ES2283053T3 - Inmunoestimulacion topica para inducir la migracion celular de langerhans. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un kit de partes que contiene: - un antígeno - unos medios para intensificar la penetración de dicho antígeno a través de la epidermis o del epitelio de un mamífero, siendo dichos medios un disolvente lipofílico y/o un estímulo físico seleccionado de entre el grupo constituido por un ultrasonido de baja frecuencia y un campo eléctrico; - un inductor de la migración celular de Langerhans, que comprende un compuesto de la forma de en el que R1 y R2 son independientemente cadenas laterales de alquilo o de arilo que contienen de 1 a 16 átomos de carbono para la preparación de un medicamento para intensificar la respuesta inmune contra dicho antígeno en un mamífero mediante administración tópica.
Description
Inmunoestimulación tópica para inducir la
migración celular de Langerhans.
La primera línea de defensa del cuerpo contra
patógenos es la piel. La capa más externa, el estrato córneo, es
una zona ancha de 20 a 30 capas de células de espesor. Las células
muertas restantes que comprenden el estrato córneo están casi
completamente rellenas de fibrillas de queratina y rodeadas por
bicapas lipídicas altamente ordenadas. Siempre que la epidermis no
esté rota, el estrato córneo densamente queratinizado presenta una
barrera física formidable para la entrada de la mayoría de
sustancias foráneas. Las membranas mucosas que recubren los tractos
digestivo, respiratorio, urinario y reproductivo, proporcionan una
barrera física similar, pero menos formidable, careciendo del
estrato córneo grueso.
Las capas subyacentes del epitelio tanto en la
piel como en las membranas mucosas están altamente pobladas con
células dendríticas inmaduras, denominadas células de Langerhans.
Estos leucocitos fagocíticos están listos para la captura de
antígenos que pueden entrar en los estratos inferiores de la
epidermis a través de brechas físicas en el estrato córneo. Después
de un trauma físico en la piel, se generan señales que inducen a las
células de Langerhans a dejar el epitelio y migrar a través de los
nodos linfáticos aferentes a los nodos de linfa, llevando consigo
cualquier antígeno que hubiera penetrado el estrato córneo protector
(es decir, vírico, bacteriano, parasítico, alergénico). Pueden
penetrar en el estrato córneo intacto moléculas lipofílicas, muy
pequeñas, y algunas moléculas altamente reactivas conocidas como
agentes sensibilizadores de la piel, tales como TNCB, catecol de
hiedra venenosa, oxazolona, etc., uniéndose posteriormente a las
proteínas de la epidermis subyacente y activando las células de
Langerhans.
Los antígenos de proteína capturados se
interiorizan y se degradan mediante las células de Langerhans para
proporcionar péptidos pequeños que se incorporan en los surcos de
unión de proteína de moléculas MHC. Los complejos
MHC-péptido se insertan a continuación en las
membranas de plasma para la presentación a los receptores de
células T. Durante su migración a los nodos de linfa, las células de
Langerhans se diferencian en células dendríticas linfoideas
maduras, perdiendo sus propiedades fagocíticas y en su lugar,
expresando niveles elevados de moléculas MHC de clase I y II además
de moléculas coestimuladoras y de adhesión, esenciales para la
presentación del antígeno eficaz (Udey, Clin. Exp. Immunol.
107:6-8, 1997). Aunque en la actualidad es bien
conocido que las células de Langerhans migran desde el epitelio a
las áreas de las células T de los nodos de linfa drenantes, se
conoce relativamente poco sobre las señales que inducen la migración
y la diferenciación de las células de Langerhans. En cualquier
caso, una vez en los nodos de linfa, las células de Langerhans
diferenciadas que contienen los complejos de
MHC-péptido activan principalmente las células T
auxiliares CD4+ y las células T citolíticas CD8+. Estas células de
Langerhans diferenciadas nuevamente que son recientes inmigrantes a
los nodos de linfa son los inductores más potentes de la inmunidad
de células T que se conoce.
Recientemente se ha demostrado que las células
dendríticas de ratón o de humano expuestas a antígenos o péptidos
de tumor son inductores eficaces de la inmunidad específica de tumor
que pueden eliminar o incluso suprimir tumores establecidos (Young
e Inaba, J. Exp. Med. 183:7-11, 1996; Zitvogel et
al., J. Exp. Med 183:87-97, 1996; Celluzzi
et al., J. Exp. Med 183:283.287, 1996; y Paglia et al., J.
Exp. Med 183:317-322, 1996). En estos estudios,
se cultivaron las células dendríticas de médula de hueso o sangre,
se expandieron en un tejido de cultivo, se expusieron a antígenos
de tumor in vitro, y se reinyectaron finalmente i.v. en el
donador. Tal terapia individualizada es necesaria en una población
criada fuera para asegurar que las moléculas MHC singeneicas
apropiadas se utilizan para células T y células tumorales objetivo
del individuo. Aunque elevadamente eficaz, este procedimiento
individualizado es demasiado engorroso, consume mucho tiempo y
resulta caro para ser una medida terapéutica de amplia
aplicación.
