ES2283399T3

ES2283399T3 - Peptidomimetico de gd3.

Info

Publication number: ES2283399T3
Application number: ES01921990T
Authority: ES
Inventors: Dai Ishikawa; Koichi Ogino; Takao Taki
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2021-04-23
Also published as: WO2001081371A1; ATE356140T1; US7341994B2; US20060058226A1; EP1616875A1; DE60127113T2; DK1279677T3; AU2001248822A1; EP1279677B1; EP1279677A1; EP1279677A4; US8017584B2; US20080125374A1; DE60127113D1; CY1108570T1; PT1279677E

Abstract

. Un peptidomimético de GD3 que comprende (i) la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4; (ii) una secuencia de aminoácidos derivada del SEQ ID NO: 4 por sustitución, deleción, adición, o inserción de un resto aminoácido; (iii) una secuencia de aminoácidos que consiste en 9 a 14 restos aminoácido continuos contenidos en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4; o (iv) una secuencia de aminoácidos derivada del SEQ ID NO: 4 y que tiene una homología del 80% más con el SEQ ID NO: 4, siendo capaz dicho peptidomimético de GD3 de unirse a un anticuerpo anti-GD3 y siendo capaz de inducir una respuesta inmunitaria anti-GD3.

Description

Peptidomimético de GD3.

Campo técnico

La presente invención se refiere a peptidomiméticos de GD3, y más concretamente a péptidos novedosos que se considera que imitan estructuralmente a GD3, que son conocidos como antígenos asociados a tumores encontrados en tumores tales como el melanoma.

Técnica antecedente

GD3 es una forma de sialosil-esfingoglicolípidos; G representa el gangliósido (sialosil-esfingoglicolípido) y D representa disialo. GD3, como otros antígenos asociados a tumores tales como GM2, GM3, GD2, y GT3, es conocido por ser expresado en células tumorales tales como las del melanoma humano. La fórmula estructural de GD3 está representada por NeuAc \alpha2-8 NeuAc \alpha2-3 Gal \beta1-4 Glc \beta1-1 Cer.

Los informes previos referentes a GD3 han revelado, entre otros descubrimientos, que el desarrollo de un tumor se corresponde con la expresión de GD3, que GD3 es altamente expresado en células de melanoma, y que la administración de anticuerpo monoclonal anti-GD3 de ratón suprime el crecimiento de los tumores en pacientes con melanoma. Basándose en estos descubrimientos, GD3 se ha vuelto del máximo interés en la inmunoterapia de estos tipos de tumores.

De este modo, se espera que la respuesta inmunitaria humana frente a GD3 proporcione efectos beneficiosos durante el curso clínico de las condiciones patológicas; de hecho, se han realizado una variedad de ensayos clínicos en el campo técnico de las vacunas. No obstante, todavía no se ha informado sobre resultados exitosos que satisfagan la expectación anterior (véase, por ejemplo, Cheresh, D. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 81, 5767-5771 (1984): Herlyn, M., et al., Cancer Res., 45, 5670-5676 (1985): Houghton, A. N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 82, 1242-1246 (1985): Livingston, P. O., Immunological Rev., 145, 147-163 (1995): Livingston, P. O., et al., Cancer Immunol. Immunother., 45, 1-9 (1997)).

Los gangliósidos, que se ha descubierto que están asociados con tumores, son conocidos de este modo por servir como diana útil en el ataque inmunológico contra el cáncer. No obstante, son reconocidos por tener una escasa inmunogenicidad.

Con el fin de superar esta desventaja, se ha desarrollado y descrito una composición de vacuna contra el cáncer para inducir o estimular la respuesta inmunitaria de los anticuerpos frente a los gangliósidos (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública (kokai) Núm. 8-53366). Esta composición es un producto N-glicosilado de gangliósido (esto es, N-glicosil GM3).

De un modo similar, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.102.663 se describe un producto 9-O-acetilado de gangliósido (GD3 9-O-acetilado).

Por otra parte, en la Publicación Japonesa Kohyo Núm. 8-508978 se describe que una vacuna para el cáncer similar, la vacuna de complejo de GD3 (complejo GD3-hemocianina de lapa ojo de cerradura), muestra respuestas de anticuerpos significativamente mejoradas. Según la descripción de esta publicación, un doble enlace del esqueleto de ceramida de GD3 es escindido con ozono para la modificación química, introduciendo de este modo un grupo aldehído, y haciendo que el grupo aldehído se una al grupo aminolisilo de la proteína por medio de una aminación reductiva, para construir de ese modo un complejo con un péptido multi-antigénico sintetizado que presenta repeticiones de epítopos de las células T de la malaria, proteína de la envuelta de Neisseria meningitidis (OMP), seralbúmina bovina cationizada (cBSA), hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH) y polilisina. Esta publicación también describe que el coadyuvante inmunológico más eficaz es QS-21, obtenido por medio de la extracción de la corteza de un árbol encontrado en Sudamérica y denominado Quillajasaponaria Molina (Aquila Pharmaceuticals, Worcester, MA, U.S.A.: Kensil, C. R. et al., J. Immunol., 146, 431 (1991)).

Las vacunas convencionales preparadas a través del empleo de GD3 per se como un antígeno muestran solamente respuestas inmunitarias débiles y sus efectos son transitorios. Por otra parte, tienen desventajas, ya que el GD3 materia prima no es fácilmente asequible. Esto es, generalmente, la producción en masa de un gangliósido deseado a partir de un organismo vivo es muy difícil. Asimismo, la síntesis de un gangliósido a través de la síntesis química o la ingeniería genética es muy difícil.

Cuando se preparan vacunas por medio de una variedad de modificaciones químicas de GD3, concretamente en el tratamiento químico realizado para mejorar la antigenicidad o en la preparación de complejos, se encuentran desventajas en términos del procedimiento intrincado en relación con la consecución, la preparación, síntesis, etc. de las materias primas para los antígenos y complejos, y la necesidad de selección de los inmunocoadyuvantes.

Entretanto, en los últimos años, se han empleado mecanismos biológicos moleculares en los campos técnicos de los sacáridos complejos, y ahora se encuentran en desarrollo mecanismos para remplazar la cadena de azúcar por un péptido. Previamente, los autores de la presente invención han obtenido con éxito, a partir de una biblioteca de péptidos de presentación en fagos al azar por medio de inmunopurificación ("panning") utilizando un anticuerpo monoclonal contra una cadena de azúcar, un péptido que muestra una unión específica a un anticuerpo contra una forma de gangliósido, GD1\alpha.

Se ha encontrado que este péptido (15 meros) imita la estructura de la cadena de azúcar de un glicolípido complejo (y por tanto se denomina péptido glico-réplica), para unirse, con especificidad, a un anticuerpo monoclonal contra el glicolípido GD1\alpha, y para inhibir la unión de un anticuerpo al GD1\alpha antigénico.

Los autores de la presente invención también han producido este péptido por medio de síntesis química, y han confirmado que el péptido reacciona con un anticuerpo monoclonal para GD1\alpha, que un péptido réplica de GD1\alpha (sintetizado químicamente) inhibe la adherencia celular de las células cancerosas de líneas celulares cancerosas altamente metastásicas, y que el péptido réplica inhibe la metástasis de las células cancerosas (Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública (kokai) Núm. 10-237099).

Además, los autores de la presente invención han tenido éxito al obtener, a partir de una biblioteca de péptidos al azar, un péptido que muestra modulación de la actividad glicosidasa y reacciona con especificidad con un anticuerpo contra lactotetraosil-ceramida o lactoneotetraosil-ceramida (véanse la Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública (kokai) Núm. 10-237098 y Saibo Kogaku, Dai Ishikawa y Takao Taki, 16 (12) 1821-1828 (1997)).

Un informe publicado recientemente describe resultados de estudios similares a los descritos antes por los autores de la presente invención. Específicamente, Qiu, J., et al. han descrito en Hybridoma 18(1) 103-112 (1999) que un péptido de 15-16 meros que contiene una secuencia Trp-Arg-Tyr y obtenido de una biblioteca de péptidos de presentación en fagos por medio del uso de un anticuerpo contra un antígeno GD2/GD3 muestra reacción cruzada con el
anticuerpo.

Willers, J., et al. describen que han obtenido, a partir de dos bibliotecas de péptidos de presentación en fagos de fagos que muestran péptidos de 15-meros y 8-meros, cuatro péptidos presentados en fagos capaces de unirse a anticuerpos monoclonales anti-GD3 MB3.6, MG22, y MG21 (Peptides, 20, 1021-1026 (1999)). Según esta publicación, se encontró que estos péptidos mostraban la capacidad de unirse al anticuerpo anti-GD3 empleado para la selección, y esta capacidad de unión era inhibida por GD3, pero no se observaba la inmunogenicidad deseada para ninguno de los péptidos.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un péptido novedoso que imita la estructura de la cadena de azúcar del gangliósido GD3 y muestra elevada afinidad con el anticuerpo anti-GD3.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un péptido inmunogénico capaz de producir un anticuerpo específico de GD3; en particular, un péptido que tenga un rasgo característico de manera que el anticuerpo producido por la inmunización con un inmunógeno que comprende el péptido presente reacción cruzada con GD3, y por lo tanto, tenga utilidad como vacuna que remplaza a GD3.

Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una secuencia de ADN que codifica el péptido mencionado antes, un vector de expresión recombinante en el cual se ha integrado la secuencia, una célula anfitriona que alberga el vector, y un producto de expresión recombinante producido por la célula.

Un objeto adicional más de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que contiene como ingrediente activo el péptido mencionado antes o el vector de expresión recombinante.

Descripción de la invención

Los autores de la presente invención han llevado a cabo estudios extensos, y han descubierto una secuencia de aminoácidos novedosa que muestra una elevada afinidad por el anticuerpo anti-GD3. Los autores de la invención también han descubierto que un antisuero obtenido por inmunización con un peptidomimético de GD3 que comprende un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos muestra reactividad cruzada con GD3, y que el peptidomimético de GD3 encuentra utilidad como vacuna que remplaza a GD3. La presente invención se ha completado basándose en estos descubrimientos.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un peptidomimético de GD3 que contiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos derivada de allí como se define en la reivindicación 1. El peptidomimético de GD3 muestra especificidad de unión para un anticuerpo anti-GD3.

En particular, la presente invención proporciona un peptidomimético de GD3 que está en una forma fusionada de un péptido - fusionado con una proteína portadora capaz de intensificar la inmunogenicidad - y el peptidomimético de GD3, donde la proteína portadora es la hemocianina de lapa ojo de cerradura; un peptidomimético de GD3 multi-antigénico que contiene al menos una especie del peptidomimético de GD3; un peptidomimético de GD3 inmunogénico que tiene la capacidad de producir un anticuerpo específico de GD3; y un peptidomimético de GD3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, el peptidomimético de GD3.

La presente invención abarca, entre otras, las siguientes realizaciones:

(1) una secuencia de ADN que codifica el peptidomimético de GD3 de la presente invención, concretamente una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4;

(2) una secuencia de ADN como se ha descrito antes, que tiene una secuencia de ADN representada por el SEQ ID NO: 8;

(3) un vector de expresión recombinante en el cual ha sido insertada al menos una de estas secuencias de ADN;

(4) una célula anfitriona en la cual ha sido incorporado el vector de expresión recombinante anterior;

(5) una composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, el vector de expresión recombinante;

(6) el uso de la composición farmacéutica de la presente invención como vacuna para estimular la inducción de un anticuerpo capaz de reconocer el GD3 o para potenciar la producción del anticuerpo;

(7) el uso de la composición farmacéutica de la presente invención como fármaco para suprimir un tumor o cáncer o para inhibir la metástasis cancerosa; y

(8) una composición farmacéutica que es una preparación de fármaco en liposomas.

El fármaco puede ser utilizado para tratar los tumores que expresan GD3 o el cáncer, concretamente las condiciones patológicas seleccionadas del grupo que consiste en el melanoma, el cáncer de intestino grueso, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, el cáncer de mama, el tumor cerebral, el cáncer de riñón, el cáncer de páncreas, el cáncer cervical, el cáncer de esófago, el cáncer de pulmón, y el cáncer de estómago.

Según se utiliza en la presente memoria, las abreviaturas de los aminoácidos, péptidos, secuencias de nucleótidos, ácidos nucleicos, etc. están de acuerdo con los patrones de la IUPAC; patrones IUB; "Guidelines for Drafting Specifications or Similar Materials Containing a Nucleotide Sequence or an Amino Acid Sequence", (editado por la Japanese Patent Office); y los símbolos empleados rutinariamente en la técnica.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que muestra la afinidad de unión, determinada mediante el método descrito en relación con el Ejemplo 2, de los péptidos inmunogénicos según la presente invención y el anticuerpo anti-GD3. La Fig. 2 muestra secuencias de péptidos multi-antigénicos empleados en el Ejemplo 5. La Fig. 3 es un gráfico que muestra la afinidad de unión de los peptidomiméticos de GD3 y el anticuerpo monoclonal anti-GD3. La Fig. 4 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor ejercido por los peptidomiméticos de GD3 inmovilizados frente a la unión entre GD3 y 4F6 (anticuerpo anti-GD3). La Fig. 5 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor ejercido por peptidomiméticos de GD3 añadidos exógenamente contra la unión entre GD3 y 4F6. La Fig. 6 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor ejercido por peptidomiméticos de GD3 añadidos exógenamente (nueve restos) frente a la unión entre GD3 y 4F6. La Fig. 7 es un gráfico que muestra la relación entre el factor de dilución de muestras de suero de ratones inmunizados con el péptido R4 y los resultados del ELISA sobre GD3. La Fig. 8 es un gráfico que muestra la relación entre el factor de dilución de muestras de suero de ratones inmunizados con R4MAP durante dos meses y los resultados del ELISA sobre GD3. La Fig. 9 es un gráfico que muestra la relación entre el factor de dilución de muestras de suero de ratones inmunizados con R4MAP durante dos meses y los resultados del ELISA realizado sobre el péptido R4MAP.

