ES2283452T3

ES2283452T3 - Vacuana mejorada a base de bacterina de i mycoplasma hyopneumoniae/ i.

Info

Publication number: ES2283452T3
Application number: ES01990123T
Authority: ES
Inventors: Hsien-Jue Chu (Steve); Wumin Li; Zhichang Xu
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2021-12-11
Also published as: AR033410A1; CZ20031721A3; US7666439B2; EP1343525A2; HK1056513A1; KR20030065556A; ATE359813T1; CY1106669T1; HU227431B1; DK1343525T3; BR0116249A; RS51536B; AU2899302A; PT1343525E; WO2002049666A2; HUP0400687A2; HRP20030585B1; HUP0400687A3; US20020131980A1; JP2009073855A

Abstract

Composición de vacuna para inmunizar a un animal contra la infección por Mycoplasma hyopneumoniae, que comprende: una cantidad inmunizante de bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae; un sistema adyuvante que se puede obtener mezclando un polímero de ácido acrílico y una mezcla de un aceite metabolizable y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno; y un vehículo farmacéuticamente aceptable, cuya composición de vacuna, después de una sola administración, produce inmunidad protectora frente a Mycoplasma hyopneumoniae.

Description

Vacuna mejorada a base de bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos mejorados para inducir inmunidad protectora contra Mycoplasma hyopneumoniae, utilizando específicamente una bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae inactivada, en una cantidad eficaz para inmunizar un animal receptor contra la infección por Mycoplasma hyopneumoniae en una única dosis.

Antecedentes de la invención

La Mycoplasma hyopneumoniae es el agente etiológico de la neumonía micoplásmica en cerdos. Está enfermedad es una causa importante de pérdida económica en la industria porcícola, debido a la ganancia de peso reducida y a la pobre deficiencia de la alimentación. La enfermedad causa una tos crónica, pelaje opaco, crecimiento retardado y aspecto desmedrado que dura varias semanas. En los animales infectados se observan lesiones características de áreas de consolidación de color púrpura a gris, particularmente en los lóbulos ventrales apical y cardiaco. Aunque la enfermedad causa poca mortalidad, los cerdos afectados son a menudo susceptibles a infecciones secundarias causadas por patógenos oportunistas, dando como resultado la muerte o estrés. Las pérdidas económicas solamente han sido estimadas entre 200 y 250 millones de dólares anualmente.

La Mycoplasma hyopneumoniae es una bacteria exigente, de crecimiento lento, que carece de pared celular. Frecuentemente es difícil aislarla del aparato respiratorio, debido a Mycoplasma hyorhinis, un agente secundario común también localizado en el aparato respiratorio. La enfermedad se disemina en forma aerosol, producido al toser, y por contacto directo con un cerdo vehículo afectado o convaleciente. La reunión de animales afectados y animales no infectados da como resultado la reinfección temprana y frecuente. La infección empieza frecuentemente con la infección de los cerditos por las cerdas vehículoas, al parir. Debido a técnicas de manejo de manadas, la infección puede no ser evidente hasta después en la vida del animal. La infección adicional se observa habitualmente después del destete, cuando los cerdos son reunidos en grupos. La enfermedad manifiesta se observa normalmente en cerdos de seis semanas o mayores. Las tasas de crecimiento y las tasas de conversión del alimento se reducen notablemente en los animales afectados. Los tratamientos que usan antibióticos son caros y requieren el uso prolongado. La reinfección es también un problema. Las vacunas son actualmente el método más eficaz para evitar infecciones y sus consecuencias.

Fort Dodge Animal Health (FDAH) comercializa la bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae, con el nombre de Suvaxyn® Respifend® MH en los Estados Unidos de América, para uso como una vacuna para proteger a los cerdos sanos contra signos clínicos causados por Mycoplasma hyopneumoniae. La vacuna contiene Carbopol como adyuvante, y se recomienda como una vacuna de dos dosis para cerdos de por lo menos una semana, administrándose la segunda dosis dos a tres semanas después de la primera vacunación. Sin embargo, una vacuna de dos dosis tiene la desventaja obvia de requerir una segunda manipulación de los animales a fin de proporcionar una protección completa contra la enfermedad.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una vacuna eficaz contra Mycoplasma hyopneumoniae que produzca inmunidad protectora y prevenga la enfermedad causada por este organismo, con una administración de una sola dosis de la vacuna.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una composición de vacuna adecuada para uso en cerdos, contra la infección y enfermedad causada por Mycoplasma hyopneumoniae, y que se pueda usar en combinación con otras bacterinas y/o toxoides.

Todavía otro objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar un método para la prevención o alivio de la enfermedad, en el que el organismo causante sea Mycoplasma hyopneumoniae, utilizando una formulación adyuvante que potencie la inmunogenicidad de la bacterina, a fin de producir inmunidad protectora después de una sola dosis de la vacuna.

Otros objetivos y características de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada presentada a continuación.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una composición de vacuna para inmunizar un animal contra la infección por
Mycoplasma hyopneumoniae, que comprende una cantidad inmunizante de una bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae inactivada; una mezcla adyuvante obtenible mezclando un polímero de ácido acrílico y una mezcla de un aceite metabolizable y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno; y un vehículo farmacéuticamente aceptable, composición de vacuna que, después de una sola administración, produce inmunidad protectora contra Mycoplasma hyopneumoniae.

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En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica para inmunizar a un
animal contra la infección por Mycoplasma hyopneumoniae, que comprende una bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae inactivada combinada con la mezcla adyuvante anterior, y un estabilizador, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El adyuvante está presente habitualmente en esta composición de vacuna en una concentración final de aproximadamente 1-25% (v/v), y de forma preferible aproximadamente 5-12% (v/v). La composición puede incluir también otros componentes de vacuna, incluyendo bacterinas inactivadas o toxoides purificados, de uno o más patógenos, tales como la Haemonphilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis y leptospira, y se puede administrar por las vías intramuscular, subcutánea, oral, aerosol o intranasal.

Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para proteger a un animal contra la enfermedad causada por Mycoplasma hyopneumoniae, administrando una sola dosis de la vacuna anterior que contiene la bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae inactivada y la mezcla adyuvante.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en la presente memoria, una "bacterina" es un cultivo bacteriano que ha sido inactivado y que, en combinación con ciertos adyuvantes, puede producir inmunidad protectora para proteger contra una enfermedad o infección cuando se administra a animales.

El término "Adyuvante" significa una composición compuesta de una o más substancias que potencia la inmunogenicidad y eficacia de la bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae en una composición de vacuna.

Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, el término MHDCE designa equivalentes celulares de ADN de Mycoplasma hyopneumoniae.

La "cantidad inmunizante" es la cantidad de bacterina que proporcionará inmunidad frente a Mycoplasma hyopneumoniae. La "cantidad inmunizante" dependerá de la especie, raza, edad, tamaño, estado de salud, y de si al animal se le ha proporcionado o no previamente una vacuna contra el mismo organismo.

La presente invención proporciona una vacuna contra Mycoplasma hyopneumoniae, que es adecuada para la inmunización con una sola dosis. La vacuna de la presente invención incluye una mezcla adyuvante que potencia la inmunogenicidad de la bacterina y proporciona así una sola administración para suscitar inmunidad protectora.

La vacuna se puede preparar a partir de cultivos recién cultivados, a través de métodos que son estándares en la técnica (véase, por ejemplo, la patente US nº 5.338.543 o la patente US nº 5.565.205, así como el Ejemplo 2 descrito a continuación). Es decir, el organismo se puede propagar en un medio de cultivo tal como medio completo PPLO (organismo similar a la Pleuropneumonia) de los laboratorios [Difco]. El crecimiento del organismo se monitoriza a través de técnicas estándares tales como la determinación de unidades de cambio del color (CCU), y se recolecta cuando se ha logrado un título lo suficientemente alto. Los lotes se pueden concentrar o liofilizar adicionalmente a través de métodos convencionales antes de la inclusión en la vacuna para su formulación. Se pueden emplear otros métodos, tales como los descritos en Thomas, et al., Agri-Practice, Vol. 7, nº 5, págs. 26-30.

La vacuna de la presente invención comprende la bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae inactivada, combinada con la mezcla adyuvante y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos adecuados para uso incluyen medios acuosos, por ejemplo, disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, Medio Esencial Mínimo (MEM), o MEM con tampón de HEPES.

La mezcla adyuvante para uso en las composiciones de vacuna de la presente invención potencia la respuesta inmunitaria y comprende una mezcla de un polímero de poli(ácido acrílico) con una mezcla de aceite metabolizable, por ejemplo un hidrocarburo terpénico insaturado o un producto de hidrogenación del mismo, preferentemente escualano (2,3,10,15,19,23-hexametiltetracosano) o escualeno, y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno. Ese polímero de ácido acrílico puede hacer un homopolímero o un copolímero. El polímero de ácido acrílico es preferentemente un carbómero. Los carbómeros se encuentran disponibles comercialmente con el nombre comercial de Carbopol. Los polímeros de ácido acrílico se describen, por ejemplo, en las patentes US nº 2.909.462 y US nº 3.790.665. Los copolímeros de bloques de polioxietileno-polioxipropileno son agentes tensioactivos, preferentemente agentes tensioactivos líquidos, que ayudan a suspender los componentes sólidos y líquidos. Los agentes tensioactivos se encuentran disponibles comercialmente como polímeros con el nombre comercial de Pluronic®. El agente tensioactivo preferido es el poloxámero 401, que se encuentra disponible comercialmente con el nombre comercial de Pluronic® L121.

La mezcla adyuvante inmunogénicamente estimulante se encuentra presente típicamente en la composición de vacuna de la invención en cantidades v/v de aproximadamente 1% a 25%, preferentemente entre aproximadamente 2% y 15%, más preferentemente entre aproximadamente 5% y 12% v/v. La cantidad de uso de la mezcla adyuvante y la relación de los dos componentes del adyuvante pueden variar dependiendo de la adición de otras bacterinas o toxoides purificados. La mezcla adyuvante comprende generalmente un aceite metabolizable, un polímero de ácido acrílico y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno, formulados como una emulsión en un medio acuoso.

En esta mezcla adyuvante, el aceite metabolizable y el polímero de ácido acrílico pueden estar presentes en cantidades comprendida entre 10 y 150 ml/l y entre 0,5 y 10 g/l, respectivamente. En una forma de realización preferida de la mezcla adyuvante, la mezcla del aceite metabolizable y componente de copolímeo de bloques de polioxietileno-polioxipropileno es una mezcla de escualano y Pluronic® L121 (poloxámero 401), que puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 50 a 100 ml/l, y el polímero carboximetilénico es Carbopol 934P (Carbómero 934P), que puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 2 ml/l. Típicamente, la mezcla adyuvante contiene aproximadamente una relación de 1:25 a 1:50 de polímero de ácido acrílico con relación a la mezcla de aceite metabolizable/copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno.

Los polímeros de ácido acrílico preferidos son aquellos comercializados por B. F. Goodrich como Carbopol 934 P NF y 941 NF, que son polímeros de ácido acrílico reticulado con polialilsacarosa, y que tienen la fórmula química (CH_{2}CHOOOH)_{n}. Estos polímeros forman geles acuosos que se formulan adecuadamente con vehículos acuosos. Los copolímeros de bloques de polioxietileno-polioxipropileno preferidos son los agentes tensioactivos no iónicos comercializados por BASF como Pluronic® L121, L61, L81 o L101.

La vacuna de la presente invención se puede administrar a través de las vías intramuscular, subcutánea, intranasal, intraperitoneal u oral, preferentemente a través de las vías intramuscular o subcutánea.

La vacuna de la invención comprende en general Mycoplasma hyopneumoniae inactivada, un aceite metabolizable, un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno y un polímero de ácido acrílico, en forma de una emulsión de aceite en agua. La vacuna contiene preferentemente el polímero de ácido acrílico en una concentración dentro del intervalo de 0,5 a 10 g/l. La vacuna contiene preferentemente el aceite metabolizable en una concentración dentro del intervalo de 2 a 6 ml/l. La vacuna contiene preferentemente el copolímero de bloques de polioxietileno-propileno en una concentración dentro del intervalo de 1 a 3 ml/l.

Para la administración de una sola dosis, la vacuna deberá contener preferentemente una cantidad de bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae que corresponde a aproximadamente 1 x 10^{8} a 3 x 10^{11} MHDCE/ml, preferentemente de aproximadamente 1 x 10^{9} a 3 x 10^{9} MHDCE/ml. Se pueden administrar aproximadamente uno a cinco ml, preferentemente 2 ml, por animal, intramuscularmente, subcutáneamente, o intraperitonealmente. Se pueden administrar de uno a diez ml, preferentemente de 2 a 5 ml, oral o intranasalmente.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar adicionalmente la invención, sin limitar su alcance.

