ES2283334T3 - Metodos dirigidos a dianas para seleccionar farmacos usando metodos de cultivo conjunto. - Google Patents

Abstract

Un método para seleccionar una molécula que inhibe la actividad o la expresión de una proteína codificada por un gen diana, que comprende: (a) cultivar conjuntamente una primera célula o un grupo de primeras células y una segunda célula o un grupo de segundas células, en presencia de una molécula de ensayo, en el que la primera célula tiene mayor expresión o actividad de un gen diana o una proteína codificada por el gen diana con relación a la segunda célula, en el que dicha proteína codificada por el gen diana contribuye positivamente a la adaptación de la primera célula y la segunda célula, en el que la primera célula comprende y expresa, además, un gen informador que no es expresado sustancialmente en dicha segunda célula, y en el que la primera célula y la segunda célula son de la misma especie y el mismo tipo celular y en el que, inicialmente en el cultivo conjunto, la relación del número de primeras células a segundas células, es menor que uno; y (b) medir la actividad o cantidad de proteína codificada por el gen informador, en el que un aumento de actividad o de la cantidad de proteína codificada por el gen informador con relación a la del cultivo conjunto en ausencia de la molécula de ensayo, indica que la molécula de ensayo inhibe la actividad o la expresión de la proteína codificada por la diana. en el que (i) la primera célula tiene niveles de tipo salvaje, de expresión y actividad del gen diana o de la proteína producida por el gen diana, y la segunda célula tiene niveles reducidos de dicha expresión o actividad, o (ii) la primera célula tiene niveles elevados de expresión o actividad del gen diana o de la proteína codificada por el gen diana, con relación a los niveles de tipo salvaje de expresión o actividad, y la segunda célula tiene niveles reducidos de expresión o actividad del gen diana con relación a dicha expresión o actividad.

Description

Métodos dirigidos a dianas para seleccionar fármacos usando métodos de cultivo conjunto.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para seleccionar moléculas, incluyendo fármacos, que eligen como dianas e inhiben proteínas específicas o caminos celulares específicos que afectan a la proliferación, crecimiento o supervivencia de una célula o de un organismo, Los métodos están basados en un ensayo de cultivo conjunto, y pueden aplicarse a bacterias, levaduras, C. elegans y células cultivadas, tales como células de mamífero, de insecto y células vegetales.

2. Fundamento de la invención 2.1. Ensayo de cultivo conjunto

Se han utilizado profusamente experimentos de cultivos conjuntos para identificar genes que contribuyan a la adaptación de células. Giaever et al. (1999, Nat. Genet., 21:278-283) han indicado recientemente que desde un grupo grande de células con distintos genotipos, podían identificarse células que tuvieran pequeñas diferencias de adaptación cuando se cultivaban en presencia de inhibidores. Los genotipos que eran responsables de la adaptación alterada eran mutaciones heterozigóticas de células diploides. Así pues, esta técnica era bastante sensible para identificar cambios de adaptación que resultaban de la diferencia entre una y dos copias de un gen dado.

2.2. Identificación de dianas de fármacos

Se ha indicado que la sobreexpresión de una proteína de una célula elegida como diana de un fármaco, comunica resistencia a la célula contra el fármaco. La resistencia comunicada por la sobreexpresión de un gen diana ha sido usada como base para seleccionar poblaciones de levaduras transformadas con una colección de plásmidos de expresión para colonias de levaduras que son resistentes a la tunicamicina, la compactina o la etionina (Rine et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6750-6754; Launhardt et al., 1998, Yeast 14:935-942). La capacidad de una colonia para crecer después de tratamiento con un fármaco, indica que el plásmido albergado por la colonia dirige la expresión de una proteína que comunica resistencia al fármaco, es decir, que la proteína es la diana de tal fármaco.

2.3. Métodos de descubrimiento de fármacos

La identificación de dianas para el desarrollo de fármacos es un proceso laborioso que ha tenido un grado de éxito bajo. Por consiguiente, existe en la técnica la necesidad de métodos nuevos para el desarrollo de nuevos fármacos y de tratamientos terapéuticos que modulen caminos celulares específicos. La presente invención proporciona un método de selección de compuestos que inhiben específicamente tales caminos elegidos como diana. Los métodos tradicionales para identificar inhibidores de dianas celulares específicas, implican ensayos in vitro que pueden medir directamente la actividad bioquímica de una enzima o la unión de un ligando a un receptor. Métodos alternativos de identificación de inhibidores utilizan genes informadores (reporter) de células intactas que son regulados en sentido ascendente o descendente cuando ha sido modulado en la célula un proceso específico mediante un compuesto en ensayo. Si bien estos enfoques han sido utilizados con éxito para identificar compuestos conducentes a productos farmacéuticos, requieren una cantidad considerable de tiempo y de trabajo para desarrollar, antes de llevar a cabo la selección, miles a cientos de miles de compuestos químicos o productos naturales.

De modo semejante, se necesitan, desesperadamente, nuevos antibióticos. El uso abusivo de antibióticos a lo largo de los pasados cincuenta años, ha conducido a la emergencia de cepas bacterianas que son resistentes a casi todos los antibióticos actualmente en uso. Por tanto, existe la necesidad inmediata de desarrollar métodos rápidos y eficaces para producir nuevos antibióticos para combatir el número creciente de estas cepas resistentes a antibióticos (Chopra et al., 1997, Antimicrob. Agents Chemother., 37:1563-1571; Cohen, 1992, Science, 257:1050-1055; Kunin, 1993, Ann. Intern. Med., 118:557-561; Neu, 1992, Science, 257:1064-1073; Tenover and Hughes, 1996, JAMA, 275:300-304).

Los enfoques tradicionales para el desarrollo de antibióticos han fallado en el cumplimiento de estas necesidades. Un enfoque utilizado comúnmente lleva consigo la modificación química de un antibiótico ya existente para producir una formulación más potente. Otro enfoque implica la selección de compuestos que elijan como diana el mecanismo de resistencia de un antibiótico conocido. Tales compuestos son usados luego en asociación con el antibiótico conocido para mejorar su eficacia. Esos enfoques han tenido algún éxito, pero son intensos en cuanto a investigación y tales fármacos tienden a hacer diana en los mismos procesos bacterianos que los antibióticos existentes, y por tanto, a semejanza de la generación anterior de antibióticos, es probable que encuentren rápidamente resistencias. Un segundo enfoque ha llevado consigo la selección masiva de compuestos por su aptitud para inhibir el crecimiento bacteriano. Usando ensayos microbiológicos, productos naturales y compuestos químicos semisintéticos o sintéticos son seleccionados por su aptitud para matar o detener el crecimiento de un organismo patógeno elegido como diana. Por lo menos inicialmente, este enfoque tiene la ventaja de ser sencillo y relativamente poco costoso, y de permitir el ensayo rápido de grandes colecciones de compuestos. Sin embargo, los compuestos prometedores que surgen de tales selecciones, deben ser ensayados seguidamente para determinar su toxicidad para el hospedante. Además, dados que tales ensayos de selección están orientadas hacia los resultados y son ciegos respecto al mecanismo, deben llevarse a cabo estudios adicionales con objeto de conocer de modo preciso el mecanismo de acción del fármaco e identificar su diana en la célula.

Los genomas de diversos microorganismos patógenos, tales como Escherichia coli, Helicobacter pylori, y
Chlamydia trachomatis, han sido secuenciados recientemente (Blattner et al., 1997, Science 277:1453; Tomb et al., 1997, Nature; 388: 539-547). La disponibilidad de secuencias génicas que codifican todas las proteínas de estas bacterias, proporciona una oportunidad sin precedentes para comprender y manipular genomas bacterianos a nivel molecular. Se conocen muchos genes, o se sospecha de los mismos, que son esenciales para el crecimiento, la supervivencia o la virulencia. Tales genes podrían ser dianas ideales para la selección de nuevos antibióticos.

La presente invención proporciona métodos de selección para la identificación de fármacos o antibióticos que eligen como diana proteínas específicas usando métodos de cultivos conjuntos

La cita o discusión de una referencia bibliográfica en esta memoria no ha de ser interpretada como admisión de que tal referencia es técnica anterior a la presente invención.

3. Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para seleccionar una molécula que inhibe la expresión o la actividad de una proteína codificada por un gen diana, que afecta a la adaptación de una célula, según se define en la reivindicación 1.

En ciertas realizaciones específicas, se seleccionan una primera célula y una segunda célula entre el grupo que consiste en una célula bacteriana. una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de mamífero y una célula vegetal.

En una realización alternativa, la primera y segunda células pueden ser grupos de células, por ejemplo, organismos multicelulares individuales de la misma especie. En un modo preferido de la realización, la especie es C. elegans.

El nivel reducido de expresión o actividad de la proteína elegida como diana, puede ser generado por una copia del gen diana en una célula diploide o por mutación del gen diana para reducir su actividad; por expresión de una forma negativa dominante de un componente de un camino celular del gen diana, o por diminución de la actividad o abundancia de RNA codificado por un gen diana. La actividad o abundancia del RNA codificado por el gen diana puede ser disminuida, por ejemplo, por medio de un ribozima, un ácido nucleico anti-sentido, un RNA de doble cadena o un aptámero.

En una realización específica, el nivel elevado de expresión del gen diana puede ser generado expresando recombinantemente el gen diana desde un plásmido o desde un cromosoma. El nivel elevado de actividad del gen diana puede ser generado también por expresión de una forma del gen diana, constitutivamente activa.

En ciertas realizaciones, el gen informador de la invención codifica una enzima, una proteína o un péptido que comprende un epítopo, un receptor, un transportador, tRNA, rRNA, o una molécula bioluminiscente, quimiluminiscente o fluorescente. En una realización específica, la molécula fluorescente es GFP o uno de sus mutantes. En un modo preferido de la realización, la molécula fluorescente es una GFP mutante que posee una longitud de onda de fluorescencia alterada, una fluorescencia aumentada, o ambas cosas. En cierta realización específica, la GFP mutante es GFP azul. En otros modos de la realización, la molécula fluorescente es proteína fluorescente roja o proteína fluorescente amarilla.

En ciertas realizaciones específicas, la primera y segunda células son cultivadas conjuntamente, inicialmente (después del establecimiento del cultivo conjunto) en una relación de 1:1, 1:10, 1:100, 1:1.000, o 1:10.000.

En ciertas realizaciones específicas el ensayo de selección de la invención es "multiplexado", es decir, se usa un ciclo de selección para identificar inhibidores de múltiples genes diana. En tales realizaciones, la selección comprende cultivar conjuntamente una primera célula y dos o más segundas células, en donde cada una de dichas segundas células tiene expresión o actividad elevada de un gen diana diferente del de la primera célula, en donde cada gen diana contribuye positivamente a la adaptación de la primera y segunda células, en donde cada una de dichas segundas células comprende además, y expresa un gen informador que no es expresado sustancialmente en dicha primera célula, y en donde dicha primera célula y dicha segunda células son de la misma especie y tipo de célula; exponer el cultivo conjunto a una molécula de ensayo; y detectar si existe una diferencia de sensibilidad respecto a la molécula entre la primera célula y una o más de las segundas células, mediante la detección de un aumento en la proporción de células que tienen actividad de gen informador, midiendo la actividad o la cantidad de proteína codificada por los genes informadores en dichas segundas células, en donde dicho aumento de actividad del gen informador indica que la molécula inhibe uno o más de dichos genes diana.

En ciertos modos de "multiplexión", las segundas célula comprenden y expresan el mismo gen informador. Para determinar cuales de las segundas células poseen actividad de gen informador aumentada en cultivos conjuntos que tienen un aumento importante de actividad del gen informador, se lleva a cabo un ciclo secundario de selección o una nueva selección. La nueva selección puede imponer una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una selección de crecimiento auxótrofo, o un método de cultivo conjunto según los métodos de la presente invención. En otros modos de "multiplexión", cada una de las segundas células comprende y expresa un gen informador diferente.

En ciertas realizaciones específicas, se usa un ensayo de selección de la invención para identificar una molécula que inhibe una proteína codificada por un primer gen diana que contribuye positivamente a la adaptación celular, pero no la proteína codificada por un segundo gen diana, similar funcionalmente. El gen diana de funcionalidad similar puede ser un homólogo del gen diana procedente de otra especie, o codificar una proteína afín de la misma especie. Tales proteína afines incluyen, aun cuando no está limitado a ellas, isozimas, variantes de corte y empalme o mutante puntuales. Tal método comprende cultivar conjuntamente una primera célula y una segunda célula, en el que la primera célula expresa niveles elevados de la proteína diana y la segunda célula expresa niveles elevados de la proteína codificada por el gen funcionalmente similar, en el que dichos gen diana y gen funcionalmente similar, ambos, contribuyen positivamente a la adaptación de la primera célula y la segunda célula, en el que la primera célula comprende y expresa, además, un gen informador que está sustancialmente sin expresar en dicha segunda célula, y en el que la primera célula y la segunda célula son de la misma especie y tipo celular; exponer el cultivo conjunto a una molécula de ensayo; y medir la actividad o la cantidad de proteína codificada por el gen informador; en el que dicho aumento de la actividad del gen informador indica que la molécula inhibe el gen diana pero no el gen de funcionalidad similar.

Los métodos de selección de la invención identifican compuestos que son candidatos principales a fármacos que causan pérdida de función de un gen diana. Existen miles de casos en que es deseable desde el punto de vista terapéutico la pérdida específica de la función de un gen, en que la pérdida de función da por resultado un fenotipo deseable, por ejemplo, en trastornos que llevan consigo niveles bajos de colesterol, cáncer, etc. Por ejemplo, sería deseable un inhibidor específico de COX2, un oncogén, una enzima de síntesis de colesterol, etc.

4. Descripción breve de las figuras

Fig. 1: Intensidad de fluorescencia en función de la relación de células reclamo (decoy):diana. El experimento se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos. Cada uno de los pocillos contenía un total de 10^{7} células de levadura en 0,2 ml de medio. Las células diana sobreexpresan la proteína GFP, mientras que las células reclamo albergan un vector control. La intensidad de la fluorescencia de los cultivos se midió sin incubación previa en un Molecular Dynamics Vistra FluorImager. La fluorescencia está representada como las unidades de fluorescencia medias/pixel para cada pocillo. La figura muestra los valores de la fluorescencia para cultivos puros (10^{7} células) de o bien la célula de levadura reclamo o diana.

Fig. 2: A Relaciones de señal a ruido de cultivos conjuntos de diana-ERGII y reclamo, hechos crecer en presencia de clotrimazol. Los cultivos fueron preparados en diversas relaciones de células diana:reclamo (columnas). Cada una de las relaciones se preparó también en varios números totales de células por pocillo y están indicados en la parte superior. El clotrimazol, que inhibe el producto génico ERGII, fue introducido mediante dilución seriada (filas). Las concentraciones de clotrimazol se indican en la parte izquierda de la tabla. El volumen de medio en cada pocillo fue 0,225 ml. La placa se dejó incubar a 30ºC durante 88 h. La señal de la fluorescencia se determinó restando los valores de la fluorescencia procedentes de una plata testigo de medio, de los valores de la fluorescencia de cada uno de los pocillos de la placa de ensayo. Las relaciones de señal a ruido fueron determinadas dividiendo estos calores corregidos por los valores correspondientes del pocillo sin fármaco en la fila de la parte inferior. B Valores de la densidad óptica, O.D._{600}, de cultivos conjuntos de cada pocillo después del crecimiento. C Una imagen fluorescente de la placa original.

Fig. 3: Resultados de un ensayo de selección de un cultivo conjunto de diana-ERGII de una colección de compuestos químicos. Las células de levadura diana que sobreexpresan el gen ERGII y la proteína GFP fueron mezcladas con células reclamo en una relación de 1:1.000 y repartidas en placas de 96 pocillos. Cada pocillo contenía 25 células diana y 25.000 células reclamo en 0,225 ml de medio YM más casamino ácidos al 2%. 560 fármacos genéricos procedentes de la colección MicroSource^{TM} fueron dispensados a cada pocillo hasta una concentración final de 5 \mug/ml ó 0,5 \mug/ml y DMSO al 1%. Las placas fueron incubadas a 30ºC durante diez días. Se exponen cuatro placas representativas que muestran cuatro aciertos positivos,

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos de selección de moléculas que inhiben la actividad de productos génicos celulares específicos, en los que la inhibición da como resultado una disminución o un aumento de la adaptación de la célula huésped u organismo hospedante. Los métodos están basados en un ensayo de cultivo conjunto, e imponen cultivar juntas dos células, es decir, dos poblaciones de células, cada una de las cuales es una población de células idénticas, de la misma especie, que se diferencian sustancialmente solo en la expresión o actividad del gen que ha de ser elegido como diana o su proteína codificada y la presencia o ausencia de un gen informador.

En cierta realización específica, el ensayo de selección se aplica a células cultivadas, que incluyen, aun cuando no se limita a ellas, células de mamífero y células de insecto. En otras realizaciones, el ensayo de selección se aplica a un organismo multicelular tal como el C. elegans. Todavía en otras realizaciones, el ensayo de selección se aplica a un organismo monocelular. En una realización preferida, el organismo monocelular es la levadura Saccharomyces cerevisiae. En otra realización preferida, el organismo monocelular es un microbio tal como una bacteria.

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En los ensayos de cultivo conjunto de la invención, el gen que ha de ser elegido como diana afecta a la adaptación de la célula u organismo que se usa en el ensayo de selección. En una realización específica, el gen diana contribuye positivamente a la adaptación de la célula u organismo que se usa en el ensayo. La proteína diana (codificada por el gen diana) no necesita ser requerida, normalmente, para la adaptación, en tanto que la célula u organismo pueda ser manipulada de tal modo que la proteína diana contribuya a la adaptación, preferiblemente que llegue a ser esencial, por ejemplo por mutación de otro gen con el que el gen diana sea redundante (véase, por ejemplo, la Sección 7, más adelante). La manipulación de la expresión del gen diana, o bien por sobreexpresión o bien por reducción de la expresión, no debe comprometer sustancialmente la viabilidad de la célula u organismo que ha de usarse como base para realizar la selección. La manipulación sensibiliza el hospedante hacia una molécula que inhibe el gen diana o su proteína codificada, de tal modo que la célula u organismo que comprende el gen manipulado crece a una velocidad diferente de la de la célula u organismo que comprende el gen sin manipular, en respuesta a la exposición a la molécula.

En una realización específica, la proteína codificada por el gen diana contribuye positivamente a la adaptación de la célula (por ejemplo, en un gen esencial en la célula) y la primera célula está inicialmente, significativamente, en minoría en el cultivo conjunto (el cultivo conjunto se ha establecido con una relación baja de primera a segunda célula). Un aumento de la señal indicativa de actividad del gen informador al cultivar el cultivo conjunto en presencia de la molécula de ensayo, indica que la molécula inhibe la expresión o la actividad de la proteína diana.

Por consiguiente, los métodos de la invención proporcionan ensayos de selección, denominados ensayos de selección de supresión de dosis elegidas como diana (a los que se alude más adelante en esta memoria como "TDS") para detectar inhibidores de una proteína específica. La proteína específica es denominada la "proteína diana" y está codificada por el "gen diana". Los ensayos TDS proporcionados por la invención, pueden ser aplicadas fácilmente para cualquier gen diana de cualquier especie con una cantidad mínima de tiempo de preparación. La única condición es que el gen diana de interés, cuando es inhibido, debe conducir a una adaptación o velocidad de crecimiento reducida. El ensayo de selección TDS es aplicable para cualquier tipo de célula u organismo que tenga un tiempo de generación razonablemente corto (preferiblemente menor que 48 horas) y en el que la expresión génica pueda ser modulada. Además, para identificar compuestos inhibidores para usar como fármacos, los métodos pueden ser empleados para identificar proteínas u otras moléculas que inhiben la función de proteínas diana.

Los métodos TDS descritos en esta memoria, obtienen ventaja de ambos hechos, la resistencia al fármaco comunicada a una célula que sobreexpresa un gen diana juntamente con la sensibilidad de los experimentos de cultivos conjuntos (crecimiento competitivo), como medios de identificación de inhibidores específicos.