Mejores modos de llevar a cabo la invención

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención se describirán a continuación con detalle.

Los peptidomiméticos de GD3 de la invención son capaces de unirse a un anticuerpo para GD3 (anticuerpo anti-GD3) con especificidad. Adicionalmente se describen aquí peptidomiméticos de GD3 caracterizados por contener una secuencia de aminoácidos representada por uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 3 o una secuencia de aminoácidos derivada de allí por sustitución, deleción, adición, o inserción de uno o más restos aminoácido y por ser capaces de unirse a un anticuerpo para GD3 (anticuerpo anti-GD3) con especificidad.

Según se utiliza en la presente memoria, "anticuerpo anti-GD3" es un término empleado generalmente en la técnica y se define como un anticuerpo específico capaz de reconocer GD3 (esto es, unirse a GD3). El anticuerpo no muestra preferiblemente reactividad cruzada con otros gangliósidos relacionados con GD3 y es particularmente preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

La secuencia de aminoácidos representada por uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4 se caracteriza por imitar la estructura de cadena de azúcar de GD3. De este modo, un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos, que muestra una unión específica con el anticuerpo anti-GD3, es un ejemplo preferido de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención.

La secuencia de aminoácidos específica mencionada anteriormente puede ser una secuencia de aminoácidos derivada por modificación de una porción de restos aminoácido o una porción de la secuencia con tal que la característica estructural; esto es, la imitación de la estructura de la cadena de azúcar de GD3, se mantenga o esté presente.

No se impone una limitación concreta sobre el grado y la posición de la modificación (esto es, sustitución, deleción, adición, o inserción) de la secuencia de aminoácidos, con tal que la secuencia de aminoácidos modificada sea equivalente en términos del efecto y muestre características similares a las de la secuencia de aminoácidos representada por uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4; es decir, la imitación de la estructura de la cadena de azúcar de GD3, se mantenga o esté presente.

La modificación se puede efectuar generalmente en un grado de homología del 80% o más, preferiblemente una homología del 90% o más.

Entre estos péptidos, se considera que un péptido que tiene al menos dos restos cisteína; p. ej., un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2, se cicla espontáneamente. Semejante péptido cíclico es activo (muestra unión específica a un anticuerpo anti-GD3) incluso cuando el péptido está presente en una forma de cadena lineal. Por lo tanto, uno o ambos restos cisteína incluidos en el péptido o una porción de la secuencia de aminoácidos emparedada por estos dos restos cisteína puede ser suprimida sin afectar mucho las características estructurales de imitación de la estructura de la cadena de azúcar de GD3. Este fenómeno es apoyado por la literatura (p. ej., Koivunen, et al., J. Biol. Chem., 268, 20205-20210 (1993)).

Los ejemplos de la secuencia de aminoácidos suprimida mencionada antes incluyen una secuencia de nueve restos aminoácido (PHFDSLLYP) que reside en el extremo N de GD3R2.

Cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención está formado por un péptido que contiene una de las secuencias de aminoácidos específicas mencionadas antes que caen dentro del alcance de la presente invención. De este modo, la característica estructural; esto es, la imitación de la estructura de la cadena de azúcar de GD3, se mantiene o está presente, y el peptidomimético de GD3 se caracteriza por la unión específica a un anticuerpo anti-GD3.

Desde el punto de vista de la inmunogenicidad y de otras propiedades, los péptidos mencionado antes que contienen una cualquiera de las secuencias de aminoácidos específicas tiene un número de restos aminoácido de al menos 5, preferiblemente 8 a 60, más preferiblemente 8 a 30, aún más preferiblemente 10 a 20.

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención tienen preferiblemente una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4. Alternativamente, los peptidomiméticos de GD3 tienen preferiblemente una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 mediante sustitución, deleción, adición, o inserción de un resto aminoácido.

Más preferiblemente, los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención son péptidos inmunogénicos que son capaces de producir un anticuerpo específico de GD3. En otras palabras, los péptidos pueden inducir un anticuerpo específico anti-GD3.

Los peptidomiméticos de GD3 que están caracterizados por contener una secuencia de aminoácidos representada por uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4, tienen per se la capacidad de producir un anticuerpo específico de GD3, y por lo tanto, tales péptidos son preferidos como péptidos inmunogénicos de la presente invención.

Los péptidos inmunogénicos de la presente invención también abarcan péptidos que empiezan a tener una inmunogenicidad deseada por medio de la transformación en formas con la inmunogenicidad intensificada, así como los péptidos de las formas con una inmunogenicidad intensificada.

De este modo, los péptidos inmunogénicos que tienen capacidad para producir un anticuerpo específico de GD3, cuyos péptidos son realizaciones preferidas de la presente invención, abarcan los péptidos no modificados per se y las formas de inmunogenicidad intensificada de los peptidomiméticos de GD3 tales como una forma de un péptido fusionado a una proteína portadora común para intensificar la inmunogenicidad y una forma de un péptido multi-antigénico, cayendo estas dos formas dentro del alcance de la presente invención.

Que los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención mantengan o presenten la característica estructural de imitar la estructura de la cadena de azúcar de GD3 (esto es, muestren unión específica a un anticuerpo anti-GD3) puede ser confirmado verificando la reactividad con el anticuerpo anti-GD3 por medio de un método de ensayo rutinario. Además, que los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención sean péptidos inmunogénicos que tengan la capacidad de producir un anticuerpo anti-GD3 puede ser confirmado verificando, por medio de un método de ensayo rutinario, la reactividad cruzada de los anticuerpos inducidos con GD3.

\newpage

La detección de la especificidad de unión de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención a un anticuerpo monoclonal anti-GD3 y la reactividad de GD3 con un anticuerpo inducido por un péptido inmunogénico se describirán específicamente en los Ejemplos descritos más abajo.

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención abarcan las siguientes realizaciones.

(a) un peptidomimético de GD3 que comprende un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos formada por medio de la fusión o conexión de una pluralidad de miembros de al menos una especie de las secuencias de aminoácidos específicas mencionadas antes;

(b) un peptidomimético de GD3 en una forma de péptido multiantigénico que comprende un péptido que contiene al menos una especie de la secuencia de aminoácidos específica mencionada antes; y

(c) un peptidomimético de GD3 en forma de un péptido de fusión fusionado con una proteína o un péptido portador que puede intensificar la inmunogenicidad o promover la respuesta inmunitaria.

Estos ejemplos específicos de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención se describirán a continuación con más detalle.

En los Ejemplos descritos más abajo, los péptidos representados por GD3R1, GD3R2, GD3R3, y GD3R4 indican péptidos que tiene secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NOS: 1 a 4, respectivamente. Estos péptidos son ejemplos preferidos de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención. También son preferidos los péptidos formados de 9 a 14 restos aminoácido arbitrariamente continuos contenido en una secuencia de aminoácidos representada por uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4. De estos, los péptidos formados de 9 a 14 restos aminoácido N-terminales o C-terminales contenidos en una secuencia e aminoácidos representada por uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4 son más preferidos. Los péptidos formados de nueve restos aminoácido N-terminales o C-terminales contenidos en una secuencia de aminoácidos representada por uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4 son particularmente preferidos. Como se muestra en los Ejemplos, estos péptidos fueron obtenidos seleccionando péptidos que muestran una unión específica a un anticuerpo

\hbox{anti-GD3 mediante el uso de
bibliotecas de presentación  en fagos.}

No es necesario repetir la etapa de escrutinio para producir los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención. Si se desea, el escrutinio se realiza, por ejemplo, de la siguiente manera.

Específicamente, se produce una gran población de moléculas (biblioteca), y se identifican los péptidos de interés por medio del escrutinio de la biblioteca de moléculas. Se puede emplear una biblioteca de presentación en fagos para el escrutinio. El método para producir la biblioteca y el método de escrutinio se describen en la literatura (p. ej., Scott, J. M. y Smith, G.P., Science, 249, 386-390 (1990); Smith, G. P. y Scott, J. K., Methods in Enzymology, 217, 228-257 (1993)). Los ejemplos de los métodos preferibles para identificar los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención incluyen los métodos para identificar peptidomiméticos de la cadena de azúcar de un glicolípido descritos, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente Japonesas Abiertas a la Inspección Pública (kokai) Núms. 10-237099 y 10-237098, y Dai ISHIKAWA y Takao TAKI, Cell Engineering, 16 (12) 1821-1828 (1997).

Los clones de fagos que presentan un péptido de interés pueden ser escrutados y seleccionados por medio de un ensayo de unión (a un anticuerpo) mediante el uso de un anticuerpo que reconozca GD3, preferiblemente un anticuerpo monoclonal que tenga una elevada especificidad para GD3.

Determinando las secuencias de ADN de los clones de fagos seleccionados, se puede identificar un peptidomimético de GD3 de interés. Las secuencias de ADN pueden ser determinadas fácilmente por medio de cualquier método conocido en la técnica; p. ej., el método didesoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463-5467 (1977)] o el método de Maxam-Gilbert [Method in Enzymology, 65, 499 (1980)]. Se puede emplear convenientemente un kit de secuenciación comercial o un medio similar para determinar las correspondientes secuencias de nucleótidos.

Producción de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención pueden ser producidos según sus secuencias de aminoácidos por medio de cualquier método de síntesis química rutinario, tales como los métodos de síntesis de péptidos en fase líquida o en fase sólida típicos.

Más específicamente, los métodos de síntesis de péptidos incluyen un método de elongación por etapas en el que los respectivos aminoácidos se conectan sucesivamente según la información de la secuencia de aminoácidos, para de ese modo prolongar la cadena; y un método de condensación de fragmentos en el que los fragmentos son sintetizados de manera preliminar a partir de diversos aminoácidos y los fragmentos son acoplados. Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención pueden ser sintetizados por medio de cualquier método.

Se puede emplear cualquier método de condensación para la síntesis de péptidos anterior. Los ejemplos de los mismos incluyen el método de la azida, el método del anhídrido de ácido mixto, el método de la DCC, el método del éster activo, el método redox, el método de la DPPA (difenilfosforilazida), el método de DCC + aditivo (p. ej., 1-hidroxibenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, o N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida), y el método del Woodward.

El disolvente empleable en estos métodos se selecciona apropiadamente entre los disolventes acostumbrados bien conocidos por ser utilizables en una variedad de reacciones de condensación de péptidos. Los ejemplos incluyen dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), hexafosforamida, dioxano, tetrahidrofurano (THF), acetato de etilo, y mezclas de los mismos.

Tras la reacción de síntesis de péptidos anterior, los grupos carboxilo de los aminoácidos y péptidos cuyos grupos no están implicados en la reacción pueden ser generalmente protegidos por medio de esterificación para formar de ese modo un éster alquílico inferior (p. ej., éster metílico, éster etílico, o éster t-butílico); o un éster aralquílico (p. ej., éster bencílico, éster p-metoxibencílico, o éster p-nitrobencílico). Un grupo funcional de la cadena lateral de un aminoácido; p. ej., el grupo hidroxilo de Tyr, puede ser protegido por un grupo tal como acetilo, bencilo, benciloxicarbonilo, o tert-butilo, pero la protección no es esencial. El grupo guanidinio de Arg puede ser protegido por un grupo protector apropiado tal como nitro, tosilo, 2-metoxibencenosulfonilo, metanosulfonilo, benciloxi-carbonilo, isoborniloxicarbonilo, o adamantiloxi-carbonilo.

La reacción de desprotección de los grupos protectores de los aminoácidos, péptidos, y los péptidos inmunogénicos obtenidos finalmente de la presente invención que tienen los grupos protectores anteriores puede ser realizada por medio de cualquier método empleado rutinariamente. Por ejemplo, se puede realizar una reducción catalítica y una desprotección química mediante el uso de un agente tal como amoníaco líquido/sodio, fluoruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, cloruro de hidrógeno, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, o ácido metanosulfónico.

La purificación de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención obtenidos de este modo se puede realizar apropiadamente a través de un método rutinario tal como el método de la resina de intercambio iónico, la cromatografía de reparto, la cromatografía en gel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), o la distribución contracorriente, que son empleados rutinariamente en el campo de la química de los péptidos.

Alternativamente, los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención pueden ser producidos por medio de una técnica de ingeniería genética que emplea las secuencias de ADN según la presente invención que codifican los péptidos.

El procedimiento anterior se lleva a cabo a través de un método rutinario. Por ejemplo, la síntesis de ADN, la producción de un vector de expresión que puede expresar el ADN, y el método de expresión del vector en las células anfitrionas se pueden llevar a cabo según los mecanismos de ingeniería genética empleados generalmente (Véase Molecular Cloning 2d. Ed., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku-Seikagaku Jikken Koza "Gene study I, II, y III", editado por The Japanese Biochemical Society (1986); etc.).

El ADN que codifica un peptidomimético de GD3 de la presente invención puede ser preparado por medio de un método rutinario basándose en la información de la secuencia de aminoácidos del peptidomimético de GD3 proporcionada por la presente invención (p. ej., Science, 224, 1431 (1984); y Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)).

Más específicamente, el ADN puede ser sintetizado químicamente por medio del método de la fosforamidita o el método del triéster. La síntesis se puede realizar mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos automatizado asequible comercialmente. Los fragmentos de doble hebra pueden ser producidos a partir de un producto de hebra sencilla producido mediante síntesis química incluyendo la síntesis de hebras complementarias y la hibridación de las hebras en condiciones apropiadas; o mediante la adición de hebras complementarias a una secuencia cebadora apropiada mediante el uso de una ADN polimerasa.

Si se desea, la secuencia de aminoácidos codificadora del ADN anteriormente mencionado puede ser modificada mediante cualquier método conocido, tal como la introducción de una variación específica del sitio empleando un oligonucleótido (Zoller, M., et al., Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500 (1982)), o la mutagénesis con una casete (Well, J., et al., Gene, 34, 315-323 (1985)).

