ES2283120T3 - Utilizacion de inhibidores de la proteina quinasa c epsilo en el tratamiento del dolor. - Google Patents
Utilizacion de inhibidores de la proteina quinasa c epsilo en el tratamiento del dolor. Download PDFInfo
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Abstract
Inhibidor de la isozima epsilon de la proteína quinasa C (PKCepsilon) para utilizar en un procedimiento de alivio del dolor, comprendiendo dicho procedimiento: administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de la isozima epsilon de la proteína quinasa C (PKCepsilon), en el que dicha cantidad eficaz es una que no inhibe significativamente otras isozimas de la PKC, y en el que dicho inhibidor provoca dicho alivio del dolor al interferir con la actividad de la PKCepsilon, y en el que dicho inhibidor es un péptido seleccionado del grupo consistente en: epsilonV1-1, epsilonV1-2, epsilonV1-3, epsilonV1-4, epsilonV1-5 y epsilonV1-6.
Description
Utilización de inhibidores de la proteína
quinasa C \epsilon en el tratamiento del dolor.
Para aquellos que lo sufren, así como de sus
familias, comunidades y empleadores, el dolor es más que una
molestia menor - es una seria carga física, emocional, social y
económica. Dado que más de dos millones de personas en los Estados
Unidos están incapacitados sólo por dolor crónico en cualquier día
determinado (T. M. Jessell & D. D. Kelly, Pain and
Analgesia en PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE, 3ª edición (E. R.
Kandel, J. H. Schwartz, T. M. Jessell, ed., 1991)), el número de
personas y de entidades que soportan estas cargas es bastante
grande.
Lamentablemente, los tratamientos actuales para
el dolor son sólo parcialmente efectivos, y muchos provocan además
efectos secundarios debilitantes o peligrosos. Por ejemplo, los
fármacos antiinflamatorios no esteriodeos ("NSAIDs"), tales
como la aspirina, el ibuprofeno y la indometacina son moderadamente
eficaces contra el dolor inflamatorio pero además son toxinas
renales, y a altas dosis tienden a provocar irritación
gastrointestinal, ulceración, hemorragias y desórdenes. Los
pacientes tratados con opiáceos sufren a menudo desórdenes, y la
utilización a largo plazo de opiáceos se relaciona con la tolerancia
y la dependencia. Los anestésicos locales tales como la lidocaína y
la mixelitina inhiben a la vez el dolor y provocan la pérdida de
sensación normal. De este modo, existe la necesidad de tratamientos
seguros y eficaces para el dolor.
Las interpretaciones mejoradas de la base
molecular del dolor deberían ayudar al desarrollo de los
medicamentos del dolor. El dolor es un tema que en particular
constituye un reto porque es una percepción basada en señales
recibidas del medio y transmitidas e interpretadas por el sistema
nervioso. Los estímulos nocivos tales como el calor y el tacto,
provocan que los receptores sensoriales especializados en la piel
envíen señales al sistema nervioso central ("SNC"). Este
proceso se denomina nocicepción, y las neuronas sensoriales
periféricas que actúan de mediadoras son nociceptoras. Dependiendo
de la fuerza de la señal del nociceptor o nociceptores y la
abstracción y la elaboración de la señal mediante el SNC, una
persona puede o no sufrir un estímulo nocivo como doloroso.
Aunque el dolor no es agradable, es crucial -
sin él, estaríamos totalmente ajenos a muchos peligros de nuestro
entorno. Cuando nuestra percepción del dolor está correctamente
calibrada con la intensidad del estímulo, el dolor sirve a su
función protectora deseada. Sin embargo, ciertos tipos de daños de
tejidos provocan un fenómeno, conocido por hiperalgesia o
pronocicepción, en que los estímulos relativamente inocuos se
perciben como intensamente dolorosos ya que se han disminuido los
umbrales del dolor de las personas. Tanto la inflamación como el
daño nervioso pueden inducir a la hiperalgesia. De este modo, las
personas aquejadas de afecciones inflamatorias, tales como la
quemadura solar, la osteoartritis, la colitis, la carditis, la
dermatitis, la miositis, la neuritis, las enfermedades del colágeno
vascular (que incluyen la artritis reumatoide y el lupus) y
similares, a menudo sufren sensaciones de dolor aumentadas. De modo
parecido, el traumatismo, la cirugía, la amputación, el absceso, la
causalgia, las enfermedades del colágeno vascular, las enfermedades
desmielinizantes, la neuralgia trigeminal, el cáncer, el
alcoholismo crónico, el derrame cerebral, el síndrome del dolor
talámico, la diabetes, las infecciones por herpes, el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida ("SIDA"), las toxinas y la
quimioterapia, provocan daños nerviosos que dan lugar a un dolor
excesivo. Aparentemente, los umbrales reducidos del dolor
característicos de la hiperalgesia son debidos a alteraciones de
forma que los nociceptores colindantes a los nervios de la
inflamación o a los nervios dañados responden a los estímulos
nocivos. Si se entendieran mejor los mecanismos por los que los
nociceptores transducen señales externas bajo condiciones normales
y bajo condiciones hiperalgésicas, podría ser posible identificar
procesos que sólo se dan en la hiperalgesia que, cuando al
interrumpirse, podría inhibir la disminución del umbral del dolor y
de ese modo aliviar la cantidad de dolor experimentado. Dado que
dicho tratamiento para el dolor crónico actuaría a nivel de las
neuronas aferentes sensoriales, evitaría tener que pasar por los
problemas asociados con los fármacos que actúan en el SNC. Si el
tratamiento incapacitara una vía de transducción específico de los
nociceptores y/o no implicara actuar de mediador de otras señales,
entonces el potencial para los efectos secundarios inducidos por el
tratamiento sería pequeño. La presente memoria describe dicho
procedimiento de alivio del dolor.
La presente memoria describe un procedimiento de
alivio del dolor que comprende la administración a un sujeto con
necesidad del mismo, una cantidad eficaz de un inhibidor de la
isozima \varepsilon de la proteína quinasa C
("PKC\varepsilon"). También se describe la utilización de un
inhibidor PKC\varepsilon para disminuir la hiperalgesia,
preferentemente sin afectar a la nocicepción. Los inhibidores son
selectivos para la PKC\varepsilon y se prefiere la administración
local del inhibidor. Un aspecto de la invención es un procedimiento
para medir la capacidad de los compuestos de modular el dolor tal y
como se expone en las reivindicaciones, que comprende la selección
de un compuesto de prueba que modula la actividad de la
PKC\varepsilon y la administración de dicho compuesto de prueba en
un sujeto modelo animal para determinar si se modula el dolor. Un
aspecto adicional de la presente invención es una composición
farmacéutica tal y como se expone en las reivindicaciones, que
comprende un inhibidor de la PKC\varepsilon y un agente
analgésico que no es un inhibidor de la PKC\varepsilon. Aspectos
adicionales de la invención incluyen la utilización de un modulador
de la PKC\varepsilon, que es un inhibidor de la PKC\varepsilon,
en la preparación de un medicamento tal y como se expone en las
reivindicaciones. Dicho medicamento se puede utilizar para el
tratamiento del dolor. Esta invención es bastante apropiada para el
tratamiento de sujetos que tienen dolor agudo o crónico provocado
por afecciones neuropáticas o inflamatorias.
Figura 1. Efecto de los antagonistas
andrenérgicos \alpha y \beta, inhibidores de la síntesis de la
simpatectomía y prostaglandinas, en la hiperalgesia dosis
dependiente inducida por la epinefrina en respuesta a estímulos
mecánicos. Descenso porcentual en los umbrales nociceptivos debido a
la inyección de 1, 10, 100 y 1.000 ng de epinefrina después de (A)
ningún tratamiento (cuadrados), inyección de propranolol
(triángulos), inyección de fentolamina (círculos rellenos) y (B)
falsa simpatectomía (cuadrados), simpatectomía (círculos) e
inyección de indometacina (triángulos
invertidos).
invertidos).
Figura 2. Latencia y duración de la hiperalgesia
inducida por la epinefrina en respuesta a estímulos mecánicos.
Descenso porcentual en los umbrales nociceptivos en el número
indicado de minutos después de la inyección de 1 \mug de
epinefrina.
Figura 3. Efecto de los antagonistas
adrenérgicos \alpha y \beta en la hiperalgesia inducida por
isoproterenol en respuesta a estímulos mecánicos. Descenso
porcentual en los umbrales nociceptivos debido a la inyección de 1,
10, 100 y 1.000 ng de isoproterenol después de ningún tratamiento
(cuadrados), inyección de fentolamina (rombos) e inyección de
propranolol (triángulos).
Figura 4 (A) Representación del voltaje de una
neurona DRG de diámetro pequeño de rata de cultivo antes de y
durante la exposición a 1 \muM de epinefrina. (B) Efecto de 1
\muM de epinefrina con el tiempo en un número de potenciales de
acción (cuadrados) y latencia al primer potencial de acción
(círculos) en otra neurona DRG de diámetro pequeño de rata de
cultivo.
Figura 5. Efecto con el tiempo de (A) 1 \muM
de epinefrina o (C) de isoproterenol en la corriente máxima de
sodio resistente a la tetrodotoxina ("corriente
TTX-RI_{Na}"). (B) Líneas corriente
TTX-RI_{Na} - voltaje para ausencia de epinefrina
(círculos vacíos) y para 1 \muM de epinefrina (círculos
rellenos).
Figura 6. Efecto de los antagonistas
adrenérgicos \alpha y \beta en la potenciación de la corriente
TTX-RI_{Na} inducida por la epinefrina. Corriente
interior normalizada con el tiempo con perfusión de 1 \muM de
epinefrina sola (círculos vacíos), de 1 \muM de epinefrina y
fentolamina (triángulos), y de 1 \muM de epinefrina y propranolol
(círculos rellenos).
Figura 7. Efecto del inhibidor de PKA en la
potenciación de la corriente TTX-RI_{Na} inducida
por la epinefrina. Corriente interior normalizada con el tiempo con
perfusión de 1 \muM de epinefrina sola (círculos vacíos) o con
perfusión de 1 \muM de epinefrina con Rp-cAMPs
presente en la pipeta registradora (círculos rellenos).
Figura 8. Efecto del inhibidor de PKC en la
potenciación de la corriente TTX-RI_{Na} inducida
por la epinefrina. Corriente interior normalizada con el tiempo con
perfusión de 1 \muM de epinefrina sola (círculos vacíos) o con
perfusión de 1 \muM de epinefrina con pretratamiento con BIM
(círculos rellenos).
Figura 9. Nocicepción e hiperalgesia mecánicas,
térmicas y químicas en ratones normales y en ratones con
PKC\varepsilon mutante. (A) Las respuestas de los ratones
normales (barras con rayas en diagonal) y en los ratones con
PKC\varepsilon mutante (barras blancas) a los estímulos mecánicos
se examinaron midiendo las frecuencias de retraimiento de las patas
después de una estimulación con filamentos de von Frey ("VFH")
de 4, 6,9 ó 14,8 gm de intensidad. La estimulación con VFH no
estaba precedida de ningún tratamiento ("basal"), inyección de
epinefrina, o inyección de PGE_{2}. (B) La tolerancia de los
ratones normales (barras con rayas en diagonal) y de los ratones con
PKC\varepsilon mutante (barras blancas) a los estímulos térmicos
se determinó midiendo la duración de la exposición (en segundos)
hasta un estímulo de calor radiante de 50 W antes del retraimiento
de las patas. La estimulación por calor no estaba precedida de
ningún tratamiento ("basal"), inyección de epinefrina, o
inyección de PGE_{2}. (C) La capacidad de la inyección
intraperitoneal de ácido acético para inducir a contracciones
abdominales ("retorcimientos") se examinó en los ratones
normales y en los ratones con PKC\varepsilon mutante ("knock
out").
