ES2283573T3 - Procedimiento de deteccion de autoanticuerpos especificos de la poliartritis reumatoide. - Google Patents
Procedimiento de deteccion de autoanticuerpos especificos de la poliartritis reumatoide. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de detección de autoanticuerpos (AAF) específicos de la poliartritis reumatoide (PR), en una muestra biológica susceptible de contener dichos autoanticuerpos (AAF) y de otros anticuerpos no específicos de la PR, según el cual se dispone, por una parte, de una filagrina (FNC) o de un derivado de la filagrina (FNC) o de un péptido de la filagrina (PFNC), comprendiendo dicho péptido después de la citrulinación, un epítopo de la filagrina, y por otra parte, de dicha filagrina citrulinada (FC) o de un derivado de dicha filagrina citrulinada (FC) o de dicho péptido citrulinado (PFC), consistiendo la citrulinación en la conversión de uno o de los residuos de arginina en citrulina, se pone dicha muestra biológica en contacto con, por un lado, dicha filagrina (FNC) o dicho derivado de dicha filagrina (FNC) o dicho péptido (PFNC), y por otro lado, dicha filagrina citrulinada (FC) o dicho derivado de dicha filagrina citrulinada (FC), o dicho péptido citrulinado (PFC), en unas condicionesapropiadas para la formación de inmunocomplejos con los autoanticuerpos (AAF), se detecta y se cuantifica la formación de inmunocomplejos formados entre los autoanticuerpos (AAF) u otros anticuerpos presentes en la muestra y dicha filagrina (FNC) o dicho derivado de la filagrina (FNC) o dicho péptido (PFNC), por un lado, y dicha filagrina citrulinada (FC) o dicho derivado de dicha filagrina citrulinada (FC) o dicho péptido citrulinado (PFC), por otro lado, siendo expresada esta cuantificación por un valor respectivamente XNC y XC, se resta el valor de XNC al de XC.
Description
Procedimiento de detección de autoanticuerpos
específicos de la poliartritis reumatoide.
La poliartritis reumatoide (PR) es el más
frecuente de los reumatismos inflamatorios crónicos. Se trata de
una enfermedad autoinmune sistémica caracterizada por una
inflamación de las articulaciones que afecta a más de 500.000
personas en Francia y a más de 2 millones de personas en los Estados
Unidos. El suero de los pacientes afectados contiene unos
anticuerpos de los cuales algunos son específicos y pueden
constituir un marcador de la enfermedad que permite su diagnóstico
incluso en un estado precoz.
Unos anticuerpos específicamente presentes en
los enfermos afectados de PR y que reaccionan con un antígeno
epitelial esofágico del ratón se han descrito por primera vez por B.
J. J. Young et al., en Br. Med. J. 2: 97-99
(1979). En esta época éstos fueron denominados "anticuerpos
antiqueratinas" (AKA), pero se ha demostrado que éstos eran, de
hecho unos anticuerpos anti-filagrina (AAF). Sus
antígenos son las formas ácido-neutras de las
filagrinas (Simon et al., J.Clin. Invest., 92, 1387,
(1993)).
La filagrina se genera a partir de la
profilagrina, que es una poliproteína fosforilada de los gránulos
queratohialinos de la epidermis. La profrilagrina tiene un peso
molecular elevado (aproximadamente 400.000 en el hombre), es
soluble en presencia de altas concentraciones de sales o de urea.
Posee un alto contenido de ácidos aminados básicos (arginina e
histidina), así como de glicina, serina y ácido glutámico. Es pobre
en ácidos aminados no polares y no contiene ni metionina, ni
cisteína, ni triptófano. Está altamente fosforilada sobre uno de
los residuos de serina, lo que le confiere un punto isoeléctrico
cercano a la neutralidad.
La profilagrina se escinde en unidades de
filagrina durante un proceso complejo de maduración, que implica
una desfosforilación, seguida de una escisión por unas proteasas a
nivel de los segmentos interdominios. Esta escisión genera en
primer lugar unos fragmentos de un tamaño intermedio, y seguidamente
las moléculas funcionales de filagrina.
