1,5%
(peso/peso) de talco (22,2 kg) durante 68 min a
28-30ºC en un baño de agitación horizontal
(Pieralsi). El caudal de la masa era Q = 1.100 kg/h. Se aisló el
aceite mediante separación de sólidos-líquidos en un
decantador horizontal de dos fases (Modelo M-2 de
Pieralsi) y separación de líquidos/líquidos en un centrifugador (en
cada caso, de manera continua). Se determinaron el contenido de
aceite residual y la humedad de la masa de aceitunas desaceitada
(Ensayos 2F0498 y 3F0502). Seguidamente se pesaron 1.250 kg de la
masa de aceitunas desaceitada del primer paso del proceso. Se
sometió la masa a incubación sin adición de aceitunas (muestra de
referencia) o con una adición de 150 ml de la mezcla de enzimas
conforme a la invención (cfs con lo que precede) por tonelada, pero
en ambos casos sin adición ulterior de talco, durante 50 min a
37-40ºC (muestra de referencia), o a
39-40ºC (muestra tratada con enzimas) en el baño de
agitación horizontal. Se aisló el aceite mediante separación de
sólidos-líquidos en un decantador horizontal de dos
fases (Modelo M-2 de Pieralisi) y separación de
líquidos/líquido en un centrifugador (en cada caso, de manera
continua). Nuevamente, el caudal de la masa era de Q = 1.100 kg/h.
Se determinaron el contenido en aceite residual y la humedad en la
muestra de referencia (Ensayo 3F0500) y en la muestra tratada
(3F0504). Para las fases dobles, véase la descripción.
Se emprendió la determinación del contenido
residual en aceite mediante extracción de Soxhlet (Norma Española
Unificada, UNE 55030), y la determinación del contenido de humedad
se efectuó por secado a 110ºC hasta peso constante.
\newpage
Ensayo 3F0498 (pulpa de aceituna
después del primer prensado de la muestra de
referencia)
MS = masa seca
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\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo 3F0500 (pulpa de aceituna
después del segundo prensado de la muestra de
referencia)
\newpage
Ensayo 3F0502 (pulpa de aceituna
después del primer prensado de la muestra
tratada)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo 3F054 (pulpa de aceituna
después del segundo prensado del a muestra
tratada)
El rendimiento relativo en aceite, del segundo
prensado, resulta del cálculo de la diferencia entre el contenido
residual en aceite en la masa bruta después del primer paso y el
contenido equivalente residual en aceite después del segundo paso,
dividido por el contenido residual de aceite del primer paso.
Para la muestra de referencia 3F0500, esto
significa que en relación con la muestra 3F0498 se obtuvo un
rendimiento relativo en aceite de 1,50 \pm 0,40%: 3,62 \pm
0,03%, correspondiente a 41,44% \pm 1,42% referido a la masa
bruta. Referido a la masa seca, resultó un rendimiento relativo en
aceite, de 2,73% \pm 0,08%; 7,75% \pm 0,04%, correspondiente a
35,22 \pm 1,21%.
Para la muestra 3F0504 tratada con la mezcla de
enzimas conforme a la invención, esto significa que en relación con
la muestra 2F0502 se logró un rendimiento relativo en aceite de
1,70% \pm 0,04%: 3,64% \pm 0,04%; correspondiente a 46,70%
\pm 1,21%, referido a la masa bruta. Referido a la masa seca,
resultó un rendimiento relativo en aceite de 3,26% \pm 0,09%:
7,88% \pm 0,09%, correspondiente a 41,37% \pm 1,62%.
En este ensayo, para una adición de 150 ml de la
mezcla de enzimas conforme a la invención, y por tonelada de la
masa de aceitunas previamente desaceitada, pudo lograrse un
rendimiento adicional medio de 17,5%, referido a la masa seca.
Un total de 31.000 kg de masa de aceitunas
predesaceitadas, obtenida de la especie Olea europea picual
cv, que había estado almacenada bajo refrigeración durante 24 días
al abrigo del aire, se empleó como material de partida para el
ensayo descrito a continuación. En un preparado semiparalelo se
sometieron en primer lugar a incubación en cada caso 15.500 kg de
esta masa de aceitunas, sin o con adición de la mezcla de enzimas
conforme a la invención (en total 250 g/t, incorporado en 1,5 l de
agua) durante 60 min. a 33-35ºC en baños de
agitación horizontal con dos planos (Pieralisi). El aceite se aisló
mediante separación de sólidos/líquidos en un decantador horizontal
de dos fases (Modelo SPI7 de Pieralisi, caudal
2.500-2.725 kg/h) y separación de líquidos/líquidos
en un centrifugador (Modelo P2000 de Pieralisi) bajo adición de 300
l/h de agua a una temperatura de 38ºC. Seguidamente se almacenó el
aceite aislado, y se determinó el rendimiento mediante lectura de un
indicador de nivel en los recipientes de almacenamiento, en los que
una diferencia de nivel de 1 cm correspondía a una cantidad de
aceite de 95,26 kg.