La producción y expresión de un péptido de interés mediante el uso del ADN se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en la técnica (p. ej., Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); y Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 5990 (1983)). La producción y expresión de péptidos y proteínas fusionados se puede realizar según el método de Ohno et al. "Protein Experiment Protocol 1, function analysis, separate vol. of Cell Engineering, Experiment Protocol Series (1997), Shujun-sha" u otros métodos.

Los péptidos de interés obtenidos de este modo pueden ser aislados y purificados mediante una variedad de procedimiento de separación basándose en las propiedades físicas, químicas, y otras propiedades (p. ej., "Biochemistry Data Book II", 1175-1259, 1ª edición, 1^{er} punto, 23 Junio, 1980, Tokyo Kagaku Dojin; Biochemistry, 25 (25), 8274-8277 (1986); y Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987)). Los ejemplos de los procedimientos de separación incluyen el tratamiento de reconstrucción general; el tratamiento mediante el uso de un agente de precipitación de proteínas (precipitación por adición de sal); centrifugación; procedimiento de choque osmótico; trituración ultrasónica; ultrafiltración; mecanismos de cromatografía líquida tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); diálisis; y combinaciones de los mismos.

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención son más preferiblemente péptidos inmunogénicos que tienen la capacidad de producir un anticuerpo específico de GD3, que puede ser una forma de inmunogenicidad intensificada tal como una forma de un péptido de fusión, un péptido fusionado con una proteína portadora, para intensificar la inmunogenicidad, o una forma de péptido multi-antigénico.

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención en forma de fusión, fusionados con una proteína portadora para intensificar la inmunogenicidad, son obtenidos uniendo cualquiera de los péptidos según la presente invención con una proteína portadora rutinaria para intensificar la inmunogenicidad.

No se impone ninguna limitación concreta sobre el tipo de proteína portadora, con tal que pueda intensificar la inmunogenicidad, y se pueden emplear como proteína portadora una variedad de proteínas y péptidos que confieran una inmunogenicidad superior basándose en el efecto portador o que promuevan la respuesta inmunitaria de los organismos vivos. La proteína portadora puede ser una proteína o péptido que ejerza adicionalmente un efecto farmacéutico tal como una actividad anti-tumoral.

Cuando los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención se utilizan como profármacos, la proteína portadora se selecciona entre las proteínas y péptidos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de las proteínas portadoras preferibles incluyen la hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH) y las citocinas tales como IL-12 y GM-CSF. Los ejemplos de las proteínas y péptidos anteriormente mencionados que ejercen un efecto farmacéutico incluyen IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma, IL-1, IL-2, TNF, TGF-\beta, angiostatina, trombospondina, y endostatina.

La unión del péptido anterior y la proteína portadora se puede llevar a cabo a través del método de síntesis de péptidos mencionado anteriormente.

La unión también se puede llevar a cabo mediante el uso del ADN o los genes del mismo por medio de la tecnología recombinante mencionada anteriormente.

De este modo, se puede obtener los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención en forma fusionada.

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención pueden ser péptidos multi-antigénicos (MAP). Estos péptidos se caracterizan porque una pluralidad de los peptidomiméticos de GD3 según la presente invención son presentados sobre una molécula base.

La forma MAP de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención puede ser producida preferiblemente mediante el uso de un dendrímero que sirve como molécula base o esqueleto.

Como es sabido generalmente, un dendrímero es una molécula (p. ej., molécula esférica) de una configuración de tipo estrella o dendrítica, cuya molécula tiene ramas (unidades repetitivas) que tienen una pluralidad de grupos funcionales (véanse, p. ej., la Publicación de Patente Japonesa Kohyo Núm. 60-500295; las Solicitudes de Patente Japonesas Abiertas a la Inspección Pública (kokai) Núms. 63-99233 y 3-263431; las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4507466 y 4568737; Polymer Journal, 17, p. 117 (1985); Angewandte Chem. Int. Engl., 29, 138-175 (1990); y Macromolecules, 25, p. 3247 (1992)).

No se impone ninguna limitación concreta sobre el dendrímero empleado en la presente invención, y el dendrímero puede estar formado por un núcleo que sirve como sitio de inicio de la polimerización; una capa interna (generación) que comprende unidades repetitivas conectadas al núcleo de inicio; y una superficie externa formada por grupos funcionales conectados a las ramas.

Las características tales como las dimensiones, la morfología, y la reactividad del dendrímero pueden ser reguladas modificando el núcleo de inicio, el número de generaciones, y el tipo de unidades repetitivas empleadas en cada generación. Específicamente, las dimensiones de un dendrímero pueden ser incrementadas fácilmente incrementando el número de generaciones a incluir (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4694064).

Los ejemplos de las formas MAP típicas de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención incluyen un dendrímero que comprende un átomo de nitrógeno que sirve como sitio núcleo de inicio; un fragmento -CH_{2}CH_{2}CONH
CH_{2}CH_{2}- que sirve como unidad repetitiva (rama) que conecta con cada sitio núcleo; y una pluralidad de peptidomiméticos de GD3 conectados a los terminales más externos de las ramas del dendrímero; y un dendrímero que comprende un aminoácido (p. ej., Lys, Arg, Glu, o Asp) que sirve como sitio núcleo de inicio, sirviendo el mismo aminoácido como unidad repetitiva conectada directamente a cada sitio núcleo, y una pluralidad de peptidomiméticos de GD3 conectados a terminales de las ramas de una manera similar.

El dendrímero anteriormente mencionado que tiene un átomo de nitrógeno que sirve como sitio núcleo de inicio puede ser producido mediante un método rutinario u obtenido en forma de un producto comercial (Polysciences, Inc., 400 Vally Road, Warrington, PA, 18976 U.S.A.). El dendrímero anteriormente mencionado que tiene un aminoácido que sirve como sitio núcleo de inicio y el mismo aminoácido que sirve como unidad repetitiva conectada directamente a cada sitio núcleo de inicio puede ser producido por medio del método de síntesis de péptidos mencionado anteriormente. Además, también se pueden utilizar los productos comerciales tales como la resina Fmoc_{8}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Alko (producto de Watanabe Kagaku Kogyo).

Más específicamente, los dendrímeros mencionados anteriormente pueden ser producidos por medio de la condensación de \alpha,\omega-diaminoácidos que sirven como unidades repetitivas y una resina para sintetizar un péptido en fase sólida, donde dos grupos amino de cada aminoácido han sido protegidos por grupos protectores, que son idénticos o diferentes entre sí, en presencia o ausencia de un espaciador; y la repetición de la separación de los grupos protectores.

Las resinas empleadas típicamente para la síntesis de péptidos pueden ser empleadas como resina para sintetizar un péptido en fase sólida. Los ejemplos incluyen resina de poliestireno, resina de poliacrilamida, resina de poliestireno-polietilenglicol, estando protegidos terminalmente los grupos terminales de estas resinas con un grupo funcional tal como clorometilo, 4-(hidroximetil)fenoxi, o 4-((\alpha-2',4'-dimetoxifenil)-9-fluorenilmetoxicarbonilaminometil)-fenoxi. Se pueden emplear uno o más aminoácidos como espaciadores.

Los ejemplos de \alpha,\omega-diaminoácidos incluyen lisina, ornitina, ácido 1,4-diaminobutírico, y ácido 1,3-diaminopropiónico. La separación de los grupos protectores se puede realizar por medio del método de síntesis de péptidos anteriormente mencionado. Los ejemplos de los grupos funcionales incluyen un grupo amino, un grupo carboxilo, y un grupo hidroxilo.

El número de capas de las ramas se ajusta a 2n realizando la condensación de una unidad repetitiva y la separación de los grupos protectores n veces en total. Específicamente, el número puede caer dentro de un intervalo de 2 a 16.

Mediante la unión de los peptidomiméticos de GD3 según la presente invención a los grupos funcionales conectados a los terminales de las ramas del dendrímero, se puede obtener un MAP de interés. El procedimiento se puede realizar según el método de síntesis de péptidos anteriormente mencionado.

El MAP producido de este modo puede ser purificado mediante cromatografía o un método similar de una manera rutinaria utilizando una resina que obtenga una exclusión por tamaños en una matriz tal como Sephacryl S-300 (producto de Pharmacia).

Los peptidomiméticos de GD3 según la presente invención que se han unido a los terminales de las ramas del MAP según la presente invención no son necesariamente idénticos entre sí, y se pueden combinar arbitrariamente. Los ejemplos de las combinaciones de diferentes peptidomiméticos de GD3 incluyen una combinación de SEQ ID NOS: 1, 3, y 4; y una combinación de un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos de 15 restos aminoácido mostrada en el SEQ ID NO: 4 y un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos de nueve restos aminoácido mostrada en la Fig. 2. Semejante MAP complejo intensifica la estabilidad del mismo en la sangre y los tejidos de la diana a la cual se administra MAP, e intensifica la inmunogenicidad u otras propiedades de la molécula a la cual se ha unido MAP. De este modo, se puede promover la producción de un anticuerpo para GD3 por medio de cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención.

Cualquiera de los MAP de la presente invención puede ser transformado en un MAP complejo en el que la proteína portadora anteriormente mencionada (p. ej. polipéptido que promueve la respuesta inmunitaria tal como IL-12 o GM-CSF) para intensificar la inmunogenicidad está unida en forma de una porción del peptidomimético de GD3 de la presente invención o a un sitio núcleo de inicio. También se pueden emplear otros gangliósidos que son expresados en células tumorales distintas de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención, tales como uno o más peptidomiméticos (p. ej., GM2, GM3, GD1, GD2, GD3, y GT3), como constituyentes del MAP combinados con cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención. Los ejemplos de los MAP complejos incluyen una combinación de al menos un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos de GD3R4 mostrada en la Fig. 2 con un péptido réplica que imita GD1\alpha descrito en la Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública (kokai) Núm. 10-237099 anteriormente
mencionada.

Las formas de MAP producidas de este modo de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención muestran una excelente inmunogenicidad y, por lo tanto, pueden ejercer los efectos deseados; esto es, inducir la producción de un anticuerpo anti-GD3 o aumentar la producción del anticuerpo.

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención en forma MAP ejercen efectos deseados para una vacuna; esto es, un efecto carcinostático y un efecto inhibidor de la metástasis cancerosa. Además, se incorpora a los MAP un fármaco arbitrario tal como un fármaco que promueve la respuesta inmunitaria a los MAP y los MAP modificados de este modo pueden ser administrados. Así, los MAP son ventajosos ya que se puede promover la inducción de un anticuerpo diana, se puede incrementar adicionalmente la producción de un anticuerpo, y se pueden intensificar otros efectos.

Composición farmacéutica de la presente invención

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para seres humanos y animales que contiene, como ingrediente activo, cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención.

La composición farmacéutica es útil, como agente de diagnóstico para el cáncer basándose en el efecto de que el ingrediente activo se une a un anticuerpo para un antígeno GD3 relacionado con el cáncer, entre otros.

Preferiblemente, la composición farmacéutica de la presente invención contiene, como ingrediente activo, cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención, en forma de un péptido inmunogénico que tiene la capacidad de producir un anticuerpo específico de GD3.

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención en forma del péptido inmunogénico anterior imitan la estructura de GD3 y muestran una inmunogenicidad similar a la del GD3. De este modo, los péptidos muestran un efecto anti-tumoral basándose en la activación de los efectos citotóxicos que dependen de un complemento o de un anticuerpo inducido o producido o de la activación de las células T citotóxicas; y un efecto inhibidor de la adherencia intercelular por mediación de GD3 en las células tumorales que expresan GD3. Los péptidos son útiles para una variedad de usos farmacéuticos.

Los ejemplos de los usos de los fármacos proporcionados por la composición farmacéutica incluyen una vacuna para estimular la inducción de un anticuerpo que reconoce GD3 o intensificar la producción del anticuerpo; el uso anti-tumoral, el uso carcinostático, o el uso inhibidor de la metástasis cancerosa; y el tratamiento de los tumores o los cánceres que expresan GD3, concretamente las enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en melanoma, cáncer de intestino grueso, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer cervical, cáncer esofágico, cáncer de pulmón, y cáncer de estómago.

La composición farmacéutica de la presente invención puede ser preparada en forma de una composición que contiene una cantidad farmacéuticamente eficaz de cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención y un portador farmacéuticamnete aceptable.

Los portadores farmacéuticamente aceptables empleados en la presente invención son conocidos en la técnica y se seleccionan apropiadamente según la forma de la composición que se vaya a preparar. Cuando la composición que se va a preparar es una solución acuosa, se pueden utilizar portadores tales como agua y tampones fisiológicos sin limitación alguna, y también se pueden utilizar glicol, glicerol, y ésteres orgánicos inyectables tales como aceite de oliva.

La composición farmacéutica de la presente invención puede contener adicionalmente otro ingrediente activo y un ingrediente arbitrario para estabilizar la absorción del ingrediente activo y potenciar la absorción. Los ejemplos de los ingredientes arbitrarios incluyen hidrocarburos tales como glucosa, sacarosa, y dextrano; antioxidantes tales como ácido ascórbico y glutatión; agentes quelantes; estabilizantes tales como proteínas de bajo peso molecular y albúmina; y vehículos.

En la composición farmacéutica de la presente invención, se pueden incorporar apropiadamente aditivos arbitrarios para diseñar preparaciones de fármacos. Los ejemplos incluyen una variedad de aditivos empleados generalmente tales como agentes antisépticos, agentes de para conferir tonicidad, tampones, estabilizantes, solubilizadores, y promotores de la absorción. Los ejemplos de agentes antisépticos incluyen aquellos eficaces para hongos y bacterias tales como cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, clorhexidina, parabenos (p. ej., metilparabeno, etilparabeno), y timerosal. Los ejemplos de los agentes para conferir tonicidad incluyen alcoholes polihidroxilados tales como D-manitol, D-sorbitol, D-xilitol, glicerina, glucosa, maltosa, sacarosa, y propilenglicol; y electrolitos tales como cloruro de sodio. Los ejemplos de los estabilizadores incluyen tocoferol, butilhidroxianisol, butilhidroxitolueno, sales de ácido etilenediamino-tetraacético (EDTA), y cisteína.

