ES2283424T3 - Proteina desintegrina humana. - Google Patents

Abstract

Polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10; (b) fragmentos solubles del polipéptido de SEQ ID NO :6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales e inhibición de la angiogénesis; (c) fragmentos del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio desintegrina, correspondiendo dicha secuencia a la secuencia desde el residuo de aminoácido 73+-5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360+ -5 a 362+ - 5 de SEQ ID NO:6, desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 16+ -5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 285+ -5 a 287+ -5 de SEQ ID NO:8, y desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 735 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 314+ -5 a 329+ -5, respectivamente; (d) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido 73+ -5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360+ - 5 a 362+ -5; (e) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 16+ -5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 285+ -5 a 287+ -5; (f) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 73+ -5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 314+ -5 a 329+ -5; (g) polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que comparten identidad de aminoácidos a través de la longitud de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10, en el que la identidad de aminoácidos en porcentaje se selecciona del grupo que consiste en al menos el 97, 5%, al menos el 99% y al menos el 99, 5%; y (h) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.

Description

Proteína desintegrina humana.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud se acoge al párrafo 119 de 35 U.S.C. (código de los EE.UU.) de la solicitud provisional estadounidense con número de serie 60/221.838, presentada el 28 de julio de 2000, y la solicitud provisional estadounidense con número de serie 60/282.550, presentada el 9 de abril de 2001.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polipéptidos que tienen homología con una familia de polipéptidos humanos desintegrina-metaloproteinasa, a polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, y a métodos para la preparación y uso de los mismos.

Antecedentes

Los polipéptidos desintegrina-metaloproteinasa, también denominados en el presente documento como polipéptidos ADAM o "ADAM" ("un dominio desintegrina y uno metaloproteinasa" ("A Disintegrin And Metalloproteinase domain")) son un grupo relacionado de polipéptidos de membrana de tipo I, de dominios múltiples. Ciertos miembros de la familia ADAM de polipéptidos están sumamente expresados en algunos tipos de células incluyendo, por ejemplo, las células musculares o del tejido reproductor. Además, miembros de la familia ADAM de polipéptidos se expresan generalmente de manera constitutiva a lo largo del desarrollo.

Se han identificado varios genes de ADAM, incluyendo de fertilina \alpha y \beta (implicadas en la unión y la fusión mediadas por integrina del óvulo y el espermatozoide; anteriormente conocida como PH-30 \alpha y \beta), proteína apical del epididimo I, ciritesteína, MDC (un candidato a supresor tumoral en el cáncer de mama humano), meltrina-\alpha (que media la fusión de mioblastos en el proceso de formación de miotubo), MS2 (un antígeno de superficie de macrófagos), y metargidina. Además, se ha demostrado que un nuevo gen de la familia ADAM, denominado ADAMTS-1, que contiene un dominio desintegrina y uno metaloproteinasa con motivos de trombospondina (TSP), está íntimamente asociado con diversos procesos inflamatorios, así como con el desarrollo de caquexia por cáncer (Kuno, K. et al., J. Biol. Chem. 272:556-562 (1997)). Se encontró que un nuevo miembro de ADAM en Drosophila, denominado gen kuzbanian ("KUZ"), estaba implicado en la neurogénesis de Drosophila (Rooke, J. et al., Science 273:1227-1231 (agosto de 1996)).

Polipéptidos típicos de la familia ADAM son polipéptidos de superficie celular que consisten en dominios citoplasmáticos y transmembrana, de repetición, de tipo factor de crecimiento epidérmico, ricos en cisteína, de tipo desintegrina, metaloproteasa y prodominios. Se cree que en algunos ADAM, el domino metaloproteinasa está implicado en las funciones de procesamiento de proteínas tales como liberación de factores de crecimiento, proteínas de adhesión, y factores inflamatorios. El dominio desintegrina puede tener un papel en las interacciones de adhesión celular mediadas por integrina (célula a célula y célula a matriz), tales como en la agregación plaquetaria, migración de células tumorales o neutrófilos y angiogénesis. Lo más probable es que estas actividades de la familia ADAM de polipéptidos estén mediadas por interacciones con los sustratos de la metaloproteinasa y con integrinas, uniéndose los sustratos de la metaloproteinasa al dominio catalítico de la metaloproteinasa y uniéndose las integrinas al dominio desintegrina de la familia ADAM de polipéptidos. Debido a sus supuestos papeles en la mediación de las funciones de procesamiento de las proteínas, tales como la liberación de factores de crecimiento, proteínas de adhesión, y factores inflamatorios y adhesión celular, se cree que la familia ADAM de polipéptidos está asociada con estados de inflamación, cáncer, alergia, del tejido reproductor y vasculares. Las características y actividades de la familia de polipéptidos ADAM se describen adicionalmente en Black, R.A. y White, J.M., 1998, Curr. Opin. in Cell Biol.10: 654-659; y en Schlondorff, J. y Blobel, C.P, 1999, J. Cell Sci. 112: 3603-3617. Nath et al., J. Cell Sci. 113:2319-2328 (2000) notifican que la meltrina y (ADAM-9) pueden desempeñar un papel en la regulación de la movilidad de células uniéndose a la integrina \alpha_{6}\beta_{1}.

La entrada referente a la secuencia ID HS388301 (20 de marzo de 1996; Bouillaud, F.) de la base de datos EMBL (número de registro N73388) describe una secuencia de 688 nucleótidos de un clon de EST humano derivado del tejido adiposo que se indica que es similar a la proteína de membrana con dominio desintegrina y metaloproteinasa de la familia MDC o ADAM.

Sumario de la invención

Por primera vez se proporcionan en el presente documento un polinucleótido y secuencias de polipéptidos que tienen homología con la familia de polipéptidos ADAM, denominada en el presente documento "ADAM-H9", para ("una desintegrina y metaloproteinasa con homología con ADAM9") así como métodos para prepararlos y métodos para usar los mismos.

La invención proporciona un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10; (b) fragmentos solubles del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tienen al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales, e inhibición de angiogénesis; (c) fragmentos del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que comprende una secuencia de aminoácidos con domino desintegrina, correspondiendo dicha secuencia a la secuencia del residuo de aminoácidos 73\pm5 a uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 360\pm5 a 362\pm5 de SEQ ID NO:6, desde uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 1 a 165 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 285\pm5 a 287\pm5 de SEQ ID NO:8, y desde uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 1 a 735 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 314\pm5 a 329\pm5, respectivamente; (d) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 360\pm5 a 362\pm5; (e) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 285\pm5 a 287\pm5; (f) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácidos 314\pm5 a 329\pm5; (g) polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que comparten identidad de aminoácidos a lo largo de la longitud de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10, en los que el porcentaje de identidad de aminoácido se selecciona del grupo que consiste en al menos el 97,5%, al menos el 99%, y al menos el 99,5%; y (h) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.

La invención proporciona adicionalmente un polipéptido, tal como se describió anteriormente, unido a un segundo polipéptido, en la que el segundo polipéptido es un polipéptido de cremallera de leucina, un polipéptido de Fc, o un ligador peptídico.

La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido, tal como se describió anteriormente.

La invención también proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en (a) un polinucleótido que comprende una secuencia de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9; (b) SEQ ID NO:5 desde el nucleótido 248 hasta el nucleótido 1111 de SEQ ID NO:5; (c) un polinucleótido que comprende una secuencia de SEQ ID NO:7 desde un nucleótido entre 82 y 127 hasta el nucleótido 936; d) un polinucleótido que comprende una secuencia de SEQ ID NO:9 desde un nucleótido entre 32 y 248 hasta un nucleótido entre 973 y 1018; (e) una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9; y (f) cualquiera de las secuencias de nucleótidos de a (a) a (e) en las que T también puede ser U. La invención proporciona adicionalmente un polinucleótido aislado que comprende una secuencia descrita anteriormente operativamente unida a un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés.

La invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica para cualquiera de los polipéptidos anteriores. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia expuesta en las SEQ ID NO:5, 7, o 9, complementos de los mismos. Además se describen en el presente documento polinucleótidos que se hibridan con un polinucleótido que tiene una secuencia de las SEQ ID NO:2, 5, 7, o 9. El polinucleótido puede ser ADN o ARN.

La invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia tal como se expone en la SEQ ID NO:5, 7, o 9 operativamente unido a un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés (por ejemplo, una secuencia que codifica para una cremallera de leucina, polipéptido de Fc, o secuencia de ligador peptídico). Preferiblemente, el polinucleótido de SEQ ID NO:5, 7, o 9 codifica para un fragmento que tiene actividad desintegrina y codifica para un polipéptido tal como se expone en las SEQ ID NO:6 desde aproximadamente el aminoácido número 73 hasta aproximadamente el 360, SEQ ID NO:8 desde el aminoácido 1 o 16 hasta el 285 y/o SEQ ID NO:10 desde el aminoácido 1 o 73 hasta 314 o 329.

La invención proporciona un vector de expresión que tiene un polinucleótido de la invención así como células huésped que comprenden un vector de expresión de este tipo o un polinucleótido recombinante de la invención.

La invención proporciona adicionalmente un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar una célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido de la invención en condiciones que estimulan la expresión del polipéptido codificado por el polinucleótido y la purificación del polipéptido.

La invención proporciona un anticuerpo sustancialmente purificado que se une específicamente a un polipéptido de la invención. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es humano o humanizado.

También se describe en el presente documento un método para diseñar un inhibidor o agente de unión de un polipéptido de la invención. El método incluye determinar la estructura tridimensional de un polipéptido ADAM-H9 de la invención, analizar la estructura tridimensional del polipéptido para unirse a sitios de ligandos, diseñar una molécula que se prevé que interaccione con el polipéptido, y determinar la actividad inhibidora o de unión de la molécula.

La invención también proporciona un método para identificar un agente que modula la expresión o actividad de ADAM-H9. El método incluye poner en contacto el agente con un polinucleótido o polipéptido ADAM-H9 en condiciones de manera que el agente y el polipéptido o el polinucleótido interaccionen y determinar la expresión o actividad de ADAM-H9 en presencia de un agente comparado con un control en el que un cambio en la actividad o expresión es indicativo de un agente que modula expresión o actividad de ADAM -H9.

Además se describe en el presente documento un método para modular la angiogénesis en un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con un polipéptido ADAM-H9 de la invención. La puesta en contacto puede ser in vitro o in vivo. También se proporcionan métodos para modular la migración de células endoteliales, poniendo en contacto una célula endotelial con un polipéptido ADAM-H9 o un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido ADAM-H9. La puesta en contacto puede ser in vitro o in vivo.

La invención también proporciona un método para inhibir la unión de una integrina con un ligando que comprende poner en contacto una célula que expresa la integrina con una cantidad eficaz de un dominio desintegrina de ADAM-H9. En algunas realizaciones, el dominio desintegrina de ADAM-H9 comprende una secuencia tal como se expone en la SEQ ID NO:6 desde aproximadamente el aminoácido número 73 hasta aproximadamente el 360, la SEQ ID NO:8 desde el aminoácido 1 o 16 (o residuos entre medias) hasta el 285, o la SEQ ID NO:10 desde el aminoácido 1 o 73 (o residuos entre medias) hasta el 314 o 329 (o residuos entre medias).

También se describe un método para modular la unión de una integrina a un ligando en un mamífero que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido soluble que comprende un dominio desintegrina de ADAM-H9. En algunas realizaciones, el mamífero está aquejado de un estado seleccionado del grupo que consiste en trastornos oculares; estados metastásicos o cancerosos; enfermedades inflamatorias; osteoporosis y otros estados mediados por resorción ósea acelerada; reestenosis; agregación, reclutamiento o activación plaquetaria inapropiada; trombosis; o un estado que requiere reparación tisular o cicatrización de heridas.

También se describe en el presente documento un método para inhibir la angiogénesis en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz en inhibición de un polipéptido soluble que comprende un dominio desintegrina de ADAM-H9. En una realización, el dominio desintegrina de ADAM-H9 comprende una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO:6 desde aproximadamente el aminoácido número 73 hasta el 360, SEQ ID NO:8 desde aproximadamente el aminoácido 1 o 16 hasta el 285, o SEQ ID NO:10 desde aproximadamente el aminoácido 1 o 73 hasta el 314 o 329. El dominio desintegrina de ADAM-H9 soluble puede estar en la forma de un multímero (por ejemplo, un dímero, trímero, o polipéptido de fusión). En una realización, el multímero comprende un polipéptido de Fc o una cremallera de leucina. En otra realización, el polipéptido comprende una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO:25.

También se describe un medio legible en ordenador que contiene en el mismo datos legibles en ordenador de una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o una combinación de las mismas.

La invención también proporciona el uso de un polipéptido ADAM-H9 soluble con dominio desintegrina que comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales, e inhibición de angiogénesis, para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis en un mamífero con necesidad de un tratamiento de este tipo.

La invención proporciona adicionalmente el uso de un polipéptido ADAM-H9 soluble con dominio desintegrina que comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales, e inhibición de angiogénesis, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un estado seleccionado del grupo que consiste en trastornos oculares, estados metastásicos y cancerosos; enfermedades inflamatorias; osteoporosis, trastornos de resorción ósea acelerada; reestenosis; agregación, reclutamiento o activación plaquetaria inapropiada; trombosis; y un estado que requiere reparación tisular o cicatrización de heridas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una alineación de secuencias de ADAM9 (SEQ ID NO:23) con ADAM-H9 expuestas en SEQ ID Nos: 6, 8, y 10. En la figura se identifican dominios previstos por homología con la familia ADAM de polipéptidos.

La figura 2 muestra una tabla que representa las secuencias de aminoácidos de polipéptidos según la invención.

La figura 3 muestra una tabla que representa las secuencias de nucleótidos de polinucleótidos según la invención.

Descripción detallada de la invención

Los elementos estructurales típicos comunes a varios miembros la familia ADAM de polipéptidos incluyen, en orden de N a C, una secuencia señal, un prodominio, un dominio metaloproteinasa, un dominio desintegrina, un dominio rico en cisteínas, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático. Existen ciertos residuos clave en los motivos/dominios metaloproteinasa (por ejemplo, el motivo de HexGHxxGxxHD (SEQ ID NO:24)) de manera que es probable que las sustituciones de esos residuos extremadamente conservados estén asociadas con una función alterada o falta de función para el polipéptido. Los ADAM con la secuencia del sitio activo de metaloproteasa conservado de SEQ ID NO:24 incluyen los ADAM 1, 8-10, 12-13, 15-17, 19-21, 24-26, 28, y 30. Los dominios metaloproteinasa catalíticos también contienen cuatro cisteínas conservadas que pueden requerirse para la formación de una estructura polipeptídica funcional mediante enlaces disulfuro. Existen 31 cisteínas sumamente conservadas en la región rica en cisteínas y desintegrina; casi todos los miembros de la familia ADAM de polipéptidos tienen estas 31 cisteínas. El experto en la técnica reconocerá que los límites de estas regiones dentro de los polipéptidos son aproximados y que los límites precisos de tales dominios (que pueden predecirse usando programas de ordenador disponibles con ese fin) pueden diferir de un miembro a otro dentro de la familia ADAM de polipéptidos.

La familia ADAM de polipéptidos está razonablemente bien conservada, con los miembros humanos de la familia similares entre sí y a miembros de la familia ADAM de otras especies, tales como ratón, rata e incluso Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans (véase, por ejemplo, Yamamoto et al., Immunol. Today, 20(6):278, 1999; y los siguientes sitios web de internet para más información (www): gene.ucl.ac.uk/users/hester/metalo.html; uta.fi/\simloiika/ADAMs/HADAMs.html; y people.Virginia.EDU/\simjag6n/Table_of_the_ADAMs.html). Sin embargo,
pueden definirse subfamilias de la familia ADAM de polipéptidos basándose en la similitud de secuencia y actividades biológicas relacionadas. Una subfamilia de este tipo comprende los polipéptidos ADAM10 y ADAM17/TACE, que muestran mayor similitud de secuencia entre sí, en comparación con otros miembros identificados hasta el momento en la familia ADAM de polipéptidos. Los ADAM 10 y 17 tienen 21 cisteínas en la región rica en cisteínas y desintegrina, en contraposición a las 31 cisteínas conservadas en esta región entre los otros ADAM. Por consiguiente, los ADAM pueden tener desde 20 hasta 31 cisteínas conservadas (por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o 31 cisteínas conservadas). ADAM17/TACE y ADAM-10 también son "convertasas", ("sheddases") lo que significa que se cree que escinden y liberan los dominios extracelulares de otras proteínas de membrana. La principal función de otra subfamilia puede ser unir integrinas u otras proteínas. Se procesa, por ejemplo, ADAM-2 para eliminar tanto el prodominio como el dominio catalítico de metaloproteinasa para exponer el dominio desintegrina y permitir que se una a su secuencia análoga. Otra subfamilia que puede definirse son los ADAM que parece que son específicos de testículos; estos polipéptidos son los ADAM 2-3, 16, 18, 20-21, 24-26, y 29-30; siendo los ADAM 5 y 6 principalmente específicos de testículos.

Los polipéptidos de la familia ADAM se expresan en muchos tipos de células incluyendo, por ejemplo, tejidos genitourinarios (por ejemplo, tejido del riñón y tejido reproductor), tejido neurológico y células musculares. Algunas parejas de unión para los polipéptidos ADAM se expresan, por ejemplo, en células endoteliales y células T, tal como se presenta por los dominios ricos cisteínas y desintegrina de varios polipéptidos de la familia ADAM que se unen a células endoteliales, al menos en parte mediante la interacción con integrinas, y a células T. Es probable que las interacciones entre los miembros de la familia ADAM de polipéptidos y sus parejas de unión participen en las interacciones de mediación entre tipos de células incluyendo tejido reproductor, tejido neurológico, y células musculares, y células endoteliales y células T que expresan parejas de unión.

El dominio desintegrina de algunos polipéptidos de la familia ADAM puede interaccionar con parejas de unión tales como integrinas de la superficie celular (véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional en tramitación junto con la presente con número de serie PCT/US01/05701, cuya descripción se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad). Mediante su unión a una o más parejas de unión, el polipéptido con dominio desintegrina puede inhibir actividades biológicas (por ejemplo, angiogénesis) mediadas a través de la unión de los polipéptidos ADAM a su pareja de unión. Dado que algunos polipéptidos de la familia ADAM muestran actividades de unión a integrina a través del dominio desintegrina, la modulación de la actividad desintegrina modulará la adhesión de, por ejemplo, el papel de los ADAM 1 y 2 en la unión del espermatozoide al óvulo y el papel de ADAM9 en interacciones de células epiteliales tubulares y glomerulares con la lámina basal en tejido renal. Puede determinarse el grado en el que los miembros individuales de la familia ADAM de polipéptidos y fragmentos y otros derivados de estos polipéptidos muestran estas actividades mediante métodos de ensayo habituales, tales como inhibición de la migración de células endoteliales mediante constructos de desintegrina-Fc, y similares. Ensayos particularmente adecuados para detectar o medir la unión entre los polipéptidos ADAM y sus parejas de unión son los análisis FACS. Ensayos adicionales para evaluar las actividades biológicas y las propiedades de unión a las parejas de los polipéptidos de la familia ADAM se describen más adelante (véanse, por ejemplo, los ejemplos 5-7). Aunque ADAM-H9 carece de dominio metaloproteinasa, puede actuar como un dominante negativo con respecto a la actividad metaloproteinasa de otros polipéptidos de la familia ADAM.

Los polipéptidos de la familia ADAM están implicados en enfermedades y trastornos neurales, del tejido reproductor, alergia, cáncer, inflamación, angiogénesis y estados o enfermedades vasculares que comparten como una característica común interacciones asociadas con integrina. Ejemplos de enfermedades y trastornos neutrales, del tejido reproductor, alergia, cáncer, inflamación, angiogénesis y estados vasculares que se sabe que son o es probable que impliquen actividades biológicas de los polipéptidos ADAM son artritis reumatoide, choque séptico, enfermedades glomerulares, insuficiencia renal aguda, enfermedad de Alzheimer y resorción ósea inapropiada. El bloqueo o inhibición de las interacciones entre miembros de la familia ADAM de polipéptidos y sus sustratos, ligandos, receptores, parejas de unión u otros polipéptidos que interaccionan es un aspecto de la invención y proporciona métodos para tratar, modular o mejorar estas enfermedades y estados mediante el uso de inhibidores o moduladores de la actividad del polipéptido ADAM. En una realización, se lleva a cabo la interacción entre miembros de la familia ADAM de polipéptidos y sus secuencias análogas poniendo en contacto una muestra que contiene un polipéptido de la familia ADAM o su secuencia análoga con un anticuerpo o polipéptido ADAM-H9. En otra realización, el polipéptido de la familia ADAM es ADAM-H9.

Para ciertos estados que implican muy poca actividad desintegrina, los métodos para tratar o mejorar estos estados comprenden aumentar la cantidad o actividad de, por ejemplo, los polipéptidos ADAM-H9, proporcionando polipéptidos o fragmentos activos o polipéptidos de fusión de los mismos, o proporcionando agentes que activan polipéptidos ADAM endógenos o exógenos. Usos adicionales para miembros de la familia de polipéptidos ADAM incluyen reactivos de diagnóstico para trastornos neurales, del tejido reproductor, alergia, cáncer, inflamación, y enfermedades vasculares; reactivos de investigación para la investigación de procesos de fertilización y polipéptidos de integrina, purificación y procesamiento de integrinas y/o células endoteliales o células T; o como un polipéptido de selección como diana/vehículo para administrar agentes terapéuticos a células.

Tal como se usa en el presente documento, tanto "proteína" como "polipéptido" significa cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación posterior a la traducción (por ejemplo, glucosilación o fosforilación), e incluye proteínas naturales, polipéptidos o péptidos sintéticos y recombinantes, así como una molécula recombinante que consiste en un híbrido con una parte que tiene, por ejemplo, toda o parte de una secuencia de aminoácidos de ADAM-H9 y una segunda parte que está codificada por toda o parte de una secuencia de nucleótidos. Normalmente, la proteína o polipéptido es sustancialmente puro de otros componentes a partir de los cuales está normalmente presente en la naturaleza. El término "sustancialmente puro" o "purificado" cuando se refiere a un polipéptido, significa un polipéptido que está al menos en un 30% libre de proteínas y moléculas orgánicas que se producen de manera natural con las que está asociadas de manera natural. Preferiblemente, el polipéptido sustancialmente puro de la invención está purificado en al menos el 35-50%; preferiblemente el 60-70%; más preferiblemente al menos el 75% al 90%; y lo más preferiblemente al menos el 99% en peso a partir de otras moléculas que se producen de manera natural. Puede obtenerse un polipéptido sustancialmente puro de la invención, por ejemplo, mediante extracción a partir de una fuente natural, mediante la expresión de un polinucleótido recombinante que codifica para el polipéptido, o mediante síntesis química del polipéptido. La pureza puede medirse mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, análisis por HPLC, PAGE o cromatografía.