Figura 10. Expresión de PKC\varepsilon en
neuronas DRG y en piel de rata; inhibición en ratas de la
hiperalgesia inducida por la epinefrina por un inhibidor de
PKC\varepsilon no selectivo y por un inhibidor de PKC\varepsilon
selectivo. Las neuronas DRG (A) y la piel (B y C) de rata se
tiñeron con un anticuerpo de PKC\varepsilon (A y B) y un
anticuerpo preabsorbido con un antígeno (C). Barra = 50 \mum (A,
B y C); Ep = epidermis; De = dermis. Las ratas recibieron
inyecciones intradérmicas de 100 ng de epinefrina ("epi") o de
100 ng de PGE_{2} tras las inyecciones en la orientación dorsal
de las patas traseras de (D) 1 \mug de bisindolimaleimida I
("BIM"), o (E) agua estéril seguido de 1 \mug de péptido
\varepsilonV1-2
("VI\varepsilon1-2") o 1 \mug de un péptido
de secuencia alterada ("S-VI\varepsilon2").
El cambio en el umbral nociceptivo se analizó midiendo la respuesta
a la estimulación de Ugo Basile.
Figura 11. Expresión de PKC\varepsilon en
neuronas de los ganglios de la raíz dorsal ("DRG") (A y B) y de
la médula espinal (D y E) de ratón. Los tejidos de ratón normal (A
y D) y de ratón con PKC\varepsilon mutante (B y E) se incubaron
con el anticuerpo anti-PKC\varepsilon. Barra = 50
\mum (A y B) o 100 \mum (D y E). (C) Histograma de frecuencia
del tamaño de neuronas que expresan la PKC\varepsilon y todas las
neuronas DRG.
Figura 12. Efecto de los inhibidores de la
PKC\varepsilon en la hiperalgesia inducida por la vincristina (A)
o en la hiperalgesia inducida por la diabetes (B) en respuesta a
estímulos mecánicos. Descenso porcentual en los umbrales
nociceptivos después de ningún tratamiento (barras blancas),
inyección del péptido inhibitorio de la PKC\varepsilon (barras
con rayas en diagonal), inyección de una versión de secuencia
alterada del péptido inhibitorio (barras punteadas) o inyección de
bisindolimaleimida I (barras con rayas inversas en diagonal).
Figura 13. Efecto del inhibidor de la
PKC\varepsilon en la hiperalgesia inducida por el carragenano en
respuesta a estímulos mecánicos. Descenso porcentual en los
umbrales nociceptivos después de la exposición a carragenano solo
(barras blancas y barras con rayas en diagonal - hiperalgesia
analizada 3 y 4 horas después de la exposición al carragenano,
respectivamente), exposición a carragenano y a una inyección del
péptido inhibitorio de la PKC\varepsilon (barras con rayas
inversas en diagonal), o exposición al carragenano y a una inyección
de una versión de secuencia alterada del péptido inhibitorio (barra
punteada). * indica significativamente diferente, p < 0,0001.
La proteína quinasa C ("PKC") es una
familia multigénica de quinasas de serina - treonina, dependiente
del fosfolípido, centrales para muchas vías de transducción de
señal. Estudios de clonación molecular han identificado diez
miembros de la familia de la PKC. Estos miembros de la familia,
denominadas isozimas, están codificados por nueve genes diferentes.
Las diez isozimas se designan como las isozimas \alpha,
\betaI, \betaII, \gamma, \delta, \varepsilon, \zeta,
\eta, \iota/\lambda, y \theta (Y. Nishizuka, Science
258, 607-614 (1992); L. A. Selbie, C.
Schmitz-Peiffer, Y. Sheng, T. J. Biden, J Biol.
Chem. 268, 24296-24302 (1993)). Basándose
en la homología de secuencias y en las propiedades bioquímicas, la
familia del gen de la PKC se ha dividido en tres grupos: (i) las
PKCs "convencionales", las isozimas \alpha, \betaI,
\betaII y \gamma, que están reguladas por el calcio y por los
ésteres de diacilglicerol y de forbol; (ii) las PCKs
"novedosas", las isozimas \delta, \varepsilon, \theta y
\eta, que son independientes del calcio, pero sensibles a los
ésteres de diacilglicerol y de forbol; y (iii) las PCKs
"atípicas", las isozimas \zeta y \iota/\lambda, que son
insensibles al calcio y al forbol 12-miristato
13-acetato. Además, dos quinasas dependientes del
fosfolípido relacionadas, la PKC\mu y la proteína quinasa D,
comparten homología de secuencia en sus dominios reguladores para
las PCKs novedosas y pueden constituir un nuevo subgrupo (F.-J.
Johannes, J. Prestle, S. Eis, P. Oberhagemann, K. Pfizenmaier,
Biol. Chem. 269, 6140-6148 (1994); A.
M. Valverde, J. Sinnett-Smith, J. Van Lint, E.
Rozengurt, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91,
8572-8576 (1994)).
Está bien comprobado que las proteínas de la
familia de las PKC juegan un papel central en el crecimiento y en
la diferenciación de las células. Las PCKs actúan de mediadoras de
los efectos de las hormonas péptido, los factores del crecimiento,
los neurotransmisores y los promotores de tumores, por actuar como
segundos mensajeros (cadena abajo, intracelular) para estas
moléculas señalizadoras (Y. Nishizuka, Science 233,
305-312 (1986); Y. Takai, K. Kaibuchi, T. Tsuda, M.
Hoshijima, J. Cell. Biochem. 29,
143-155 (1985)). Aún se están determinando las
identidades de las isozimas de la PKC que transducen señales
particulares en tipos de células específicas. Las isozimas
\alpha, \betaI, \betaII, \gamma, \delta, \varepsilon y
\zeta se han implicado en la diferenciación de células no
neurales (E. Berra, et al., Cell 74,
555-563 (1993); J. Goodnight, H. Mischak, J. F.
Mushinski, Adv. Cancer Res. 64,
159-209 (1994); J. R. Gruber, S. Ohno, R. M. Niles,
J. Biol. Chem. 267, 13356-13360
(1992); D. E. Macfarlane, L. Manzel, J. Biol. Chem.
269, 4327-4331 (1994); C. T. Powell et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89,
147-151 (1992)). Estudios recientes, que muestran
que la isozima \varepsilon de la PKC ("PKC\varepsilon") se
activa mediante el factor de crecimiento del nervio ("FCN") y
que actúa de mediador del sobrecrecimiento neurítico inducido por
el FCN, se interpretaron como indicadores de un papel para la
PKC\varepsilon en la diferenciación neuronal (B. Hundle, et
al., J. Biol. Chem. 272,
15028-15035 (1997)).
Uno de los descubrimientos clave que subyacen en
la presente invención es la demostración de que una isozima
específica de la PKC, la PKC\varepsilon, actúa en los nociceptores
aferentes primarios para actuar de mediadora de ciertos tipos de
hiperalgesia. En particular, los ratones que carecen de la proteína
de la PKC\varepsilon funcional ("ratones con PKC\varepsilon
mutante") muestran una disminución de las respuestas a las
inyecciones de ácido acético y una disminución de la hiperalgesia
inducida por la epinefrina en respuesta a los estímulos mecánicos y
térmicos. La administración de un péptido que inhibe selectivamente
la PKC\varepsilon también disminuye la hiperalgesia inducida por
la epinefrina, la hiperalgesia inducida por el carragenano y la
hiperalgesia asociada con la quimioterapia y la diabetes, en
respuesta a los estímulos mecánicos. Debido a que la magnitud de la
hiperalgesia inducida por la epinefrina era similar en ratas
tratadas con un inhibidor de la PKC\varepsilon no selectivo y en
los tratados con el inhibidor selectivo de la PKC\varepsilon, la
PKC\varepsilon parece ser la única isozima de la PCK que actúa de
mediadora de la hiperalgesia inducida por la epinefrina. De modo
parecido, debido a que la magnitud de la hiperalgesia asociada a la
diabetes fue ligeramente menor en ratas tratadas con un inhibidor de
la PKC\varepsilon no selectivo que en los tratados con el
inhibidor selectivo de la PKC\varepsilon, la PKC\varepsilon
aparece para ser la principal, pero quizás no la única, isozima de
la PCK que actúa de mediadora de la hiperalgesia asociada a la
diabetes.
El descubrimiento de que la PKC\varepsilon
actúa de mediador de ciertos tipos de hiperalgesia fue inesperado.
Aunque había evidencia de que la familia de la PKC de las proteínas
contribuye con la hiperalgesia neuropática diabética (S. C.
Ahlgren, J. D. Levine, J. Neurophys. 72,
684-692 (1994)) y con la activación y la
sensibilización inducida por la bradiquinina de los nociceptores (S.
M. McGuirk, A. C. Dolphin, Neuroscience 49,
117-28 (1992); L. M. Boland, A. C. Allen, R.
Dingledine, J. Neurosci. 11, 1140-9
(1991)), los roles de las isozimas de la PKC individuales en estos
procesos fueron inexplorados e imprevisibles.
Un aspecto particularmente útil de la presente
invención es el hecho de que los inhibidores de la PKC\varepsilon
puedan disminuir la hiperalgesia sin afectar a la nocicepción o sin
comprometer a otra percepción sensorial. De este modo, una persona
que recibe un inhibidor de la PKC\varepsilon tendría alivio de un
dolor excesivo producto de estímulos inocuos mientras que aún es
capaz de sentir dolor en repuesta a estímulos intensos. Este aspecto
de la invención se basa en experimentos que utilizan estímulos
mecánicos y térmicos para mostrar que las PKC\varepsilon actúan
de mediador de la hiperalgesia inducida por la epinefrina y la
hiperalgesia inducida por el carragenano pero no se implican en la
nocicepción (es decir, la respuesta basal). La disminución en el
retorcimiento visto en los ratones con PKC\varepsilon mutante
inyectados con ácido acético en comparación con los ratones normales
concuerda con las PKC\varepsilon que tienen un rol en la
hiperalgesia inflamatoria pero no en la nocicepción. La teoría de
que la inyección de ácido acético provoca la inflamación que da
lugar en la hiperalgesia se apoya en los datos que muestran que los
fármacos antiinflamatorios (en estos casos, NSAIDs) inhiben la
cantidad de retorcimientos inducidos por la exposición al ácido
acético (C. J. Niemegger, J. A. Van Bruggen y P. A. Janssen,
Arzneimittelforschung 25, 1505-1509
(1975); R. Vinegar, J. F. Truax y J. L. Selph, Eur. J.
Pharmacol. 37, 23-30 (1976); R. Bjorkman,
Acta Anaesthesiol. Scand. Supp. 103,
1-44 (1995)). El hecho de que la administración de
un inhibidor selectivo de la PKC\varepsilon casi elimina la
hiperalgesia del otro tipo provocada por la carragenano, un agente
inflamatorio bien establecido, además de solidificar el rol de la
PKC\varepsilon en su actuación de mediador de la hiperalgesia
inflamatoria.