Según el método TDS de la presente invención, una célula expresa niveles superiores de proteína diana para la que se busca un inhibidor que es su contraparte del cultivo conjunto, o expresa una proteína diana que posee mayor actividad que su contraparte del cultivo conjunto, o ambas cosas. Se dice que una célula sobreexpresa una proteína diana en virtud de mayores niveles de expresión o mayor actividad de la proteína diana en la célula. Preferiblemente, la otra célula, es decir, la pareja del cultivo conjunto, es isogénica con la célula que se sobre expresa, excepto por cambios que se refieren a la expresión o la actividad de un gen diana y la expresión de un gen informador. Por tanto, el punto de referencia no es la expresión de tipo salvaje si no la expresión en la pareja del cultivo conjunto. La explicación de este enfoque se basa en el aumento de resistencia que adquiere una célula para una molécula particular cuando el gen que codifica la diana de la molécula inhibidora es expresado en un nivel superior o posee mayor actividad en una célula con respecto a otra. Por ejemplo, el aumento de expresión puede resultar de un aumento de la velocidad de expresión del gen diana, de un aumento del número de copias (dosificación génica) del gen diana o de una disminución de la velocidad de expresión o el número de copias del gen diana en la contraparte del cultivo conjunto, o ambas cosas. En todos los casos, cuanto mayor es el número de proteínas diana que expresa una célula o un organismo, más resistente es a los inhibidores correspondientes (Clewell et al., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1720-1724; Schimke et al., 1978, Science 202:1051-1055). La generación de una célula diana con mayor actividad proteínica puede ser mediada, alternativamente, por expresión de un inhibidor de esta proteína diana o una proteína mutante en la pareja del cultivo conjunto.

El segundo componente del método TDS implica mezclar las células que sobreexpresan el gen diana (la célula "diana") con un exceso de una célula sustancialmente similar (la célula "reclamo" (decoy)) que no sobreexpresa o incluso subexpresa, el gen diana. Esta característica del método de selección utiliza el extraordinario poder de resolución de experimentos de cultivo conjunto para distinguir entre la adaptación relativa de dos tipos de células. Cuando el gen diana contribuye positivamente a la adaptación de la célula diana y las células diana y reclamo son cultivadas en presencia de un inhibidor del gen diana presente en la célula diana, la célula diana expondrá una resistencia aumentada, o adaptación, con relación a la célula reclamo. Durante el crecimiento de la mezcla, la proporción de la célula diana con relación a la célula reclamo aumentará hasta hacerse la predominante, si no el único miembro de la población.

Como medio de distinguir la célula diana de la célula reclamo en poblaciones de células que crecen en presencia de un inhibidor, la célula diana alberga un gen marcador o informador que se detecta con facilidad, tal como la proteína GFP. Así pues, en una realización preferida, la célula diana expresa tanto el gen diana como la GFP en niveles muy altos. La célula reclamo no expresa la proteína GFP. Después de cultivar la mezcla de células en presencia de diversos candidatos moduladores, las células son examinadas para determinar la fluorescencia. Las moléculas que confieren la ventaja de un crecimiento diferencial a la célula diana pueden detectarse con facilidad o bien con luz UV manual de longitud de onda larga u otro equipo que pueda detectar y/o medir luz fluorescente.

Para asegurarse contra falsos positivos resultantes de la falta de acoplamiento del gen informador procedente de la célula u organismo diana, es necesario que no se mezclen los genomas de las células diana y reclamo, o que el gen informador esté ligado estrechamente (genéticamente) para la sobreexpresión del gen diana. Por ejemplo, en levadura, esto puede conseguirse usando cepas deficientes en apareamiento de modo que el material genético de las células diana y reclamo permanece segregado. Alternativamente, cuando el gen diana es expresado desde un plásmido, el gen informador está logrado, por lo que también es expresado desde el mismo plásmido. Los expertos en la técnica pueden reconocer otros medios de consecución del mismo resultado.

En una realización en la que el gen diana contribuye positivamente a la adaptación celular, el ensayo TDS es excelentemente específico, dado que un logro positivo indica que la expresión del gen diana comunicaba resistencia al candidato a inhibidor. Este resultado indicaría que el compuesto químico inhibía la proteína diana o, posiblemente, una proteína funcionalmente afín, o una proteína que actúa aguas abajo de la diana. La sobreexpresión de bombas o proteínas que degradan el compuesto podría causar también resistencia y conducir a falsos positivos. Sin embargo, estos casos podrían identificarse con facilidad debido a que serían resistentes a un gran número de compuestos diferentes. En algunos casos raros es concebible el que la resistencia al inhibidor sea conferida mediante la expresión conjunta del gen marcador. Cuando el gen marcador es la proteína GFP, esta posibilidad parece improbable ya que no se ha documentado que esta proteína influya significativamente en la fisiología celular.

En otra realización específica, la proteína codificada por el gen diana contribuye negativamente a la adaptación de la célula (por ejemplo, su sobre expresión ocasiona un defecto de crecimiento tal como letalidad de la sobreexpresión), y la primera célula es, inicialmente, significante en mayoría en el cultivo conjunto (el cultivo conjunto es establecido con una alta relación de primera a segunda célula). Al realizar el cultivo conjunto en presencia de la molécula de ensayo, la detección de una señal fluorescente que es por lo menos tal alta como cuando el cultivo conjunto es establecido inicialmente, indica que la molécula inhibe la expresión o actividad de la proteína codificada del gen diana (véase la Sección 5.8, más adelante).

La información genética de las células puede manipularse de modo que un gen diana, cuando ha sido sobreexpresado en la primera célula con respecto a la segunda célula, o bien positiva o bien negativamente, contribuya a la adaptación de la célula, por lo que puede emplearse un análisis de la invención.

Los ensayos de selección TDS descritos en esta memoria, pueden ser aprovechados para seleccionar simultáneamente inhibidores de múltiples genes diana mediante el cultivo conjunto de varias células diana con la célula reclamo, según se describe en la Sección 5.9 que figura más adelante. La Sección 5.9 describe también variaciones en los métodos TDS para identificar inhibidores de proteína diana afines pero no idénticas.

En ciertas realizaciones de la presente invención, el gen diana codifica una proteína que es un componente de un camino biológico que contribuye, o bien positivamente o bien negativamente, a la adaptación de una célula. Caminos biológicos, tal como se emplea en esta memoria, se refiere a colecciones de constituyentes celulares (por ejemplo, abundancias o actividades de proteínas, fosforilación de proteínas, abundancias de especies de RNA tales como abundancias de especies de mRNA, o abundancias de especies de DNA, tales como abundancias de especies de cDNA derivadas de mRNA-tal como se emplea en esta memoria se entiende que la expresión "constituyente celular" no se refiere a orgánulos subcelulares conocidos tales como mitocondrias, lisosomas, etc.) que están relacionados, ya que cada uno de los constituyentes celulares de la colección está influido, según algún mecanismo biológico. por uno o más de otros constituyentes celulares de la colección. En una realización, el camino biológico es un camino de señalización o de control. Los caminos de señalización y de control incluyen, típicamente, moléculas de señalización primarias o intermedias, así como proteínas que participan en las cascadas de señal o de control que caracterizan a estos caminos. En los caminos de señalización, la unión de una molécula señal a un receptor habitualmente influye directamente en las abundancias de moléculas de señalización intermedias e influye indirectamente, por ejemplo, en el grado de fosforilación (u otra modificación) de las proteínas del camino. Ambos de estos efectos influyen a su vez sobre las actividades de proteínas celulares que son efectores clave de los procesos celulares iniciados por la señal, afectando, por ejemplo, al estado de la transcripción de la célula. Los caminos de control, tales como aquellos que regulan la temporalidad y la ocurrencia del ciclo celular, son similares. Aquí, múltiples acontecimientos celulares, frecuentemente en marcha, son coordinados temporalmente, con frecuencia con control recíproco, consiguiendo un resultado consistente, tal como división celular con segregación cromosómica. Esta coordinación es consecuencia del funcionamiento del camino, a menudo mediado por influencias mutuas de proteínas sobre el grado de fosforilación de unas con otras u otra modificación. Otros caminos biológicos que poseen componentes adecuados para usar como proteínas diana, incluyen aun cuando no se limita a ellos,: caminos relacionados con telómeros, caminos de apareamiento, caminos de ciclos celulares, caminos de división celular, caminos de restauración celular, caminos de síntesis de moléculas pequeñas, caminos de síntesis de proteínas, caminos de síntesis de DNA, caminos de síntesis de RNA, caminos de restauración de DNA, caminos de respuesta a esfuerzos, caminos citoesqueletales, caminos esteroideos, caminos de transducción de señales mediadas por receptores, caminos de transcripción, caminos de traducción, caminos de respuestas inmunitarias, caminos de choque térmico, caminos de motilidad, caminos de secreción, caminos endocitóticos, caminos de clasificación de proteínas, caminos fagocíticos, caminos fotosintéticos, caminos de excreción, caminos de respuesta eléctrica, caminos de respuesta a la presión, caminos de modificación de proteínas, caminos de respuesta a moléculas pequeñas, caminos de transformación del camino de respuesta a moléculas tóxicas, etc. Específicamente, la invención de esta memoria está ilustrada en la Sección 6 por el camino de erg11 y en la Sección 77 por el camino de señalización de células ras. Otros caminos de control bien conocidos, adecuados para seleccionar proteínas diana, buscan el mantener niveles óptimos de metabolitos celulares con vistas a un medio ambiente en fluctuación. Otros ejemplos de caminos celulares que operan según mecanismos comprendidos, son bien conocidos y, por consiguiente, evidentes fácilmente para los expertos en la técnica.

5.1. Definiciones y técnicas generales

A menos que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones técnicos y científicos que se emplean en esta memoria, poseen el significado comprendido comúnmente por los expertos de habilidad ordinaria en la técnica a la que pertenece esta invención. La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, DNA recombinante, técnicas genéticas y de inmunología. Véase, por ejemplo, la publicación de Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Ausubel et al., 1992, Current Protocols in Molecular Biology (Nueva York: John Wiley and Sons); Guthrie and Fink, 1991, Methods Enzymol. 194:1-863.

Adaptación de una célula o un organismo: El potencial de crecimiento de una célula específica, es decir, la viabilidad o capacidad de la célula para crecer, por ejemplo en un medio ambiente competitivo de crecimiento, medido preferiblemente mediante el número neto de duplicaciones de la célula durante un periodo de tiempo dado. Se dice que la adaptación aumenta cuando la duración del ciclo celular o la ocurrencia de muerte celular se reduce. Al contrario, se dice que la adaptación se reduce cuando la duración del ciclo celular o la ocurrencia de muerte celular aumenta.

Gen diana: Un gen para el que se busca un inhibidor. El gen diana es sobreexpresado en la célula diana y/o subexpresado en la célula reclamo. La proteína codificada por el gen diana es la "proteína diana",

Tal como se usa en esta memoria, la expresión "proteína diana" incluye fragmentos proteínicos funcionales, formas mutantes de la proteína que poseen actividad mayor o menor (pero todavía mayor que la actividad de la proteína diana de la célula reclamo) que la proteína de tipo salvaje (por ejemplo, formas constitutivamente activas de la proteína), muteínas funcionalmente activas, o derivados de la proteína diana. La proteína diana puede ser expresada también como una proteína de fusión, por ejemplo, con una etiqueta de un epítopo o con la proteína informadora (reporter).

Tal como se emplea en esta memoria, un "fragmento funcional" de una proteína es una parte de la secuencia de aminoácidos que retiene la actividad funcional de la proteína, incluyendo la actividad biológica, aun cuando no limitado a ella (por ejemplo, la capacidad de rescatar un mutante en el gen que codifica la proteína).

Una "muteína" polipeptídica, se refiere a un polipéptido cuya secuencia contiene sustituciones, inserciones o deleciones de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa o de tipo salvaje. Una muteína posee una homología de secuencia por lo menos de 50% respecto a la proteína de tipo salvaje, de preferencia una homología de secuencia del 60%, y más preferido una homología de secuencia del 70%. Las más preferidas son las muteínas que poseen una homología de secuencia del 80%, 90% ó 95% respecto a la proteína de tipo salvaje, en las que la homología de secuencias se mide mediante un algoritmo común de análisis de secuencias, tal como el Gap o Bestfit.

Un "derivado" de una proteína hace referencia a polipéptidos o fragmentos de los mismos que son sustancialmente homólogos en la secuencia estructural primaria, pero que incluyen, por ejemplo, modificaciones bioquímicas in vivo, incluyendo, aun cuando no se limita a ello, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, diversas modificaciones enzimáticas, o sustituciones conservativas, como podrá apreciarse fácilmente por los expertos en la técnica.

La expresión "proteína de fusión" se refiere a polipéptidos que comprenden polipéptidos (por ejemplo, fragmentos de proteínas) unidos mediante una unión peptídica a secuencias heterólogas de aminoácidos. Las proteínas de fusión son útiles debido a que pueden ser construidas de modo que contengan dos o más elementos funcionales deseados procedentes de dos o más proteínas diferentes, Las proteínas de fusión pueden ser producidas recombinantemente construyendo una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o uno de sus fragmentos, en el marco de lectura, con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína o un péptido diferente, y expresando luego la proteína de fusión.

5.2. Metodología de levadura

En una realización específica, genes de S. cerevisiae que contribuyen positivamente a la adaptación, proporcionan dianas para el diseño o descubrimiento de agentes antifúngicos, herbicidas e insecticidas, y agentes antiproliferativos que pueden usarse en una diversidad de campos, terapéutico, veterinario y agrícola.

En una realización de la invención, el gen diana de la presente invención es un gen que contribuye positivamente a la adaptación de una célula. En una realización preferida, el gen diana es un gen esencial. El término "esencial" se refiere a un gen que codifica un producto génico cuya función es requerida para la adaptación, el crecimiento o la viabilidad de una célula o un organismo. A título de ilustración, el término "esencial", cuando se usa con referencia al S. cerevisiae, puede indicar que el gen codifica un producto cuya función es requerida para un crecimiento vegetativo. Un ejemplo alternativo de un gen esencial de levadura que puede ser usado con éxito como gen diana, es el erg11, descrito en la Sección 6 que figura más adelante. La lista de genes esenciales de levadura conocidos está creciendo constantemente por los esfuerzos realizados de los proyectos de genomas de levaduras. Por ejemplo, genes esenciales de cromosoma VIII distintos del erg11 incluyen, aun cuando no se limita a ellos, s10 p, gpa1I, mas2, thr1, ppa1, erg7, gar1, cdc12, msh1, prp8, cdc23, erg9 y sch9 (U. Washington Yeast Genome Project;

http://genome.wustl.edu/gsc/yeast/chromosome8ORFs.html).. Para una lista completa, puesta al día, de genes esenciales de levadura conocidos, véase el Saccharomyces Genome Deletion Project en

http://sequence-ww.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html.

Un gen de S. cerevisiae esencial puede ser identificado mediante una pérdida completa de mutación funcional (un K.O.) del gen que evita el crecimiento vegetativo de la levadura en un medio rico. Sin embargo, la pérdida de completa de mutación funcional no es el único camino para identificar un gen esencial en la levadura. Un gen esencial puede ser identificado también mediante un alelo no nulo del gen en donde el alelo no nulo codifica una proteína con una actividad bioquímica suficientemente reducida, de modo que la proteína es insuficiente para cumplir la función esencial que se requiere de la levadura, con el resultado de que se evita el crecimiento vegetativo de la levadura. Por ejemplo, un alelo no nulo puede ser un alelo que posea un mutación puntual en el sitio activo de una enzima. Finalmente, existen varios genes en la levadura que no son esenciales, solamente debido a redundancia o duplicación en el genoma, de tal modo que hay múltiples copias de un gen o de una familia de genes que codifican proteínas con la misma función o con funciones que se solapan. Tales genes pueden ser hechos esenciales mediante manipulación genética, por ejemplo, por deleción o mutación de un gen redundante o duplicado. Un ejemplo ilustrativo de un gen que normalmente no es esencial pero que puede hacerse esencial, es el rce1, que se describe en la Sección 7, que figura más adelante.

Otra categoría de genes de levadura que son útiles como genes diana según los métodos de la presente invención, son aquellos que poseen fenotipos de crecimiento lento cuando se someten a deleción. Ejemplos de genes de crecimiento lento del cromosoma VIII incluyen, aun cuando no se limita a ellos, mrp4, myo1, ste12 y eno2 (U. Washington Yeast Genome Project;

http://genome.wustl.edu(gsc/yeast/chromosome8ORFs.html).

Genes diana de S. cerevisiae pueden sur utilizados para identificar inhibidores de diversas categorías de dianas diferentes. Genes diana de S. cerevisiae que no tienen homólogos vegetales y/ o de mamífero pueden ser usados para seleccionar agentes antifúngicos altamente específicos. Alternativamente, genes diana de S. cerevisiae que poseen homólogos de insecto o de plantas pueden ser usados en la selección de insecticidas y herbicidas, respectivamente. En último lugar, genes diana de S. cerevisiae que tiene homólogos de mamífero, pueden ser usados como dianas para seleccionar agentes antiproliferativos, tales como aquellos que pueden usarse en el tratamiento de las psoriasis, la prevención de las restenosis después de las angioplastias y la de tumores benignos y malignos. Estos grupos pueden no ser mútuamente exclusivos. Por ejemplo, un gen de S. cerevisiae que contribuya positivamente a la adaptación de una célula, puede tener un homólogo de planta pero no un homólogo de mamífero. El gen (o la proteína que codifica) puede usarse como gen diana para identificar agentes anti-fúngicos potenciales para mamíferos, así como diana para aislar herbicidas que sean seguros para los mamíferos. De modo semejante, un gen de S. cerevisiae puede tener homológos de plantas, insectos y mamíferos, y puede ser usado como diana para el diseño o descubrimiento de herbicidas, insecticidas y agentes antiproliferativos de mamíferos, potenciales.

Por tanto, las semejanzas y diferencias entre genes de S. cerevisiae y genes que proceden de otros organismos, pueden ser aprovechadas para el diseño de un método de selección. Por ejemplo, si un gen diana ha de ser útil para identificar agentes antifúngicos para uso de seres humanos o de mamíferos, no tiene, preferiblemente, un homólogo de mamífero humano o no humano. Si un gen diana ha de ser útil para identificar agentes antifúngicos agrícolas, es preferible que el gen no tenga un homólogo de plantas. Si los genes de un mamífero o una planta no codifican una proteína que sea homóloga con la proteína codificada por el gen diana de S. cerevisiae, los inhibidores de la diana que son identificados por los métodos de la presente invención poseen el potencial de ser, específicos, altamente fúngicos. Alternativamente. si el gen diana, o el camino, exhibe alguna homología con proteínas de mamífero o proteína vegetales, pueden diseñarse "tamices" para obtener nuevos agentes antifúngicos según los métodos de la invención, para aprovechar las diferencias existentes entre la diana de levadura y las proteínas homólogas de mamífero o vegetales, y producir un agente antifúngico específico.

La presente invención proporciona métodos para identificar nuevos herbicidas e insecticidas, mediante selección de moléculas que inhiben genes diana de S. cerevisiae que son homólogos entre S. cerevisiae y plantas o insectos. Tales genes no solamente ponen de manifiesto semejanzas de secuencias sino que también exhiben frecuentemente semejanzas funcionales. Por ejemplo, si un gen de S. cerevisiae contribuye positivamente a la adaptación de S. cerevisiae y es homólogo de un gen de un insecto o de una planta, existe la posibilidad razonable de que el gen homólogo de insecto o de planta sea importante también para el crecimiento del insecto o la planta. Así pues, las moléculas que son identificadas en los métodos de selección usando S. cerevisiae que ha sido sensibilizado mediante alteración de genes que son homólogos con genes de insectos o de plantas, y que se sabe que llevan a cabo la misma función, entonces tales moléculas pueden ser usadas como insecticida o herbicida. Una ventaja de este método de selección es que los insecticidas y herbicidas diseñados para reaccionar con ciertas dianas específicas, pueden tener menos efectos secundarios tóxicos o ser menos propensos a favorecer el desarrollo de resistencia a una plaga.

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La presente invención proporciona métodos para identificar nuevos fármacos antiproliferativos para mamíferos, en especial seres humanos. Como se ha discutido anteriormente, los genes que proceden de S. cerevisiae frecuentemente tienen homólogos en otros organismos eucarióticos, incluyendo los seres humanos. Por tanto, si el papel del método de selección es identificar una molécula para usar como agente antiproliferativo en un mamífero, el gen diana que ha sido sensibilizado con fines de selección, es un homólogo de un gen de mamífero, que es importante también para la proliferación o adaptación celular en mamíferos. Alternativamente, el gen diana de levadura puede ser reemplazado por su contraparte de mamífero o usado en combinación con él. Los fámacos antiproliferativos elegidos como diana pueden ser más efectivos que los que se encuentran disponibles actualmente, o pueden ser usados en conjunción con fármacos de los que se dispone actualmente, para inhibir la proliferación celular.