Se describe un procedimiento de vacunación
tópica para intensificar una respuesta inmune contra un antígeno.
Los antígenos de tumores, patógenos víricos y bacterianos, además de
parásitos están comprendidos dentro del alcance de la presente
invención. El procedimiento implica la administración del antígeno
junto con: 1) un medio para intensificar la penetración del
antígeno a través de la piel o de membranas mucosas, y 2) un agente
para inducir la migración de las células de Langerhans a los nodos
de linfa. El antígeno es preferentemente un péptido de
3-20 residuos de aminoácidos de longitud, y más
preferentemente, el péptido contiene 8-14 residuos
de aminoácidos. El antígeno se administra preferentemente a una
concentración que está en el intervalo de aproximadamente 1
\mug/ml a aproximadamente 100 mg/ml.
Los medios para intensificar la penetración del
antígeno incluyen, la utilización de un vehículo lipofílico o un
intensificador de penetración, tal como el sulfóxido de dimetilo
(DMSO) o azona, ultrasonido de baja frecuencia, electroporación,
iontoforesis, administración intraepidérmica y combinaciones de los
mismos. Preferentemente, la penetración del péptido en el estrato
córneo se facilita con sulfóxido de dimetilo en combinación con uno
de los medios de administración transdérmica física.
Los agentes que inducen la migración de las
células de Langerhans se seleccionan de entre el grupo constituido
por ftalato de dibutilo, D-tartrato de dibutilo,
N,N-dietil-toluamida, fumarato de
dibutilo, fumarato de di(2-etilhexilo),
maleato de diisooctilo, maleato de dietilhexilo, fumarato de
diisooctilo, ácido benzoico, cloruro de benzalconio, alcanfor,
maleato de bihenilo, ftalato de dioctilo, maleato de dibutilo,
maleato de dioctilo, succinato de dibutilo, succinato de dioctilo,
ftalato de dinonilo, ftalato de diisononilo, ftalato de dimetilo,
ftalato de dietilo, ftalato de dipropilo, ftalato de difenilo,
ftalato de dibencilbutilo y ftalato de dietilmetilo. El ultrasonido
de baja frecuencia se puede utilizar asimismo como un inductor de la
migración de las células de Langerhans. Preferentemente, se
administra ftalato de dibutilo para inducir la migración de las
células de Langerhans.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 ilustra el efecto de los diversos
regímenes de tratamiento sobre las células dendríticas linfoideas
totales y FITC+ después de dos días de tratamiento.
La figura 2 muestra la cinética de la migración
de las células de Langerhans en respuesta a FITC en acetona y en
ftalato de dibutilo.
La figura 3 muestra el efecto de la
administración tópica de FITC en acetona y en ftalato de dibutilo
sobre el número total de células dendríticas del nodo de linfa.
La figura 4 muestra la inhibición pobre del
crecimiento del tumor EG7-OVA mediante la
administración tópica cutánea del péptido de tumor SIINFEKL en
acetona y en ftalato de dibutilo.
La figura 5 ilustra la inducción de la inmunidad
específica de tumor EG7-OVA completa mediante la
aplicación tópica intravaginal de SIINFEKL en acetona y en ftalato
de dibutilo.
La figura 6 muestra la inhibición del
crecimiento del tumor EG7-OVA completa mediante la
administración tópica cutánea de SIINFEKL en DMSO, seguida de
ftalato de dibutilo en acetona.
La figura 7 muestra el efecto de inductores
potenciales diversos de la migración de las células de Langerhans
en el ensayo de selección de FITC.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, se administra
tópicamente un antígeno para la absorción por las células de
Langerhans propias del individuo. Se prefiere incluir un disolvente
lipofílico para facilitar la penetración del antígeno a través del
estrato córneo y de la epidermis subyacente. En una forma de
realización de la presente invención, un estímulo físico, tal como
un ultrasonido de baja frecuencia o un campo eléctrico, se puede
aplicar a la piel siguiendo la administración tópica, para
intensificar la penetración del antígeno a través del estrato
córneo. La administración del antígeno a la piel se acompaña de la
aplicación tópica de un(os) agente(s)
adicional(es), tal como el ftalato de dibutilo, que induce
la migración de las células de Langerhans al nodo de linfa
drenante.