Tal y como se describió anteriormente, la
presente especificación describe la administración de un inhibidor
de la PKC\varepsilon para aliviar el dolor, para prevenir el
futuro dolor, y/o para inhibir mayormente a la sensibilidad a un
estímulo nocivo. Aunque es suficiente para aliviar el dolor
cualquier molécula que inhiba a la isozima PKC\varepsilon, son
preferidas las moléculas que inhiben selectivamente la isozima
PKC\varepsilon porque, tal y como se mostró en los ratones con
PKC\varepsilon mutante, la eliminación de la PKC\varepsilon no
provoca mayores anomalías en el desarrollo ni efectos secundarios
graves. Ya que las moléculas son también capaces de inhibir a las
isozimas PKC\varepsilon aparte de la PKC\varepsilon interfieren
con las diversas funciones obtenidas por aquellas isozimas, tales
inhibidores no selectivos de la PKC\varepsilon, aunque disminuyan
el dolor, lo más probable es que tengan muchos efectos secundarios
no deseados.
Existen muchos inhibidores conocidos de la
PKC\varepsilon que se pueden utilizar en la invención inmediata.
Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos número 5.783.405
describe un gran número de péptidos que inhiben a las isozimas
PKC\varepsilon. De éstos, los péptidos
\varepsilonV1-1,
\varepsilonV1-2,
\varepsilonV1-3, \varepsilon4,
\varepsilonV1-5 y
\varepsilonV1-6 son selectivos para la
PKC\varepsilon y son los inhibidores péptidos preferidos. El
péptido \varepsilonV1-2 es en particular el
péptido inhibitorio preferido. Los inhibidores de molécula pequeña
de la PKC se describen en las Patentes de los Estados Unidos
números 5.141.957, 5.204.370, 5.216.014, 5.270.310, 5.292.737,
5.344.841, 5.360.818 y 5.432.198. Estas moléculas pertenecen a las
siguientes clases:
N,N'-Bis-(sulfonamido)-2-amino-4-iminonaftaleno-1-onas;
N,N'-Bis-(amido)-2-amino-4-iminonaftaleno-1-onas;
compuestos carbocíclicos vecinales sustituidos; derivados del
1,3-dioxano;
1,4-Bis-(amino-hidroxialquilamino)
antraquinonas; furo-coumarinsulfonamidas;
Bis-(hidroxialquilamino)-antraquinonas; y amidas de
N-aminoalquilo. Debido a su relativa facilidad de
administración (por ejemplo, a menudo son viables la liberación
transdérmica o la ingestión para moléculas pequeñas pero no para
péptidos), se prefieren los inhibidores de la PKC\varepsilon de
molécula pequeña por encima de inhibidores péptidos.
Los inhibidores de la PKC\varepsilon
adicionales se pueden identificar utilizando ensayos que miden la
activación, la translocalización intracelular, uniendo los
receptores intracelulares (por ejemplo, los RACKs) o la actividad
catalítica de la PKC\varepsilon. Tradicionalmente, la actividad de
la quinasa de los miembros de la familia de la PKC se ha ensayado
utilizando al menos PKC purificada parcialmente en un ambiente
fosfolípido reconstituido con ATP radioactivo como el donante de
fosfato y una proteína histónica o un péptido corto como el sustrato
(T. Kitano, M. Go, U. Kikkawa, Y. Nishizuka, Meth. Enzymol.
124, 349-352 (1986); R. O. Messing, P. J.
Peterson, C. J. Henrich, J. Biol. Chem. 266,
23.428-23.432 (1991)). Recientes mejoras incluyen un
ensayo de quimiluminiscencia rápida y de alta sensibilidad que mide
la actividad de la proteína quinasa en concentraciones fisiológicas
y que se puede automatizar y/o utilizar en revisiones de alto
rendimiento (C. Lehel, S. Daniel-Issakani, M.
Brasseur, B. Strulovici, Anal. Biochem. 244,
340-346 (1997)) y un ensayo utilizando la PKC en
membranas aisladas y un sustrato péptido selectivo que se deriva a
partir de la proteína MARKS (B. R. Chakravarthy, A Bussey, J. F.
Whitfield, M. Sikorska, R. E. Williams, J. P. Durkin, Anal.
Biochem. 196, 144-150 (1991)). Se pueden
identificar los inhibidores que afectan la translocalización
intracelular de la PKC\varepsilon mediante ensayos en los que se
determina la localización intracelular de la PKC\varepsilon
mediante fraccionado (R. O. Messing, P. J. Peterson, C. J. Henrich,
J. Biol. Chem. 266, 23428-23432
(1991)) o inmunohistoquímica (Patente de los Estados Unidos número
5.783.405; Solicitud de Patente de los Estados Unidos número
08/686.796). Para identificar un inhibidor de la PKC\varepsilon,
se deberían realizar los ensayos con la PKC\varepsilon. El
criterio de dichos inhibidores de la PKC\varepsilon se puede
determinar mediante la comparación del efecto del inhibidor en la
PKC\varepsilon con su efecto en otra isozima de la PKC.
Como la PKC\varepsilon es una proteína
intracelular, realizaciones preferidas de la invención implican
formulaciones de inhibidor farmacéuticamente aceptables capaces de
impregnar la membrana del plasma. Las pequeñas moléculas no polares
son a menudo permeables a la membrana. La permeabilidad de la
membrana de otra molécula se puede mejorar mediante una variedad de
procedimientos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo
su disolución en soluciones hipotónicas, acoplándolos a las
proteínas de transporte, y envolviéndolos en las micelas.
Los inhibidores se pueden administrar cada hora,
varias veces al día, diariamente o tan a menudo como la persona
sufra el dolor o que el médico de la persona observe el ataque de
dolor. Preferentemente, el intervalo de administración estará en el
rango de 8 a 24 horas. Se puede tener en cuenta la intensidad del
dolor del paciente cuando se determinan los intervalos apropiados
para los tratamientos del inhibidor de la PKC\varepsilon. Los
tratamientos del inhibidor de la PKC\varepsilon pueden continuar
después de varios días, un mes, varios meses, un año, varios años o
la duración de la vida del paciente. Otra posibilidad es que los
inhibidores de la PKC\varepsilon se pueden administrar solamente
en una vez, siempre y cuando se espera que el dolor sea pasajero y
que no vuelva a aparecer. Los inhibidores de la PKC\varepsilon se
deberían administrar a niveles suficientes para disminuir el dolor
en el cuerpo del paciente. El profesional experto apreciará que
aumentando las dosis de los inhibidores de la PKC\varepsilon se
debería administrar hasta que el paciente experimente la
disminución el dolor, y que las dosis más grandes no consiguen
llevar a cabo una mejora mayor del dolor. La administración se
podría establecer de manera que el paciente pueda controlar las
dosis futuras de los inhibidores de la PKC\varepsilon según la
cantidad de dolor que experimente.
Las dosis del inhibidor variarán según muchos
parámetros, que incluyen la naturaleza del inhibidor y el modo de
administración. Para el péptido \varepsilonPKC-v1,
una concentración intracelular de 150 \mug/ml inhibió la
translocalización de la PKC\varepsilon y los efectos cadena abajo
de la activación de la PKC\varepsilon (Patente de los Estados
Unidos número 5.783.405). Se contemplan dosis diarias para los
inhibidores de la PKC en el rango de 1 \mug/kg - 100 mg/kg de
peso, preferentemente de 1 \mug/kg - 1 mg/kg y más preferentemente
de 10 \mug/kg - 1 mg/kg, que son de
N,N'-Bis-(sulfonamido)-2-amino-4-iminonaftaleno-1-onas
o de
N,N'-Bis-(amido)-2-amino-4-iminonaftaleno-1-onas.
Se contemplan dosis diarias para los inhibidores de la PKC en el
rango de 1 \mug/kg - 100 mg/kg de peso, preferentemente de 1
\mug/kg - 40 mg/kg y más preferentemente de 10 \mug/kg - 20
mg/kg, que son de compuestos carbocíclicos vecinales sustituidos.
Se contemplan dosis diarias para los inhibidores de la PKC en el
rango de 5 - 400 mg/kg de peso, preferentemente 10 - 200 mg/kg y
más preferentemente 10 - 50 mg/kg, que son de
1,4-Bis-(amino-hidroxialquilamino)-antraquinonas,
de Bis-(hidroxialquilamino)-antraquinonas, o de
amidas de N-aminoalquilo. Se contemplan dosis
diarias para los inhibidores de la PKC en el rango de 0,1 - 40
mg/kg de peso, preferentemente 1 - 20 mg/kg, que son de derivados
del 1,3-dioxano. Se contemplan dosis diarias para
los inhibidores de la PKC en el rango de 1 - 100 mg/kg de peso, que
son furo-coumarinsulfonamidas.
Se pueden administrar los inhibidores de la
PKC\varepsilon localmente cerca del lugar de la inflamación o del
daño del nervio periférico. Dicha administración local puede ser
tópica o mediante inyección intradérmica o subcutánea. La
administración sistémica de un inhibidor de la PKC\varepsilon
representa otra realización de la invención. La administración oral
y la administración por inyección intravenosa son los tipos
preferidos de administración sistémica. Desde que la
PKC\varepsilon aparece para modular el dolor en el nivel de los
nociceptores periféricos y puede desempeñar otras funciones en el
cerebro, la administración local de los inhibidores de la
PKC\varepsilon es más preferible que la administración sistémica
porque la administración local debería tratar con eficacia el dolor
en los alrededores con efectos perjudiciales mínimos en la actividad
de la PKC\varepsilon en lugares distantes. Los procedimientos
descritos en la especificación son útiles para el tratamiento de
mamíferos en general y de humanos en particular.
Una realización preferida de la presente
invención puede suponer la administración de una formulación
farmacéuticamente aceptable de un inhibidor de la PKC\varepsilon.
Una "formulación farmacéuticamente aceptable" comprende una
que es adecuada para administrar el inhibidor de la PKC\varepsilon
de manera que de los resultados deseados y que no produzca además
efectos secundarios adversos suficientes para convencer al médico de
que el daño potencial a un paciente es mayor que el beneficio
potencial para aquel paciente. El ingrediente básico para una
formulación inyectable es un excipiente de agua. El agua utilizada
será de una pureza igualada al estándar USP para agua estéril para
inyección. Los excipientes acuosos que son útiles incluyen solución
de cloruro sódico (NaCl), solución de Ringer, solución de
NaCl/dextrosa, y similares. Son también útiles los excipientes
miscibles en agua para llevar a cabo la solubilidad completa del
inhibidor de la PKC\varepsilon. Dependiendo de la necesidad, son
útiles los agentes antimicrobianos, las soluciones tampón y los
antioxidantes.
En la preparación de las composiciones del
inhibidor de la PKC\varepsilon para esta invención, uno puede
seguir las recomendaciones estándar de fuentes farmacéuticas bien
conocidas tales como REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF
PHARMACY, 19ª edición (Mack Publishing, 1995). En general, la
composición farmacéutica de esta invención se basa en polvos o en
solución acuosa con excipientes añadidos que ayudan en la
solubilidad del inhibidor de la PKC\varepsilon, en la
isotonicidad de la composición, en la estabilidad química y en la
disuasión de crecimiento de microorganismos. Para la administración
oral, se prefiere incluir sustancias que protejan al inhibidor de
la PKC\varepsilon de la degradación por parte de agentes
digestivos.
