ES2283005T3 - Composiciones y procedimientos para catalizar la hidrolisis de gp 120 de hiv. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN ANTICUERPO CATALITICO Y COMPONENTES DEL MISMO QUE ROMPE EL GP120 DE VIH. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA AISLAR, CLONAR Y PURIFICAR DICHOS ANTICUERPOS O COMPONENTES DEL ANTICUERPO A PARTIR DE PACIENTES. LAS COMPOSICIONES DESCRITAS PUEDEN RESULTAR UTILES EN EL TRATAMIENTO DE LA INFECCION POR VIH.

Description

Composiciones y procedimientos para catalizar la hidrólisis de gp120 de HIV.

Campo de la invención

Esta invención está relacionada con el tratamiento de la infección por VIH y con las patologías asociadas. En particular, se proporcionan anticuerpos catalíticos (proteolíticos), o derivados de los mismos, que catalizan la hidrólisis de la proteína gp120 del VIH.

Antecedentes de la invención

Las glicoproteínas de la membrana de VIH-1 se sintetizan inicialmente como un solo precursor de 160 kD, el cual cortado por una proteasa celular en el enlace Arg511-Ala512, produciendo gp120 y la proteína integral gp41 de membrana (Kido, H., et al., J. Biol. Chem. 268:13406-13413 (1993)). La actividad biológica de gp120 es un elemento clave en la unión inicial del VIH-1 a las células hospedadoras, en la propagación del virus y en sus efectos tóxicos sobre las neuronas no infectadas y otras células (Kieber-Emmons, T., et al., Biochim. Biophys. Acta. 989:281-300, (1987); Capon et al., Ann. Rev. Immunol. 9:649-678). Así, la gp120 es una diana para la inmunización pasiva o activa contra el SIDA (Kahn, J.O., et al., J. Infec. Dis. 170:1288-1291 (1994); Birx, D.L., et al., Curr. Opn. Immunol. 5:600-607(1993); Berman, P.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5200-5204 (1988). La primera etapa en la infección por VIH-1 es la unión de un epítopo conformacional de gp120 a receptores CD4 de las células hospedadoras. Los aminoácidos individuales que constituyen este epítopo parecen estar localizados en el segundo (C2), tercero (C3), y cuarto (C4) segmentos conservados de gp120 (Olshevsky, T.J., et al., J. Virol. 64:5701-5705 1990)). Estos son los residuos 256, 257, 368-370, 421-427 y 457 de gp120. Se han descrito anticuerpos monoclonales que se unen al sitio de unión de CD4 (Tahalí, M., et al., J. Virol. 65:6188-6193 (1991); tahalí, M., et al., J. Virol. 66:5635-5641 (1992). Puesto que el sitio de unión a CD4 es un epítopo conformacional, los residuos distantes que por sí mismos no son constitutivos del epítopo podrían ser importantes en el mantenimiento de la capacidad para unirse a CD4. Las interacciones de gp120 con otras proteínas de la célula hospedadora son también esenciales para la propagación del virus. Por ejemplo, la unión de gp120 por la calmodulina podría estar implicada en la infectividad de VIH-1, según se revela por el efecto inhibidor de los antagonistas de calmodulina (Srinivas, R.V., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 108:1489-1496 (1994). Asp180 localizado entre las regiones V1 y V2 de gp120 es crítico para la replicación vírica (Wang, W-K., et al., J. Virol. 69:538-542 (1995). De manera similar, el bucle V3 es esencial para la infectividad (Ivanoff, L.A., et al., Virology 187:423-432 (1992). Por lo tanto, está claro que probablemente sean necesarios determinantes estructurales en gp120 diferentes de los constitutivos del sitio de unión a CD4 para la replicación del genoma vírico, la síntesis de proteínas de la cubierta, y el empaquetamiento de las partículas víricas.

Se ha propuesto la restricción de gp120 por las partículas víricas como un factor en la patogénesis del SIDA (Gelderblom, H.R. et al., Lancett ii:1016-1017 (1985)). La gp120 purificada es tóxica para las neuronas cultivadas (Brenneman, D.E. et al., Nature 335:639-642 (1988); Muller, W.E.G. el al., Eur. J. Pharmacol. 226:209-214 (1992)). Los monocitos dependientes del anticuerpo pueden provocar la lisis de los linfocitos T no infectados recubiertos con gp120 (Hober, D. et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 10:83-92 (1995)). Las células CD4+ no infectadas pueden morir porque la unión del complejo gp120-gp41 induce apoptosis (Laurent-Crawford, A.G. et al., Res. Virol 146:5-17 (1995)). La gp120 se une también a componentes complementarios (Stoiber, H. et al., AIDS 9:19-26 (1995)).

Ha habido un interés considerable en la posibilidad de que gp120 contribuya en el daño neuronal observado en pacientes con SIDA (Everall, l.Petal., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52:561-566 (1993)). La infección productiva en el cerebro ocurre en un número relativamente pequeño de células, que incluyen microglías, células gigantes multinucleadas y macrófagos derivados de la sangre (Epstein. L.G et al., Ann. Neurol. 52:561-566 (1993)). Sin embargo, hay un daño generalizado del cerebro en áreas que no han sido infectadas por el virus. Esto ha sugerido que la gp120 soluble liberada por el virus y las citoquinas producidas por las células infectadas podrían ser responsables del daño (Lipton, S.A., Brain Pathol. 1:193-199 (1991), Giulian, D. et al., Science 250:1593-1595 (1990); Benos, D.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:494-498 (1994)). Los efectos neurotóxicos de gp120 pueden ser indirectos, implicando la estimulación del receptor NMDA (Benos, D.J. et al.,Proc. Natl. Acad. USA 91:494-498 (1994)) o la inducción de citoquinas (Yeung, M.C. et al., AIDS 9:137-143, (1995)). Gp120 también estimula la liberación de neurotoxinas procedentes de los monocitos (Giulian, D. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:2769-2773, (1993)), indicando que sus efectos neurotóxicos podrían requerir la participación de este tipo de células. La evidencia de la neurotoxicidad de la gp120 soluble incluye:

(a)

ratones transgénicos que expresan gp120 en el cerebro muestran daño neuronal generalizado (Toggas, S.M. et al., Nature 367:188-193 (1994));

(b)

gp120 pura en concentraciones sub-picomolares mata los astrocitos cultivados y células corticales cerebrales (Brenneman, D.E. et al., Nature 335:639-642 (1988); Muller, W.E.G. et al., Eur. J. Pharacol. 226:209-214 (1992));

(c)

inyecciones de gp120 pura in vivo producen daño cerebral (Hill, J.M. et al., Brain Res. 603:222-223 (1993));

(d)

se ha descrito una actividad neurotóxica similar a la de gp120 presente en el fluido espinal (Buzy, J. et al., Brain Res. 598:10-18 (1992));

(e)

el péptido-T, un octapéptido que corresponde a un segmento de gp120 y que tiene cierta homología con el neuropéptido VIP, podría mejorar la disfunción neuronal en pacientes con SIDA (Bridge, T.P. et al., Psychopharmacol. Bull 27:237-245(1991)).

Gp120 expresa muchos epítopos antigénicos lineales y conformacionales para los que se producen anticuerpos. Estos incluyen los anticuerpos neutralizantes del bucle V3 producidos por individuos infectados con VIH (Dreyer, E.B. et al., Science 248:364:367 (1990); Meylan, P.R. et al., AIDS 6:128-130 (1992); Pollard, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11320-11324 (1991)). Estos anticuerpos son específicos de tipo porque el bucle V3 es una región hipervariable, con actividad neutralizante dirigida únicamente contra variantes del VIH con secuencias V3 similares a la cepa del virus responsable de la infección inicial. Por otro lado, los anticuerpos liberados en las últimas fases de la enfermedad pueden ser, por lo general, protectores, si los medimos según la inhibición de la capacidad de diferentes cepas de VIH-1 para infectar líneas de células y cultivos susceptibles in vitro de células linfoides primarias. Un subconjunto de estos anticuerpos protectores se dirigen contra regiones conservadas de gp120 esenciales para la unión al receptor CD4 y para la propagación del virus (Hattori, T. et al., FEBS Lett 248:48-52 (1989); Schulz, T. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:159-166 (1993); Clements, G.J. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 7:3-16 (1991). Se cree ampliamente que el reclutamiento de respuestas con anticuerpos neutralizantes en las regiones conservadas de gp120 será necesario para la vacuna efectiva contra el SIDA. De igual manera, el éxito de la inmunización pasiva con anticuerpos dependerá de la capacidad de reconocer las regiones conservadas de gp120.

Otros han observado que los autoanticuerpos encontrados en pacientes con lupus eritematoso sistémico son capaces de unirse a gp120 (Gu, R. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:1007-1015 (1993); Callebaut, C. et al., Science 262:2045-2050 (1993)). Se ha sugerido una reactividad cruzada entre anticuerpos contra gp120 y contra las cadenas pesadas de clase l de HLA (cadenas H) (Sattentau, Q.J. et al., J. Virol. 67:7383-7393 (1993). Se han descrito también anticuerpos catalíticos que hidrolizan el ADN en pacientes con SIDA (Woolley, D.W. et al., John Wiley & Sons, Inc. 1952 pp82).

Las especulaciones sobre la posibilidad de que los anticuerpos desarrollen actividad catalítica se remontan a Woolley en 1952 (Gao, Q:S:, et al., J. Biol. Chem. 269:32389-32393 (1994)) quien sugirió que si se expone a un antígeno durante un periodo de tiempo suficientemente largo, el sistema inmune podría sintetizar anticuerpos catalíticos. Existe una homología de secuencia detectable entre las cadenas L de anticuerpo y las proteasas de serina (Sun, M. et al., J. Immunol 153:5121-5126 (1994); Paul, S. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:241-255 (1994)). Kohen et al., publicaron que la inmunización con esteroides o dinitrofenol conjugado a proteínas portadoras provocaban la formación de anticuerpos con capacidad esterasa (Sun, M. et al., J. Immunol 153:5121-5126 (1994); Paul, S. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:241-255 (1994)). Se ha demostrado que los autoanticuerpos humanos hidrolizan el neuropéptido VIP (Ll, L. et al., Mol. Immunol. 1996, in press.) Se ha reproducido la hidrólisis de VIP catalizado por autoanticuerpo (Ll, L. et al., J. Immunol. 154:3328-3332 (1995)). Otros grupos han mostrado hidrólisis de ADN mediada por autoanticuerpo (Tyutyulkova, S. et al., Biochimica Biophysica Acta 1996, in press.; Kalaga, R. et al., J. Immunol. 155:2695-2702 (1995)).

Los anticuerpos con actividad enzimática ofrecen la posibilidad de conversión química catalítica de ligandos específica y con alta eficacia. Muchos mediadores biológicos son péptidos o proteínas, incluyendo los antígenos de organismos patógenos, hormonas, neurotransmisores y antígenos específicos de tumores. Es posible utilizar el enorme repertorio de especificidades que el sistema inmune abarca para catalizar reacciones químicas que no están incluidas en los enzimas que se encuentran de manera natural. La combinación de la especificidad de anticuerpo con el poder catalítico de los enzimas tiene el potencial de generar agentes terapéuticos potentes, p. e., anticuerpos catalíticos capaces de hidrolizar específicamente las proteínas de la cubierta vírica de cierre.