Ejemplo 1

Preparación de la bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae de la composición de vacuna

Descripción de los lotes víricos. La Mycoplasma hyopneumoniae se puede obtener a partir de cierto número de fuentes fácilmente disponibles. En una realización, se puede usar la cepa P-5722-3 de Mycoplasma hyopneumoniae. El cultivo se obtuvo de C. Armstrong, Purdue University, West Lafayette, Indiana. Después de la recepción del cultivo de Mycoplasma hyopneumoniae, se pasó siete veces en caldo de Mycoplasma hyopneumoniae para establecer la Siembra Maestra.

Cultivo celular. La Mycoplasma hyopneumoniae se hizo crecer en un medio que comprende polvo de Bacto PPLO, extracto de levadura, glucosa, hidrocloruro de L-cisteína, ampicilina, acetato de talio, rojo fenol, antiespumante, suero estéril normal de cerdo, y agua, durante periodos que oscilaban desde 18 hasta 144 horas. Para la inactivación, se añadió etilenimina binaria (BEI) directo al cultivo de producción, dentro del recipiente de fermentación. El pH se ajustó a 7,4, y luego se recolectó de acuerdo con procedimientos convencionales, para proporcionar la bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae.

Preparación de la composición de vacuna

Composición de Conservantes y Proporciones Usadas. La bacterina recolectada se conservó mediante adición de timerosal y la sal tetrasódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), a razón de no más de 0,01% y 0,07%, respectivamente. En el medio de crecimiento hay ampicilina U.S.P. en una cantidad de 0,250 gramos/litro. La concentración de la ampicilina residual variará en el producto final, dependiendo del volumen de los fluidos recolectados, no superando la concentración de ampicilina residual en el producto completado la cantidad de 30 pg/ml.

Estandarización del producto. El concentrado de Mycoplasma se cuantifica mediante un ensayo fluorométrico de ADN.

Una mezcla de un aceite metabolizable que comprende uno o más hidrocarburos terpénicos y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno, por ejemplo una mezcla de escualano/Pluronic L121, se prepara disolviendo 10 g de cloruro de sodio, 0,25 g de cloruro de potasio, 2,72 g de fosfato dibásico de sodio, 0,25 g de fostato monobásico de potasio, 20 ml de Pluronic L121 (BASF Corporation), 40 ml de escualano (Kodak), 3,2 ml de Tween 80, en 900 ml de agua purificada, y cantidad suficiente para 1000 ml. Después de mezclar, los ingredientes se pueden someter a autoclave. Después, la mezcla se homogeniza hasta que se forma una emulsión estable. Se puede añadir formalina hasta una concentración final de 0,02%, o se puede añadir timerosal hasta una concentración final de 1:10.000.

Ensamblaje de unidades para obtener una serie. Los concentrados satisfactorios de Mycoplasma hyopneumoniae se combinan asépticamente con los adyuvantes, el conservante y el diluyente, en un recipiente estéril equipado con un agitador, y se mezclan durante un tiempo no menor que 30 minutos.

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Método y técnica para llenar y sellar los recipientes finales. El producto se puede filtrar de forma basta a través de un elemento filtrante estéril de 200 a 500 micrómetros, y se puede rellenar, en las condiciones especificadas en 9 CFR 114.6, en recipientes estériles finales en una habitación diseñada para operaciones de llenado. Los recipientes de vidrio o plástico se cierran con un tapón de caucho, y se sellan con plisado con sellos de aluminio. Cada dosis de 2,0 ml contendrá no menos de 2 x 10^{9} equivalentes celulares de ADN de Mycoplasma hyopneumoniae.

Ensayo para determinar la potencia. La potencia de muestras a granel o del recipiente final, del producto terminado, se puede ensayar según lo siguiente:

Método de Ensayo para Determinar la Potencia: Se usaron ratones hembra ICR, de seis a siete semanas, de un solo pedido, de Harlan Sprage Dawley u otros proveedores aceptables. Se requiere un mínimo de 20 ratones para la inmunización con cada bacterina Desconocida y de Referencia. Se conservan un mínimo de cinco ratones como controles no inoculados. Las bacterinas de prueba y de referencia se mezclan individualmente a conciencia. Se usan jeringas desechables estériles, con agujas de calibre 25 de 5/8 pulgadas (1,59 centímetros), para inocular los ratones subcutáneamente en la región inguinal con 1/10 de una dosis de un animal huésped (0,2 ml). Cada grupo de ratones se alojó como una unidad individual, y se le dejó libre acceso a alimento y agua durante 14 días. Posteriormente, cada ratón se anestesió. El ratón anestesiado se colocó sobre su lomo. Usando una mano, se sostuvo la cabeza hacia abajo y se extendió una pata frontal alejándola del cuerpo. Usando un escalpelo, se realizó una incisión en la piel, de una longitud de aproximadamente 1/2 pulgadas (1,27 centímetros), entre la pata frontal extendida y el tórax, cortando la arteria braquial. Usando una jeringa de 3,0 ml, sin aguja, se recolectó la sangre que se acumuló en la incisión. La sangre se descargó en un tubo de ensayo etiquetado, y se dejó coagular. Los tubos coagulados se centrifugaron a 1.000 x g para separar el suero del coágulo. Los sueros individuales se almacenaron a -20ºC o a una temperatura menor, hasta que se analicen.

Análisis serológico: Se usó un procedimiento de ELISA para medir la respuesta de anticuerpos de los ratones a las bacterinas de Referencia y/o Desconocida. El procedimiento de ELISA se lleva a cabo usando placas de microtitulación de fondo plano desechables Immulon II, de Dynatech o equivalente, y un lector de placas de ELISA.

Reactivos de ensayo Disolución salina tamponada con fosfato-Tween (PBST) (pH ajustado hasta 7,2 a 7,4 con NaOH 5N o HCl 5N)

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Disolución salina tamponada con glicina (GBS) (pH ajustado hasta 9,5 a 9,7 con NaOH 5N o HCl 5N)

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Suero de Control Positivo: El Suero de Control Positivo es un conjunto de sueros de ratones vacunados con bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae.

Conjugado y Substrato

El conjugado marcado con peroxidasa de anti-IgG de ratón, purificado por afinidad, se obtuvo de Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc. (nº de catálogo 074-1802). El procedimiento para determinar la dilución óptima del conjugado se detalla a continuación. Las disoluciones de substrato de peroxidasa (ABTS) se obtuvieron de Kirkegaard and Perry, Inc.