La invención se puede utilizar en el tratamiento
de un paciente que tanga un dolor inflamatorio. Dicho dolor
inflamatorio puede ser agudo o crónico y se puede deber a una
cantidad de condiciones caracterizadas por la inflamación
incluyendo, sin limitación, la quemadura solar, la artritis
reumatoide, la osteoartritis, la colitis, la carditis, la
dermatitis, la miositis, la neuritis y las enfermedades del colágeno
vascular. Esta utilización de la invención se basa en experimentos
que muestran que la administración de un inhibidor de la
PKC\varepsilon disminuye significativamente tanto la hiperalgesia
aguda como la crónica resultante de la exposición al carragenano
del agente inflamatorio. El hecho de que los inhibidores de la
PKC\varepsilon disminuyen con eficacia la hiperalgesia crónica
cuando se administran un tiempo después del agente inflamatorio (en
estos experimentos, carragenano) indica que las personas que han
sufrido durante tiempo el dolor asociado con las enfermedades
inflamatorias tales como las enumeradas anteriormente deberían
experimentar al menos un alivio parcial del dolor siguiendo la
administración de un inhibidor de la PKC\varepsilon. Además, la
administración de inmediato de un inhibidor de la PKC\varepsilon
a un sujeto previamente, durante o después de un evento inflamatorio
puede mejorar tanto el dolor agudo como la hiperalgesia crónica que
el sujeto experimentaría de otra forma.
La invención se puede utilizar también en el
tratamiento de un paciente que tanga un dolor neuropático. Dichos
pacientes pueden tener una neuropatía clasificada como una
radiculopatía, una mononeuropatía, una mononeuropatía múltiple, una
polineuropatía o una plexopatía. Estas clases de enfermedades pueden
ser provocadas por una variedad de condiciones o procedimientos que
perjudiquen a los nervios, que incluyen, sin limitación, el
traumatismo, el derrame cerebral, las enfermedades
desmielinizantes, el absceso, la cirugía, la amputación, las
enfermedades inflamatorias de los nervios, la causalgia, la
diabetes, las enfermedades del colágeno vascular, la neuralgia
trigeminal, la artritis reumatoide, las toxinas, el cáncer (que
puede provocar de forma directa o remota una (por ejemplo,
paraneoplástica) enfermedad nerviosa), el alcoholismo crónico, la
infección por herpes, el SIDA y la quimioterapia. La enfermedad
nerviosa que provoca hiperalgesia puede estar en los nervios
periféricos o en los del SNC. Esta utilización de la invención se
basa en experimentos que muestran que la administración de un
inhibidor de la PKC\varepsilon disminuye significativamente la
hiperalgesia debida a la diabetes, a la quimioterapia o a una
lesión nerviosa traumática.
Se cree que los inhibidores de la
PKC\varepsilon alivian el dolor por interferir con la función de
la PKC\varepsilon en las neuronas aferentes sensoriales (también
conocidos como nociceptores o neuronas aferentes primarias). Estas
neuronas, unas neuronas de ganglios de la raíz dorsal de pequeño o
de medio diámetro ("neuronas DRG"), extendidas por la dermis,
donde sus terminales periféricos están localizados, en las neuronas
laminae superficiales del asta dorsal, donde hace sinapsis con las
neuronas del SNC. En las neuronas aferentes sensoriales, se cree
que la PKC\varepsilon es un segundo mensajero que transduce una
repuesta iniciada por un estímulo nocivo o un agente inductor de la
hiperalgesia.
Algunas de las observaciones que subyacen en la
presente invención se hicieron en experimentos en los que la
hiperalgesia se indujo mediante una inyección intradérmica de
epinefrina en la pata trasera de un ratón o de una rata. La
hiperalgesia inducida por la epinefrina es un sistema modelo para el
estudio de la hiperalgesia que tiene lugar de manera natural, y la
relevancia clínica del sistema se sostiene por el hecho que la
administración local de epinefrina exacerba los síntomas en los
pacientes con dolor neuropático (B. Cboi, M. C. Rowbotham,
Pain 69, 55-63 (1997)) y que la
epinefrina provoca dolor anginal en ausencia de isquemia aparente
(B. Eriksson et al., Am. J Cardiol. 75,
241-245 (1995)). La epinefrina provoca una
hiperalgesia mecánica y térmica dosis dependiente en los terminales
nerviosos sensoriales en la piel por la unión de los receptores
\beta-adrenérgicos en estos terminales nerviosos.
Los receptores \beta-adrenérgicos unidos por la
epinefrina activando a su vez a dos vías de segundos mensajeros
independientes, la vía de la PKC y la vía del AMP cíclico
("cAMP")/proteína quinasa A ("PKA"). Aunque las
prostaglandinas no actúan como mediadores de la hiperalgesia
inducida por la epinefrina, tanto la epinefrina como la
prostaglandina E2 ("PGE_{2}"), aumentan la corriente de
sodio resistente a la tetrodotoxina
(TTX-RI_{Na}), que es importante en la
hiperalgesia inflamatoria inducida por el mediador y la
sensibilización del nociceptor. Desde que los inhibidores de la PKC
disminuyen el efecto de la epinefrina en esa corriente, la
TTX-RI_{Na} puede ser un objetivo de la PKC,
además de la PKA.
La acción directa de la epinefrina en las
neuronas aferentes sensoriales primarias está en contraposición con
otros agentes que inducen la higeralgesia que indirectamente
sensibilizan a estas neuronas. Por ejemplo, la bradiquinina y la
norepinefrina afectan a los nociceptores por motivar a las células
intermedias a liberar prostaglandinas que actúan en los
nociceptores y por motivar a las neuronas simpáticas a enviar
señales a los nociceptores (N. Y. Andreev, N. Dimitrieva, M.
Koltzenburg, S. B. McMahon, Pain 63,
109-115 (1995); S. H. Ferreira, et al.,
Brit. J. Pharmacol 121, 883-888
(1997); Y. O. Taiwo, P. H. Heller, J. D. Levine, Neuroscience
39, 523-531 (1990)). El hecho de que ni la
inhibición de la síntesis de la prostaglandina ni la simpatectomía
de las patas traseras (eliminación de la inervación simpática de las
patas traseras) tuviera ningún efecto en la capacidad de la
epinefrina para inducir la hiperalgesia muestra que es directo el
único modo de acción de la epinefrina. Los efectos directos de la
epinefrina en el nociceptor aferente primario proporcionan además
evidencia de que es un bien modelo para explorar la contribución de
la(s) isozima(s) de la PKC implicada(s) en la
señalización nociceptiva.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
de medida de la capacidad de un compuesto para modular el dolor,
mediante selección, como un compuesto de prueba, un compuesto que
modula la actividad de la PKC\varepsilon, y que administra dicho
compuesto de prueba a un sujeto para determinar si el dolor se
modula tal y como se expone en las reivindicaciones.
Preferentemente, el compuesto inhibirá la actividad de la
PKC\varepsilon. El sujeto será un animal habitualmente utilizado
en la investigación y en el desarrollo del dolor. La capacidad de un
compuesto de prueba para inhibir a la actividad de la
PKC\varepsilon se puede determinar mediante ensayos adecuados
midiendo la función de la PKC\varepsilon. Por ejemplo, las
respuestas tales como su actividad, por ejemplo, la actividad
enzimática, o la capacidad de la PKC\varepsilon para unirse a sus
ligandos, molécula adaptadora o sustrato, se pueden determinar
mediante ensayos in vitro. Los ensayos celulares se pueden
desarrollar para controlar una modulación de la producción del
segundo mensajero, que cambia en el metabolismo celular, o que lleva
a cabo la actividad enzimática. Estos ensayos se pueden realizar
utilizando técnicas convencionales desarrolladas para estos
propósitos. Por último, la capacidad de un compuesto de prueba para
inhibir a la función de la PKC\varepsilon se medirá en modelos
adecuados de animales in vivo.
Realizaciones preferidas de la presente
invención incluyen una composición tal y como se expone en las
reivindicaciones combinando un inhibidor de la PKC\varepsilon con
uno o más agentes adicionales reductores del dolor.
Un medicamento individual del dolor proporciona
a menudo sólo un alivio parcialmente efectivo del dolor porque
interfiere justo con una de las muchas vías de transducción del
dolor. Por ejemplo, los experimentos presentados en la presente
invención muestran que la PKC\varepsilon y la PKA son ambos
segundos mensajeros de la hiperalgesia inducida por la epinefrina.
El dolor asociado con este tipo de hiperalgesia se puede dirigir con
más eficacia mediante la inhibición de tanto la PKC\varepsilon
como la PKA que mediante la inhibición con PKC\varepsilon en
solitario. Otra posibilidad es que los inhibidores de la
PKC\varepsilon se puedan administrar en combinación con un agente
reductor del dolor (un analgésico) que actúa en un punto diferente
en el proceso de percepción del dolor. Un inhibidor de la
PKC\varepsilon puede minimizar el dolor mediante la alteración de
las respuestas de los noniceptores a los estímulos nocivos. Una
clase de analgésicos, tales como los NSAIDs, regula hacia abajo los
mensajeros químicos de los estímulos que se detectan por los
noniceptores y otra clase de fármacos, tales como los opiáceos,
altera el tratamiento de la información noniceptiva en el SNC.
Otros analgésicos son anestésicos, anticonvulsivos y antidepresivos
locales. Administrando una o más clases de fármacos, además de los
inhibidores de la PKC\varepsilon, se pueden proporcionar una
mejora más efectiva del dolor. Los NSAIDs son los componentes
preferidos de la composición de la invención. Los NSAIDs preferidos
son la aspirina, el paracetamol, el ibuprofeno y la
indometacina.
El término "alivio del dolor" tal y como se
utiliza en la presente invención comprende un proceso mediante el
cual el nivel de dolor que un sujeto percibe se disminuye en
relación con el nivel de dolor que el sujeto habría percibido si no
fuera por la intervención. Cuando el sujeto es una persona, el nivel
de dolor que la persona percibe se puede evaluar preguntando a el
o a ella para que describa el dolor o lo compare con otra
experiencia dolorosa. Otra posibilidad es que los niveles de dolor
se puedan calibrar midiendo las respuestas físicas del sujeto al
dolor, tal como la liberación de los factores relacionados con el
estrés de los nervios transductores del dolor en el sistema
nervioso periférico o en el SNC. Uno puede también calibrar niveles
de dolor midiendo la cantidad de un analgésico bien caracterizado
requerido para una persona para informar que el dolor no está
presente o para un sujeto para detener los síntomas expuestos de
dolor. El alivio del dolor puede dar lugar al crecimiento del
umbral en el que un sujeto experimenta un estímulo dado como
doloroso. Puede dar lugar a la hiperalgesia inhibidora, la
sensibilidad destacada a un estímulo nocivo, y dicha inhibición
puede tener lugar sin la nocicepción deteriorada, la sensibilidad
normal del sujeto a un estímulo
nocivo.
nocivo.
"Un sujeto y su necesidad" comprende un
animal o una persona, preferentemente una persona, que se espera
que experimente el dolor en un futuro próximo. Dicho animal o
persona puede tener en curso una condición que esté provocando
actualmente el dolor y lo más probable es que continúe para provocar
el dolor, o el animal o la persona ha estado soportando, está
soportando o soportará un procedimiento o acontecimiento que por lo
general tiene consecuencias dolorosas. Son ejemplos del primer tipo
las condiciones dolorosas crónicas tales como la hiperalgesia
neuropática diabética y las enfermedades del colágeno vascular; son
ejemplos del modelo último el trabajo dental, en particular en un
área de inflamación o en un daño nervioso, y la exposición a
toxinas (incluyendo la exposición a los agentes
quimioterapéuticos).
"Una cantidad eficaz" comprende una
cantidad que da lugar al alivio del dolor. Dicha cantidad eficaz
variará entre sujeto y sujeto, dependiendo de la sensibilidad normal
del sujeto, su altura, su peso, su edad y su salud, la fuente del
dolor, el modo de administrar el inhibidor de la PKC\varepsilon,
el inhibidor especial administrado, y otro factor. Como resultado,
es conveniente para determinar empíricamente una cantidad eficaz
para un sujeto en especial bajo un conjunto especial de
circunstancias.