Descripción resumida de la invención

No se ha desarrollado aún una cura para la infección por VIH. Los tratamientos disponibles hasta la fecha tienen como finalidad inhibir la replicación vírica para prolongar el periodo de latencia de la enfermedad. La presente invención proporciona procedimientos y composiciones que se pueden utilizar en pacientes con SIDA para reducir el nivel de VIH y de gp120 soluble en el cuerpo. La administración de estas composiciones a pacientes puede aliviar los síntomas neurológicos en pacientes que sufren de demencia relacionada con el SIDA.

La presente invención comprende anticuerpos anti-gp120 hidrolíticos y componentes de anticuerpos de cadena L aislados de sueros de pacientes que cortan eficientemente gp120 en subfragmentos inactivos. Se proporcionan procedimientos para el aislamiento y la purificación de anticuerpos catalíticos y de componentes de anticuerpos que median la hidrólisis de gp120.

Realizaciones preferidas de la invención son los anticuerpos y componentes de los anticuerpos producidos utilizando procedimientos recombinantes. Siguiendo al cribado de los sueros por actividad de escisión de gp120, se aíslan los linfocitos de la sangre periférica y se usan como una fuente de ARNm que codifica la actividad para generar una librería de ADNc. Se consigue el aislamiento de los genes que codifican los anticuerpos catalíticos y los componentes de anticuerpo de la invención utilizando procedimientos ampliamente conocidos por los expertos en la materia. Se contemplan la exhibición en fagos de las cadenas L de la invención para el aislamiento de los clones que expresan cadenas L. También se prevé la clonación del repertorio inmune a partir de linfocitos aislados procedentes de pacientes con VIH-1 y de pacientes con SLE utilizando cebadores para las regiones conservadas de los genes de IgG.

Después del aislamiento, expresión y purificación de los anticuerpos y componentes de anticuerpo recombinantes que hidrolizan gp120, se proporciona la metodología para la administración a pacientes infectados por VIH. Se puede administrar por vía intravenosa el anticuerpo catalítico que escinde gp120 o sus componentes en una preparación farmacéuticamente adecuada. Alternativamente, los anticuerpos hidrolíticos de gp120 de la invención se pueden administrar vía cánula al compartimiento intraventricular del cerebro. Las cadenas L catalíticas de la invención se pueden fusionar traduccionalmente con transferrina para mediar el paso a través de la barrera hematoencefálica en pacientes infectados con VIH-1.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 es un gel teñido con plata de proteínas de Bence Jones y sus dominios V_{L} en condiciones reductoras (A) y no reductoras (B).

Figura 2A es un autoradiograma que ilustra la hidrólisis de gp120 radiomarcada incubada con la cadena L Lay-2 durante 6 horas a 37ºC.

Figura 2B es un gel SDS-page teñido con plata que muestra la hidrólisis de gp120 no marcada por parte de la cadena L Lay2.

Figura 3 es un gráfico que muestra la progresiva depleción del sustrato de gp120 radiomarcado en presencia de concentraciones crecientes de la cadena L Lay2.

Figura 4 es un gráfico que representa la dependencia del pH de la hidrólisis catalizada por la cadena L Lay-2 de gp120 radiomarcada.

Figura 5 es un gráfico que muestra la reducción de neurotoxicidad de gp120 en células neuronales siguiendo un tratamiento con la cadena L de Lay2.

Figura 6 es un gráfico que muestra la inhibición de la infectividad de VIH-1 mediante pretratamiento con la cadena L Lay2.

Figura 7 es un gel que muestra el tamaño del ADNc que codifica el dominio V_{L} de Lay2 sintetizado por PCR recursivo.

Figura 8 es un autorradiograma que muestra la hidrólisis de gp120 radiomarcada por parte de cadenas L aisladas a partir de un paciente con SLE.

Figura 9 es un autorradiograma que muestra la hidrólisis de gp120 radiomarcada por cadenas L aisladas procedentes de un paciente con VIH.

Descripción detallada de la invención

El descubrimiento no anticipado de que una proteína humana normal es capaz de reconocer específicamente a gp120 y catalizar la lisis de un enlace peptídico en gp120, abre la posibilidad de desarrollar una nueva intervención terapéutica en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se puede utilizar farmacológicamente un anticuerpo hidrolítico anti-gp120 en el tratamiento de enfermos con SIDA, por ejemplo en el tratamiento de la demencia relacionada con el SIDA. Datos preliminares han indicado que la proteólisis de anti-gp120 elimina la neurotoxicidad mediada por gp120. Otra y más directa aplicación sería una solución de proteína inyectable que mediante unión a, y escisión de gp120, disminuiría la infectividad del VIH, ya sea destruyendo el sitio de unión al receptor de gp120 o desestabilizando el sitio de unión del receptor vírico. Se puede utilizar el anticuerpo hidrolítico de gp120 como un suplemento del sistema inmune para potenciar la capacidad de los mecanismos naturales del cuerpo para controlar la enfermedad. Se aisló una de las cadenas L con actividad hidrolizante de gp120 ejemplificada en esta solicitud procedente de un paciente con mieloma múltiple (Lay2). Se desconoce el estimulo antigénico original responsable de la especificidad de la cadena L del mieloma. La reacción de la cadena L con gp120 puede reflejar un fenómeno de reactividad cruzada, debido a un ajuste estructural fortuito entre el sitio de unión y gp120. En el momento de la muerte del paciente, el SIDA no era una entidad clínica reconocida y se desconoce cuándo el paciente dio positivo para los anticuerpos del VIH-1. El mieloma múltiple se puede dar con frecuencia aumentada en pacientes con SIDA (Erhan, S., et al., Nature 251:353-355 (1974)), pero no hay ninguna evidencia de que el donante de la cadena L catalítica tuviera SIDA.