El isotiocianato de fluoresceína (FITC) se ha
utilizado ampliamente por el presente inventor y por otros, para
caracterizar la migración de las células de Langerhans. El FITC es
una molécula lipofílica mayor, no peptídica, pequeña (peso
molecular 389), capaz de cruzar el estrato córneo. La
inmunogenicidad de FITC se debe a la reactividad de su grupo
isotiocianato (-N-C-S) con los
grupos amino libres, permitiendo que se una covalentemente a las
proteínas y/o péptidos. Los ratones C57BL/6 recibieron los
tratamientos siguientes: 1) ninguno; 2) sólo afeitado del abdomen;
3) administración tópica de FITC en acetona; 4) administración
tópica de FITC en acetona y en aceite de oliva; 5) administración
tópica de FITC en acetona y en DMSO diluido en salino regulado por
fosfato (PBS); y 6) administración tópica de FITC en acetona y en
ftalato de dibutilo. A continuación se examinaron cada día los
nodos de linfa inguinales drenantes para las células de Langerhans
inmigrantes mediante inmunofluorescencia por citometría de flujo. Se
identificaron las células de Langerhans migratorias por la
presencia de FITC y por la expresión de moléculas MHC de clase II
elevadas o por anticuerpos monoclonales específicos de células de
Langerhans (NLDC-145). Se podrían diferenciar
asimismo otras células dendríticas residentes de los nodos de linfa
utilizando un anticuerpo monoclonal específico de célula dendrítica,
33D1. Se observaron la absorción de FITC y la respuesta de las
células de Langerhans a las señales migratorias en el nodo de linfa
drenante tan pronto como a las seis horas después de la
administración tópica. Sin embargo, se requirieron
48-72 horas para una velocidad de inmigración máxima
en el nodo de linfa. La figura 1 ilustra el efecto de regímenes de
tratamiento diversos sobre las células dendríticas linfoideas FITC +
y totales 2 días después del tratamiento. En animales a los que se
administró FITC en acetona, no se produjo intensificación en el
número de células de Langerhans FTIC+ inducidas por aceite de oliva
o por sulfóxido de dimetilo (DMSO), aunque el DMSO tuvo un modesto
efecto estimulador sobre la inmigración no específica, sugiriendo
que el contacto del antígeno y la migración de las células de
Langerhans se regulan independientemente. La adición de ftalato de
dibutilo tuvo un efecto impresionante tanto sobre la migración de
células dendríticas FITC + como en el total en el nodo de linfa. De
esta manera, el ftalato de dibutilo fue un inductor de migración muy
potente.
En ratones tratados con FITC en acetona y en
ftalato de dibutilo, la cinética de la migración de las células de
Langerhans se muestra en la figura 2. Estuvo presente un elevado
número de células de Langerhans FITC+ en el nodo de linfa durante
12 horas y la frecuencia de pico de células de Langerhans FITC+
inmigrantes ocurrió aproximadamente de 2 a 3 días después de la
administración tópica. Se observa, sin embargo, que además de
inducir la migración de células de Langerhans FITC+, el número de
células dendríticas sin marcar se incrementó asimismo notablemente,
alcanzando niveles de pico 9-10 días después del
tratamiento. Las células dendríticas sin marcar eran lo más
probable células de Langerhans que habían perdido la marca FITC. Las
células de nodo de linfa totales en respuesta a la administración
tópica se muestran en la figura 3. Cinco días después de la pintura
de la piel, la población celular de nodo de linfa se había
incrementado aproximadamente en 7,2 veces sobre los niveles de la
línea de base. Estos resultados indican que el antígeno (FITC) en
acetona y en ftalato de dibutilo no solo estimuló la migración
celular de Langerhans antígeno +, sino que resultó además en una
respuesta espectacular de células T y B en el nodo de linfa
drenante.
drenante.
La línea celular de tumor de timoma C57BL/6,
EL4, se transfectó con el gen completo de ovoalbúmina de pollo
(OVA). La línea celular transfectada resultante,
EG7-OVA, expresa la ovoalbúmina de pollo. Un péptido
de ocho aminoácidos, OVA 257-264, con la secuencia,
SIINFEKL, se expresa en la molécula K^{b} MHC de clase I, en la
que se ha demostrado que funciona como un antígeno de péptido
asociado a un tumor para CD8+CTL tanto in vivo como in
vitro (Celluzzi et al., J. Exp. Med 183:283 (1996)).
Basándose en los resultados positivos utilizando FITC, los
presentes inventores siguieron un protocolo similar en un intento
para inducir la inmunidad del tumor EG7-OVA
mediante la administración tópica del péptido, asociado a tumor
SIINFEKL sintético, bien caracterizado.
Los ratones C57BU6 se trataron como sigue: 1)
solo afeitado; 2) administración tópica de acetona y de ftalato de
dibutilo; 3) SIINFEKL (240:g/ml) en DMSO diluido en PBS, seguido de
5 horas en acetona y en ftalato de dibutilo; y 4) SIINFEKL
(240:g/ml) en acetona y en ftalato de dibutilo. Posteriormente, se
inyectaron a todos los ratones subcutáneamente 5 x 10^{5} de
células EG7-OVA (5 veces la dosis tumorigénica
mínina). La inmunidad específica de tumor se monitorizó midiendo el
tamaño del tumor. Los resultados que se muestran en la figura 4,
indican que ninguno de los protocolos de tratamiento fue eficaz en
la inhibición del crecimiento de las células de tumor. Desde que se
conoció a partir de los experimentos de FITC que el ftalato de
dibutilo era un potente inductor de migración de las células de
Langerhans y que el SIINFEKL se incorporaba fácilmente en la
molécula K^{b} MHC de clase I en la que se activaban CD8+ CTL
(Celluzzi et al., J. Exp. Med. 183:283 (1996)), se concluyó
que el péptido SIINFEKL no consiguió atravesar el estrato
córneo.