"Un inhibidor de la isozima \varepsilon de
la proteína quinasa C (PKC\varepsilon)" comprende una molécula
o un grupo de moléculas que interfiere con: (1) la expresión, la
modificación, la regulación o la activación de la PKC\varepsilon,
(2) una o más de las funciones normales de la PKC\varepsilon, o
(3) la expresión, la modificación, la regulación o la activación de
una molécula que actúa cadena abajo de la PKC\varepsilon en una
vía dependiente de la PKC\varepsilon. Las funciones normales de
la PKC\varepsilon, muchas de las cuales son dependientes de la
activación, incluyen la fosforilación de sustratos (es decir, la
actividad catalítica de la PKC\varepsilon), la autofosforilación,
el movimiento desde una localización intracelular hasta otra
activación por encima (es decir, la translocalización intracelular),
y la unión a o la liberación desde uno o más proteínas que aseguran
la PKC\varepsilon en una localización dada. Un inhibidor de la
PKC\varepsilon puede también inhibir a otras isozimas de la PKC.
Sin embargo, un inhibidor selectivo de la PKC\varepsilon inhibe
significativamente una o más funciones normales de la
PKC\varepsilon a una concentración en la que no se inhiben
significativamente a las otras isozimas de la PKC. Un inhibidor
"actúa directamente en la PKC\varepsilon" cuando el
inhibidor se une a la PKC\varepsilon por medio de interacciones
electrostáticas o químicas. Dichas interacciones pueden o no actuar
de mediador mediante otras moléculas. Un inhibidor actúa
"indirectamente en la PKC\varepsilon" cuando su efecto más
inmediato está en una molécula, aparte de la PKC\varepsilon, que
influye en la expresión, la activación o el funcionamiento de la
PKC\varepsilon o en los efectos cadena abajo de la
PKC\varepsilon.
PKC\varepsilon.
Un compuesto o una molécula "modula la
actividad de la PKC\varepsilon" si afecta a (1) una o más de
las funciones normales de la PKC\varepsilon, o a (2) la
expresión, la modificación, la regulación, la activación o la
degradación de la PKC\varepsilon o una molécula que actúa antes
de la PKC\varepsilon en una vía reguladora o enzimática. Las
funciones normales de la PKC\varepsilon, muchas de las cuales son
dependientes de la activación, incluyen la fosforilación de
sustratos (es decir, la actividad catalítica de la
PKC\varepsilon), la autofosforilación, el movimiento desde una
localización intracelular hasta otra activación por encima (es
decir, la translocalización intracelular), y la unión a o la
liberación desde uno o más proteínas que aseguran la
PKC\varepsilon en una localización dada.
La diferencia entre dolor "agudo" y
"crónico" se basa en el tiempo: el dolor agudo se experimenta
pronto (preferentemente dentro de aproximadamente 48 horas, más
preferentemente dentro de aproximadamente 24 horas, mucho más
preferentemente dentro de aproximadamente 12 horas) después de la
incidencia del evento (tal como la lesión inflamatoria o nerviosa)
que llevó a dicho dolor. En comparación, existe un intervalo de
tiempo importante entre la experimentación del dolor crónico y la
incidencia del evento que llevó a dicho dolor. Dicho intervalo de
tiempo es de al menos aproximadamente 48 horas después de dicho
evento, preferentemente al menos aproximadamente 96 horas después
de dicho evento, más preferentemente al menos aproximadamente una
semana después de dicho
evento.
evento.
El "dolor neuropático" comprende el dolor
que surge a partir de las condiciones o eventos que dan lugar en el
daño nervioso. La "neuropatía" comprende un proceso de la
enfermedad que tiene como resultado el daño a los nervios. La
"causalgia" denota un estado de dolor crónico que sigue a la
lesión nerviosa o a una condición o evento, tal como el infarto
cardiaco, que provoca el dolor referenciado. La "alodinia"
comprende una condición en la que una persona experimenta el dolor
como respuesta normalmente a unos estímulos no dolorosos, tal como
un contacto suave. Un "agente analgésico" comprende una
molécula o una combinación de moléculas que provoca una disminución
en el dolor. Un agente analgésico emplea un mecanismo de acción
aparte de la inhibición de la PKC\varepsilon cuando su mecanismo
de acción no implica una unión directa (por medio de interacciones
electrostáticas o químicas) a una disminución en la función de la
PKC\varepsilon o cualquier molécula intracelular en la vía de la
PKC\varepsilon.
Los puntos específicos mencionados en las
definiciones precedentes representan realizaciones preferidas de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se muestra en la Figura 1A, las
inyecciones intradérmicas de 1 ng a 1 \mug de epinefrina en la
superficie dorsal de las pata trasera de una rata produjo una
disminución dosis dependiente (F = 90,7, p < 0,01) en el umbral
en el que la rata retrajo la pata como respuesta a la aplicación de
una fuerza mecánica que se incrementa linealmente mediante el
analgesímetro de Ugo Basile (Stoelting, Chicago, IL). La llegada de
la latencia en esta hiperalgesia inducida por la epinefrina fue
breve - fue indicativo 2 minutos después de 1 \mug de inyección
de epinefrina, alcanzando un efecto máximo en 5 minutos (Figura 2A)
y durando aproximadamente 2 horas (Figura 2B).
Desde que la epinefrina tiene afinidad tanto por
los receptores adrenérgicos \alpha- como por los \beta-
("\alpha-AR" y
"\beta-AR", respectivamente), la contribución
de la \alpha-AR en la hiperalgesia inducida por la
epinefrina se ensayó utilizando fentolamina, un antagonista de la
\alpha-AR. Estudios recientes mostraron que una
dosis similar de fentolamina no tuvo efecto en el umbral de la
retirada de la pata en la rata normal pero invirtió
significativamente la hiperalgesia inducida por la formalina e
inhibió la capacidad de la rolipram, un inhibidor de tipo
fosfodiesterasa IV, para prolongar la hiperalgesia inducida por la
PGE_{2} (J. D. Levine et al., Nature 323,
158-160 (1986); A. K. Ouseph et al.,
Neurosci. 64, 769-776 (1995)). Sin
embargo, la fentolamina no afectó significativamente la
hiperalgesia inducida por la epinefrina (Figura 1A), demostrando que
la \alpha-AR no actúa de mediadora de los efectos
hiperalgesicos de la
epinefrina.
epinefrina.
Para examinar el rol de la
\beta-AR en la hiperalgesia inducida por la
epinefrina, se administraron mediante inyección intradérmica el
propranolol, un antagonista de la \beta-AR, y el
isoproterenol, un agonista selectivo de la
\beta-AR. El isoproterenol produjo hiperalgesia
dosis dependiente en ausencia de la epinefrina (Figura 3). El
propranolol atenuó significativamente tanto la hiperalgesia
provocada por el isoproterenol como la debida a la epinefrina
(Figuras 3 y 1A, respectivamente). De este modo, la epinefrina
produce hiperalgesia por activación de la
\beta-AR.
La bradiquinina y la norepinefrina se conocen
para provocar indirectamente la hiperalgesia, provocando a otras
células para producir prostaglandinas que tienen un efecto
sensibilizante en las neuronas aferentes primarias y estimulando a
las neuronas simpatéticas que influyen en los nociceptores (J. D.
Levine et al., Nature 323,
158-160 (1986); Y. O. Taiwo, P. H. Heller, J. D.
Levine, Neurosci. 39, 523-531 (1990)).
Para ensayar si la epinefrina provoca también indirectamente la
hiperalgesia, la síntesis de la prostaglandina se inhibió mediante
un tratamiento continuo con 4 mg/kg de indometacina (n = 8) y la
contribución de las neuronas simpatéticas se eliminó mediante
simpatectomía (n = 8). Ni el tratamiento de indometacina ni la
simpatectomía tuvo efecto alguno en la capacidad de la epinefrina
para inducir la hiperalgesia (Figura 1B). Esto sugiere que la
epinefrina actúa directamente en las neuronas DRG
noniceptivas.
noniceptivas.
Los roles de la PKC, la proteína quinasa A
("PKA") y el receptor \mu-opiáceo en la
actuación de mediadora de la hiperalgesia inducida por la
epinefrina se evaluó midiendo los efectos de: monofosfato de
Rp-adenosina-3',5'-cíclica
("Rp-cAMPs") y WIPTIDE, ambos inhibidores de
la PKA; SQ22536, un inhibidor de la adenilil ciclasa, un enzima
activado por la PKA; bisindolimaleimida ("BIM"), un inhibidor
no selectivo de las isozimas de la PKC; y
[D-Ala^{2},N-Me-Phe^{4},Gly^{5}-ol]-enquefalina
("DAMGO"), receptor agonista de la
\mu-opiáceo. La dosis por cada inhibidor fue de 1
\mug, excepto para el WIPTIDE, que se administró en una dosis de
100 ng. El DAMGO se coinyectó con epinefrina mientras que los otros
inhibidores se aplicaron 15 minutos antes que la inyección de
epinefrina. Tal y como se muestra en la Tabla 1, todos los
inhibidores atenuaron significativamente la hiperalgesia inducida
por la epinefrina, mostrando que la hiperalgesia inducida por la
epinefrina actúa de mediadora por las vías de la PKC y de la PKA y
por los receptores del \mu-opiáceo. La misma
dosis de BIM no tuvo efecto en la hiperalgesia inducida por la
PGE_{2} pero atenuó significativamente la hiperalgesia inducida
por el isoproterenol. En contraste, la misma dosis de WIPTIDE
también atenuó significativamente la hiperalgesia inducida por la
PGE_{2} y suprimió casi por completo la hiperalgesia inducida por
el isoproterenol. Esto muestra un rol para la PKA en tanto la
hiperalgesia mediada por la prostaglandina como en la hiperalgesia
mediada por la \beta-AR y un rol para la PKC en
ésta sola.
Para ensayar si la hiperalgesia inducida por la
epinefrina medida utilizando modelos de conducta se debe a la
acción directa de la epinefrina en los nociceptores aferentes
primarios, los experimentos patch-clamp de
célula entera se realizaron en la disociación de neuronas DRG de
pequeño diámetro dentro de las 12 - 24 horas de baño. Se han
mostrado anteriormente estas neuronas para servir como modelo para
los terminales nociceptores periféricos (P. I. Baccaglini and P. G.
Hogan, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 80,
594-598 (1983); S. Pitchford and J. D. Levine,
Neurosci. Let. 132, 105-108 (1991); S.
England et al., J. Physiol. Londres 495,
429-440 (1996); M. S. Gold et al.,
Neurosci. 71, 265-275 (1996)).
Se realizaron grabaciones de modo de fijación de
corriente utilizando la técnica de célula entera de sello
perforado. El número de potenciales de acción generados durante una
inyección de corriente despolarizante de rampa/meseta de 750 ms,
además de la latencia al primer pico, se utilizaron como una medida
de la excitabilidad. Después de 5 - 10 minutos de grabaciones de la
línea base, se añadió la epinefrina (1 \muM) al baño. La Figura
4A muestra las señales de voltaje de una neurona típica antes y
durante la exposición a 1 \muM de epinefrina, mientras que la
Figura 4B muestra el ciclo de tiempo de los cambios en el número de
potenciales de acción y la latencia al primer potencial de acción
de otra célula. Para 11 neuronas tratadas con 1 \muM de
epinefrina, el número promedio de potenciales de acción generado
como respuesta a la corriente de rampa/meseta fue de 1,7 \pm 0,2
antes de la adición de epinefrina y de 5,3 \pm 0,9 cinco minutos o
más después del inicio de la perfusión del fármaco (p < 0,005).