Recientes informes han demostrado que la infección por VIH implica un equilibrio entre la replicación rápida del VIH y una alta renovación de las células T de CD4 (Wei et al., Nature 373:123-126 (1995). Un tratamiento proteolítico agresivo específico del virus en esta etapa, cuando el sistema inmune aún esta fuerte y que contiene la infección, potenciaría la posibilidad de eliminar la infección, o de prolongar el periodo de latencia.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para describir el invento con mayor detalle. No tienen la intención de limitar en absoluto la invención.

Ejemplo 1 Hidrólisis de gp120 mediada por la cadena L de anticuerpo

Se han descrito veintinueve cadenas L de anticuerpo monoclonal purificadas de pacientes con mieloma múltiple (Solomon, A., Meth. Enzym. 116:101-121 (1985); se cribaron anticuerpos policlonales anti-VIP en muestras proporcionadas por el Dr. Solomon, University of Tennessee), una cadena L recombinante con actividad hidrolizante de VIP (Gao, Q-S., et al., J. Biol. Chem. 269:32389-32393 (1994)) y (Paul, S., et al., J. Biol. Chem 266:16128-16134 (1991) por su capacidad para hidrolizar gp120 marcada con I^{121}. Se utilizó el procedimiento de la cloramina T para el marcaje con radio de gp120 electroforéticamente pura (IIIB; AIDS Research and Reference Reagente Program, NIH) seguido de una filtración por gel para la purificación de gp120-I^{121}. Se observó una única banda de gp120 radiomarcada a 120 kD con SDS-PAGE y con autorradiografía. La figura 1 es un gel de SDS-PAGE teñido con plata que muestra la pureza de la preparación de cadena L. Se incubaron las cadenas L con gp120-I^{121} y se analizaron las mezclas de la reacción mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y autorradiografía cuantitativa (Brugger, C., et al., J. Biol. Chem. 266:18358-18362 (1991). Se identificó una cadena L humana con actividad hidrolizante de gp120 (Lay2). El resto de cadenas L y de anticuerpos anti-VIP estaban desprovistos de actividad. La actividad hidrolizante de gp120 proviene de la coelución a partir de una columna de filtración en gel con el pico de la cadena L de la proteína. Se observó la escisión casi equivalente de gp120 por parte de Lay2 en tampones fisiológicos y en medios con nutrientes (salino tamponado con fosfato (PBS), solución salina tamponada de Hank (HBSS) y RPMI 1640). Fueron evidentes, por electroforesis no reductora, cuatro productos de escisión de gp120 marcadas con radio con masas de aproximadamente 80 kD, una mancha alrededor de 50 kD, 20 kD, y <6 kD. Ver Figura 2A. La banda de 80 kD pareció sufrir fragmentación bajo condiciones reductoras, sugiriendo que contenía fragmentos unidos a disulfuro. Se observaron perfiles idénticos de productos utilizando preparaciones de gp120-I^{121} derivadas a partir de cepas de VIH-1, IIIB, SF2 y MN. La banda de 80 kD radiomarcada pareció sufrir una nueva digestión bajo incubación prolongada de hasta 36 horas. Los perfiles de escisión de gp120 sin marcar y de gp120 radiomarcada fueron similares, excepto por la intensidad de las bandas individuales que fueron diferentes, lo cual, probablemente, fuera un reflejo de los procedimientos utilizados para la detección de los dos tipos de sustratos (teñido con plata versus marcaje con I^{121} en residuos Tyr seguidos por autoradiografía). Se hidrolizó con Lay2 (250 nM; 6 horas) la gp120 no marcada, aislada a partir de cepas de VIH-1 IIIB, SF2 y MN, hasta niveles similares (50, 44 y 60%, respectivamente), y se estimó las intensidades de las bandas con el Scanning cuantitativo.

La inmunotransferencia de geles reductores con un anticuerpo de anti-gp120 que reconoce los productos de la ruptura proteolítica de la proteína (Pollard, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11320-11324 (1991)) produjo bandas de productos bien definidas generadas por Lay2. Ver Figura 2B. El aumento de la hidrólisis de gp120 fue evidente a concentraciones aumentadas de Lay2, como se muestra en la Figura 3, estimado como la reducción en intensidad de la banda del sustrato de 120 kD. Esto iba acompañado de un aumento de la acumulación de los productos de 80 kD y de los otros productos de escisión.

Las estimaciones de las cinéticas obtenidas por incubación de 20 nM de Lay2 con concentraciones aumentadas de Lay2 (10-300 nM) produjeron tasas iniciales que se pudieron ajustar a la ecuación de Michaelis-Menten. El valor Km aparente de la reacción fue de 30 nM y la Vmax fue de 0,06 nmol gp120/nmolLay2/h. Se muestra comparativamente la alta afinidad de gp120 para Lay2 mediante observaciones de que la hidrólisis catalizada por tripsina analizada en reacciones en paralelo no fue saturable en concentraciones de hasta 1 \mumol, sugiriendo que la Km de tripsina para gp120 era sustancialmente mayor que el de Lay2.