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Especificaciones
En este ensayo, para una adición de 250 gramos
de mezcla de enzimas conforme a la invención por tonelada de
aceitunas predesaceitadas bajo las condiciones dadas, pudo lograrse
un rendimiento del 63%, referido a la masa seca (MS) determinada,
en comparación con la muestra de referencia no tratada. El contenido
residual, mínimo, de aceite en la masa de aceitunas tratada, hace
que sea superflua una elaboración ulterior en un procedimiento
químico-extractivo.
En las investigaciones se involucró el producto
Olivex® (designado en lo que sigue, como KP1) de la firma Nozymes
A/S, DK, obtenible en el comercio. Para los experimentos descritos a
continuación se determinaron todas las actividades de las enzimas
conforme al procedimiento indicado en el capítulo precedente
referido a los métodos. En este caso pudieron determinarse las
actividades individuales señaladas en la siguiente tabla:
(*) Determinado de acuerdo con el capítulo de
métodos, con PGA (ácido pectínico) como sustrato
Para las mediciones comparativas se pesaron en
cada caso 600 g de masa de aceitunas desaceitada (Olea europea
hojiblanca, cv., tercera etapa de madurez) y se la sometió a
incubación sin o con solución acuosa de enzimas (150 \mul del
producto de cooperación, eventualmente más la adición de pectina
esterasa) durante 60 min. a 35ºC en un recipiente de acero
inoxidable bajo agitación con un agitador de espiral 150 rpm). La
separación de sólidos y líquidos tuvo lugar mediante centrifugación
a 3.500 g durante 60 segundos. El rendimiento en aceite se
determinó volumétricamente después de una separación de fases
durante una hora en una probeta con pie.
Se ajustaron relaciones diversas entre pectina
esterasa y las otras enzimas en los ensayos mediante la adición de
cantidades definidas de una pectina esterasa de cáscara de naranja
(Sigma/Aldrich, Catálogo No. P5400). Para ello se recogió la enzima
liofilizada en un tampón ((NH_{4})_{2}SO_{4} 3,2 M y
NaCl 0,1 M, pH = 7,0), y se ajustó a una actividad de 75 U/ml. La
adición se llevó a cabo en incrementos de en cada caso 7,5 U; se
efectuó una determinación doble. Se han resumido los resultados
experimentales en la tabla siguiente. El rendimiento en aceite sin
ningún tipo de adición de enzima, fue de 14,7% \pm 0,6 ml, el
rendimiento en aceite bajo adición de 150 \mul de la mezcla de
enzimas conforme a la invención, fue de 24,5 \pm 0,4 ml.
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En la Figura 1 puede encontrarse una evaluación
gráfica de ambos análisis. Es evidente que la modificación de las
relaciones entre las actividades de las enzimas mediante la adición
de pectina esterasa al producto KP1 conduce a una manifiesta mejoría
del rendimiento en aceite.
Las modificaciones entre las relaciones de las
actividades, resultantes de la adición de pectina esterasa, han
sido representadas en las tablas siguientes. En este caso no se
tuvieron en cuenta efectos de volumen. De las tablas se desprende
que el ajuste de las relaciones entre las actividades de las enzimas
en los intervalos conformes a la intervención está correlacionado
con una fuerte elevación de rendimiento en aceite en caso de
KP1.
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Ajuste de las actividades de
enzima
KP1
Los siguientes Ejemplos 6 y 7 se llevaron a cabo
para la comprobación de la optimización biotecnológica del proceso
en la producción de aceite bajo utilización de la mezcla de enzimas
conforme a la invención.
Desde un piletón de reserva se aportó de manera
continua pulpa de aceituna, predesaceitada, a un recipiente de
mezclado con varillas de agitación verticales. El rendimiento de
este recipiente de mezclado fue de 25 tm/h, con un tiempo medio de
permanencia de 60 min. En este caso, se calentó la pulpa a una
temperatura de 45ºC. Desde este recipiente de mezcla se transportó
la pulpa de aceituna a un recipiente de mezclado con varillas de
agitación horizontales (de tipo Amasador Pieralisi 900 4 piletones).