Cuando la epinefrina no está presente, la latencia promedio desde el
inicio de la inyección de corriente hasta el máximo del primer pico
fue de 278 \pm 42 ms; siguiendo la perfusión de epinefrina, la
carencia promedio fue de 189 \pm 21 ms (n = 11, p < 0,05).
Nueve (el 81%) de las 11 neuronas ensayadas mostraron un incremento
en el número de picos y 5 (el 45%) de estas neuronas mostraron
también una disminución en la latencia de pico de al menos 50 ms.
Los potenciales restantes promedio no se afectaron por la
epinefrina.
El hecho de que la adición de 10 \muM de
propranolol 30 segundos antes de y con 1 \muM de epinefrina
suprimió el incremento en el número de picos (1,2 \pm 0,1 antes y
1,3 \pm 0,2 después de la adición de la epinefrina, n = 7, p
< 0,05) y la disminución en la latencia al primer pico (235 \pm
9 ms antes y 233 \pm 10 ms después de la adición de la
epinefrina, n = 7, p < 0,05) normalmente provocado por la
epinefrina demuestra que, como en los estudios de conducta, la
epinefrina actúa en las neuronas aferentes primarias por la
activación de la \beta-AR.
Desde que los agentes hiperalgésicos que
sensibilizan a los nociceptores in vitro se han mostrado
para incrementar la TTX-RI_{Na} (S. England et
al., J. Physiol. Londres 495,
429-440 (1996); M. S. Gold et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93,
1108-1112 (1996)), se examinó el efecto de la
epinefrina en la TTX-RI_{Na}. Tal y como se
muestra en la Figura 5, 1 \muM de epinefrina causó una
potenciación marcada de la TTX-RI_{Na}, cambiando
las líneas corriente - voltaje por la activación mediante
aproximadamente 10 mV en la dirección hiperpolarizada (Figura 5B).
Esta dosis de epinefrina causó un incremento en la
TTX-RI_{Na} en 14 de 21 neuronas (el 67%). Desde
que la aplicación de isoproterenol produjo resultados similares que
la epinefrina (Figura 5C) y que 2 \muM de propranolol eliminaron
esta potenciación pero 5 \muM de fentolamina no la eliminaron,
los efectos de la epinefrina en la TTX-RI_{Na}
actuaron de mediadores por la \beta-AR y no por
la \alpha-AR.
Los roles de la PKC y de la PKA en la actuación
como mediadoras de la potenciación de la
TTX-RI_{Na} inducida por la epinefrina se ensayó
mediante la adición de 1000 \muM de Rp-cAMPs o de
100 \muM de BIM. El Rp-cAMPs suprimió y el BIM
disminuyó significativamente (n = 11, p < 0,01) la potenciación
de la TTX-RI_{Na} inducida por la epinefrina
(Figuras 7 y 8), demostrando de este modo la participación de las
vías de la PKA y de la PKC. La inhibición de la PKC mediante el BIN
disminuyó el número de neuronas (5 de 11 frente a 8 de 11) que
respondieron a la epinefrina y a la magnitud de sus respuestas
(incremento de la corriente máxima principal del 32% frente al
49%).
De este modo, la hiperalgesia inducida por la
epinefrina manifestada por animales es debida a la estimulación de
epinefrina de los receptores \beta-adrenérgicos y
a las vías de la PKC y la PKA en los nociceptores aferentes
primarios.
Uno de los procedimientos más poderosos para
ensayar el rol de una proteína en un proceso es generar células
mutantes de animales que carecen de la proteína y comparar el
proceso en animales mutantes con la proteína en su equivalente
normal. Para examinar si la PKC\varepsilon representa un rol en
el dolor señalizado, los ratones con PKC\varepsilon mutante
homocigotos se generaron mediante recombinación homóloga, la
producción de los ratones quiméricos y la reproducción posterior.
Se describe en detalle la construcción de estos ratones en la
Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos titulada
"PKC\varepsilon as Modulator of Anxiety" y presentada el 6
de julio de 1998. Los ratones con PKC\varepsilon mutante son
viables y se distinguen de las crías normales en el ambiente normal
de la jaula. Por otra parte, no mostra-
ron anomalías anatómicas la hematoxilina y la eosina que tiñen al cerebro, a la médula espinal y a las neuronas DRG.
ron anomalías anatómicas la hematoxilina y la eosina que tiñen al cerebro, a la médula espinal y a las neuronas DRG.
La nocicepción mecánica, térmica y química se
evaluó en los ratones normales y en los ratones con
PKC\varepsilon mutante. Tanto para los ratones normales (n = 8)
como para los ratones con PKC\varepsilon mutante (n = 8), el
umbral nociceptivo mecánico basal se midió como la frecuencia en
que los ratones retiran sus patas después de ser golpeadas en las
patas traseras con un Filamento de von Frey ("VFH"; Stoelting
Co.) aplicando una fuerza de 4, 6,9 o 14,8 gramos. Tal y como se
muestra en la Figura 9A, la respuesta del retraimiento porcentual
después de la estimulación VFH fue similar tanto en los ratones
normales como en los ratones mutantes. Cuando se administraron 100
ng de epinefrina o de prostaglandina E_{2} ("PGE_{2}")
mediante inyección intraplantar antes de la estimulación VFH, la
respuesta del retraimiento porcentual a una intensidad en concreto
del estímulo VFH incrementó de manera espectacular en los normales,
indicando que los compuestos inyectados bajan los umbrales
nociceptivos (E. Kinnman, J. D. Levine, Neuroscience 64,
751-767 (1995)). Mientras que los ratones mutantes
de los ratones y los ratones normales demostraron unas respuestas
del retraimiento porcentual similares a la estimulación VFH después
de la exposición a PGE_{2}, la respuesta de la retirada porcentual
que sigue a la inyección de la epinefrina fue significativamente
inferior (p = 0,0013 para 4 gramos de VHF; p = 0,0692 para 6,9
gramos de VHF; y p = 0,0023 para 14,8 gramos de VHF) en los
ratones con PKC\varepsilon mutante que en los ratones normales
(Figura 9A).
Cuando los umbrales nociceptivos térmicos se
determinaron mediante el ensayo nociceptivo térmico de Hargreave
(K. O. Aley, D. B. Reichling, J. D. Levine, Neuroscience
73, 259-265 (1996)), los ratones normales (n
= 8) y los ratones mutantes (n = 8) demostraron umbrales basales
similares y respuestas similares a la PGE_{2}, pero los animales
con PKC\varepsilon mutante manifestaron significativamente una
disminución (p = 0,0006) de la hiperalgesia térmica inducida por la
epinefrina comparada con sus crías normales (Figura 9B).
La hiperalgesia química inducida en los ratones
normales (n = 4) y en los ratones mutantes (n = 4) se determinó
mediante el writhing test del ácido acético (S. J. Ward, A.
E. Takemori, J. Pharmacol. Exp. Ther. 224,
525-530 (1983)). Tal y como se demuestra en la
Figura 9C, los ratones con PKC\varepsilon mutante tienen
significativamente superiores (p = 0,0124) umbrales nociceptivos
que los animales normales.
La presencia de respuestas normales mediadas por
la PGE_{2} en los ratones con PKC\varepsilon mutante concuerda
con los datos que indican que la hiperalgesia y la sensibilización
de la PGE_{2} no es dependiente en la PKC, pero en cambio es
dependiente en la PKA (G. R. Lewin. A. M. Ritter. L. M. Mendell.
J. Neurosci. 13, 2136-2148 (1993)).
Estos estudios sugieren que un defecto en la transducción de señal
mediada por la PKC\varepsilon explica la disminución de la
hiperalgesia mediada por la epinefrina en los ratones con
PKC\varepsilon mutante. El inferior resultado en el writhing
test del ácido acético en los ratones con PKC\varepsilon
mutante sugiere también que la PKC\varepsilon contribuye con el
dolor inflamatorio. Las conclusiones de que la PKC\varepsilon no
contribuye en los umbrales nociceptivos de la línea base y de que
los ratones mutantes actúan y aparecen de forma normal indican que
los inhibidores de la PKC\varepsilon pueden mejorar el dolor sin
provocar graves efectos secundarios sistémicos o sin afectar a las
respuestas noniceptivas normales.
\vskip1.000000\baselineskip
Para confirmar que las respuestas hiperalgésicas
de los ratones con PKC\varepsilon mutante que se presenta en el
Ejemplo 3 se debieron al rol de la PKC\varepsilon en estos
procesos antes que un posible requisito para la PKC\varepsilon
durante el desarrollo del sistema nervioso, las respuestas
nociceptiva e hiperalgésica de las ratas
Sprague-Dawley adultas normales (200 - 250 gm)
obtenidas a partir de Bantin-Kingman (Fremont CA) se
examinaron inmediatamente siguiendo el tratamiento con un inhibidor
selectivo de la PKC\varepsilon, el péptido
\varepsilonV1-2. Este péptido inhibe
selectivamente la isozima \varepsilon de la PKC mediante la
interferencia con su transposición inducida por la activación en
presencia de \varepsilonV1-2, afectando a la
unión de la PKC\varepsilon a la \beta'COP, su proteína de
anclaje (J. A. Johnson, M. O. Gray, C. - H. Chen, D.
Mochly-Rosen, J. Biol. Chem. 271,
24962-24966 (1996); M. Csukai, C. - H. Cehn, M. A.
De Matteis, D. Mochly-Rosen, J. Biol. Chem.
272, 29200-29206 (1997); B. Hundle, et
al., J. Biol. Chem. 272,
15028-15035 (1997)).