Aun cuando está realización de la invención es ejemplificada usando S. cerevisiae, este método puede ser puesto en práctica usando una variedad de otros géneros fúngicos. Estos incluyen los organismos patógenos humanos tales como Aspergillus, Candida, Neurospora, Cryptococcus y Trichoderma. Además, pueden ser seleccionados como dianas, también, organismos patógenos de plantas tales como Fusarium. Un gran número de genes, así como partes de algunos de estos genomas fúngicos distintos de S. cerevisiae, han sido clonados y también son conocidos métodos de rotura de genes de estos hongos.

5.2.1. Métodos para la construcción de cepas de levadura mutantes

En varias realizaciones de la invención, se generan mutaciones de levadura para sensibilizar específicamente una célula reclamo para una molécula específica de un inhibidor. Existen diversos métodos, bien conocidos en la técnica, mediante los que un gen puede ser roto o mutado en la levadura. En una realización, un gen entero crea un alelo nulo, en el que no está expresada parte alguna del gen. En otras realizaciones, puede construirse un alelo por deleción que comprende solamente una parte del gen que no es suficiente para la función génica, que puede ser construido, por ejemplo, insertando un codón sin sentido en la secuencia del gen, de tal modo que la traducción del transcrito de mRNA mutante finaliza prematuramente. Los alelos pueden hacerse asimismo de modo que contengan mutaciones puntuales, individualmente o en combinación, que reducen o anulan la función génica. Tales métodos son bien conocidos en la técnica.

Existen varias estrategias diferentes para crear alelos condicionales de genes. Ampliamente, un alelo puede ser condicional para la función o la expresión. Un ejemplo de un alelo que es condicional para la función es una mutación sensible a la temperatura en la que el producto génico es funcional en una temperatura (es decir, la temperatura permisiva) pero no es funcional en una temperatura diferente (es decir, temperatura no permisiva), por ejemplo, debido a un plegamiento erróneo o una localización equivocada. Los expertos en la técnica pueden producir alelos mutantes que pueden tener solamente uno o unos pocos nucleótidos alterados, pero que codifican proteínas inactivas o sensibles a la temperatura. Las células de levadura mutantes sensibles a la temperatura expresan una proteína funcional en temperaturas permisivas pero no expresan una proteína funcional en temperaturas no permisivas.

Un ejemplo de un alelo que es condicional para la expresión es un gen quimérico en el que un promotor regulado controla la expresión del gen. En una condición, el gen es expresado y en otra no. Puede reemplazarse o alterarse el promotor endógeno del gen con un promotor heterólogo o alterado que solamente puede ser activado en ciertas condiciones. Estos mutantes condicionales solamente expresan el gen en condiciones experimentales definidas. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase la publicación de Stark, 1998, Methods in Microbiology 26:83-100; Garfinkel et al., 1998, Methods in Microbiology 26:101-118; y Lawrence and Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194:281-301.

En otra realización de la invención, un gen puede tener una expresión disminuida sin ruptura o mutación del gen. Por ejemplo, la expresión de un gen puede disminuirse mediante transformación de levadura con una molécula antisentido bajo el control de un promotor regulado o constitutivo (véase la publicación de Nasr et al., 1995, Molecular and General Genetics, 249:51-57. Tal construcción antisentido se liga operablemente a un promotor inducible y se introduce en S. cerevisiae para estudiar la función de un alelo condicional (véase Nasr et al., referencia anterior), o para actuar como perturbaciones de una célula.

La expresión génica puede disminuirse también insertando una secuencia mediante recombinación homóloga en el gen de interés o próximo a él, en donde la secuencia selecciona como diana el mRNA o la proteína para degradación. Por ejemplo, puede introducirse una construcción que codifique ubiquitina de modo que se produce una proteína de fusión de ubiquitina. Esta proteína tendrá, probablemente, una semivida más corta que la proteína de tipo salvaje. Véase por ejemplo, Johnson et al., 1992, EMBO J. 11:497-505.

En un modo preferido, se rompe completamente un gen diana con objeto de asegurar que no existe función residual del gen. Un gen puede romperse mediante métodos "clásicos" o por métodos basados en PCR. El método clásico de inutilización del gen ha sido descrito por Rothstein, 1991. Sin embargo, en algunas realizaciones, es preferible usar un método de deleción basado en la PCR, debido a que es más rápido y de menor esfuerzo de trabajo.

5.2.2. Sistemas de expresión de levadura

La presente invención proporciona células de levadura que sobreexpresan un gen diana por medios recombinantes para usar como una célula diana en el ensayo de selección TDS. La invención proporciona también células de levadura que sobreexpresan un gen diana para usar como una célula "reclamo" en el ensayo de selección TDS.

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En una realización preferida el gen diana es sobreexpresado de modo inducible por lo que pueden modularse los niveles de expresión génica. Cualquiera de los diversos sistemas de expresión regulables conocidos de que se dispone para usar en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, son adaptables a esta invención (Mumberg et al., 1994, Nucl. Acids Res., 22:5767-5768). Habitualmente, la expresión génica es regulada mediante controles de la transcripción, con el promotor del gen que ha de ser regulado reemplazado en su cromosoma por un promotor exógeno regulable. El promotor regulable más comúnmente empleado en levaduras es el promotor GAL1 (Johnston et al., 1984, Mol. Cell. Biol., 8:1440-1448). El promotor GAL1 es fuertemente reprimido por la presencia de glucosa en el medio de crecimiento, y gradualmente es desviado de un modo gradual hacia nivele altos de expresión por la disminución de la abundancia de glucosa y la presencia de galactosa. El promotor GAL1 permite, habitualmente, una gama de 5-100 veces más de control de la expresión sobre un gen de interés.

Otros sistemas de promotores frecuentemente usados, incluyen el promotor MET25 (Kerjan et al., 1986, Nucl. Acids. Res. 14:7861-7871), que es inducido por la ausencia de metionina en el medio de crecimiento, el promotor CUP1, que es inducido por cobre (Mascorro-Gallardo et al., 1996, Gene 172:169-170), el promotor CYCI, que es reprimido en presencia de glucosa (Guarente y Ptashne, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78:2199-2203) y el PHO5 que puede ser regulado por la tiamina (Meyhack et al., 1982, EMBO J. 1:675-680). Todos estos sistemas de promotores son controlables dado que la expresión génica puede ser controlada incrementalmente mediante cambios incrementales de la abundancia de un resto que realiza el control, existente en el medio de crecimiento.

Una desventaja de los sistemas de expresión citados es que el control de la actividad del promotor (efectuada, por ejemplo, mediante cambios en la fuente de carbono, la separación de ciertos aminoácidos, etc.) con frecuencia ocasiona otros cambios de la fisiología celular, que alteran independientemente los niveles de expresión de otros genes. Un sistema para levaduras, desarrollado recientemente, el sistema Tet, mitiga este problema en gran extensión (Gari et al., 1997, Yeast 13:837-848). El promotor Tet, adoptado desde sistemas de expresión de mamíferos (Gossen et al., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 89:5547-55551) es modulado mediante la concentración del antibiótico tetraciclina o el compuesto doxiciclina, estructuralmente afín. Por tanto, en ausencia de doxiciclina, el promotor induce un alto nivel de expresión, y la adición de niveles crecientes de doxiciclina ocasiona una represión aumentada de la actividad del promotor. Una expresión génica de niveles intermedios puede ser conseguida en el estado estacionario mediante la adición de niveles intermedios del fármaco. Además, niveles de doxiciclina que proporcionan una represión máxima de la actividad del promotor (10 microgramos/ml) no tiene efecto significativo sobre el grado de crecimiento en las células de levadura de tipo salvaje (Gari et al., 1997, Yeast 13:837-848).

En una realización alternativa, el gen diana es sobreexpresado bajo el control de un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados incluyen, pero sin limitarse a ellos, los promotores de los genes PGK (3-fosfoglicerato quinasa; Hitzeman et al., 1983, Science 219:620-625), los genes TDH que codifican la GAPDH (Giceraldehído fosfato deshidrogenasa; Holland y Holland, 1979, J. Biol. Chem., 254:9839-9845), los genes TEF1 (factor 1 de alargamiento; Cottrelle et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:3090-3096) y el MF\alpha1 (precursor de la feromona sexual \alpha; Inokuchi et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3185-3193).

El gen informador para marcar la célula diana es expresado también mediante los métodos descritos en esta sección.

En una cierta realización específica, sistemas de expresión tales como anteriormente descritos, son introducidos para usar en células u organismos que carecen del correspondiente gen endógeno y/o de la correspondiente actividad génica, por ejemplo, células en las que el gen endógeno ha sido destruido o ha sido suprimido. El gen recombinante puede utilizarse para expresar una proteína diana mutante o sus fragmentos, que tenga actividad reducida, para generar una célula reclamo o una proteína diana o uno de sus fragmentos funcionales con actividad de tipo salvaje o aumentada, para genera una célula diana. Ejemplos de clases de mutantes de proteínas que poseen actividad aumentada o reducida están descritos en la Sección 5.2.4., que figura más adelante.

5.2.3. Métodos de modificación de la abundancia de proteínas

La presente invención proporciona células diana de levadura con abundancia aumentada de proteínas diana y células reclamo de levadura con abundancia reducida de proteínas diana.

Los métodos de alteración de las abundancias de proteínas incluyen, entre otros, los que alteran las velocidades de degradación de proteínas y los que usan anticuerpos (que se unen a las proteínas afectando a las abundancias de actividades de las especies de proteínas diana nativas). Aumentando (o disminuyendo) las velocidades de degradación de una especie de proteína, disminuye (o aumenta) la abundancia de tal especie. Métodos para aumentar de modo regulable la velocidad de degradación de una proteína diana en respuesta a una temperatura elevada y/o exposición a un fármaco particular, que son conocidos en la técnica, pueden emplearse en esta invención. Por ejemplo, uno de tale métodos emplea un degrón del extremo N terminal inducible por calor o inducible por fármacos, que es un fragmento de proteína del extremo N terminal que expone una señal de degradación que favorece la degradación rápida de la proteína a temperaturas más altas (por ejemplo, 37ºC) y que está oculto, evitando la degradación rápida a temperaturas más bajas (por ejemplo, 23ºC) (Dphmen et al., 1994, Science 263:1273-1276). Un degrón que sirve de ejemplo es el Arg-DHFR^{is}, una variante de la dihidrofolato reductasa murina, en que la Val del extremo N terminal ha sido reemplazada por Arg, y la Pro de la posición 66 ha sido reemplazada por Leu. Según este método, por ejemplo, un gen para una proteína diana, P; es reemplazado mediante métodos estándar de selección génica como diana, conocidos en la técnica, (Lodish et al., 1995, Molecular Biology of the Cell, Capítulo 8, Nueva York: W.H. Freeman y Co.) con un gen que codifica la proteína de fusión Ub-Arg-DHFR^{is}-P ("Ub" significa ubiquitina). La ubiquitina del extremo N terminal es adherida rápidamente después de la traducción que expone el degrón del extremo N terminal. A temperaturas inferiores, las lisinas internas de la Arg-DHFR^{is} no son expuestas. ni tiene lugar la ubiquitinación de la proteína de fusión, la degradación es lenta y los niveles de la proteína diana activa son altos. A temperaturas superiores (en ausencia de metotrexato), las lisinas internas de la Arg-DHFR^{is} son expuestas, tiene lugar ubiquitinación de la proteína de fusión, la degradación es rápida y los niveles de proteína diana activa son bajos. La activación por calor de la degradación es bloqueada de modo regulable por exposición a metotrexato. Este método es adaptable a otros degrones del extremo N terminal que responden a otros factores de inducción, tales como fármacos y cambios de temperatura.

Las abundancias de proteínas diana así como, directa o indirectamente, sus actividades, pueden hacerse disminuir también por neutralización de anticuerpos o aumentarse por activación de anticuerpos.

Los anticuerpos pueden introducirse en las células de varios modos. En una realización preferida, un anticuerpo es introducido en una célula por transformación de mRNA de un hibridoma que codifica el anticuerpo en la célula (Burke et al., 1984, Cell 36:847-858). En otra técnica, anticuerpos recombinantes pueden ser obtenidos y expresados ectópicamente en una amplia variedad de tipos de células no linfoides para unirse a proteínas diana así como para bloquear las actividades de proteínas diana (Biocca et al., 1995, Trends in Cell Biology 5:248-252). Preferiblemente, la expresión del anticuerpo está bajo el control de un promotor regulable, tal como el promotor Tet. Una primera etapa es la selección de un anticuerpo monoclonal particular con especificidad apropiada para la proteína diana (véase más adelante). Después, secuencias que codifican las regiones variables del anticuerpo seleccionado pueden ser clonadas en diversos formatos de anticuerpos logradas, incluyendo, por ejemplo, anticuerpo total (inmunoglobulina), fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv de una sola cadena (regiones V_{H} y V_{L} unidas mediante un engarce peptídico) (fragmentos "ScFv"), diacuerpos (dos fragmentos ScFv asociados con especificidades diferentes), y así sucesivamente (Hayden et al., 1997, Current Opinion in Immunology 9:210-212). Anticuerpos de los diversos formatos expresados intracelularmente, pueden ser elegidos como diana en compartimientos celulares (por ejemplo, el citoplasma, el núcleo, las mitocondrias, etc.) expresándolos como fusiones con las diversas secuencias conductoras intracelulares conocidas (Bradbury et al., 1995, Antibody Engineering, vol. 2, Borrebaeck compilador, IRL Press, páginas 295-361). En particular, el formato ScFv se muestra particularmente adecuada para la elección del citoplasma como diana.

Para preparar anticuerpos monoclonales dirigidos hacia una proteína diana, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Tales técnicas incluyen, aun cuando no se restringe a ellas, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma del EBV, para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Según la invención, pueden utilizarse anticuerpos humanos y pueden ser obtenidos usando hibridomas humanos (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030), o transformando células B humanas con virus EBV in vitro (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). En efecto, según la invención, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al, 1985, Nature 314:452-454), mediante corte y empalme de los genes procedentes de una molécula de un anticuerpo de ratón, específico para la proteína diana, junto con genes procedentes de una molécula de un anticuerpo humano de actividad biológica apropiada; tales anticuerpos están dentro del alcance de estas invención. También pueden ser usados anticuerpos humanizados con las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) de un anticuerpo de ratón, y la regiones de marco de lectura humano.

Adicionalmente, cuando son ventajosos los anticuerpos monoclonales, estos anticuerpos pueden ser seleccionados alternativamente partiendo de colecciones grandes de anticuerpos usando las técnicas de exposición de fagos (Marks et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:16007-16010). Usando esta técnica colecciones de hasta 10^{12} anticuerpos diferentes han sido expresadas sobre la superficie de fago filamentoso fd, creando un sistema inmune de anticuerpo, in vitro, de "pote único", para la selección de anticuerpos monoclonales (Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13:3245-3260). La selección de anticuerpos desde tales colecciones puede efectuarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen poner en contacto el fago con la proteína diana inmovilizada, seleccionar y clonar el fago unido a la diana, y subclonar las secuencias que codifican las regiones variables del anticuerpo en un vector apropiado que exprese el formato deseado del anticuerpo.

Según la invención, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (patentes de EE.UU. 4.946.778 y 5.359.046) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena única específicos para la proteína diana. Una realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de colecciones de expresión de Fab (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281), que permiten la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificada deseada para la proteína diana.

En la producción de anticuerpos, la selección del anticuerpo deseado puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas). Para seleccionar anticuerpos específicos para una proteína diana, pueden ensayarse los hibridomas generados o una colección de anticuerpos de exposición de fagos para un anticuerpos que se una a la proteína diana.

5.2.4. Métodos de modificación de la actividad de proteínas

La presente invención proporciona células diana de levadura con actividad de proteína diana aumentada y células reclamo (decoy) de levadura con actividad de proteína diana reducida.

Los métodos para modificar directamente las actividades de las proteínas incluyen, entre otros, mutaciones, por ejemplo, mutaciones sensibles a la temperatura, mutaciones negativas dominantes, ganancia de mutaciones funcionales, por ejemplo, aquellas que dan lugar a proteínas activas constitutivamente, fármacos específicos, la adición de restos químicos tales como grupos fosfato o acetilo, o sustituciones de aminoácidos que imitan la adición de tales restos químicos, y el uso de anticuerpos.

Las mutaciones negativas dominantes son mutaciones a genes endógenos o genes recombinantes mutantes que cuando son expresados en una célula alteran la actividad de una especie de proteína elegida como diana. Dependiendo de la estructura y de la actividad de la proteína elegida como diana, existen reglas generales que guían la selección de una estrategia apropiada para construir mutaciones negativas dominantes que alteran la actividad de tal diana (Hershkowitz, 1987, Nature 329:219-222). En el caso de formas monómeras activas, la sobreexpresión de una forma inactiva puede ocasionar competición con sustratos o ligandos naturales, suficiente para reducir significativamente la actividad neta de la proteína diana. Tal sobreexpresión puede conseguirse, por ejemplo, asociando con el gen mutante un promotor, preferiblemente un promotor regulable o inducible, de actividad aumentada. Alternativamente, pueden llevarse a cabo cambios de restos de sitios activos de modo que tenga lugar una asociación virtualmente irreversible con el ligando diana. Tal cosa puede conseguirse con ciertas tirosina quinasas, mediante reemplazo cuidadoso de restos de serina de sitios activos. (Perlmutter et al., 1996, Current Opinion in Immunology 8:285-290).

En el caso de formas multímeras activas, varias estrategias pueden guiar la selección de un mutante negativo dominante. La actividad multímera puede disminuirse de modo regulable mediante expresión de genes que codifican fragmentos proteínicos exógenos que se unen a los dominios de la asociación multímera y evitan la formación de multímeros. Alternativamente, la sobreexpresión regulable de una unidad proteínica inactiva de un tipo particular, puede resolver unidades activas de tipo salvaje en multímeros inactivos, haciendo disminuir con ello la actividad multímera (Nocka et al., 1990, EMBO J. 9:1805-1813). Por ejemplo, en el caso de proteínas diímeras de unión de DNA, el dominio de unión de DNA puede ser suprimido desde la unidad de unión de DNA, o el dominio de activación suprimido desde la unión de activación. Asimismo, en este caso, la unidad del dominio de unión de DNA puede expresarse sin el domino que causa asociación con la unidad de activación. Por ello, los sitios de unión de DNA son resueltos sin activación posible de la expresión. En el caso en que un tipo particular de unidad sufra, normalmente, un cambio de conformación durante la actividad, la expresión de una unidad rígida puede inactivar los complejos que resultan. Como un ejemplo adicional, las proteínas implicadas en mecanismos celulares, tales como la motilidad celular, el proceso mitótico, la arquitectura celular, y así sucesivamente, están compuestas, típicamente, por asociaciones de muchas subunidades de unos pocos tipos. Estas estructuras son con frecuencia altamente sensibles a la rotura por inclusión de algunas unidades monómeras con defectos estructurales. Tales monómeros mutantes alteran las actividades proteínicas de importancia y pueden ser expresadas de modo regulable en una célula.

Además, de mutaciones negativas dominantes, proteínas diana mutantes que son sensibles a la temperatura (u otros factores exógenos) o constitutivamente activas, pueden obtenerse mediante mutagénesis y procedimientos de selección que son bien conocidos en la técnica.

Asimismo, los expertos en la técnica podrán apreciar que la expresión de anticuerpos que se unen e inhiben una proteína diana, pueden ser empleados como otro estrategia negativa dominante.

5.3. Metodología de células de mamífero e insecto

Los métodos de selección TDS de la invención, pueden ser usados también con células cultivadas de mamífero y de insecto. Los genes de células cultivadas que contribuyen positivamente a la adaptación, pueden proporcionar dianas para el diseño o descubrimiento de fármacos antiproliferativos y antitumorales y de fármacos antivirales e insecticidas, que pueden ser usados en una diversidad de ambientes terapéuticos, veterinarios y agrícolas.

Los genes que contribuyen positivamente a la adaptación de células de mamífero cultivadas, que incluyen pero sin limitarse a ellos, genes esenciales, que pueden ser usados como dianas para seleccionar agentes antiproliferativos, tales como los que pueden ser usados en el tratamiento de la psoriasis, la prevención de las restenosis después de las angioplastias, y de tumores benignos y malignos, por ejemplo. Células de mamífero cultivadas pueden usarse también para seleccionar fármacos para tratar afecciones o enfermedades humanas si puede identificarse un gen diana (a) cuya sobreactividad contribuya a la afección o enfermedad, y (b) la adaptación de la célula cultivada puede llevarse a cabo, dependiendo de la actividad de dicho gen diana.