No hubo hidrólisis de albúmina-I^{121} mediada por Lay2, sugiriendo que la hidrólisis de gp120 observada no es un fenómeno no específico, Figura 2A. Concentraciones aumentadas de VIP inhibieron la hidrólisis de gp120-I^{121} mediada por Lay2 (Ki aparente de VIP, 620 nM). Lay2 también hidrolizó VIP marcado con radio, con un Km de 144 nM. Basado en la comparación de sus Km para gp120 y Ki/Km para VIP, Lay2 aparece unido a gp120 alrededor de 5-21 veces mas fuertemente plegado que a VIP, gp120 tiene dos regiones cortas de homología con VIP (LaRosa, G.J., et al., Science 149:932-935 (1990); Gomy, M., et al., J. Immunol. 150:635-643 (1993)), que podrían ser fundamentales en la reactividad de ambos polipéptidos con Lay2.

El pH óptimo para la hidrólisis de gp120 por parte de Lay2 estuvo en la franja neutra, como se muestra en la Figura 4, sugiriendo la implicación de residuos de aminoácidos con valores de pKa neutros como los residuos catalíticos (Ser, Thr, Tyr, His) en presencia de un inhibidor de la proteasa sérica (0,3 mM de diisopropilfluorofosfato), la hidrólisis catalizada por Lay2 esencialmente fue inhibida por completo. En comparación, los inhibidores de las metalproteasas, proteasas de la cisteína y proteasas ácidas (EDTA, yodoacetamida, Pepstatina A) no tuvieron ningún efecto en la reacción. Estas observaciones sugieren que un residuo de Ser puede estar implicado en la hidrólisis de gp120.

Se ha determinado la secuencia de Lay2. Lay2 es un miembro del subgrupo kappa IIc. El número de residuos de Ser/Thr en los CDR de esta cadena L es inusualmente alto. La mutagénesis dirigida de una cadena L anti-VIP ha demostrado que su Ser27a y His93 son los residuos catalíticos. Un residuo de Ser está también presente en la posición 27 de Lay2. La posición 93 en Lay2 está ocupada por Glu (en vez de His en la cadena L de anti-VIP). En un modelo preliminar de Lay2 generado utilizando el programa de ordenador AbM (Martin, A.C.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)), Ser27a y Glu93 se encuentran dentro de la distancia de enlace de hidrógeno (2,9 amgstrons). Si estos residuos se unen a hidrógeno, el aumento resultante en la nucleofilicidad del residuo de Ser podría permitir su participación en la hidrólisis del enlace peptídico mediante un mecanismo análogo al que tiene lugar en la catálisis de la proteasa de serina.

Se compararon los efectos de gp120 control y gp120 tratada con Lay2 (10 \muM, 30 horas) en cuanto a la viabilidad de las células corticales del cerebro cultivadas de ratón. Como se ha referido previamente (Brenneman, D.E., et al., Nature 335:639-642 (1988)), concentraciones subpicomolares de gp120 control eran tóxicas para estas células. Brevemente, se prepararon las células corticales del cerebro a partir de ratas Wistar recién nacidas, utilizando 0,25% de tripsina para disociar el tejido. Se cultivaron las células en un medio MEM con suplemento de suero fetal de ternero al 10%. Después de 2 días, alrededor del 80% de las células eran neuronas y alrededor del 20% eran astrocitos gliales positivos a la proteína acídica fibrilar. Siguiendo el tratamiento con Lay2, se redujo la potencia de gp120 por más de 10 pliegues, correspondiendo directamente al nivel de hidrólisis. Ver Figura 5. La electroforesis y la tinción con plata de gp120 tratada con Lay2 mostraron que alrededor del 85% de la proteína había sido digerida. Lay2 control sin gp120 no manifestó un efecto neurotóxico.

Se probó Lay2 por su capacidad para inhibir la infectividad de VIH-1. Bajo condiciones libres de suero, el pretratamiento con esta cadena L catalítica inhibió de manera efectiva la infección por VIH-1 (IIIB) en células MT-2, una línea de células T, según se determinó a través de la observación microscópica de los efectos citopáticos (formación del sincitio) y del ensayo del microcultivo en tetrazolio (MTA) utilizando el hidróxido del 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)5-[(fenilamino)-2H-tetrazolio. Ver Figura 6. La multiplicidad de infección (MOI) en este experimento fue de 3,2. A valores menores de MOI, es posible que la cadena L manifieste incluso una mejor potencia. El tratamiento de las células con la cadena L en ausencia de VIH-1 no produjo un efecto citopático. Estos resultados indican que la cadena L es capaz de reconocer y romper la gp120 natural.

Ejemplo II Preparación de V_{L} de Lay2 recombinante

Como se ha mencionado previamente, el Dr. Alan Solomon, University of Tennessee proporcionó la proteína humana de Bence Jones llamada Lay2, recogida de un paciente ahora fallecido. Se hizo frente a la necesidad de un suministro regenerable del catalizador con la construcción de una forma recombinante de Lay2 en un sistema de expresión bacteriano. Se espera que esto permita la manipulación genética de derivados de Lay2 con características catalizadoras mejoradas.

En la patente U.S. Nº. 5.229.272, se ha descrito la clonación y el aislamiento con éxito de una cadena L con actividad contra el péptido intestinal vasoactivo, cuya completa descripción está incorporada como referencia en el presente documento.

Se ha determinado previamente la secuencia del dominio variable de la cadena L de Lay2 en el laboratorio del Dr. Solomon. La porción codificada de exón V difiere de aquella de uno de los tres genes de línea germinal (011-01) (Klein, R., et al., Eur. J. Immunol. 23:3248-3271 (1993)) que codifican la familia de cadenas L II humanas en seis posiciones. De estas diferencias, que presumiblemente reflejan mutaciones somáticas, una implica una posición CDR. En la posición 92 de CDR3, Lay2 tiene un residuo Leu en vez de IIe. Las cinco diferencias restantes entre la proteína Lay2 y el gen 011-01 implican los sitios FR lejanos de los segmentos CDR; Lay2 también tiene un residuo adicional, Glu, en la posición 0, que representa una séptima variación de significado desconocido. Es notable la similitud entre la secuencia de Lay2 y la secuencia 011-01 de línea germinal, en eso se podría reflejar la capacidad de otros dominios V_{L} derivados de este gen de línea germinal de unirse e hidrolizar gp120.