Para ensayar el nociceptivo mecánico, el reflejo
de la flexión nociceptiva se cuantificó utilizando un analgesímetro
de Ugo Basile que aplica una fuerza que aumenta constantemente
medida en gramos (Stoelting, Chicago, IL; K. O. Aley, J. D. Levine,
J. Neurosci. 17, 8018-23 (1997)). El
umbral mecánico basal promedio para las ratas utilizadas en estos
experimentos fue de 105,3 \pm 2,8 gramos. Los efectos de los
agentes epinefrina (100 ng) y PGE_{2} (100 ng) que inducen la
hiperalgesia en los umbrales nociceptivos mecánicos se determinaron
midiendo las frecuencias del retraimiento de las patas en 15, 20, y
25 minutos después de la administración del agente hiperalgésico y
calculando entonces el promedio de estas tres lecturas. Tal y como
se muestra en la Figura 10E, los umbrales nociceptivos mecánicos de
ratas (n = 8) que recibieron inyecciones de agua estéril en la
almohadilla plantar (para crear un ambiente hipotónico) y 1 mg de
una versión de secuencia alterada del péptido
\varepsilonV1-2 antes de que el tratamiento de la
epinefrina fuera muy similar a aquellas ratas (n = 8) tratadas sólo
con la epinefrina; ambos grupos mostraron una disminución del umbral
de aproximadamente 25 - 30%. En contrate, las ratas (n = 8) que
reciben inyecciones de agua estéril en la almohadilla plantar (para
crear un ambiente hipotónico) y 1 mg de del péptido
\varepsilonV1-2 antes del tratamiento de la
epinefrina, expusieron significativamente menos disminución del
umbral inducido por la epinefrina (Figura 10E). Tal y como se
esperaba, las ratas que recibían la
\varepsilonV1-2 y la PGE_{2} (n = 10) mostraron
disminuciones del umbral que fueron indistinguibles de aquellas
ratas que recibieron sólo la PGE_{2} (n = 10). Estos resultados
demostraron que la inhibición de la PKC\varepsilon en neuronas
adultas disminuye la hiperalgesia mediada por la epinefrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para calcular la contribución de las isozimas de
la PKC aparte de a la hiperalgesia inducida por la epinefrina,
coinyectamos la epinefrina con un inhibidor de la PKC que no es una
isozima selectiva, bisindolimaleimida I ("BIM", D. Toullec,
et al., J. Biol. Chem. 266,
15771-15781 (1991)), y comparamos los umbrales
nociceptivos resultantes con los registrados siguiendo las
inyecciones consecutivas del péptido
\varepsilonV1-2 y la epinefrina. Como el BIM
inhibe la hiperalgesia inducida por la epinefrina a una extensión
similar como la \varepsilonV1-2 (Figura 10D), la
PKC\varepsilon aparece para ser la única isozima de la PKC
implicada en la hiperalgesia inducida por la epinefrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la(s)
localización(es) de la actividad transducida por la
hiperalgesia de la PKC\varepsilon, se examinó la distribución
celular de la PKC\varepsilon. A los ratones y a las ratas
anestesiados se les realizó una perfusión transcardiaca con PBS
(137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1,47 mM de KH_{2}PO_{4}, 8 mM de
Na_{2}HPO_{4}, 0,5 mM de MgCl_{2}, 0,9 mM de CaCl2, pH 7,2) y
después con paraformaldehido al 4% en PBS. Se sacaron las médulas
espinales y las DRGs y se ubicaron en paraformaldehido al 4% durante
3 horas, después en PBS que contiene un 20% de sacarosa durante 24
horas y un 40% de sacarosa durante 24 horas. Se cortaron secciones
(5 - 10 \mum) utilizando un micrótomo refrigerado (Leica
SM2000R), y se trató con metanol : acetona (1:1) durante 10 minutos
a -20ºC. Se incubaron las neuronas DRG a 25ºC en PBS/suero normal de
cabra al 1%/Tween-20 al 0,05% durante 1 hora, y
después en la misma solución tampón que contiene anti
PKC\varepsilon policlonal (dilución 1:300, Santa Cruz
Biotechnology) durante 1 - 2 horas. Las secciones se visualizaron
utilizando IgG de cabra contra conejo conjugada con isotiocianato
de fluoresceína FITC (dilución 1:50, Vector Laboratories,
Burlingame, CA). Para la inmunocitoquímica, se pretrataron las
secciones de medula espinal con H_{2}O_{2} al 3% antes de la
incubación con suero normal de cabra al 4% y con
Tween-20 al 0,05% en un Superblock (Pierce). Se
incubaron entonces las muestras con anticuerpo anti
PKC\varepsilon policlonal (dilución 1:300) toda la noche en
PBS/Tween-20 al 1%, y se detectó la
inmunoreactividad utilizando el equipo ABC (Vector) con
diaminobenzamina seguido por un aumento con tetraóxido de osmio al
0,02%.
La PKC\varepsilon estaba presente en el 70
\pm 2% de las neuronas DRG en los ratones adultos normales (n =
6), incluyendo a las neuronas DRG de diámetro más pequeño y de
muchos diámetros medios (Figura 11A y C). En las ratas, las
neuronas DRG de tamaño similar expresan la PKC\varepsilon (Figura
10A).
Desde que las neuronas DRG noniceptivas terminan
en el asta dorsal de la médula espinal, la distribución de la
PKC\varepsilon se examinó también en las médulas espinales de los
ratones normales y de los ratones con PKC\varepsilon mutante. En
las médulas espinales de un ratón normal (n = 4), se detectó la
PKC\varepsilon en el asta dorsal superficial (Figura 3D). De este
modo, la PKC\varepsilon está presente en las fibras nerviosas
aferentes primarias de las neuronas DRG. En los ratones con
PKC\varepsilon mutante, no se detectó la PKC\varepsilon en la
médula espinal (Figura 11B).
Para dirigir la posibilidad de que la inyección
intradérmica del péptido \varepsilonV1-2 o de BIM
bloqueó la hiperalgesia por inhibición de la PKC\varepsilon en
células no neuronales que residen en la dermis, la piel de ratas
normales se tiñen con anticuerpo de PKC\varepsilon. Se detectó la
PKC\varepsilon en una banda delgada en la capa basal de la
epidermis, pero fue perceptible la PKC\varepsilon en la dermis.
La preabsorción del anticuerpo
anti-PKC\varepsilon con el péptido inmunizado
eliminó el teñido, demostrando que es específico. Estos resultados
indican que, desde que la PKC\varepsilon no está presente en la
dermis, los inhibidores de la PKC\varepsilon inyectados
intradérmicamente no actúan por inhibición de la PKC\varepsilon
en el tejido conectador dérmico. Mejor dicho, estos datos combinados
con los presentados anteriormente condujeron a la conclusión de que
los inhibidores de la PKC\varepsilon inyectados en la dermis
entran en las neuronas aferentes primarias (neuronas DRG de pequeño
y medio diámetro) y actúan en la PKC\varepsilon presente en estas
células.
La inmunoreactividad de la PKC\varepsilon se
presentó en las neuronas DRG de pequeño y mediano tamaño y en las
laminas superficiales del asta dorsal de la médula espinal donde
terminan las aferencias nociceptivas. Por otra parte, la inyección
intradérmica de un péptido inhibidor de la PKC\varepsilon
disminuyó la hiperalgesia inducida por la epinefrina; este péptido
se inyectó después de la inyección de la solución hipotónica, un
procedimiento efectivo para introducir péptidos en las
terminaciones nerviosas periféricas (L. K. West, L. Huang,
Biochemistry 19, 4418-4423 (1980)).
Desde que otros tipos de células en la dermis no expresaban la
PKC\varepsilon, estos resultados indican que la PKC\varepsilon
que reside en las neuronas DRG es necesaria para el efecto
hiperalgésico de la epinefrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los humanos que se someten con frecuencia a la
quimioterapia experimentan la hiperalgesia. La vincristina es un
fármaco quimioterapéutico conocido por provocar dicha hiperalgesia,
y se estableció un modelo de rata de la hiperalgesia inducida por
la vincristina como sigue. Se administró la vincristina diariamente
por vía intravenosa (100 \mug/kg en solución salina; Sigma
Chemical Catalog) a cada una de las 32 ratas por un periodo de dos
semanas. Después del segundo día de la administración de la
vincristina, las ratas demostraron que una disminución dosis
dependiente aguda en los umbrales nociceptivos mecánicos y una
respuesta aumentada ("hiperalgesia") a los estímulos mecánicos
no nocivos, administrada por el analgesímetro de Ugo Basile,
relativa para controlar a las ratas que no mostraron ningún déficit
motor importante (como el medido mediante el análisis de Rotorod).
Durante la segunda semana de la administración de la vincristina,
las ratas tratadas con la vincristina expusieron umbrales
nociceptivos mecánicos crónicos más bajos y la respuesta aumentada a
los estímulos mecánicos no nocivos 24 horas después del tratamiento
más reciente de la vincristina. Las respuestas a los estímulos
mecánicos disminuyeron gradualmente hasta la línea base durante las
dos horas que siguen a la suspensión del tratamiento de la
vincristina.
Para determinar si la administración de un
inhibidor de la PKC\varepsilon aliviaría la hiperalgesia inducida
por la vincristina en el modelo de rata descrito anteriormente, en
el decimotercero día del tratamiento de la vincristina, las ratas
no recibieron tratamiento (n = 16) o recibieron inyecciones
intradérmicas de agua estéril seguidas de inyecciones intradérmicas
de 1 \mug de \varepsilonV1-2, un péptido
inhibitorio de la PKC\varepsilon (n = 8; etiquetado como
"PKC\varepsilonI" en la Figura 12A), o 1 \mug de
S-V\varepsilonV1-2, una versión de
secuencia alterada del péptido \varepsilonV1-2 (n
= 8; etiquetado como "PCK\varepsilonI SCR" en la Figura 12A),
20 - 30 minutos antes de la administración de un estímulo mecánico.
Tal y como se muestra en la Figura 12A, la hiperalgesia crónica
inducida por la vincristina disminuyó significativamente por la
administración del inhibidor de la PKC\varepsilon (p < 0,05)
pero no se vio afectada por el péptido inhibidor de secuencia
alterada. Estos datos demuestran que la inhibición de la
PKC\varepsilon alivia el dolor debido a la lesión nerviosa
tóxica, tal como la inducida por un fármaco quimioterapéutico.
Las personas con diabetes incontrolada o mal
controlada experimentan con frecuencia la hiperalgesia. El rol de
la PKC\varepsilon en neuropatía diabética se examinó en un modelo
de diabetes en el que ratas Sprague-Dawley macho
reciben una inyección subcutánea de estreptozotocina (70 mg/kg), una
toxina de \beta-célula pancreática. Estas ratas
exponen hiperglucemia y glucosuria dentro de las 24 horas después de
la inyección y muestran una disminución de los umbrales
nociceptivos como respuesta a los estímulos mecánicos administrados
por el analgesímetro de Ugo Basile en la pata trasera después de
una semana (Ahlgren, S.C. et al, J. Neurophysiology,
68, 2077-2085 (1992); Ahlgren, S.C. y
Levine, J.D., Neuroscience 52,
1049-1055 (1993)). Cuatro semanas después de la
inyección de estreptozotocina, cada rata no recibió tratamiento (n
= 8) o recibió una inyección intradérmica de agua estéril seguida
de unas inyecciones intradérmicas de (1) 1 \mug de
bisindolimaleimida, una proteína inhibidora de la quinasa C (n = 4;
etiquetada como "BIM" en la Figura 12B), (2) 1 \mug de
\varepsilonV1-2, un péptido inhibitorio de la
PKC\varepsilon (n = 8; etiquetado como "PKC\varepsilonI" en
la Figura 12B), o (3) 1 \mug de
S-V\varepsilonV1-2, una versión de
secuencia alterada del péptido \varepsilonV1-2 (n
= 4; etiquetado como "PCK\varepsilon1 SCR" en la Figura 12B)
y posteriormente se expusieron a los estímulos mecánicos. Tal y
como se muestra en la Figura 12B, la administración de
bisindolimaleimida o de \varepsilonV1-2 disminuyó
de forma notoria la disminución inducida por la diabetes en el
umbral nociceptivos (ambos con p < 0,05) pero el tratamiento con
el péptido de secuencia alterada tuvo un pequeño efecto en la
disminución en el umbral nociceptivo. Estos datos demostraron que
la PKC\varepsilon es la principal^{1}.
^{1}Desde que la
bisindolimaleimida causó una disminución un tanto mayor en la
disminución porcentual en el umbral nociceptivo que en la
PKC\varepsilonI, es posible que una o más isozimas de la PKC
aparte de la PKC\varepsilon tengan roles en la actuación como
mediadora de la hiperalgesia inducida por la diabetes, en la isozima
de la PKC que modula la hiperalgesia en diabéticos y en que la
administración de los inhibidores de la PKC\varepsilon alivia el
dolor asociado con la neuropatía
diabética.