Titulación del Conjugado: Se revistió una placa de fondo plano Immulon II con 100 \mul por pocillo de antígeno de célula completa de Mycoplasma hyopneumoniae de concentración de 20 \mug por ml, diluido en 10 mM de GBS. La placa se incubó durante no menos de una hora a 37ºC \pm 2ºC, y se transfirió a 2-7ºC durante no menos de 18 horas y no más de una semana. Antes de usar la placa, ésta se lavó tres veces con PBST, con un tiempo de empapamiento de un minuto entre cada lavado, y se le dio golpecitos hasta que se secó. Se preparó una dilución 1:40 en PBST del Suero de Control Positivo, y el Suero Positivo diluido (100 \mul/pocillo) se añadió a la mitad de los pocillos en la placa. Se añadió PBST a la otra mitad de los pocillos. La placa se incubó durante una hora a temperatura ambiente, después de lo cual la placa se lavó tres veces. El Suero Conjugado se diluyó en serie con PBST, dos veces, empezando con una dilución de 1:100 y terminando con una dilución de 1:10.240. Se añadieron 100 \mul de cada dilución de conjugado a cuatro pocillos del Suero Positivo y a cuatro pocillos del PBST, y se dejó reaccionar durante media hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces, y se añadieron 100 \mul de la disolución de Substrato de Peroxidasa (abts) por pocillo. La placa se leyó a un ajuste de longitud de onda dual de T \lambda = 450. Se selecciona una dilución de Conjugado que proporciona una lectura de 0,850 a 1,050 para el Suero de Control Positivo cuando el valor del Control de PBST se resta del valor del Suero de Control Positivo.

Antígeno de ensayo

El antígeno de Mycoplasma hyopneumoniae es una preparación de célula completa, y es suministrado por Fort Dodge Animal Health.

El ELISA se lleva a cabo según lo siguiente: Se usan placas de microtitulación de fondo plano Immulon II de Dynatech. Un vial de antígeno de células completas de Mycoplasma hyopneumoniae liofilizadas se reconstituye hasta diez ml con Disolución Salina Tamponada con Glicina (GBS). La concentración de la proteína de Mycoplasma reconstituida es de 20 \mug/ml. Entonces se añaden a todos los pocillos de una placa 100 \mul (2 \mug) de antígeno diluido. La placa se incuba a 37ºC \pm 2ºC durante no menos de una hora, y luego se transfiere a una temperatura de 2-7ºC durante un mínimo de 18 horas y un máximo de una semana. Las placas se lavan tres veces con PBST, empapando un minuto entre cada lavado, y luego se secan dándoles golpecitos. Los sueros se diluyeron 1:40 en PBST. El Suero de Control Positivo se incluirá por cuadruplicado en cada placa. El volumen de la muestra por pocillo es de 100 \mul. Las Muestra de Suero de Ensayo y las Muestra de Suero de Referencia, en serie, se ensayarán por duplicado en la misma placa. Las placas se incuban durante una hora a temperatura ambiente, y se lavan tres veces con PBST. Se añaden a todos los pocillos 100 \mul de conjugado marcado con peroxidasa de anti-IgG de ratón (Kirkegaard and Perry), diluidos en PBST, y los pocillos se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavan cuatro veces con PBST. Se añaden a todos los pocillos 100 \mul de una disolución de Substrato de Peroxidasa (ABTS), y las placas se incuban hasta que el Control de Suero Positivo alcanza una OD_{405} (450) de 0,850 hasta 1,050 cuando la máquina se referencia contra los pocillos de control con PBST. Las placas se leen y se referencian contra los pocillos con PBST. Para que sea una prueba válida, los sueros de los ratones inoculados con la Bacterina de Referencia deben producir un valor medio mínimo de 0,500, y los sueros de los ratones de control no vacunados no deben exceder el valor medio máximo de 0,100; o la diferencia entre el valor medio de los sueros de ratones inoculados con la Bacterina de Referencia y los sueros de los ratones de control no vacunados debe ser mayor o igual a 0,400.

Los Valores Medios para los animales vacunados en Serie, los animales vacunados de Referencia y los Controles se calculan y evalúan según lo siguiente: Para que sea satisfactoria, la Bacterina de Ensayo debe demostrar un Valor promedio de Densidad Óptica Media igual o mayor que la Referencia. O, usando una prueba de la t de Student de una cola, la Bacterina de Ensayo no debe ser significativamente (Nivel de Confianza p\leq 0,05) menor que la Bacterina de Referencia. Cualquier Valor T calculado igual o mayor que 1,686 indicará una diferencia significativa entre la Bacterina de Referencia y la Bacterina de Ensayo, y provocará que se rechace la Bacterina de Ensayo. Cualquier Valor T calculado menor que 1,686 indicará una serie satisfactoria. Cualquier bacterina de ensayo, determinada mediante el Ensayo como no satisfactoria por alguna razón no relacionada con la eficacia del producto, se vuelve a analizar, y el ensayo inicial se considera inválido.

Ejemplo 2

Vacuna de ensayo

La vacuna para análisis se preparó de acuerdo con los procedimientos detallados en el Ejemplo 1, usando 5% de una mezcla de un aceite metabolizable que comprende uno o más hidrocarburos terpénicos y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno (mezcla de escualano/Pluronic L121) y 0,2% de polímero de ácido acrílico (Carbopol) como adyuvante, y 2 x 10^{9} equivalentes celulares de ADN de M. hyopneumoniae (MHDCE) por dosis.

Ejemplo 3

Este estudio se diseñó para demostrar la duración de cuatro meses de la inmunidad (DOI) en cerdos, inducida por una vacunación de una dosis, de la vacuna del Ejemplo 2, a una edad de tres semanas.

Para este estudio se llevaron a cabo dos pruebas en animales separadas. Todos los cerdos en ambas pruebas eran seronegativos (título de anticuerpo <10) en el momento de la vacunación, indicando que los animales eran susceptibles a la Mycoplasma hyopneumoniae. Todos los cerdos en los grupos de control permanecieron sero-negativos antes de la exposición. Esto indica que la respuesta inmunitaria en los cerdos vacunados se debió a la vacuna y no ninguna exposición ambiental.