Se ha sintetizado el ADNc que codifica la proteína del dominio V_{L} de Lay2 por medio de PCR recursiva. Ver Figura 7. Se podría expresar la forma recombinante de la proteína completamente funcional tal como la descrita más abajo. Se han utilizado previamente estos procedimientos para construir con éxito genes que codifican dominios humanos variables (Wilkins-Stevens. P., et al., Prot. Science 4:421-432 (1995). Brevemente, la construcción del ADNc del dominio V_{L} implica el uso de PCR recursiva (Prodromou, C., et al., Prot. Eng. 5:827-829 (1992)) para unir ocho oligonucleótidos sintéticos solapados que proporcionan codones que se extendien al dominio V_{L} completo, una secuencia señal N-terminal y secuencias flanqueadoras que contienen los sitios de restricción Sfil y Notl para permitir la inserción en un vector de expresión. El ADNc también incluye un segmento corto C-terminal de unión que se usa para construir un Fv.

Ejemplo III Aislamiento de los anticuerpos catalíticos de gp120 de pacientes con sida y sle y sus productos recombinantes

Se aisló la cadena L descrita en la sección anterior mediante cribado aleatorio de pacientes con mieloma múltiple. Se sabe que los anticuerpos catalíticos se forman a altos niveles en enfermedades autoinmunes como el Lupus, y se han encontrado anticuerpos unidos a gp120 en pacientes con SLE. Esta observación nos ha motivado a analizar pacientes seropositivos con VIH-1 y pacientes con Lupus por la presencia de anticuerpos catalíticos de gp120.

La fracción IgG purificada a partir del suero (-0,5 ml) de pacientes con SIDA y de pacientes con SLE se purificó mediante cromatografía en DEAE-celulosa (DE52 matrix, Whatman) o Sefarosa-Proteína G (Pharmacia) en 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,002% de azida sódica. Se obtuvieron las fracciones de IgG como material no unido a partir de la columna de DEAE-celulosa y como proteína ácida eliminada a partir de la columna de Proteína G. La eliminación se hizo utilizando 100 mM de glicina, a pH 2,7, seguida de una neutralización de la solución con base Tris 1M, a pH 9,0. Desde que se sabe que las preparaciones de IgG contienen pequeñas cantidades de cadenas L libres, la IgG purificada con celulosa-DEAE se somete a otra cromatografía en columna de filtración en gel de alta resolución (Superosa-12, Pharmacia) en 50 mM de Tris-HCl, 100 ml de glicina, 150 mM de NaCl, 0,025% de Tween 20, 0,02% de azida sódica, a pH 7,5 (velocidad de flujo 0,5 ml/minuto; tamaño de fracción 0,5 ml). Se identificaron las cadenas L presentes en la IgG purificada mediante la celulosa-DEAE como la fracción que se elimina con masa de 25 kD basada en la calibración de la columna con proteínas estándares con masa conocida. Se obtuvieron las concentraciones de proteínas mediante la medición de la absorbancia de la luz ultravioleta a 280 mn (0,8 mg/ml de solución de proteína da una lectura de 1,0 de densidad óptica a 280 mn utilizando una cubeta de longitud de recorrido de 1 cm). Se midió la escisión de gp120 mediante electroforesis SDS y autoradiografía como se describe en la sección anterior.

Los sueros descritos arriba son policlonales. Se podría llevar a cabo la resolución de cadenas L individuales utilizando dos electroforesis en gel dimensional seguidas de electroelución de las cadenas L individuales. Un vez aisladas las cadenas L del monómero, se llevaría a cabo un péptido amino terminal secuenciante para generar sondas de oligonucleótidos específicos con el propósito de clonar.

La Figura 8 muestra que la incubación de gp120-I^{125} (2 nM) con IgG (3 \muM) purificada con sefarosa de proteína G a partir de un paciente con SLE (código de laboratorio #530) durante 18 horas a 37ºC terminó con la aparición de productos de escisión de gp120 que corresponden a una mancha a alrededor de 110 kD y bandas de resolución con masas de 37 kD, 24 kD y 10 kD. La gp120 intacta es evidente como la banda de 120 kD. La mancha de 110 kD podría ser una mezcla de polipéptidos o podrían ser unos productos individuales que están demasiado próximos en masa a gp120 intacta para permitir su separación limpia mediante los procedimientos experimentales aplicados en este experimento.

La Figura 9 muestra la incubación de gp120-I^{125} (2 nM) con cadenas L purificadas a partir de un paciente VIH positivo (código de laboratorio #005) durante 17 horas a 37ºC que terminó con la aparición de con la aparición de productos de escisión de gp120 que corresponden a 90 kD, 25 kD, 12 kD y < 10 kD. Fracciones similares de cadenas L procedentes de controles negativos de VIH no manifestaron actividad de escisión de gp120. Se sabe que las concentraciones de cadenas L en preparaciones de IgG como la utilizada para la filtración en gel de este experimento, son muy pequeñas. La electroforesis-SDS y la tinción con plata mostraron que la concentración de cadena L en esta fracción de IgG fue de < del 1,5%. Se puede calcular la actividad específica (% escisión de la concentración de gp120/proteína) de las cadenas L utilizadas como catalizadoras, para que sea por lo menos 112 pliegues más grande que la cadena L del anticuerpo catalítico de Lay2 descrita en la sección precedente.