Las filagrinas obtenidas de las
desfosforilización y de la escisión de la profilagrina son unas
proteínas básicas cuyo contenido en ácidos aminados es similar al
de las profilagrinas. Participan en la organización de los
filamentos de queratina, y sufren una maduración progresiva durante
la que los residuos arginina, básicos, son convertidos en residuos
citrulina, neutros, bajo la acción de la peptidilarginina deiminasa
(Harding C. R. y Scott I.R., J. Mol. Biol. 170, p.
651-673 (1983)). Esto provoca una reducción de su
afinidad por las queratinas de las que se desprenden; entonces son
totalmente degradadas bajo la acción de diversas proteasas.
Las propiedades de las profilagrinas y de las
filagrinas han sido bien estudiadas en particular en la rata, en el
ratón y en el hombre. El tamaño de la profilagrina varía, según las
especies, entre 300 y 400 kD y el de las filagrinas entre 27 y 64
kD.
El gen que codifica para la profilagrina se
compone de subunidades repetidas de las que cada una codifica para
una molécula de filagrina, separadas por unas porciones que
codifican para los segmentos peptídicos interdominios. Todas las
unidades de repetición que codifican para cada una de las filagrinas
humanas tienen la misma longitud (972 pares de bases en el hombre);
sin embargo, en el hombre, se observan unas variaciones importantes
(10-15%) de secuencia de una subunidad a otra. Si
bien la mayoría son conservadoras, algunas de estas variaciones
inducen unos cambios de ácidos aminados y en ciertos casos unos
cambios de la carga eléctrica de la proteína. Así las filagrinas
humanas forman, independientemente de las modificaciones
postranscripcionales, una población heterogénea de moléculas de un
tamaño similar pero con unas secuencias y unas cargas (pHi igual a
8,3 \pm 1,1) diferentes (Gan et al., Biochem. 29, p.
9432-9440 (1990)).
El polimorfismo observado en el hombre entre las
secuencias de las unidades filagrina en el interior de un mismo gen
de profilagrina no aparece en la rata y en el ratón. Las filagrinas
presentan además una gran variabilidad inter e intra específica a
nivel de su secuencia. Esta variabilidad no afecta sin embargo a sus
propiedades funcionales, ni a su composición global en ácidos
aminados, y a sus propiedades bioquímicas. Asimismo, las
localizaciones tisulares de la profilagrina y de las filagrinas son
idénticas en los diferentes mamíferos estudiados.
Los auto anticuerpos (AAF) están asociados a los
parámetros clínicos y biológicos que definen las formas más activas
y más severas de la enfermedad, y precederían la aparición de los
síntomas clínicos. Su detección resulta por tanto una etapa
esencial en el diagnóstico de la PR.
Según el documento
WO-A-98/08946 a nombre del
solicitante, se ha puesto a punto un procedimiento de detección de
los AAF, en una muestra biológica, basado en el descubrimiento según
el cual la citrulinación de la filagrina era necesaria para la
detección de los AAF presentes en unos sueros de pacientes afectados
de PR, generando esta citrulinación unos epítopos reconocidos por
los AAF. Este procedimiento comprende las siguientes etapas:
se pone en contacto la muestra biológica
analizada con una filagrina recombinante citrulinada o un fragmento
de ésta, en unas condiciones apropiadas para la formación de
inmunocomplejos con los AAF, y
se detectan los inmunocomplejos eventualmente
formados con los AAF.
Los resultados evidencian una alta sensibilidad
del procedimiento, reconociendo una mayoría de los sueros de
pacientes afectados de PR la filagrina recombinante citrulinada.
Sin embargo se ha observado durante las etapas
de diagnóstico de la PR en los pacientes cuyos sueros resultaban
positivos en este procedimiento, que no todos eran casos de PR. En
efecto, este procedimiento lleva a la detección de falsos
positivos, como se ilustrará en los siguientes ejemplos, y por lo
tanto no puede ser utilizado de forma fiable, debido a una
especificidad insuficiente.
Los actuales inventores han puesto a punto ahora
un nuevo test ELISA para el diagnóstico de la PR en unos pacientes,
que posee una gran especificidad conservando a la vez la alta
sensibilidad del procedimiento citado anteriormente.