Tal como se usa en el presente documento, un "polipéptido ADAM-H9" significa un polipéptido que contiene o comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la figura 2; polipéptidos que tienen homología sustancial o identidad sustancial con las secuencias expuestas en las SEQ ID, NO:1, 3, 4, 6, 8, o 10; fragmentos de las secuencias anteriores; y variantes conservativas de las anteriores. En el presente documento se describen y/o reivindican polipéptidos que tienen una secuencia tal como se expone las SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, y 10. Se ha demostrado que los polipéptidos tienen un elevado grado de homología con el polipéptido ADAM9 y, por tanto, tienen una función/actividad prevista de un polipéptido ADAM. Por consiguiente, en el presente documento se describe y/o reivindica un polipéptido ADAM-H9 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8, y 10. En una realización, un polipéptido ADAM-H9 tiene una actividad desintegrina o actividad inhibidora de metaloproteinasa o una combinación de las mismas. Pueden conseguirse métodos para determinar si un polipéptido de la invención tiene o no una actividad desintegrina o actividad inhibidora de metaloproteinasa deseada sometiendo a ensayo el polipéptido mediante cualquiera de los métodos descritos más adelante en el presente documento. Por ejemplo, puede medirse la actividad desintegrina de ADAM-H9 usando, los métodos de los ejemplos 5-7, a continuación.

Un polipéptido de la invención también engloba una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad o similitud suficiente o sustancial con una secuencia expuesta en la figura 2. Los expertos en la técnica pueden identificar secuencias sustancialmente idénticas que tienen dominios estructurales y/o que tienen actividad biológica en común con un polipéptido ADAM-H9. Los métodos para determinar la similitud o identidad pueden emplear algoritmos computacionales tales como, por ejemplo, BLAST, FASTA, y similares.

La expresión "sustancialmente idénticos", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a secuencias o subsecuencias que tienen al menos el 60%, preferiblemente el 80% o el 85%, lo más preferiblemente el 90-95% de identidad con el residuo de aminoácido o nucleótido cuando se alinea para una correspondencia máxima a través de una ventana de comparación tal como se mide mediante, por ejemplo, un algoritmo de comparación de secuencia o mediante una alineación manual e inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba, que tienen complementariedad sustancial de secuencia o subsecuencia cuando la secuencia de prueba tiene identidad sustancial con respecto a la secuencia de referencia. Una "ventana de comparación", tal como se usa en el presente documento, incluye referencia a un segmento de una cualquiera de la variedad de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en desde 20 hasta 1800, normalmente de aproximadamente 50 a 200, más normalmente de aproximadamente 70 a 150, en la que puede compararse una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas, una vez que las dos secuencias están óptimamente alineadas.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y referencia en un ordenador, se diseñan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. Pueden usarse parámetros del programa por defecto, o pueden diseñarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces las identidades de secuencia en porcentaje para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Puede realizarse una alineación óptima de secuencias para la comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch, J.Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, del Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante alineación manual e inspección visual.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones por parejas, progresivas para mostrar la relación e identidad de secuencia en porcentaje. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 (1987), y es similar al método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 (1989). El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación por parejas de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación se alinea entonces con la siguiente secuencia o agrupación de secuencias alineadas más relacionada. Se alinean dos agrupaciones de secuencias mediante una extensión sencilla de la alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones por parejas, progresivas. Por ejemplo, puede compararse una secuencia de referencia con otras secuencias de prueba para determinar la relación de identidad de secuencia en porcentaje usando los siguientes parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10), y huecos de extremo pesados.

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de secuencia en porcentaje y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, tal como se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información de Biotecnología) (www- ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que o bien corresponde o bien satisface una puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina como el umbral de puntuación de palabras vecinas. Estas identidades exactas de palabras vecinas iniciales actúan como inicio para comenzar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Las identidades exactas de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Se detiene la extensión de identidades exactas de palabras en cada dirección cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye en la cantidad X de su valor alcanzado máximo; la puntuación acumulativa se hace cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Una medición de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que podría producirse una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad de suma en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.

Alternativamente, la identidad en porcentaje de dos secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico puede determinarse comparando la información de la secuencia usando el programa de ordenador GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin. Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, tal como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para huecos en los extremos.

Un experto en la técnica reconocerá que las adiciones, deleciones o sustituciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido o secuencia polipeptídica, que altera, añade o deleciona un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservativa" donde la alteración da como resultado una molécula que tiene sustancialmente la misma actividad biológica (por ejemplo, actividad desintegrina). Por ejemplo, una alteración que da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar es una variante modificada de manera conservativa. En la técnica se conocen tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Cada uno de los siguientes seis grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M),Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Una indicación de que dos polinucleótidos o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por un primer polinucleótido reacciona inmunológicamente de manera cruzada con los anticuerpos surgidos frente al polipéptido codificado por un segundo polinucleótido. Otra indicación de que dos polinucleótidos son sustancialmente idénticos es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones rigurosas.

La invención también engloba a los polipéptidos derivados de los polipéptidos ADAM-H9 de la invención mediante cualquier tipo de alteración (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en el estado de glucosilación del polipéptido; replegamiento o isomerización para cambiar su estructura tridimensional o estado de autoasociación; y cambios en su asociación con otros polipéptidos o moléculas). Por tanto, los polipéptidos proporcionados por la invención incluyen polipéptidos caracterizados por secuencias de aminoácidos similares a las expuestas en la figura 2, pero en las que las modificaciones se proporcionan de manera natural o modificadas por ingeniería genética de manera deliberada. La invención engloba a un polipéptido que comparte actividades biológicas en común con un polipéptido que comprende una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO 6, 8, o 10 que tienen actividad desintegrina y/o actividad inhibidora de matoloproteinasa.

La presente invención engloba diversas formas de dominios de desintegrina de ADAM-H9 que conservan al menos una actividad ("actividad desintegrina") seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales, e inhibición de la angiogénesis. Se pretende que la expresión "polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina" (ADAM-H9dis) englobe polipéptidos que contienen todo o parte de un dominio desintegrina de ADAM-H9, con o sin otros dominios ADAM (tal como la región rica en cisteínas), así como formas relacionadas incluyendo, pero sin limitarse a: (a) fragmentos, (b) variantes, (c) derivados, (d) polipéptidos de fusión, y (e) formas multiméricas (multímeros). La capacidad de estas formas relacionadas para inhibir la unión a integrina, la migración de células endoteliales y/o la inhibición de la angiogénesis puede determinarse in vitro o in vivo usando métodos tales como los ejemplificados más adelante o usando otros ensayos conocidos en la técnica.

Un experto en la técnica puede realizar ensayos fácilmente para determinar la actividad usando los métodos descritos en el presente documento. Tales métodos miden, por ejemplo, las actividades biológicas mostradas por los miembros de la familia ADAM de polipéptidos incluyendo, sin limitación, adhesión celular. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos anti-ADAM-H9, que neutralizan la actividad de ADAM-H9, para realizar un ensayo para determinar polipéptidos similares poniendo en contacto un anticuerpo anti-ADAM-H9 con un polipéptido de interés y determinando si se neutraliza la actividad asociada con el polipéptido de interés. Además, la reactividad cruzada de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido ADAM-H9 de la invención es indicativo de un polipéptido que comparte características estructurales (por ejemplo, características de proteína primaria, secundaria o terciaria) con un polipéptido ADAM-H9 de la invención.

La invención proporciona tanto formas de longitud completa como madura de polipéptidos ADAM-H9. Los polipéptidos de longitud completa son los que tienen la secuencia primaria de aminoácidos completa del polipéptido tal como se tradujeron inicialmente. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos longitud completa pueden obtenerse, por ejemplo, traduciendo el marco de lectura abierto ("ORF") de una molécula de ADNc. Pueden codificarse varios polipéptidos de longitud completa por un locus genético sencillo si se producen múltiples formas de ARNm a partir de este locus mediante corte y empalme alternativo o mediante el uso de múltiples sitios de iniciación de la traducción. La "forma madura" de un polipéptido se refiere a un polipéptido que ha experimentado etapas de procesamiento posteriores a la traducción, si las hay, tales como, por ejemplo, escisión de la secuencia señal o escisión proteolítica para eliminar un prodominio. Pueden producirse múltiples formas maduras de un polipéptido de longitud completa particular, por ejemplo, mediante escisión imprecisa de la secuencia señal, o mediante regulación diferencial de proteasas que escinden el polipéptido. La(s) forma(s) madura(s) de tal polipéptido puede(n) obtenerse mediante expresión, en una célula de mamífero adecuada u otra célula huésped, de un polinucleótido que codifica para el polipéptido de longitud completa. La secuencia de la forma madura del polipéptido también puede determinarse a partir de la secuencia de aminoácidos de la forma de longitud completa, mediante la identificación de las secuencias señal o sitios de escisión de proteasas (por ejemplo, S68 o P71 de las SEQ ID NO:6 y 10 son posibles sitios de procesamiento). Los polipéptidos ADAM-H9 de la invención también incluyen polipéptidos que son el resultado de acontecimientos de procesamiento posteriores a la transcripción o posteriores a la traducción tales como procesamiento de ARNm alternativo que puede dar un polipéptido truncado pero biológicamente activo, por ejemplo, una forma soluble que se produce de manera natural del polipéptido. También se engloban en la invención variaciones atribuibles a proteolisis, tales como diferencias en los extremos N o C-terminal con la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales del polipéptido (generalmente desde los aminoácidos 1-5 terminales).

Un polipéptido de la invención puede prepararse cultivando células huésped transformadas o recombinantes en condiciones de cultivo adecuadas para expresar un polipéptido de la invención. El polipéptido expresado resultante puede purificarse entonces a partir de un cultivo de este tipo usando procedimientos de purificación conocidos, tales como la filtración en gel y cromatografía de intercambio iónico. La purificación del polipéptido también puede incluir una columna de afinidad que contiene agentes que se unirán al polipéptido; una o más etapas de columna sobre resinas de afinidad de este tipo como concanavalina A-agarosa, heparina-toyopearl® o Cibacrom blue3GA Sepharose®; una o más etapas que implican cromatografía de interacción hidrófoba usando resinas de este tipo como fenil éter, butil éter, o propil éter; o cromatografía de inmunoafinidad. Alternativamente, el polipéptido de la invención también puede expresarse en una forma que facilitará la purificación. Por ejemplo, puede expresarse como un polipéptido de fusión, tales como los polipéptidos de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST) o tiorredoxina (TRX). Existen kits para la expresión y purificación de tales polipéptidos de fusión disponibles comercialmente de New England BioLab (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ), e InVitrogen, respectivamente. El polipéptido también puede marcarse con un epítopo y posteriormente purificarse usando un anticuerpo específico dirigido a tal epítopo. Un epítopo de este tipo ("Flag") está disponible comercialmente de Kodak (New Haven, Conn.). Finalmente, puede emplearse una o varias etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) empleando medios de RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes, para purificar adicionalmente el polipéptido. También puede emplearse alguna o todas las etapas de purificación posteriores, en varias combinaciones, para proporcionar un polipéptido recombinante sustancialmente homogéneo. El polipéptido así purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos de mamífero y se define según la invención como un "polipéptido sustancialmente purificado"; tales polipéptidos purificados incluyen anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido ADAM-H9, fragmento, variante, y similares. Un polipéptido de la invención también puede expresarse como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de ovejas, cerdas, cabras o vacas transgénicas que se caracterizan por células germinales o somáticas que contienen un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la invención.

También es posible utilizar una columna de afinidad tal como un anticuerpo monoclonal generado frente a los polipéptidos de la invención, para purificar por afinidad los polipéptidos expresados. Estos polipéptidos pueden eliminarse de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, por ejemplo, en un tampón de elución rico en sal y después dializarse en un tampón pobre en sal para su uso o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriza de afinidad utilizada, o eliminarse de manera competitiva usando el sustrato que se produce de manera natural del resto de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la invención. En este aspecto de la invención, proteínas que se unen a un polipéptido de la invención (por ejemplo, un anticuerpo anti-ADAM-H9 de la invención) puede unirse a un soporte en fase sólida o un sustrato similar adecuado para la identificación, separación o purificación de células que expresan polipéptidos de la invención sobre su superficie. Puede lograrse adherencia de, por ejemplo, un anticuerpo anti-ADAM-H9 de la invención a una superficie en fase sólida por cualquier medio, por ejemplo, pueden recubrirse microesferas magnéticas con estas proteínas de unión a polipéptido y conservarse en el recipiente de incubación mediante un campo magnético. Se ponen en contacto suspensiones de mezclas de células con la fase sólida que tiene proteínas de unión a polipéptido sobre ellas. Los anticuerpos anti-ADAM-H9 se unen a las células que tienen los polipéptidos de la invención sobre su superficie (por ejemplo, un dominio extracelular de ADAM-H9). Se eliminaron por lavado las células no unidas (por ejemplo, las células que carecen del polipéptido ADAM-H9) de las células unidas. Este método de unión por afinidad es útil para la purificación, selección o separación de tales células que expresan el polipéptido de la solución. En la técnica se conocen métodos para liberar células seleccionadas positivamente de la fase sólida y engloban, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son preferiblemente no tóxicas y no dañinas para las células y preferiblemente se dirigen para escindir la pareja de unión a superficie de las células. Alternativamente, se incuban en primer lugar mezclas de células que se sospecha que contienen células que expresan polipéptido de la invención con un polipéptido de unión biotinilado de la invención. Normalmente los periodos de incubación son de al menos una hora de duración para garantizar la unión suficiente a los polipéptidos de la invención. La mezcla resultante se pasa entonces a través de una columna empaquetada con perlas recubiertas de avidina, mediante la cual la elevada afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de las células a las perlas. El uso de perlas recubiertas con avidina se conoce en la técnica (véase, Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239, 1986). Se realiza el lavado de material no unido y la liberación de las células unidas usando métodos convencionales.

Un polipéptido de la invención también puede producirse mediante síntesis química convencional conocida. Los expertos en la técnica conocen métodos para construir los polipéptidos de la invención mediante métodos sintéticos. Las secuencias de polipéptidos construidas sintéticamente, en virtud de la compartición de las características de la estructura primaria, secundaria, o terciaria y/o las características conformacionales con polipéptidos nativos pueden presentar propiedades biológicas en común con las mismas, incluyendo la actividad biológica. Por tanto, los polipéptidos sintetizados pueden emplearse como sustitutos biológicamente activos o inmunológicos de polipéptidos naturales, purificados, en la selección de compuestos terapéuticos y en procesos inmunológicos para el desarrollo de anticuerpos.

El grado de pureza deseado depende del uso pretendido del polipéptido. Se desea un grado de pureza deseado relativamente alto cuando el polipéptido va a administrarse por ejemplo in vivo. En un caso de este tipo, los polipéptidos se purifican de manera que no puedan detectarse bandas de polipéptidos correspondientes a otros polipéptidos tras el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). Un experto en el campo pertinente reconocerá que las bandas múltiples correspondientes al polipéptido pueden visualizarse mediante SDS-PAGE, debido a glucosilación diferencial, procesamiento posterior a la traducción diferencial y similares. Lo más preferiblemente, el polipéptido de la invención se purifica hasta la homogeneidad sustancial, tal como se indica mediante una banda de polipéptido única tras el análisis mediante SDS-PAGE. La banda de polipéptido puede visualizarse mediante tinción con plata, tinción con azul de Coomassie, o (si el polipéptido está radiomarcado) mediante autorradiografía.

La invención también proporciona homólogos de especie de polipéptidos ADAM-H9 y polinucleótidos que codifican para los polipéptidos. Tal como se usa en el presente documento, un "homólogo de especie" es un polipéptido o polinucleótido con una especie de origen diferente de la de un polipéptido o polinucleótido dado, pero con similitud de secuencia significativa al polipéptido o polinucleótido dado. Los homólogos de especie pueden aislarse e identificarse preparando cebadores o sondas adecuadas a partir de polinucleótidos que codifican para los polipéptidos proporcionados en el presente documento y seleccionando una fuente de ácidos nucleicos adecuada de las especies deseadas. Alternativamente, los homólogos pueden identificarse examinando una base de datos de genoma que contiene secuencias de una o más especies utilizando una secuencia (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico o aminoácidos) de un ADAM-H9 de la invención. Tales bases de datos de genoma están fácilmente disponibles para varias especies (por ejemplo, en la "world wide web" (www) en tigr.org/tdb;genetics.wisc.edu; stanford.edu/-ball; hiv-web.1an1.gov; ncbi.nlm.nig.gov; ebi.ac.uk; y pasteur.fr/other/biology). La invención también engloba variantes alélicas de polipéptidos ADAM-H9 y ácidos nucleicos que los codifican que son formas alternativas que se producen de forma natural de tales polipéptidos y polinucleótidos en las que las diferencias en las secuencias de aminoácidos o nucleótidos se atribuyen al polimorfismo genético.

Puede usarse la búsqueda de secuencias intermedia (ISS) para identificar homólogos íntimamente relacionados así como distantes contentando dos proteínas a través de una o más secuencias intermedias. ISS usa repetidamente los resultados de la búsqueda anterior como inicio para nueva búsqueda. BLAST saturado es un paquete que realiza ISS. Empezando con una secuencia de proteínas, BLAST saturado opera en un búsqueda BLAST e identifica secuencias representativas para la siguiente generación de búsquedas. Se ejecuta el procedimiento hasta la convergencia o hasta que se alcanzan algunos criterios predefinidos. BLAST saturado está disponible en la "world wide web" (www) en: bioinformatics.burnham-inst.org/xblast (véase también, Li et al. Bioinformatics 16(12):1105, 2000).

La invención también engloba fragmentos de los polipéptidos ADAM-H9 de la invención y pueden estar en forma lineal o cíclica usando métodos conocidos (véase, por ejemplo, H.U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773 (1992); y R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9245 (1992), incorporados ambos como mediante referencia en el presente documento). Los fragmentos peptídicos de los polipéptidos ADAM-H9 de la invención, y los polinucleótidos que codifican para tales fragmentos incluyen longitudes de secuencia de aminoácidos o nucleótidos que son al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, el 60%, o el 70%, y lo más preferiblemente al menos el 80%) de la longitud de un polinucleótido o polipéptido ADAM-H9. Preferiblemente, tales secuencias tendrán al menos el 60% de identidad de secuencia (más preferiblemente al menos el 70%-75%, el 80%-85%, el 90%-95%, al menos el 97,5%, o al menos el 99%, y lo más preferiblemente al menos el 99,5%) con un polinucleótido o polipéptido ADAM-H9 cuando se alinea para maximizar el solapamiento y la identidad mientras se minimizan los huecos de secuencia. También se incluyen en la invención polipéptidos, fragmentos peptídicos, y polinucleótidos que los codifican, que contienen o codifican para un segmento que comprende preferiblemente al menos de 8 a 10, o más preferiblemente al menos 20, o todavía más preferiblemente al menos 30, o lo más preferiblemente al menos 40 aminoácidos contiguos. Tales polipéptidos y fragmentos también pueden contener un segmento que comparte al menos el 70% (al menos el 75%, el 80%-85%, el 90%-95%, al menos el 97,5%, o al menos el 99%, y lo más preferiblemente al menos el 99,5%) con cualquier segmento de este tipo de cualquiera de los polipéptidos de la familia ADAM, cuando se alinea para maximizar el solapamiento y la identidad mientras se minimizan los huecos de secuencia. La inspección visual, el cálculo matemático o los algoritmos informáticos pueden determinar la identidad en porcentaje.

La invención también proporciona formas solubles de polipéptidos ADAM-H9 que comprenden ciertos fragmentos o dominios de estos polipéptidos. Son de particular interés los fragmentos solubles que tienen actividad desintegrina. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que comienza con una secuencia CGN sumamente conservada en el residuo 73 y que continúa hasta aproximadamente el residuo 361 que carece de una región transmembrana de SEQ ID NO:6 tiene actividad desintegrina. Otras formas solubles incluyen polipéptidos que comprenden SEQ ID NO:8 que comienza en un aminoácido entre e incluyendo los residuos 1 y 16 hasta el residuo 285, o SEQ ID NO: 10 que comienza en un aminoácido entre e incluyendo los residuos 1 y 73 hasta un residuo entre 314 y 329. En tales formas, parte o la totalidad de los dominios intracelular y transmembrana del polipéptido se eliminan de manera que el polipéptido se segrega totalmente de la célula en la que se expresa. Pueden identificarse los dominios intracelular y transmembrana de polipéptidos de la invención según técnicas conocidas para la determinación de tales dominios a partir de la información de la secuencia. Por ejemplo, la alineación de las secuencias polipeptídicas de la invención con otros miembros de la familia ADAM de polipéptidos que tienen dominios conocidos proporcionará información en relación con los dominios de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, se han identificado las SEQ ID NO:1 3, 6, 8 y 10 basándose en su homología con ADAM9 y tienen dominios que se prevé que pertenecen a un dominio desintegrina, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. Un polipéptido que tiene, por ejemplo, una secuencia expuesta en las SEQ ID NO:6, 8, y 10 que comienza con una secuencia CGN sumamente conservada en, por ejemplo, el residuo 73 de SEQ ID NO:6 y que continúa hasta aproximadamente el residuo 360, tiene varios residuos de cisteína conservados cuando se compara con ADAM9 e incluye un dominio desintegrina previsto de un polipéptido de la familia ADAM. Un experto en la técnica reconocerá que pueden realizarse ligeras modificaciones en el intervalo de secuencias de un dominio particular sin afectar a la actividad biológica de la molécula. Por consiguiente, la presente invención engloba los cambios en las secuencias identificadas de 1, 2, 3, 4, o 5 aminoácidos en cualquier dirección del dominio particular (por ejemplo, el dominio desintegrina de SEQ ID NO:6 puede incluir los residuos 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, o 78 hasta aproximadamente los residuos 355, 356, 357, 358, 359, 361, 362, 363, 364, o 365).