Desde que se postuló que la administración
tópica de SIINFEKL en acetona y en ftalato de dibutilo fallaba en
conferir la inmunidad específica de tumor porque el péptido no
penetró en el estrato córneo, se aplicó intravaginalmente la misma
vacuna tópica. Las membranas mucosas carecen de la barrera
resistente colocada por el estrato córneo. Los resultados que se
muestran en la figura 5 sugirieron que la protección completa
contra el tumor se indujo mediante SIINFEKL en acetona y en ftalato
de dibutilo. La línea celular madre de tumor EL4, carecedora de
ovoalbúmina de pollo, se utilizó como control positivo; no se
observó inmunidad contra las células de tumor EL4. De este modo, se
confirmó la hipótesis de los presentes inventores en cuanto a la
penetración del estrato córneo; el péptido SIINFEKL no alcanzaba las
células de Langerhans subyacentes en el estrato córneo.
Aunque la administración tópica intravaginal del
antígeno de tumor proporcionó un medio de recorrido eficaz de
antígeno a las células de Langerhans para la posterior inducción de
la inmunidad específica de tumor, los sitios de aplicación de
membrana mucosa, como la vagina, no son bien adecuados para la
utilización y la monitorización convenientes por médicos generales
que se involucran probablemente en la administración de vacunas
tópicas de la presente invención. De este modo, para intensificar
la eficacia de la administración tópica cutánea, se disolvió
SIINFEKL en DMSO y se aplicó a la piel sin dilución. Se aplicó
ftalato de dibutilo en acetona al mismo sitio 5 horas más tarde.
Posteriormente se les inyectó subcutáneamente 5 x 10^{5} de
células EG7-OVA a todos los ratones. Los resultados
que se muestran en la figura 6, indican que el péptido en DMSO fue
capaz de atravesar el estrato córneo, obteniendo eficazmente acceso
a las células de Langerhans. El crecimiento de tumor se suprimió
después de 6 a 9 días e incluso los tumores establecidos se
eliminaron completamente 16 días después de la inoculación. De este
modo, el péptido específico de tumor, SIINFEKL, en DMSO concentrado,
penetró el estrato córneo, se incorporó en la molécula K^{b} MHC
de clase I sobre las células de Langerhans de la epidermis y en
presencia del inductor de migración, ftalato de dibutilo, se
presentó eficazmente a CD8+ CTL en los nodos de linfa.
"Antígeno" tal como se utiliza en la
presente memoria, incluye cualquier molécula que cuando se
administra según la presente invención es capaz de provocar la
inmunidad específica de antígeno. En consecuencia, el antígeno o un
fragmento del mismo debe ser capaz de (1) penetrar la piel o la
membrana mucosa, (2) interactuar con las células de Langerhans en
la epidermis o epitelio de membranas mucosas, (3) asociarse por
completo o en parte con una molécula MHC de clase I o II sobre una
célula de Langerhans, y (4) activar los receptores de célula T
sobre células T CD4+ o CD8+, confiriendo inmunidad específica de
antígeno. Más particularmente, el procedimiento de vacunación
tópica de la presente invención se dirige hacia los antígenos de
células tumorales, patógenos víricos y bacterianos y
parásitos.
parásitos.
Se prefieren particularmente antígenos de
péptido pequeños, aunque no esenciales, ya que es más fácil que
atraviesen péptidos más pequeños (aproximadamente de 3,20 residuos
de aminoácidos) a través del estrato córneo y de la epidermis que
proteínas mayores. Además, los péptidos de tamaño adecuado, como
SIINFEKL, es más probable que se unan directamente a las moléculas
MHC sobre la superficie de la célula de Langerhans a través del
procedimiento de intercambio de péptido, en el que los péptidos
añadidos exógenamente sustituyen los péptidos endógenos, que pueden
mostrar una afinidad inferior para el surco de unión de péptido de
las moléculas MHC de clase I o II. Se han estudiado ampliamente las
características de péptidos adecuados para la asociación directa con
las moléculas MHC de clase I o II. De este modo, los expertos en la
materia serían capaces de predecir, basándose en la estructura del
péptido, secuencias probables para la asociación con un MHC dado.
Los péptidos que se unen eficazmente a las moléculas MHC de clase I
comprenden por lo general de aproximadamente 8-9
residuos de aminoácidos, mientras que los péptidos que se asocian
preferentemente con las moléculas MHC de clase II tienen una
longitud de aproximadamente 11-14 residuos de
aminoácidos. De hecho, se conocen algunos péptidos de antígeno
capaces de interactuar directamente con las moléculas MHC sobre las
células dendríticas y se pueden sintetizar mediante técnicas
estándar.
De forma alternativa, aunque los antígenos
asociados a tumor específico se han identificado por muchos tumores
humanos, a menudo se desconocen los péptidos relevantes. Sin
embargo, se pueden preparar rápida y fácilmente los péptidos de
tumor eluídos con ácido puro y se ha demostrado que son eficaces
inductores de la inmunidad específica de tumor cuando se asocian
con células dendríticas (Zitvogel et al., J. Exp. Med.