En la primer prueba, se evaluó una vacuna del Ejemplo 2 junto con un producto comercialmente disponible, Ingelvac M. hyo® fabricado por Boehringer Ingelheim (BI), mediante un alto nivel de exposición a M. hyopneumoniae virulenta (0,4 x 10^{6} organismos). Se vacunaron veintidós (22) cerdos de 18 a 21 días con la vacuna del Ejemplo 2 intramuscularmente (IM), y ocho (8) cerdos con el Ingelvac M. hyo® [serie 271 032]. Veintidós (22) cerdos sirvieron como controles de la exposición, y 10 cerdos como controles de la ausencia de exposición. Los cerdos en los grupos de control vacunados y de la exposición se expusieron a M. hyopneumoniae virulenta, a los cuatro meses después de la vacunación. Los cerdos vacunados con la vacuna del Ejemplo 2 tuvieron lesiones pulmonares promedio de 15,9%, y los cerdos de control de la exposición tuvieron lesiones pulmonares promedio de 19,6%. Las lesiones pulmonares promedio en el grupo vacunado con la vacuna del Ejemplo 2 fueron menores que los controles, aun cuando los cerdos habían sido expuestos a una mayor dosis que la recomendada por la Universidad del Estado de Iowa (ISU); sin embargo, la diferencia no fue significativa (p=0,19). De igual manera, cuando el producto comercial Ingelvac M. hyo® se evaluó en el mismo grupo de animales, con la misma dosis de exposición, se observó también un nivel similar de lesiones pulmonares (14,6%). Tampoco hubo diferencia significativa entre el grupo vacunado con Ingelvac M. hyo® y el grupo de control (p=0,27) y entre el grupo vacunado con Ingelvac M. hyo® y el grupo vacunado con la vacuna del Ejemplo 2.

En la segunda prueba, se evaluó una vacuna del Ejemplo 2 mediante exposición a M. hyopneumoniae virulenta, al nivel sugerido por la ISU (1,0 x 10^{6} organismos) a los cuatro meses después de la vacunación. Se vacunaron veintitrés (23) cerdos con una dosis de la vacuna, a la edad de 21 días; 25 cerdos sirvieron como controles de la exposición, y 7 cerdos como controles de la ausencia de exposición. Los cerdos en los grupos de control vacunados y de exposición se expusieron a M. hyopneumoniae virulenta a los cuatro meses después de la vacunación. El grupo de control tuvo lesiones pulmonares promedio de 10,4%, y el grupo vacunado tuvo lesiones pulmonares promedio de 5,5%. Hubo una diferencia significativa entre el grupo vacunado y el grupo de control (p=0,031). Esto indica que la vacuna del Ejemplo 2 es eficaz estimulando la inmunidad protectora, la cual puede durar por lo menos cuatro meses después de una vacunación de una sola dosis en cerdos de tres semanas.

Cuando se combinaron y analizaron los datos relacionados con la vacuna del Ejemplo 2, en las dos pruebas, las lesiones pulmonares promedio del grupo vacunado fueron significativamente menores que las del grupo de control.

En conclusión, la vacuna del Ejemplo 2 induce inmunidad protectora contra la exposición a M. hyopneumoniae virulenta, a los cuatro meses después de una vacunación de una dosis, en cerdos de tres semanas.

Datos experimentales

En este estudio se llevaron a cabo dos ensayos separados. En el ensayo 1, se asignaron sesenta y siete (67) cerdos a cuatro grupos, usando el programa de distribución al azar de Microsoft Excel. Se vacunaron intramuscularmente (IM) veinticuatro (24) cerdos de 18 a 21 días con una dosis de una vacuna preparada de acuerdo con el Ejemplo 2. Veinticuatro (24) cerdos sirvieron como controles de la exposición, y 10 cerdos como controles de ausencia de exposición. Se vacunaron IM nueve cerdos con el producto comercial Ingelvac M. hyo® [serie 271 032, fabricado por Boehringer Ingelheim (BI)], según la instrucción de la etiqueta. Cinco cerdos (dos cerdos vacunados con la vacuna del Ejemplo 2, uno con la vacuna de BI, y dos controles) murieron durante el periodo de cuarentena de la vacunación, debido a razones no relacionadas con la vacunación. Los cerdos restantes en los grupos vacunados y en el grupo de control de la exposición se expusieron a 14 ml de M. hyopneumoniae virulenta (1,4 x 10^{6} organismos) a los cuatro meses después de la vacunación. Los cerdos en los cuatro grupos se sacrificaron mediante eutanasia 30 días después de la exposición, y se dio una puntuación a las lesiones pulmonares para cada cerdo en la prueba.

En una segunda prueba, se vacunaron IM veinticinco (25) cerdos de 21 días con una dosis de una vacuna preparada de acuerdo con el Ejemplo 2. Veinticinco (25) cerdos sirvieron como controles de la exposición, y 10 cerdos como controles de ausencia de exposición. Dos cerdos murieron debido a razones no relacionadas con la vacunación, y un cerdo se vendió por error durante el periodo de cuarentena de la vacunación. Los cerdos restantes en los grupos vacunados y de control de la exposición se expusieron a 10 ml de M. hyopneumoniae virulenta (1,0 x 10^{6} organismos) a los cuatro meses después de la vacunación. Dos cerdos murieron durante el periodo de observación posterior a la exposición, debido a razones no relacionadas con la vacunación/exposición. Los cerdos restantes en los tres grupos se sacrificaron mediante eutanasia 30 días después de la exposición, y se dio una puntuación a las lesiones pulmonares para cada cerdo en la prueba.

Vacunación

A cada cerdo en los grupos de vacunación se les dio, intramuscularmente, una dosis de 2 ml de las vacunas de prueba en el costado del cuello.

Exposición y Necropsia

El lote de la exposición a M. hyopneumoniae virulenta, un homogenado de pulmón congelado (-70ºC), se preparó por Dr. Eileen Thacker de la Universidad del Estado de Iowa (ISU). Se confirmó que el lote de la exposición era puro y contenía aproximadamente 10^{7} organismos de M. hyopneumoniae por ml. La dosis de exposición recomendada es de 10 ml de un lote diluido en proporción 1:100 (es decir, 1,0 x 10^{6} organismos).

Los cerdos en los grupos vacunado y de control de la exposición, en la primera prueba, se expusieron a 14 ml de lote diluido en proporción 1:100 (es decir, 1,4 x 10^{6} organismos). Los cerdos en la segunda prueba se expusieron a 10 ml de lote diluido en proporción 1:100 (es decir, 1,0 x 10^{6} organismos), según lo recomendado.