En otro aspecto de la invención, un polipéptido puede comprender varias combinaciones de dominios de polipéptidos ADAM, tales como un dominio metaloproteinasa, un dominio desintegrina, o un dominio citoplasmático. Por consiguiente, los polipéptidos y polinucleótidos de la invención incluyen los que comprenden o codifican para dos o más copias de un dominio tal como el dominio metaloproteinasa, dos o más copias de un dominio tal como el dominio desintegrina, o al menos una copia de cada dominio, y pueden presentarse estos dominios en cualquier orden dentro de tales polipéptidos. También se incluyen polipéptidos recombinantes y los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos, en los que los polipéptidos recombinantes son "polipéptidos quiméricos" o "polipéptidos de fusión" y comprenden una secuencia de ADAM-H9 tal como se expone en SEQ ID NO:1, 3, 6, 8 o 10 operativamente unida a un segundo polipéptido. El segundo polipéptido puede ser cualquier polipéptido de interés que tiene una actividad o función independiente de, o relacionada con, la función de un polipéptido ADAM-H9. Por ejemplo, el segundo polipéptido puede ser un dominio de un miembro relacionado pero distinto de la familia ADAM de polipéptidos tal como, por ejemplo, un dominio extracelular, citoplasmático, metaloproteasa, o transmembrana de un polipéptido ADAM relacionado. Se pretende que la expresión "operativamente unido" indique que la secuencia de ADAM-H9 y la secuencia del segundo polipéptido están fusionadas entre sí en marco. El segundo polipéptido puede estar fusionado al extremo N-terminal o C-terminal de una secuencia de ADAM-H9 tal como se expone en la figura 2. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión GST-ADAM-H9 en el que las secuencias de ADAM-H9 están fusionadas al extremo C-terminal de las secuencias de GST. Tales polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de secuencias de ADAM-H9 recombinantes. En otra realización, el polipéptido de fusión es una secuencia de ADAM-H9 que comprende una secuencia señal heteróloga en su extremo N-terminal. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), puede aumentarse la expresión y/o secreción de un polipéptido ADAM-H9 mediante el uso de una secuencia señal. Como otro ejemplo, un polipéptido ADAM-H9 o fragmento del mismo puede fusionarse con una cola de hexa-histidina para facilitar la purificación de la proteína expresada en bacterias, o con una cola de hemaglutinina para facilitar la purificación de la proteína expresada en células eucariotas. Además, los polipéptidos de fusión pueden comprender, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénica descritos en la patente estadounidense número 5.011.912 y en Hopp et al., Bio/ Technology 6:1204, 1988. Un péptido de este tipo es el péptido FLAG®, que es sumamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente mediante un anticuerpo monoclonal, permitiendo un ensayo rápido y la fácil purificación del polipéptido recombinante expresado. Un hibridoma murino denominado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido FLAG® en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, tal como se describió en la patente estadounidense 5.011.912, incorporada al presente documento como referencia. La línea celular de hibridoma 4E11 se ha depositado en la ATCC con el número de registro HB9259. Los anticuerpos monoclonales que se unen al péptido FLAG® están disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut.

La invención engloba oligómeros o polipéptidos de fusión que contienen un polipéptido ADAM-H9. Los oligómeros que pueden usarse como parejas de fusión pueden estar en forma de multímeros unidos covalentemente o no covalentemente, incluyendo dímeros, trímeros, u oligómeros superiores. En un aspecto de la invención, los oligómeros mantienen la capacidad de unión de los componentes polipeptídicos y proporcionan para los mismos sitios de uniones bivalentes, trivalentes y similares. En una realización alternativa, la invención se refiere a oligómeros que comprenden múltiples polipéptidos unidos a través de interacciones covalentes o no covalentes entre los restos peptídicos fusionados con los polipéptidos. Tales péptidos pueden ser ligadores peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Cremalleras de leucinas y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden estimular la oligomerización de los polipéptidos unidos a los mismos, tal como se describe con más detalle más adelante. Los oligómeros particularmente preferidos comprenden un dominio desintegrina de ADAM-H9. Tales oligómeros preferidos se ejemplifican mediante un ADAM-H9dis operativamente unido a un dominio de Fc o dominio de cremallera de leucina.

Normalmente, un ligador será un resto de ligador peptídico. La longitud del resto de ligador se elige para optimizar la actividad biológica del polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9 y puede determinarse empíricamente sin demasiada experimentación. El resto de ligador debe ser suficientemente largo y suficientemente flexible para permitir que un resto de ADAM-H9 interaccione libremente con un sustrato o ligando. El resto de ligador preferido es un péptido entre aproximadamente uno y 30 residuos de aminoácidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente dos y 15 residuos de aminoácidos. Restos de ligador preferidos son - - Gly-Gly-, GGGGS(SEQ ID NO:11), (GGGGS)n (SEQ ID NO:12), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO:13), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:14), GSTSGSGKS
SEGSGSTKG (SEQ ID NO:15), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 16), o EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:17). Se describen restos de unión, por ejemplo, en Huston; J. S., et al., PNAS 85:5879 (1988), Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6:989 (1993), y Newton, D. L., et al., Biochemistry 35:545 (1996). Otros ligadores peptídicos adecuados son los descritos en las patentes estadounidenses 4.751.180 y 4.935.233, que se incorporan al presente documento como referencia. Una secuencia de ADN que codifica para un ligador peptídico deseado puede insertarse entre, y en el mismo marco de lectura que, las secuencias de ADN de la invención, usando cualquier técnica convencional adecuada. Por ejemplo, puede ligarse entre las secuencias un oligonucleótido químicamente sintetizado que codifica para el lidagor. En realizaciones particulares, un polipéptido de fusión comprende desde dos hasta cuatro polipéptidos ADAM solubles, separados por ligadores peptídicos.

En las realizaciones en las que se construyen variantes de un polipéptido ADAM-H9 para incluir un dominio transmembrana, formarán un polipéptido de membrana tipo I. En tales realizaciones, es preferible unir la pareja de fusión al extremo C-terminal del polipéptido ADAM-H9. Alternativamente, los polipéptidos transmembrana pueden fusionarse con los polipéptidos de dominio de receptor extracelular conocidos, para los cuales también se conoce el ligando. Tales polipéptidos de fusión pueden manipularse entonces para controlar las rutas de señalización intracelular desencadenadas por el polipéptido ADAM-H9 unido. Polipéptidos que abarcan la membrana celular también pueden fusionarse con agonistas o antagonistas de receptores de la superficie celular, o moléculas de adhesión celular para modular adicionalmente efectos intracelulares de ADAM-H9. En otro aspecto de la invención, pueden situarse interleucinas entre el fragmento de polipéptido ADAM-H9 preferido y otros dominios de polipéptido de fusión.

Los polipéptidos ADAM-H9 de la invención también pueden incluir una secuencia de localización para dirigir el polipéptido a sitios celulares particulares mediante la fusión a secuencias señal que seleccionan como diana los orgánulos apropiadas o proteínas huésped localizadas. Un polinucleótido que codifica para una secuencia de localización, o secuencia señal, puede ligarse o fusionarse al extremo 5’ de un polinucleótido que codifica para un polipéptido ADAM-H9 de manera que el péptido señal está localizado en el extremo amino terminal del polinucleótido/polipéptido de fusión resultante. En eucariotas, el péptido señal funciona para transportar un polipéptido a través del retículo endoplasmático. La proteína secretora se transporta entonces a través del aparato de Golgi, hacia vesículas secretoras y hacia el espacio extracelular o el entorno externo. Los péptidos señal incluyen pre-pro-péptidos que contienen un sitio de reconocimiento enzimático proteolítico.

La secuencia de localización puede ser una secuencia de localización nuclear, de retículo endoplasmático, de peroxisoma, o mitocondrial, o una proteína localizada. Las secuencias de localización pueden ser secuencias que seleccionan como diana que se describen, por ejemplo, en "Protein Targeting", capítulo 35 de Stryer, L., Biochemistry (4ª ed.). W. H. Freeman, 1995. Algunas secuencias de señalización importantes incluyen las que seleccionan como diana el núcleo (por ejemplo, KKKRK (SEQ ID NO:18)), la mitocondria (MLRTSSLFTRRVQPSLFRNILRLQST (SEQ ID NO:19)), el retículo endoplasmático (KDEL (SEQ ID NO:20)), el peroxisoma (SKF), la membrana plasmática (CAAX (SEQ ID NO:21), CC, CXC, o CCXX (SEQ ID NO:22)), el lado citoplasmático de la membrana plasmática (fusión a SNAP-25), o el aparato de Golgi (fusión a furina).

En otra realización, un polipéptido de la invención o fragmentos del mismo pueden fusionarse a moléculas transportadoras tales como inmunoglobulinas para una variedad de fines incluyendo aumentar la valencia de los sitios de unión al polipéptido. Como ejemplo, los fragmentos del polipéptido pueden fusionarse a través de secuencias ligadoras a la parte Fc de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente del polipéptido, tal fusión podría ser a la parte Fc de una molécula de IgG. También pueden usarse otros isotipos de inmunoglobulinas para generar tales fusiones. Por ejemplo, una fusión polipéptido-IgM debe generar una forma decavalente del polipéptido de la invención. En una realización, la invención proporciona un polipéptido de fusión que tiene un dominio polipeptídico de Fc y una secuencia de polipéptido ADAM-H9, tal como se expone en SEQ ID NO:6 desde aproximadamente el aminoácido número 73 hasta aproximadamente el 360, SEQ ID NO:8 desde el aminoácido 1 o 16 hasta el 285, o SEQ ID NO: 10 desde el aminoácido 1 o 73 hasta el 314 o 329.

La expresión "polipéptido de Fc", tal como se usa en el presente documento, incluye formas nativas y de muteína de polipéptidos constituidos de la región Fc de un anticuerpo que comprende cualquiera o todos los dominios CH dominios de la región Fc. También se incluyen formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Polipéptidos preferidos comprenden un polipéptido de Fc derivado de un anticuerpo IgG1 humano. Como alternativa, se prepara un oligómero usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. Se ha descrito la preparación de polipéptidos de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a varias partes de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc), por ejemplo, por Ashkenazi et al. (PNASUSA 88:10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344:677, 1990); y Hollenbaugh y Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Polypeptides", en Current Protocols in Immunology, Supl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11, 1992). En la técnica se conocen métodos para la preparación y uso de oligómeros basados en inmunoglobulina. Una realización de la invención se refiere a un dímero que comprende dos polipéptidos de fusión creados fusionando un polipéptido de la invención con un polipéptido de Fc derivado de un anticuerpo. Un gen de fusión que codifica para el polipéptido/polipéptido de fusión Fc se inserta en un vector de expresión apropiado. Se expresan el polipéptido/ polipéptidos de fusión Fc en células huésped trasformadas o transfectadas con el vector de expresión recombinante o polinucleótido recombinante que codifica para el polipéptido de fusión, y se dejan que se reúnan de manera muy parecida a moléculas de anticuerpo, tras lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los restos de Fc para dar moléculas divalentes. Un polipéptido de Fc adecuado, escrito en solicitud PCT WO 93/10151 (incorporada al presente documento como referencia), es un polipéptido de cadena sencilla que se extiende desde la región bisagra N-terminal hasta el extremo C-terminal nativo de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipéptido de Fc útil es la muteína Fc descrita en la patente estadounidense 5.457.035 y en Baum et al., (EMBO J. 13:3992, 1994) incorporada al presente documento como referencia. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto en que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La muteína muestra afinidad reducida para los receptores de Fc. Los polipéptidos de fusión anteriormente descritos que comprenden restos de Fc (y los oligómeros formados a partir de los mismos) ofrecen la ventaja de la purificación fácil mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de polipéptido A o polipéptido G. En otras realizaciones, los polipéptidos de la invención pueden sustituirse por la parte variable de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo. Si se preparan polipéptidos de fusión con cadenas tanto pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero con hasta cuatro regiones extracelulares de ADAM-H9 y/o ADAM.

Otro método para preparar los oligómeros de la invención implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que estimulan la oligomerización (dímeros y trímeros) de los polipéptidos en los que se encuentran. Originalmente se identificaron cremalleras de leucinas en varios polipéptidos de unión a ADN (Landschulz et al., Science 240:1759,1988), y desde entonces se han encontrado en una variedad de polipéptidos diferentes. El dominio de cremallera comprende una repetición de siete aminoácidos repetitivos, a menudo con cuatro o cinco residuos de leucina intercalados con otros aminoácidos.

Un polipéptido quimérico o de fusión de la invención puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante. En una realización, fragmentos de polinucleótido que codifican para las diferentes secuencias de polipéptidos están ligados juntos en marco según técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos romos o escalonados para el ligamiento, digestión por enzimas de restricción para proporcionar los extremos apropiados, llenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseable y el ligamiento enzimática. Ejemplos de polinucleótidos que codifican para todos o partes de polipéptidos ADAM-H9 se exponen en la figura 3. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores automáticos de ADN. Alternativamente, puede llevarse a cabo amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de anclaje que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden aparearse posteriormente y volverse a amplificar para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Es más, muchos vectores de expresión están disponibles comercialmente que ya codifican para un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST).

La invención incluye adicionalmente polipéptidos con o sin glucosilación de patrón nativo asociado. Polipéptidos expresados en sistemas de expresión de levaduras o de mamíferos (por ejemplo, células COS-1 o CHO) pueden ser similares a o significativamente diferentes de un polipéptido nativo en el peso molecular y el patrón de glucosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de los polipéptidos de la invención en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glucosiladas. Además, una preparación dada puede incluir especies glucosiladas de manera diferente del polipéptido. Los grupos glucosilo pueden eliminarse mediante métodos convencionales, en particular los que usan glucopeptidasa.

En otra realización, pueden hacerse modificaciones en el polipéptido o polinucleótido usando técnicas conocidas. Las modificaciones de interés en las secuencias de polipéptido pueden incluir la alteración, sustitución, reemplazo, inserción, deleción de un residuo de aminoácido seleccionado en la secuencia codificante. Por ejemplo, uno o más de los residuos de cisteína puede delecionarse o sustituirse con otro aminoácido para alterar la conformación de la molécula, una alteración que puede suponer evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras el plegamiento o renaturalización. Las técnicas para tal alteración, sustitución, reemplazo, inserción o deleción son conocidas para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 4.518.584). Como otro ejemplo, pueden modificarse los sitios de N-glucosilación en un domino extracelular de un polipéptido para excluir la glucosilación, permitiendo la expresión de un análogo de hidrato de carbono reducido en sistemas de expresión de mamífero y de levadura. Los sitios de N-glucosilación en polipéptidos eucariotas se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro, e Y es Ser o Thr. Sustituciones, adiciones o deleciones apropiadas para la secuencia de nucleótidos que codifica para estos tripletes darán como resultado la prevención de la unión de residuos de hidrato de carbono en la cadena lateral de Asn. La alteración de un nucleótido sencillo, elegido de manera que Asn se sustituya por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glucosilación. Alternativamente, la Ser o el Thr pueden sustituirse por otro aminoácido, tal como Ala. Procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glucosilación en polipéptidos incluyen los descritos en la patente estadounidense 5.071.972 y el documento EP 276.846, incorporados al presente documento como referencia. Posibles sitios de N-glicosilación incluyen N23 de SEQ ID NO:1; N37 de SEQ ID NO:3; N53 de SEQ ID NO:4; N144 y N277 de SEQ ID NO:6; N10, N69, y N202 de SEQ ID NO:8; y N144,N277 de SEQ ID NO:10.

Variantes adicionales dentro del alcance de la invención incluyen polipéptidos que pueden modificarse para crear derivados de los mismos mediante formación de conjugados covalentes o de agregación con otros restos químicos, tales como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Pueden prepararse derivados covalentes uniendo los restos químicos a grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos o en el extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido. En el presente documento se contemplan conjugados que comprenden agentes terapéuticos o de diagnóstico (detectables) unidos a los mismos. Preferiblemente, tal alteración, sustitución, reemplazo, inserción o deleción conserva la actividad deseada del polipéptido.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican para polipéptidos ADAM-H9. El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, o formas modificadas de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de cadena sencilla y doble de ADN o ARN. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN químicamente sintetizado, ADN amplificado mediante PCR, y combinaciones de los mismos. Los polinucleótidos de la invención incluyen genes de longitud completa y moléculas de ADNc, así como una combinación de fragmentos de los mismos. Los polinucleótidos de la invención se derivan preferentemente de fuentes humanas, pero la invención incluye los derivados de especies no humanas, también.

Por "polinucleótido aislado" se quiere decir un polinucleótido que no es inmediatamente contiguo con ambas secuencias codificantes con el que es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5’ y una en el extremo 3’) en el genoma que se produce de manera natural del organismo del que se deriva. El término por tanto incluye, por ejemplo, una molécula de polinucleótido recombinante, que está incorporada en un vector, por ejemplo, un vector de expresión; en un virus o plásmido que se replica de manera autónoma; o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias.

Un polinucleótido ADAM-H9 (1) descrito y/o reivindicado en el presente documento codifica para un polipéptido que comprende una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, o 10; (2) tiene una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7, o 9 (véase, por ejemplo, la figura 3); (3) tiene secuencias complementarias a una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7, o 9; (4) fragmentos de las SEQ ID NO:2, 5, 7, o 9 o sus complementos que se hibridan específicamente con el polinucleótido de (2) o (3) en condiciones de moderadas a rigurosas; (5) polinucleótidos de (1), (2), (3), o (4) en los que T también puede ser U (por ejemplo, secuencias de ARN). También se describen homólogos de un polinucleótido ADAM-H9 de la invención. Estos polinucleótidos pueden identificarse de varias maneras, incluyendo aislamiento de moléculas genómicas o de ADNc a partir de una fuente adecuada, o búsquedas computacionales de bases de datos de secuencias disponibles. Pueden usarse oligonucleótidos o polinucleótidos correspondientes a las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento como sondas o cebadores para el aislamiento de homólogos de polinucleótido o como secuencias de búsqueda para búsquedas de bases de datos. Pueden obtenerse secuencias de oligonucleótidos degeneradas mediante "traducción inversa" a partir de las secuencias de aminoácidos de la invención. Puede emplearse el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar y amplificar una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido ADAM o una combinación deseada de fragmentos de polipéptido ADAM. Se emplean oligonucleótidos que definen el extremo deseado de una molécula de ADN diana como cebadores 5’ y 3’. Por consiguiente, los fragmentos de los polinucleótidos de la invención son útiles como sondas y cebadores para identificar o amplificar la secuencia relacionada o para obtener secuencias de longitud completa de un ADAM-H9 de la invención. Los oligonucleótidos pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción de la combinación amplificada de fragmentos de ADN en un vector de expresión. Las técnicas de PCR se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990)).

La invención también incluye polinucleótidos y oligonucleótidos que se hibridan en condiciones de rigurosidad reducidas, más preferiblemente condiciones moderadamente rigurosas, y lo más preferiblemente condiciones sumamente rigurosas, a los polinucleótidos ADAM-H9 descritos en el presente documento. Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de hibridación y a la guía para deducir condiciones adecuadas se exponen por Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4, incorporados al presente documento como referencia), y pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica basándose, por ejemplo, en la longitud y/o la composición de las bases del polinucleótido. Una manera de lograr condiciones moderadamente rigurosas supone el uso de una solución de prelavado que contiene 5 x SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de formamida aproximadamente al 50%, 6 x SSC, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 55°C (u otras soluciones de hibridación similares, tal como una que contiene formamida a aproximadamente el 50%, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42°C), y condiciones de lavado de aproximadamente 60°C, en 0,5 x SSC, SDS al 0,1%. Generalmente, se definen condiciones sumamente rigurosas como las condiciones de hibridación anteriores, pero con lavado a aproximadamente 68°C, 0,2 x SSC, SDS al 0,1%. SSPE (1xSSPE es NaCl 0,15 M, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituirse por SSC (1xSSC es NaCl 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos una vez que se completa la hibridación. Debe entenderse que la temperatura de lavado y la concentración de sal de lavado pueden ajustarse según sea necesario para lograr un grado deseado de rigurosidad aplicando los principios básicos que rigen las reacciones de hibridación y estabilidad de dúplex, tal como conocen los expertos en la técnica y descritos adicionalmente más adelante (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Cuando se hibrida un ácido nucleico con un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se supone que la longitud del híbrido es la del ácido nucleico con que se está hibridando. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse mediante la alineación de las secuencias de los ácidos nucleicos e identificando la región o regiones de complementariedad de secuencia óptima. Se prevé que la temperatura de hibridación para híbridos inferiores a 50 pares de bases de longitud debe ser de 5 a 10°C inferior a la temperatura de fusión (T_{f}) del híbrido, donde T_{f} se determina según una de las siguientes ecuaciones. Para híbridos inferiores a 18 pares de bases de longitud, T_{f} (°C) = 2 (número de bases A + T) + 4
(número de bases G + C). Para híbridos superiores a 18 pares de bases de longitud, T_{f} (°C) = 81,5 + 16,6(log_{10} [Na^{+}]) +
0,41(% G + C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na^{+}] es la concentración de iones sodio en el tampón de hibridación ([Na^{+}] para 1xSSC = 0,165M). Preferiblemente, cada ácido nucleico que se hibrida de este tipo tiene una longitud que es al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, el 60%, o el 70%, y lo más preferiblemente al menos el 80%) de la longitud de un polinucleótido de la invención con el cual se hibrida y tiene al menos el 60% de identidad de secuencia (más preferiblemente al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97,5%, o al menos el 99%, y lo más preferiblemente al menos el 99,5%) con un polinucleótido de la invención con el que se hibrida.

"Variantes modificadas de manera conservativa" se aplica tanto al polipéptido como al polinucleótido. Con respecto a polinucleótido particular, las variantes modificadas de manera conservativa se refieren a codones en el polinucleótido que codifican para aminoácidos idénticos o esencialmente idénticos. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de polinucleótidos funcionalmente idénticos codifican para cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican para el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición en la que una alanina se especifica por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de manera conservativa. Cada secuencia de polinucleótidos en el presente documento que codifica para un polipéptido también describe todas las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un polinucleótido (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina) puede modificarse para dar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

La invención también proporciona metodología para el análisis de polinucleótidos de la invención sobre "chips de ADN" tal como se describe en Hacia et al., Nature Genetics, 14:441-447 (1996). Por ejemplo, se aplican matrices de alta densidad de oligonucleótidos que comprenden una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7, 9, o una variante o forma mutante de la misma y se inmovilizan sobre el chip y pueden usarse para detectar variaciones de secuencia en una población. En una muestra de prueba, se hibridan los polinucleótidos a los oligonucleótidos inmovilizados. El perfil de hibridación del polinucleótido diana a la sonda inmovilizada se cuantifica y compara con un perfil de referencia. La información genética resultante puede usarse en el diagnóstico molecular. Puede modificarse la densidad de los oligonucleótidos sobre los chips de ADN según sea necesario.

La invención también proporciona genes correspondientes a los polinucleótidos descritos en el presente documento. "Genes correspondientes" son las regiones del genoma que se transcriben para producir los ARNm de los cuales se derivan las moléculas de ADNc y pueden incluir regiones contiguas del genoma necesarias para la expresión regulada de tales genes. Por tanto, los genes correspondientes pueden incluir, pero sin limitarse a, secuencias codificantes, regiones no traducidas en 5’ y 3’, exones alternativamente cortados y empalmados, intrones, promotores, potenciadores, y silencidadores o elementos supresores. Los genes correspondientes pueden aislarse según métodos conocidos usando la información de secuencia descrita en el presente documento. Tales métodos incluyen la preparación de sondas o cebadores a partir de la información de secuencia descrita para la identificación y/o amplificación de genes en bibliotecas genómicas apropiadas u otras fuentes de materiales genómicos.