183:87-97, 1996). De este modo, preparaciones
homogéneas de péptidos sintéticos, además de mezclas desconocidas de
péptidos extraídos, ambas conocidas, pueden ser adecuadas para
utilizar en la presente invención. La elección y la preparación de
los antígenos de péptido adecuados resultarán evidentes para los
expertos en la materia. Ver a continuación para una descripción
detallada de los ejemplos de trabajo específicos.
Los compuestos inmunogénicos no peptídicos
capaces de inducir la inmunidad específica se contemplan asimismo
como antígenos potenciales según la presente invención. Los haptenos
no peptídicos pequeños se pueden unir covalentemente a los péptidos
o proteínas después de cruzar el estrato córneo, por medio de lo
cual obtienen el acceso a rutas de presentación de antígeno
estándar, por medio de la asociación con una molécula MHC. Por
ejemplo, la inmunogenicidad de FITC se demostró que se debía a la
reactividad de su grupo isotiocianato
(-N-C-S) con grupos amino libres,
permitiendo que se incorpore covalentemente dentro de proteínas y/o
péptidos. De esta manera, las mitades antigénicas no peptídicas, de
células de tumor, patógenos, parásitos, alérgenos, etc., se pueden
utilizar en la práctica de los procedimientos de vacunación tópica
de la presente invención.
Se debería apreciar que la elección de la fuente
de antígeno no es crítica para la presente invención, siendo un
procedimiento general para intensificar la inmunidad específica de
antígeno. Sin embargo, la respuesta inmune específica obtenida,
dependerá, por supuesto, del antígeno utilizado en particular. Es la
forma de la administración tópica, la penetración del estrato
córneo, la inducción de la migración celular de Langerhans y la
presentación de antígeno posterior mediante rutas dependientes de
MHC, lo que individualmente o en combinación, ejemplifica las
características de la presente invención. El hecho de que no se
impongan limitaciones en la selección de antígenos a partir de una
amplia variedad de fuentes es consistente con la utilización de los
procedimientos básicos para la inducción de la inmunidad específica
de antígenos contra muchos antígenos. De este modo, la elección de
un antígeno particular y su fuente dependerá de la aplicación y
resultará evidente para los expertos en el campo de la
inmunología.
La capa más externa de la piel está concebida
para resistir la entrada de materiales foráneos en el cuerpo.
Debido a que está formada por capas empaquetadas densamente de
membranas celulares de queratinocito y de fibrillas de queratina,
el estrato córneo es impermeable a la mayoría de moléculas de masa
molecular elevada, particularmente la de naturaleza hidrofílica. En
consecuencia, sólo unos pocos fármacos se administran
transdérmicamente. Tales moléculas son típicamente pequeñas y
lipofílicas. La administración transdérmica de péptidos está mal
favorecida a causa de su hidrofilicidad y por lo general de su masa
molecular elevada. Numerosos estudios documentan la gran dificultad
en pasar péptidos a través del estrato córneo (para revisión, ver
Steinstrasser y Merkle, Pharm. Acta. Helv.
70:3-24 (1995)). Entre los enfoques que han
proporcionado algún éxito en la mejora de la penetración de péptido
se incluyen vehículos lipofílicos, ultrasonido de baja frecuencia,
electroporación, iontoforesis y administración intraepidérmica.
Éstos se consideran a continuación.
Disolventes lipídicos- los disolventes
lipídicos como la acetona, la azona y el sulfóxido de dimetilo
(DMSO) se sabe que penetran en el estrato córneo. Según se ha
descrito anteriormente, el presente inventor ha descubierto que los
péptidos pequeños, como SIINFEKL, disuelto en DMSO cruza el estrato
córneo y entra en los estratos inferiores de la epidermis. De esta
manera, la presente descripción, con respecto a los intensificadores
de la penetración de antígeno, comprende una variedad de
disolventes lipofílicos, incluyendo DMSO, y sulfuro simétrico o
asimétrico y sulfóxidos en los que el grupo alquilo contiene de 1 a
16 átomos de carbono, además de liposomas.
Cuando los penetrantes lipofílicos, tales como
el DMSO, se utilizan en la presente invención para mejorar la
penetración de péptido, tales disolventes se pueden administrar
puros o diluidos con otras soluciones, tales como PBS. Las
proporciones de mezclas pueden estar en el intervalo de
aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1 (penetrante a diluyente).
Preferentemente, el potenciador de penetración no se diluye.
Ultrasonido de baja frecuencia.
Mitragotri et al., publicó que incluso las moléculas de
proteína grandes, tales como la insulina (peso molecular 6.000),
IFN-(peso molecular 17.000), y la eritropoyetina (peso molecular
48.000) podrían ser coaxiales al cruzar el estrato córneo, a
aproximadamente 12% de la eficacia, utilizando un ultrasonido de
baja frecuencia (Mitragotri et al., Science
269:850-853 (1995)). El ultrasonido trabaja sobre
la piel mediante efectos no térmicos, cavitacionales, creando
microburbujas que expanden y contraen el estrato córneo, resultando
en un incremento transitorio de la permeabilidad. La cavitación
ocurre a ondas de sonido de frecuencia mucho menor (es decir,
aproximadamente 20 KHz) que la imagen de diagnóstico tradicional
(2-12 Mhz); requiriendo ambas aplicaciones una
intensidad de aproximadamente 0,2 W/cm^{2}.