El día de la exposición, el homogenado se descongeló rápidamente en agua tibia y se diluyó de acuerdo con las recomendaciones de la ISU usando medio de crecimiento estéril de M. hyopneumoniae. Los cerdos se sedaron con una mezcla de Xylazine-Ketamine-Telazol^{TM} que consiste en 50 mg/ml de xilazina, 50 mg/ml de ketamina y 100 mg/ml de Telazol. La mezcla anestésica se administró intramuscularmente a razón de 0,022-0,044 ml/kilogramo de peso corporal (0,01-0,02 ml/libra de peso corporal). A cada cerdo se le administró una sola dosis de 14 ml (primera prueba) o de 10 ml (segunda prueba) del material de exposición, intratraquealmente. Para asegurar que la colocación de la aguja era correcta, se extrajo aire hacia la jeringa antes de la administración de la dosis de exposición. Los cerdos de control no sometidos a exposición, no vacunados, se mantuvieron en habitaciones separadas, y no se sometieron a la exposición.

A los 30 días después de la exposición (DPC), todos los cerdos se sacrificaron mediante eutanasia. Se extrajeron los pulmones, y las lesiones grandes de los pulmones recibieron una puntuación por una persona que no tenía conocimientos de los grupos de ensayo.

Recogida y análisis de muestras

Se recogieron muestras de sangre de todos los cerdos el día de la vacunación (0 DPV), un mes después de la vacunación (1 MPV), 4 MPV/0 DPC, y 30 DPC en busca de anticuerpos del suero contra M. hyopneumoniae, detectado por un kit de ELISA competitivo (fabricado por DAKO Co.). Las muestras de suero se almacenaron a -20ºC antes de ser analizadas.

Análisis de datos

Las puntaciones de las lesiones pulmonares se compararon entre grupos vacunados y no vacunados, mediante análisis de variancia (ANOVA). A las puntaciones de los pulmones se les realizó la transformación de arcoseno para mejorar la distribución de los residuales.

Resultados y discusión

Serología: Todos los cerdos en ambas pruebas se analizaron en busca de anticuerpos del suero contra la M. hyopneumoniae mediante un kit comercial de ELISA competitivo, usando una dilución del suero de 1:10 para todos los ensayos. Todos los cerdos fueron seronegativos (título de anticuerpos menor que 10) en el momento de la vacunación, indicando que los animales eran susceptibles a M. hyopneumoniae. Todos los cerdos en los grupos de control permanecieron seronegativos antes de la exposición. Esto indica que la respuesta inmunitaria en los cerdos vacunados se debió a la vacuna y no a ninguna exposición ambiental. Todos los cerdos en los grupos vacunados, y la mayor parte de los cerdos en los grupos de control de la exposición (de 18 de 22 cerdos en la prueba uno, y 15 de 25 en la prueba 2), sufrieron la conversión serológica a M. hyopneumoniae después de la exposición, mientras que todos los animales no expuestos siguieron siendo seronegativos. Esto implica que la exposición fue específica para M. hyopneumoniae. El estado serológico de los animales de ensayo se resume en la Tabla 1.

Análisis de la inmunogenicidad en la primera prueba

La primera prueba se llevó a cabo para determinar si la vacuna del Ejemplo 2 podría estimular fuerte inmunidad que pudiese proteger contra un mayor nivel de exposición que el recomendado por la ISU a los cuatro meses después de la vacunación. Esta prueba comparó también una vacuna del Ejemplo 2 con la disponible comercialmente, Ingelvac M. hyo®, con respecto a su capacidad para estimular inmunidad protectora a los cuatro meses después de la vacunación.

Veintidós cerdos vacunados con FDAH Suvaxyn MH-One y ocho cerdos con un producto de patente, Ingelvac M. hyo® serie 271.032, se expusieron a 1,4 x 10^{6} organismos por cerdo, del material de exposición (1,0 x 10^{6} organismos por cerdo fue lo recomendado por la ISU, ver la Sección 5.5). Veintidós cerdos sirvieron como controles de la exposición, y 10 cerdos como controles de la ausencia de exposición. Los porcentajes de lesiones pulmonares se resumen en la Tabla 2. Los cerdos vacunados con la vacuna del Ejemplo 2 tuvieron lesiones pulmonares medias de 15,9%, y los cerdos de control expuestos tuvieron lesiones pulmonares medias de 19,6%. Las lesiones pulmonares en el grupo vacunado con la vacuna del Ejemplo 2 fueron menores que las del control, incluso cuando los cerdos se expusieron con una dosis mayor de M. hyopneumoniae. Sin embargo, la diferencia no fue significativa (p=0,19). De igual manera, cuando se evaluó un producto comercialmente disponible, el Ingelvac M. hyo®, en el mismo grupo de animales, con la misma dosis de exposición, se obtuvo también un nivel similar de lesiones pulmonares (14,6%). No hubo diferencia significativa entre el grupo vacunado con Ingelvac M. hyo® y el grupo de control (p=0,27) y entre el grupo vacunado con Ingelvac M. hyo® y el grupo vacunado con la vacuna del Ejemplo 2 (p=0,88).

Aunque en el grupo que recibió la vacuna del Ejemplo 2 se registró una reducción numérica no significativa de las lesiones, los datos obtenidos en esta prueba sugieren que la mayor dosis de exposición (1,4 x 10^{6} organismos) usada en esta prueba fue probablemente abrumadora, incluso para la inmunidad de los cerdos estimulada por el producto comercial Ingelvac. Este nivel de exposición probablemente no es apropiado para la evaluación del estudio de vacunación/exposición, usando tamaños de grupo de 20-25 animales, aunque con tamaños de grupos mayores es posible que se mejore la significancia.

Análisis de inmunogenicidad en la segunda prueba

Los cerdos en los grupos vacunados y de control expuesto, en la prueba 2, fueron evaluados con la dosis de exposición (1,0 x 10^{6} organismos) tal como lo recomienda la ISU, a los cuatro meses después de la vacunación, para demostrar la DOI a los cuatro meses. Los porcentajes de lesión pulmonar se resume en la Tabla 3. El grupo de control tuvo una lesión pulmonar media de 10,4%. El grupo vacunado tuvo una lesión pulmonar media de 5,5%. Hay una diferencia significativa entre los grupos vacunado y de control (p=0,031). Esto indica que la vacuna del Ejemplo 2 es eficaz estimulando la inmunidad protectora, que puede durar por lo menos cuatro meses después de una vacunación con una sola dosis en cerdos de tres semanas.