Los genes que contribuyen positivamente a la adaptación de células de insecto cultivadas, que incluyen pero sin limitarse a ellos, genes esenciales, pueden ser usados para identificar inhibidores de dos clases útiles de dianas. Los genes diana que no están conservados entre insectos y mamíferos o que no tienen homólogos de mamífero, pueden ser usados como dianas para seleccionar insecticidas. A la inversa, genes diana de insectos que han conservado homólogos de mamífero, pueden ser usados para seleccionar agentes antiproliferativos, como se ha descrito para las células de mamífero.

La presente invención proporciona células de mamífero y de insecto en las que el gen diana de elección está subexpresado para usar como una célula reclamo en el método de selección TDS. Tal subexpresión se refiere a un nivel reducido de expresión o actividad en una célula u organismo relativo a un acompañante del cultivo conjunto. La subexpresión puede ser conseguida haciendo disminuir los niveles de RNA que codifican una proteína diana o haciendo disminuir los niveles de actividad de la propia proteína diana, según se describe más adelante.

5.3.1. Métodos de reducción de la abundancia o actividad del RNA

La subexpresión en cultivos de tejidos es conseguida del mejor modo reduciendo la abundancia o actividad del mRNA que codifica la proteína diana. Los métodos de reducción de las abundancias o actividades del RNA caen, corrientemente, dentro de tres clases, ribozimas, especies antisentido y aptámeros de RNA (Good et al., 1997, Gene Therapy 4:45-54). La exposición regulable de una célula a estas entidades permite una perturbación regulable de la abundancia de RNA.

Los ribozimas son RNAs capaces de catalizar reacciones de escisión de RNA. (Cech, 1987, Science 236:1532-1539; Publicación Internacional OCT WO 90/11364, publicada el 4 de Octubre de 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Ribozimas de RNA de "horquilla de pelo" y de "pez martillo", pueden diseñarse para escindir específicamente un mRNA diana particular. Se han establecido reglas para el diseño de moléculas cortas de RNA con actividad de ribozimas, que son capaces de escindir otras moléculas de RNA de un modo altamente específico de la secuencia y pueden elegirse como diana para, virtualmente, todos los tipos de RNA. (Haseloff et al., 1988, Nature 334:585-591; Koizumi et al., 1988, FEBS Lett. 228:228-230; Koizumi et al., 1988, FEBS Lett. 239:285-288). Los métodos que emplean ribozimas para la subexpresión de un gen diana, llevan consigo inducir la expresión en una célula, etc., de tales moléculas pequeñas de ribozimas de RNA (Grassi and Marini, 1996, Annals of Medicine, 28:499-510; Gibson, 1996, Cancer and Metastasis Reviews 15:287-299).

Los ribozimas pueden ser expresados rutinariamente in vivo en número suficiente para ser efectivos desde el punto de vista catalítico en la escisión de RNA, y modificar con ello la abundancia de RNA en una célula (Cotten et al., 1989, EMBO J. 8:3861-3866). En particular, una secuencia de DNA que codifica un ribozima, diseñado según las reglas anteriores y sintetizado, por ejemplo, mediante la química estándar de la fosforamidita, puede ligarse en un sitio de una enzima de restricción en el tallo de un anticodón y el lazo de un gen que codifica un tRNA, que luego puede transformarse y expresarse en una célula de interés por métodos rutinarios de la técnica. Preferiblemente, un promotor inducible (por ejemplo, un glucocorticoide o un elemento de respuesta de tetraciclina) es introducido también en esta construcción, de modo que la exptesión del ribozima puede ser regulada selectivamente. Genes de tDNA (es decir, genes que codifican tRNAs) son útiles en esta solicitud debido a su pequeño tamaño, alta velocidad de transcripción y expresión de ubiquitina esn diferentes tipos de tejidos. Por consiguiente, pueden diseñarse rutinariamente ribozimas para escindir virtualmente cualquier secuencia de mRNA y una célula puede transformarse rutinariamente con DNA que codifica tales secuencias de ribozimas de modo que es expresada una cantidad del ribozima regulable y catalíticamente eficaz. Por consiguiente, puede alterarse la abundancia de virtualmente cualquier especie de RNA de una célula.

En otra realización, la actividad de una especie de RNA diana(preferiblemente mRNA) específicamente su velocidad de traducción, puede ser inhibida de modo regulable mediante la aplicación regulable de ácidos nucleicos antisentido. Un ácido nucleico "antisentido", tal como se usa en esta memoria, se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridarse a una parte del RNA diana (por ejemplo, no-poli A) específica de la secuencia, por ejemplo, su región de iniciación de la traducción, en virtud de alguna secuencia complementaria de una región codificante y no codificante. Los ácidos nucleicos antisentido de la invención son producidos intracelularmente mediante la transcripción de secuencias exógenas introducidas en cantidades regulables suficientes para perturbar la traducción del RNA diana.

Preferiblemente, los ácidos nucleicos antisentido tienen por lo menos seis nucleótidos y hasta aproximadamente 200 oligonucleótidos. Los ácidos nucleicos antisentido de la invención comprenden una secuencia complementaria de una parte, al menos, de una especie de RNA diana. No obstante, no se requiere una complementariedad absoluta, aun cuando se prefiere. Una secuencia "complementaria de una parte al menos de un RNA", tal como a la que se hace referencia aquí, significa una secuencia que posee suficiente complementariedad para ser capaz de hibridarse con el RNA, formando un dúplex estable; en el caso de ácido nucleicos antisentido de doble cadena, puede ensayarse así una cadena del DNA dúplex, o puede ensayarse una formación tríplex. La capacidad de hibridación depende del grado de complementariedad y de la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, cuanto más largo es el ácido nucleico que se hibrida, más desigualdades básicas con un RNA diana puede contener y formar, todavía, un dúplex estable (o tríplex, según sea el caso). Los expertos en la técnica, pueden determinar una grado tolerable de desigualdad mediante el uso de procedimientos operatorios estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. La cantidad de ácido nucleico antisentido efectiva para inhibir la traducción del RNA diana, puede determinarse mediante técnicas analíticas estándar.

Los ácidos nucleicos antisentido de la invención son expresados intracelularmente de modo regulable por transcripción desde una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector puede ser introducido in vivo de modo que sea captado por una célula, dentro de cuya célula el vector o una parte del mismo es transcrita, produciendo un ácido nucleico (RNA) antisentido de la invención. Tal vector podría contener una secuencia que codificara el ácido nucleico antisentido. Tal vector puede permanecer episomal o llegar a integrarse en el cromosoma, en tanto pueda ser transcrito para producir el RNA antisentido deseado. Tales vectores pueden ser construidos mediante métodos de tecnología de DNA recombinante, estándar en la técnica. Los vectores pueden ser plasmídicos, virales u otros conocidos en la técnica, usados para la replicación y expresión en células de mamífero y de insecto. La expresión de las secuencias que codifican los RNAs antisentido puede realizarse mediante cualquier promotor conocido en la técnica, que actúe en una célula de interés. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Lo más preferible, es que los promotores sean controlables o inducibles mediante la administración de un resto exógeno, con objeto de conseguir una expresión controlada del oligonucleótido antisentido. Tales promotores controlables incluyen, pero sin limitarse a ellos, el promotor Tet, la región de promotor temprana de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición del terminal largo de 3’ del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina quinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), etc.

Por consiguiente, los ácidos nucleicos antisentido pueden diseñarse para elegir como diana virtualmente cualquier secuencia de mRNA, y una célula puede ser transformada rutinariamente con ácidos nucleicos que codifican tales secuencias antisentido, de modo que es expresada una cantidad efectiva y controlable del ácido nucleico antisentido. Por tanto, la traducción de virtualmente cualquier especie de RNA en una célula puede ser perturbada de modo controlable.

Finalmente, en una realización adicional, pueden introducirse aptámeros de RNA en una célula o expresarse en ella. Los aptámeros de RNA son ligandos específicos de RNA para proteínas, tales como RNA de Tat y Rev (Good et al., 1997, Gene Therapy 4:45-54) que pueden inhibir específicamente su traducción.

5.3.2. Métodos de modificación de la abundancia de proteínas

La presente invención proporciona células diana cultivadas, de mamífero y de insecto, con abundancia aumentada de proteína diana y células reclamo (decoy) cultivadas de mamífero y de insecto, con abundancia reducida de proteína diana. Los métodos para modificar la abundancia de proteína diana en células cultivadas, de mamífero y de insecto, se consiguen esencialmente como se ha descrito para la levadura en la Sección 5.2.3, que figura anteriormente.

Para disminuir la abundancia de proteína en células cultivadas, de mamífero y de insecto, usando un degrón del extremo N-terminal, ha de tenerse cuidado en la selección del degrón para asegurar que es funcional a una temperatura compatible con el crecimiento de la célula.

5.3.3. Métodos de modificación de actividades de proteínas

La presente invención proporciona células diana cultivadas, de mamífero y de insecto, con actividad aumentada de proteína diana, y células "reclamo" cultivadas, de mamífero y de insecto, con actividad disminuida de proteína diana. Los métodos para modificar la actividad de proteínas diana en células cultivadas de mamífero y de insecto, se siguen esencialmente como se ha descrito para la levadura en la Sección 5.2.4, expuesta anteriormente.

5.3.4. Sistemas de sobreexpresión de cultivos celulares

En células cultivadas, de mamífero y de insecto, se encuentran disponibles varios medios de sobreexpresión (Spencer, 1996, Trends Gener. 12:181-187). A título de ejemplo, según se cita en la Sección 5.2.2. anterior, el sistema Tet es usado profusamente, tanto en su forma original, el sistema "hacia adelante" en el que la adición de doxiciclina reprime la transcripción, como en el "inverso", más moderno, en el que la adición de doxiciclina estimula la transcripción (Gossen et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Hoffmann et al., 1997, Nucl. Acids, Res. 25:1078-1079; Hofmann et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5185-5190; Paulus et al., 1996, Journal of Virology, 70:62-67). Otro sistema de promotor regulable, empleado comúnmente en células de mamífero, es el sistema inducible por ecdisona desarrollado por Evans y colegas (No et al., 1996, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:3346-3351), en el que la expresión es regulada mediante el nivel de muristerona que se añade a las células cultivadas. Asimismo, la expresión puede ser modulada usando el sistema de "dimerización inducida químicamente" (CID) desarrollado por Schreiber, Crabtree, y colegas (Belshaw et al., 1996, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93:4604-4607; Spencer, 1996, Trends Genet. 12:181-187) y sistemas similares de expresión génica regulable, tales como los desarrollados originalmente en la levadura. En este sistema, el gen de interés es colocado bajo el control del promotor que responde al sistema CID, y transfectado en células que expresan dos proteínas híbridas diferentes, una de ellas compuesta de un dominio de unión de DNA fusionado a FKBP12, que fija FK506. La otra proteína híbrida contiene un dominio de activación de la transcripción fusionado también a FKBP12. La molécula que induce el sistema CID es la FK1012, una versión homodímera de la FK506, que es capaz de unir simultáneamente ambas proteínas híbridas las de unión de DNA y de activación de la transcripción. Con la presencia graduada de FK1012, se activa la transcripción graduada del gen controlado.

Para otros modos de expresión constitutiva o inducible, los promotores que pueden ser usados incluye, pero sin limitarse a ellos, cualquiera de los promotores siguientes: la región de promotor temprana de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature, 290:304-310), el promotor contenido en la repetición del terminal largo de 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22:787-797); el promotor de timidina quinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneina (Brinster et al., 1982, Nature, 296:39-42), y la secuencia reguladora del gel inmediato-temprana del citomegalovirus humano
(Foecking, M., y Hofstetter, H., 1986, Gene, 45:101-105; patente de EE.UU. No. 5.168.062).

Para cada uno de los sistemas de expresión de cultivos celulares descritos, como es ampliamente conocido por los expertos en la técnica, el gen diana se coloca bajo el control del promotor de elección, y un plásmido que alberga esta construcción junto con un gen de resistencia a antibiótico es transfectado en células cultivadas de mamífero o de insecto. En general, el DNA plasmídico se integra en el genoma, y se seleccionan colonias resistentes al fármaco y se clasifican para obtener una expresión apropiada del gen regulado. Alternativamente, el gen regulado puede ser insertado en un plásmido episomal tal como el pCEP4 (Invitrogen, Inc.), que contiene componentes del virus de Epstein-Barr necesarios para la replicación del plásmido.

En una realización preferida, un gen informador ligado operablemente a un promotor, está presente en el plásmido que alberga el gen diana. Para generar una célula "reclamo", puede usarse un plásmido similar que no alberga inserción del gen diana ni tiene un promotor mutante.

5.4. Metodología con C. elegans

La presente invención proporciona cepas de C. elegans que pueden ser usadas para la identificación y caracterización de moléculas que inhiben genes que contribuyen positivamente o negativamente a la adaptación de células y/u organismos, según los métodos de la presente invención. Tales cepas de C. elegans se caracterizan por niveles elevados de expresión o actividad de proteínas diana en un gusano diana, con relación a un gusano "reclamo".

Genes de C. elegans que contribuyen a la adaptación pueden ser usados para identificar agentes antiproliferativos para usar en el tratamiento de enfermedades o trastornos de hiperproliferación en mamíferos, si los genes han conservado homólogos de mamifero. Tales genes pueden ser usados también para seleccionar fármacos, para tratar enfermedades o trastornos de otros mamíferos, incluyendo los seres humanos, si los genes (a) se sabe que contribuyen a una enfermedad por superactividad o expresión anormal, y (b) la adaptación de una cepa de gusano puede hacerse que sea dependiente de la actividad de los genes. Por ejemplo, si el gen no contribuye a la adaptación de un gusano del tipo suave, puede generarse una cepa de gusano con una mutación en un gen funcionalmente redundante para usar en un método de ensayo TDS.

Niveles elevados de expresión del gen diana pueden ser la sobreexpresión del gen diana en el gusano diana, subexpresión (por ejemplo debida a inactivación) del gen diana en la expresión del gusano "reclamo" de la diana en un tiempo de desarrollo diferente al de los animales de tipo salvaje, en una célula "reclamo", por ejemplo, pérdida de expresión del gen diana en un momento necesario para la adaptación celular.

La presente invención proporciona como cepas diana y/o cepas "reclamo", nematodos transformados genéticamente. Las cepas pueden albergar (a) una deleción o una inserción en el gen diana, (b) RNAs qie interfieren, derivados de un gen diana; y/o (c) transgenos para la expresión de formas de tipo salvaje o mutantes de tales genes, según se ha descrito antes.

En una realización específica de un tipo de cepa, un ácido nucleico ha sido introducido recombinantemente en el genoma del gusano como un gen adicional, bajo la regulación de un elemento promotor exógeno o endógeno, y como o bien un minigén o un fragmento genómico grande. El ácido nucleico puede codificar un supresor o mutante negativo dominante del gen diana, titulable, para la generación de una cepa reclamo para el método de selección TDS. Al revés, el ácido nucleico puede codificar una proteína diana de tipo salvaje para sobreexpresión, para generar una cepa diana para un ensayo TDS.

Es preferible asegurar que la expresión del gen diana esté manipulada en todos los tejidos dado que la modulación del crecimiento causada por un compuesto en ensayo puede ser mediada por un tipo específico de célula o de tejido.

La invención proporciona, además, animales con genes mutados o inactivados, por ejemplo, producidos mediante mutagénesis por compuestos químicos o rayos X, para usar como cepas reclamo en ensayos TDS.

El C. elegans, a semejanza de muchos nematodos, es hermafrodita, Su reproducción tiene lugar partiendo de la fertilización de oocitos mediante esperma, que habitualmente procede del mismo individuo. No obstante, cuando las líneas de gusano diana y reclamo se mezclan y se las deja propagar, tiene lugar la reproducción sexual entre las dos líneas del gusano. Los linajes diana y reclamo son, preferiblemente, isógenos excepto para los genes diana e informador, pero pueden ser dos linajes cualquiera que sean sustancialmente diferentes solo en cuanto a la actividad de expresión de un gen diana o una proteína codificada por el gen diana, y la presencia o ausencia de un gen informador. Por consiguiente, el esquema de segregación de un minicromosoma o transgeno no es importante, en tanto en cuanto el gen informador esté ligado genéticamente al gen diana. Los únicos componentes críticos para el éxito de un ensayo de selección TDS en un animal total son: 1) la capacidad del gen diana para conferir sensibilidad a un compuesto específico del animal diana; y 2) la facilidad y fiabilidad del gen informador para la detección. Los dos factores pueden ser determinados en un ensayo de selección a escala de planta piloto antes de llevar a cabo un ensayo de selección a gran escala, por ejemplo, por identificación de condiciones de selección adecuadas usando una molécula testigo, tal como un inhibidor conocido del gen diana.

Más adelante se describen métodos para la creación de cepas de C. elegans que poseen expresión elevada del gen diana en el gusano diana, con relación al gusano reclamo. Los métodos de modificación de la expresión incluyen cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Como ejemplos específicos se incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos, mutagénesis química por EMS, mutagénesis del transposón Tc1, interferencia de RNA de doble cadena, y mis-expresión mediada por transgeno. En la creación de animales transgénicos, se prefiere usar promotores heterólogos (es decir, no nativos) para inducir la expresión del transgeno.

Con fines de selección, pueden introducirse compuestos de ensayo en los nematodos mediante difusión, ingestión, microinyección, o disparo con una pistola de partículas. En una realización preferida, el compuesto en ensayo es esparcido sobre el medio de ingestión del gusano.

5.4.1. Mutagénesis por deleción química con EMS

La presente invención proporciona un gusano "reclamo" que posee actividad reducida de gen diana, preferiblemente para aumentar la sensibilidad de un ensayo de selección TDS cuando el gusano diana posee gen diana o proteína o actividad codificada por el gen diana, que está elevada con respecto a la expresión o actividad de tipo salvaje. En una realización específica, tales cepas reclamo comprenden genes diana mutados. En una realización específica, se emplea mutagénesis por deleción química para generar una expresión reducida de un gen diana en C. elegans. En una realización preferida, el mutágeno químico es el metanosulfonato de etilo (EMS). Una cepa reclamo puede ser heterozigótica para un mutante por deleción con EMS, que sea un alelo nulo del gen diana, o heterozigótica u homozigótica para un mutante por deleción con EMS que tenga una pérdida parcial del alelo de funcióno, es decir, un hipomorfo, del gen diana.

El EMS es un mutágeno químico usado comúnmente para crear mutaciones de pérdida de función en genes de interés del C. elegans. Aproximadamente el 13% de las mutaciones inducidas por EMS son deleciones pequeñas. Con los métodos descritos en esta sección, hay, aproximadamente, una probabilidad del 95% de identificar una deleción de interés explorando 4 x 10^{6} genomas mutagenizados con EMS. En breve, este procedimiento operatorio lleva consigo la creación de una colección de varios millones de C. elegans mutagenizados que son distribuidos en pequeños grupos en placas de 96 pocillos, estando compuesto cada grupo por aproximadamente 400 genomas haploides. Se emplea una parte de cada grupo pera generar la correspondiente biblioteca de DNA genómico derivada de los nematodos mutagenizados. La biblioteca de DNA se selecciona con un ensayo de PCR para identificar grupos que son portadores de genomas con deleciones de interés, y se recuperan gusanos mutantes que son portadores de las deleciones deseadas desde las correspondientes agrupaciones de los animales mutagenizados. Aun cuando el EMS es el mutágeno preferido para generar deleciones, pueden usarse otros mutágenos que proporcionen también un rendimiento importante de deleciones, tales rayos X, rayos gamma, diepoxibutano, formaldehído y trimetlpsoraleno con luz ultravioleta.

Los nematodos pueden ser mutagenizados con EMS usando cualquier procedimiento operatorio conocido por los expertos en la técnica, tal como el procedimiento descrito por Sulston y Hodgkin (1988, Methods, páginas 587-606, en The Nematode Caenorhabditis elegans, Wood, Compilador, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). A título de ejemplo, después de exponer al mutágeno, los nematodos son distribuidos en placas petri, incubados uno a dos días, y aislados embriones por tratamiento con hipoclorito (ID.), Los embriones se dejan madurar y se recogen las larvas L1 después de incubación durante la noche. Las larvas se distribuyen en placas petri a una densidad media de 200 animales por placa, y se incuba durante 5 a 7 días hasta que justamente son privados de alimento. Se recoge una muestra de nematodos desde cada placa lavando con una solución de agua destilada, y los nematodos lavados procedentes de cada una de las placas se colocan en una placa de 96 pocillos. Los gusanos son lisados mediante la adición de un volumen igual de tampón de lisis (KCl 100 mM, Tris.HCl pH 8,3 20 mM, MgCl_{2} 5 mM, Nonidet P-40 al 0,9%, Tween 20 al 0,9%, gelatina al 0,02%, y proteinasa K, 400 \mug/ml) seguida de incubación a -80ºC durante 15 minutos, 60ºC durante 3 horas, y 95ºC durante 15-30 minutoss. Los lisados que contienen DNA son mantenidos por almacenamiento de las placas a -80ºC hasta que son analizados posteriormente. Partes alícuotas de nematodos vivos procedentes de cada una de las placas son distribuidas en tubos colocados en gradillas para almacenamiento a -80ºC, de modo que la disposición física de los tubos de animales vivos es la misma que la disposición de los correspondientes lisados de DNA en las placas de 96 pocillos.