Según este procedimiento, se detectan unos
autoanticuerpos (AAF) específicos de la poliartritis reumatoide
(PR), en una muestra biológica susceptible de contener dichos
autoanticuerpos (AAF) y otros anticuerpos no específicos de la PR,
como sigue:
se dispone por una parte, de una filagrina (FNC)
o de un derivado de la filagrina (FNC) o de un péptido de la
filagrina (PFNC), comprendiendo dicho péptido después de la
citrulinación, un epítopo de la filagrina, y por otra parte, dicha
filagrina citrulinada (FC) o un derivado de dicha filagrina
citrulinada (FC) o de dicho péptido citrulinado (PFC), consistiendo
la citrulinación en la conversión de uno o de los residuos arginina
en citrulina,
se pone dicha muestra biológica en contacto, por
un lado, con dicha filagrina (FNC) o el mencionado derivado de
dicha filagrina (FNC) o dicho péptido (PFNC), y por otro lado, con
dicha filagrina (FC) o dicho derivado de dicha filagrina (FC), o
dicho péptido (PFC), en unas condiciones apropiadas para la
formación de inmunocomplejos con los anticuerpos (AAF),
se detectan y se cuantifican los inmunocomplejos
formados entre los autoanticuerpos (AAF) o los otros anticuerpos
presentes en la muestra y dicha filagrina (FNC) o dicho derivado de
dicha filagrina (FNC) o dicho péptido (PFNC), por un lado, y dicha
filagrina citrulinada (FC) o dicho derivado de dicha filagrina
citrulinada (FC) o dicho péptido (PFC), por otro lado, siendo
expresada esta cuantificación por un valor respectivamente X_{NC}
y X_{C},
se resta el valor de X_{NC} al de X_{C}.
Para la realización del procedimiento de la
invención, la filagrina (FNC) o el derivado de la filagrina (FNC) o
el péptido (PFNC) es inmovilizado sobre un soporte sólido y la
filagrina (FC) o un derivado de una filagrina (FC) o el péptido
(PFC) es inmovilizado sobre otro soporte sólido. Puede tratarse,
entre otros, de dos pocillos de una placa de microtitulación o de
dos conos del aparato Vidas (marca registrada) comercializado por el
solicitante, pero también de unas tiras o de cualquier otro soporte
apropiado.
Antes de describir con mayor detalle la
invención y de presentar sus variantes preferidas, se definen a
continuación algunos de los términos empleados en la descripción y
las reivindicaciones.
La citrulinación es la reacción de conversión de
un residuo arginina en citrulina por la transformación del grupo
-C(NH)NH_{2} de la arginina en -CONH_{2}. La
reacción se realiza ventajosamente in vitro por la enzima
peptidil arginina deiminasa (PAD). Esta enzima puede ser una PAD de
músculo del conejo; sin embargo está al alcance del experto en la
materia seleccionar otra PAD apropiada. Se puede evidentemente
prever cualquier otro medio de citrulinación, tal como unos
reactivos químicos, unos microorganismos.
Según la invención, cuando se hace referencia a
una filagrina citrulinada, se entiende que una proporción de al
menos 20% de los residuos arginina han sido convertidos en residuos
citrulina, realizándose esta conversión al azar. Preferentemente,
esta proporción es de al menos 30%, y ventajosamente de al menos
50%. Se ha observado que la inmunorreactividad de una filagrina
citrulinada cuya proporción de citrulinación es de aproximadamente
80% es similar a la de una filagrina cuya proporción de
citrulinación es de aproximadamente 50%. En estas condiciones, no
es útil por lo tanto intentar alcanzar unas proporciones muy
elevadas de citrulinación.
Si la citrulinación no se realiza al azar, sino
que regioespecífica, y en particular, si se puede limitar la
reacción de conversión a un residuo arginina que pertenece a un
epítopo de la filagrina después de la citrulinación, la proporción
de citrulinación puede ser más baja que los valores citados
anteriormente, sin que la inmunorreactividad de la filagrina así
citrulinada se vea por ello afectada.