Puede realizarse la expresión, aislamiento, y purificación de los polipéptidos y fragmentos de la invención mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo pero sin limitarse a, los siguientes métodos.

Los polinucleótidos aislados de la invención pueden estar operativamente unidos a una secuencia control de la expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19:4485 (1991); y Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985, y Suplementos), con el fin de producir recombinantemente un polipéptido de la invención. En la técnica se conocen muchas secuencias control de la expresión. También se conocen métodos generales para expresar polipéptidos recombinantes y se ejemplifican en R. Kaufman, Methods in Enzymology 185:537 (1990). Tal como se define en el presente documento "operativamente unido" significa que un polinucleótido aislado de la invención y una secuencia control de la expresión están situados en un vector o célula de tal manera que el polipéptido codificado por el polinucleótido se expresa por una célula huésped que se ha transformado (transfectado) con el vector o polinucleótido operativamente unido a la secuencia control.

Además, una secuencia que codifica para un péptido señal apropiado (nativo o heterólogo) puede incorporarse en vectores de expresión. La elección de una secuencia líder o péptido señal puede depender de factores tales como el tipo de células huésped en las que va a producirse el polipéptido recombinante. Ejemplos de péptidos señal heterólogos que son funcionales en células huésped de mamíferos incluyen la secuencia señal para interleucina (IL)-7 (véase, patente estadounidense 4.965.195); la secuencia señal para el receptor de IL-2 (véase, Cosman et al., Nature 312:768, 1984); el péptido señal del receptor de IL-4 (véase, el documento EP 367.566); el péptido señal del receptor de IL-1 de tipo I (véase, patente estadounidense 4.968.607); y el péptido señal del receptor de IL-1 de tipo II (véase, el documento EP 460.846). Un péptido señal que es funcional en las células huésped deseadas estimula la secreción extracelular del polipéptido. El péptido señal se escinde del polipéptido tras la secreción de un polipéptido de la célula. Una preparación de polipéptido puede incluir una mezcla de moléculas polipeptídicas que tienen diferentes aminoácidos N-terminal, que resultan de la escisión del péptido señal en más de un sitio.

Se han descrito métodos establecidos para introducir ADN en células de mamíferos (Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, págs. 15-69). Pueden usarse protocolos adicionales usando reactivos comercialmente disponibles, tales como Lipofectamina o Lipofectamina-más reactivo lipídico (Gibco/BRL), para transfectar células (Felgner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7413, 1987). Además, puede usarse la electroporación para transfectar células de mamíferos usando procedimientos convencionales, tales como los que aparecen en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Puede realizarse la selección de transformantes estables usando métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185:487, 1990, describe varios esquemas de selección, tales como resistencia a dihidrofolato reductasa (DHFR). Una variedad adecuada para la selección de DHFR puede ser la variedad DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980). Puede introducirse un plásmido que expresa el ADNc de DHFR en la variedad DX-B11, y sólo las células que contienen el plásmido pueden crecer en los medios selectivos apropiados. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que pueden incorporarse en un vector de expresión incluyen ADNc que confieren resistencia frente a antibióticos, tales como G418 e higromicina B. Se seleccionan células que albergan al vector basándose en la resistencia frente a estos compuestos.

Alternativamente, pueden obtenerse productos génicos a través de recombinación homóloga, o técnicas de "selección como diana de genes". Tales técnicas emplean la introducción de elementos control de transcripción exógena (tales como el promotor de CMV o similares) en un sitio predeterminado particular en el genoma, para inducir la expresión de un ADAM-H9 endógeno de la invención. La ubicación de la integración en un cromosoma huésped o genoma puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica, dada la ubicación conocida y la secuencia del gen. En una realización preferida, la invención también contempla la introducción de elementos control transcripcionales exógenos junto con un gen amplificable, para producir cantidades aumentadas del producto génico. La práctica de recombinación homóloga o de selección como diana de genes se explica por Chappel en la patente estadounidense número 5.272.071 (véase también Schimke, et al. "Amplification of Genes in Somatic Mammalian cells", Methods in Enzymology 151:85 (1987), y por Capecchi, et al., "The New Mouse Genetics: Altering the Genome by Gene Targeting", TIG 5:70 (1989)).

Células huésped adecuadas para la expresión del polipéptido incluyen células eucariotas y procariotas. Células huésped de mamíferos incluyen, por ejemplo, la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, líneas de células BHK (ATCC CRL 10), línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (véase, McMahan et al. EMBO J. 10: 2821, 1991), células 293 de riñón humanas, células A431de la epidermis humana, células Colo205 humanas, otras líneas celulares de primates transformadas, células diploide normales, variedades celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, HL-60, U937, HaK o células Jurkat. Alternativamente, puede ser posible producir el polipéptido en eucariotas inferiores tales como levadura o en procariotas tales como bacterias. Cepas de levadura potencialmente adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa de levadura que puede expresar polipéptidos heterólogos. Cepas bacterianas potencialmente adecuadas incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana que puede expresar polipéptidos heterólogos. Si el polipéptido se prepara en levaduras o bacterias, puede ser necesario modificar el polipéptido producido en las mismas, por ejemplo mediante fosforilación o glucosilación de los sitios apropiados, con el fin de obtener el polipéptido funcional. Tales uniones covalentes pueden conseguirse usando métodos químicos o enzimáticos conocidos. El polipéptido también puede producirse uniendo operativamente un polinucleótido de la invención a secuencias control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insecto, y empleando un sistema de expresión de insecto. Materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/insecto están comercialmente disponibles en forma de kit de, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU. (el kit MaxBac®), así como métodos descritos en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), y Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988), incorporados al presente documento como referencia. También podrían emplearse sistemas de traducción libres de células para producir polipéptidos que usan ARN derivados de constructos de acido nucleico descritos en el presente documento. Una célula huésped que comprende un polinucleótido aislado de la invención, unido preferiblemente de manera operativa a al menos una secuencia control de expresión, es una "célula huésped recombinante".

En algunos casos puede ser deseable reducir la cantidad de actividad de un polipéptido ADAM-H9 en el que la sobreexpresión o actividad aberrante de ADAM-H9 está asociada con un trastorno o enfermedad. Puede usarse cualquier método que neutraliza los polipéptidos ADAM-H9 o inhibe la expresión (o bien la transcripción o bien la traducción) de un polinucleótido ADAM-H9 para reducir las actividades biológicas de los polipéptidos ADAM-H9.

Pueden diseñarse antagonistas para reducir el nivel de expresión de ADAM-H9 endógeno, por ejemplo, usando enfoques de ribozima o antisentido conocidos para inhibir o evitar la traducción de transcriptos de ARNm de ADAM-H9; enfoques de triple hélice para inhibir la transcripción de genes ADAM-H9; o recombinación homóloga dirigida para inactivar o "desactivar" los genes de ADAM-H9 o sus elementos potenciadores o promotores endógenos. Tales antagonistas antisentido, de ribozima y de triple hélice pueden diseñarse para reducir o inhibir la actividad de ADAM-H9 o bien dañada o bien, si es apropiado, mutante.

Las moléculas de ARN y ADN antisentido actúan para bloquear directamente la traducción de ARNm hibridándose con un ARNm dirigido y evitando la traducción de polipéptidos. Los enfoques antisentido implican el diseño de oligonucleótidos (o bien ADN o bien ARN) que son complementarios a un ARNm que tiene una secuencia de polinucleótido ADAM-H9. No se requiere, aunque se prefiere, la complementariedad absoluta. Los oligonucleótidos que son complementarios al extremo 5’ del mensaje, por ejemplo, la secuencia no traducida en 5’ hasta, e incluyendo, el codón de iniciación AUG, deben funcionar lo más eficazmente en la inhibición de la traducción. Los ácidos nucleicos antisentido son preferiblemente oligonucleótidos que varían desde 6 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser ADN, ARN, mezclas quiméricas, derivados o versiones modificadas de los mismos, de cadena sencilla o de cadena doble. El oligonucleótido puede modificarse en el resto básico, resto de azúcar, o esqueleto de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, hibridación y similares. El oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos tales como péptidos (por ejemplo, para seleccionar como diana receptores de células huésped in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véanse, por ejemplo, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648, 1987; publicación PCT número WO88/09810), o agentes de intercalación o agentes de escisión desencadenados por la hibridación (véase, por ejemplo, Zon, Pharm. Res. 5:539, 1988). Se administran las moléculas antisentido a células, que expresan un transcrito que tiene una secuencia de polinucleótido ADAM-H9 in vivo mediante, por ejemplo, inyección directa en el sitio de derivación celular o tisular, o moléculas antisentido modificadas, diseñadas para seleccionar como diana las células deseadas (por ejemplo, moléculas antisentido unidas a péptidos o anticuerpos que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados en la superficie celular diana) pueden administrarse sistémicamente. Un enfoque preferido utiliza un constructo de ADN recombinante en el que el oligonucleótido antisentido está situado bajo el control de un fuerte promotor de pol III o pol II.

Las moléculas de ribozima diseñadas para escindir catalíticamente transcriptos de ARNm que tienen una secuencia de polinucleótido ADAM-H9 evitan la traducción de ARNm de ADAM-H9 (véanse, por ejemplo, publicación internacional PCT WO90/11364, patente estadounidense número 5.824.519). Los ribozimas son moléculas de ARN que tienen la capacidad de escindir específicamente otro ARN de cadena sencilla. Dado que las ribozimas son específicas de secuencia, sólo se inactivan ARNm con secuencias particulares. Existen dos tipos básicos de ribozimas concretamente, tipo Tetrahymena (Hasselhoff, Nature, 334:585, 1988) y de tipo "cabeza de martillo". Las ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen secuencias, que son de cuatro bases de longitud, mientras que las ribozimas de tipo "cabeza de martillo "reconocen secuencias de bases de 11-18 bases de longitud. Cuanto más larga es la secuencia de reconocimiento, mayor es la probabilidad de que la secuencia se produzca exclusivamente en las especies de ARNm diana. En consecuencia, las ribozimas de tipo cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas de tipo Tetrahymena. Como en el enfoque antisentido, las ribozimas pueden estar compuestas por oligonucleótidos modificados y administrarse usando un constructo de ADN "que codifica para" la ribozima bajo el control de un fuerte promotor pol III o pol II constitutivo.

Alternativamente, puede reducirse la expresión de ADAM-H9 endógeno seleccionando como diana secuencias de ADN complementarias a una región reguladora del gen diana (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores del gen diana) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen diana (véase de manera general, Helene, Anticancer Drug Des., 6(6), 569, 1991; Helene, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27, 1992; y Maher, Bioassays 14(12), 807, 1992).

Pueden prepararse moléculas antisentido, de ribozima y de triple hélice mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ADN y ARN e incluir técnicas para sintetizar químicamente oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos tales como, por ejemplo, síntesis química de fosforamidita en fase sólida usando un sintetizador automático de ADN disponible de Biosearch, Applied Biosystems. Pueden sintetizarse oligonucleótidos de fosforotioato mediante el método de Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209, 1988. Pueden prepararse oligonucleótidos de metilfosfonato mediante el uso de soportes poliméricos de vidrio de poro controlado (Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448, 1988). Alternativamente, pueden generarse moléculas de ARN mediante transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican para la molécula de ARN antisentido.

La expresión génica endógena también puede reducirse inactivando o "desactivando" el gen diana o su promotor usando recombinación homóloga dirigida (véanse, por ejemplo, Smithies, et al., Nature 317:230, 1985; Thomas y Capecchi, Cell 51, 503, 1987; Thompson, et al., Cell 5, 313, 1989; cada uno de los cuales se incorpora como referencia al presente documento en su totalidad). Por ejemplo, puede usarse un gen diana no funcional mutante (o una secuencia de ADN no relacionada completamente) flanqueado por ADN homólogo al gen diana endógeno, con o sin un marcador seleccionable y/o marcador seleccionable negativo. La inserción del constructo de ADN, a través de recombinación homóloga dirigida, da como resultado la inactivación del gen diana. Tales enfoques son particularmente adecuados cuando pueden usarse modificaciones a células madre embrionarias para generar crías de animales no humanos con un gen diana inactivo (por ejemplo, véase Thomas y Capecchi, 1987 y Thompson, 1989, citados anteriormente; véase también la técnica de "interferencia por ARN" ("ARNi") de Grishok et al., Science 287 (5462): 2494, 2000), y Dernburg et al., Genes Dev. 14 (13): 1578, 2000).

Tal como se usa en el presente documento, un "animal transgénico" es un animal que incluye un transgén que se inserta en una célula embrionaria y se convierte en una parte del genoma del animal que se desarrolla a partir de esa célula, o una cría de tal animal. Cualquier animal no humano que puede producirse mediante tecnología transgénica está incluido en la invención, aunque se prefieren mamíferos. Los mamíferos preferidos incluyen primates no humanos, ovejas, cabras, caballos, ganado, cerdos, conejos y roedores, tales como cobayas, hámster, ratas, jerbos y ratones.

Un "transgén" es un polinucleótido que comprende una o más secuencias seleccionadas (por ejemplo, ribozimas codificantes que escinden ARNm de ADAM-H9, que codifican para una molécula antisentido a ARNm de ADAM-H9, que codifican para una secuencia de ADAM-H9 mutante, y similares) para expresarse en un animal transgénico. El polinucleótido es parcial o completamente heterólogo, es decir, foráneo, al animal transgénico, u homólogo a un gen endógeno del animal transgénico, pero que se ha diseñado para insertarse en el genoma del animal en una ubicación que difiere de la del gen natural. Un transgén puede incluir uno o más promotores y cualquier otra secuencia de ADN, tales como intrones, necesarias para la expresión del ADN seleccionado, todas operativamente unidas al ADN seleccionado, y puede incluir una secuencia potenciadora.

Puede usarse el animal transgénico con el fin de identificar el impacto de niveles de ADAM-H9 aumentados o disminuidos sobre una ruta o fenotipo particular. En la técnica se conocen protocolos útiles en la producción de tales animales transgénicos (véase, por ejemplo, Brinster, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:4438, 1985; Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260, 1976; Hogan, et al., 1986, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Jahner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927, 1985; Van der Putten, et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 82:6148; Steward, et al., EMBO J., 6:383, 1987; Jahner, et al., Nature, 298:623, 1982).

En otra realización, se proporcionan en el presente documento anticuerpos que son inmunorreactivos con los polipéptidos de la invención. Los polipéptidos ADAM-H9, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares, tal como se expuso anteriormente, pueden emplearse como "inmunógenos" para producir anticuerpos inmunorreactivos con los mismos. Tales anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos a través de los sitios de unión a antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos que se unen específicamente son los que reconocerán específicamente y se unirán con polipéptidos de la familia ADAM-H9, homólogos, y variantes, pero no con otras moléculas. En una realización preferida, los anticuerpos son específicos para polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de ADAM-H9 de la invención y no reacciona de manera cruzada con otros polipéptidos.

Más específicamente, los polipéptidos, fragmento, variantes, polipéptidos de fusión, y similares contienen determinantes antigénicos o epítopos que provocan la formación de anticuerpos. Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser o bien lineales o bien conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales están compuestos por una sección única de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos están compuestos por secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena polipeptídica que se acercan mucho tras el plegamiento del polipéptido. Pueden identificarse epítopos mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente, pueden usarse epítopos de los polipéptidos de la invención como reactivos de investigación, en ensayos, y para purificar anticuerpos de unión específica de sustancias tales como sueros policlonales o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Tales epítopos o variantes de los mismos pueden producirse usando técnicas conocidas en la técnica tales como síntesis en fase sólida, escisión química o enzimática de un polipéptido, o usando tecnología de ADN recombinante.

Pueden prepararse anticuerpos tanto policlonales como monoclonales frente a los polipéptidos de la invención mediante técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988); Kohler y Milstein, (patente estadounidense número 4.376.110); la técnica del hibridoma de células B humano (Kosbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026, 1983); y la técnica del hibridoma de VEB (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). También se contemplan en el presente documento líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de la invención. Tales hibridomas pueden producirse e identificarse mediante técnicas convencionales. Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos animales huésped mediante inyección con un polipéptido ADAM-H9, fragmento, variante o mutantes del mismo. Tales animales huésped pueden incluir, pero no se limitan a, conejos, ratones, y ratas, por nombrar algunos. Pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dependiendo de las especies huésped, tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Pueden recuperarse los anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales. Tales anticuerpos monoclonales pueden ser cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de las mismas.

Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Takeda et al., Nature, 314:452, 1985) mediante corte y empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígenos apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes se derivan de diferentes especies animales, tales como los que tienen una región variable derivada de AcM porcino y una región constante de imunoglobulina humana. Los anticuerpos monoclonales de la invención también incluyen versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas y presentan la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando se administran los anticuerpos a seres humanos. Por ejemplo, pueden emplearse ratones transgénicos en los que se ha introducido material genético que codifica para una o más cadenas de inmunoglobulina humana. Tales ratones pueden alterarse genéticamente en una variedad de formas. La manipulación genética puede dar como resultado cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina humana que sustituyen cadenas de inmunoglobulina endógenas en al menos algunos (preferiblemente casi todos) anticuerpos producidos por el animal tras la inmunización. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales modificados adicionalmente por ingeniería y quiméricos incluyen los descritos en Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/ Technology 7:934, 1989), y Winter y Harris (TIPS 14:139, Can, 1993). Pueden encontrarse procedimientos para generar anticuerpos transgénicamente en el documento GB 2.272.440, patentes estadounidenses números 5.569.825 y 5.545.806 y patentes relacionadas que reivindican prioridad de las mismas, todos los cuales se incorporan como referencia al presente documento. Preferiblemente, para su uso en seres humanos, los anticuerpos son humanos o humanizados; también se conocen técnicas para crear tales anticuerpos humanos. Los animales transgénicos para preparar anticuerpos humanos están disponibles de, por ejemplo, Medarex Inc. (Princeton, NJ) y Abgennix Inc. (Fremont, CA).

Puede usarse la expresión de secuencias de inmunoglobulina humanizada en huéspedes bacterianos para seleccionar secuencias de inmunoglobulina humanizada de mayor afinidad sometiendo a mutagénesis las regiones CDR y produciendo bibliotecas de exposición en bacteriófago que pueden examinarse para detectar variantes de CDR de inmunoglobulina inmunizada que tienen unión de alta afinidad y/o alta especificidad a un polipéptido ADAM-H9 o fragmento del mismo. Una ventaja potencial de tal mejora de la afinidad es la generación de variantes de CDR de inmunoglobulina humanizada que presentan afinidad de unión mejorada y/o reactividad cruzada reducida con moléculas diferentes al polipéptido ADAM-H9 o fragmento del mismo. En la técnica se proporcionan métodos para producir bibliotecas de exposición en fago que tienen secuencias de región variable de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Cesareni, FEBS Lett 307:66, 1992; Swimmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3756, 1992; Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576,1992; Clackson et al., Nature 352:624, 1991; Scott & Smith, Science 249:386, 1990; Garrard et al., Bio/Techniques 9:1373, 1991. Las secuencias de inmunoglobulina humanizada de variantes de CDR de afinidad mejorada resultantes se expresan posteriormente en un huésped adecuado.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo, que reconocen epítopos específicos, mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a: los fragmentos F(ab’)_{2} que pueden producirse mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos (ab’)_{2}. Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab (Huse et al., Science, 246:1275, 1989) para permitir una identificación rápida y sencilla de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. También pueden adaptarse las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente estadounidense número 4.946.778; Bird, Science 242:423, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; y Ward et al., Nature 334:544, 1989) para producir anticuerpos de cadena sencilla frente a polipéptidos que contienen secuencias de aminoácidos de ADAM-H9. Además, pueden utilizarse, a su vez, anticuerpos frente al polipéptido ADAM-H9 para generar anticuerpos anti-idiotipo que "imitan" a un polipéptido ADAM-H9 y que pueden unirse al polipéptido ADAM-H9 usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. (véanse, por ejemplo, Greenspan & Bona, FASEB J 7(5):437, 1993; y Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429, 1991).

Se conocen procedimientos de selección para identificar tales anticuerpos, y pueden implicar por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad. Pueden seleccionarse anticuerpos por sus propiedades agonistas (es decir, que imitan a ligando). Tales anticuerpos, tras unirse a un polipéptido ADAM-H9 en la superficie celular, pueden inducir efectos biológicos (por ejemplo, transducción de señales biológicas) similares a los efectos biológicos inducidos cuando la pareja de unión a ADAM-H9 que se produce de manera natural se une al polipéptido en la superficie celular. Pueden usarse
anticuerpos agonistas para inducir comunicación intracelular o rutas coestimuladoras mediadas por ADAM-H9.

Además, pueden usarse anticuerpos que bloquean la unión de un polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9 de la invención a su pareja de unión para inhibir la comunicación intracelular mediada por ADAM-H9 o la coestimulación que resulta de tal unión y/o para identificar análogos de integrina de ADAM-H9. Tales anticuerpos de bloqueo pueden identificarse usando cualquier procedimiento de ensayo adecuado, tal como someter a prueba anticuerpos para determinar la capacidad para inhibir la unión de un polipéptido ADAM-H9 a ciertas células que expresan una pareja de unión (por ejemplo, una integrina) para el polipéptido. Alternativamente, pueden identificarse anticuerpos de bloqueo en ensayos para determinar la capacidad para inhibir un efecto biológico que resulta de la unión de un polipéptido ADAM-H9 a células diana. En una realización, se usa un ensayo de inhibición de la unión basado en AcM de integrina de citometría de flujo para mostrar la unión de polipéptidos ADAM-H9dis-Fc con integrinas expresadas en la superficie de células endoteliales. Pueden usarse células endoteliales humanas en tal ensayo. Las células endoteliales humanas expresan integrinas \alpha_{v}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{5}, \beta_{1}, \beta_{4}, \alpha_{1}, \alpha_{2}, \alpha_{3}, \alpha_{4}, \alpha_{5}, y \alpha_{6}. Se pone en contacto un polipéptido ADAM-H9dis-Fc con las células endoteliales. Los anticuerpos monoclonales específicos para integrinas humanas \alpha_{v}\beta_{3} (LM609, anti-CD51/61, Chemicon, Temecula, CA; Brooks et al., Science 264:569, 1994), \alpha_{2}\beta_{1} (BHA2.1, anti-CD49b, Chemicon; Wang et al., Mol. Biol. of the Cell 9:865, 1998), \alpha_{5}\beta_{1} (SAM-1, anti-CD49e, Biodesign; A. te Velde et al., J. Immunol. 140:1548, 1988), (\alpha_{3}\beta_{1}, (ASC-6, anti-CD49c, Chemicon; Pattaramalai et al., Exp. Cell. Res. 222: 281,1996), \alpha_{4}\beta_{1}, (HP2/1, anti-CD49d, Immunotech, Marsella, Francia; Workshop of the 4th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Viena Austria, 1989, número de taller p091), \alpha_{6}\beta_{1} (GoH3, anti-CD49f, Immunotech; Workshop 4th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, número de taller p055), \alpha_{6}\beta_{4} (439-9B, anti-CD104, Pharmingen, San Diego, CA; Schlossman et al., 1995 Leukocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, Nueva York), y \alpha_{v}\beta_{5} (MAB 1961, Chemicon; Weinaker, et al., J.Biol. Chem. 269:6940, 1994) pueden unirse específicamente a HMVEC-d. Se sabe que cada uno de estos anticuerpos bloquea específicamente la unión de la integrina indicada a sus ligandos (por ejemplo, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno). La capacidad de los AcM de integrina para inhibir la unión de polipéptidos de ADAM-H9dis-Pc revela qué integrinas se unen a los dominios desintegrina e, indirectamente, qué actividades de unión a integrina pueden antagonizar los dominios desintegrina. Adicionalmente se someten a prueba polipéptidos ADAM-H9dis-Fc que se unen para seleccionar integrinas para determinar la capacidad para perturbar las interacciones integrina-ligando y para modular la función de las células endoteliales, angiogénesis y otras actividades biológicas in vitro e in vivo.