Una forma de la composición farmacéutica de la presente invención es una preparación de liposomas. Esta preparación se describirá a continuación con detalle. La preparación puede ser producida haciendo que cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención sea mantenido en liposomas que comprendan, como ingrediente formador de la membrana, fosfolípidos ácidos o que comprendan, como ingredientes formadores de la membrana, fosfolípidos neutros y fosfolípidos ácidos.

No se impone ninguna limitación concreta sobre el tipo de fosfolípido neutro y fosfolípido ácido que sirve como ingredientes formadores de la membrana, y se pueden utilizar las especies de lípidos que se utilizan rutinariamente en semejantes preparaciones de liposomas solas o en combinaciones de dos o más especies.

La membrana del liposoma se forma mediante el método habitual mediante el uso de fosfolípidos ácidos como ingredientes formadores de la membrana o mediante el uso de fosfolípidos neutros y fosfolípidos ácidos combinados como ingrediente formadores de la membrana. El contenido en fosfolípidos ácidos es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100% en moles basándose en la cantidad total de ingredientes formadores de la membrana del liposoma, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 90% en moles, más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50% en moles.

Tras la preparación de la membrana del liposoma, se pueden incorporar aditivos tales como colesterol al fosfolípido, para controlar de ese modo la fluidez, facilitando de este modo la preparación de la membrana de los liposomas. La cantidad de colesterol incorporada al fosfolípido es equivalente generalmente a la del fosfolípido o menor, preferiblemente 0,5-1 equivalentes.

La proporción de fosfolípidos ácidos con respecto al ingrediente o los ingredientes activos contenidos en una dispersión de liposomas es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 equivalentes, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 equivalentes, más preferiblemente de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 20 equivalentes. La cantidad de cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención es de un pequeño% en moles a algunas decenas% en moles basándose en la especie de lípidos totales, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10% en moles, empleándose típicamente aproximadamente un 5% en moles.

La preparación, concentración, control del tamaño de partículas, y otros procedimientos del liposoma se pueden realizar mediante un método rutinario. Los diversos aditivos anteriormente mencionados pueden ser incorporados a la preparación de liposomas conforme a las necesidades.

Tras la producción del liposoma, se puede unir un ácido graso (p. ej., ácido behénico, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido mirístico, u ácido oleico), un grupo alquilo, un grupo colesterilo, o un grupo similar a cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención. La producción de una preparación de liposomas mediante el uso de semejante péptido modificado se puede realizar mediante un método rutinario (p. ej., Long Circulating Liposomes: Old drugs, New therapeutics., M. C. Woodle, G. Storm, Eds: Springer-Verlag Berlin (1998)).

No se impone ninguna limitación concreta sobre la cantidad de ingredientes activos contenida en la composición farmacéutica (preparación de fármaco) de la presente invención, y la cantidad se puede seleccionar de un amplio intervalo, con tal que sea farmacéuticamente eficaz.

Generalmente, cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención está contenido en una preparación de fármacos en una cantidad de aproximadamente 0,00001 a aproximadamente 70% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 5% en peso. No se impone ninguna limitación concreta sobre la cantidad de administración de la preparación de fármaco, y la cantidad se selecciona apropiadamente de un amplio intervalo según los efectos terapéuticos deseados, el método de administración (vía), el período de la terapia, y la edad, el sexo, y otras condiciones de los pacientes. Generalmente, la dosis diaria por paciente por peso corporal (kg) cae preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,01 \mug a aproximadamente 10 mg reducido a los ingredientes activos, preferiblemente de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 1 mg. La preparación de fármaco puede ser administrada una vez al día o de manera dividida.

La composición farmacéutica de la presente invención se emplea preferiblemente en forma de la composición de vacuna mencionada anteriormente. En el uso como composición de vacuna, la composición de la presente invención se administra preferiblemente junto con una cantidad farmacéuticamente eficaz de un coadyuvante combinado con el fin de potenciar su efecto anti-tumoral.

No se impone una limitación concreta sobre el tipo de coadyuvante, y los ejemplos incluyen coadyuvante completo de Freund, muramildipéptido, BCG, IL-12, N-acetilmuramin-L-alanil-D-isoglutamina (MDP), timosina \alpha1, y QS-21. Aunque la cantidad de coadyuvante que se va a administrar está limitada dependiendo del tipo de condiciones patológicas del ser humano y los animales causadas, tras la administración, por la reacción inmunitaria tales como malestar, dolor, y eritema de la piel; fiebre; dolor de cabeza; o dolores musculares, la dosis diaria de coadyuvante por paciente (kg) es generalmente de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 1.000 \mug, preferiblemente de aproximadamente 1 \mug a varios cientos de \mug.

La composición farmacéutica de la presente invención puede ser utilizada combinada con otros fármacos, tales como péptidos promotores de la respuesta inmunitaria y agentes quimioterapéuticos para el cáncer (agentes anti-cancerosos). La cantidad de fármaco administrado combinado se determina apropiadamente según la cantidad farmacéuticamente eficaz del fármaco. Por ejemplo, cuando se utiliza GM-CSF, la dosis diaria del mismo por peso corporal (kg) del paciente es generalmente de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 1.000 \mug, preferiblemente de aproximadamente 1 \mug a algunos cientos de \mug.

Los ejemplos de los fármacos anteriormente mencionados utilizados en la combinación incluyen agentes quimioterapéuticos que incluyen 5-fluorouracilo (5-FU), tales como agentes alquilantes, antagonistas del metabolismo, preparaciones de antibióticos anti-tumorales, preparaciones de origen vegetal anti-tumorales; y las citocinas anteriormente mencionadas que tienen una actividad anti-tumoral.

En el uso combinado, se puede incorporar un fármaco a los peptidomiméticos de GD3 en forma de MAP de la presente invención de la manera mencionada antes. Además, también se puede utilizar una sustancia de liberación de fármaco tal como un microdispositivo que tenga una microcámara que pueda alojar otros fármacos y que aloje los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención. Los ejemplos de tales sustancias de liberación de fármacos incluyen sustancias biológicas tales como liposomas, microcápsulas que tienen membranas permeables o semi-permeables, y otros microdispositivos que tienen microcámaras. Estas sustancias no son tóxicas y pueden ser biodegradables.

La unión de estas sustancias de liberación de fármacos y el peptidomimético de GD3 de la presente invención se puede realizar mediante un método rutinario (p. ej., Harlow y Lane, Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press (1988); y Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)). Mediante un método conocido (p. ej., Liposomal application to cancer therapy, Y. Namba, N. Oku, J., Bioact. Compat. Polymers, 8, 158-177 (1993)) se produce una composición farmacéutica que contiene una sustancia tal como una citocina que contiene un carcinostático y que ejerce una actividad anti-tumoral.

Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se emplea como agente de diagnóstico, cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención - el ingrediente activo - puede ser marcado para su detección. El marcaje se puede realizar mediante un método rutinario, y se pueden utilizar materiales tales como compuestos radiactivos, sustancias fluorescentes, enzimas, biotina, y medios de contraste.

Mediante el empleo de semejante agente de diagnóstico, se puede detectar un anticuerpo anti-GD3 contenido en una variedad de muestras tales como tejidos y células cancerosos y fluidos corporales tales como sangre. De este modo, el agente de diagnóstico es útil para la diagnosis del cáncer, el control de las condiciones patológicas, etc.

ADN de la presente invención

La presente invención proporciona ADN que comprende una secuencia que codifica cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención. El ADN es útil en la producción anteriormente mencionada de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención a través de un mecanismo de ingeniería genética. El ADN es utilizado adecuadamente para producir una vacuna de ADN que contiene el ADN como ingrediente activo.

Como se ha mencionado antes, el ADN que codifica los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención es preferiblemente un ADN que codifica péptidos inmunogénicos que tienen la capacidad de producir un anticuerpo específico de GD3 cuyos péptidos inmunogénicos son realizaciones de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención. Además, el ADN puede codificar las formas anteriormente mencionadas de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención.

La vacuna mencionada anteriormente comprende una composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, el ADN que codifica péptidos inmunogénicos que tienen la capacidad de producir un anticuerpo específico de GD3 cuyos péptidos inmunogénicos son realizaciones de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención o un vector de expresión recombinante que puede expresar el ADN.

La composición farmacéutica es útil para una vacuna de ADN que se dirige a células o tejidos cancerosos de mamíferos incluyendo los seres humanos, y los usos de la composición farmacéutica son similares a los descritos en relación a la composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención.

La vacuna de ADN anteriormente mencionada puede ser preparada en forma de una composición farmacéutica mediante el método acostumbrado utilizando un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la vacuna contiene una solución fisiológicamente aceptable tal como solución salina fisiológica esterilizada o solución salina fisiológica tamponada esterilizada. De un modo similar al caso de la composición farmacéutica anteriormente mencionada que contiene, como ingrediente activo, cualquiera de los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención, la composición puede ser una preparación de fármaco en liposomas y se puede utilizar combinada con un coadyuvante o un material similar.

La composición farmacéutica puede contener un fármaco arbitrario y aditivos. Los ejemplos del fármaco incluyen un fármaco tal como iones calcio que promueven la incorporación del ADN a las células, y los ejemplos de los aditivos incluyen materiales para facilitar la transfección, tales como los liposomas anteriormente mencionados, las emulsiones de fluorocarbonos, los cocleatos, los túbulos, las partículas de oro, las microesferas biodegradables, y los polímeros catiónicos.

La cantidad del ADN que puede ser expresado y es introducido en un anfitrión de vacunación o la cantidad del ARN transcrito que es introducido en un anfitrión de vacunación se selecciona de un amplio intervalo de cantidades de administración. La cantidad varía, por ejemplo, de acuerdo con la capacidad de los promotores de la transcripción y la traducción empleados. La intensidad de la respuesta inmunitaria varía de acuerdo con el nivel de expresión de proteína y la inmunogenicidad de los productos génicos expresados. Generalmente, la vacuna se administra parenteralmente en una cantidad eficaz de aproximadamente 1 ng a aproximadamente 5 mg basándose en el ADN, preferiblemente de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 2,5 mg, más preferiblemente de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 750 \mug, aún más preferiblemente de aproximadamente 10 \mug a 300 \mug. Generalmente, la vacuna se administra directamente a los tejidos musculares. Alternativamente, también se pueden emplear otros métodos de administración tales como la inyección hipodérmica, la introducción en el corion, la impresión cutánea, la administración intraperitoneal, la administración intravenosa, y la inhalación.

En general, la vacuna no es administrada de una vez, sino que se efectúa una vacunación de refuerzo una o más veces de manera que se intensifique el efecto de la vacuna mientras se controlan las condiciones de los especímenes a los que se ha administrado. Alternativamente, la vacunación de ADN puede estar seguida de un refuerzo mediante el uso de la composición farmacéutica anteriormente mencionada que comprende el peptidomimético de GD3 de la presente invención. Además, las combinaciones anteriormente mencionadas pueden potenciar la eficacia de la terapia.

No se impone ninguna limitación concreta sobre el tipo de vector de expresión recombinante que puede expresar el ADN de la vacuna de ADN anteriormente mencionada, y se pueden emplear los vectores de expresión empleados generalmente en tales tipos de vacunas de ADN y otros vectores de expresión utilizables. Estos vectores pueden ser producidos mediante un método rutinario.

Anticuerpo de la presente invención

Los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención funcionan como antígenos y producen los correspondientes anticuerpos. Específicamente, cualquiera de los péptidos que se unen a GD3 se unen a células tales como las células tumorales malignas (p. ej., células de melanoma) que expresan GD3, produciendo de ese modo un anticuerpo (anticuerpo neutralizador) que inhibe la proliferación de las células y muestra actividad para inhibir la metástasis de las células. La presente invención también proporciona semejante anticuerpo.

La confirmación de la producción de semejante anticuerpo se considera como un ensayo para el diagnóstico de que el peptidomimético de GD3 de la presente invención es un péptido inmunogénico que tiene la capacidad de producir un anticuerpo específico de GD3.

Los anticuerpos según la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales. Estos anticuerpos pueden ser producidos por medio de un mecanismo empleado rutinariamente mediante el uso del peptidomimético de GD3 como inmunógeno.

A continuación, se describirá con detalle la producción del anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal puede ser producido, por ejemplo, fusionando células de plasma (inmunocitos) de un mamífero que ha sido inmunizado con el inmunógeno anterior y células de plasmacitoma (células de mieloma) del mamífero, para de ese modo producir células fusionadas (hibridomas); seleccionando un clon que produce el anticuerpo deseado que reconoce GD3 (anticuerpo monoclonal); y cultivando el clon. El anticuerpo monoclonal es producido fundamentalmente según un método rutinario (p. ej., Hanfland, P., Chem. Phys. Lipids, 15, 105 (1975); Hanfland, P., Chem. Phys. Lipids, 10, 201 (1976); y Koscielak, J., Eur. J. Biochem., 37, 214 (1978)).

No se impone una limitación concreta sobre el mamífero que es inmunizado con el inmunógeno en el método anterior, y se utilizan preferiblemente ratones, ratas, etc. desde el punto de vista de la compatibilidad de las células de plasmacitoma que se van a fusionar. La inmunización se puede realizar mediante un método rutinario tal como la administración del inmunógeno anterior a un mamífero por medio de inyección (p. ej., intravenosa, intradérmica, hipodérmica, o intraperitoneal).

Más específicamente, cuando se utilizan ratones, preferiblemente, el inmunógeno se diluye a una concentración apropiada con un diluyente tal como solución salina fisiológica tamponada con fosfato (PBS) o solución salina y se administra, combinado con un coadyuvante rutinario opcional según las necesidades, a un espécimen animal varias veces a intervalos de 2 a 14 días en una cantidad total de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 \mug/ratón. Los ejemplos del coadyuvante que se emplea preferiblemente en el procedimiento anterior incluye vacuna de pertusis, coadyuvante completo de Freund, y ALUM. Los inmunocitos empleados preferiblemente incluyen células de bazo que han sido extirpadas aproximadamente tres días después de la administración final del
inmunógeno.