Por derivado de una filagrina (FNC) o derivado
citrulinado correspondiente se entiende: una filagrina quimera que
consiste en una asociación de fragmento(s) de secuencias de
filagrina humana y de rata y/o una asociación de
fragmento(s) de secuencias de filagrina humana y/o de rata y
de péptido(s) consenso.
Para la realización del procedimiento de la
invención, la filagrina es seleccionada preferentemente de entre la
filagrina humana y una filagrina de origen animal. Consiste
ventajosamente en una filagrina recombinante de rata, que tiene la
secuencia SEC ID nº:1.
\newpage
En vez de la filagrina, se puede seleccionar un
péptido de la filagrina (PFNC), cuya secuencia comprende al menos
un residuo arginina, y el péptido citrulinado correspondiente (PFC)
para el que dicho residuo arginina al menos de PFNC habrá sido
convertido en residuo citrulina. Según una variante del
procedimiento de la invención, el péptido comprende un epítopo de
la filagrina después de la citrulinación. Así, se puede seleccionar
un péptido (PFNC) en particular de entre los siguientes
péptidos:
- \sqbullet
- el péptido S47S cuya secuencia está representada en SEC ID nº: 2 correspondiente a los ácidos aminados 71 a 119 de la secuencia de una unidad de filagrina humana y que comprende 6 residuos arginina,
- \sqbullet
- el péptido E12H cuya secuencia está representada en SEC ID nº: 3 tal como se ha determinado por referencia a las secuencias nucleotídicas del gen de la profilagrina humana descritas por Gan S.Q et al. (Biochemistry, 29: 9432-9440, (1990)) y que comprende 1 residuo arginina,
- \sqbullet
- el péptido E12D cuya secuencia está representada en SEC ID nº: 4 tal como se ha determinado por referencia a las secuencias nucleotídicas del gen de la profilagrina humana descritas por Gan S.Q et al. (Biochemistry, 29: 9432-9440, (1990)) y que comprende 3 residuos arginina,
- \sqbullet
- el péptido G22Q cuya secuencia está representada en SEC ID nº: 5 correspondiente a una secuencia consenso de una unidad filagrina de rata que comprende 4 residuos arginina,
- \sqbullet
- el péptido G26E cuya secuencia está representada en SEC ID nº: 6 correspondiente a una secuencia consenso de una unidad filagrina de rata que comprende 10 residuos arginina.
Como se ha mencionado anteriormente, si se
dispone de una filagrina (FNC) para realizar el procedimiento de la
invención, la filagrina citrulinada (FC) utilizada presenta la
secuencia peptídica de la filagrina (FNC) en la que están
citrulinados al menos 20%, preferentemente al menos 30%, y aún mejor
al menos 50% de los residuos arginina de dicha FNC.
Los autoanticuerpos (AAF) son circulantes, y se
puede seleccionar una muestra biológica para analizar según el
procedimiento de la invención entre la sangre, el plasma, el
suero.
Se realiza la detección y la cuantificación de
los inmunocomplejos formados mediante cualquier técnica bien
conocida por el experto en la materia, y en particular mediante la
utilización de una enzima para la detección y de su substrato
colorimétrico o fluorescente para la cuantificación (ejemplos:
fosfatasa alcalina/4-metilumbeliferilfosfato
peroxidasa/ortofenilendiamina).
Como se ilustrará en los ejemplos siguientes, se
pueden así poner en contacto los inmunocomplejos formados con un
conjugado constituido por un anticuerpo marcado dirigido contra las
inmunoglobulinas humanas, en unas condiciones apropiadas para la
formación de inmunocomplejos marcados, y se detectan y se
cuantifican a continuación los inmunocomplejos marcados.
Ventajosamente el conjugado es un anticuerpo antiinmunoglobulina
humana, entero o fragmentado (ejemplos: fragmentos Fab',
Fab'_{2}) marcado con peroxidasa o con fosfatasa alcalina, se
detecta y cuantifica a continuación la formación de inmunocomplejos
marcados por colorimetría o fluorometría, siendo expresada la
cuantificación en valores X_{NC} y X_{C} de densidad óptica o de
fluorescencia.
Una prueba positiva que revela la presencia de
autoanticuerpos (AAF) específicos de la PR, en la muestra analizada,
se caracteriza porque el valor X_{C} es superior al valor de
X_{NC}.