Además, a título de ejemplo, se emplea luego una estrategia de agrupamiento para permitir una selección eficiente por PCR de los lisados de DNA. Se forman los grupos procedentes de cada una de las placas de 96 pocillos mezclando 10 \mul de lisado procedente de los 8 pocillos que comprenden cada columna de pocillos de una placa. Se emplean los lisados reunidos de cada columna para realizar la selección con PCR. Se designan cebadores de la PCR para que cada locus de interés esté separado aproximadamente 1,5 a 12 kb, dependiendo del tamaño del locus, de tal modo que las deleciones que encierran las regiones codificantes enteras de los genes diana pueden ser detectadas siguiendo un procedimiento operatorio anteriormente descrito (véase Plasterk, 1995, Methods in Cell Biology 48:59-80). Para cada una de las regiones, se eligen dos juegos de pares de cebadores para llevar a cabo la estrategia de PCR establecida, de tal modo que se usa un juego exterior para la primera ronda de PCR y un juego interior para la segunda ronda de PCR. La segunda ronda de PCR se lleva a cabo para conseguir una mayor especificidad de la reacción. Los productos de la segunda ronda de PCR pueden ser analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% para determinar si ha sido generado un producto potencial de deleción.

5.4.2. Mutagénesis por inserción del transposón Tc1

La reducción de la expresión del gen diana en C. elegans puede conseguirse alternativamente por mutagénesis usando el elemento transposable Tc1. La inserción del elemento transposable en un gen diana puede dar por resultado la inactivación de la función del gen diana. Partiendo de una cepa que contiene un alto número de copias del elemento tansposable Tc1 en un fondo mutador (es decir, una cepa en la que el elemento transposable es altamente móvil), se crea una colección de Tc1 que contiene aproximadamente 3.000 cultivos individuales según se ha descrito anteriormente (Id). La colección es explorada para determinar las inserciones de Tc1 existentes en la región de interés, usando la reacción en cadena de la polimerasa con un juego de cebadores específico para la secuencia de Tc1 y un juego cebadores específicos del gen. Debido a que el Tc1 muestra preferencia para inserción dentro de intrones, con frecuencia es necesario llevar a cabo una selección secundaria de poblaciones de animales de inserción para determinar una escisión imprecisa del elemento transposable, que puede dar como resultado la deleción de una parte o de la totalidad del gen de interés (en general, están suprimidos 1-2 kb de la secuencia genómica). Se lleva a cabo la selección para deleciones de Tc1 y los animales resultantes de la deleción son recuperados del mismo modo que para la selección con EMS anteriormente descrita.

5.4.3. Interferencia de RNA de doble cadena

Una cepa de C. elegans que subexpresa un gen diana, puede ser generada usando un método basado en las propiedades de interferencia de RNAs de doble cadena derivados desde las regiones codificantes de los genes identificados (véase Fire et al., 1998, Nature 391:806-811). En el método, RNAs sentido y antisentido derivados desde una parte sustancial de un gen diana de C. elegans, son sintetizados in vitro partiendo de moldes de DNA de fagémidos que contienen clones de cDNA de genes diana que están insertados entre promotores en oposición para RNA polimerasas de los fagos T3 y T7, o a partir de productos de PCR amplificados procedentes de regiones codificantes de genes diana, en que los cebadores usados para las reacciones de PCR han sido modificados mediante la adición de promotores de los fagos T3 y T7. Los RNAs sentido y antisentido que resultan son sometidos a hibridación de extremos complementarios en un tampón de inyección y el RNA de doble cadena se inyecta en hermafroditas del C. elegans. La progenie de los hermafroditas inyectados son inspeccionados para determinar los fenotipos de interés. Otros métodos pueden ser empleados también para generar fenotipos mutantes en nematodos usando especies de DNA o RNA antisentido de una sola cadena, según se ha descrito antes. Sin embargo, los métodos basados en una sola cadena pueden ser menos eficaces en los nematodos que el de interferencia de DNA de doble cadena (véase Guo y Kemphues, 1995, Cell, 81:611-620; véase también Fire, 1991, Development, 113:503-514).

5.4.4. Sobreexpresión de gener diana mediada por transgenos

La presente invención proporciona cepas diana de C. elegans que sobreexpresan un gen diana para usar en un ensayo de selección TDS. Los promotores que pueden ser usados para la sobreexpresión de genes diana incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos, la región temprana del promotor SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición del terminal largo de 3’ del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de la timidino quimasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneina (Brinster et al., 1982, Nature, 296:39-42), la secuencia reguladora del citomegalovirus humano para su expresión en cualquier tejido (Foecking, M, y Hofstetter, H., 1986, Gene, 45:101-105; patente de EE.UU. No. 5.168.062). La expresión de un gen diana inducida por la temperatura, puede ser regulada por los promotores génicos del choque térmico hsp 16-2 y hsp 16-41.

En una realización específica, se incorpora en un vector de transformación una fusión génica que comprende un promotor constitutivo o inducido por choque térmico, ligado funcionalmente a un gen diana y/o un gen informador. El vector de transformación comprende también una marcador seleccionable dominante, tal como el rol-6. El procedimiento de microinyección se lleva a cabo, preferiblemente, según los métodos de Fire et al. (1986, EMBO J., 5:2673-2680). Los animales transgénicos para usar como cepas diana son identificados como aquellos que ponen de manifiesto un fenotipo "roller". La cepa reclamo es generada por transformación de gusanos con un vector qiue comprende el marcador seleccionable dominante, pero no el gen diana ni el gen informador.

5.5. Metodología bacteriana

La invención proporciona células bacterianas que han sido modificadas para sobreexpresar una proteína cuya inhibición reduce la adaptación o la viabilidad celular, o en una realización alternativa, aumenta la adaptación o la viabilidad celular. Tales células bacterianas se usan de conformidad con los métodos TDS descritos en la presente solicitud de patente.

La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína para la que se busca un inhibidor o un análogo o fragmento funcionalmente activo u otro de sus derivados, pueden insertarse en un vehículo de expresión apropiado, por ejemplo, un plásmido que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Las señales necesarias de la transcripción y la traducción pueden ser aportadas desde el gen nativo y/o sus regiones de flanqueo. Alternativamente, se construye un vehículo de expresión insertando una secuencia de DNA estructural que codifica la proteína deseada junto con señales adecuadas de iniciación y terminación de la traducción en fase de lectura operable, con un promotor funcional, usando uno de una diversidad de métodos que se conocen en la técnica para la manipulación de DNA. Véase, en general, Sambrook et al, 1989, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Nueva York, NY. Estos métodos pueden incluir técnicas de DNA recombinante y sintéticas, in vitro, y recombinantes in vivo (recombinación genérica).

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En ciertas realizaciones específicas de la invención, el vehículo de expresión de la proteína diana es un plásmido. Gran número de plásmidos adecuados son conocidos por los expertos en la técnica, y se encuentran disponibles en el comercio, para generar las construcciones recombinantes de la presente invención.

Tales plásmidos comerciales incluyen, por ejemplo, el pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y el GEM 1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones "de esqueleto" del pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que haya de ser expresada. El pBR322 se considera que es un plásmido de bajo número de copias. Si se desean niveles de expresión más altos, el plásmido puede ser un plásmido de un número de copias alto, por ejemplo un plásmido con una cadena principal de pUC. Los plásmidos pUC incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos, el pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985, Gene, 33:103) y el pBluescript (Stratagene).

Otros plásmidos de expresión que pueden ser usados en asociación con los métodos de la invención, incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos: pBs, phagescript, PhiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pHN46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); y GEM 1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.).

La presente invención proporciona también bacterias que sobreexpresan una proteína diana mediante integración cromosómica mediada por transposón, de la secuencia codificante de la proteína. Cualquier plásmido de transposón conocido en la técnica, puede ser usado en los métodos de la invención, en tanto un ácido nucleico que codifique la proteína diana pueda ser construido en la casete del transposón. Por ejemplo, la invención proporciona un plásmido de transposón, que comprende un transposón o un minitransposón, y un MCS.

En ciertas realizaciones de la invención, el plásmido de la invención es un plásmido de transposón, es decir, comprende un transposón en el que está insertada la secuencia que codifica la proteína diana. Los plásmidos de transposón contienen casetes de transposón cuya casete llega a estar integrada en el genoma bacteriano. Por consiguiente, un ácido nucleico que codifica una proteína diana o un fragmento activo o un análogo de la misma, es insertado en la casete del transposón. Por tanto, una inserción de un transposón integra la casete en el genoma bacteriano. La secuencia codificante puede ser ligada operablemente a un promotor, o puede ser sin promotor. En este último caso la expresión de la proteína diana es inducida por un promotor en el sitio de inserción del transposón en el genoma bacteriano. Colonias de bacterias que tienen una inserción de transposón son exploradas para determinar los niveles de expresión que cumplan los requisitos de la invención.

En ciertas realizaciones, además del transposón, el plásmido de transposón comprende fuera de la repeticiones invertidas del transposón, un gen de transposón que cataliza la inserción del transposón en el genoma bacteriano sin ser transportado junto con el transposón, de modo que son generadas cepas bacterianas con inserciones adecuadas de transposón.

Los transposones a ser utilizados por la presente invención incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos, los Tn7, Tn9, Tn10 y Tn5. En una realización preferida, el plásmido de transposón es el pBR322 (ATCC) que posee un gen de resistencia a la ampicilina situado fuera de los elementos de inserción del Tn10 y los ácidos nucleicos que codifican una proteína diana y, opcionalmente, una proteína informadora está insertada entre los dos elementos de inserción del Tn10 (por ejemplo, dentro de la casete del transposón).

En una realización, después de la manipulación del plásmido según es apropiado y de la selección de aquellos clones que tienen la construcción deseada usando las propiedades de resistencia a la ampicilina codificadas por el plásmido, la selección de antibiótico es separada y se escogen las cepas que tienen una inserción cromosómica del transposón para llevar a cabo la selección según los métodos de la presente invención.

En una realización preferida, un plásmido de transposón para efectuar la selección de integrantes cromosómica mediada por transposón, comprende un gen de transposasa, para efectuar la escisión e integración del transposón; una secuencia codificante que corresponde a un gen de selección que ha sido sometido a deleción partiendo de la cepa bacteriana así como un sitio de unión ribosómica y terminador para el gen de tipo salvaje, pero que carece de promotor; y un sitio de clonación múltiple (MCS) que contiene sitios de restricción únicos dentro del plásmido, para la incorporación de un ácido nucleico que codifica la proteína diana y, opcionalmente, un gen informador.

Todavía en otra realización, el vehículo de expresión es un plásmido extracromosómico que es estable sin requerir selección de antibiótico. es decir, es auto-mantenido. Por ejemplo, en una realización de la invención, se mantiene el sistema de selección de plásmido, proporcionando una función de la que carece la bacteria y en base a la cual aquellas bacterias que poseen la función pueden ser seleccionadas, a expensas de aquellas que no lo son. En una realización, la bacteria de la invención es una cepa mutante auxótrofa y el plásmido de expresión proporciona la función enzimática biosintética mutante o ausente. La bacteria que contiene el plásmido de expresión puede ser seleccionada cultivando las células en un medio de crecimiento que carece del nutriente que solamente pueden metabolizar las células deseadas, es decir, aquellas con el plásmido de expresión.

En otras realizaciones de la invención, el vehículo de expresión es un vector \lambda, más específicamente un vector \lambda lisógeno. En una cierta realización específica, el hospedante bacteriano que comprende el vector \lambda comprende, además, un represor \lambda sensible a la temperatura que es funcional a 30ºC pero no a 37ºC. Por consiguiente, el hospedante bacteriano puede ser cultivado y manipulado a 30ºC sin expresión de la proteína diana. Cuando se lleva a cabo el método de selección TDS, las células se cultivan a 37ºC, a cuya temperatura el represor \lambda está inactivado y la expresión de la proteína diana y, opcionalmente, el gen informador, está activada.

La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína diana, puede ser regulada mediante una segunda secuencia de ácido nucleico por lo que la proteína es expresada en una bacteria transformada con la molécula de DNA recombinante. La expresión de la proteína diana puede ser regulada por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Un promotor/potenciador puede ser homólogo (por ejemplo, nativo) o heterólogo (por ejemplo, no nativo). Los promotores que pueden ser usados para regular la expresión de la proteína diana y, opcionalmente, del gen informador en bacterias, incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos, promotores procarióticos tales como el promotor de la \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3727-3731), o el promotor lac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25; Scientific American, 1980, 242:74-94). Otros promotores incluidos por la presente invención, incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos, lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, Lambda P_{L} y trc.

Una vez construido el plásmido que comprende la secuencia codificante para la proteína diana, es introducido en la bacteria para producir una célula diana, la expresión de la proteína diana puede ser verificada por cualquier método conocido en la técnica que incluye, pero no se limita, la actividad biológica, la actividad enzimática, el análisis de transferencia Northern y el análisis de transferencia Western (Véase Sambrook et al., 1989, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Nueva York, NY.).

Con objeto de que los métodos de la invención tengan éxito, es imperativo que el gen informador y el ácido nucleico que codifican la proteína diana, estén ligados estrechamente. Esto puede conseguirse mediante uno cualquiera de varios medios, incluyendo la expresión de ambas secuencias codificantes desde un plásmido o teniendo ambas secuencias codificantes integradas en el genoma bacteriano. En todas las realizaciones, la expresión del gen informador es constitutiva en las condiciones de la selección.

Cuando la célula diana de la invención es una célula bacteriana modificada que o bien (a) expresa la proteína diana desde un plásmido o un transposón extragenómico, o bien (b) posee una copia adicional de la secuencia codificante de la proteína diana integrada en el cromosoma bacteriano, la célula reclamo es entonces (a) una célula bacteriana isógena o, de otro modo, no sustancialmente diferente que lleva un plásmido "vacío", cuando el vehículo de expresión para la proteína diana es un plásmido o un transposón extragenómico; o (b) una célula bacteriana isógena o, de otro modo, no sustancialmente diferente, cuyo genoma carece de la copia adicional de la secuencia codificante para la proteína diana y carece de la expresión sustancial del gen informador, cuando el ácido nucleico que codifica la proteína diana ha sido integrado en el cromosoma.

5.6. Metodología en plantas

Los ensayos de selección TDS de la invención pueden emplearse también usando células vegetales. La invención proporciona células vegetales diana que han sido modificadas para sobreexpresar una proteína cuya inhibición reduce o, alternativamente, aumenta, la adaptación o a la viabilidad de la célula. La invención proporciona, además, células vegetales "reclamo" que han sido modificadas para subexpresar una proteína cuya inhibición reduce o aumenta la adaptación o viabilidad de la célula. Puede utilizarse una variedad de sistemas vegetales de expresión para llevar a cabo los métodos TDS de la presente invención. Pueden seleccionarse especies vegetales particulares entre cualquier especie de dicotiledóneas, monocotiledóneas, gimnospermas, vegetales inferiores vasculares o no vasculares, incluyendo cualquier cultivo de cereal u otro cultivo importante desde el punto de vista agrícola. Tales plantas incluyen, aun cuando sin limitarse a ellas, alfalfa, Arabidopsis, espárragos, cebada, repollo, zanahoria, apio, maíz, algodón, pepino, lino, lechuga, colza de semilla oleosa, peras, guisantes, petunias, álamo, patata, arroz, soja, remolacha azucarera, girasol, tabaco, tomate, trigo y trébol blanco.

La sobreexpresión de un gen diana en células vegetales por medios recombinantes puede conseguirse mediante uno de los métodos siguientes, que son bien conocidos de los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Plant Biotechnology, 1989, Kung and Arntzen compiladores, Butterworth Publishers, capítulos 1, 2, cuyos capítulos son incorporados en esta memoria en su totalidad). Los ejemplos de métodos de transformación que pueden ser usados eficazmente para generar una célula diana incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos, la transformación de limbos de hojas u otros tejidos vegetales con mediación de Agrobacterium, microinyección de DNA directamente en células vegetales, electroporación de DNA en protoplastos de células vegetales, fusión de liposomas o esferoplastos, bombardeo con microproyectiles, y la transfección de células o tejidos vegetales con virus vegetales apropiadamente obtenidos.

Los procedimientos operatorios de cultivos de tejidos vegetales que pueden ser usados para la puesta en práctica de la invención, son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Dixon, 1985, Plant Cell Culture: A Practical Approach, IRL Press). Los procedimientos de cultivo de tejidos que pueden ser usados eficazmente para la puesta en práctica de la invención, incluyen la producción y cultivo de protoplastos vegetales y suspensiones celulares, propagación de cultivos estériles de limbos de hojas u otros tejidos vegetales en medios que contienen cepas de agentes transformantes modificados tales como, por ejemplo, Agrobacterium o cepas de virus vegetales y la regeneración de plantas transformadas totales procedentes de protoplastos, suspensiones de células y tejidos de callo.

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Métodos de transformación de vegetales han sido descritos, adicionalmente, por Davey et al., Plant Mol. Biol. 13:273-285, y en el capítulo nueve de la publicación de Grierson and Covey (1988, Plant Molecular Biology, 2ª edición, Blackie ad Sons Ltd. Glagow, Escocia; publicada en los Estados Unidos por Chapman and Hall, Nueva York). Métodos generales y especializados de cultivos vegetales, incluyendo métodos para aislar mutantes procedentes de cultivos celulares, pueden encontrarse también en la publicación Handbook of Plant Cell Culture, Volumen 1. 1983, Macmillan Publishing Company, Nueva York, Evans, Sharp, Ammirato y Yamada, Compiladores, capítulos 1-6, 10, 14 y 15. Otras consideraciones para la realización con éxito de cultivos de células vegetales a gran escala, han sido descritos por Taticek et al., 1994, Curr. Opin. Biotechnok., 5:165-174; y Scragg, 1992, Curr. Opin. Biotechnol. 3:105-109.

Wullems et al., (1986, Handbook of Plant Cell Culture, Volumen 4, Macmillan Publishing Company, Nueva York, Evans, Sharp y Ammirate, Compiladores) proporcionan un protocolo detallado sobre la transformación de plantas por medio del plásmido Ti de Agrobacterium. La transformación mediante electroporación ha sido descrita por Bates, 1999, Methods Mol. Biol. 111:359-366. Para plantas monocotiledóneas que son especialmente resistentes a la absorción de DNA extraño, pueden usarse geminivirus para la expresión de genes recombinantes (véase Stanley, 1993, Curr. Opin. Genet. Devel. 3:91-96).

Métodos de identificación de mutantes de plantas distintos de los indicados en la publicación Handbook of Plant Cell Culture, referencia anterior, han sido descritos por Walden et al., 1994, Plant Mol. Biol., 26:1521-1528 y por Langridge, 1994, Bioessays 16:775-778.

Los métodos para obtener las construcciones de expresión y vectores de transformación, incluyen recombinación y manipulación genética estándar, in vitro. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas por Weissbach y Weissbach, 1988, en Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Capítulos 26-28.

Los elementos reguladores que pueden ser usados en construcciones de expresión en células vegetales que comprenden un gen diana y/o un gen informador, incluyen promotores que pueden ser o bien heterólogos o bien homólogos con respecto a la célula vegetal. El promotor puede ser un promotor vegetal o un promotor no vegetal, capaz de inducir niveles elevados de transcripción de una secuencia ligada en células vegetales y vegetales. Ejemplos no limitativos de promotores de plantas que pueden usarse eficazmente para la puesta en práctica de la invención, incluyen el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, rbcS, el promotor para la proteína de unión de las clorofilas a/b, AdhI, NOS y HMG2.

5.7. Genes informadores

El gen informador usado para marcar la célula dina de la invención puede seleccionarse entre cualquiera de los genes informadores conocidos en la técnica. En una realización, el gen informador puede ser un gen que codifica una proteína fluorescente, una proteína bioluminiscente, una proteína quimiluminiscente, una enzima (por ejemplo, la proteína lacZ bacteriana o la cloranfenicol-acetil transferasa (CAT)), un receptor, una proteína transportadora o canal iónico (tal como la proteína transportadora de la fibrosis cística), o una proteína que comprende un epítopo u otro resto de unión detectable inmunológicamente (por ejemplo, el antígeno CD4 de la superficie celular, myc, la glutatión-S-transferasa (GST), o la hexahistidina).