Evaluación de los resultados combinados de ambas pruebas

Aunque las dos pruebas fueron significativamente diferentes, el efecto de la prueba en el grupo no fue significativo. La magnitud del efecto de grupo fue similar entre las dos pruebas. De este modo, el efecto del grupo se pudo evaluar sin considerar la prueba. Dado que el análisis del modelo completo mostró que la interacción entre el grupo y la prueba no fue significativa, esto respalda la noción de que el efecto de grupo fue el mismo en ambas pruebas, y justifica la combinación de datos de las dos pruebas en un solo análisis. Como tal, cuando se combinaron los datos relacionados con la vacuna del Ejemplo 2 procedentes de la dos pruebas, y cuando la variable transformada mediante arcoseno para la lesión pulmonar se analizó con el grupo y la prueba como variables independientes (modelo reducido), el grupo es estadísticamente significativo (p=0,013).

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TABLA 1 Resumen del estado serológico frente a M. hyopneumoniae en cerdos de control y vacunados

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TABLA 2 Resumen de porcentajes de lesión pulmonar en la prueba uno (sobredosis)*

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TABLA 3 Resumen de los porcentajes de lesión pulmonar en la prueba dos (dosis recomendada)

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Ejemplo 4

Evaluación de la inmunidad a largo plazo inducida por una composición de vacuna de la invención contra una exposición virulenta de seis meses después de la administración de una sola dosis

Usando esencialmente los mismos procedimientos descritos en los Ejemplos 1 y 2, y empleando las cantidades mostradas abajo, se preparó la vacuna de prueba A.

Vacuna de prueba A

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El pH de la serie se ajustó hasta 7,0 \pm 0,2.

MHDCE - equivalentes celulares de ADN de Mycoplasma hyopneumoniae

Sumario

En esta evaluación participaron treinta y tres cerdos de 21 días. Se vacunaron veinte cerdos con una dosis de vacuna A intramuscularmente (IM) a la edad de tres semanas. Diez cerdos sirvieron como controles no vacunados, y tres cerdos como controles ambientales sin exposición.

Todos los cerdos fueron seronegativos (título de anticuerpos < 10) en el momento de la vacunación, indicando que los animales eran susceptibles a M. hyopneumoniae. Todos los cerdos en los grupos de control permanecieron seronegativos antes de la exposición. Esto indica que la respuesta inmunitaria en los cerdos vacunados se debió a la vacuna y no a ninguna exposición ambiental.

Seis meses después de la vacunación, 20 cerdos vacunados y 10 cerdos de control no vacunados se expusieron a M. hyopneumoniae virulenta (1,0 x 10^{6} organismos por cerdo). Tres cerdos sirvieron como controles sin exposición. Los cerdos vacunados tuvieron una puntuación media de lesión pulmonar de 3,6%, y los cerdos de control expuestos tuvieron una puntuación media de lesión pulmonar de 14,6%. Las lesiones pulmonares en el grupo vacunado fueron significativamente menores que las de los controles (p=0,0215).

Los datos obtenidos en esta evaluación demuestran que la vacuna de prueba A indujo inmunidad protectora a la largo plazo contra el desafío con M. hyopneumoniae virulenta, seis meses después de una vacunación con una sola dosis.

Diseño Experimental

Treinta y tres cerdos de 21 días se asignaron aleatoriamente a tres grupos (grupo vacunado, grupo de control de la exposición y grupo de control ambiental sin exposición), usando el programa de aleatorización de Microsoft Excel por camada. Se vacunaron veinte cerdos con una dosis de la vacuna de prueba A intramuscularmente, a la edad de tres semanas. Diez cerdos sirvieron como controles de la exposición, y tres cerdos como controles ambientales sin exposición. Los cerdos en el grupo vacunado y los controles de la exposición se expusieron a 10 ml de un cultivo de M. hyopneumoniae virulenta (1,0 x 10^{6} organismos) por cerdo a los seis meses después de la vacunación. Se usaron tres cerdos no vacunados como controles de la ausencia de exposición. Los cerdos expuestos y los controles de la ausencia de exposición se sacrificaron por eutanasia 26 días después de la exposición, y se dio una puntación a las lesiones pulmonares para cada cerdo.

Cada cerdo en los grupos de vacunación recibió una dosis de 2 ml de la vacuna de prueba, intramuscularmente, en el costado del cuello.

Exposición y necropsia

El medio concentrado de exposición de M. hyopneumoniae virulenta, un homogenado de pulmón congelado (\leq -70ºC), se preparó por Dr. Eileen Thacker de la Universidad del Estado de Iowa (ISU). Se confirmó que el medio concentrado de exposición era puro y contenía aproximadamente 10^{7} organismos de M. hyopneumoniae por ml.

Los cerdos se expusieron a 10 ml de una dilución 1:100 del medio concentrado (es decir, aproximadamente 1,0 x 10^{6} organismos).

En el día de la exposición, el homogenado se descongeló rápidamente en agua tibia, y se diluyó de acuerdo con las recomendaciones de la ISU, usando medio de crecimiento de M. hyopneumoniae estéril. Los cerdos se sedaron con una mezcla de xilazina-quetamina-Telazol^{TM} que consistía en 50 mg/ml de xilazina, 50 mg/ml de quetamina, y 100 mg/ml de Telazol. La mezcla anestésica se administró IM a razón de 0,01-0,02 ml/libra de peso corporal. A cada cerdo se le administró una sola dosis de 10 ml del material de exposición (1,0 x 10^{6} organismos), intratraquealmente. Para asegurar que la colocación de la aguja era correcta, se extrajo aire hacia la jeringa antes de la administración de la dosis de exposición. Los cerdos de control no vacunados, no expuestos, se mantuvieron en habitaciones separadas, y no se expusieron.

A los 26 días después de la exposición (DPC), todos los cerdos fueron sacrificados por eutanasia. Los pulmones se extrajeron, y las lesiones pulmonares grandes recibieron una puntuación tal como se describió en el Ejemplo 3.

Recogida y análisis de muestras

Se recogieron muestras de sangre de todos los cerdos el día de la vacunación (0 DPV), a 35 DPV, - 1 DPC y 26 DPC, para la determinación de anticuerpos del suero frente a M. hyopneumoniae, según se detectan mediante un kit de ELISA competitivo (fabricado por DAKO Co.) Las muestras de suero se almacenaron a \leq -20ºC antes de ser analizadas.

Análisis de datos

Las puntuaciones de lesiones pulmonares se compararon entre los animales vacunados y los controles, mediante ANOVA unilateral. Las puntuaciones de las lesiones pulmonares se transformaron por arcoseno, para mejorar la distribución de los residuales. Dado que la suposición de normalidad para las puntuaciones de lesiones pulmonares fue cuestionable, tanto las puntuaciones de lesiones pulmonares como las puntuaciones de lesiones pulmonares transformadas por arcoseno se analizaron mediante la prueba de la Suma de Rangos de Wilcoxon. El nivel de significancia se ajustó a p<0,05. Los resultados de la prueba de la Suma de Rangos de Wilcoxon, no paramétrica, se usaron con fines informativos.