Por tanto pueden tratarse trastornos causados o agravados (directa o indirectamente) por la interacción de ADAM-H9 con una pareja de unión a la superficie celular. Un método terapéutico implica la administración in vivo de un anticuerpo de bloqueo a un sujeto en una cantidad eficaz para inhibir la actividad biológica mediada por la unión a ADAM-H9. Tal como se usa en el presente documento, un "sujeto" puede ser cualquier animal, preferiblemente un mamífero (por ejemplo, canino, felino, bovino, porcino, equino, primates, y similares), y lo más preferiblemente un ser humano. Generalmente se prefieren anticuerpos monoclonales para su uso en tales métodos terapéuticos. En una realización, se emplea un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. En el presente documento, se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo frente a un polipéptido ADAM-H9, y un diluyente, excipiente o vehículo fisiológicamente aceptable.

También se proporcionan en el presente documento conjugados que comprenden un agente terapéutico o detectable (por ejemplo, de diagnóstico) unido al anticuerpo. Los conjugados encuentran su uso en procedimientos in vitro o in vivo. Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos de la invención, o bien in vitro o bien in vivo. Los anticuerpos también pueden emplearse para purificar polipéptidos o fragmentos de la invención mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Se usa el diseño racional de fármacos para producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las que interaccionan, por ejemplo, sustratos, agentes de unión, inhibidores, agonistas, antagonistas, y similares. Los métodos proporcionados en el presente documento pueden usarse para crear o identificar agentes que son formas más activas o estables del polipéptido o que potencian o interfieren en la función de un polipéptido in vivo (Hodgson J, Biotechnology 9:19, 1991). La estructura tridimensional de un polipéptido de la invención, un ligando o pareja de unión, o de un complejo de pareja de unión a polipéptido, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante resonancia magnética nuclear o mediante modelización de la homología por ordenador o, lo más normalmente, mediante una combinación de estos enfoques. Se usa la información estructural relevante para diseñar moléculas análogas, para identificar inhibidores eficaces o para identificar moléculas pequeñas que pueden unirse a un polipéptido de la invención. El uso de información estructural de polipéptido ADAM, preferiblemente información estructural de ADAM-H9, en sistemas de software de modelización molecular prevé el diseño de inhibidores o agentes de unión útiles en la modulación de la actividad de ADAM-H9. Un método particular comprende analizar la estructura tridimensional de polipéptidos ADAM-H9 para detectar sitios de unión probable de sustratos o ligandos, sintetizar una nueva molécula que incorpora un sitio reactivo predictivo y someter a ensayo la nueva molécula tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Se describen ejemplos de algoritmos, software y métodos para modelar sustratos o agentes de unión basados en la estructura tridimensional de una proteína en la publicación PCT WO107579A2.

También es posible aislar un anticuerpo específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal como se describe adicionalmente en el presente documento, y después resolver su estructura cristalina dando así un núcleo farmacéutico en el que se basa el posterior diseño de fármacos. Es posible evitar la cristalografía del polipéptido todo junto generando anticuerpos antiidiotípicos (anti-id) frente a un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como una imagen especular de una imagen especular, debe esperarse que el sitio de unión de los anti-id sea análogo al del receptor original. Podría entonces usarse el anti-id para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como el núcleo farmacéutico.

La invención proporciona métodos para identificar agentes que modulan la expresión o actividad de ADAM-H9. Tales métodos incluyen poner en contacto una muestra que contiene un polinucleótido o polipéptido ADAM-H9 con un agente de prueba en condiciones que permiten que interaccionen el agente de prueba y el polipéptido o polinucleótido y medir la actividad o expresión de un polipéptido ADAM-H9 en presencia o ausencia del agente de prueba.

En una realización, una célula que contiene un polinucleótido ADAM-H9 se pone en contacto con un agente de prueba en condiciones tales que permiten que interaccionen la célula y el agente de prueba. Tales condiciones incluyen normalmente condiciones normales de cultivo celular que concuerdan con el tipo de célula particular que está utilizándose y que se conocen en la técnica. Puede ser deseable dejar que el agente de prueba y la célula interaccionen en condiciones asociadas con el aumento de temperatura o en presencia de reactivos que facilitan la captación del agente de prueba por la célula. Se trata un control de manera similar pero en ausencia del agente de prueba. Alternativamente, puede medirse la expresión o actividad de ADAM-H9 antes de ponerse en contacto con el agente de prueba (por ejemplo, la medición habitual o de control) y luego de nuevo tras el contacto con el agente de prueba. La célula tratada se compara entonces con el control y una diferencia en la expresión o actividad de ADAM-H9 comparado con el control es indicativa de un agente que modula la expresión o actividad de ADAM-H9.

Cuando se esta midiendo la expresión de ADAM-H9, puede cuantificarse la detección de la cantidad de ARNm que codifica para un polipéptido ADAM-H9 en la célula mediante, por ejemplo, PCR o transferencia de tipo Northern. Cuando se está midiendo un cambio en la cantidad de polipéptido ADAM-H9 en la muestra, puede usarse la detección de ADAM-H9 mediante el uso de anticuerpos anti-ADAM-H9 para cuantificar la cantidad de polipéptido ADAM-H9 en la célula usando técnicas conocidas.

Un agente de prueba puede ser cualquier molécula usada normalmente en la modulación de la expresión o actividad de una proteína e incluye, por ejemplo, moléculas pequeñas, productos químicos, peptidomiméticos, anticuerpos, péptidos, polinucleótidos (por ejemplo, moléculas de ribozima o antisentido), y similares. Por consiguiente, pueden someterse a prueba agentes desarrollados mediante diseño de fármacos basado en ordenador en el laboratorio usando el ensayo y los métodos descritos en el presente documento para determinar la actividad del agente en la modulación de la expresión o actividad de ADAM-H9. La modulación de ADAM-H9 incluye un aumento o disminución de la actividad o expresión.

Un polipéptido ADAM-H9 de la invención (incluyendo fragmentos, variantes, oligómeros y otras formas) es útil en una variedad de ensayos. Por ejemplo, un ADAM-H9 de la invención puede usarse para identificar parejas de unión de miembros de la familia ADAM de polipéptidos, que también puede usarse para modular la comunicación intracelular, coestimulación o actividad celular inmunitaria. Alternativamente, pueden usarse para identificar moléculas de parejas no de unión o sustancias que modulan la comunicación intracelular, rutas coestimuladoras o la actividad celular inmunitaria.

Pueden usarse polipéptidos ADAM-H9 y fragmentos de los mismos para identificar parejas de unión. Por ejemplo, pueden someterse a prueba para determinar la capacidad para unirse a una pareja de unión candidata en cualquier ensayo adecuado, tal como un ensayo de unión convencional. Para ilustrar, un polipéptido ADAM-H9 o fragmento del mismo puede marcarse con una molécula detectable (por ejemplo, un radionúclido, un cromóforo y una enzima que cataliza una reacción colorimétrica o fluoriométrica y similares). El polipéptido marcado se pone en contacto con células que expresan la pareja de unión candidata. Se lavan entonces las células para eliminar polipéptido marcado no unido, y se determina la presencia de marcador unido a célula mediante una técnica adecuada, elegida según la naturaleza del marcador.

En una realización, se identifica una integrina de pareja de unión mediante el uso de anticuerpos anti-integrina. La capacidad de los AcM frente a integrina para inhibir la unión de polipéptidos ADAM-H9dis-Fc revela qué integrina se une al dominio desintegrina e indirectamente qué actividades de unión a integrina puede antagonizar el dominio desintegrina. Los polipéptidos ADAM-H9dis-Fc que se unen para seleccionar integrinas se someten a prueba adicionalmente para determinar la capacidad para perturbar las interacciones integrina-ligando y para modular la función de las células endoteliales, angiogénesis y otras actividades biológicas in vitro e in vivo.

En otro ejemplo de un ensayo de unión, se transfecta un vector de expresión recombinante que contiene el ADNc de la pareja de unión candidata en células CVI-EBNA-1. Se incuban las células durante 1 hora a 37°C con diversas concentraciones de, por ejemplo, un polipéptido ADAM-H9 soluble/polipéptido de fusión de Fc. Se lavan las células y se incuban con una concentración saturante constante de ^{125}I-IgG de ratón anti-humana. Tras el lavado, se liberan las células mediante tripsinización. La IgG de ratón anti-humana empleada anteriormente se dirige contra la región Fc de la IgG humana y puede obtenerse de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo se unirá a la parte Fc de cualquier polipéptido de Fc que se haya unido a las células. Se cuantifica el ^{125}I-anticuerpo unido a células en un contador Packard Autogamma.

Cuando un polipéptido ADAM-H9 se une o potencialmente se une a otro polipéptido (por ejemplo, en una interacción receptor-ligando), el polinucleótido ADAM-H9 también puede usarse en ensayos de trampa de interacción (véase, por ejemplo, Gyuris et al., Cell 75:791, 1993) para identificar polinucleótidos que codifican para el otro polipéptido con el que se produce la unión o para identificar inhibidores de la interacción de unión. También pueden usarse polipéptidos implicados en estas interacciones de unión para seleccionar inhibidores de molécula pequeña o péptido o agonistas de la interacción de unión.

Otro tipo de ensayo de unión adecuado es un ensayo de unión competitiva. Para ilustrar, puede determinarse la actividad biológica de una variante sometiendo a ensayo la capacidad de la variante para competir con el polipéptido nativo por unirse a la pareja de unión candidata. Pueden realizarse ensayos de unión competitiva mediante la metodología convencional. Los reactivos que pueden emplearse en ensayos de unión competitiva incluyen una variante o fragmento de ADAM-H9 radiomarcado y células intactas que expresan ADAM-H9 (endógeno o recombinante) en la superficie celular. En lugar de células intactas, podría sustituirse una pareja de unión soluble /polipéptido de fusión de Fc unido a una fase sólida a través de la interacción de polipéptido A o polipéptido G (sobre la fase sólida) con el resto de Fc. Las columnas de cromatografía que contienen polipéptido A y G incluyen las disponibles de Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ.

Puede someterse a ensayo la influencia de los polipéptidos ADAM-H9, fragmentos de ADAM-H9 y anticuerpos sobre la comunicación intracelular, coestimulación, unión a integrinas, migración de células endoteliales, angiogénesis o actividad celular inmunitaria, poniendo en contacto una célula o grupo de células con un polinucleótido, polipéptido, agonista o antagonista, para inducir, potenciar, suprimir o detener la comunicación celular, coestimulación, unión a integrinas, migración de células endoteliales, angiogénesis o actividad en las células diana. Puede realizarse la identificación de polipéptidos ADAM-H9, agonistas o antagonistas mediante una variedad de ensayos conocidos por los expertos en la técnica. Están incluidos en tales ensayos los que evalúan la capacidad de un polipéptido ADAM-H9 para influir en la comunicación intracelular, coestimulación, unión a integrinas, migración de células endoteliales o angiogénesis. Un ensayo de este tipo implicaría, por ejemplo, el análisis de las interacciones célula-célula (por ejemplo, a través de unión relacionada con integrinas) en presencia de un polipéptido ADAM-H9 o fragmento de desintegrina soluble del mismo. En un ensayo de este tipo, se determinaría una tasa de interacción célula-célula, interacción célula-matriz, o unión asociada a integrinas en presencia de un polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9 y después determinar si tal unión o interacción se altera en presencia de, por ejemplo, una secuencia de ADAM-H9 con desintegrina soluble (ADAM-H9dis). Ensayos a modo de ejemplo de este aspecto de la invención incluyen ensayos de migración endotelial. En la técnica se conocen otros ensayos.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar la capacidad de un agente de prueba para afectar la interacción célula-célula, interacción célula-matriz, actividad de unión asociada a integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o actividad angiogénica del agente de prueba en una célula o cultivo. En este aspecto, el método comprende: (1) poner en contacto un primer grupo de células diana con un agente de prueba que incluye un polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9 (por ejemplo, las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8, o 10; o un resto de desintegrina de ADAM-H9 soluble), un ligando o receptor para un polipéptido ADAM-H9, o un fragmento del mismo, en condiciones apropiadas para el ensayo particular que se está usando; (2) medir la tasa neta de interacción célula-célula, interacción célula-matriz, actividad de unión asociada a integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o actividad angiogénica entre las células diana; y (3) observar la tasa neta de interacción célula-célula, interacción célula-matriz, actividad de unión asociada a integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o actividad angiogénica entre células control que contienen un ligando de polipéptido ADAM-H9 o fragmentos del mismo, en ausencia de un agente de prueba, en condiciones de otra manera idénticas a las del primer grupo de células. En esta realización, la tasa neta de comunicación intracelular o coestimulación en las células control se compara con la de las células tratadas tanto con una molécula de ADAM-H9 como con un agente de prueba. La comparación proporcionará una diferencia en la tasa neta de interacción célula-célula, interacción célula-matriz, actividad de unión asociada a integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o actividad angiogénica indicativa de un agente que modula la actividad de ADAM-H9. El agente de prueba puede funcionar como un efector mediante o bien activación o bien regulación por incremento, o bien inhibición o bien regulación por disminución de la interacción célula-célula, interacción célula-matriz, unión asociada a integrinas, actividad migratoria de células endoteliales o actividad angiogénica.

Un polipéptido de la invención puede mostrar actividad de inhibición o producción de citocinas, proliferación celular (o bien inductora o bien inhibidora), o actividad de diferenciación celular (o bien inductora o bien inhibidora). Muchos factores polipeptídicos descubiertos hasta la fecha, incluyendo todas las citocinas conocidas, han mostrado actividad en uno o más ensayos de proliferación celular, y por tanto los ensayos sirven como una confirmación conveniente de la actividad de citocinas. La actividad de un polipéptido de la invención se pone en evidencia mediante uno cualquiera de una variedad de ensayos de proliferación celular dependientes de factor rutinarios para líneas celulares que incluyen, sin limitación, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e y CMK. La actividad de un polipéptido ADAM-H9 de la invención puede medirse mediante los siguientes métodos:

Los ensayos para determinar la proliferación de células T o timocitos incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed. por Coligan et al., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706, 1990; Bertagnolli et al., Cell. Im-
munol. 133:327,1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149:3778, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756, 1994.

Los ensayos para determinar la producción de citocinas y/o proliferación de células de bazo, células de ganglio linfático o timocitos incluyen, sin limitación, los descritos en: Policlonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M. y Shevach, Vol. 1 págs. 3.12.1-3.12.14, y Measurement of mouse and human Interferon \gamma, Schreiber, R. D. Vol. 1 págs. 6.8.1-6.8.8. en Current Protocols in Immunology. E. M. Coligan eds. John Wiley and Sons, Toronto. 1994; Coligan eds., John Wiley and Sons, Toronto, 1994.

Los ensayos para determinar la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas incluyen, sin limitación, los descritos en: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 y Interleukin 4, Bottomly et al., en Current Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol. 1 págs. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; de Vries et al., J. Exp. Med. 173:1205, 1991; Moreau et al., Nature 336:690, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6, Nordan, R. en Current Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol. 1 págs. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.83:1857, 1986; Measurement of human Interleukin 11, Bennett et al., en Current Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol. 1 págs. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9, Ciarletta et al., en Current Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol. 1 págs. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto. 1991.

Los ensayos para determinar respuestas de clones de células T frente a antígenos (que identificarán, entre otros, polipéptidos que afectan las interacciones APC-célula T así como efectos de células T directos midiendo la proliferación y producción de citocinas) incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan eds., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Capítulo 6, Cytokines and their cellular receptors; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6091, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11:405, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137:3494, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508, 1988.

Los ensayos para determinar la citotoxicidad de timocitos o esplenocitos incluyen, sin limitación, Current Protocols in Immunology, Coligan eds., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function págs. 3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488,1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508, 1988; Bowman et al., J. Virol. 61:1992; Bertagnolli et al., Cell. Imm. 133:327, 1991; Brown et al., J. Immun. 153:3079, 1994.

Los ensayos para determinar respuestas de IgG dependientes de células T y cambio de isotipo (que identificarán, entre otros, polipéptidos que modulan las respuestas de anticuerpos dependientes de células T y que afectan a los perfiles de Th1/Th2) incluyen, sin limitación, los descritos en: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028, 1990; y Assays for B cell function: In vitro antibodies production, Mond, J. J. y Brunswick, M. en Current Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol. 1 págs. 3.8.1-3.8.16, Wiley and Sons, Toronto. 1994.

Los ensayos de reacción mixta de linfocitos (MLR) (que identificará, entre otros, polipéptidos que predominantemente generan respuestas Th1 y CTL) incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan eds., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function págs. 3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., 1986, citado anteriormente; Takai et al., 1988, citado anteriormente; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778, 1992.

Los ensayos dependientes de células dendríticas (que identificarán, entre otros, polipéptidos expresados por células dendríticas que activan células T vírgenes) incluyen, sin limitación, los descritos en: Guery et al., J. Immunol. 134:536, 1995; Inaba et al., J. of Exp. Med. 173:549, 1991; Macatonia et al., J. Immunol. 154:5071, 1995; Porgador et al., J. of Exp. Med.182:255, 1995; Nair et al., J. Virol. 67:4062, 1993; Huang et al., Science 264:961, 1994; Macatonia et al., J. of Exp. Med. 169:1255, 1989; Bhardwaj et al., J. Clin. Invest. 94:797, 1994; e Inaba et al., J. of Exp. Med. 172:631, 1990.

Los ensayos para determinar la apoptosis/supervivencia de linfocitos (que identificarán, entre otros, polipéptidos que evitan la apóptosis tras la inducción de superantígeno y polipéptidos que regulan la homeostasis de linfocitos) incluyen, sin limitación, los descritos en: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53:1945, 1993; Itoh et al., Cell 66:233, 1991; Zacharchuk, J. Immunol. 145:4037, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891, 1993; Gorczyca et al., Int. J. of Oncology 1:639, 1992.

Los ensayos para determinar polipéptidos que influyen las etapas tempranas de compromiso y desarrollo de células T incluyen, sin limitación, los descritos en: Antica et al., Blood 84:111, 1994; Fine et al., Cell. Immunol. 155:111, 1994; Galy et al., Blood 85:2770, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 88:7548, 1991.

Los ensayos para determinar la diferenciación de células madre embrionarias (que identificarán, entre otros, polipéptidos que influyen en la hematopoyesis de la diferenciación embrionaria) incluyen, sin limitación, los descritos en: Johansson et al Cell. Biol. 15:141, 1995; Keller et al., Mol. and Cell. Biol. 13:473, 1993; McClanahan et al., Blood 81:2903, 1993.

Los ensayos para determinar la diferenciación y supervivencia de células madre (que identificarán, entre otros, polipéptidos que regulan la linfohematopoyesis) incluyen, sin limitación, los descritos en: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M.G. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. eds. Vol. págs. 265-268, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I. K. y Briddell, R. A. en Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. eds. Vol. págs. 23-39, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. 1994; Neben et al., Exp. Hematol. 22:353, 1994; Cobble-stone area forming cell assay, Ploemacher, en Culture of Hematopoietic Cells. Freshney, et al. eds. Vol. págs. 1-21, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer et al. en Culture of Hematopoietic Cells. Freshney, et al. eds. Vol. págs. 163-179, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, en Culture of Hematopoietic Cells. Freshney, et al. eds. Vol. págs.139-162, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. 1994.

Los ensayos para determinar de actividad de generación tisular incluyen, sin limitación, los descritos en: publicación de patente número WO95/16035 (hueso, cartílago, tendón); publicación de patente número WO95/05846 (nervio, neuronal); publicación de patente número WO91/07491 (piel, endotelio). Los ensayos para determinar la actividad de cicatrización de heridas incluyen, sin limitación, los descritos en: Winter, Epidermal Wound Healing, págs. 71-112 (Maibach, y Rovee, eds.), Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, modificado por Eaglstein y Mertz, J. Invest. Dermatol 71:382-84 (1978).

Los ensayos para determinar la actividad de activina/inhibina incluyen, sin limitación, los descritos en: Vale et al., Endocrinol. 91:562, 1972; Ling et al., Nature 321:779, 1986; Vale et al., Nature 321:776, 1986; Mason et al., Nature 318:659, 1985; Forage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3091, 1986.

Los ensayos para determinar la adhesión y movimiento celular incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan eds., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 6.12, Measurement of \alpha and \beta Chemokines 6.12.1-6.12.38; Taub et al. J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind et al. APMIS 103:140, 1995; Muller et al. Eur. J. Immunol. 25: 1744; Gruber et al. J. Immunol. 152:5860, 1994; Johnston et al. J. Immunol. 153: 1762, 1994.

Los ensayos para determinar la actividad hemostática y trombolítica incluyen, sin limitación, los descritos en: Linet et al., J. Clin. Pharmacol. 26:131, 1986; Burdick et al., Thrombosis Res. 45:413,1987; Humphrey et al., Fibrinolysis 5:71, 1991; Schaub, Prostaglandins 35:467, 1988.

Los ensayos para determinar la actividad de receptor-ligando incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan eds., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28.1-7.28.22), Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6864, 1987; Bierer et al., J. Exp. Med. 168:1145, 1988; Rosenstein et al., J. Exp. Med. 169:149, 1989; Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods 175:59, 1994; Stitt et al., Cell 80:661, 1995.