Se ilustrará ahora la invención y sus
características y ventajas se pondrán más claramente de
manifiesto.
Ejemplo
1
Los trabajos de Haydock y Dale, 1986 (J. Biol.
Chem., 261, 12520-12525) y de Rothnagel et
al., 1987 (J. Biol., Chem., 262, 15643-15648)
han mostrado que el gen de la profilagrina de rata estaba compuesto
por 20 \pm 2 unidades repetidas de aproximadamente 1200 pares de
bases (pb) y no disponía de ningún intrón en su región que
codifica, estando compuesta cada unidad de profilagrina por un
dominio filagrina y una secuencia de enlace.
Por otra parte, se ha publicado la secuencia que
codifica para dos unidades de profilagrina incompletas por Haydock
y Dale, 1990 (DNA Cell Biol.,9, 251-261).
A partir de estos datos, se han concebido unos
oligonucleótidos destinados a la amplificación por PCR de la
secuencia que codifica para una unidad profilagrina de rata
completa. Se ha preparado la matriz de ADN genómico de rata a
partir de sangre total de una rata Wistar. Se han obtenido tres
productos de PCR diferentes con tres pares de oligonucleótidos
diferentes. Estos productos de PCR han sido clonados en un vector
pCAPs (PCR cloning kit, Boehringer) y secuenciados. Presentan entre
ellos un grado de homología elevado (de más del 99%) así como una
homología del 95 y del 98% con las dos unidades de profilagrina
incompletas publicadas por Haydock y Dale, 1990.
Estos datos confirman la naturaleza del ADN
obtenido y sugieren que las secuencias disponibles son
representativas de los dominios profilagrina de rata existentes,
esperándose una cierta variabilidad inter e intra individuo.
Una de las secuencias obtenidas ha sido clonada
en un vector de expresión pMR (Cheynet et al., 1993, Prot.
Exp. Purif., 4, 367-372) en fusión con una secuencia
que codifica para 6 histidina en 5'. Se ha utilizado la
construcción identificada bajo la denominación pOL041 para
transformar unas bacterias de E. coli. Ésta codifica para
una proteína de 399 ácidos aminados y de un peso molecular teórico
de 42.210 que presenta la secuencia SEC ID nº:1
Para la puesta en cultivo de una cepa de E.
coli transformada (BL21 o DH5\alpha), se realiza un
aislamiento sobre un medio gelosado con ampicilina 0,1 mg/ml a
partir del banco conservado a -80ºC.
A partir de una colonia aislada, se realiza un
cultivo previo en medio líquido (extracto de levadura, glucosa 2% y
ampicilina 0,1 mg/ml) en Erlens, puestos a +37ºC y bajo agitación
orbital (280 rpm).
Este cultivo previo permite a continuación la
siembra de Erlens de cultivo, de 5 l, conteniendo cada uno 1 l del
mismo medio completado eventualmente con PMSF 0,5 mM en final. Estos
Erlens son cultivados a +37ºC bajo agitación a 280 rpm, hasta la
obtención de una DO a 600 nm de 0,8. A partir de este valor de DO,
el cultivo continúa durante 3 horas.
Se para entonces el cultivo y se centrifuga 25
minutos a 6.000 g. Los culotes bacterianos son entonces recogidos y
conservados a -25ºC.
Se realiza la lisis del culote bacteriano por
acción de la lisozima en presencia de un inhibidor de proteasas en
un tampón NaH_{2}PO_{4} 0,1 M/NaCl 0,6 M/Tween 0,2%/Azida Na 1
mM/Imidazol 6 mM pH 7,3 y por sonicación. Este lisado es entonces
clarificado 30 minutos a 23.700 g y el sobrenadante es
conservado.
Se purifica la filagrina recombinante por
cromatografía por quelación de metales (Níquel) a +4ºC.
Brevemente después del reequilibrado del gel en
tampón de lisis, el sobrenadante de la lisis es inyectado sobre la
columna y seguido de un lavado (y de la señal de detección UV 280
nm), por el tampón NaH_{2}PO_{4} 0,1 M/NaCl 0,6 M/Azida Na 1
mM/Imidazol 6 mM pH 7,3, hasta el retorno de la señal de detección
UV 280 nm a la línea de base.