Electroporación- Vanbever et al.,
describió que aproximadamente un 10% de la molécula pequeña (peso
molecular 267), metoprolol, se podría transportar a través de la
piel durante 4 horas después de 5 pulsos individuales de 450 V
(Vanbever et al., Pharm. Res. 11:1000-1003
(1994)). La electroporación se ha utilizado ampliamente para la
permeabilización de las membranas celulares con el objetivo de
conseguir que el ADN entre en las células. El transporte
transdérmico de péptidos se puede llevar a cabo mediante la
exposición localizada de la piel a pulsos de campo eléctrico de
elevada intensidad, que puede crear poros acuosos transitorios en
las bicapas lipídicas.
Iontoforesis - Bodde et al.
descubrió que sólo aproximadamente 0,4% por hora de vasopresina
(peso molecular 1084) cruzó el estrato córneo (Bodde et al.,
Biochem. Soc. Trans. 17:943-945 (1990)). La
iontoforesis implica la exposición de la piel a corriente de
intensidad baja. Las moléculas polares se mueven en respuesta a la
corriente. Sin embargo, se cree que el transporte ocurre vía
glándulas o folículos pilosos que se proyectan a través de la
epidermis abajo hacia la dermis. En consecuencia, el procedimiento
no se puede adecuar idealmente para proporcionar el acceso de las
células de Langerhans epidérmicas a los péptidos permeadores. Sin
embargo, el procedimiento está dentro del alcance de la presente
invención.
Administración intraepidérmica -
Ciertamente, el estrato córneo se puede penetrar utilizando
instrumentos afilados. De este modo, son posibles las inyecciones
intraepidérmicas utilizando agujas biseladas y jeringas
tradicionales. De forma similar, es posible asimismo la introducción
de agentes antigénicos en la epidermis utilizando instrumentos
dentados, como los que se utilizan para la administración del ensayo
tina. Tales procedimientos físicos invasivos pueden solucionar el
problema de la penetración y pueden incluso proporcionar señales
migratorias concomitantes a las células de Langerhans. Sin embargo,
tales procedimientos pueden frustrar algunas de las ventajas clave
de la presente invención, tales como la facilidad de la aplicación
tópica sin la necesidad de instrumentos estériles o de personal
sanitario altamente preparado. Además, la utilización de
procedimientos invasivos se acompaña siempre de un riesgo
incrementado de infección.
Aunque poner en contacto eficazmente los
antígenos con las células de Langerhans en la epidermis es necesario
para la práctica del procedimiento de vacunación tópica actual, no
es en sí mismo suficiente para inducir la fuerte inmunidad
específica de antígeno deseada para un procedimiento de vacunación.
De hecho, es la segunda etapa, la inducción de la migración celular
de Langerhans, la que continuó poco clara durante mucho tiempo
hasta la presente invención. Aunque el fenómeno de la migración
celular de Langerhans desde el epitelio a los nodos de linfa se ha
conocido muy bien durante muchos años, no se comprenden bien las
rutas reguladoras complejas que controlan la migración celular de
Langerhans y la diferenciación in vivo. Además, existe
aparentemente un número de malentendidos comúnmente mantenidos
respecto a la migración celular de Langerhans. Por ejemplo, algunos
investigadores creen que la migración espontánea y/o continua de las
células de Langerhans es suficiente para la inducción de la
inmunidad específica de antígeno (ver, por ejemplo, Matsuno et
al., J. Exp. Med. 183:1865 (1996)). Otros en el campo creen que
el hecho que antígenos sensibilizadores por contacto sean capaces de
inducir la migración celular de Langerhans por sí mismos, indica
que no se necesita un estímulo de inducción separado para ningún
antígeno (ver, por ejemplo, Udey. Clin. Exp. Immunol. 107:6
(1997)). En consecuencia, los científicos que utilizan FITC en
acetona y en ftalato de dibutilo para estudiar la migración celular
de Langerhans creen que es el antígeno (FITC) el que induce la
migración (ver por ejemplo, Tang et al., J. Immunol. 88:284
(1996)). En resumen, el estado de la técnica en este campo en la
actualidad, no contempla ni la existencia de inductores exógenos de
la migración celular de Langerhans, ni un papel para tales
inductores en una inmunidad específica de antígeno
intensificada.
En el presente, la investigación en la
regulación de la migración celular de Langerhans se enfoca en la
producción de citocinas y quimiocinas mediante una variedad de
células, lo que parece modular la migración celular de Langerhans y
la maduración in vitro. Por ejemplo, el factor estimulador de
la colonia granulocito-macrófago
(GM-CSF) y la interleucina-1\alpha
(IL-1\alpha) pueden mediar la maduración in
vitro (Larregina et al., Immunology
87:317-325, 1996). El factor \alpha de necrosis de
tumor (TNF-\alpha) está implicado en la migración
celular de Langerhans (Banchereau y Steinman, Nature
392-245 (1998)). Otros factores implicados en el
control de diversos aspectos de la maduración y/o la migración
celular de Langerhans incluyen MIP-1a,
IL-4, receptores acoplados a la proteína G para el
péptido relacionado con el gen de calcitonina, C5a y otras
quimiocinas (Banchereau y Steinman, Nature
392-245 (1998)). De esta manera, aunque se han
identificado muchas señales y rutas de señalización posibles, el
esquema regulador sigue poco
claro.
claro.