Los ensayos para determinar la actividad supresora invasiva y adhesiva de cadherina incluyen, sin limitación, los descritos en: Hortsch et al. J Biol. Chem. 270(32):18809, 1995; Miyaki et al. Oncogene 11: 2547, 1995; Ozawa et al. Cell 63:1033, 1990. Puede usarse un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9 proporcionada por la invención para numerosos fines de diagnóstico u otros fines útiles. Un polinucleótido de la invención (por ejemplo, las SEQ ID NO:2, 5, 7, o 9) puede usarse como marcadores para tejidos en los que el polipéptido correspondiente se expresa preferentemente, como marcadores de peso molecular en geles tipo Southern, como marcadores cromosómicos o como etiquetas para identificar cromosomas o para mapear posiciones génicas relacionadas, para comparar con secuencias de ADN endógenas en sujetos para identificar trastornos genéticos potenciales, como sondas para hibridar y descubrir así polinucleótidos relacionados novedosos, como una fuente de información para derivar cebadores de PCR para la identificación mediante la huella dactilar genética, como una sonda para "restar" polinucleótidos conocidos en el proceso de descubrimiento de otros ácidos nucleicos novedosos, como un antígeno para producir anticuerpos anti-ADN o provocar otra respuesta inmunitaria, y para terapia génica.

Sondas y cebadores. Entre los usos de los polipéptidos ADAM-H9 descritos, y combinaciones de fragmentos de los mismos, está el uso de fragmentos como sondas o cebadores. Tales fragmentos comprenden generalmente al menos aproximadamente 17 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras realizaciones, un fragmento de ADN comprende al menos 30, o al menos 60 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de hibridación y la orientación para concebir condiciones adecuadas se exponen por Sambrook et al., 1989 y se describieron en detalle anteriormente. Usando el conocimiento del código genético junto con las secuencias de aminoácidos expuestas anteriormente, pueden prepararse conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Tales oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), en las que se aíslan fragmentos de ADN y se amplifican. En ciertas realizaciones, pueden usarse cebadores degenerados como sondas para bibliotecas genéticas no humanas. Tales bibliotecas incluirán, pero no se limitan a bibliotecas de ADNc, bibliotecas genómicas e incluso bibliotecas de ADN o EST (etiqueta de secuencia expresada) electrónicas. Se usarán entonces las secuencias homólogas identificadas mediante este método como sondas para identificar homólogos no humanos de la secuencia de ADAM-H9 identificada en el presente documento.

Mapeo cromosómico. Los polinucleótidos que codifican para polipéptidos ADAM-H9, y los fragmentos y combinaciones descritos de estos polinucleótidos, pueden usarse por los expertos en la técnica usando técnicas conocidas para identificar el cromosoma humano en el que se mapean estas secuencias. Técnicas útiles incluyen, pero no se limitan a, usar la secuencia o partes, incluyendo oligonucleótidos, como una sonda en varias técnicas conocidas tales como mapeo de híbridos de radiación (alta resolución), hibridación in situ con extensiones cromosómicas (resolución moderada), e hibridación de tipo Southern para hibridar líneas celulares que contienen cromosomas humanos individuales (baja resolución). El siguiente sitio web proporciona información adicional sobre el mapeo de híbridos de radiación: www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/humanSTSreleases/july97/07-97.INTRO.html.

Un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9 de la invención, y los fragmentos y combinaciones descritos de estos polinucleótidos puede usarse para analizar anomalías asociadas con los genes correspondientes a polipéptidos ADAM-H9. Esto permite distinguir condiciones en las que este marcador se reordena o deleciona. Además, pueden usarse polinucleótidos de la invención o un fragmento de los mismos como un marcador posicional para mapear otros genes de ubicación desconocida. El polinucleótido puede usarse para desarrollar tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o indirectamente) por cantidades deficientes o insuficientes de genes (por ejemplo, un trastorno asociado a ADAM-H9) correspondientes a los polinucleótidos de la invención. Los polinucleótidos y secuencias asociadas descritos en el presente documento permiten la detección de genes defectuosos, y la sustitución de los mismos por genes normales. Pueden detectarse genes defectuosos en ensayos de diagnóstico in vitro, y comparando las secuencias de polinucleótido descritas en el presente documento con las de un gen derivado de un sujeto del que se sospecha que alberga un defecto en su gen o que tiene un trastorno asociado a ADAM-
H9.

Los usos de polipéptidos ADAM-H9 y fragmentos peptídicos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: agentes de administración; reactivos de investigación y terapéuticos; marcadores de peso molecular e isoelectroenfoque; controles para la fragmentación peptídica; identificación de polipéptidos desconocidos; y preparación de anticuerpos.

Los polipéptidos ADAM-H9 descritos y/o reivindicados en el presente documento (por ejemplo, las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8 o 10) de la invención pueden usarse como reactivos de purificación de polipéptidos. Por ejemplo, los polipéptidos ADAM-H9 pueden unirse a un material de soporte sólido y usarse para purificar sus parejas de unión (por ejemplo, una molécula de integrina) mediante cromatografía de afinidad. En realizaciones particulares, se une un polipéptido a un soporte sólido mediante procedimientos convencionales. Como ejemplo, están disponibles columnas de cromatografía que contienen grupos funcionales que reaccionarán con cadenas laterales de aminoácidos de los polipéptidos (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). En una alternativa, se une un polipéptido ADAM-H9-Fc a columnas de cromatografía que contienen polipéptido A o polipéptido G mediante interacción con el resto Fc. El polipéptido también encuentra uso para purificar o identificar células que expresan una pareja de unión en la superficie celular. Los polipéptidos se unen a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato adecuado similar. Por ejemplo, pueden recubrirse microesferas magnéticas con los polipéptidos y mantenerlos en un recipiente de incubación a través de un campo magnético. Se ponen en contacto suspensiones de mezclas celulares que contienen células que expresan la pareja de unión con la fase sólida que tiene los polipéptidos en ella. Las células que expresan la pareja de unión en la superficie celular se unen a los polipéptidos sobre la fase sólida, y después se eliminan por lavado las células no unidas. Alternativamente, los polipéptidos pueden conjugarse con un resto detectable, después incubarse con células que van a someterse a prueba para determinar la expresión de la pareja de unión. Tras la incubación, se elimina la materia marcada no unida y se determina la presencia o ausencia del resto detectable en las células.

Vehículos y agentes de administración. Los polipéptidos también encuentran uso como vehículos para administrar agentes unidos a los mismos a células que portan parejas de unión identificadas (por ejemplo, una integrina). Por tanto, los polipéptidos pueden usarse para administrar agentes terapéuticos o de diagnóstico a tales células en procedimientos in vitro o in vivo. Agentes terapéuticos y detectables (de diagnóstico) que pueden unirse a un polipéptido incluyen, pero no se limitan a, toxinas, otros agentes citotóxicos, fármacos, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares, eligiéndose el agente particular según la aplicación pretendida. Entre las toxinas están ricina, abrina, toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, polipéptidos inactivantes ribosómicos, micotoxinas tales como tricotecenos, y derivados y fragmentos (por ejemplo, cadenas sencillas) de los mismos. Los radionúclidos adecuados para uso diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In y ^{76}Br. Los ejemplos de radionúclidos adecuados para uso terapéutico son ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu y ^{67}Cu. Tales agentes pueden unirse al polipéptido mediante cualquier procedimiento adecuado. El polipéptido comprende grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos que pueden reaccionar con grupos funcionales de un agente deseado para formar por ejemplo, enlaces covalentes. Alternativamente, el polipéptido o agente puede derivatizarse para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivatización puede implicar la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponibles para unir diversas moléculas a polipéptidos (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Son de particular interés las desintegrinas de ADAM-H9 solubles que pueden usarse para dirigir células que expresan una pareja de unión para el resto de desintegrina de ADAM-H9 (por ejemplo, una integrina). Tales desintegrinas de ADAM-H9 solubles pueden usarse para dirigir reactivos a células que expresan, por ejemplo, la integrina análoga de la desintegrina. De manera similar, y tal como se describe con más detalle a continuación, pueden marcarse anticuerpos específicos para un polipéptido ADAM-H9 con un agente terapéutico o de diagnóstico y usarse para dirigir el agente terapéutico o de diagnóstico a células que expresan un polipéptido ADAM-H9.

Pueden emplearse polipéptidos ADAM-H9 y fragmentos de ADAM-H9 (por ejemplo, fragmentos que tienen actividad desintegrina) para modular una actividad biológica de un polipéptido ADAM, particularmente un polipéptido ADAM-H9, en procedimientos in vitro o in vivo. Están englobados dentro de la invención los dominios de polipéptido ADAM-H9 que actúan como moduladores de la función del polipéptido ADAM nativo, incluyendo la actividad de ADAM-H9 nativo, cuando se expresan como fragmentos o como componentes de polipéptidos de fusión. Por ejemplo, puede usarse un dominio polipeptídico sustancialmente purificado de la invención para inhibir la unión de un polipéptido ADAM-H9 a parejas de unión endógenas. Tal uso bloquearía eficazmente las interacciones de ADAM-H9 e inhibiría las actividades de ADAM-H9. En todavía otro aspecto de la invención, se usa una forma soluble de una pareja de unión de ADAM-H9 (por ejemplo, un dominio integrina soluble) para unirse a, e inhibir competitivamente la activación del polipéptido ADAM-H9 endógeno.

En otra realización, la invención se refiere a métodos para inhibir la unión de una integrina a su ligando, e inhibir así la actividad biológica de la integrina, que comprende poner en contacto la integrina con una cantidad eficaz de un polipéptido ADAM-H9dis. La invención se refiere además a métodos para inhibir la migración de células endoteliales y métodos para inhibir la angiogénesis que comprenden administrar una cantidad eficaz de un polipéptido ADAM-H9dis. En algunas realizaciones el polipéptido ADAM-H9dis está en la forma de un multímero, preferiblemente un multímero de cremallera de leucina o polipéptido de Fc. Alternativamente, pueden administrarse polipéptidos ADAM-H9 sustancialmente purificados o modificados de la invención para modular las interacciones entre polipéptidos ADAM-H9 y parejas de unión a ADAM-H9 que no están unidos a la membrana.

Los anticuerpos que se unen a polipéptidos ADAM-H9 pueden inhibir la actividad del polipéptido ADAM-H9 y pueden actuar como antagonistas. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos que se unen específicamente a uno o más epítopos de un polipéptido ADAM-H9, o epítopo de variantes conservadas de polipéptidos ADAM-H9 o fragmentos, para inhibir la actividad de ADAM-H9. Por "unirse específicamente" se quiere decir que un anticuerpo frente a un polipéptido ADAM-H9 o fragmento del mismo no reaccionará de manera cruzada con polipéptidos no relacionados. Preferiblemente un anticuerpo de este tipo no reaccionará de manera cruzada con otros miembros de la familia ADAM.

En un aspecto alternativo, la invención engloba además el uso de agonistas de la actividad de ADAM-H9 para tratar o mejorar los síntomas de una enfermedad para la cual es beneficioso el aumento de la actividad desintegrina. En un aspecto preferido, la invención supone administrar composiciones que comprenden un polinucleótido ADAM-H9 (por ejemplo, que comprende las SEQ ID NO 5,7 o 9) o fragmento del mismo o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de ADAM-H9 (por ejemplo, las SEQ ID NO 6, 8 o 10) o un fragmento del mismo. La administración puede ser a células in vitro, a células ex vivo, a células in vivo, y/o a organismos multicelulares. Las formas terapéuticas preferidas incluyen formas solubles de un ADAM-H9 que tiene actividad desintegrina. Una desintegrina de ADAM-H9 soluble de este tipo se unirá a su pareja de unión (por ejemplo, una integrina) y estimulará una actividad biológica asociada con la pareja de unión.

Todavía en otro aspecto de la invención, las composiciones comprenden administrar un polinucleótido que codifica para un polipéptido ADAM-H9 para la expresión en un organismo huésped para el tratamiento de enfermedades. Particularmente preferida, a este respecto, es la expresión en un sujeto humano para el tratamiento de una disfunción asociada con la actividad endógena aberrante (por ejemplo, disminuida) de un polipéptido ADAM-H9. Además, la invención engloba la administración de compuestos que se encuentra que aumentan la actividad endógena de polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de ADAM-H9 a células y/u organismos. Un ejemplo de compuestos que aumentan la actividad del polipéptido ADAM-H9 son anticuerpos que se unen a polipéptidos ADAM-H9, preferiblemente anticuerpos monoclonales, y aumentan o estimulan la actividad del polipéptido ADAM-H9 produciendo señalización intracelular constitutiva (o "imitación de ligandos"), o evitando la unión de un inhibidor nativo de la actividad del polipéptido ADAM-H9.

Debido a la multiplicidad e interconexión de las rutas e interacciones biológicas, un polipéptido ADAM-H9, fragmento, variante, antagonista, agonista, anticuerpo y pareja de unión de la invención puede ser útil para tratar estados médicos y enfermedades asociados con interacciones célula-célula y célula-matriz (por ejemplo, trastornos mediados por integrinas), migración endotelial, angiogénesis, inflamación, cáncer, alergia, estados reproductores, neurológicos y vasculares tal como se describen adicionalmente en el presente documento. La molécula o moléculas terapéuticas que van a usarse dependerán de la etiología del estado que va a tratarse y las rutas biológicas implicadas, y se considerará que diferentes variantes, antagonistas, y parejas de unión de los polipéptidos ADAM-H9 pueden tener efectos similares o diferentes. Por ejemplo, un polipéptido ADAM-H9 o fragmento del mismo puede actuar como un antagonista de una función de procesamiento proteico de metaloproteinasas (por ejemplo, de otros miembros de la familia ADAM de polipéptidos) interaccionando con un pareja de unión de ADAM y evitando la actividad de la metaloproteinasa sobre su sustrato. En consecuencia, un ADAM-H9 puede modular el procesamiento proteico, tal como la liberación de factores de crecimiento, proteínas de adhesión y factores inflamatorios.

Los polipéptidos ADAM-H9 descritos, fragmentos de los mismos, anticuerpos, composiciones y terapias de combinación descritos en el presente documento son útiles en medicamentos para tratar infecciones bacterianas, víricas o protozoarias, y las complicaciones que resultan de las mismas. Se pueden tratar trastornos cardiovasculares con los polipéptidos ADAM-H9 descritos, fragmentos de los mismos, anticuerpos, composiciones farmacéuticas o terapias de combinación, incluyendo aneurismas aórticos; arteritis; oclusión vascular; complicaciones de cirugía de derivación coronaria; lesión por isquemia/reperfusión; enfermedad cardíaca; insuficiencia cardíaca e infarto de miocardio. Además, pueden usarse los polipéptidos ADAM-H9, fragmentos de los mismos, anticuerpos, composiciones y terapias de combinación de la invención para tratar estados de dolor crónico, para tratar diversos trastornos del sistema endocrino, estados del sistema gastrointestinal, trastornos del sistema genitourinario, y anemias y trastornos hematológicos.

Debido al papel de las integrinas (por ejemplo, integrinas a_{v}b_{3}, a_{v}b_{5}, b_{1}, b_{4}, a_{1}, a_{2}, a_{3}, a_{4}, a_{5} y a_{6}) en trastornos proliferativos celulares, incluyendo cáncer y metástasis de células cancerígenas, también se proporcionan en el presente documento métodos para usar los polipéptidos ADAM-H9, fragmentos de los mismos (particularmente los que comprenden un dominio ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de ADAM-H9dis-Fc), anticuerpos, composiciones o terapias de combinación para tratar diversos trastornos hematológicos y oncológicos. Por ejemplo, pueden usarse dominios desintegrina de ADAM-H9 soluble para tratar diversas formas de cáncer, incluyendo leucemia mielógena aguda, carcinoma nasofaríngeo positivo para el virus de Epstein-Barr, glioma, cáncer de colon, estómago, próstata, de células renales, cervicouterino y de ovario, cáncer de pulmón (CPCP y CPCNP), incluyendo caquexia asociada al cáncer, fatiga, astenia, síndrome paraneoplásico de caquexia e hipercalcemia, modulando las interacciones asociadas a integrinas.

Enfermedades adicionales que pueden tratarse con los polipéptidos, fragmentos, anticuerpos, composiciones o terapias de combinación de la invención son tumores sólidos, incluyendo sarcoma, osteosarcoma, y carcinoma, tales como adenocarcinoma (por ejemplo, cáncer de mama) y carcinoma de células escamosas. La administración de un dominio desintegrina de ADAM-H9 soluble puede modular interacciones célula-célula y célula-matriz de tales células tumorales y/o modular la angiogénesis y el riego sanguíneo a tales tumores.

Además, los polipéptidos ADAM-H9, fragmentos de los mismos, composiciones o terapias de combinación son útiles para tratar la leucemia, incluyendo leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda o crónica y leucemia de células pilosas. Otros tumores malignos con potencial metastásico invasivo que pueden tratarse con los polipéptidos ADAM-H9, fragmentos, anticuerpos, composiciones y terapias de combinación, incluyen mieloma múltiple, diversos trastornos linfoproliferativos tales como síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA), leucemia linfoblástica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfática crónica, linfoma de células T periférico, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células T positivo para el virus de Epstein-Barr, linfoma histiocítico, enfermedad de Hodgkin, linfoma difuso agresivo, leucemias linfáticas agudas, enfermedad linfoproliferativa T-gamma, linfoma cutáneo de células B, linfoma cutáneo de células T (es decir, micosis fungoides), y síndrome de Sézary.

Puede administrarse una combinación de al menos un polipéptido ADAM-H9, fragmento del mismo, o un anticuerpo, y uno o más factores antiangiogénesis adicionales u otro(s) agente(s) terapéutico(s) al sujeto. El/los agente(s) terapéutico(s) adicional(es) pueden administrarse antes de, o de manera concurrente con, o tras la administración del polipéptido ADAM-H9, fragmentos del mismo (particularmente los que comprenden un dominio ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo. Es particularmente ventajoso el uso de más de un agente terapéutico cuando el sujeto que se está tratando tiene un tumor sólido. En algunas realizaciones de la invención, el tratamiento comprende además tratar al mamífero con radiación. La radiación, incluyendo braquiterapia y teleterapia, puede administrarse antes de, de manera concurrente con, o tras la administración del polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 y/o agente(s) terapéutico(s) adicional(es).

El método incluye la administración de, además de un polipéptido ADAM-H9, fragmentos del mismo (particularmente los que comprenden un dominio ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo, uno o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en agentes de alquilación, antimetabolitos, alcaloides de la vinca y otros quimioterápicos de origen vegetal, antibióticos antitumorales, enzimas antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, análogos de platino, supresores adrenocorticales, hormonas y antihormonas, anticuerpos, agentes inmunoterápicos, agentes radioterápicos y modificadores de la respuesta biológica.

El método incluye además la administración de, además de un polipéptido ADAM-H9, fragmentos del mismo (particularmente los que comprenden un dominio ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo, uno o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en cisplatino, ciclofosfamida, mecloretamina, melfalán, bleomicina, carboplatino, fluorouracilo, 5-fluorodesoxiuridina, metotrexato, taxol, asparaginasa, vincristina, y vinblastina, linfocinas y citocinas tales como interleucinas, interferones (\alpha, \beta o \delta) y TNF, clorambucilo, busulfano, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, dacarbazina, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, vindesina, etopósido, tenipósido, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, L-asparaginasa, hidroxiurea, metilhidrazina, mitotano, tamoxifeno, fluoximesterona, inhibidores de IL-8, angiostatina, endostatina, kringle 5, angiopoyetina 2 u otros antagonistas de angiopoyetina 1, antagonistas del factor activador de las plaquetas, antagonistas del factor de crecimiento de fibroblastos básico e inhibidores de COX-2.

El método también incluye la administración de, además de un polipéptido ADAM-H9, fragmentos del mismo (particularmente los que comprenden un dominio ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo, uno o más polipéptidos terapéuticos, incluyendo formas solubles de los mismos, seleccionado del grupo que consiste en ligando Flt3 (véase la patente estadounidense número 5.554.512), ligando CD40 (véase la patente estadounidense número 5.716.805), IL-2, IL-12, ligando 4-1BB (véase la patente estadounidense número 5.674.704), anticuerpos anti-4-1BB, TRAIL (véase la patente estadounidense número 5.763.223), antagonistas de TNF y antagonistas del receptor de TNF (TNFR) incluyendo TNFR/Fc, antagonistas de Tek (véase la publicación PCT número WO 00/75323, 14 de diciembre de 2000), antagonistas de TWEAK y antagonistas de TWEAK-R (véanse las patentes estadounidenses con números de serie 60/172.878 y 60/203.347 y Feng et al., Am. J. Pathol. 156(4):1253) incluyendo TWEAK-R/Fc, antagonistas de VEGF incluyendo anticuerpos anti-VEGF, antagonistas del receptor de VEGF (incluyendo VEGFR1 y VEGF-R2, también conocidos como Flt1 y Flkl o KDR), proteínas de unión a CD148 (también denominadas como DEP-1, ECRTP, y PTPRJ, véase Takahashi et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10:2135-45, 1999; y publicación PCT número WO 00/15258, 23 de marzo de 2000), y antagonistas de nectina 3 (véase, Satoh-Horikawa et al., J. Biol. Chem. 275(14):10291, 2000; los números de registro Genbank de las secuencias de polipéptido y ácido nucleico de nectina 3 humana son AF282874 y AAF97597, respectivamente).

En algunas realizaciones preferidas, se usa un polipéptido ADAM-H9, fragmentos del mismo (particularmente los que comprenden un dominio ADAM-H9dis, por ejemplo, oligómeros de ADAM-H9dis-Fc), o un anticuerpo de la invención como componente de, o en combinación con, "terapia metronómica", tal como la descrita por Browder et al. y Klement et al. (Cancer Research 60:1478, 2000; J. Clin. Invest. 105(8):R15, 2000; véase también Barinaga, Science 288:245, 2000).

Se describen y/o reivindican en el presente documento compuestos, composiciones y métodos para tratar un sujeto, preferiblemente un sujeto mamífero, y lo más preferiblemente un sujeto humano, que padece un trastorno médico, y en particular un trastorno asociado a ADAM-H9. Tales trastornos asociados a ADAM-H9 incluyen estados provocados (directa o indirectamente) o agravados por la unión entre un polipéptido que tiene una secuencia de ADAM-H9 (por ejemplo, las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8 o 10) y su pareja de unión (por ejemplo, una integrina). Para los fines de esta descripción, los términos "dolencia", "enfermedad", "trastorno", "estado médico", "estado anómalo" y similares se usan de manera intercambiable con el término "trastorno médico". Los términos "tratar", "que trata", y "tratamiento" usados en el presente documento incluyen tratamiento curativo, preventivo (por ejemplo, profiláctico) y paliativo o de mejora. Para tales usos terapéuticos, pueden administrarse polipéptidos ADAM-H9 y fragmentos, polinucleótidos de ADAM-H9 que codifican para un polipéptido ADAM-H9, y/o agonistas o antagonistas del polipéptido ADAM-H9 tales como anticuerpos, al sujeto que lo necesita a través de medios conocidos. Las composiciones de la invención pueden contener un polipéptido en cualquier forma descrita en el presente documento, tales como polipéptidos nativos, variantes, derivados, oligómeros, y fragmentos biológicamente activos. En realizaciones particulares, la composición comprende un polipéptido soluble o un oligómero que comprende polipéptidos ADAM-H9 solubles (por ejemplo, un dominio desintegrina de ADAM-H9 soluble).