Una variedad de células de plasmacitoma de mamífero conocidas pueden ser empleadas como células contra-parentales que se van a fusionar con los inmunocitos anteriores. La fusión se puede realizar mediante cualquier método conocido, tal como el método descrito por Milstein et al. (Method in Enzymology, 73, 3 (1981)). El aislamiento y la clonación de los hibridomas producidos se pueden realizar mediante métodos rutinarios.

Las cepas productoras de anticuerpos diana pueden ser recobradas mediante una variedad de métodos empleados generalmente para detectar anticuerpos ("Hybridoma Method and Monoclonal Antibody", expedido por R&D Planning, 30-53, 5 Marzo, 1982). Los ejemplos de los métodos incluyen el método ELISA (Engvall, E., Meth. Enzymol., 70, 419-439 (1980)), el método en placa, el método de la aplicación, el método de la aglutinación, el método de Ochterlony, y el radioinmunoanálisis (RIA). Tras la recuperación, se pueden emplear el inmunógeno anteriormente mencionado y GD3.

Los hibridomas producidos de este modo que producen el anticuerpo monoclonal deseado que reconoce GD3 pueden ser subcultivados en un medio rutinario y conservados durante un largo período de tiempo en nitrógeno líquido. Los ejemplos de los métodos para recoger un anticuerpo monoclonal de los hibridomas incluyen un método que comprende cultivar los hibridomas de una manera rutinaria y recoger el anticuerpo del sobrenadante de cultivo; y un método que comprende administrar los hibridomas a un mamífero compatible con los hibridomas para la proliferación de los hibridomas y recoger un anticuerpo de la ascitis. El primer método es adecuado para producir un anticuerpo de gran pureza, mientras el último método es adecuado para la producción en masa de un anticuerpo.

El sobrenadante de cultivo y la ascitis de ratón obtenidos mediante los métodos anteriores y que contienen hibridomas que producen anticuerpos pueden ser empleados como líquidos de anticuerpo brutos. Alternativamente, los líquidos brutos pueden ser purificados mediante un método rutinario; esto es, un método tal como el fraccionamiento con sulfato de amonio, la precipitación por adición de sal, la filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico, o la cromatografía de afinidad tal como la cromatografía en columna con proteína A, para rendir de ese modo anticuerpo purificado.

Ejemplos

La presente invención se describirá a continuación con más detalle por medio de ejemplos, que no se deben considerar limitantes de la invención.

En la presente memoria se emplean las siguientes abreviaturas.

TBS: Solución salina tamponada con tris fosfato

TC: tetraciclina

KM: kanamicina

PEG/NaCl: polietilenglicol/cloruro de sodio

TFA: ácido trifluoroacético

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Ejemplo 1

Identificación de peptidomimético de GD3 (1) Preparación de bibliotecas de presentación en fagos

Según el procedimiento descrito por Nishi T., Saya H., et al. (FEBS Letter, 399, 237-240 (1996)), se insertaron fragmentos de ADN al azar que codificaban péptidos de 15 restos aminoácido al azar en el gen de la proteína de la envuelta del fago PIII, para de ese modo preparar bibliotecas de presentación en fagos de interés que contenían genes capaces de expresar péptidos de 15 restos aminoácido al azar sobre la superficie de la cubierta de los respectivos
fagos.

Puesto que los fagos contienen un gen resistente TC, E. coli infectada con los fagos es resistente a TC. Las bibliotecas de fagos construidas de este modo fueron almacenadas en una solución de TBS que contenía NaN_{3} al 0,02%.

Los rasgos característicos de las bibliotecas de presentación en fagos anteriormente mencionadas son descritos por Scott, J. K. and Smith G. P. (Science, 249, 386-390 (1990)).

(2) Inmovilización del anticuerpo monoclonal anti-GD3

El anticuerpo anti-GD3 empleado es un anticuerpo monoclonal anti-GD3 4F6 (referido en adelante como anticuerpo de GD3 4F6). El anticuerpo de GD3 4F6 es un anticuerpo monoclonal de ratón (IgG) contra GD3 (Thomas C. P., et al., Glycoconj. J., 13 (3), 377-384 (1996)), que es proporcionado amablemente por el Dr. Jacques Portoukalian (INSERM, France).

Una suspensión de proteína A Sepharose recombinante (50 \muL) (Protein A Sepharose Fast Flow; producto de Pharmacia Biotech K.K., Código Núm: 17-1279-01, Lote Núm: 237393) fue transferida a un tubo Eppendorf de 0,5 mL, y a este se añadió TBS (400 \muL). Con posterioridad, se añadió el anticuerpo de GD3 4F6 (1 mL), y la mezcla se dejó reaccionar durante la noche a 4°C con agitación cuidadosa. Una vez completada la reacción, la mezcla se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante, se añadió TBS (0,5 mL) al residuo, y la mezcla se agitó cuidadosamente. La mezcla resultante se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL. A esto se añadió TBS (0,5 mL), la mezcla se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos, y el sobrenadante se descartó. Con posterioridad, se añadió TBS (1 mL) al residuo, la mezcla se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos, y el sobrenadante se separó. Se añadió TBS (100 \muL) al residuo, para producir de ese modo una suspensión; esto es, una suspensión de proteína A Sepharose (100 \muL) unida a anticuerpo de GD3 4F6, que se almacenó a 4°C hasta su uso.

Una alícuota de la suspensión de proteína A Sepharose recombinante así obtenida (50 \muL) fue transferida a un tubo Eppendorf de 1,5 mL, y a esto se añadió TBS (900 \muL). Con posterioridad, se añadieron 12 mg/mL suero patrón con inmunoglobulina de ratón (Núm. de Código: RS10-101-2; producto de Bethyl; adquirido de Cosmo Bio Co., Ltd.) en TBS (volumen total de la solución resultante: 100 \muL), y la mezcla se dejó reaccionar durante la noche a 4ºC con agitación cuidadosa. (La proteína A se hizo reaccionar con una cantidad excesiva de IgG con el fin de minimizar la cantidad de proteína A que permanecía sin reaccionar). Una vez completada la reacción, la mezcla se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se separó, se añadió TBS (1 mL) al residuo, y la mezcla se agitó cuidadosamente. La mezcla resultante se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5-mL. La mezcla se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos, y el sobrenadante se separó. Después de repetir este procedimiento tres veces, se añadió TBS (100 \muL) al residuo, para preparar de ese modo una suspensión; esto es, una suspensión de proteína A Sepharose recombinante (100 \muL) unida a IgG de ratón (250 \mug), que se almacenó a 4ºC hasta su uso.

(3) Preparación de E. coli

La E. coli empleada como anfitriona del fago es E. coli K91KAN (cepa resistente a la kanamicina; amablemente proporcionada por el Profesor SAYA, Hideyuki, Department of Tumor Genetics and Biology of Kumammoto University).

Mediante la utilización de un asa de platino desechable, se inoculó E. coli K91KAN en una placa NZY que contenía 100 \mug/mL de kanamicina (producto de Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) para la incubación a 37ºC durante la noche. Al día siguiente, la placa se separó de la incubadora y se almacenó a 4ºC hasta su uso.

El día antes de que E. coli fuera infectada con los fagos, se recogió una pequeña cantidad de la E. coli que se había almacenado a 4ºC en la placa utilizando un asa de platino, y se inoculó en medio NZY (5 mL) que contenía 100 \mug/mL de kanamicina, seguido de cultivo con sacudimiento a 200 rpm a 37ºC durante la noche (pre-cultivo). Al día siguiente, la mezcla cultivada (100 \muL) fue transferida a un medio NZY reciente (10 mL), seguido de cultivo con sacudimiento a 37ºC durante 4 horas. Después de eso, con el fin de que las células desarrollen cilios, se detuvo el sacudimiento, y se dejó que las células reposaran durante 30 minutos. Las células de E. coli preparadas de este modo se infectaron con fagos como se describe más abajo.

El medio NZY anteriormente mencionado se obtuvo por medio de las siguientes etapas: Se disolvieron NZ amina A (producto de Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.; Núm. de Código: 541-00241) (10 g), extracción de levadura cervecera (nombre de fábrica: EBIOS, producto de Asahi Breweries, Ltd.) (5 g), y NaCl (5 g) en agua destilada (1 L); a esto se añadió NaOH 5 N (1 mL); el pH de la mezcla se ajustó a 7,5; la mezcla se esterilizó en un autoclave; y la mezcla resultante se almacenó a la temperatura ambiente hasta su uso.

(4) Amplificación del fago

Las células anfitrionas de E. coli fueron infectadas con los fagos preparados en el procedimiento descrito en el apartado (1).

Brevemente, se colocaron E. coli K91KAN (10 \muL) y una preparación de fago diluida (10 \muL) en un tubo de centrífuga de 15 mL, y la mezcla se dejó reaccionar a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió medio NZY (que contenía 0,2 \mug/mL de TC) (1 mL) que se había calentado de antemano a 37ºC a la mezcla, seguido de cultivo con sacudimiento a 2.000 rpm a 37°C durante 40 minutos. Se inoculó una alícuota (200 \muL) de la mezcla resultante en una placa con NZY (que contenía 20 \mug/mL de TC y 100 \mug/mL de KM) para la incubación a 37ºC durante la noche. Al día siguiente, se contó el número de colonias.

Se preparó un control negativo añadiendo E. coli K91KAN (10 \muL) al líquido de dilución (10 \muL). Puesto que esta mezcla permanecía sensible a TC, no se produjo la amplificación de los fagos de la placa con NZY que contenía TC.

La amplificación de los fagos que fueron recuperados mediante bioinmunopurificación ("biopanning"), que se describirá en la presente memoria más adelante, se realizó de la siguiente manera.

La cantidad completa de la solución de fago, exceptuando la cantidad (2 \muL) que se iba a utilizar para la medición del título, se colocó en un tubo Eppendorf de 1,5-mL, y a esto se añadió la E. coli K91KAN (100 \muL) preparada antes, seguido de reacción a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Una vez completada la reacción, se añadió toda la cantidad de la mezcla a un medio con NZY con suplemento de TC (20 mL; la cantidad de TC: 0,2 \mug/mL) que se había calentado de antemano a 37ºC en un tubo de centrífuga de de 50 mL, seguido de cultivo con sacudimiento a 200 rpm a 37ºC durante 40 minutos. Se añadieron 20 mg/mL de TC (20 \muL), y la mezcla se sometió de nuevo a cultivo con sacudimiento a 37°C durante la noche. Al día siguiente, la mezcla resultante se centrifugó a 3.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo de centrífuga Oakridge y se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos, para de ese modo separa completamente las células de E. coli. El sobrenadante se transfirió a otro tubo de centrífuga Oakridge, y se añadió PEG/NaCl (3 mL) a esto, seguido de agitación. La mezcla resultante se dejó estar a 4ºC durante 4 horas o más.

Con posterioridad, se realizó la centrifugación a 12.000 rpm durante 10 minutos para ocasionar la sedimentación de los fagos amplificados. El sobrenadante se separó, y el sedimento de fagos se suspendió en TBS (1 mL). La suspensión se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5-mL Eppendorf y se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos, para separar de ese modo las sustancias insolubles. El sobrenadante se transfirió a otro tubo Eppendorf, a esto se añadió PEG/NaCl (150 \muL), y la mezcla se agitó cuidadosamente y se dejó estar a 4°C durante 1 hora o más.

La mezcla se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos, para permitir de este modo que precipitaran los fagos. El sobrenadante se separó, y el sedimento de fagos precipitados se resuspendió en TBS (200 \muL) que contenía 0,02% de NaN_{3}. La suspensión se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos, para sedimentar de ese modo las sustancias insolubles. El sedimento se transfirió a un tubo Eppendorf de 500 \muL para su almacenamiento a 4ºC, y se empleó como fuente de "fago amplificado" en cada ronda de inmunopurificación.

Los fagos fueron titulados de la siguiente manera.

Para la titulación de los fagos recuperados en cada ronda, se utilizaron preparaciones de fagos diluidas 10^{2}, 10^{3}, y 10^{4}, mientras para la titulación de los fagos amplificados, se utilizaron preparaciones diluidas 10^{7}, 10^{8}, y 10^{9}. Se empleó TBS/gelatina (producto de Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) como solución de dilución, y la dilución se realizó según el siguiente esquema de dilución.

dilución \times10^{2}: solución de fago (2 \muL) + TBS/gelatina (198 \muL)

dilución \times10^{3}: solución de fago diluida 10^{2} (10 \muL) + TBS/gelatina (90 \muL)

dilución \times10^{4}: solución de fago diluida 10^{2} (2 \muL) + TBS/gelatina (198 \muL)

dilución \times10^{6}: solución de fago diluida 10^{4} (2 \muL) + TBS/gelatina (198 \muL)

dilución \times10^{7}: solución de fago diluida 10^{6} (10 \muL) + TBS/gelatina (90 \muL)

dilución \times10^{8}: solución de fago diluida 10^{6} (2 \muL) + TBS/gelatina (198 \muL)

dilución \times10^{9}: solución de fago diluida 10^{8} (10 \muL) + TBS/gelatina (90 \muL)

El título de fago se calculó a partir de la siguiente ecuación.

\text{Título/mL} = colonia\ x\ 1 . 020\ (\mu L)/200\ (\mu L)\ x\ 1 . 000\ (\mu L)/10\ (\mu L)\ x\ factor\ de\ dilución

El título total de los fagos recuperados se calculó multiplicando el valor anterior por el volumen total (mL) de la solución de fago recuperada.

Puesto que los fagos empleados para la reacción tienen un título de 6,2 x 10^{10} la tasa de recuperación (%) se define como el "título total de fagos recuperados/6,2 x 10^{10}" X 100.