En una realización específica, el gen informador codifica una proteína transportadora o canal de información. La actividad del gen informador es función del transporte de iones y/o moléculas a través de la membrana celular. Cuando la actividad del gen informador da por resultado un flujo iónico aumentado, la actividad puede ser medida electrofisiológicamente (por ejemplo, para los iones Na^{+}, K^{+} o Cl^{-} ) o mediante un colorante que se une al ion (por ejemplo, para los iones Ca^{++}).

En una realización preferida se usa el lacZ como gen informador. La actividad de la \beta-galactosidasa puede medirse mediante uno de varios métodos. Si las células del cultivo conjunto son células de levadura o células bacterianas, los ensayos con filtros de \beta-galactosidasa pueden ser llevados a cabo como han sido modificados partiendo del protocolo de Breeden y colaboradores (Breeden y Nasmyth, 1985, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 50:643-650). Los cultivos conjuntos de levadura o bacterianos son sometidos a hibridación puntual sobre papel Whatman y los puntos que son positivos para la actividad de \beta-galactosidasa se vuelven azules. Alternativamente, la levadura o la bacteria pueden cultivarse en medios indicadores que comprenden el sustrato X-gal de la galactosidasa. Los análisis cuantitativos de \beta-galactosidasa sobre levadura pueden ser llevados a cabo según ha sido descrito anteriormente por Coney y Roeder (Coney y Roeder, 1988, Mol. Cell. Biol. 8:4009-4017). Los ensayos quimiluminiscentes de \beta-galactosidasa pueden ser llevados a cabo usando el sistema de ensayo Galacto-Light y galacto-Light más informador quimiluminiscente, para la detección de \beta-galactosidasa (Tropix, Inc.) según los protocolos del fabricante. Los ensayos fluorescentes de la \beta-galactosidasa pueden llevarse a cabo usando el kit FluoReporter lacZ/Galactosidase Quantitation (Molecular Probes) según los protocolos del fabricante. Para ensayos de cultivos conjuntos usando células cultivadas o C. elegans, la actividad de \beta-galactosidasa puede detectarse determinado la actividad enzimática in situ, añadiendo sustrato al medio, según ha sido modificado desde el protocolo de Breeden y colaboradores (Breeden y Nasmyth, 1985, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 50:643-650).

En la realización más preferida, el gen informador codifica una molécula fluorescente, por ejemplo luciferasa de luciérnaga. En un modo preferido de la realización, la proteína codificada por el gen informador es la GFP procedente de Aequorea victoria o uno de sus mutantes. La proteína GFP puede ser codificada por su secuencia codificante que se presenta de modo natural o mediante una secuencia codificante que ha sido modificada para uso óptimo de codones humanos (patente de EE.UU. No. 5.874.304) cuando se selecciona en una línea celular de mamífero. Pueden introducirse mutaciones en la secuencia codificante para producir mutantes de GFP con longitud de onda o intensidad de fluorescencia,o ambas, alteradas. Tales mutaciones están en gran medida en la vecindad de los restos 65-67, que forman el cromóforo de la proteína Ejemplos de mutaciones de GFP útiles para usar como genes informadores según los métodos de la presente invención, pueden encontrarse en las patentes de EE.UU. Nos. 5.777.079 y 5.804.387 y en la Publicación Internacional WO97/11094. En otro modo preferido de la realización, el mutante de GFP es una GFP azul. Ejemplos de GFPs azules han sido descritos por Heim y Tsien (1996, Curr. Biol. 6:178-82). Todavía en otro modo preferido de la realización, la proteína fluorescente es un emisor amarillo o rojo-anaranjado recientemente descubierto en corales de arrecifes (Matz et al., 1999, Nature Biotechnol. 17:969-973).

En una realización, el informador de la invención puede ser expresado como una proteína de fusión con la proteína diana.

El promotor elegido para regular la expresión del gen informador depende del tipo de célula u organismo en el que es expresado el informador. Promotores adecuados para cada organismo están descritos en las Secciones 5.2.2., 5.3.4., y 5.4.4., anteriores.

5.8. Uso de genes diana que contribuyen negativamente a la adaptación de las células

Según se ha descrito anteriormente, en una realización de la invención, la proteína diana contribuye positivamente a la adaptación de la célula diana. Sin embargo, en una realización alternativa, que se describe en esta sección, la proteína diana contribuye negativamente a la adaptación de la célula diana (por ejemplo, proporciona letalidad de la sobreexpresión). Células de varios fondos genéticos (por ejemplo, bibliotecas de deleción) pueden ser supervisadas con objeto de identificar la cepa celular en la que la sobreexpresión del gen diana deseado contribuye negativamente a la adaptación de la célula, o la cepa celular óptima (más sensible) para lo mismo.

En una realización tal, la invención proporciona un método para seleccionar una molécula que inhibe la actividad o la expresión de una proteína codificada por un gen diana, que comprende cultivar conjuntamente una primera célula o un grupo de primeras células y una segunda célula o un grupo de segundas células en presencia de una molécula de ensayo, en el que la primera célula tiene mayor expresión o actividad de un gen diana o una proteína codificada por el gen diana, con relación a la segunda célula, en el que dicha proteína codificada por el gen diana contribuye negativamente a la adaptación de la primera célula, en el que la primera célula comprende y expresa, además, un gen informador que sustancialmente no es expresado en dicha segunda célula, en el que la primera célula y la segunda célula son de la misma especie y tipo de célula, y en el que la relación del número de primeras células a segunda células en el cultivo conjunto es, inicialmente, mayor que uno; y medir la actividad o cantidad de proteína codificada por el gen informador, en el que la ausencia de una disminución de actividad o de cantidad de proteína codificada por el gen informador con relación a la del cultivo conjunto en ausencia de la molécula de ensayo, indica que la molécula de ensayo inhibe la actividad o la expresión de la proteína codificada por el gen diana. Tal ensayo de selección de cultivo conjunto puede identificar inhibidores contra genes preseleccionados, preferiblemente genes humanos. El ensayo de selección identifica inhibidores que rescatan defectos de adaptación causados por la sobreexpresión de un gen diana. Si la sobreexpresión de un gen diana ocasiona un defecto de crecimiento en la célula diana, entonces un inhibidor que elija como diana la proteína diana debe salvar el defecto de crecimiento. Una compañía denominada Iconix Pharmaceuticals, Inc. selecciona actualmente inhibidores de dianas humanas basado en el rescate de defectos de crecimiento causados por la sobre expresión de un gen diana. Véase,

http://www.iconixpharm.com/scitech.library.html.

La presente invención mejora la tecnología usada por Iconix Pharmaceuticals, Inc. de dos modos importantes:

1) Experimentos de crecimiento competitivos con grandes colecciones de cepas de deleción identificadas por código de barra, podrían usarse para identificar fondo o fondos genéticos con sensibilidad aumentada a para el fenotipo letal de sobreexpresión de diversos genes humanos.

2) El ensayo de cultivo conjunto revela un modo muchos más sensible y robusto para identificar diferencias sutiles en las velocidades de crecimiento causadas por inhibidores que recatan el fenotipo letal de sobreexpresión en la levadura.

Esta realización está ilustrada, a título de ejemplo, en la Sección 11, más delante.

La realización de la invención en la que el gen diana contribuye negativamente a la adaptación de la célula que sobreexpresa relativamente el gen diana, puede ser también multiplexada, mediante métodos tales como los descritos en esta memoria para la realización en la que el gen diana contribuye positivamente a la adaptación de la célula (véase, por ejemplo, la Sección 5.9.1. "Ensayos de selecciones multiplexados").

5.9. Variaciones en los métodos TDS

La presente invención proporciona variaciones en los métodos TDS descritos en esta memoria. En una realización, las variaciones proporcionan selección elegida como diana, a gran escala, mediante "multiplexión", es decir, selección concurrente de inhibidores se genes diana múltiples. En otra realización, las variaciones proporcionan selección diferencial elegida como diana, de inhibidores de un gen diana pero no de un gen diana funcionalmente similar.

5.9.1. Metodos de selección multiplexados

En ciertas realizaciones preferidas de la presente invención, el método de selección TDS es multiplexado para llevar a cabo una selección más eficiente y efectiva desde el punto de vista del coste. La multiplexión implica el uso de más de una cepa diana, cada una de las cuales sobreexpresa un gen diana diferente. La célula reclamo correspondiente es una célula de tipo salvaje. En un ensayo de selección multiplexado ha de tenerse cuidado para asegurar que la actividad combinada del gen informador procedente de todas las células diana no genera una relación alta de ruido:
señal.

Las células diana pueden expresar el mismo gen informador o genes informadores diferentes. Si las células expresan el mismo gen informador, se usa una ronda secundaria de selección para identificar en un cultivo conjunto que tiene niveles significativamente aumentados de actividad de gen informador, cual de las células diana es el origen de dicha actividad aumentada del gen informador, es decir, determinar cual es el gen diana del fármaco con el que el tratamiento del cultivo conjunto da por resultado una actividad aumentada del gen informador. La selección secundaria puede llevarse a cabo usando diversos métodos. En un ejemplo no limitativo, se usan ensayos de selección TDS no multiplexados para realizar la selección secundaria, en la que cada cultivo conjunto comprende la cepa reclamo y solamente uno o un subconjunto de las células diana. Alternativamente, la selección secundaria puede ser llevada a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), más preferiblemente PCR cuantitativa, en la que se usan pares de cebadores de oligonucleótidos que son específicos para cada célula diana recombinante. En un modo preferido de la realización, se usa una parte alícuota del cultivo conjunto como molde en una serie de reacciones de PCR, conteniendo cada reacción un par de cebadores específicos para un plásmido que alberga uno de los genes diana y un gen diana alojado por ese plásmido. Preferiblemente, los cebadores están diseñados de modo que cada reacción PCR que ensaya la presencia de un gen diana del ensayo de selección multiplexado, produzca un tamaño distinto de amplicón, por lo que la presencia o ausencia de un producto de PCR de un tamaño dado, o la relación de productos de la PCR obtenidos, es indicativa de cual es el gen diana amplificado. Todavía en otro ejemplo no limitativo, la selección secundaria puede ser llevada a cabo haciendo crecer el cultivo conjunto, que consiste principalmente en aquellas células diana que poseen actividad aumentada del gen informador, sobre medios de cultivo selectivos si las diferentes células diana tienen requisitos auxótrofos diferentes, Por ejemplo, cada una de las células diana de levadura, por ejemplo, es deficiente para un camino nutriente (biosíntesis) diferente, y el ensayo de selección secundario implica depositar en placa una parte alícuota del cultivo conjunto sobre una variedad de medios, cada uno de los cuales carece de uno de los nutrientes necesario para el crecimiento de una de las células diana. La identificación de la célula diana que es el origen de la actividad aumentada del gen informador, puede hacerse entonces basándose en cual de las placas de medios tenía pocas o no tenía colonias de levadura.

Las células diana en un ensayo multiplexado que expresan diferentes genes diana pueden, opcionalmente cada una, expresar un gen informador diferente. Alternativamente, las células diana son divididas en grupos, expresando cada grupo un gen informador diferente para simplificar los procesos secundarios de selección. Todavía en otra realización, las células diana expresan combinaciones no idénticas de genes informadores, generando un código de genes informadores para la identificación instantánea de la célula diana con actividad aumentada de gen informador. En un modo preferido de la realización, cada una de las células diana expresa una combinación única de una o más de las proteínas GFP, GFP azul, proteína fluorescente amarilla y proteína fluorescente roja.

5.9.2. Ensayos de selección específicos de especies e isoformas

En ciertas realizaciones preferidas de la presente invención, se utiliza el método de ensayo de selección TDS para identificar una molécula que inhibe una proteína diana expresada por una célula diana pero no una proteína de funcionalidad similar expresada en la célula reclamo correspondiente. En una realización tal, la proteína diana contribuye positivamente a la adaptación de la célula diana.

Tal como se usa en esta memoria, un gen o una proteína que es "funcionalmente similar" a un gen diana, indica un gen o una proteína con la capacidad de salvar la totalidad o una pérdida parcial de función del gen diana o la proteína, respectivamente.

En una realización específica, un ensayo de selección TDS para identificar una molécula que inhibe de modo diferente una proteína diana pero no otra proteína de funcionalidad similar, comprende cultivar conjuntamente una célula diana y una célula reclamo en cuya realización la célula diana posee expresión o actividad elevada con respecto a la célula reclamo de (a) un gen diana que contribuye positivamente a la adaptación de la célula, o (b) la proteína codificada por el gen diana, y la célula reclamo tienen expresión o actividad elevada de un gen funcionalmente similar, o de la proteína codificada por dicho gen de funcionalidad similar con respecto a la célula diana. Como con el ensayo de selección TDS básico, este ensayo de selección modificado implica entonces, exponer el cultivo conjunto a una molécula de ensayo o a un panel de moléculas de ensayo, y detectar luego si el tratamiento con la molécula de ensayo produce un aumento importante de la actividad o la cantidad de proteína codificada por el gen informador expresado por la célula diana; si es así, la molécula de ensayo está indicada para ser un inhibidor de la proteína diana pero no la proteína de funcionalidad similar.

En una realización, el gen de funcionalidad similar puede ser un gen parcial o totalmente redundante de la misma especie que el gen diana. En otra realización, el gen de funcionalidad similar puede codificar una proteína con actividades similares a las de la proteína diana, tal como una isozima que puede ser expresada en el mismo o diferente tipo de célula o tejido que la proteína diana.

Tal variante del método de selección TDS puede llevarse a cabo cuando se desea inhibir un gen diana que causa una dolencia pero no un gen afín, por ejemplo, una isozima expresada en un tejido diferente, cuya inhibición da por resultado efectos secundarios indeseados. Un ejemplo de un método de selección tal implicaría la expresión de COX2 en una célula diana y de COX1 en una célula reclamo. COX1 es una ciclooxigenasa expresada de modo ubiquitoso cuya inhibición en el tracto intestinal, como resultado de la administración de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDS), produce nauseas, al tiempo que las propiedades analgésicas antiinflamatorias de los NSAIDS están mediadas por la inhibición de la actividad de COX2. (Véase, por ejemplo, Masferrer et al., 1996, Gastroenterol. Clin. North Am., 25:363-372). Por tanto, la identificación de un inhibidor específico para la COX2, según los métodos de la presente invención, puede conducir al desarrollo de analgésicos que eligen como diana COX2 pero que no producen los efectos secundarios de la inhibición de COX1.

En otra realización, el gen de funcionalidad similar puede ser un homólogo del gen diana procedente de otra especie. Esta realización puede ser utilizada para seleccionar molécula inhibidoras específicas de las especies. Por ejemplo, si la finalidad de la selección es identificar un agente antifúngico para el tratamiento de mamíferos tales como seres humanos, puede usarse un gen diana que tenga un homólogo de mamífero, para generar un gen diana, en tanto que una célula reclamo exprese el homólogo de mamífero del gen en niveles comprables o mayores que los niveles de la expresión del gen diana en la célula diana. Si la finalidad del método de selección es identificar un insecticida que sea seguro para los seres humanos, el gen diana puede ser un gen de insecto con un homólogo humano, en tanto que la célula diana sobreexprese el gen de insecto y la célula reclamo sobreexprese el homólogo humano en niveles comparables o superiores.

Todavía en otra realización, el gen de funcionalidad similar puede codificar una proteína codificada por DNA cortado y empalmado, alternativo, codificado por el gen diana o un gen desde el que haya sido derivado el gen diana, por ejemplo, si el gen diana ha sido derivado de un cDNA, el gen desde el que ha sido derivado sería la secuencia genómica correspondiente. Todavía en otra realización, el gen de funcionalidad similar puede codificar una proteína diana mutante que tiene sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, de aquellos aminoácidos que se desea sean elegidos como diana, o una proteína diana mutante que tenga una deleción en un dominio particular que se desea que sea elegida como diana por el método de selección TDS.

5.10. Organismos microbianos para la selección TDS

Los compuestos antibióticos identificados mediante los métodos de la invención, es decir, aquellos que inhiben un gen de un microorganismo que contribuye positivamente a la adaptación del microorganismo, pueden ser utilizados para tratar enfermedades infecciosas causadas por tales bacterias en animales, que incluyen seres humanos, animales de compañía (por ejemplo, perros y gatos), animales de ganadería (por ejemplo, ovejas, ganado vacuno, cabras, cerdos y caballos), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas y conejos) y animales en cautividad o en estado salvaje.

En ciertas realizaciones, los métodos de selección TDS de la invención están dirigidos hacia el descubrimiento de fármacos para el tratamiento de enfermedades ocasionadas por bacterias y otros microorganismos, mediante la identificación de moléculas que inhiben un gen diana de la bacteria o microorganismo que causa las enfermedades. Tales microorganismos incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos, cocos Gram positivos, tales como Staphylococcus (por ejemplo, S. aureus), Streptococcus (por ejemplo, S. pneumoniae, S. pyrogens, S. faecalis, S. viridans); bacilos Gram positivos, tales como Bacillus (por ejemplo, B. anthracis), Corynebacterium (por ejemplo, C. diphtheriae), Listeria (por ejemplo, L. monocytogenes); cocos Gram negativos, tales como Neisseria (por ejemplo, N. gonorrhoeae, N. Meningitidis); bacilos Gram negativos, tales como Haemophilus (por ejemplo, H. influenzae), Pasteurella (por ejemplo, P. multocida), Proteus (por ejemplo, P. mirabilis), Salmonella (por ejemplo, S. typhi murium), especies de Shigella, Escherichia (por ejemplo, E. coli), Klebsiella (por ejemplo, K. pneumoniae), Serratia (por ejemplo, S. marcenscens), Yersinia (por ejemplo, Y. pestis), especies de Providencia, especies de Enterobacter, Bacteroides (por ejemplo, fragilis), especies de Acinetobacter, Campylobacter (por ejemplo, C. jejuni), Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Bordetella (por ejemplo, B. pertussis), especies de Brucella, Fracisella (por ejemplo, F. tularensis), Clostridia (por ejemplo, C. perfriugens), Helicobacter (por ejemplo, H. pylori), Vibrio (por ejemplo, C. cholerae), Mycoplasma (por ejemplo, M. pneumoniae), Legionella (por ejemplo, L. pneumophila), Spirochetes (por ejemplo, Treponema, Leptospira y Borrelia), Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), Nocardia (por ejemplo, N. asteroides), Chlamydia (por ejemplo, C. trachomatis), y especies de Rickettsia.

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5.11. Kits y sistemas de ensayo

La invención proporciona también kits para llevar a cabo los métodos de selección de la invención Tales kits comprenden, en uno o más recipientes, una población purificada de una célula diana y una población purificada de una célula reclamo de la misma especie y el mismo tipo de célula, en donde la célula diana tiene expresión o actividad elevada del gen diana o de la proteína codificada por el gen de diana con relación a la célula reclamo y comprende y expresa, además, un gen informador que codifica una molécula biolumniniscente, quimiluminiscente o fluorescente, que sustancialmente no es expresada en la célula reclamo.

En una realización, la célula diana y las células reclamo son células bacterianas, células de levadura, células de insecto cultivadas, células de mamífero cultivadas o células vegetales cultivadas. En otra realización, la molécula fluorescente es la proteína GFP o uno de sus mutantes que tiene una longitud de onda de fluorescencia alterada, una fluorescencia aumentada, o ambas cosas.

En otra realización, el kit comprende, además de una primera célula diana y de la célula reclamo, por lo menos una segunda célula diana que tiene expresión o actividad elevada de un segundo gen diana o la proteína codificada por el segundo gen diana con relación a la célula reclamo y la primera célula diana, y comprende y expresa, además, un gen informador que codifica una molécula bioluminiscente, quimiluminiscente o fluorescente que no es expresada sustancialmente en la célula reclamo o la primera célula diana.

En otra realización, el kit comprende, además, una molécula que se sabe que inhibe el gen diana o la proteína codificada por el gen diana, que sirve como molécula testigo durante el proceso de selección.

Opcionalmente, están incluidas instrucciones para usar las células suministradas para llevar a cabo los métodos de selección de la presente invención.

También se proporcionan sistemas de ensayo, que comprenden los cultivos conjuntos usados en los métodos de selección TDS.

5.12. Aplicaciones farmacéuticas

Las moléculas identificadas mediante los métodos de la presente invención como poseedoras de actividad inhibidora contra un gen diana específico, son compuestos principales como candidatos para el desarrollo de fármacos. Estos compuestos principales pueden ser ensayados para determinar su eficacia hacia el estado específico al que está dirigido, sus efectos secundarios, etc. Estos compuestos pueden ser modificados químicamente, por ejemplo derivatizados, para mejorar su actividad y su especificidad.