En la puesta en práctica del método de tratamiento o uso de la invención, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico de la invención a un sujeto que tiene un estado que va a tratarse, preferiblemente para tratar o mejorar enfermedades asociadas con la actividad de un polipéptido ADAM-H9. "Agente terapéutico" incluye sin limitación cualquier polipéptido ADAM-H9, fragmento, y variante; polinucleótido que codifica para un polipéptido ADAM-H9, fragmento, y variante; agonistas o antagonistas del un polipéptido ADAM-H9 tales como anticuerpos; una pareja de unión al polipéptido ADAM-H9; complejos formados a partir de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, variante y pareja de unión, y similares. Tal como se usa en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad total de cada agente terapéutico u otro componente activo de la composición farmacéutica o método que es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el sujeto, por ejemplo, tratamiento, curación, prevención o mejoría del estado médico relevante, o un aumento en la velocidad de tratamiento, curación, prevención o mejoría de tales estados. Cuando se aplica a un agente terapéutico o principio activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese componente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los componentes que dan como resultado el efecto terapéutico, ya se administren en combinación, en serie o simultáneamente. Tal como se usa en el presente documento, la frase "administrar una cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico significa que el sujeto se trata con dicho agente terapéutico en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora, y preferiblemente una mejora sostenida, en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno. Una mejora se considera "sostenida" si el sujeto muestra la mejora en al menos dos ocasiones separadas por una o más semanas. Se determina el grado de mejora basándose en signos o síntomas, y las determinaciones también pueden emplear cuestionarios que se distribuyen al sujeto, tales como cuestionarios sobre la calidad de vida. Pueden evaluarse diversos indicadores que reflejan el grado de la dolencia del sujeto para determinar si la cantidad y momento del tratamiento son suficientes. Se establece el valor inicial para el indicador o indicadores elegidos mediante el examen del sujeto antes de la administración de la primera dosis del agente terapéutico. Preferiblemente, el examen inicial se realiza en un plazo de aproximadamente 60 días anteriores a la administración de la primera dosis. Si se está administrando el agente terapéutico para tratar síntomas agudos, la primera dosis se administra lo antes posible en la práctica tras producirse la lesión. Se induce la mejora administrando agentes terapéuticos tales como un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 hasta que el sujeto manifiesta una mejora con respecto al nivel inicial para el indicador o indicadores elegidos. En el tratamiento de estados crónicos, se obtiene este grado de mejora mediante la administración repetida de este medicamento durante un periodo de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos o tres meses o más tiempo, o indefinidamente. Con frecuencia es suficiente un periodo de una a seis semanas, o incluso una única dosis, para tratar estados agudos. Aunque puede parecer que el grado de la dolencia de un sujeto ha mejorado tras el tratamiento según uno o más indicadores, el tratamiento puede continuarse indefinidamente al mismo nivel o a una dosis o frecuencia reducida. Una vez que se ha reducido o interrumpido el tratamiento, puede reanudarse más tarde al nivel original si los síntomas vuelven a aparecer.

Un experto en la técnica reconocerá que las dosificaciones adecuadas variarán, dependiendo de factores tales como la naturaleza y gravedad del trastorno que va a tratarse, el peso corporal, edad, estado general y dolencias y/o tratamientos previos del sujeto, y la vía de administración. Pueden determinarse las dosis preliminares según pruebas con animales, y la ampliación a escala de dosificaciones para administración a seres humanos se realiza según prácticas aceptadas en la técnica tales como ensayos de dosificación convencionales. Por ejemplo, puede estimarse inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos de cultivo celular. La dosificación dependerá de la actividad específica del compuesto y puede determinarse fácilmente mediante experimentación de rutina. Puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue una inhibición que es la mitad de la máxima de los síntomas) según se determina en cultivo celular, mientras se minimizan las tonicidades. Puede usarse tal información para determinar con más precisión dosis útiles en seres humanos. En última instancia, el médico que atiende decidirá la cantidad de polipéptido de la invención con la que tratar a cada sujeto individual. Inicialmente, el médico que atiende administrará dosis bajas del polipéptido de la invención y observará la respuesta del sujeto. Pueden administrarse dosis mayores del polipéptido de la invención hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el sujeto, y en ese punto la dosis no se aumenta más. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas usadas para poner en práctica el método de la invención deben contener de aproximadamente 0,01 ng a aproximadamente 100 mg (preferiblemente de aproximadamente 0,1 ng a aproximadamente 10 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 microgramos a aproximadamente 1 mg) de un polipéptido de la invención por kg de peso corporal. En una realización de la invención, se administra un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 una vez a la semana para tratar los diversos trastornos médicos descritos en el presente documento. En otra realización, se administra un polipéptido, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9, al menos dos veces a la semana y en otra realización al menos tres veces a la semana. Si se inyecta, la cantidad eficaz de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 por dosis de adulto oscila desde 1-20 mg/m^{2}, y es preferiblemente de aproximadamente 5-12 mg/m^{2}. Alternativamente, puede administrarse una dosis uniforme cuya cantidad puede oscilar desde 5-100 mg/dosis. Los intervalos de dosis a modo de ejemplo para una dosis uniforme que va a administrarse mediante inyección subcutánea son de 5-25 mg/dosis, 25-50 mg/dosis y 50-100 mg/dosis. En una realización de la invención, se tratan las diversas indicaciones descritas en el presente documento administrando una preparación aceptable para inyección que contiene un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 a 25 mg/dosis, o alternativamente, que contiene 50 mg por dosis. Las dosis de 25 mg o 50 mg pueden administrarse de manera repetida, particularmente para estados crónicos. Si se usa una vía de administración distinta a la inyección, se ajusta apropiadamente la dosis según las prácticas médicas habituales. En muchos casos, se obtendrá una mejora en el estado de un sujeto inyectando una dosis de aproximadamente 25 mg de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 una a tres veces a la semana durante un periodo de al menos tres semanas, o una dosis de 50 mg de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 una o dos veces a la semana durante al menos tres semanas (puede ser necesario un tratamiento durante periodos más prolongados para inducir el grado de mejora deseado). Para estados crónicos incurables, puede continuarse el régimen indefinidamente, realizándose ajustes en la dosis y frecuencia si se consideran necesarios por el médico del sujeto. Las dosis anteriores son ejemplos para un sujeto adulto que es una persona que tiene 18 años de edad o más. Para sujetos pediátricos (edad de 4-17 años), un régimen adecuado supone la inyección subcutánea de 0,4 mg/kg, hasta una dosis máxima de 25 mg de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9, administrados mediante inyección subcutánea una o más veces a la semana. Si se usa un anticuerpo frente a un polipéptido ADAM-H9 como un antagonista del polipéptido ADAM-H9, un intervalo de dosis preferido es de 0,1 a 20 mg/kg, y más preferiblemente es de 1-10 mg/kg. Otro intervalo de dosis preferido para un anticuerpo anti-polipéptido ADAM-H9 es de 0,75 a 7,5 mg/kg de peso corporal. Se prefieren anticuerpos humanizados. Tales anticuerpos pueden inyectarse o administrarse por vía intravenosa.

En el presente documento, se proporcionan composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un polipéptido ADAM-H9 de la invención (derivado de cualquier fuente, incluyendo sin limitación a partir de fuentes recombinantes y no recombinantes), en combinación con otros componentes tales como un diluyente, vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere en la eficacia de la actividad biológica del/de los principio(s) activo(s). Las formulaciones adecuadas para la administración incluyen soluciones para inyección estériles, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacterióstatos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor; y suspensiones estériles, acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Pueden formularse los polipéptidos según métodos conocidos usados para preparar composiciones útiles farmacéuticamente. Pueden combinarse en mezcla, o bien como el único material activo o con otros materiales activos conocidos adecuados para una indicación dada, con diluyentes (por ejemplo, solución salina, Tris-HCl, soluciones tamponadas con acetato y fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones adecuadas para las composiciones farmacéuticas incluyen las descritas en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA. En algunas realizaciones, el polipéptido puede someterse a pegilación para ayudar en la adsorción o captación. Por ejemplo, pueden complejarse tales composiciones con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporarse en compuestos poliméricos tales como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), hidrogeles, dextrano, y similares, o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, eritrocitos fantasma o esferoblastos. Los lípidos adecuados para la formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares. La preparación de tales formulaciones liposomales está dentro del nivel de las habilidades de la técnica, tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense número 4.235.871; la patente estadounidense número 4.501.728; la patente estadounidense número 4.837.028; y la patente estadounidense número 4.737.323, que se incorporan todas al presente documento como referencia. Tales composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de aclaramiento in vivo, y por tanto, se eligen según la aplicación pretendida, de modo que las características del vehículo dependerán de la vía de administración seleccionada. En una realización preferida de la invención, se usan formas de liberación sostenida de un polipéptido ADAM-H9. Las formas de liberación sostenida adecuadas para su uso en los métodos descritos incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido ADAM-H9 que está encapsulado en un polímero biocompatible que se disuelve lentamente (tal como las micropartículas de alginato descritas en la patente estadounidense número 6.036.978), mezclado con un polímero de este tipo (incluyendo hidrogeles aplicados tópicamente), y/o encerrado en un implante semipermeable biocompatible.

Un polipéptido ADAM-H9 de la invención puede ser activo en multímeros (por ejemplo, heterodímeros u homodímeros) o complejos con el mismo u otros polipéptidos. Como resultado, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un polipéptido de la invención en tal forma multimérica o complejada. La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un complejo del/de los polipéptido(s) de la invención La invención incluye además la administración de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 de manera concurrente con uno o más fármacos que se administran al mismo sujeto en combinación, administrándose cada fármaco según un régimen adecuado para ese medicamento. La "administración concurrente" engloba el tratamiento simultáneo o secuencial con los componentes de la combinación, así como regímenes en los que se alternan los fármacos, o en los que se administra un componente a largo plazo y el/los otro(s) se administran intermitentemente. Pueden administrarse los componentes en la misma composición o en composiciones separadas, y por la misma vía de administración o vías diferentes. Ejemplos de componentes que pueden incluirse en la composición farmacéutica de la invención son citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos tales como: MCSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL,-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-17, IL-18, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, trombopoyetina, factor de células madre y eritropoyetina. La composición farmacéutica puede contener además otros agentes que o bien potencian la actividad del polipéptido o complementan su actividad o uso en tratamiento. Tales factores y/o agentes adicionales pueden incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con un polipéptido de la invención, o para minimizar los efectos secundarios. Por el contrario, puede incluirse un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 de la invención en formulaciones con una citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico, o agente antiinflamatorio particular, para minimizar los efectos secundarios de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico, o agente antiinflamatorio. Ejemplos adicionales de fármacos que van a administrarse de manera concurrente incluyen, pero no se limitan a antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticoesteroides, antagonistas de citocinas inflamatorias, antiinflamatorios no esteroideos, pentoxifilina, talidomida, y fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME) tales como azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, sulfato de hidroxicloroquina, metotrexato, leflunomida, minociclina, penicilamina, sulfasalazina y compuestos de oro tales como oro oral, aurotiomalato sódico y aurotioglucosa. Adicionalmente, puede combinarse un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 con un segundo polipéptido ADAM-H9, anticuerpo frente a un polipéptido ADAM-H9, o un péptido derivado del polipéptido ADAM-H9 que actúa como un inhibidor competitivo de un polipéptido ADAM-H9 nativo.

Puede usarse una vía de administración eficaz para administrar terapéuticamente un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 del mismo, incluyendo aquellas composiciones que comprenden polinucleótidos de ADAM-H9. La administración parenteral incluye inyección, por ejemplo, a través de las vías intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea mediante inyección en bolo o mediante infusión continua. Otras vías incluyen la administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesión. Otros medios de administración adecuados incluyen la liberación sostenida desde implantes; inhalación y/o insuflación de aerosoles; colirios; supositorios vaginales o rectales; preparaciones bucales; preparaciones orales, incluyendo píldoras, jarabes, pastillas para chupar o chicle; y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, pulverizaciones, pomadas u otras técnicas adecuadas. Alternativamente, puede suministrarse el polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 mediante la implantación de células que expresan el polipéptido, por ejemplo, mediante la implantación de células que expresan un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9. También pueden cultivarse las células ex vivo en presencia de polipéptidos de la invención con el fin de que proliferen o para producir un efecto deseado sobre o en la actividad de tales células. Entonces pueden introducirse in vivo células tratadas para fines terapéuticos. En otra realización, se inducen las propias células del sujeto para que produzcan un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 mediante transfección in vivo o ex vivo con un polinucleótido que codifica para un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9. El polinucleótido puede introducirse en las células del sujeto, por ejemplo, inyectando ADN desnudo o ADN encapsulado en liposomas que codifica para un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9, o mediante otros medios de transfección. También pueden administrarse los polinucleótidos de la invención a sujetos mediante otros métodos conocidos para la introducción de ácidos nucleicos en una célula u organismo (incluyendo, sin limitación, en la forma de vectores víricos).

Cuando se administra por vía oral una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido ADAM-H9, fragmento del mismo, anticuerpo, o pareja de unión de la invención, el polipéptido normalmente estará en la forma de un comprimido, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un vehículo sólido tal como una gelatina o un adyuvante. El comprimido, cápsula y polvo contienen desde aproximadamente el 5 hasta el 95% de un polipéptido de la invención, y preferiblemente desde aproximadamente el 25 hasta el 90% de un polipéptido de la invención. Cuando se administra en forma líquida, puede añadirse un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente el 0,5 hasta el 90% en peso de un polipéptido de la invención, y preferiblemente desde aproximadamente el 1 hasta el 50% de un polipéptido de la invención.

Cuando se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o agente de unión de la invención mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el polipéptido estará en la forma de una solución acuosa libre de pirógenos, aceptable por vía parenteral. La preparación de tales soluciones de polipéptido aceptables por vía parenteral, teniendo en debida consideración el pH, isotonicidad, estabilidad, y similares, está dentro de las habilidades del experto en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener, además de un polipéptido de la invención, un vehículo isotónico tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Ringer con lactato, u otro vehículo tal como se conoce en la técnica. La composición farmacéutica de la invención también puede contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes, u otros aditivos conocidos por los expertos en la técnica. La duración de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la invención variará, dependiendo de la gravedad de la enfermedad que se esté tratando y el estado y posible respuesta idiosincrásica de cada sujeto individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de un polipéptido de la invención estará en el intervalo de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. En última instancia, el médico que atiende decidirá sobre la duración apropiada de la terapia intravenosa.

Para las composiciones de la invención que son útiles para la reparación o regeneración de tejido, el método terapéutico incluye administrar una forma libre de pirógenos, fisiológicamente aceptable de la composición tópicamente, por vía sistémica o localmente o en asociación con un implante o dispositivo. Además, la composición puede encapsularse o inyectarse de manera deseable en una forma viscosa para la administración al sitio con daño tisular. También pueden incluirse opcionalmente agentes útiles adicionales en la composición, tal como se describió anteriormente, o pueden administrarse simultánea o secuencialmente con la composición en los métodos de la invención. Las composiciones pueden incluir una matriz que puede administrar la composición que contiene el polipéptido en el sitio con daño tisular, proporcionando una estructura para el desarrollo de tejido y que puede reabsorberse de manera óptima en el cuerpo. La elección del material de la matriz se basa en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, aspecto cosmético y propiedades de la interfase. Las posibles matrices para las composiciones incluyen sulfato de calcio, fosfato de tricalcio, hidroxiapatita, poli(ácido láctico), poli (ácido glicólico) y polianhídridos. Otras posibles matrices no son biodegradables y están definidas químicamente, tales como hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden componerse de combinaciones de cualquiera de los tipos de material mencionados anteriormente, tales como poli(ácido láctico) e hidroxiapatita o colágeno y fosfato de tricalcio. Puede monitorizarse el progreso mediante la evaluación periódica del crecimiento y/o reparación de tejido/hueso, por ejemplo, rayos X, determinaciones histomorfométricas y marcado con tetraciclina.

Además de sujetos humanos, las composiciones que comprenden un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 son útiles en el tratamiento de estados patológicos en animales no humanos, tales como mascotas (perros, gatos, aves, primates y similares), animales de granja domésticos (caballos, ganado, ovejas, cerdos, aves y similares). En tales casos, puede determinarse una dosis apropiada según el peso corporal del animal. Por ejemplo, puede usarse una dosis de 0,2-1 mg/kg. Alternativamente, se determina la dosis según el área superficial del animal, oscilando una dosis a modo de ejemplo desde 0,1-20 mg/m^{2}, o más preferiblemente, desde 5-12 mg/m^{2}. Para animales pequeños, tales como perros o gatos, una dosis adecuada es de 0,4 mg/kg. En una realización, se administra un polipéptido ADAM-H9, fragmento, anticuerpo, o pareja de unión a ADAM-H9 (preferiblemente construido a partir de genes derivados de la misma especie que el sujeto), mediante inyección u otra vía adecuada una o más veces a la semana hasta que mejora el estado del animal, o puede administrarse indefinidamente.

La invención también se refiere al uso de un polipéptido ADAM-H9, fragmento y variante; polinucleótido que codifica para un polipéptido ADAM-H9, fragmento, y variante; agonistas o antagonistas de un polipéptido ADAM-H9 tales como anticuerpos; una pareja de unión al polipéptido ADAM-H9; complejos formados a partir de un polipéptido ADAM-H9, fragmento, variante, y pareja de unión, y similares, en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento terapéutico de una enfermedad o trastorno.

También están englobados por la invención sistemas y métodos para analizar polipéptidos ADAM-H9 que comprenden identificar y/o caracterizar uno o más polipéptidos ADAM-H9, ácidos nucleicos que los codifican, y genes correspondientes, comprendiendo preferiblemente estos sistemas y métodos un conjunto de datos que representan un conjunto de una o más moléculas de ADAM-H9, o el uso de las mismos. En consecuencia, se describe en el presente documento un medio legible por ordenador que tiene almacenado en él un elemento seleccionado del grupo que consiste en un polinucleótido que comprende una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7 o 9; un polipéptido que comprende una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8 o 10; un conjunto de secuencias de polinucleótido en las que al menos una de dichas secuencias comprende una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:2, 5, 7, o 9; y un conjunto de secuencias de polipéptido en las que al menos una de dichas secuencias comprende una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8 o 10.

Además se describe en el presente documento un entorno de cálculo y una pluralidad de algoritmos ejecutados selectivamente para analizar un polipéptido o polinucleótido de la invención. Los ejemplos de análisis de un polipéptido ADAM incluyen, sin limitación, visualizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido en el conjunto, comparar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido en el conjunto con la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido en el conjunto, predecir la estructura de un polipéptido en el conjunto, determinar las secuencias de nucleótidos de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido en el conjunto, e identificar un gen correspondiente a un polipéptido en el conjunto.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Todos los títulos y subtítulos proporcionados en el presente documento son solamente para la facilidad de lectura y no debe considerarse que limitan la invención. Los términos "un", "una" y "el/la" tal como se usan en el presente documento pretenden englobar el plural a menos que el contexto dicte claramente la forma singular. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, en la práctica o las pruebas de la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, dominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar realizaciones particulares y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Identificación de ADAM-H9, un nuevo miembro de la familia ADAM de polipéptidos

Se recibió un conjunto de datos de Celera Genomics (Rockville, Maryland) que contenía secuencias de aminoácidos que se prevé que están codificadas por el genoma humano. Se buscó este conjunto de datos usando un algoritmo BLAST para identificar los polipéptidos de la familia ADAM. Se identificó que una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:1 comprendía secuencias de aminoácidos parciales de un nuevo polipéptido de la familia ADAM humano. Se usó esta secuencia de aminoácidos para identificar un primer exón de aproximadamente 194 pb. Se usó este primer exón para identificar un clon que contenía un polinucleótido contiguo que contenía la secuencia del primer exón. Se identificó un segundo exón analizando la secuencia contigua en el sentido de 5' del primer exón hasta que se encontró homología sustancial con la secuencia codificante para ADAM9 (SEQ ID NO:23). Se identificó esta región de homología sustancial como un posible segundo exón y posteriormente se amplificó por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de células de ganglio linfático. El producto de PCR (SEQ ID NO:2) codificaba para una secuencia parcial de un polipéptido ADAM-H9 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 (desde el residuo 17 hasta el 67). Los primeros 14 aminoácidos de SEQ ID NO:3 representan la traducción de un segundo exón de aproximadamente 42 pb (aproximadamente 1,3 kb en el sentido de 5' del primer exón identificado) y se confirmaron ambos exones mediante amplificación por PCR y análisis de ADNc de una variedad de tejidos humanos incluyendo placenta, hígado, riñón, páncreas, bazo, testículos, estómago, médula ósea, ganglio linfático, corazón, músculo esquelético, cerebro, pulmón, colon, próstata, timo, ovario, intestino delgado, piel y esófago. También se analizó ADNc de algunos tejidos relacionados de origen fetal. Las secuencias de aminoácidos presentadas en la figura 2 se presentan en el código de aminoácidos de 1 letra habitual, en el que "A" representa alanina, "C" representa cisteína y similares.

Ejemplo 2 Análisis RACE

Se identificaron polinucleótidos adicionales que codificaban para un polipéptido ADAM-H9 mediante análisis de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE, "rapid amplification of cDNA ends"). Se clonaron todos los productos de RACE en vectores y se secuenciaron. Los análisis de secuencia de los productos de RACE identificaron varios clones que tenían secuencias sustancialmente idénticas. Los kits de análisis RACE están disponibles a partir de varias compañías incluyendo Roche Molecular Systems. Se diseñaron cebadores basándose en secuencias consenso encontradas mediante comparación de productos de RACE.

Se usó un par de cebadores que comprendían los nucleótidos 25-49 y 1434-1464 de SEQ ID NO:5 para amplificar por PCR una biblioteca de ADNc de células de ganglio linfático y células de la médula ósea. Se clonaron los productos de PCR resultantes y se secuenciaron usando protocolos habituales. Los polinucleótidos contenidos en estos clones se presentan en las SEQ ID NO:5, 7 y 9 y codifican para los polipéptidos que tienen una secuencia tal como se expone en las SEQ ID NO:6, 8 y 10, respectivamente. Dos de las tres secuencias clonadas incluyen dominios citoplasmáticos y anclajes transmembrana previstos.