(5) Escrutinio (bioinmunopurificación) para los clones de fagos que están unidos a un anticuerpo anti-GD3

En el escrutinio (bioinmunopurificación) de los clones de fagos que expresan péptidos capaces de unirse al anticuerpo de GD3 4F6 con especificidad, con el fin de escrutar eficazmente los fagos capaces de unirse a la región Fab del anticuerpo de GD3 4F6, se hizo reaccionar el anticuerpo de GD3 4F6 con la biblioteca de fagos de la cual se habían excluido de antemano los fagos que se unen a IgG de ratón y/o proteína A Sepharose recombinante.

Específicamente, la bioinmunopurificación se realizó mediante el siguiente procedimiento.

Ronda 1

Se disolvieron IgG de ratón normalizada - proteína A Sepharose recombinante (10 \muL) y A Sepharose recombinante (50 \muL) en PBS (340 \muL), y a esto se añadió una biblioteca de fagos (10 \muL) (título 6,2 \times 10^{10}). La mezcla se dejó reaccionar en un tubo Eppendorf de 500 \muL a 4ºC durante la noche, seguido de centrifugación a 30.000 rpm durante 3 minutos, para separar de ese modo las partículas de fago unidas a IgG de ratón normalizada y/o proteína A Sepharose recombinante.

El sobrenadante (380 \muL) y el anticuerpo para GD3 4F6 - proteína A recombinante Sepharose (50 \muL) preparado en la etapa (2) anterior se transfirieron a un tubo Eppendorf de 500 \muL y se dejaron reaccionar a 4ºC durante 5 horas, seguido de centrifugación a 3.000 rpm durante 3 minutos.

El sobrenadante se descartó, y se añadió PBS (0,5 mL) al sedimento, para preparar de ese modo una suspensión. La suspensión se transfirió después a un tubo Eppendorf de 1,5 mL, seguido de centrifugación a 3.000 rpm durante 3 minutos. Después de repetir dos veces este procedimiento, se descartó el sobrenadante, y se añadió PBS (500 \muL) al sedimento, con lo que se obtuvo una suspensión. La suspensión se transfirió a un tubo Eppendorf de 500 \muL, seguido de centrifugación a 3.000 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se descartó, y se añadió tampón de extracción (50 \muL) al sedimento, y la mezcla se dejó estar a la temperatura ambiente durante 15 minutos con agitación suave realizada cada 3 minutos, seguido de centrifugación a 3.000 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se transfirió a un concentrador (CentriconTM 30 Concentrator: producto de Amicon Corporation) y se neutralizó con Tris 1 M (pH 9,1) (75 \muL), y después se añadió a esto TBS (2 mL).

La mezcla se centrifugó a 5.000 rpm durante 20 minutos, se añadió TBS (2 mL), y la centrifugación se realizó a 5.000 rpm durante 20 minutos.

La solución de fago que quedaba en el filtro se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL. El filtro se lavó con TBS (50 \muL), y los lavados se añadieron al tubo Eppendorf (volumen total: 470 \muL). Los fagos obtenidos fueron amplificados (4).

Ronda 2

Los fagos amplificados (100 \muL) preparados en la Ronda 1 e IgG de ratón normalizada - proteína A Sepharose recombinante (10 \muL; 25 \mug) se disolvieron en PBS (350 \muL), y la mezcla se transfirió a un tubo Eppendorf de 500 \muL para la reacción a 4ºC durante la noche. Con posterioridad, se añadió proteína A Sepharose recombinante (50 \muL), y la mezcla se dejó reaccionar a 4ºC durante la noche y después se centrifugó a 3.000 rpm durante 3 minutos, rindiendo un sobrenadante (500 \muL).

El sobrenadante (500 \muL) se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL, a esto se añadió una solución de anticuerpo anti-GD3 (1 mL), y la mezcla se dejó reaccionar a 4ºC durante la noche, seguido de separación centrífuga a 3.000 rpm durante 3 minutos.

Con posterioridad, se añadió a esto proteína A Sepharose recombinante (50 \muL), y la mezcla se dejó reaccionar a 4ºC durante 3 horas, después se centrifugó a 3.000 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se descartó, y se añadió TBS (1 mL) al sedimento, para preparar de ese modo una suspensión. La suspensión se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y después se centrifugó a 3.000 rpm durante 3 minutos. Después de repetir este procedimiento dos veces, el sobrenadante se descartó, se añadió al sedimento tampón de extracción (50 \muL), y la mezcla se dejó estar a la temperatura ambiente durante 15 minutos con agitación suave realizada cada 3 minutos, seguido de centrifugación a 3.000 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se transfirió a un concentrador y se neutralizó con Tris 1 M (pH 9,1) (75 \muL), y después se añadió a esto TBS (2 mL). La mezcla se centrifugó a 5.000 rpm durante 20 minutos, se añadió TBS (2 mL), y la centrifugación se realizó a 5.000 rpm durante 20 minutos. La solución de fago que quedaba en el filtro del Centricon se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL. El filtro se lavó con TBS (50 \muL), y los lavados se añadieron al tubo Eppendorf (volumen total: 230 \muL). Los fagos obtenidos fueron
amplificados.

Ronda 3

Se repitió el procedimiento general empleado en la Ronda 1 utilizando los fagos amplificados (100 \muL) preparados en la Ronda 2. De este modo, por medio de la reacción de los fagos con la solución de anticuerpo anti-GD3, se obtuvieron fagos amplificados. Los fagos obtenidos de este modo se centrifugaron utilizando un Centricon, por medio de lo cual se recuperó el eluato en un volumen total de 110 \muL.

Los resultados de las 3 rondas anteriores de inmunopurificación (tasas de recuperación de clones de fagos de las respectivas rondas) se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1

1

En la Tabla 1, "fd tipo salvaje" hace referencia a la cepa de fago de tipo salvaje de prototipo no peptídico que está siendo insertada - que fue proporcionada para construir bibliotecas de fagos en el Ejemplo 1. Los fagos prototipo fueron preparados mediante el siguiente procedimiento y empleados en el presente ensayo. Brevemente, los vectores de fago formados de moléculas de ADN de los fagos que constituyen la biblioteca de péptidos de fagos fueron escindidos para la separación de los sitios de inserción de los péptidos, y los fragmentos de vectores restantes fueron ligados. Los vectores reconstruidos de este modo fueron utilizados para transformar E. coli JM109 (adquirida de Takara), los transformantes resultantes fueron cultivados con medio NZY durante la noche, y los fagos amplificados fueron recuperados.

La secuenciación de los péptidos expresados por los clones de fagos preparados por medio de las 3 rondas de inmunopurificación descritas antes se realizó como sigue.

A partir de cada una de las placas obtenidas mediante la medición del título descrita antes realizada después de completar las 3 rondas de bioinmunopurificación, se seleccionaron al azar 32 colonias arbitrarias, se inocularon en una nueva placa con NZY, y se incubaron a 37ºC durante la noche. La placa resultante, que servía como placa maestra, se almacenó a 4ºC.

En un medio NZY (20 mL, que contenía 20 \mug/ml de TC) dispuesto en un tubo de centrífuga de 50-mL, se suspendió cada colonia de la placa maestra, seguido de cultivo con sacudimiento a 200 rpm a 37ºC durante la
noche.

El cultivo se sometió a separación centrífuga a 3.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo de centrífuga Oakridge y se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos, para separar de ese modo las células de E. coli. El sobrenadante se transfirió a otro tubo de centrífuga Oakridge, y a esto se añadió PEG6000/NaCl (3 mL; PEG = polietilenglicol), seguido de agitación cuidadosa. La mezcla resultante se dejó estar a 4ºC durante 4
horas.

Con posterioridad, se realizó la centrifugación a 12.000 rpm durante 10 minutos para ocasionar la sedimentación de los fagos. El sobrenadante se separó, y el sedimento de fagos se suspendió en TBS (1 mL). La suspensión se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos, para separar de ese modo las sustancias insolubles. El sobrenadante se transfirió a otro tubo Eppendorf, a esto se añadió PEG/NaCl (150 \muL), y la mezcla se agitó cuidadosamente y se dejó estar a 4ºC durante 1 hora.

La mezcla se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos, para permitir de ese modo que los fagos precipitaran. El sobrenadante se separó, y el sedimento de fagos precipitados se resuspendió en TBS (200 \muL). La suspensión se centrifugó a 15.000 rpm durante 10 minutos, para sedimentar de ese modo las sustancias insolubles. El sedimento se transfirió a un tubo Eppendorf de 0,5 mL para el almacenamiento de los clones de fagos a 4°C.

La extracción de ADN de los clones de fagos así obtenidos se realizó de la siguiente manera. Los clones de fagos, TBS, y fenol saturado con TE (producido por Nippon Gene Co., Ltd.) se colocaron en un tubo Eppendorf de 1,5 mL en cantidades de 100 \muL, 100 \muL, y 200 \muL, respectivamente, y la mezcla se agitó violentamente durante 10 minutos, después se sometió a separación centrífuga a 15.000 rpm durante 10 minutos. Con posterioridad, se añadieron fenol saturado con TE (200 \muL) y cloroformo (200 \muL) al sobrenadante (fase acuosa; 200 \muL), y la mezcla se agitó violentamente durante 10 minutos, seguido de separación centrífuga a 15.000 rpm durante 10 minutos. Se añadieron TE (250 \muL), acetato de sodio 3 M (40 \muL), 20 mg/mL de glicógeno (producto of Boehringer Mannheim; 1 \muL), y etanol (1 ml) al sobrenadante (fase acuosa; 150 \muL), y la mezcla se dejó estar a -20ºC durante una hora en un tubo Eppendorf de 1,5 mL, seguido de separación centrífuga a 15.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se descartó, se añadió suavemente etanol del 80% (-20°C; 1 mL) al residuo, y las sales restantes se separaron por medio de separación centrífuga a 15.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se descartó, se evaporó la humedad del tubo, y el ADN que precipitó se disolvió en agua destilada esterilizada (10 \muL) para el almacenamiento
4°C.

Los ADN de fagos obtenidos de este modo se sometieron a secuenciación de aminoácidos de los péptidos.

(6) Secuenciación de aminoácidos de los péptidos seleccionados

La secuencia de aminoácidos de un péptido codificado por el ADN del fago fue determinada mediante el método de terminación con colorante utilizando un kit de secuenciación de ADN (producido por Perkin Elmer, Código; 402079, Lote; A6L015) según el manual anexado al kit. La secuencia de ADN del cebador, mostrada como SEQ ID NO: 10, fue sintetizada con un sintetizador de ADN automático.

La reacción de elongación para el ADN se realizó mediante el uso de un ciclador térmico (Modelo 9600, Perkin Elmer, 25 ciclos, consistiendo un ciclo en 96°C durante 10 segundos, 50°C durante 5 segundos, y 60°C durante 4 minutos). Para secuenciar el ADN, se empleó una secuenciador de ADN (ABIPRISMTM 377, producto de ABI).

De los 32 clones, las secuencias de ADN de 27 clones fueron determinadas con éxito y clasificadas en 4 tipos. Estos 4 tipos de péptidos, tomados como peptidomiméticos de GD3, fueron denominados "GD3R1", "GD3R2", "GD3R3", y "GD3R4" (desde la aparición más alta a la más baja).

Las secuencias de aminoácidos de las cuatro especies de peptidomiméticos de GD3 determinadas de este modo están representadas por los SEQ ID NO: 1, 2, 3, y 4, y las secuencias de ADN que codifican estas 4 especies de aminoácidos están representadas por los SEQ ID NO: 5, 6, 7, y 8.

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Ejemplo 2

Afinidad de unión del peptidomimético de GD3 y el anticuerpo anti-GD3 (ELISA)

Se añadió una solución de NaHCO_{3} 0,1 M que contenía cada uno de los clones de fagos obtenidos en el Ejemplo 1 (título 10^{11}, 10^{10}, o 10^{9}/100 \muL) a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos (producto de Nunc), para la inmovilización de los clones de fagos a la temperatura ambiente durante una hora. El sobrenadante se separó, después los pocillos se sometieron a bloqueo mediante el uso de una solución de bloqueo (400 mL; TBS que contiene 1% de BSA, 0,1% de leche desnatada, y 0,02% de Tween 20; pH 7,5) a 37°C durante cuatro horas.

El sobrenadante se separó, después se añadió el anticuerpo para GD3 4F6 (100 \muL), que servía como anticuerpo primario, a cada pocillo para la reacción con sacudimiento a la temperatura ambiente durante dos horas. Una vez completada la reacción, el sobrenadante se separó, después se lavaron los pocillos seis veces con una solución de lavado (400 \muL para cada pocillo, TBS que contenía 0,05% de Tween 20). Con posterioridad, se añadió a los pocillos un anticuerpo secundario (anti-IgG-HRP de ratón, producto de Santa Cruz Biotechnology, Núm. de catálogo SC-2031, Lote. Núm. C089) que se diluyó 5.000 veces utilizando una solución de bloqueo preparada de antemano a los pocillos (100 \muL a cada pocillo) para la reacción con sacudimiento a la temperatura ambiente durante una hora. Una vez completada la reacción, los pocillos se lavaron cuatro veces con una solución de lavado (400 \muL para cada pocillo), después se añadió un reactivo de detección (TMB Microwell; producto de KPL, Núm. Catálogo 50-76-04, Lote Núm. WF075) a los pocillos (100 \muL a cada pocillo), y se dejó estar la mezcla durante cinco minutos a la temperatura ambiente.

Se añadió ácido clorhídrico (100 \muL) a cada pocillo para detener la reacción. La absorbancia de cada pocillo se midió a 450 nm y a 620 nm, y se calculó "DO450 - DO620". Se utilizó un Multiscan (producto de Labosystems) en la medición de la absorbancia. Un pocillo en el que no se habían inmovilizado fagos sirvió como blanco, y se determinó la absorbancia de cada pocillo restando el valor del blanco de valor "medido".

Los resultados se muestran en la Fig. 1.

En la Fig. 1 se muestra que GDR4 muestra la afinidad de unión más fuerte por el anticuerpo de GD3 4F6.