Además, las señales y rutas elaboradas descritas
anteriormente tienden a enfocar sobre la respuesta "normal" a
las brechas traumáticas de la epidermis. Los inductores exógenos de
la migración celular de Langerhans no se han considerado antes de
este trabajo por el presente inventor. De hecho, los investigadores
no habían reconocido ni siquiera que la estimulación de la
migración celular de Langerhans era una etapa crítica en la
inducción terapéutica de la inmunidad específica de antígeno.
Los compuestos con la capacidad para inducir la
migración celular de Langerhans se pueden representar por la
fórmula general:
en la que R_{1} y R_{2} son
independientemente, cadenas laterales de alquilo o arilo que
contienen de 1 a 16 átomos de carbono. Las mitades arilo son
preferentemente mitades fenilo o bencilo sustituidas o no
sustituidas. En una forma de realización particularmente preferida,
los grupos R_{1} y R_{2} son mitades alquilo idénticas de 2 a 6
átomos de carbono, tales como ftalato de dibutilo, en los que
R_{1} y R_{2} son
(CH_{2})_{3}-CH_{3}.
Los compuestos que son útiles como inductores de
la migración celular de Langerhans se pueden seleccionar utilizando
los procedimientos FITC estándar descritos para los datos
presentados en las figuras 1-3. Se afeitó el
abdomen de los ratones C57BL6 y se pintaron con 100 \mul de
solución de ensayo, que contenía 5 mg/ml de FITC en una mezcla
50/50 (v/v) de acetona y de inductor de migración (por ejemplo,
ftalato de dibutilo). Después de 2 días, se eliminó el nodo de
linfa inguinal drenante y se determinó el número total de células
dendríticas (tanto FITC+ como FITC-) mediante citometría de flujo e
inmunoensayo MHC de clase II.
Los compuestos específicos que comprende la
presente invención para la inducción de la migración celular de
Langerhans se proporcionan a continuación:
- \underbar{Abreviación}
- \underbar{Compuesto}
- DBP
- ftalato de dibutilo
- DBT
- D-tartrato de dibutilo
- DET
- N,N-dietiltoluamida
- DBF
- fumarato de dibutilo
- DEHF
- fumarato de di(2-etilhexilo)
- DIOM
- maleato de diisooctilo
- DEHM
- maleato de di(etilhexilo)
- DIOF
- fumarato de diisooctilo
- BA
- ácido benzoico
- BC
- cloruro de benzalconio
- C
- alcanfor
- BM
- maleato de bihenilo
- DOP
- ftalato de dioctilo
- DBM
- maleato de dibutilo
- DOM
- maleato de dioctilo
- DBS
- succinato de dibutilo
- DOS
- succinato de dioctilo
- DNP
- ftalato de dinonilo
- DINP
- ftalato de diisononilo
- DMP
- ftalato de dimetilo
- DEP
- ftalato de dietilo
- DPP
- ftalato de dipropilo
- DphP
- ftalato de difenilo
- DBBP
- ftalato de dibencilbutilo
- DMEP
- ftalato de dietilmetilo
Los resultados del ensayo se muestran en la
Figura 7. Las células MHC de clase II se incrementaron sobre la
línea de base para la mayoría de los compuestos ensayados. DNP, C,
DBBP, DBT y DINP estuvieron dentro de 1 desviación estándar del
control positivo, ftalato de dibutilo (DBP).
Además de los inductores químicos de la
migración celular de Langerhans, el presente inventor ha encontrado
que el ultrasonido de baja frecuencia muestra asimismo resultados
positivos en el procedimiento de selección de la migración de FITC
descrito anteriormente. De este modo, en una forma de realización de
la presente invención, se puede utilizar el ultrasonido de baja
frecuencia tanto como un penetrador y/o como un inductor de la
migración celular de Langerhans.
Los péptidos/antígenos utilizados según la
presente invención se pueden aplicar por lo general tópicamente a
sitios epidérmicos o epitélicos en un intervalo de dosis de
aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 100 mg/ml.
Preferentemente, los antígenos de péptido se pueden administrar
dentro del intervalo de dosis de 1 mg/ml a 10 mg/ml. La
administración tópica a la piel puede incluir de 0,01 a 1 ml de
volúmenes de aplicación, preferentemente aproximadamente de 0,05 a
0,5 ml. Por lo general, se puede aplicar un volumen menor cuando se
selecciona la ruta de administración vaginal o de otra membrana
mucosa. Se pueden seleccionar las rutas de administración a partir
de cualquier sitio de membrana mucosa y/o epidérmica incluyendo, la
piel, administración intravaginal, rectal, aerosol a las vías
respiratorias y pulmones, y posiblemente administración al tracto
GI para algunos antígenos. Donde se aplican los inductores químicos
de migración celular de Langerhans, el inductor químico se puede
aplicar puro o mezclado con un disolvente orgánico, tal como
acetona, en un intervalo de proporciones de aproximadamente 1:9 a
aproximadamente 9:1 (inductor a disolvente), preferentemente en el
intervalo de proporciones de aproximadamente 3:7 a aproximadamente
7:3 y más preferentemente en una proporción de aproximadamente
1:1.