En ciertas realizaciones de la presente invención, el compuesto principal tiene como objetivo un trastorno o una proliferación celular aumentada, que incluyen, aun cuando sin limitarse a ellos, cambios neoplásicos, malignidad, cambios disproliferativos (tales como metaplasias y displasias), u otros trastornos hiperproliferativos. El tratamiento puede ser preventivo o terapéutico.

De modo semejante, pueden ensayarse compuestos antifúngicos potenciales en sistemas heterólogos de células huésped (por ejemplo células humanas) para verificar que no afectan en un grado importante a la proliferación u otras funciones celulares. Por ejemplo, pueden usarse compuestos anti-fúngicos potenciales en un sistema Genome Reporter Matrix de mamífero, para asegurar que los compuestos no alteran adversamente la transcripción génica (por ejemplo, de un modo indeseable). De modo semejante, pueden ensayarse compuestos antiproliferativos potenciales para asegurarse de que no afectan adversamente a funciones distintas de la proliferación. También pueden ser ensayados compuestos herbicidas e insecticidas potenciales para determinar efectos secundarios potenciales en sistemas celulares de mamíferos, de preferencia seres humanos, tales como el sistema Genome Reporter Matrix, para detectar efectos secundarios sobre funciones celulares. Como es natural, ciertos cambios en la transcripción génica pueden ser inevitables y muchos de estos no son perjudiciales para el paciente u organismo hospedante. Como se ha citado anteriormente, una vez identificados los compuestos principales, estos compuestos pueden ser refinados posteriormente mediante el diseño racional de fármacos y otras técnicas farmacéuticas estándar. En último lugar, los compuestos pueden ser usados como eficaces antibióticos, agentes anti-fúngicos, fármacos antiproliferativos, herbicidas y plaguicidas

Los compuestos de esta invención que poseen aplicaciones en seres humanos y en animales (es decir, aplicaciones terapéuticas humanas y veterinarias) pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas y administrados in vivo en una dosis eficaz para tratar una enfermedad o una afección particular. La determinación de la formulación farmacéutica preferida y del régimen de dosis terapéuticamente eficaz para una aplicación dada, se encuentra dentro del conocimiento de los expertos en la técnica, al tomar en consideración, por ejemplo, el estado y el peso del paciente, la extensión del tratamiento deseado y la tolerancia del paciente al tratamiento. La administración de los compuestos de esta invención, (con inclusión de formas aisladas y purificadas, sus sales o sus derivados farmacéuticamente aceptables), a un ser humano o a un animal, puede efectuarse usando cualquier modo de administración aceptado convencionalmente.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden moléculas identificadas mediante los métodos de la presente invención, pueden ser administradas a un sujeto tal como un vegetal, un ser humano o un animal, con objeto de tratar enfermedades bacterianas u ocasionadas por hongos, o trastornos proliferativos. Tales animales a ser tratados por las composiciones farmacéuticas de la presente invención, incluyen mamíferos no humanos, con inclusión, aun sin limitarse a ellos. monos y otros primates, perros, gatos, hurones, cobayas, ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos, y pájaros.

Los agentes antifúngicos identificados mediante los métodos de la presente invención, pueden ser usados, además, para evitar la contaminación de células de mamíferos y de no mamíferos (por ejemplo, células de insecto) que crecen en cultivos de tejidos, por hongos, por ejemplo, levadura, por incubación de tales células en un medio de cultivo celular que contiene una cantidad eficaz de un agente.

Realizaciones alternativas para llevar a cabo los métodos de selección de esta invención, serán evidentes para los expertos en la técnica y están destinados a ser comprendidos dentro de las reivindicaciones que se acompañan. En particular, las reivindicaciones que se acompañan están destinadas a incluir tipos alternativos de células u organismos como modelos de selección, genes informadores, métodos de sobreexpresión y subexpresión de genes diana y genes informadores, clases de moléculas a ser identificadas mediante los métodos de selección elegidos como diana, variaciones en los métodos de selección, etc.

Los ejemplos experimentales que siguen se ofrecen a título de ilustración y en modo alguno, de limitación

6. Identificación de inhibidores para una diana que es esencial para el crecimiento normal en Saccaromyces cerevisiae

Este ejemplo describe una serie de experimentos que muestran la posibilidad de realización de cultivos conjuntos para seleccionar fármacos en levadura usando el método de selección TDS y erg11l como un gen diana.

6.1. Determinación de la relación de señal a ruido del ensayo TDS en levadura

La célula reclamo era la ABY11 (MATa, ura-3-1\Deltaleu2-1\Delta). La célula diana era la ABY11 que albergaba un plásmido que expresa la proteína GFP procedente del promotor DDR2 de levadura (pDW415). Células de levadura recién cultivadas fueron resuspendidas en medio YM más casaminoácidos al 2% (YM-Cas). La densidad del cultivo se determinó por lectura de la absorbancia del cultivo a 600 nm en un espectrofotómetro Shimadzu BioSpec 1601. Las densidades celulares fueron calculadas usando el factor de conversión siguiente: 1 unidad de D.O.600 = 1,5 x 10^{7} células por ml.

Las células fueron distribuidas en pocillos de una placa de 96 pocillos en un número constante total de 5 x 10^{7} células por ml en un volumen total de 225 \mul en medio YM más casaminoácidos al 2%. La composición de las mezclas de células variaba desde el 100% de células diana al 100% de célula reclamo. La cantidad de fluorescencia emitida desde los cultivos fue cuantificada en un Molecular Dynamics Vistra FluorImager. La formación de imagen de la placa tuvo lugar inmediatamente después de preparar las mezclas para evitar el crecimiento celular.

La fluorescencia emitida desde las mezclas de células no era lineal con respecto al factor de dilución (Fig. 1). En diluciones de reclamo:diana mayores que 10 aproximadamente, la fluorescencia detectable de las mezclas de células era próxima al ruido de fondo. Cuando las células diana estaban presentes en más del 10% de la población de células, la fluorescencia obtenida de las mezclas aumentaba significativamente. Este resultado sugirió que una relación de reclamo:diana superior o igual a 10, daría lugar a un ensayo de cultivo conjunto con éxito. En otras palabras, si fuera ensayado un candidato a fármaco que llevara a que la abundancia relativa de células diana en la población aumentara en más de 10%, entonces resultaría una señal fluorescente grande.

6.2. Determinación de la sensibilidad del ensayo TDS en levadura

La sensibilidad del ensayo TDS viene determinada por la diferencia de las velocidades de crecimiento entre las células diana y las células reclamo, y el número de duplicaciones de población que la mezcla puede atravesar antes de alcanzar la saturación (\sim 3 x 10^{7} células/ml para la levadura). El número de duplicaciones de la población se determina mediante el volumen de cultivo y el número de células de partida. Por ejemplo, un cultivo de 200 \mul inoculado con 1025 células (1000 reclamo y 25 diana) alcanza la saturación después de \sim13 duplicaciones de la población. La Tabla 2 ilustra como afecta la diferencia en las velocidades de crecimiento entre las células diana y las células reclamo a los resultados del ensayo TDS. Los cálculos están basados en un cultivo de 200 \mul que había sido inoculado con 1025 células que se dejaron crecer hasta saturación (3 x 10^{7} células/ml). Estos números sugieren que se requiere una diferencia de 50% en la velocidad de crecimiento entre la célula diana y la célula reclamo para generar una señal detectable en el ensayo TDS. La sensibilidad del ensayo puede ser mejorada incrementando el número de duplicaciones de la población. Esto puede conseguirse aumentando el volumen de cultivo o diluyendo los cultivos por adición de medio que contiene fármaco de nueva aportación.

100

Tabla 2: Sensibilidad del ensayo TDS. Los cálculos están basados en un experimento teórico en el que diferentes cultivos de 200 \mul fueron inoculados con 1025 células (1000 reclamo y 25 diana) que se dejaron crecer hasta saturación (3 x 10^{7} células/ml). Los tiempos de duplicación de la célula diana se mantuvieron constantes en 100 minutos mientras que los tiempos de duplicación de la célula reclamo fueron variados desde 100 a 1000 minutos. Las relaciones diana:reclamo "inicial" y "final" se indican para cada uno de los diferentes experimentos de cultivo conjunto. La "Señal a Ruido" predicha está basada en los datos procedentes del experimento de mezcla de la Fig. 1. Esto demuestra que una diferencia de 50% ó más en las velocidades de crecimiento, genera una señal fluorescente detectable.

6.3. Estudio piloto con clotrimazol

Para determinar las condiciones óptimas del ensayo, se ensayaron diversas relaciones diana:reclamo en presencia de diferentes concentraciones de clotrimazol (Fig. 2). El clotrimazol es un compuesto antifúngico que inhibe el producto génico ERG11; lanosterol 14\alpha-desmetilasa, una enzima biosintética esteroleica (Georgopapadakou y Walsh, 1996, Antimicrob. Agents Chemother. 40:279-291). La célula diana ABY676 alberga dos plásmidos, el pAB98 y el pAB99, que expresan GFP y ERG11 en altos niveles, respectivamente. La célula reclamo ABY674 alberga dos vectores testigo, el YEplac 195 y el YEplac 112.

Las células diana y las células reclamo fueron mezcladas en las relaciones 1:10, 1:100 y 1:1000, en presencia de concentraciones diversas de clotrimazol. Además, el número total de células se varió mediante dilución seriada y esto está indicado en el panel de la parte superior de la Fig. 2A. Las células se mezclaron en un volumen de 225 \mul de medio YM-Cas en cada uno de los pocillos. Después de incubación a 30ºC durante 88 horas, se determinó la fluorescencia procedente de cada pocillo. Los valores de la fluorescencia fueron corregidos para tener en cuenta la fluorescencia de fondo del medio y están representados como el incremento en el número de veces sobre la señal de la fluorescencia procedente del tratamiento correspondiente sin fármaco.

La cantidad de crecimiento de las células se determinó midiendo la densidad óptica en 600 nm en un espectrofotómetro para la lectura de placas Molecular Devices Spectra Max 250 (Fig. 2B).Se presenta también una imagen fluorescente de la placa, que sirvió como origen de la cuantificación de las señales fluorescentes, (Fig. 2C).

Este experimento reveló que los cultivos conjuntos producían una relación grande de señal a ruido a lo largo de un amplio intervalo de concentraciones de clotrimazol. Las señales fluorescentes eran también significativamente mayores que las del tratamiento sin fármaco en las tres relaciones de reclamo:diana y en todas las variaciones del número de células/pocillo. Más específicamente, las relaciones de diana:reclamo 1:10 y 1;100 produjeron señales significantes desde 0,2-5,6 \mug/ml en la máxima densidad de células por pocillo. Las diluciones en serie de las células en estas relaciones produjeron señales fluorescentes significantes a 0,2-2,8 \mug/ml de clotrimazol. Los valores de la densidad óptica, D.O._{600} para los pocillos que no tenían fluorescencia aumentada, indicaban que bajo estas condiciones, el clotrimazol inhibía el crecimiento tanto de las células diana como de las células reclamo. Las señales fluorescentes procedentes de la relación de diana: reclamo 1:1000 produjeron señales fluorescentes importantes a 0,2-5,6 \mug/ml de clotrimazol en cada una de las densidades celulares. Estos resultados procedentes de este estudio a escala de planta piloto con clotrimazol demuestran que este método es flexible, robusto y que podía tener ventajas importantes sobre los métodos tradicionales de selección de fármacos basados en células.

6.4. Determinación de la especificidad del ensayo TDS en levadura

Para determinar la especificidad del ensayo TDS, se exploró una colección de compuestos químicos constituida por 560 compuestos usando las mismas cepas descritas en la Fig. 2. La colección MicroSource es una colección de 560 fármacos genéricos. Cuatro compuestos de azol que son inhibidores conocidos del Erg11p, el miconazol, el sulconazol, el ketoconazol y el clotrimazol, están representados en la colección. Las condiciones escogidas para el cultivo conjunto fueron 25 células diana y 25.000 células reclamo (relación diana:reclamo 1:1000) en un volumen de 225 \mul. Estas condiciones produjeron la máxima relación de señal a ruido a través del más amplio intervalo de fármaco de la Fig. 2.

Cultivos nocturnos de las células diana y reclamo se hicieron crecer en medio YM más casaminoácidos al 2%, para mantener la selección de ambos plásmidos episomales. Se preparó un lote grande de medio de nueva aportación (YM-Cas) que contenía ambas células, diana y reclamo. Este cultivó se diluyó a 1 x 10^{5} células/ml y se distribuyó en las placas de 96 pocillos. Después se añadieron a los cultivos fármacos procedentes de la colección Microsource a dos concentraciones: 5 \mug/ml más DMSO al 1%; y 0,5 \mug (ml más DMSO al 0,1%. Las placas fueron incubadas a 30ºC. Las medidas de la fluorescencia y de la D.O._{600} fueron realizadas dos veces al día durante diez días.

Los únicos cuatro fármacos que produjeron una señal fluorescente procedente de los cultivos conjuntos, que era significativamente mayor que la de los tratamientos sin fármaco, fueron los cuatro azoles conocidos inhibidores de Erg11p (Fig. 3). Los cultivos conjuntos que fueron expuestos a clotrimazol en ambas concentraciones dieron por resultado una señal fluorescente importante. La concentración de miconazol y sulconazol de 5 \mug/ml dio por resultado una inhibición del crecimiento demasiado severa para producir señales positivas, mientras que la concentración inferior (0,5 \mug/ml) de ambos fármacos produjo señales positivas significantes. Por el contrario, la concentración superior de ketoconazol produjo una señal significante mientras que la concentración inferior ni inhibió el crecimiento ni produjo una señal positiva.

Cinco compuestos de la colección inhibieron fuertemente el crecimiento en ambas concentraciones. Estos compuestos eran: cloruro de cetilpiridinio, diclonina-HCl, efedrina-HCl, borato de fenilmercurio y timerosol. Dos compuestos de la colección, calceína y cloruro de acriflaviniol, no pudieron ser comprobados dado que estos compuestos eran significativamente fluorescentes.

Este experimento demuestra dos aspectos importantes de este método de selección de fármacos. Primero, no se detectaron falsos positivos en el ensayo. De 560 compuestos, cada uno de los cuales posee actividad biológica en algunas especies, las únicas cuatro señales positivas fueron las procedentes de fármacos que se sabe inhiben el Erg11p. La segunda característica de este ensayo es la facilidad con la que el ensayo pudo ser adaptado para cualquier diana de interés. El único requisito específico es que el gen diana, cuando sea expresado a un nivel alto, comunique resistencia al inhibidor correspondiente.

Una limitación del ensayo es su sensibilidad a la concentración de los fármacos candidatos. Por ejemplo, tres de los cuatro azoles solamente produjeron señales positivas en únicamente una de las dos concentraciones ensayadas. Esta limitación pudo ser obviada de una de dos formas. La colección de compuestos podía ser explorada en múltiples concentraciones. La estrategia de este enfoque es encontrar al menos una concentración en la que haya una diferencia importante entre las velocidades de crecimiento de las células diana y reclamo. El segundo enfoque , y más preferido, es normalizar la colección de compuestos basándose en los valores de la concentración mínima inhibitoria (MIC) de los compuestos, en la levadura, antes de realizar la selección. En este caso, los compuestos que no inhiben cualesquiera funciones celulares esenciales podrían ser eliminados de la selección. La colección normalizada que resulta podría, entonces, ser explorada en un número mínimo de concentraciones.

7. Aumento de la sensibilidad del ensayo TDS usando una célula reclamo sensibilizada

La sensibilidad del ensayo TDS viene determinada por la diferencia entre las velocidades de crecimiento de las cepas diana y reclamo. Un modo de aumentar la sensibilidad del ensayo consiste en usar una célula reclamo que tenga sensibilidad aumentada con respecto a una diana previamente seleccionada. Esto puede conseguirse reduciendo la dosis del gen diana en la célula reclamo desde dos copias a una. Gaiever et al., han demostrado que varios heterozigotos diferentes poseen sensibilidad aumentada a los fármacos correspondientes (Gaiever, G Nat. Genet. 21:278-283). Por ejemplo, se ha puesto de manifiesto que el heterozigoto erg11/ERG11, tiene una sensibilidad aumentada al fluconazol. Por tanto, el heterozigoto erg11/ERG11 puede ser usado en un reclamo en el ensayo TDS según se ha descrito en la Sección 6.3 para aumentar la sensibilidad del ensayo. Otros tipos de mutaciones que sensibilizan fármacos (por ejemplo, mutaciones puntuales en el gen diana) pueden introducirse también en la célula reclamo para aumentar la sensibilidad del ensayo de selección TDS.

En algunos casos, el gen diana no es esencial para la viabilidad o para el crecimiento normal de la célula u organismo de ensayo. Por ejemplo, el gen RCE1 de la levadura es necesario para la maduración proteolítica de la proteína Ras2p y puede representar una nueva diana del cáncer (Boyartchuk et al., 1997, Science, 275:1796-1800). No obstante, la deleción del gen RCE1 no ocasiona un defecto aparente del crecimiento.

Algunas ligeras modificaciones pueden llevarse a cabo en el genoma de la levadura, que pueden crear una situación en la que la función de Rce1p puede influir positivamente de modo importante en la adaptación de la célula. El alelo ras2-23 es una mutación sensible a la temperatura en uno de los dos genes RAS de la levadura (Mitsuzawa et al., 1989, Genetics, 123:739-748). Las células que albergan esta mutación junto con una mutación de ras1, pueden crecer a 30ºC pero no a 37ºC. A 34ºC, el crecimiento de levadura que alberga el alelo ras2-23 es dependiente de Rcelp (Boyartchuk et al., 1997, Science, 275:1796-1800).

Puede establecerse un ensayo TDS para identificar inhibidores de Rcelp, mediante construcción de las células siguientes. La célula diana podría poseer pérdida de mutaciones de función de RAS1 y RAS2. En lugar de RAS2 la célula podría poseer el alelo ras2-23. Además, la célula diana podría poseer también construcciones recombinantes que expresen RCE1 y GFP en niveles altos. La célula reclamo podría ser isogénica respecto a la célula diana, excepto las construcciones recombinantes que expresan RCE1 y GFP.

Dado que una célula mutante de rce1 no posee fenotipos patentes, es de esperar que un inhibidor de Rce1p no inhiba el crecimiento de una célula de tipo salvaje. El crecimiento de las células diana y reclamo descrito en este ejemplo, dependerá, sin embargo, de la función de Rce1p. En presencia de un inhibidor de Rce1p, la célula diana será más resistente al fármaco que la célula reclamo y, finalmente, llegará a ser el miembro dominante de la población y podrá detectarse con facilidad determinando la fluorescencia emitida.

8. Identificación de inhibidores para una diana en células de mamífero

El ensayo de selección TDS puede aplicarse a líneas celulares de mamífero. Se ha puesto de manifiesto que la amplificación del gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) en células de ovario de hámster chino, confiere resistencia al metotrexato (Assaraf et al, 1989, J. Biol. Chem. 264:18326-18334). Para llevar a cabo un ensayo de selección TDS para detectar inhibidores de DHFR, se introduce un transgeno de GFP en una línea celular que sobreexpresa el gen de DHFR creando una célula diana. Las células diana se mezclan en una relación de 1:1000 con células reclamo de tipo salvaje( sin GFP, niveles normales de DHFR) y la mezcla se cultiva en presencia de diferentes compuestos. Los cultivos con niveles detectables de fluorescencia verde, habrán crecido en presencia de inhibidores putativos de la DHFR.

9. Indentificación de inhibidores para una diana en el nematodo Caenorhabditis elegans

Se construye una cepa de C. elegans que sobreexpresa \beta-tubulina, la proteína codificada por el locus de ben-1, y GFP sobre un minicromosoma mediante microinyección de una construcción que alberga las regiones codificantes para las dos proteínas bajo el control de un promotor constitutivo, por ejemplo, un promotor de la ruta glicolítica. Descendientes de los gusanos microinyectados que manifiestan transmisión de la línea germinal de los transgenos, son seleccionados generando la cepa diana. La cepa reclamo es la cepa parental, sin inyectar. Un grupo de compuestos de ensayo es extendido sobre una placa de medio a la que se ha añadido un gusano procedente de cada una de las cepas reclamo y diana. Una placa se trata con bencimidazol como testigo positivo, ya que se sabe que el bencimidazol induce parálisis en los gusanos de tipo salvaje haciendo bajar la adaptación de los mismos, pero no en aquellos que tienen mutaciones de ben-1 dominantes (Driscoll et al., 1989, J. Cell. Biol., 109:2993-3003). Se dejan incubar las placas durante un tiempo de generación de 48 horas. Las placas se examinan para determinar cuales de los grupos de compuestos aumentan la proporción de gusanos fluorescentes con respecto a los gusanos no fluorescentes. Grupos de ensayo que contienen números sucesivamente más pequeños de compuestos de ensayo, son ensayados del mismo modo, hasta que son identificados los auténticos inhibidores de la actividad de la \beta-tubulina.