Estas observaciones demuestran que la síntesis de cadenas L con actividad de escisión de gp120 podría ser un componente bastante común de la respuesta inmune en pacientes con VIH-1 y SLE. Se puede obtener un suministro regenerador de cadenas L clonando el repertorio inmune de los pacientes arriba mencionado utilizando técnicas que han conseguido aislar con éxito las cadenas L que cortan VIP procedentes de un paciente con asma, como se describe en Gao et al., en Antibody Engineering Protocols paginas 51:286-291, ed. S. Paul, Humana Press, Totowa, NJ, (1995).

Se pueden aislar rápidamente anticuerpos poco comunes mediante cromatografía de afinidad específica del ligando de partículas de fago, que muestran fragmentos de anticuerpos recombinantes en su superficie, como las proteínas de fusión del gen III. Se ha preparado una biblioteca de fagos que exhiben cadena VL a partir de linfocitos de sangre periférica de un paciente con asma (Tyutyulkova, S. et al., Appl. Biochem. Biotech. 47:191-198 (1994); Tyutyulkova, S. et al., en Antibody Engineering Protocols, páginas 5121:377-394, ed. S. Paul, Humana Press, Totowa, NJ, (1995). En estos experimentos, se enriquecieron las partículas de fago con actividad de unión a VIP mediante cromatografía de afinidad sobre VIP inmovilizado. Se expresaron, en E. coli, dos cadenas L que se unen a VIP en forma soluble, se dedujo su estructura primaria mediante secuenciación de ADNc y se purificaron las proteínas hasta la homogeneidad electroforética mediante quelación con metal y cromatografía de afinidad con proteína L.

Se midió la actividad proteolítica de las cadenas L utilizando el sustrato de VIP (Tir10-I^{125}). Fue evidente un aumento lineal de la hidrólisis de VIP con concentraciones incrementadas de cadenas L recombinantes. La reacción de ambas cadenas L mostró cinéticas de saturación con respecto a la concentración del sustrato. Las eficiencias cinéticas (kcat/km), utilizando VIP como sustrato, fueron mejores o comparables a la de la tripsina, una proteasa altamente desarrollada. Las cadenas L no catalizaron el corte de resorufina, un sustrato no específico de proteasa. La forma monomérica de la cadena L fue la responsable de la hidrólisis de VIP, se demostró con la pérdida de la actividad a -26 kD a partir de una columna de filtración en gel.

Se pueden adaptar procedimientos similares para clonar y expresar las cadenas L de los pacientes con VIH y con SLE descritos arriba. Se recogerían linfocitos de sangre periférica, y ADNc de cadena L preparada mediante el procedimiento PCR de transcriptasa inversa. Se clonarían entonces los productos de PCR en el vector del fago pCANTABhis6, que permite la manifestación de las cadenas L en la superficie de las partículas de fago o su expresión como proteínas solubles. Después de la electroporación de células TG1 de E. coli competentes con ADN del fago, se rescataron partículas de fago que mostraban cadenas L fusionadas a proteína 3 mediante una superinfección con el fago auxiliar VCSM13, precipitado con polietilenglicol y sujeto a cromatografía de afinidad sobre una columna de gp120-sefarosa. Se aislarán clones mediante elución a pH bajo y se probará su unión a gp120 mediante radioinmunoensayo y/o ELISA. Los clones crecerían en células de E. coli y se inducirían los cultivos con IPTG (1 mM) durante 24 horas para permitir la secreción de las cadenas L solubles en el sobrenadante. Se podrían expresar las cadenas L en el espacio periplásmico reduciendo el periodo de inducción con IPTG de 24 a 3 horas.

Como se ha mencionado previamente, los anticuerpos catalíticos se sintetizan como respuesta a la inmunización con sustrato. Se ha clonado una librería de cadenas L de anticuerpo a partir de un ratón inmunizado con VIP. Se determinó la actividad proteolítica de los clones de cadena L seleccionadas aleatoriamente o seleccionadas basándose en su actividad de unión al antígeno. Se hizo la selección mediante cromatografía de fagos sobre VIP inmovilizada. Se aislaron potentes catalizadores capaces de hidrolizar VIP (Tir10-I^{125}) y sustratos de proteasa genérica (péptido-metil-courmarinamidas). Los clones que se seleccionaron basándose en su actividad de unión a VIP mostraron una catálisis aumentada en 1-2 órdenes de magnitud. El aumento de la actividad catalítica se debió a un aumento en la afinidad de unión a VIP. Los números renovados utilizando VIP como sustrato oscilaron entre 0,1-2,2/min. Aproximadamente el 20% de las cadenas L purificadas a partir de 156 clones seleccionados aleatoriamente ensayadas en proteína 10 nM, mostraron actividad catalítica utilizando un péptido sintético como sustrato. Se ha secuenciado la región variable de doce cadenas L y ahora se buscan secuencias consensuadas y motivos espaciales asociados a la actividad catalítica. Estas observaciones muestran catálisis frecuentes por parte de un repertorio de cadenas L naturales de anticuerpo y el desarrollo de la actividad catalítica específica de antígeno por parte de la inmunización con un polipéptido. Esto podría ocurrir por el desarrollo de novo de actividad catalítica debido a la diversificación de la secuencia de la región variable o su herencia como una actividad de línea germinal y el mantenimiento de la alta afinidad para el inmunogen durante la maduración.

La infección con VIH-1 induce una respuesta inmune masiva. La clonación de una librería de cadenas L a partir de linfocitos del paciente arriba descrito, utilizando los procedimientos expuestos en el presente documento para la clonación de cadena L de VIP, probaría también con éxito el aislamiento de un suministro rellenable de anti-gp120 que hidrolice cadenas L de anticuerpo.