Con un tiempo de permanencia medio de 40 min, el rendimiento de
esta unidad de procesamiento fue de 11 t /h. La pulpa de aceituna
fue transportada desde este baño horizontal de mezclado hacia dos
decantadores de tres fases de Tipo Pieralisi Giant 2. Estos
decantadores tenían un rendimiento nominal de aproximadamente 7 tm
de pulpa de aceite por hora, pero habían sido regulados al flujo de
masa preestablecido por el proceso. Los resultados que se describen
a continuación provienen del análisis de muestras que se extrajeron
del desagüe acuoso (papilla) de ambos decantadores.
Para la investigación del efecto de la mezcla de
enzimas conforme a la invención de acuerdo con el Ejemplo 1, se
añadieron a la pulpa de aceitunas conducida al recipiente horizontal
de mezclado, directamente en la abertura de ingreso y a lo largo de
un intervalo de tiempo de 12 horas, 80, 160 ó 240 ml/tm de la mezcla
de enzimas conforme a la invención de acuerdo con el Ejemplo 1,
mediante una bomba. La temperatura del baño era de 45ºC, 37ºC y
41ºC, respectivamente. Las muestras correspondientes para el
análisis del funcionamiento de la composición de enzimas conforme a
la invención se extrajeron a las 6 h después del inicio de la
adición de enzimas, de la papilla en los decantadores. A las
6 horas después de la terminación de la adición de enzima se
tomaron muestras de comparación en los mismos lugares de extracción.
De esta manera fue posible una comparación directa entre los
resultados del proceso, con adición de la mezcla de enzimas conforme
a la invención, y sin dicha adición.
Durante el análisis de las muestras se
determinaron los resultados para los siguientes parámetros:
contenido de agua en la papilla, y contenido de aceite en la
papilla. Los resultados para la adición de 80, 160 y de 160 ml/tm,
de la mezcla de enzimas conforme a la invención se han resumido en
las siguientes Tablas 1, 2 y 3.
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La evaluación adicional de estos datos de
análisis arrojó los siguientes resultados:
1.- La adición de 80 ml de la mezcla de enzimas
conforme a la invención por tonelada de pulpa de aceitunas bajo las
condiciones de proceso dadas (T = 45ºC) conduce, en comparación con
la pulpa de aceitunas sin tratar, a una elevación del contenido de
agua en la papilla, de hasta 2,61%, y a una reducción del contenido
de aceite en la papilla, de hasta 28,44%. En este paso del proceso,
el rendimiento en aceite subió hasta 38,26%.
2.- La adición de 160 ml de la mezcla de enzimas
conforme a la invención por tonelada de pulpa de aceitunas bajo las
condiciones de proceso dadas (T = 37ºC) conduce, en comparación con
la pulpa de aceitunas sin tratar, a una elevación del contenido de
agua en la papilla, de hasta 2,78%, y a una reducción del contenido
de aceite en la papilla, de hasta 38,30%. En este paso del proceso,
el rendimiento en aceite subió hasta 29,03%.
Bajo las condiciones dadas, la adición de 160 ml
de la mezcla de enzimas conforme a la invención por tonelada de
aceitunas, mostró un efecto especialmente ventajoso en cuanto al
contenido de agua y de aceite en la papilla, así como en el
rendimiento en aceite. También se logró un efecto positivo, referido
a los parámetros mencionados, mediante la adición de 80 ml de la
mezcla de enzimas conforme a la invención, si bien en este caso se
llevó a cabo una elevación de la temperatura de 8ºC, en comparación
con el ensayo con 160 ml/t.
También puede comprobarse que la adición de 160
ml de la mezcla de enzimas conforme a la invención por tonelada de
pulpa de aceitunas a una temperatura de aproximadamente 37ºC tiene
un efecto especialmente ventajoso sobre la capacidad de separación,
así como sobre el rendimiento en aceite en el proceso considerado,
pero del análisis de los otros resultados se concluye también que
es posible observar otros efectos ventajosos con otras temperaturas
y con otras concentraciones de enzimas.
Desde un piletón de reserva se aportó de manera
continua pulpa de aceitunas, desaceitada de antemano, a un
recipiente de mezclado provisto de barras verticales de agitación.
El rendimiento de este recipiente de mezclado era de 25 tm/h con un
tiempo medio de permanencia de 60 min. Desde este recipiente de
mezclado se transportó la pulpa de aceite de manera directa, es
decir sin interposición de un recipiente de mezclado con barra
horizontal de agitación, hacia decantadores de tres fases
(Pieralisi, Tipo Giant 2). Estos decantadores tenían un capacidad
nominal de aproximadamente 7 tm de pulpa de aceituna por hora, pero
habían sido regulados al flujo de masa prefijado por el proceso.