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Ejemplo 3

Síntesis del peptidomimético de GD3 y afinidad de unión por el anticuerpo anti-GD3 (1) Síntesis del peptidomimético de GD3

Las cuatro especies de peptidomimético de GD3 obtenidas en el Ejemplo 1 fueron sintetizadas mediante el siguiente método.

Brevemente, mediante el uso de un sintetizador de péptidos automático (ACT357, producto de Advanced Chemtech) junto con el soporte lógico de la misma compañía, se realizó la síntesis en fase sólida de los respectivos sólidos a través de Fmoc/NMP, método de HOBt (Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo, NMP: N-metilpirrolidona, HOBt: 1-hidroxibenzotriazol).

Según el programa de síntesis, se diseñaron los péptidos libres del extremo C (OH) con referencia a las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 1-4. Específicamente, a 0,25 mmoles de "resina Fmoc - aminoácido - Alko", que correspondía al aminoácido del extremo C del péptido de interés, se añadieron sucesivamente Fmoc - aminoácidos correspondientes al segundo aminoácido (para el extremo C) y a los siguientes aminoácidos para la elongación de la cadena.

Asimismo, se diseñaron como sigue péptidos que tenían cada uno una amida C-terminal. Según el programa de síntesis, "Fmoc - aminoácido", que correspondía al aminoácido del extremo C del péptido de interés, era añadido a 0,25 mmoles de "Fmoc - NH - SAL resina", para inducir de ese modo la reacción entre ellos, y con posterioridad se hizo que se anclaran sucesivamente, Fmoc - aminoácidos que correspondían al segundo aminoácido (para el extremo C) y a los aminoácidos posteriores por medio de una reacción de condensación para la elongación de la
cadena.

Una vez completada la reacción, el grupo Fmoc N-terminal fue desprotegido según el programa.

Cada una de las resinas peptídicas obtenidas de este modo fue recogida en una minicolumna (producto de Assist) hecha de polipropileno, seguido de lavado con metanol y secado a vacío. Mediante el siguiente procedimiento, el péptido se escindió de la resina, y también se separaron los grupos protectores de las cadenas laterales del péptido. Brevemente, se añadió Reactivo K (82,5% de TFA, 5% de fenol, 5% de H_{2}O, 5% de tioanisol, y 2,5% de etanoditiol) (2 mL) a la resina, y la reacción se dejó continuar en la minicolumna durante 60 minutos.

Con posterioridad, la mezcla de reacción se añadió gota a gota a éter dietílico frío (8 mL), para de ese modo detener la reacción y permitir que el péptido precipite. Después de eso, la mezcla de la minicolumna se lavó con TFA (2 mL), se añadió éter dietílico frío (5 mL) a la mezcla, la mezcla se centrifugó, y el sedimento precipitado se lavó con éter dietílico (10 mL) cuatro veces. Después el péptido se solubilizó con acetonitrilo al 50% (aproximadamente 5 mL) y se liofilizó. Este procedimiento (solubilización y liofilización) se repitió dos veces, con lo que se obtuvo un producto liofilizado bruto de interés.

El producto liofilizado se fraccionó por medio de una cromatografía de líquidos de alta resolución en fase reversa (HPLC) empleando una Octadecyl Column (20 (diámetro) \times 250 mm, producto de YMC), para aislar de ese modo el péptido de interés.

Las resinas y el derivado de aminoácido que se utilizaron en el procedimiento descrito antes son productos de Watanabe.

Los péptidos respectivos aislados de este modo fueron identificados mediante secuenciación de aminoácidos y medición del peso molecular por espectrometría de masas.

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(2) Síntesis de péptido multi-antigénico

Los péptidos multi-antigénicos de los peptidomiméticos de GD3 obtenidos antes (MAP) fueron sintetizados mediante el uso de la resina Fmoc - MAP -Alko (producto de Watanabe).

La reacción entre la resina Fmoc - MAP - Alko (Fmoc_{8} - Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla - Alko resina) y cada uno de los peptidomiméticos de GD3 continuó de la misma manera que en el método de síntesis en fase sólida descrito
antes.

Las estructuras de los MAP obtenidos de este modo, mostradas mediante una representación de una letra de los restos aminoácido, son las siguientes.

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MAP del SEQ ID NO: 1 péptido:

: (LAPPRPRSELVFLSV)_{8}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla

MAP del SEQ ID NO: 2 péptido:

: (PHFDSLLYPCELLGC)_{8}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla

MAP del SEQ ID NO: 3 péptido:

: (GLAPPDYAERFFLLS)_{8}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla

MAP del SEQ ID NO: 4 péptido:

: (RHAYRSMAEWGFLYS)_{8}-Lys_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla

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(3) Afinidad de unión al anticuerpo anti-GD3

Se añadió una solución de NaHCO_{3} 0,1 M que contenía un peptidomimético de GD3 de la invención de la forma MAP anterior (100 ng/100 \muL) a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos, para la inmovilización a la temperatura ambiente durante una hora.

Con posterioridad, de una manera similar al método ELISA empleado en el Ejemplo 2, se investigó la afinidad de unión del peptidomimético de GD3 al anticuerpo de GD3 4F6.

Se utilizaron anticuerpo anti-GD2 y anticuerpo anti-OAcGD3 (Cerato, E., et al., Hybridoma, 16(4), 307-316 (1997)) como controles (estos anticuerpos fueron amablemente proporcionados por el Dr. Portoukalian).

Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 2.

TABLA 2

2

Como resulta evidente a partir de la Tabla 2, entre otros peptidomiméticos, GD3R3 y GD3R4 muestran una unión más fuerte al anticuerpo anti-GD3. Además, se encontró que todos los péptidos se unen al anticuerpo anti-GD3 más fuerte que a los anticuerpos de control.

(4) Síntesis del péptido de fusión

Los péptidos de fusión - fusionados con KLH - fueron preparados utilizando cada uno de los peptidomiméticos de GD3 obtenidos antes o un MAP de los mismos.

Brevemente, cada uno de los péptidos sintetizados antes, o un MAP de los mismos, y la KLH fueron añadidos a una solución de PBS (pH 7,4) que contenía 0,25% de glutaraldehído a una razón en peso de 1:10, y la mezcla se dejó reaccionar durante la noche a la temperatura ambiente, para sintetizar de ese modo un péptido de fusión.

Ejemplo 4

Inmunización mediante el uso de peptidomiméticos de GD3 (1) Inmunización

Se disolvieron cuatro especies de peptidomimético de GD3 (MAP) obtenidos en el Ejemplo 3 (2) en PBS con el fin de lograr una concentración de 200 \mug/mL. La solución se añadió a coadyuvante completo de Freund (o incompleto) (1:1, en volumen), para preparar de ese una emulsión.

Se inmunizaron ocho ratones (C57BL/6) mediante administración subcutánea de la emulsión anterior (0,2 mL/
ratón, en una administración, 5 \mug de péptido por ratón). La administración se realizó cada dos semanas (para la segunda administración y administraciones siguientes, se utilizó coadyuvante incompleto de Freund). Al cabo de una semana de las respectivas administraciones, se recogió sangre de la cola de cada ratón, para producir de ese modo antisuero.

El antisuero obtenido directamente después de la primera administración será referido como "1º", el obtenido después de la segunda administración será referido como "2º", y el obtenido después de la tercera administración será referido como "3º".

(2) Medición del título de antisuero (ELISA)

El título, frente a GD3, de cada una de las muestras de antisuero (3 \times 8 ratones = 24 muestras) obtenido en el apartado (1) anterior fue medido por medio de ELISA como se describe más abajo.

El GD3 empleado en el ensayo fue proporcionado amablemente por el Dr. Portoukalian, y era un producto extraído de melanoma y purificado (J. Portoukalian et al., Int. Cancer, 49, 893-899 (1991)). El GD3 fue purificado por medio de HPLC empleando una columna de gel de sílice (Si60) (producto de Merck, U.S.A.) en un cromatograma (Hitachi L-6200). El GD3 que se había adsorbido en la columna se hizo eluir con una mezcla de isopropanol/hexano/agua purificada (con un gradiente de 55/35/12 a 55/30/15 en volumen). La velocidad de flujo de la columna era de 4 mL por minuto.

El GD3 purificado obtenido de este modo se disolvió en metanol, por medio de lo cual se preparó una solución de GD3 que tenía una concentración de 10 \mug/mL. La solución de GD3 se añadió a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos en cantidades de 10 \muL por pocillo (que corresponde a 100 ng de GD3 por pocillo), y se evaporó el metanol. Con posterioridad, se añadió una solución de bloqueo (TBS suplementado con 1% de BSA) a los pocillos en cantidades de 50 \muL por pocillo, para bloquear a 37ºC durante 4 horas.

El sobrenadante se descartó. Cada una de las muestras de antisuero obtenidas en el apartado (1) anterior fue diluida 100 veces, 400 veces, o 1.600 veces con la solución de bloqueo mencionada antes. El antisuero diluido (50 \muL) se añadió a cada pocillo para que reaccionaran a 4ºC durante la noche. El pocillo se lavó seis veces con TBS, y después de eso, se añadió anticuerpo IgG de ratón marcado con HRP diluido 5.000 veces con la solución de bloqueo (50 \muL por pocillo) para que reaccionaran durante 2 horas a la temperatura ambiente. El pocillo se lavó cuatro veces con TBS, y después de eso, se detectó la actividad enzimática (peroxidasa) del pocillo con solución de TMB (50 \muL). La reacción se detuvo con HCl 1 N (50 \muL), y se calculó el valor correspondiente para "420 nm - 620 nm".

Se preparó una muestra de control como sigue. En primer lugar, se sintetizó un péptido irrelevante (esto es, un péptido de 15 restos aminoácido que es diferente de cualquiera de los cuatro péptidos obtenidos en el Ejemplo 1 y que no tiene afinidad de unión para el anticuerpo anti-GD3; la secuencia está representada por el SEQ ID NO: 10) de una manera similar a la empleada en el Ejemplo 3. El péptido sintetizado se administró a un ratón para la inmunización, y el antisuero obtenido sirvió muestra de control. El título de la muestra de control se obtuvo de una manera similar a la descrita antes. (No obstante, el número de ratones proporcionado fue de cinco, y solamente se utilizó una solución diluida 100veces). Esta muestra de péptido de control también se utilizó en forma de MAP como se ha descrito antes.

Los datos de l reactividad de las respectivas muestras de antisuero con GD3 se resumen en las Tablas 3 a 5 siguientes.

TABLA 3

3

4

TABLA 4

5

TABLA 5

6

Como resulta evidente a partir de las Tablas 3 a 5, las muestras de antisuero obtenidas mediante el uso, como inmunógeno, de un peptidomimético de GD3 de la presente invención, presentan reacción cruzada con GD3; en particular, aquellos obtenidos mediante el uso, como inmunógeno, de un GD3R4 de la presente invención muestra reacción cruzada con GD3. En contraste, se encontró que las muestras de antisuero obtenidas mediante el uso del péptido de control mostraban una reactividad débil con GD3, y tomados juntos, se sugiere que los antisueros obtenidos mediante el uso de un peptidomimético de GD3 de la presente invención presentan reacción cruzada con GD3.

Los resultados anteriores sugieren que los peptidomiméticos de GD3 de la presente invención, en particular GD3R4, imitan una porción de la estructura de GD3; esto es, una porción estructural reconocida por el anticuerpo anti-GD3 4F6.

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Ejemplo 5

Reactividad del peptidomimético de GD3

(1) De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 3, los péptidos de los 9 restos aminoácido N-terminales o los 9 restos aminoácido C-terminales de GD3R1, GD3R2, GD3R3, o GD3R4. La nomenclatura y las secuencias de los respectivos péptidos empleados en el presente ensayo se muestran en la Fig. 2. Estos fueron empeladas como péptidos multi-antigénicos (MAP).

(2) Con el fin de ampliar la búsqueda del enlace entre el anticuerpo anti-GD3 4F6 y cada uno de los peptidomiméticos de GD3 mostrados en la Fig. 1, se sometieron los péptidos multi-antigénicos (MAP) a ELISA. Se proporcionaron las muestras de los MAP que tenían una variedad de concentraciones mostradas en el eje de las X en la Fig. 3, y cada muestra fue inmovilizada en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Con posterioridad, los pocillos fueron bloqueados con una solución de bloqueo (TBS suplementado con 1% de BSA, 0,1% de leche desnatada, y 0,02% de Tween 20) a 4°C durante la noche. Se añadió 4F6 (sobrenadante de hibridoma: utilizado en forma pura) (100 \muL/pocillo) para la reacción a la temperatura ambiente durante 2 horas. Una vez completada la reacción, se descartó el sobrenadante, y los pocillos se lavaron con solución de lavado (TBS con un suplemento de 1% de FBS y 0,05% de Tween 20) seis veces. Con posterioridad, se dejó que los pocillos reaccionaran con IgG anti-ratón marcada con peroxidasa (diluida 1.000 veces con solución de bloqueo) a la temperatura ambiente durante 2 horas. Los pocillos se lavaron de nuevo con una solución de lavado cuatro veces, y se detectó la cantidad de enzima peroxidasa restante en cada pocillos y se determinó cuantitativamente con el sustrato TMB, por medio de lo cual se investigó la unión de MAP a 4F6. El ensayo se realizó por triplicado, y los valores del gráfico son "media \pm DT".

Como se entiende a partir de la Fig. 3, 4F6 se une a los peptidomiméticos de GD3 3 o 4 de una manera dependiente de la dosis. Aunque la unión de GD3 parece haber declinado a partir de la concentración de 0,8 \mug/pocillo y superior, esto puede ser atribuido a una cantidad excesiva de GD3 inmovilizado presente en la placa de ELISA, lo que intensificaba la hidrofobicidad, inhibiendo de ese modo la unión al anticuerpo.