Un análisis de la secuencia de ADAM-H9 demuestra que todas las SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8 y 10 contienen una región de aminoácidos que tiene homología con el dominio desintegrina de la familia ADAM de polipéptidos. Un dominio desintegrina de la invención puede incluir una secuencia que comienza con una secuencia CGN altamente conservada que comienza en el residuo 73 y que continua hasta aproximadamente el residuo 360 a 362 de SEQ ID NO:6; puede incluir una secuencia desde aproximadamente el residuo 1 o 16 hasta aproximadamente el residuo 285 a 287 de SEQ ID NO:8; o puede incluir una secuencia desde el residuo 1 o 73 (o cualquier residuo intermedio) hasta aproximadamente 314 o 329 (o cualquier residuo intermedio) de SEQ ID NO:10. El análisis también identificó una secuencia transmembrana presente en SEQ ID NO:6 y 8 que comienza en aproximadamente el residuo 361 y que continúa hasta el residuo 382 de SEQ ID NO:6 o desde aproximadamente el residuo 286 hasta el residuo 307 de SEQ ID NO:8. En consecuencia, un polipéptido que carece de un dominio transmembrana, (por ejemplo, fragmentos de las SEQ ID NO:6 y 8 que tienen el dominio transmembrana ausente o delecionado) se prevé que son polipéptidos solubles que tienen actividad desintegrina. También se identifica por la invención una variante que se produce de manera natural de un polipéptido ADAM-H9 que carece de un dominio transmembrana (véase, por ejemplo, SEQ ID NO:10). Además, una comparación de la secuencias del polipéptido ADAM-H9 de SEQ ID NO:6, 8 y 10 con las de la secuencia de ADAM9 humana demuestra varios residuos de cisteína conservados en los dominios ricos en cisteína y desintegrina que concuerdan con los polipéptidos de la familia ADAM. En la figura 1, se presenta una alineación de la secuencia de ADAM9 con SEQ ID NO:6, 8 y 10. En la figura 1, las barras grises representan una aproximación del dominio rico en cisteína y desintegrina y la línea de puntos el dominio transmembrana aproximado. Los residuos de cisteína conservados están marcados y en mayúsculas.

En la figura 3, se proporcionan las secuencias de polinucleótido que codifican para una parte o para todas las secuencias de polipéptido de ADAM-H9 (SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8 o 10). La ATG en negrita en las SEQ ID NO:5, 7 y 9 anteriores representa el codón de inicio o metionina en la posición 1 de SEQ ID NO:6, 8 y 10. Un análisis de la secuencia codificante de SEQ ID NO:6, 8 y 10, tal como se representa en las SEQ ID NO: 5, 7 y 9, respectivamente, demuestra que el dominio que tiene actividad desintegrina corresponde a de aproximadamente el nucleótido 248 a aproximadamente el nucleótido 1111 de SEQ ID NO:5; de aproximadamente el nucleótido 82 o 127 (o cualquier nucleótido intermedio) a aproximadamente el nucleótido 936 de SEQ ID NO:7; o de aproximadamente el nucleótido 32 o 248 (o cualquier nucleótido intermedio) a aproximadamente el nucleótido 973 o 1018 (o cualquier nucleótido intermedio) de SEQ ID NO:9. En consecuencia, un polinucleótido que comprende fragmentos de las secuencias de ácidos nucleicos anteriores representa una secuencia codificante para un polipéptido soluble que tiene la actividad desintegrina. Además, la secuencia codificante para el dominio transmembrana de SEQ ID NO:6 y 8 corresponde a de aproximadamente los nucleótidos 1112 a aproximadamente el 1177 o de aproximadamente los nucleótidos 937 a aproximadamente el 1002 de las SEQ ID NO:5 y 7, respectivamente. Tal como se trata en el presente documento, los dominios citoplasmáticos de SEQ ID NO:6, 8 y 10 difieren y potencialmente representan variantes de corte y empalme.

Las variantes de las secuencias del polipéptido ADAM-H9 pueden identificarse basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento. En el presente documento, se proporcionan varias variantes (tal como se describe de manera más completa a continuación) y se incluyen dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, SEQ ID NO:1 está presente en las SEQ ID NO:3, 4, 6, 8 y 10, sin embargo, SEQ ID NO:8 carece de un tramo de 39 aminoácidos en el dominio citoplasmático previsto del polipéptido comparado con SEQ ID NO:6. Se prevé que es más probable que las sustituciones de aminoácidos y otras alteraciones (deleciones, inserciones y similares) en las secuencias de aminoácidos de ADAM-H9 alteren o perturben las actividades del polipéptido ADAM-H9 si dan como resultado cambios en los residuos conservados de la secuencias de aminoácidos tal como se muestra en la figura 1, y particularmente si esos cambios no sustituyen un aminoácido de estructura similar (tales como la sustitución de uno cualquiera de los residuos alifáticos - Ala, Gly; Leu, Ile o Val - por otro residuo alifático). A la inversa, si se realiza un cambio en una secuencia de aminoácidos de ADAM-H9 que da como resultado la sustitución del residuo en esa posición en la alineación de una de las otras secuencias de polipéptido ADAM-H9, es menos probable que una alteración de este tipo afecte a la función del polipéptido ADAM-H9 alterado.

Ejemplo 3 Anticuerpos monoclonales que se unen a polipéptidos de la invención

Puede usarse un polipéptido ADAM-H9 sustancialmente purificado para generar anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con éste, usando técnicas convencionales tales como las descritas en la patente estadounidense 4.411.993. Se inmunizan ratones con un inmunógeno de polipéptido ADAM-H9 emulsionado en adyuvante completo de Freund, y se les inyecta por vía subcutánea o por vía intraperitoneal cantidades que oscilan desde 10-100 \mug. De diez a doce días más tarde, a los animales inmunizados se administra una dosis de refuerzo con polipéptido ADAM-H9 adicional emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Se les administra una dosis de refuerzo periódicamente a los ratones después con un programa de inmunización de semanal a bisemanal. Se toman periódicamente muestras de suero mediante extracción de sangre retroorbital o escisión del extremo de la cola para someter a prueba un anticuerpo frente al polipéptido ADAM-H9 mediante ensayo de inmunotransferencia puntual, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) o inhibición de la unión de un polipéptido ADAM-H9 a una pareja de unión al polipéptido ADAM-H9.

Tras la detección de un título de anticuerpos apropiado, se les proporciona a los animales positivos una última inyección de un polipéptido ADAM-H9 en solución salina. De tres a cuatro días más tarde, se sacrifican los animales, se recogen las células del bazo, y se fusionan las células del bazo con una línea celular de mieloma murino, por ejemplo, NS1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se siembran en múltiples placas de microtitulación en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.

Se seleccionan las células de hibridoma mediante ELISA para determinar la reactividad frente a un polipéptido ADAM-H9 sustancialmente puro mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall et al., (Immunochem. 8:871, 1971) y en la patente estadounidense 4.703.004. Una técnica de selección preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita en Beckmann et al., (J. Immunol. 144:4212,1990). Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse por vía intraperitoneal a los ratones BALB/c singénicos para producir ascitis que contiene altas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-ADAM-H9. Alternativamente, pueden hacerse crecer las células de hibridoma in vitro en matraces o frascos rotatorios mediante varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitis de ratón pueden purificarse mediante precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también puede usarse la cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpos a polipéptido A o polipéptido G, como puede ser la cromatografía basada en la unión al polipéptido ADAM-H9.

Ejemplo 4 Mapeo cromosómico

Se mapea el gen correspondiente a un polipéptido ADAM-H9 usando estrategias de mapeo basadas en PCR. Las asignaciones cromosómicas humanas iniciales se realizan usando cebadores de PCR específico para ADAM-H9 tales como los descritos anteriormente en el ejemplo 1 y un kit BIOS Somatic Cell Hybrid PCRable DNA (ADN que puede someterse a PCR de híbridos de células somáticas) de BIOS Laboratories (New Haven, CT), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realiza un mapeo más detallado usando un panel de híbridos de radiación de Genebridge 4 (Research Genetics, Huntsville, AL (véase, por ejemplo, Walter, MA et al., Nature Genetics 7:22-28, 1994). Entonces, los datos de este análisis se someten electrónicamente al mapeador de híbridos de radiación MIT (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/condg/rhmapper.pl) siguiendo las instrucciones contenidas en el mismo. Este análisis produce nombres de marcadores genéticos específicos que, cuando se someten electrónicamente a NCBI: (www-ncbi.nlm.nih.gov/genemap/map.cgi?CHR=8), producen el intervalo cromosómico específico. La ubicación cromosómica prevista es en el cromosoma 8 en aproximadamente 8p11.1.

Ejemplo 5 Generación de ADAM-H9dis.Fc y actividad de polipéptidos ADAM con dominio desintegrina en un ensayo de cavidad corneal ("Corneal Pocket Assay")

Para construir un polinucleótido que codifica para el dominio extracelular de ADAM-H9 fusionado con un Fc, se unió un ácido nucleico que codifica para los residuos de aminoácidos 73 a 362 de SEQ ID NO:6, a un ácido nucleico que codifica para una parte Fc de IgG1 humana. El polipéptido codificado por este constructo se muestra en SEQ ID NO:25. Este constructo usa la secuencia líder igKappa, que se escinde por la peptidasa de señal tras el aminoácido G (glicina) C- terminal en la posición 20 de SEQ ID NO:25. Entonces se prevé que la forma soluble de la molécula se inicia en el aminoácido 21 de SEQ ID NO:25. La secuencia TS (treonina-serina) (aminoácidos 21 y 22 de SEQ ID NO:25) es una consecuencia del sitio de restricción usado para unir un dominio desintegrina de SEQ ID NO:6 (aminoácidos 73 a 362 de SEQ ID NO:6) al dominio Fc. Un dominio desintegrina de SEQ ID NO:6 comienza en el aminoácido 23 y continúa hasta el aminoácido 312 de SEQ ID NO:25. La secuencia RS (arginina-serina) en los aminoácidos 313-314 es una consecuencia del sitio de restricción usado para unir un dominio desintegrina de SEQ ID NO:6 (aminoácidos 73 a 362 de SEQ ID NO:6) al dominio Fc. La secuencia de Fc comienza en el aminoácido 315 y continúa hasta el codón de terminación en marco tras el residuo 542.

Se usa un ensayo de cavidad corneal en ratón para cuantificar la inhibición de la angiogénesis por los polipéptidos ADAM-H9dis-Fc in vivo. En este ensayo, se inmovilizan los agentes que van a someterse a prueba para determinar la actividad angiogénica o antiángiogénica en una forma de liberación lenta en un gránulo de Hydron, que se implanta en las microcavidades creadas en el epitelio corneal de los ratones anestesiados. Se mide la vascularización como la aparición, densidad y extensión de vasos en crecimiento del limbo corneal vascularizado en la cornea normalmente avascular.

Los gránulos de Hydron, tal como se describe en Kenyon et al., Invest Opthamol. & Visual Science 37:1625, 1996, incorporan sucralfato con FGFb (90 ng/gránulo), FGFb e IgG (11 \mug/gránulo, control), o FGFb y un intervalo de concentraciones del agente que va a someterse a prueba (por ejemplo, polipéptido ADAM-H9dis-Fc). Los gránulos se implantan quirúrgicamente en las microcavidades estromales corneales creadas mediante la microdisección a 1 mm en la parte media con respecto al limbo corneal lateral de ratones C57BL machos de 6-8 semanas de edad. Tras cinco días, en el pico de la respuesta neovascular a FGFb, se fotografían las corneas usando una lámpara de hendidura Zeiss en un ángulo incipiente de 35-50° del eje polar en el meridiano que contiene el gránulo. Se digitalizan y procesan las imágenes mediante filtros de color sustractivos (Adobe Photoshop 4.0) para delinear microvasos establecidos por el contenido en hemoglobina. Se usa un software de análisis de imágenes (Bioquant, Nashville, TN) para calcular la fracción de la imagen corneal que está vascularizada, la densidad de vasos dentro del área vascularizada, y la densidad de vasos dentro de la cornea total. Se determina la inhibición de la angiogénesis corneal inducida por FGFb, como una función de la dosis de polipéptido ADAM-H9 con desintegrina-Fc.

Ejemplo 6 Inhibición de la neovascularización por polipéptidos ADAM con dominio desintegrina en un modelo de transplante murino

La supervivencia de tejidos cardíacos trasplantados heterotópicamente de un ratón donante a la piel de la oreja de otro ratón genéticamente similar, requiere la neovascularización adecuada por el corazón trasplantado y el tejido que lo rodea, para promover la supervivencia y la energía para la función del músculo cardíaco. La vasculatura inadecuada en el sitio de trasplante produce una isquemia excesiva al corazón, daño tisular y fallo del tejido que va a injertarse. Los agentes que antagonizan los factores implicados en la migración de las células endoteliales y la formación de vasos pueden disminuir la angiogénesis en el sitio de transplante, limitando así la función del tejido de injerto y por último su propio prendimiento del injerto. Se usa un modelo de isoinjerto cardíaco heterotópico murino para demostrar los efectos antagonistas de polipéptidos ADAM-H9dis-Fc sobre la neovascularización.

Se administran injertos de corazón neonatal a receptores hembras BALB/c (\approx 12 semanas de edad) de ratones donantes de la misma raza. Se injerta el tejido de corazón del donante en el pabellón auditivo de la oreja izquierda del receptor en el día 0 y se dividen los ratones en dos grupos. El grupo control recibe IgG humana (IgG Hu) mientras que el otro grupo recibe ADAM-H9dis-Fc, ambos por vía intraperitoneal. Se continúan los tratamientos durante cinco días consecutivos. Se determina la funcionalidad de los injertos monitorizando la actividad pulsátil visible en los días 7 y 14 tras el prendimiento del injerto. La inhibición del prendimiento del injerto funcional, se determina como una función de las dosis de ADAM-H9dis-Fc. Se examina la histología de los corazones trasplantados con el fin de visualizar los efectos de ADAM-H9dis-Fc sobre el edema en el sitio de trasplantes y la vasculatura del tejido de donante y huésped (usando, por ejemplo, la tinción con factor VIII).

Ejemplo 7 Tratamiento de tumores con polipéptidos ADAM-H9 con dominio desintegrina (ADAM-H9dis)

Se somete a prueba ADAM-H9dis-Fc en modelos animales de tumores sólidos. Se determina el efecto de ADAMdis-Fc midiendo la frecuencia tumoral y el crecimiento tumoral. También se demuestra la actividad biológica de ADAM-H9dis-Fc en otros ensayos in vitro, ex vivo e in vivo conocidos en la técnica, tales como ensayos de movilización de calcio y ensayos para medir la activación, reclutamiento o agregación de plaquetas.

<110> Immunex Corporation

\hskip1cm Poindexter, Kurt

\hskip1cm Black, Roy A.

\hskip1cm Mosley, Bruce

\hskip1cm Dubose, Robert F

\hskip1cm Wiley, Steve R

\vskip0.400000\baselineskip

<120> PROTEÍNA DESINTEGRINA HUMANA

\vskip0.400000\baselineskip

<130> IMNX 3199-WO

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PENDIENTE DE CESIÓN

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 27-07-2001

\vskip0.400000\baselineskip

<150> Documento US 60/221.838

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 28-07-2000

\vskip0.400000\baselineskip

<150> Documento US 60/282.550

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 09-04-2001

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(154)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1532

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)..(1432)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 466

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

8

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (82)..(1140)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

10

11

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

13

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)..(1021)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

16

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Resto de ligador artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Resto de ligador artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es una o más repeticiones de GGGGS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Gly Gly Ser Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Resto de ligador artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Resto de ligador artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Resto de ligador artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr}

\sac{Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Resto de ligador artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr}

\sac{Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Resto de ligador artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lus Glu Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia de localización artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Lys Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia de localización artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Leu Arg Thr Ser Ser Leu Phe Thr Arg Arg Val Gln Pro Ser Leu}

\sac{Phe Arg Asn Ile Leu Arg Leu Gln Ser Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia de localización artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia de localización artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en el residuo 4 es cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Ala Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia de localización artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X en el residuo 3 y 4 puede ser cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Cys Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 819

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

18

19

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia consenso artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> x en los residuos 3, 6, 7, 9 y 10 puede ser cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Glu Xaa Gly His Xaa Xaa Gly Xaa Xaa His Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 542

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Constructo de desintegrina-Fc

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

Claims (40)

1. Polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10;

(b) fragmentos solubles del polipéptido de SEQ ID NO :6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales e inhibición de la angiogénesis;

(c) fragmentos del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio desintegrina, correspondiendo dicha secuencia a la secuencia desde el residuo de aminoácido 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360\pm5 a 362\pm5 de SEQ ID NO:6, desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 285\pm5 a 287\pm5 de SEQ ID NO:8, y desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 735 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5, respectivamente;

(d) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360\pm5 a 362\pm5;

(e) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 285\pm5 a 287\pm5;

(f) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5;

(g) polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que comparten identidad de aminoácidos a través de la longitud de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10, en el que la identidad de aminoácidos en porcentaje se selecciona del grupo que consiste en al menos el 97,5%, al menos el 99% y al menos el 99,5%; y

(h) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, unido a un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido es un polipéptido de cremallera de leucina, un polipéptido de Fc o un ligador peptídico.

3. Polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido según la reivindicación 1 o 2.

4. Polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9;

(b) SEQ ID NO:5 desde el nucleótido 248 hasta el nucleótido 1111 de SEQ ID NO:5;

(c) un polinucleótido que comprende una secuencia de SEQ ID NO:7 desde un nucleótido entre 82 y 127 hasta el nucleótido 936;

(d) un polinucleótido que comprende una secuencia de SEQ ID NO:9 desde un nucleótido entre 32 y 248 hasta un nucleótido entre 973 y 1018;

(e) una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9; y

(f) cualquiera de las secuencias de nucleótidos de a) a e) en las que T también puede ser U.

5. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia según la reivindicación 4, operativamente unida a un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés.

6. Vector de expresión que comprende un polinucleótido según la reivindicación 3, 4 o 5.

7. Célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido según la reivindicación 3, 4 o 5.

8. Método para producir un polipéptido según la reivindicación 1 o 2, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 7 en condiciones que fomentan la expresión del polipéptido según las reivindicaciones 1 o 2.

9. Método según la reivindicación 8, que comprende además purificar el polipéptido.

10. Polipéptido de desintegrina producido mediante el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 7 en condiciones que fomentan la expresión del polipéptido.

11. Anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido según la reivindicación 1.

12. Anticuerpo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

13. Anticuerpo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.

14. Anticuerpo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo inhibe la actividad biológica del polipéptido según la reivindicación 1.

15. Método para identificar un agente que modula una actividad de un polipéptido según la reivindicación 1, que comprende:

(a) poner en contacto el agente con un polipéptido según la reivindicación 1 en condiciones tales que interaccionan el agente y el polipéptido; y

(b) determinar la actividad del polipéptido en presencia del agente comparado con un control, en el que un cambio en la actividad es indicativo de un agente que modula la actividad del polipéptido.

16. Método según la reivindicación 15, en el que el agente se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o un péptido.

17. Polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble que comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales e inhibición de la angiogénesis, para su uso en terapia.

18. Uso de un polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble que comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales e inhibición de la angiogénesis, para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis en un mamífero que necesita tal tratamiento.

19. Método in vitro para modular la angiogénesis en un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con un polipéptido según la reivindicación 1.

20. Polipéptido según la reivindicación 1, para su uso en terapia.

21. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1, para la preparación de una composición farmacéutica para modular la angiogénesis en un tejido.

22. Método in vitro para modular la migración de células endoteliales, que comprende poner en contacto una células endotelial con un polipéptido según la reivindicación 1.

23. Uso de un polipéptido según la reivindicación 1, para la preparación de una composición farmacéutica para modular la migración de células endoteliales.

24. Método in vitro para inhibir la unión de una integrina a un ligando, que comprende poner en contacto una célula que expresa la integrina con una cantidad eficaz de un polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble que comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales, e inhibición de la angiogénesis.

25. Uso de un polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble que comprende un fragmento del polipéptido de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:10 que tiene al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en actividad de unión a integrina, inhibición de la migración de células endoteliales e inhibición de la angiogénesis, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un estado seleccionado del grupo que consiste en trastornos oculares; estados cancerígenos y metastásicos; enfermedades inflamatorias; osteoporosis, trastornos con resorción ósea acelerada; reestenosis; activación, reclutamiento o agregación de plaquetas inapropiados; trombosis; y un estado que requiere la reparación de tejidos o la cicatrización de heridas.

26. Polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble según la reivindicación 17, para el uso especificado en ella, en el que el polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble comprende una secuencia seleccionado del grupo que consiste en:

(a) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360\pm5 a 362\pm5;

\newpage

(b) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 285\pm5 a/o 287\pm5; y

(c) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5.

27. Polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble según la reivindicación 26, en el que el dominio desintegrina de ADAM-H9 soluble está en la forma de un multímero.

28. Polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble según la reivindicación 27, en el que el multímero es un dímero o trímero.

29. Polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble según las reivindicaciones 27 o 28, en el que el multímero comprende un polipéptido de Fc, una cremallera de leucina, o un ligador peptídico.

30. Polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble según la reivindicación 29, en el que el multímero comprende una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO:25.

31. Uso según las reivindicaciones 18 o 25, en el que el polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360\pm5 a 362\pm5;

(b) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 285\pm5 a/o 287\pm5; y

(c) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5.

32. Uso según la reivindicación 31, en el que el dominio desintegrina de ADAM-H9 soluble está en la forma de un multímero.

33. Uso según la reivindicación 32, en el que el multímero es un dímero o trímero.

34. Uso según las reivindicaciones 32 o 33, en el que el multímero comprende un polipéptido de Fc, una cremallera de leucina o un ligador peptídico.

35. Uso según la reivindicación 34, en el que el multímero comprende una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO:25.

36. Método según la reivindicación 24, en el que el polipéptido ADAM-H9 con dominio desintegrina soluble comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) SEQ ID NO:6 desde el residuo de aminoácido 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 360\pm5 a 362\pm5;

(b) SEQ ID NO:8 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 16\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 285\pm5 a/o 287\pm5; y

(c) SEQ ID NO:10 desde uno cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 73\pm5 hasta uno cualquiera de los residuos de aminoácido 314\pm5 a 329\pm5.

37. Método según la reivindicación 36, en el que el dominio desintegrina de ADAM-H9 soluble está en la forma de un multímero.

38. Método según la reivindicación 37, en el que el multímero es un dímero o trímero.

39. Método según las reivindicaciones 37 o 38, en el que el multímero comprende un polipéptido de Fc, una cremallera de leucina o un ligador peptídico.

40. Método según la reivindicación 39, en el que el multímero comprende una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO:25.