10. Realización de ensayos de selección TDS en organismos microbianos

El tiempo de generación, corto, y la disponibilidad de herramientas genéticas, hace que los organismos microbianos sean idealmente adecuados para el ensayo de selección TDS. Por ejemplo, el ensayo TDS puede ser usado para identificar si un compuesto posee actividad de antibiótico. En un ejemplo no limitativo, el ensayo de selección TDS puede ser usado para identificar nuevos inhibidores del crecimiento de micobacterias tales como la Mycobacterium tuberculosis, el agente causante de la tuberculosis. Se ha puesto de manifiesto que la ruta de metabolismo del dinucleótido nicotinamida-adenina (NAD) es esencial para el crecimiento del organismo y es la diana de agentes antimicrobianos. Por ejemplo, el fármaco isoniazida inhibe el crecimiento de micobacterias (para una revisión, véase, por ejemplo, la publicación de Miesel et al., 1998, Novartis Found Symp., 217:209-221). El gen diana de la isoniazida es el inhA, un gen que codifica la enzima hidrazida del ácido isonicotínico, que cataliza la reducción específica de NAD de la proteína soporte de 2-transenoil-acilo, una etapa necesaria en la síntesis de ácidos grasos. Las micobacterias que sobreexpresan el gen inhA son resistentes a la isoniazida. Tal sobreexpresión puede ser generada en el laboratorio (Banerjee et al., 1994, Science, 263:227-230) o se presenta de modo natural en cepas clínicamente resistentes de M. tuberculosis (Rouse et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother., 39:2472-2477). Así pues, los caminos relacionados con la NAD son caminos diana útiles para ensayos de selección TDS, para la identificación de moléculas con actividad antituberculosa. Aun cuando el producto génico inhA puede ser usado como diana en un ensayo tal, es preferible identificar fármacos que inhiban genes o productos génicos afines, a los que las cepas clínicas no sean resistentes. Uno de tales genes es la ácido quinolínico fosforribosiltransferasas (QAPRTasa) que es una enzima requerida para la biosíntesis de NAD (Sharma et al., 1998, Structure 6:1587-1599).

Se usa el siguiente ensayo de selección TDS para identificar inhibidores de NAD: se genera una célula diana por transformación de una cepa seleccionada de M. tuberculosis (o una micobacteria afín) con un plásmido de expresión, seleccionable respeto a la ampicilina, de alto número de copias, que expresa la QAPRTasa (que puede amplificarse mediante PCR partiendo del genoma de M. tuberculosis (Genbank, Nº de catálogo Z95586) y GFP bajo el control de un promotor constitutivo. La célula reclamo es generada transformando la cepa parental con una contraparte vacía del plásmido. La célula diana y la célula reclamo se mezclan luego en la relación de 1:1000 y se dispersan en placa de microtitulación de 96 pocillos en un total de aproximadamente 10.000 células en un volumen de 225 \mul de medio LB con una concentración de ampicilina de 125 \mug/ml. Fármacos procedentes de la colección Microsource son añadidos individualmente a los pocillos. Por lo menos un pocillo de cada placa no recibe fármaco y sirve de testigo negativo para realizar la medida de relaciones de señal a ruido. Los cultivos se hacen crecer a 37ºC durante 48 horas, tomando medidas de la fluorescencia y de la densidad óptica cada dos horas.

Los compuestos que inhiben específicamente la ruta de la QAPRTasa producen aumentos de fluorescencia detectables en aquellos cultivos que han recibido los compuestos, pero no en los cultivos testigo.

11. Ensayo TDS en levadura con un gen diana que contribuye negativamente a la adaptación celular

La exposición que sigue describe un ensayo de selección TDS en levadura, con un gen diana que contribuye negativamente a la adaptación celular.

Etapa 1. Se clona el gen humano de interés en un plásmido de sobreexpresión.

Etapa 2. Se transforma el plásmido en una cepa de levadura y se determina si la sobreexpresión da por resultado pérdida de adaptación (velocidad de crecimiento reducida). Varios ejemplos de letalidad de la sobreexpresión han sido documentados en la bibliografía. En algunos casos puede requerirse un fondo genético específico para obtener el fenotipo deseado de adaptación reducida de la sobreexpresión. Para seleccionar rápidamente todos los posibles fondos genéticos, el plásmido de sobreexpresión puede ser transformado en una población de cepas de deleción de levadura codificadas por un código de barras. Los mutantes por deleción que son afectados específicamente por la sobreexpresión del gen humano, son agotados desde la población durante un experimento competitivo de crecimiento. La cepa de deleción con la mayor sensibilidad a la construcción de sobreexpresión, se usa como la cepa diana en el ensayo de cultivo conjunto.

Etapa 3. Se transforma la célula de levadura que contiene el plásmido humano de sobreexpresión, con un segundo plásmido que sobreexpresa la proteína GFP. La cepa resultante es la diana en el ensayo de cultivo conjunto.

Etapa 4. Se genera una cepa reclamo transformando los dos plásmidos vacíos en una cepa de levadura isógena.

Etapa 5. Se mezclan las cepas dina y reclamo en una relación 1000:1 y se distribuyen las células de placas de 96 pocillos conteniendo cada pocillo 200 \mul de medio con diferentes inhibidores.

Etapa 6. Se deja crecer la mezcla hasta saturación y se miden los niveles finales de fluorescencia de cada uno de los pocillos. Hay tres posibles consecuencias de este ensayo de cultivo conjunto:

1.

El inhibidor bloquea el crecimiento tanto de la cepa diana como de la cepa reclamo. El cultivo final tendrá una señal de fluorescencia muy baja.

2.

El inhibidor no afecta a las velocidades de crecimiento de la célula reclamo ni de la célula diana. En este caso, la cepa reclamo no competirá con la cepa diana que crece más lentamente y el cultivo saturado final tendrá una señal de fluorescencia baja.

3.

El inhibidor escoge como diana específicamente a la proteína humana sobreexpresada. Esto libera al fenotipo letal de la sobreexpresión y permite que la cepa diana crezca a velocidades normales. Debido a que la cepa diana comienza en una relación de 1000:1 sobre la cepa reclamo, esta relación se mantendrá en el cultivo saturado final. El resultado final será una señal fluorescente muy alta.

Para referencias bibliográficas que sirvan de ayuda, véanse, por ejemplo, las publicaciones de Espinet et al., 11 de Enero, 1995, Yeast 1:25-32 y la de Lin et al., 13 de Noviembre, 1992, Genetics, 3:665-673.

La presenta invención no está limitada en su alcance por la realizaciones específicas descritas en esta memoria. Sin duda, diversas modificaciones de la invención, además de las aquí descritas, se harán evidentes a los expertos en la técnica, de la descripción anterior y las figuras que se acompañan. Se entiende que tales modificaciones caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (58)

1. Un método para seleccionar una molécula que inhibe la actividad o la expresión de una proteína codificada por un gen diana, que comprende:

(a) cultivar conjuntamente una primera célula o un grupo de primeras células y una segunda célula o un grupo de segundas células, en presencia de una molécula de ensayo, en el que la primera célula tiene mayor expresión o actividad de un gen diana o una proteína codificada por el gen diana con relación a la segunda célula, en el que dicha proteína codificada por el gen diana contribuye positivamente a la adaptación de la primera célula y la segunda célula, en el que la primera célula comprende y expresa, además, un gen informador que no es expresado sustancialmente en dicha segunda célula, y en el que la primera célula y la segunda célula son de la misma especie y el mismo tipo celular y en el que, inicialmente en el cultivo conjunto, la relación del número de primeras células a segundas células, es menor que uno; y

(b) medir la actividad o cantidad de proteína codificada por el gen informador, en el que un aumento de actividad o de la cantidad de proteína codificada por el gen informador con relación a la del cultivo conjunto en ausencia de la molécula de ensayo, indica que la molécula de ensayo inhibe la actividad o la expresión de la proteína codificada por la diana.

en el que (i) la primera célula tiene niveles de tipo salvaje, de expresión y actividad del gen diana o de la proteína producida por el gen diana, y la segunda célula tiene niveles reducidos de dicha expresión o actividad, o (ii) la primera célula tiene niveles elevados de expresión o actividad del gen diana o de la proteína codificada por el gen diana, con relación a los niveles de tipo salvaje de expresión o actividad, y la segunda célula tiene niveles reducidos de expresión o actividad del gen diana con relación a dicha expresión o actividad.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la primera célula tiene niveles de tipo salvaje de expresión y actividad del gen diana o la proteína codificada por el gen diana, y la segunda célula tiene niveles reducidos de dicha expresión o actividad.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la primera célula tiene niveles elevados de expresión o actividad del gen diana o la proteína codificada por el gen diana con relación a niveles de tipo salvaje de expresión o actividad, y la segunda célula tiene niveles reducidos de expresión o actividad del gen diana con relación a dicha expresión o actividad.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el nivel reducido de expresión o actividad del gen diana o la proteína codificada por el gen diana en la segunda célula ha sido generado por deleción de una copia del gen diana en una célula diploide o por mutación del gen diana.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el nivel reducido de expresión o actividad del gen diana o la proteína codificada por el gen diana en la segunda célula, es generado por expresión de una forma negativa dominante de un componente de un camino celular del gen diana.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el nivel reducido del gen diana o la proteína codificada por el gen diana en la segunda célula, es generado por la disminución de la actividad o abundancia de un RNA codificado por el gen diana

7. El método según la reivindicación 6, en el que la actividad o abundancia de un RNA codificado por un gen diana en dicha segunda célula, es disminuida por medio de un ribozima, un ácido nucleico antisentido, un RNA de doble cadena o un aptámero.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la primera y segunda células son cultivadas conjuntamente en una relación de 1:10.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la primera y segunda células son cultivadas conjuntamente en una relación de 1:100.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la primera y segunda células son cultivadas en una relación de 1:1000.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la primera y segunda células son cultivadas conjuntamente en una relación de 1:10000.

12. Un método para seleccionar una molécula que inhibe la actividad o la expresión de una proteína codificada por un gen diana, que comprende:

(a) cultivar conjuntamente, en presencia de una molécula de ensayo, una primera célula o un grupo de primeras células, y dos o más segundas células o grupos de segundas células, en el que cada dicha segunda célula o cada grupo de segundas células tiene expresión o actividad elevada de un gen diana diferente o una proteína codificada por dicho gen diana, con relación a la primera célula, en el que cada gen diana afecta a la adaptación de la primera célula y las segundas células o grupos de segundas células, en el que dichas segundas células o grupos de segundas células comprende y expresa, además, un gen informador que no es expresado sustancialmente en dicha primera célula o grupo de células, y en el que dicha primera célula y dichas segundas células o grupos de segundas células son de la misma especie y el mismo tipo de célula; y

(b) medir la actividad o cantidad de proteína codificada por los genes informadores en dichas segundas células o grupos de segundas células, en el que la actividad o cantidad de proteína codificada por los genes informadores es indicativa de si la molécula de ensayo inhibe el gen diana,

en el que (i) cada gen diana contribuye positivamente a la adaptación de la primera célula y las segundas células o grupos de segundas células, en el que la relación del número de primeras células a cada una de las segundas células o grupos de segundas células, inicialmente, en el cultivo conjunto, es menor que uno, y en el que el aumento de la actividad o cantidad de proteína codificada por al menos uno de los genes informadores con relación a las del cultivo conjunto en ausencia de la molécula de ensayo, indica que la molécula de ensayo inhibe uno o más de dichos genes diana, o (ii) cada gen diana contribuye negativamente a la adaptación de la primera célula y la segunda célula o grupo de segundas células, en el que la relación del número de primeras células a cada una de las segundas células o grupos de segundas células es, inicialmente, mayor que uno, y en el que la falta de disminución de actividad o de la cantidad de proteína codificada por al menos uno de los genes informadores con relación a las del cultivo conjunto en ausencia de la molécula de ensayo, indica que la molécula de ensayo inhibe uno o más de dichos genes diana.

13. El método según la reivindicación 12, en el que cada gen diana contribuye positivamente a la adaptación de la primera célula y las segundas células o grupos de segundas células, en el que la relación del número de primeras células a cada una de las segundas células o grupos de segundas células, inicialmente, en el cultivo conjunto, es menor que uno, y en el que el aumento de la actividad o de la cantidad de proteína codificada por al menos uno de los genes informadores con relación a la del cultivo conjunto en ausencia de la molécula de ensayo, indica que la molécula de ensayo inhibe uno o más de dichos genes diana.

14. El método según la reivindicación 12, en el que cada gen diana contribuye negativamente a la adaptación de la primera célula y la segunda célula o grupo de segundas células, en el que la relación del número de primeras células a cada una de las segundas células o grupos de segundas células es, inicialmente, mayor que uno, y en el que la falta de disminución de actividad o cantidad de proteína codificada por al menos uno de los genes informadores con relación a la del cultivo conjunto en ausencia de la molécula de ensayo, indica que la molécula de ensayo inhibe uno o más de dichos genes diana.

15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que un nivel elevado de al menos la expresión de un gen diana en una al menos de dichas segundas células o grupos de segundas células, es generado expresando recombinantemente el gen diana en dicha al menos una de dichas segundas células o grupos de segundas células.

16. El método según la reivindicación 15, en el que dicho gen diana es expresado recombinantemente desde un plásmido.

17. El método según la reivindicación 15, en el que dicho gen diana es expresado recombinantemente desde un cromosoma.

18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que un nivel elevado de al menos la actividad de un gen diana en dicha célula o grupo de segundas células, es generado por expresión de una forma constitutivamente activa de la proteína codificada por el gen diana.

19. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que cada una de las segundas células o grupos de segundas células expresa el mismo gen informador.

20. El método según la reivindicación 19, que comprende además la reselección de un cultivo conjunto en el que un aumento importante de actividad o cantidad de proteína codificada por los genes informadores es detectada en la etapa (b), detectando cual de las segundas células o grupos de segundas células posee actividad o cantidad aumentada de proteína codificada por su gen informador.

21. El método según la reivindicación 20, en el que la reselección comprende llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa sobre ácido nucleico procedente de dicho cultivo conjunto.

22. El método según la reivindicación 20, en el que la reselección comprende el crecimiento selectivo de células desde el cultivo conjunto sobre medios auxótrofos.

23. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que cada segunda célula o grupo de segundas células es transformado con un ácido nucleico que comprende un gen informador y un gen diana diferente.

24. El método según la reivindicación 29, en que la reselección comprende para cada segunda célula o grupo de segundas células:

(a) cultivar conjuntamente, en presencia de una molécula de ensayo que causaba actividad o cantidad aumentada de proteína codificada por al menos uno de dichos genes informadores, la primera célula o grupo de primeras células y una segunda célula o grupo de segundas células; y

(b) medir la actividad o la cantidad de proteína codificada por el gen informador de dicha segunda célula o grupo de segundas células, en el que dicho aumento de la actividad o la cantidad de proteína codificada por el gen informador, indica que la molécula inhibe la proteína codificada por el gen diana expresado por dicha segunda célula o grupo de segundas células.

25. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que cada una de las segundas células o grupo de segundas células expresa un gen informador diferente.

26. El método según la reivindicación 25, en el que cada gen informador diferente codifica una molécula diferente, bioluminiscente, quimiluminiscente o fluorescente, y medir la actividad o la cantidad de la proteína codificada por cada gen informador diferente, comprende medir la bioluminiscencia, la quimiluminiscencia o la fluorescencia de dicha molécula.

27. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que la relación de cada segunda célula a la primera célula es 1:100.

28. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que la relación de cada segunda célula a la primera célula es 1:1.000.

29. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que la relación de cada segunda célula a la primera célula es 1:10.000.

30. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la molécula inhibe la actividad o la expresión de la proteína codificada por el gen diana pero no una proteína codificada por un segundo gen funcionalmente similar, en el que la segunda célula expresa niveles elevados del segundo gen, en el que las proteínas codificadas por dichos gen diana y gen funcionalmente similar, ambos, contribuyen positivamente a la adaptación de la primera célula y la segunda célula, y en el que un aumento de la actividad o la cantidad de proteína codificada por el gen informador indica que la molécula de ensayo inhibe la actividad o expresión de la proteína codificada por el gen diana pero no la proteína codificada por el gen funcionalmente similar.

31. El método según la reivindicación 30, en el que el gen funcionalmente similar es un homólogo del gen diana procedente de otra especie.

32. El método según la reivindicación 30, en el que el gen funcionalmente similar codifica una proteína procedente de la misma especie.

33. El método según la reivindicación 32, en el que dicha proteína es una isozima de la proteína codificada por el gen diana.

34. El método según la reivindicación 32, en el que dicha proteína es una variante de corte y empalme de la proteína codificada por el gen diana.

35. El método según la reivindicación 32, en el que dicha proteína es un mutante puntual de la proteína codificada por el gen diana.

36. El método según la reivindicación 30, en el que el nivel elevado de expresión génica de dicho gen diana o gen funcionalmente similar, es generado expresando recombinantemente el gen.

37. El método según la reivindicación 36, en el que el gen diana o gen funcionalmente similar es expresado recombinantemente desde un plásmido.

38. El método según la reivindicación 36, en el que el gen diana o gen funcionalmente similar es expresado recombinantemente desde un cromosoma.

39. El método según la reivindicación 30, en el que las primera y segunda células son cultivadas conjuntamente en una relación 1:1.

40. El método según la reivindicación 30, en el que la primera y segunda células o grupos de células son cultivadas conjuntamente en una relación de 1:100.

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41. El método según la reivindicación 30, en el que la primera y segunda células o grupos de células se cultivan conjuntamente en una relación de 1:1.000.

42. El método según la reivindicación 30, en el que la primera célula es transformada con un ácido nucleico que comprende el gen informador y el gen diana.

43. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 9-11, 12, 27-30, 40 ó 41, en el que la primera y segunda células son seleccionadas entre el grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto y una célula de mamífero.

44. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 8, 30 y 39, en el que un grupo de primeras células y un grupo de segundas células son cultivadas conjuntamente, y el grupo de primeras células y el grupo de segundas células son dos organismos multicelulares individuales, respectivamente, de la misma especie.

45. El método según la reivindicación 44, en el que la especie es C. elegans.

46. El método según la reivindicación 1, 12, 25 ó 30, en el que el gen informador o al menos un gen informador o cada gen informador diferente, respectivamente, codifica una molécula bioluminiscente, quimiluminiscente o fluorescente, y medir la actividad o cantidad de proteína o proteína codificada por dicho gen informador o dichos genes informadores, comprende medir la bioluminiscencia, la quimiluminiscencia o la fluorescencia de dicha molécula.

47. El método según la reivindicación 45, en la que la molécula fluorescente es la proteína fluorescente verde (GFP) o uno de sus mutantes.

48. El método según la reivindicación 47, en el que la molécula fluorescente es una GFP mutante que tiene una longitud de onda de fluorescencia alterada, una fluorescencia aumentada, o ambas cosas.

49. El método según la reivindicación 48, en el que la GFP mutante es la GFP azul.

50. El método según la reivindicación 46, en el que la molécula fluorescente es una proteína fluorescente roja.

51. El método según la reivindicación 46, en el que la molécula fluorescente es una proteína fluorescente amarilla.

52. El método según la reivindicación 1, 12 ó 30, en el que el gen informador o al menos un gen informador o cada gen informador diferente, respectivamente, codifica una enzima.

53. El método según la reivindicación 52, en el que la enzima es la \beta-galactosidasa.

54. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 12, 25 y 30, en el que el gen informador o al menos un gen informador o cada gen informador diferente, respectivamente, codifica un receptor.

55. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 12, 25 y 30, en el que el gen informador o al menos un gen informador o cada gen informador diferente, respectivamente, codifica un transportador.

56. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 12, 25 y 30, en el que el gen informador o al menos un gen informador o cada gen informador diferente, respectivamente, codifica una proteína o un péptido que comprende un epítopo.

57. El método según la reivindicaciones 56, en el que el gen informador codifica una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en CD4, myc, glutatión-S-transferasa y hexahistidina.

58. El método según la reivindicación 56, en el que el gen informador y el gen diana, juntos, comprenden un gen de fusión, en el que dicho gen de fusión codifica una fusión en el marco de lectura de la proteína codificada por los genes informador y diana.