(3) La afinidad de unión mostrada en la Fig. 3 fue investigada mediante otro método. Brevemente, se proporcionaron muestras de MAP que tenían una variedad de concentraciones mostrada en el eje de las X en la Fig. 4. Cada muestra fue inmovilizada sobre los pocillos de de placa de 96 pocillos, y se dejó que los pocillos reaccionaran con 4F6 (100 \muL/pocillo) a 4°C durante la noche. Al día siguiente, se recogió el sobrenadante (80 \muL) y se añadió a los pocillos de otra placa en la que se había inmovilizado GD3 de antemano (100 ng/pocillo) para que reaccionaran a la temperatura ambiente durante 2 horas. Una vez completada la reacción, se detectó la cantidad de anticuerpo 4F6 que se había condensado con GD3 (esto es, que no había sido adsorbido por MAP) y se determinó cuantitativamente por medio del método descrito en el apartado (2) anterior, por medio de lo cual se investigó el efecto inhibidor de MAP sobre la unión de GD3 a 4F6. El ensayo se realizó por triplicado, y los valores del gráfico son la "media \pm DT".

Como resultado, como se muestra en la Fig. 4, como en el caso de GD3, se encontró que ambos peptidomiméticos de GD3 3 y 4 inhibían la unión de GD 3 al anticuerpo, y la inhibición se producía de una manera dependiente de la cantidad inmovilizada.

(4) A continuación, se realizó una investigación en cuanto a si la unión entre GD3R3 o GD3R4 y 4F6 se producía en el sitio de unión a GD3 de 4F6. A los pocillos de una placa en la que se había inmovilizado GD3 (100 ng/pocillo), se añadieron simultáneamente cada una de las muestras de MAP que tenían una variedad de concentraciones mostrada en el eje de las X de la Fig. 5 y 4F6 (100 \muL/pocillo), por medio de lo cual se realizó un ensayo inhibidor. El ensayo se realizó por triplicado, y los valores del gráfico son la "media \pm DT".

Como resultado, como resulta evidente a partir de la Fig. 5, en el intervalo de concentración empleado en el presente ensayo, GD3R3, como GD3, mostraba un efecto inhibidor, pero R4 no. A partir de estos resultados, se deducen los dos siguientes.

Primero, la fuerza de unión entre 4F6 y los respectivos MAP disminuye en el orden GD3 > GD3R3 > GD3R4. Segundo, GD3R3 se une al sitio de unión a GD3, o en las proximidades, de 4F6.

(5) Mediante el procedimiento descrito antes, entre otros peptidomiméticos, se ha encontrado que GD3R3 se une específicamente al dominio de unión a GD3 de 4F6 o un sitio próximo a este. A continuación, en un intento de determinar el dominio requerido para establecer la unión al anticuerpo anti-GD3 4F6 en los peptidomiméticos de GD3, se sintetizaron un MAP de nueve restos N-terminales del péptido GD3R3 y un MAP de nueve restos C-terminales del mismo péptido GD3R3 como se muestra en la Fig. 2, se estudió su unión a 4F6 mediante ELISA. Se realizó el ELISA por triplicado, y los valores de los gráficos son la "media \pm DT".

Como resultado, como resulta evidente a partir de la Fig. 6, se encontró que GD3R3C9 tenía una capacidad comparable para los 15 restos al inhibir la unión entre GD3 y 4F6, y la inhibición se producía de una manera dependiente de la cantidad inmovilizada.

Tomados juntos, está claro que GD3R3 es el más fuerte en la unión al anticuerpo anti-GD3 4F6, y que nueve restos del extremo C (GD3R3C9) son críticos en el establecimiento de la unión.

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Ejemplo 6

Inmunización con el péptido de fusión (1) Inmunización

Utilizando un péptido de fusión R4-KLH obtenido en el Ejemplo 3(4) entre GD3R4 y KLH o un péptido de fusión en forma de MAP R4MAP-KLH creado entre GD3R4 y KLH, se realizó la inmunización como se ha descrito en el apartado (1) anterior.

Brevemente, se administró una emulsión mixta con un coadyuvante (1:1, en volumen) a cada miembro de los grupos de ratones, constando cada grupo de 3 ratones (CD-1), en una cantidad de 100 \muL/ratón (para una administración (ip), 30 \mug péptido/ratón) para la inmunización. En el caso de R4-KLH, la administración se realizó cada semana durante un mes, y con posterioridad cada dos semanas durante un mes; y en el caso de R4MAP-KLH, cada semana durante 2 meses. En cualquier caso, 4 días después de la inmunización final, se recogió sangre para preparar de ese modo muestras de antisuero.

De un modo similar al caso de la inmunización con R4-KLH, también se prepararon muestras de antisuero mediante inmunización con GD3 (30 \mug).

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(2) Ensayo ELISA

Utilizando una placa para ELISA en la que se había inmovilizado GD3 o péptido GD3R4, se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 4(2).

Placa con GD3 inmovilizado: se añadió a cada pocillo GD3 en metanol-PBS (1:1) (0,5 \mug/50 \muL), y la placa se dejó estar durante una hora. Los pocillos se lavaron con PBS, después se añadió a esto 1% de HSA en PBS (200 \muL/pocillo) para la incubación a 37°C durante 2 horas, por medio de lo cual se bloquearon los pocillos.

Placa con péptido GD3R4 inmovilizado: Se añadió a cada pocillo péptido GD3R4 (1 \mug) disuelto en tampón bicarbonato 0,1 M (pH 9,5), seguido de incubación a 37ºC durante la noche y lavado con PBS, por medio de lo cual se bloquearon los pocillos de una manera similar a la anterior.

Las muestras de antisuero obtenidas en lo anterior fueron diluidas con PBS para rendir de ese modo muestras de antisuero diluidas de 100 veces a 10.000 veces. Cada una de las muestras de antisuero diluido resultantes (50 \muL) fue añadida a cada pocillo y la mezcla se dejó reaccionar durante una hora. Con posterioridad, se dejó que la reacción continuara con anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón biotinilado (anticuerpo específico Ig, IgM, IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3) durante una hora, después con estreptavidina-HRP durante una hora de una manera similar, después de lo cual se detectó actividad enzimática en cada pocillo como se ha descrito antes (405 nm).

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(3) Ensayo de respuesta celular

El bazo retirado asépticamente de cada uno de los ratones inmunizados anteriores se desmenuzó en medio RPMI 1640 con suplemento de 10% de FCS. Utilizando una columna de lana de nailon, se prepararon linfocitos ricos en células T y se contaron las células. El medio anterior que contenía las células en una cantidad de 10^{5} células por 150 \muL se añadió a cada uno de los pocillos de una placa de cultivo. Se añadió PHA con el fin de obtener una concentración final de 1 \mug/mL. Se añadió un péptido de la presente invención o cualquiera de los diferentes gangliósidos en PBS, y la mezcla se incubó durante 96 horas. Se obtuvo un sobrenadante (100 \muL) de cada pocillo. La actividad IL-2 del sobrenadante se determinó utilizando células de ratón dependientes de IL-2, CTLL2. Brevemente, se añadió a los pocillos el sobrenadante (100 \muL) diluido de 2 a 50 veces con medio en una cantidad de 10^{4} células CTLL2/pocillo, seguido de incubación a 37ºC durante 48 horas. Con posterioridad, se añadió a cada pocillo timidina-H^{3} (0,5 \muCi), seguido de incubación durante 6 horas. Las células CTLL2 se recuperaron sobre un papel de filtro y se sometieron a recuento en cuanto a H^{3}.

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(4) Resultados

Se encontró que las muestras de antisuero obtenidas de la inmunización con R4-KLH o R4MAP-KLH contenían anticuerpos específicos que reaccionaban con el péptido GD3R4 y GD3. Los títulos de los anticuerpos IgG y los de anticuerpos IgM eran casi los mismos. Los resultados referentes a la reactividad entre GD3 y antisuero obtenido de la inmunización con R4-KLH se muestran en la Fig. 7. La reactividad entre GD3 y antisuero obtenido de la inmunización con R4MAP-KLH y la reactividad entre GD3 y antisuero obtenido de la inmunización con GD3R4 se muestran en las Figs. 8 y 9, respectivamente.

Los linfocitos ricos en células T de ratón inmunizado con GD3 se consideran o activados, ya que no se detectaba actividad de IL-2 en presencia de gangliósidos (Tabla 6). No obstante, en presencia de péptido GD3R4 o péptido GD3R3, se confirmó la producción de IL-2 (Tabla 6). En relación con esto, en los ratones inmunizados con R4-KLH, se ha confirmado que las células T han sido activadas por el péptido GD3R4 o el péptido GD3R3 (Tabla 7). Estos resultados indican que los péptidos de la presente invención inducen la activación de las células T específicas en ratones inmunizados con GD3.

TABLA 6 Absorción de timidina H^{3} en células CTLL2 dependientes de Il-R incubadas en sobrenadante de cultivo de células de bazo de ratones inmunizados con GD3 y estimulados con PHA durante 96 horas (en presencia de una variedad de gangliósidos o péptidos)

7

8

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TABLA 7 Absorción de timidina H^{3} en células CTLL2 dependientes de IL-2 incubadas en sobrenadante de cultivo de células de bazo de ratones inmunizados con péptido R4 y estimulados con PHA durante 96 horas (en presencia de una variedad de gangliósidos o péptidos)

9

10

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, se proporcionan secuencias de aminoácidos novedosas que imitan el GD3 que se expresa en tejidos cancerosos o superficies de células cancerosas. Los péptidos que imitan GD3 de la presente invención que contienen una de las secuencias de aminoácidos encuentran utilidad para la preparación de fármacos, incluyendo agentes de diagnóstico para el cáncer o vacunas para el cáncer. Se describe en la presente memoria un método de tratamiento del cáncer, un método de diagnóstico del cáncer, etc., que contribuyen de este modo a la mejora del efecto terapéutico de la terapia del cáncer.

<110> Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

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<120> GD3 mimic peptide

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<130> 0P0035

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<150> JP P2000-124259

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<151> 2000-04-25

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<160> 10

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Biblioteca de presentación en fagos (GD3R-1)

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<400> 1

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\sa{Leu Ala Pro Pro Arg Pro Arg Ser Glu Leu Val Phe Leu Ser Val}

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<210> 2

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Biblioteca de presentación en fagos (GD3R-2)

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<400> 2

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\sa{Pro His Phe Asp Ser Leu Leu Tyr Pro Cys Glu Leu Leu Gly Cis}

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<210> 3

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Biblioteca de presentación en fagos (GD3R-3)

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<400> 3

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\sa{Gly Leu Ala Pro Pro Asp Tyr Ala Glu Arg Phe Phe Leu Leu Ser}

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<210> 4

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Biblioteca de presentación en fagos (GD3R-4)

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<400> 4

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\sa{Arg His Ala Tyr Arg Ser Met Ala Glu Trp Gly Phe Leu Tyr Ser}

\newpage

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<210> 5

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Biblioteca de presentación en fagos (GD3R-1)

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctggctcctc ctcggccgcg ttctgagctg gtttttcttt ctgtt

\hfill

45

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<210> 6

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Biblioteca de presentación en fagos (GD3R-2)

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcattttg attcgttgct gtatccttgt gagctgctgg ggtgt

\hfill

45

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<210> 7

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Biblioteca de presentación en fagos (GD3R-3)

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcttgctc cgccggatta tgctgagcgt ttttttcttc tttct

\hfill

45

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<210> 8

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Biblioteca de presentación en fagos (GD3R-4)

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

cggcatgctt atggtctat ggctgagtgg gggtttctgt attct

\hfill

40

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<210> 9

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia cebadora

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

taacactgag tttcgtcacc agta

\hfill

24

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<210> 10

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Biblioteca de presentación en fagos

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<400> 10

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\sa{Ala Asp Gly Ala Arg Gly Gly Phe Ser Asp Thr Ser Arg Thr Gly Met}

\sac{Val Ser Val Gly Ala Ala Gly}

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Claims

1. Un peptidomimético de GD3 que comprende

(i): la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4;

(ii): una secuencia de aminoácidos derivada del SEQ ID NO: 4 por sustitución, deleción, adición, o inserción de un resto aminoácido;

(iii): una secuencia de aminoácidos que consiste en 9 a 14 restos aminoácido continuos contenidos en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4; o

(iv): una secuencia de aminoácidos derivada del SEQ ID NO: 4 y que tiene una homología del 80% más con el SEQ ID NO: 4, siendo capaz dicho peptidomimético de GD3 de unirse a un anticuerpo anti-GD3 y siendo capaz de inducir una respuesta inmunitaria anti-GD3.

2. El peptidomimético de GD3 según la reivindicación 1, fusionado con una proteína portadora que potencia la inmunogenicidad.

3. El peptidomimético de GD3 fusionado según la reivindicación 2, donde la proteína portadora es la hemocianina de lapa ojo de cerradura.

4. Un peptidomimético de GD3 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un péptido inmunogénico que tiene la capacidad de producir un anticuerpo específico de GD3.

5. Un peptidomimético de GD3 según a reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos derivada del SEQ ID NO: 4 y que tiene una homología del 90% o más con el SEQ ID NO: 4, siendo capaz dicho peptidomimético de GD3 de unirse a un anticuerpo anti-GD3 y siendo capaz de inducir una respuesta inmunitaria anti-GD3.

6. Un peptidomimético de GD3 según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ NO: 4.

7. Una composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, un peptidomimético de GD3 como se cita en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una secuencia de ADN que codifica el peptidomimético de GD3 definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Un peptidomimético de GD3 multi-antigénico que comprende el peptidomimético de GD3 definido en la reivindicación 1.

10. El peptidomimético de GD3 multi-antigénico según la reivindicación 9, que comprende adicionalmente

(i): una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4;

(ii): una secuencia de aminoácidos derivada de uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4 por sustitución, deleción, adición, o inserción de un resto aminoácido;

(iii): una secuencia de aminoácidos que consiste en 9 a 14 restos aminoácido continuos contenidos en uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4; o

(iv): una secuencia de aminoácidos derivada de uno cualquiera de los SEQ ID NOS: 1 a 4 y que tiene una homología del 80% o más con los SEQ ID NOS: 1 a 4, respectivamente.