En algunos casos, puede ser ventajoso,
simplemente aumentar la migración celular de Langerhans, sin
administrar específicamente ningún antígeno. Por ejemplo, en un
individuo que padece cáncer de piel, tal como melanoma o carcinoma
celular basal, puede ser útil para intensificar la respuesta inmune
contra el tumor administrar un inductor de la migración celular de
Langerhans a los sitios de alrededor del tumor, antes de la cirugía.
De forma alternativa, la administración tópica puede darse después
de la excisión y la posterior quimioterapia y/o radiación.
<110> LIDAK PHARMACEUTICALS
\vskip0.400000\baselineskip
<120> INMUNOESTIMULACIÓN TÓPICA PARA
INDUCIR LA MIGRACIÓN CELULAR DE LANGERHANS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P.KNOB.104/EP(WO)
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 98918392.6
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ovoalbúmina de pollo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu}
Claims (15)
1. Utilización de un kit de partes que
contiene:
- -
- un antígeno
- -
- unos medios para intensificar la penetración de dicho antígeno a través de la epidermis o del epitelio de un mamífero, siendo dichos medios un disolvente lipofílico y/o un estímulo físico seleccionado de entre el grupo constituido por un ultrasonido de baja frecuencia y un campo eléctrico;
- -
- un inductor de la migración celular de Langerhans, que comprende un compuesto de la forma de
en el que R_{1} y R_{2} son
independientemente cadenas laterales de alquilo o de arilo que
contienen de 1 a 16 átomos de carbono para la preparación de un
medicamento para intensificar la respuesta inmune contra dicho
antígeno en un mamífero mediante administración
tópica.
2. Utilización según la reivindicación 1, en
la que dichas composiciones se van a administrar a un sitio de
membrana epidérmica o mucosa de dicho mamífero.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que dicho antígeno es un péptido de aproximadamente 3 a 20
residuos de aminoácidos de longitud.
4. Utilización según la reivindicación 3, en
la que dicho péptido es de 8 a 14 residuos de aminoácidos de
longitud.
5. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que dicho péptido se va a administrar a una concentración en
un intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 100
mg/ml.
6. Utilización según la reivindicación 1 ó
2, en la que dicho disolvente lipofílico se selecciona de entre el
grupo constituido por alquilsulfuros y alquilsulfóxidos simétricos o
asimétricos, en la que dicho grupo alquilo contiene de 1 a 16
átomos de carbono.
7. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que dicho disolvente lipofílico es el sulfóxido de
dimetilo.
8. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que dicho inductor de la migración celular de Langerhans se
selecciona de entre el grupo constituido por ftalato de dibutilo,
ftalato de dioctilo, ftalato de dinonilo, ftalato de diisononilo,
ftalato de dimetilo, ftalato de dietilo, ftalato de dipropilo,
ftatalo de difenilo, ftalato de dibencilbutilo y ftalato de
dietilmetilo.
9. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que dicho inductor de la migración celular de Langerhans es
ultrasonido de baja frecuencia.
10. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que dicho inductor de la migración celular de Langerhans es
el ftalato de dibutilo.
11. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que dicho disolvente lipofílico se selecciona de entre el
grupo constituido por cetonas de dialquilo simétricas o asimétricas,
en el que dicho grupo alquilo contiene de 1 a 16 átomos de
carbono.
12. Utilización según la reivindicación 11, en
la que dicho disolvente lipofílico es la acetona.
13. Utilización según la reivindicación 1, en
la que dicho campo eléctrico se adapta a la electroporación o
iontoforesis o combinaciones de las mismas.
14. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el antígeno procede de una
fuente seleccionada de entre el grupo constituido por tumores,
virus, bacterias y parásitos.
15. Utilización de una cantidad eficaz de un
inductor de la migración celular de Langerhans para la preparación
de un medicamento para intensificar una respuesta inmune en un
mamífero mediante la administración tópica de dicho inductor de la
migración celular de Langerhans, seleccionándose dicho inductor de
entre el grupo constituido por ftalato de dibutilo,
D-tartrato de dibutilo,
N,N-dietiltoluamida, fumarato de dibutilo, fumarato
de di(2-etilhexilo), maleato de diisooctilo,
maleato de dietilhexilo, fumarato de diisooctilo, ácido benzoico,
cloruro de benzalconio, maleato de bihenilo, ftalato de dioctilo,
maleato de dibutilo, maleato de dioctilo, succinato de dibutilo,
succinato de dioctilo, ftalato de dinonilo, ftalato de diisononilo,
ftalato de dimetilo, ftalato de dietilo, ftalato de dipropilo,
ftalato de difenilo, ftalato de dibencilbutilo, ftalato de
dietilmetilo y alcanfor.
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