Resultados y discusión Serología

Todos los cerdos se analizaron para determinar anticuerpos del suero contra M. hyopneumoniae mediante un kit comercial de ELISA competitivo, usando una dilución del suero de 1:10 para todos los ensayos. Las muestras con resultados de ensayo dudosos según las instrucciones del kit se trataron como positivas en el análisis de datos. Todos los cerdos fueron seronegativos (título de anticuerpos <10) en el momento de la vacunación, indicando que los animales eran susceptibles a M. hyopneumoniae. Todos los cerdos en los grupos de control permanecieron seronegativos antes de la exposición. Después de la vacunación, quince de veinte animales vacunados (15/20) se volvieron seropositivos a M. hyopneumoniae por lo menos una vez (muestras recogidas a 35 DPV y -1 DPC). Esto indica que la respuesta inmunitaria en los cerdos vacunados se debió a la vacuna y no a ninguna exposición ambiental. Todos los cerdos vacunados y cuatro de diez cerdos en el grupo de control de la exposición se volvieron seropositivos a M. hyopneumoniae después de la exposición, mientras que todos los animales expuestos siguieron siendo seronegativos. El estado serológico de los animales de ensayo se resume en la Tabla 4.

Puntuaciones de Lesiones Pulmonares

Veinte cerdos vacunados con la vacuna de prueba A y diez cerdos de control no vacunados se expusieron a M. hyopneumoniae virulenta (1,0 x 10^{6} organismos por cerdo) a los seis meses después de la vacunación. Tres cerdos sirvieron como controles de ausencia de exposición. Ocho de veinte animales vacunados (40%) no desarrollaron lesiones pulmonares después de la exposición, mientras que en el grupo de control solamente uno de 10 cerdos (10%) no tuvo lesión pulmonar. Los porcentajes de lesiones pulmonares se resumen en la Tabla 5. Los cerdos vacunados tuvieron una puntuación media de lesiones pulmonares de 3,6%, y los cerdos de control expuestos tuvieron una puntuación media de lesiones pulmonares de 14,6%. Las lesiones pulmonares en el grupo vacunado fueron significativamente menores que para los controles (p=0,0215).

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TABLA 4 Estado serológico frente a M. hyopneumoniae de los cerdos en el estudio*

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TABLA 5 Resumen de puntaciones de lesiones pulmonares (%) en cerdos expuestos a M. hyopneumoniae y en controles no expuestos

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Como se puede observar a partir de los datos mostrados en la Tablas 4 y 5, la vacuna de prueba A induce inmunidad protectora contra una exposición a M. hyopneumoniae virulenta, durante seis meses después de una administración de una sola dosis en cerdos vacunados a la edad de tres semanas.

Claims

1. Composición de vacuna para inmunizar a un animal contra la infección por Mycoplasma hyopneumoniae, que comprende:

una cantidad inmunizante de bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae;

un sistema adyuvante que se puede obtener mezclando un polímero de ácido acrílico y una mezcla de un aceite metabolizable y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno; y

un vehículo farmacéuticamente aceptable, cuya composición de vacuna, después de una sola administración, produce inmunidad protectora frente a Mycoplasma hyopneumoniae.

2. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que el sistema adyuvante está constituido por un polímero de ácido acrílico y una mezcla de un aceite metabolizable que comprende uno o más hidrocarburos de terpeno y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno en una relación de aproximadamente 1:25 a 1:50 de polímero de ácido acrílico con respecto a la mezcla de aceite metabolizable/copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno.

3. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que el sistema adyuvante está presente en una concentración de aproximadamente 1-25% v/v de la composición de vacuna.

4. Composición de vacuna según la reivindicación 3, en la que el polímero de ácido acrílico está presente en una concentración final de aproximadamente 1% v/v, y la mezcla de hidrocarburos de terpeno/copolímeros de bloques de polioxietileno-polioxipropileno está presente en una concentración final de aproximadamente 5% a 10% v/v.

5. Composición de vacuna según la reivindicación 3, en la que el sistema adyuvante está presente en una concentración de aproximadamente 2% - 15% v/v de la composición de vacuna.

6. Composición de vacuna según la reivindicación 5, en la que el sistema adyuvante está presente en una concentración de aproximadamente 5% - 12% v/v de la composición de vacuna.

7. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que el aceite metabolizable es escualano o escualeno.

8. Composición de vacuna según la reivindicación 6 ó 7, en la que el polímero de ácido acrílico es un carbómero.

9. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además por lo menos una bacterina seleccionada de entre el grupo constituido por la bacteria Haemophilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis y leptospira.

10. Uso de la bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae en combinación con una mezcla adyuvante que comprende un polímero de ácido acrílico y una mezcla de aceite metabolizable y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de una composición de vacuna para proteger a un animal frente a una enfermedad causada por Mycoplasma hyopneumoniae, composición la cual, después de una sola dosis, produce inmunidad protectora frente a la infección por Mycoplasma hyopneumoniae.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que la cantidad inmunizante de la bacterina de Mycoplasma hyopneumoniae es de aproximadamente 1 x 10^{8} a 3 x 10^{11} MHDCE/ml, en el que MHDCE es el número de equivalentes celulares de ADN de Mycoplasma hyopneumoniae.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que la cantidad inmunizante de dicha bacterina es de aproximadamente 1 x 10^{9} a 3 x 10^{9} MHDCE/ml.

13. Uso según la reivindicación 10, en el que la composición de vacuna es para la administración intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, en aerosol, oral o intranasal.

14. Uso según la reivindicación 10, en el que el sistema adyuvante consiste en un polímero de ácido acrílico y una mezcla de aceite metabolizable que comprende uno o más hidrocarburos de terpeno y un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno, presente en una concentración final de aproximadamente 1 - 25% v/v.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que el polímero de ácido acrílico de la mezcla adyuvante es un carbómero.

16. Uso según la reivindicación 14, en el que el aceite metabolizable del sistema adyuvante es un hidrocarburo de terpeno seleccionado de entre el grupo del escualeno y escualano.

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17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en el que además la composición de vacuna comprende por lo menos una bacterina adicional seleccionada de entre el grupo constituido por la bacteria Haemophilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis y leptospira.

18. Vacuna según la reivindicación 1, en la que el polímero de ácido acrílico está presente en forma de una emulsión de aceite en agua.