\vskip1.000000\baselineskip
El modelo de lesión nerviosa traumática de
Seltzer (Seltzer, Z. et al, Pain 43,
205-218 (1990)) se utiliza para investigar el rol
de la PKCs en la modulación de la hiperalgesia inducida por la
lesión nerviosa traumática. Después de establecer los lugares en la
orientación dorsal de la pata trasera en que la lesión nerviosa
traumática ha provocado la hiperalgesia, las ratas no reciben
tratamiento o reciben inyecciones intradérmicas de agua estéril en
tal lugar seguida por inyecciones intradérmicas de (1) 1 mg de
bisindolimaleimida, (2) 1 \mug de
\varepsilonV1-2, o (3) 1 \mug de
S-V\varepsilonV1-2. Posteriormente
se analizan las respuestas a los estímulos mecánicos, y los
inhibidores de la PKC\varepsilon se muestran en al menos la
hiperalgesia parcialmente inversa asociada con la lesión nerviosa
traumática.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos de retorcimiento con ácido
acético presentados en el Ejemplo 3 indican que la PKC\varepsilon
contribuye al dolor inflamatorio. Para investigar si la
PKC\varepsilon actúa de mediadora de la hiperalgesia inducida por
otros agentes inflamatorios, las ratas recibieron inyecciones
intradérmicas de 10 \mul de una solución de carragenano al 1%, un
potente agente irritante (Ferreira, S.H. et al, Nature
334, 698-700 (1988)) y tres horas y media después,
las ratas no recibieron tratamiento (n = 12; etiquetado como
"Car-4" en la Figura 13) o recibieron
inyecciones intradérmicas de agua estéril seguido de inyecciones
intradérmicas de 1 \mug de \varepsilonV1-2, un
péptido inhibitorio de la PKC\varepsilon (n = 6; etiquetado como
"\varepsilonV" en la Figura 13), o 1 \mug de
S-V\varepsilonV1-2, una versión
de secuencia alterada del péptido \varepsilonV1-2
(n = 6; etiquetado como "S-\varepsilonV" en
la Figura 13). Cuando se aplicaron 30 minutos después los estímulos
mecánicos, tal y como se muestra en la Figura 13, las ratas que
recibieron sólo el carragenano o tanto el carragenano como el
péptido de secuencia alterada mostraron considerable hiperalgesia.
En comparación, las ratas que recibieron el carragenano y el péptido
inhibitorio de la PKC\varepsilon casi no mostraron hiperalgesia
mecánica. Estos datos demuestran que la administración de un
inhibidor de la PKC\varepsilon disminuye significativamente la
hiperalgesia inducida por el carragenano.
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar el rol, si lo hay, de la
PKC\varepsilon en el dolor inflamatorio crónico, se desarrolló el
siguiente sistema de modelo para el dolor inflamatorio crónico. Las
ratas recibieron inyecciones intradérmicas de carragenano, un
agente inflamatorio, en la pata trasera. Después de 3 - 4 días que
siguen a la administración del carragenano, las ratas expusieron
hiperalgesia mecánica, tal y como se calculó mediante el ensayo de
retraimiento de las patas de Randall - Selitto. Esto se consideró
como una respuesta aguda a la inflamación inducida por el
carragenano. Aunque la administración de Prostaglandina E2
("PGE_{2}"), de 5-hidroxitriptamina
("5-HT", serotonina) o de
CGS-21680 (un receptor agonista selectivo de la
adenosina A2) provoca normalmente ratas sin tratar (esto es, ratas
que no han recibido inyecciones de carragenano) para experimentar
hiperalgesia perdurable más de 6 horas, la hiperalgesia
experimentada por las ratas sensibilizadas al carragenano que sigue
a la administración de cualquiera de estas substancias duró más de
24 horas. Esta hiperalgesia prolongada se vio en dichas ratas tres
semanas después de la inyección del carragenano. Estos datos
establecen un modelo de dolor inflamatorio prolongado crónico y
sugieren que los cambios inducidos por la inflamación aguda
persisten durante un largo periodo de tiempo.
Por lo general el rol de las enzimas de la
proteína quinasa C, y en particular la isozima PKC\varepsilon, en
la modulación del dolor inflamatorio crónico se ensayó mediante la
administración de 1 \mug de bisindolimaleimida ("BIM," un
inhibidor de la PKC\varepsilon no selectivo) o 1 \mug de
\varepsilonV1-2 (un péptido que inhibe
selectivamente a la PKC\varepsilon) varios días después de la
inyección del carragenano, y posteriormente tratando a las ratas con
PGE_{2} y midiendo la hiperalgesia resultante. La hiperalgesia
inducida por la PGE_{2} prolongada vista normalmente en las ratas
sensibilizadas al carragenano se inhibió por la administración del
BIM o de la \varepsilonV1-2. Estos datos muestran
que la hiperalgesia inducida por la PGE_{2} prolongada es
dependiente por encima de la actividad de la PKC\varepsilon y
demuestra que la administración de un inhibidor de la
PKC\varepsilon alivia el dolor aumentado crónico debido a la
inflamación previa.
Para examinar si la proteína quinasa C modula
los procesos por los que un evento inflamatorio breve provoca
hiperalgesia prolongada muchos días después, las ratas recibieron el
carragenano y 1 \mug de inyecciones de BIM a la vez. La
hiperalgesia se midió 72 horas después, cuando las ratas se trataron
con PGE_{2}. La administración de BIM a la vez que el carragenano
atenuó tanto la hiperalgesia aguda inducida normalmente por la
exposición al carragenano como la hiperalgesia prolongada observada
normalmente cuando se tratan las ratas con el PGE_{2} o muchas
horas después de la exposición al carragenano. Estos datos
demostraron que la PKC modula tanto a la hiperalgesia aguda como a
la crónica. Por lo tanto, la administración de un inhibidor de la
PKC aproximadamente a la vez que el agente inflamatorio que da
origen a la hiperalgesia prolongada crónica o aproximadamente a la
vez que el estímulo inducido por la hiperalgesia, pueden aliviar
dicha hiperalgesia crónica. La administración de la
\varepsilonV1-2 en vez de BIM confirmó que estos
efectos se debían a la isozima PKC\varepsilon y mostraron que la
administración de un inhibidor selectivo de la PKC\varepsilon
inmediatamente antes, durante o después del evento inflamatorio
alivia tanto el dolor agudo debido a dicho evento como interfiere el
mecanismo que conduce al dolor crónico que sigue a dicho
evento.
Claims (17)
1. Inhibidor de la isozima \varepsilon de la
proteína quinasa C (PKC\varepsilon) para utilizar en un
procedimiento de alivio del dolor, comprendiendo dicho
procedimiento:
- administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de la isozima e de la proteína quinasa C (PKC\varepsilon), en el que dicha cantidad eficaz es una que no inhibe significativamente otras isozimas de la PKC, y
en el que dicho inhibidor provoca dicho alivio
del dolor al interferir con la actividad de la PKC\varepsilon,
y
en el que dicho inhibidor es un péptido
seleccionado del grupo consistente en:
\varepsilonV1-1,
\varepsilonV1-2,
\varepsilonV1-3,
\varepsilonV1-4,
\varepsilonV1-5 y
\varepsilonV1-6.
2. Inhibidor según la Reivindicación 1, en el
que dicha administración da lugar a una disminución de la
hiperalgesia sin una disminución de la nocicepción.
3. Inhibidor según la Reivindicación 1, en el
que dicho procedimiento comprende también la administración de un
compuesto del grupo consistente en: un inhibidor de la proteína
quinasa A (PKA), un inhibidor del cAMP, un fármaco antiinflamatorio
no esteroideo, un anestésico local, un anticonvulsivo, un
antidepresivo y un opiáceo.
4. Inhibidor según la Reivindicación 1, en el
que dicho dolor es agudo o crónico.
5. Inhibidor según la Reivindicación 1, en el
que dicho dolor es inflamatorio o neuropático.
6. Inhibidor según la Reivindicación 5, en el
que:
dicho dolor inflamatorio se debe a la quemadura
solar, la osteoartritis, la colitis, la carditis, la dermatitis, la
miositis, la neuritis o la enfermedad del colágeno vascular, y
dicho dolor neuropático se debe a la causalgia,
la diabetes, las enfermedades del colágeno vascular, la neuralgia
trigeminal, la lesión de la médula espinal, la lesión del tronco
cerebral, el síndrome del dolor talámico, el cáncer, el alcoholismo
crónico, el derrame cerebral, el absceso, las enfermedades
desmielinizantes, la infección por herpes, el SIDA, el traumatismo,
la cirugía, la amputación, toxinas o la quimioterapia.
7. Procedimiento de medición de la capacidad de
un compuesto de prueba para modular el dolor, comprendiendo dicho
procedimiento:
- seleccionar, como compuesto de prueba, un inhibidor de la isozima \varepsilon de la proteína quinasa C (PKC\varepsilon), en el que el inhibidor inhibe significativamente la PKC\varepsilon a una concentración en la que las otras isozimas de la PKC no se inhiben significativamente, y
- medir la capacidad del inhibidor para modular el dolor en un modelo animal del dolor,
en el que dicho compuesto de prueba
modula el dolor en dicho sujeto modulando la actividad de la
PKC\varepsilon.
8. Composición que comprende un inhibidor de la
isozima \varepsilon de la proteína quinasa C (PKC\varepsilon),
en el que el inhibidor inhibe significativamente la
PKC\varepsilon a una concentración en la que las otras isozimas de
la PKC no se inhiben significativamente, y un agente analgésico,
teniendo dicho agente analgésico un mecanismo de acción diferente
de la inhibición de la PKC\varepsilon, en el que dicho inhibidor
es un péptido seleccionado del grupo consistente en:
\varepsilonV1-1,
\varepsilonV1-2,
\varepsilonV1-3,
\varepsilonV1-4, \varepsilonV1-5
y \varepsilonV1-6.
9. Composición según la Reivindicación 8, en la
que dicho agente analgésico se selecciona del grupo consistente en:
un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, un opiáceo, un anestésico
local, un anticonvulsivo y un antidepresivo.
10. Utilización de un inhibidor de la isozima
\varepsilon de la proteína quinasa C (PKC\varepsilon), en el que
el inhibidor inhibe significativamente la PKC\varepsilon a una
concentración en la que las otras isozimas de la PKC no se inhiben
significativamente, en la preparación de un medicamento para el
tratamiento del dolor, y en el que dicho inhibidor provoca dicho
tratamiento del dolor interfiriendo con la actividad de la
PKC\varepsilon.
11. Utilización según la Reivindicación 10, en
el que dicho inhibidor es un inhibidor selectivo de la
PKC\varepsilon.
12. Utilización según la Reivindicación 11, en
el que dicho inhibidor selectivo es un péptido seleccionado del
grupo consistente en: \varepsilonV1-1,
\varepsilonV1-2,
\varepsilonV1-3,
\varepsilonV1-4, \varepsilonV1-5
y \varepsilonV1-6.
13. Utilización según la Reivindicación 10, en
el que dicho inhibidor da lugar a una disminución de la hiperalgesia
sin una disminución de la nocicepción.
14. Utilización según la Reivindicación 10, en
el que dicho medicamento comprende también un compuesto del grupo
consistente en: un inhibidor de la proteína quinasa A (PKA), un
inhibidor del cAMP, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, un
anestésico local, un anticonvulsivo, un antidepresivo y un
opiáceo.
15. Utilización según la Reivindicación 10, en
el que dicho dolor es agudo o crónico.
16. Utilización según la Reivindicación 10, en
el que dicho dolor es inflamatorio o neuropático.
17. Utilización según la Reivindicación 16, en
el que
dicho dolor inflamatorio es debido a la
quemadura solar, la osteoartritis, la colitis, la carditis, la
dermatitis, la miositis, la neuritis o la enfermedad del colágeno
vascular, y
dicho dolor neuropático es debido a la
causalgia, la diabetes, la enfermedad del colágeno vascular, la
neuralgia trigeminal, la lesión de la médula espinal, la lesión del
tronco cerebral, el síndrome del dolor talámico, el cáncer, el
alcoholismo crónico, el derrame cerebral, el absceso, la enfermedad
desmielinizante, la infección por herpes, el SIDA, el traumatismo,
la cirugía, la amputación, toxinas o la quimioterapia.
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