La filagrina recombinante (rFlg) adsorbida sobre
el gel, es eluida, por el tampón NaH_{2}PO_{4} 0,1 M/NaCl 0,6
M/Azida Na 1 mM/Imidazol 0,5 M pH 7,15.
La fracción obtenida de esta manera es
concentrada sobre membrana de 10 kDa.
Se realiza la última etapa de purificación por
cromatografía de filtración sobre gel sobre un soporte de Superdex
200, en tampón Tris 20 mM/NaCl 0,3 M pH 11. Se inyecta el
concentrado en la columna, siendo recogidas las fracciones por el
seguimiento de la señal UV a 280 nm y 214 nm. Esta etapa permite
aislar y recuperar la filagrina recombinante de interés,
inmunológicamente activa, en el segundo pico de elución (PM\approx
42.000).
Ejemplo
2
Después de la dosificación de las proteínas
totales por el método de Bradford (reactivos Biorad), se realiza la
citrulinación, por acción de la Peptidil Arginina Deiminasa durante
4 horas, a 37ºC, bajo agitación magnética a razón de 4 unidades
enzimáticas/mg de proteínas totales, en presencia de EDTA 0,1 M/DTT
1 M/CaCl_{2} 0,5 M. La proporción de proteínas totales es
entonces dosificada de nuevo sobre la fracción deiminada.
La filagrina citrulinada es purificada por
cromatografía Ni-NTA, y a continuación por
cromatografía por filtración sobre gel.
La proporción de citrulinación detectada es del
53%.
Los siguientes ejemplos 3 y 4 ilustran el
diagnóstico de la PR en un procedimiento de detección de la técnica
anterior y en un procedimiento de detección según la invención, para
permitir su comparación.
El procedimiento de detección de la técnica
anterior consiste en una prueba ELISA, del tipo descrito en el
documento WO-98/08946 a nombre del solicitante, que
emplea filagrina citrulinada, y está basado en la detección de los
inmunocomplejos formados entre los anticuerpos AAF eventualmente
presentes en la muestra y la filagrina citrulinada.
El procedimiento de detección según la invención
es una prueba ELISA que emplea filagrina citrulinada y filagrina no
citrulinada y que se basa en la detección paralela de los
inmunocomplejos formados con la filagrina citrulinada por un lado y
la filagrina no citrulinada por otro, y en la diferencia de valores
entre los dos.
Ejemplo
3
Las pruebas han sido realizadas sobre las
siguientes muestras:
63 sueros testigo afectados de las siguientes
patologías: algodistrofia, gota, hemopatía maligna, enfermedad de
Paget, neuralgia, patología mecánica, periartritis nudosa,
polimiositis, reumatismo lúpico, reumatismo psoriático,
esclerodermia, espondiloartritis anquilosante, espondiloartropatía,
síndrome de Goujerot, síndrome de Sharp, vascularitis.
65 sueros de pacientes afectados de poliartritis
reumatoide diagnosticada clínicamente.
Placa Nunc Maxisorp 468667
Estufa a 35-39ºC
Lavador Axia microwasher U4402
Lector de placas Biotek (marca comercial).
Depósito en los pocillos: 100 \mul por pocillo
de 2,5 \mug/ml de filagrina, durante 2 horas a 37ºC en tampón PBS
pH 7,2
3 lavados con 300 \mul por pocillo de tampón
PBS Tween 0,05% pH 7,2
Pasivación de 1 hora a 37ºC con 250 \mul por
pocillo de tampón PBS BSA 1% pH 7,2
3 lavados con 300 \mul por pocillo de tampón
PBS Tween 0,05% pH 7,2
Incubación durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul
por pocillo de suero diluido al 1/100ª en tampón Tris 10 mM, NaCl
350 mM, TRITON X 100 1%, BSA 1%, suero de conejo 10% pH 7,5
3 lavados con 300 \mul por pocillo de tampón
PBS Tween 0,05% pH 7,2
Incubación de un conjugado
anti-IgG humano diluido en Tampón Tris 10 mM, NaCl
350 mM, Triton X100 1%, BSA 1%, suero de conejo 10% pH 7,6; 100
\mul por pocillo
3 lavados con 300 \mul por pocillo de tampón
PBS Tween 0,05% pH 7,2.