Los resultados que se describen a continuación, provienen del
análisis de muestras que se extrajeron directamente de un
decantador elegido arbitrariamente. La temperatura de la pulpa de
aceituna en el proceso era de 32ºC.
Para la investigación de la acción de la mezcla
de enzimas conforme a la invención de acuerdo con el Ejemplo 1, se
añadió a la pulpa de aceitunas introducida al recipiente de mezclado
vertical, directamente en la abertura de entrada a lo largo de un
intervalo de tiempo de 12 horas, 160 ó 240 ml/tm, respectivamente,
de la mezcla de enzimas conforme a la invención, mediante una
bomba. Las muestras correspondientes para el análisis del
funcionamiento de la composición de enzimas conforme a la invención
a partir de las corrientes de proceso de los decantadores (pulpa de
aceitunas, procesada (Alperujo), fase acuosa
(papilla)) se extrajo 6 horas después del inicio de la
adición de las enzimas. La cantidad de aceite producida se determinó
de manera continua mediante la técnica de medición disponible en el
lado de la instalación. Después de 12 h se detuvo la adición de
enzimas. A las 6 horas después de terminado la adición de enzimas se
extrajeron muestras de comparación de los mismos lugares de
extracción. De esta manera fue posible una comparación directa entre
los resultados del proceso, con adición o sin adición, de la mezcla
de enzimas conforme a la invención.
Durante el análisis se determinaron los
resultados para los siguientes parámetros: contenido de agua en el
alperujo, contenido de aceite en el alperujo, contenido de agua en
la papilla, y contenido de aceite en la papilla. Además, se
determinó la eficiencia del proceso, referido al rendimiento en
aceite, en el momento de la correspondiente extracción de muestras.
En las siguientes Tablas 3 y 4 se han resumido los resultados para
la adición de 160 o de 240 ml/tm de la mezcla de enzimas conforme a
la invención.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\newpage
La evaluación ulterior de estos datos de
análisis aportó los siguientes resultados:
1.- La adición de 240 ml de la mezcla de enzimas
conforme a la invención por tonelada de pulpa de aceitunas bajo las
condiciones de proceso dadas, conduce, en comparación con la pulpa
de aceitunas sin tratar, a una elevación del contenido de agua en
el alperujo, de 4,24%, a una reducción del contenido de aceite en el
alperujo de 12,42%, a una elevación del contenido de agua en la
papilla, de 1,07%, y a una reducción del contenido de aceite en la
papilla, de 8,73%. En este paso del proceso, el rendimiento en
aceite cayó en 2,22%.
2.- La adición de 160 ml de la mezcla de enzimas
conforme a la invención por tonelada de pulpa de aceitunas bajo las
condiciones de proceso dadas, conduce, en comparación con la pulpa
de aceitunas sin tratar, a una reducción del contenido de agua en
el alperujo de 13,85%, a una reducción del contenido de aceite en el
alperujo de 13,25%, a una elevación del contenido de agua en la
papilla de 0,13%, y a una reducción del contenido de aceite en la
papilla de 3,94%. En este paso del proceso, el rendimiento en aceite
aumentó cayó en 4,94%.
Bajo las condiciones dadas, la adición de 160 ml
de la mezcla de enzimas conforme a la invención por tonelada de
aceitunas, muestra una acción especialmente ventajosa con respecto a
la economía del conjunto del proceso. Una acción positiva, referida
a la economía global del proceso, también se logra mediante la
adición de 240 ml de la mezcla de enzimas conforme a la invención,
si bien no tan acentuada, como en el caso de la adición de 160
ml.
Es de especial importancia que estos
experimentos se llevaron a cabo a una temperatura de proceso de
32ºC. También en el caso de esta temperatura, comparativamente baja,
el empleo de la mezcla de enzimas conforme a la invención tuvo un
fuerte efecto positivo sobre la economía del proceso.
Claims (20)
1. Procedimiento para la producción de aceite a
partir de masas de aceitunas y/o de componentes de aceitunas, que
abarca los pasos siguientes:
a.- puesta a disposición de una masa de
aceitunas y/o de componentes de aceitunas, sin la separación de los
huesos de las aceitunas;
b.- adición de una enzima o de una mezcla de
enzimas que contiene por lo menos una pectina esterasa, en forma
líquida o sólida;
c.- mezclado conjunto de la masa y de la mezcla
de enzimas;
d.- separación de la fase de aceite de la masa,
con ayuda de un decantador de tres fases.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
que además abarca el siguiente paso: incubación de la mezcla de la
reivindicación 1c, en especial a una temperatura entre 20 y 60ºC, y
en especial durante 5 a 120 min.
3. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, en el que como masa de aceitunas y/o
de componentes de aceitunas se emplea una masa previamente
desaceitada.
4. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, en el que en por lo menos un paso se
aporta en un decantador de tres fases, pulpa de aceitunas
desaceitada de antemano sin interposición de un recipiente de
mezclado con barras de agitación horizontales (amasador), ni de un
recipiente de mezclado con barras de agitación verticales.
5. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, en el que la mezcla de enzimas
contiene por lo menos una pectina esterasa, por lo menos una
endo-poligalacturonasa y por lo menos una
exo-poligalacturonasa, y en el que la relación entre la
actividad de la pectina esterasa y la actividad de la
endo-poligalacturonasa es preferentemente de por lo menos
0,13, y en el que la relación entre la actividad de la pectina
esterasa y la actividad de la exo-poligalacturonasa es
preferentemente de 0,3.
6. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
relación entre la actividad de la pectina esterasa y la actividad de
la endo-poligalacturonasa es de por lo menos 0,15,
preferentemente de por lo menos 0,16.
7. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
relación entre la actividad de la pectina esterasa y la actividad de
la exo-poligalacturonasa es de por lo menos 0,33.
8. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la
mezcla de enzimas conforme a la invención se halla contenida por lo
menos una laminarinasa, y porque la relación entre la actividad de
la pectina esterasa y la actividad de la laminarinasa es de por lo
menos 20, preferentemente de al menos 30.
9. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la
mezcla de enzimas conforme a la invención se halla contenida por lo
menos una celulasa-C1 y porque la relación entre la
actividad de la pectina esterasa y la actividad de la
celulasa-C1 es de por lo menos 75, preferentemente
de por lo menos 100.
10. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la
mezcla de enzimas conforme a la invención se hallan contenidas las
siguientes actividades de enzima:
- a.-
- pectina esterasa: más de 300 U/ml, en especial, más de 320 U/ml;
- b.-
- exo-poligalacturonasa: menos de 1.000 U/ml:
- c.-
- endo-poligalacturonasa: entre 1.500 y 2.500 U/ml,
- d.-
- laminarinasa: menos de 15 U/ml, en especial menos de 12 U/ml;
- e.-
- celulasa-C1: menos de 3,3 U/ml;
- f.-
- pectina liasa: entre aproximadamente 25.000 y 150,000 U/ml.
11. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en el
mismo, se encuentran contenidos por tonelada de masa, en especial
entre 50 y 400 ml, preferentemente entre 100 y 300 ml, de manera
especialmente preferida entre 125 y 250 ml de la mezcla de
enzimas.
\newpage
12. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la
mezcla de enzimas la concentración de proteínas es de entre 2 y 20
mg/ml, preferentemente entre 2 y 12 mg/ml, en especial entre 3 y 10
mg/ml.
13. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se trata
de un procedimiento para la producción de aceite a partir de masas
previamente desaceitadas de aceitunas y/o de componentes de
aceitunas.
14. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se trata
de un procedimiento físico o mecánico-físico para la
producción de aceite.
15. Uso de una mezcla de enzimas conforme a una
de las reivindicaciones precedentes, definido en un procedimiento
conforme a una de las reivindicaciones precedentes para la mejora de
la separación entre sólidos y líquidos para la producción de aceite,
en especial en el desaceitado de una masa previamente desaceitada de
aceitunas o de componentes de aceitunas.
16. Uso conforme a la reivindicación 15,
caracterizado porque la separación de sólidos/líquidos tiene
lugar exclusivamente con ayuda de por lo menos un decantador de tres
fases.
17. Uso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque se eleva el
rendimiento en aceite en la separación de sólidos/líquidos.
18. Uso conforme a una de las reivindicaciones
15 a 17, caracterizado porque se reduce el contenido de
aceite en la descarga acuosa del decantador de tres fases y/o porque
se eleva la cantidad de agua separada en la descarga acuosa.
19. Uso conforme a una de las reivindicaciones
15 a 18, caracterizado porque se reduce el contenido en
aceite y/o en agua de la fase sólida obtenida con ayuda del
decantador de tres fases.
20. Uso conforme a una de las reivindicaciones
15 a 19, para poder reducir la temperatura del proceso manteniéndose
por lo menos constante el rendimiento en aceite.
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