Ejemplo IV Tratamiento de pacientes con cadenas L de la invención que hidrolizan la gp120

Se podrían administrar los anticuerpos de cadena L catalíticos anti-gp120 a los pacientes en un excipiente farmacéuticamente adecuado para reducir los niveles de antígeno de gp120 soluble en el cuerpo.

Se ha revisado al detalle el uso clínico de inmunoglobulina para su administración vía intravenosa (IVIG). Ver, por ejemplo, Dietrich et al., Blood 79:2946-51 (1992); Rossi et al., Immunol. Rev. 110:135-149 (1989); Dwyer, J.M., New Eng. J. Med. 326:107-16, (1992); Schwartz, S.A., J. Clin. Immunol. 10:81 (1990).

Se administrarían por vía i.v. las cadenas L purificadas de la presente invención que hidrolizan gp120 a los pacientes para reducir los niveles de VIH-1 soluble y de gp120 en el cuerpo. Se ajustarían las dosis de acuerdo con la carga vírica del paciente, y podrían oscilar entre 1/100 veces la carga vírica con los niveles estequiométricos (1:1). Se podrían requerir dosis sustancialmente menores para la neutralización del virus debido a que las cadenas L son catalíticas. Se sabe que las dosis de inmunoglobulina que oscilan entre 0,25-1 g/kg de peso corporal son seguras. Se mediría la eficacia analizando los niveles de gp120 soluble mediante ELISA antes y después del tratamiento.

Alternativamente, se administrarían los anticuerpos que hidrolizan gp120 directamente a los cerebros de los pacientes con demencia asociada a SIDA. Se ha descrito en la literatura la introducción de los agentes terapéuticos en el cerebro. Ver, por ejemplo, Harbaugh, R.E., Biomed. Pharmacother, 43:483-485 (1989); Johnson et al., J. Neurosurg. 70:240-248 (1989); Giannone, L., et al., J. Clin. Oncol. 4:68-73 (1986).

Se podrían introducir las cadenas ligeras que hidrolizan gp120 directamente en el compartimiento intraventricular mediante una cánula y, alternativamente, se podrían conjugar con una molécula de transferrina e introducirlas por vía i.v. Se conoce muy bien, en la materia, la construcción de proteínas de fusión. Se unirían operativamente las secuencias genéticas que codifican la cadena L catalítica de la invención con las secuencias genéticas que codifican la transferrina. Se ha demostrado que la transferrina es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y de este modo podría introducir eficazmente la cadena L de la invención en el cerebro. (Shin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:2820-2824 (1995).

Claims (9)

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   1. Anticuerpo catalítico humano aislado que cataliza la escisión de un enlace peptídico en la glicoproteína 120 del Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH), siendo obtenible dicho anticuerpo a partir del suero de humanos infectados con el VIH o partir de pacientes con SLE.
2. 2. Anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo es una IgG.
3. 3. Fv producida de manera recombinante utilizando ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2.
4. 4. Procedimiento para aislar un anticuerpo humano catalítico que cataliza la escisión de gp120, que comprende las etapas de:

   a)

   cribar muestras de suero humano para la presencia de dicho anticuerpo catalítico humano al ser analizadas por la generación productos de escisión de dicha gp120 inferiores a 120 kd; y

   b)

   purificar dicho anticuerpo;

   donde dicho suero procede de un paciente infectado con el VIH-1 o procede de un paciente con SLE.
5. 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, comprendiendo dicho procedimiento además las etapas de:

   c)

   determinar la secuencia genética del anticuerpo catalítico humano;

   d)

   insertar dicha secuencia que codifica el anticuerpo catalítico humano en una célula;

   e)

   expresar dicho anticuerpo en dicha célula.

6. 6. Procedimiento para producir un anticuerpo catalítico anti-gp120 a partir del suero de humanos infectados con VIH-1 o de pacientes con SLE que comprende:

   a)

   aislar el ARNm de linfocitos de sangre periférica de dicho humano;

   b)

   generar un ADNc a partir de dicho ARNm utilizando la transcriptasa inversa-PCR;

   c)

   insertar dicho ADNc en un vector utilizando sitios adecuados de restricción; y

   d)

   incorporar dicho vector en un fago, de manera que se expresan las secuencias de ADNc y las proteínas recombinantes se exhiben en la superficie de dicho fago;

   e)

   aislar las partículas de fago que expresan dicha actividad catalítica anti-gp120 mediante cromatografía en columna;

   f)

   transformar E. coli con dicho fago que expresa dicha actividad catalítica de gp120; y

   g)

   purificar dichos anticuerpos catalíticos anti-gp120 de dichas células de E. coli transformadas.

7. 7. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde el anticuerpo es una IgG.
8. 8. Uso de un anticuerpo catalítico humano de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o de una Fv de acuerdo con la reivindicación 3, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente VIH-1positivo, donde la preparación de un medicamento que comprende una Fv de acuerdo con la reivindicación 3 comprende:

   a)

   unir operativamente una secuencia genética que codifica dicha Fv con una secuencia que codifica transferrina;

   b)

   transformar una célula con dichas secuencias genéticas unidas operativamente de manera que se sintetiza una proteína de fusión;

   c)

   purificar dicha proteína de fusión, y

   d)

   preparar un medicamento que comprende dicha proteína de fusión para administrar a un paciente con un portador farmacéutico apropiado.

9. 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 de un anticuerpo catalítico humano de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicho anticuerpo, se administra vía i.v. a una dosis que oscila entre 0,1-1 g/kg de peso corporal.