- 100 \mul de ortofenilendiamina (OPD) por
pocillo
- Incubación 10 min a
18-25ºC
- Bloqueo por 100 \mul de H_{2}SO_{4}
- Lectura a 492 nm.
Las muestras son dosificadas en paralelo sobre
una placa revestida de filagrina no citrulinada y sobre otra placa
revestida de filagrina citrulinada.
Las muestras son dosificadas sin duplicar.
Los resultados son expresados en densidad
óptica. Las señales indicadas a una densidad óptica de 3 son iguales
o superiores a 3.
Los resultados están agrupados en las tablas 1 y
2 siguientes.
Con los resultados obtenidos sobre filagrina
citrulinada según el documento
WO-A-98/08946 (tabla 1), las
prestaciones son las siguientes:
| 100% de especificidad | umbral a 1,337 | 34% de sensibilidad (22/65) |
| 98% de especificidad | umbral a 0,937 | 38% de sensibilidad (25/65) |
| 95% de especificidad | umbral a 0,335 | 61,5% de sensibilidad (40/65). |
Con los resultados obtenidos sobre filagrina
citrulinada-filagrina no citrulinada según la
invención (tabla 2), las prestaciones son las siguientes:
| 100% de especificidad | umbral a 0,731 | 38% de sensibilidad (25/65) |
| 98% de especificidad | umbral a 0,009 | 69% de sensibilidad (45/65) |
| 95% de especificidad | umbral a -0,004 | 77% de sensibilidad (50/65). |
En los dos casos, a 95% de especificidad 3
sueros son unos falsos positivos.
Todas las muestras detectadas sobre la fase
filagrina citrulinada son detectadas con el sistema diferencial a
100% y a 98% de especificidad. Un único suero es detectado además
con el sistema diferencial. A 95% de especificidad, 7 muestras son
detectadas además con el sistema diferencial.
El sistema diferencial es más eficaz que la fase
filagrina citrulinada sobre esta población con 69% de sensibilidad
para 98% de especificidad.
Para esta población, las prestaciones de las
pruebas utilizadas habitualmente son las siguientes:
| GIFOR (inmunofluorescencia sobre corte de esófago de ratón) | ||
| 98% de especificidad | umbral a 2 | 49% de sensibilidad (32/65) |
| Gblot | ||
| 98% de especificidad | umbral a 2,25 | 58% de sensibilidad (38/65). |
Las prestaciones obtenidas en ELISA sobre
filagrina de rata son mejores que las técnicas utilizadas
actualmente, GIFOR y GBlot.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este ejemplo permite comparar una prueba de
diagnóstico según la invención, la prueba
ArFa-ELISA, y varias pruebas de diagnóstico de la
técnica anterior disponibles comercialmente o que emplean unos
métodos conocidos, a saber las pruebas AKA por inmunofluorescencia,
AhFA-IB, AhFA-ELISA y
CCP-ELISA.
Las pruebas han sido practicadas sobre 711
sueros de los cuales 240 procedían de pacientes afectados de
poliartritis reumatoide (PR) y 471 procedían de pacientes no PR.
Entre los pacientes no PR, 157 estaban afectados de una enfermedad
inflamatoria seleccionada de entre el lupus eritematoso progresivo
(21), la esclerodermia generalizada (9), el reumatismo psiorásico
(43), la espondiloartritis anquilosante (40) y otras enfermedades
inflamatorias (44), y 314 estaban afectados de una enfermedad no
inflamatoria seleccionada de entre la artrosis (104), la neuropatía
compresiva (25), la enfermedad de Paget (68), la distrofia simpática
refleja (29), las enfermedades graves de los huesos (49), y otras
enfermedades no inflamatorias (39).
La filagrina es una filagrina recombinante de
rata; la filagrina no citrulinada es obtenida de acuerdo con el
ejemplo 1, y la filagrina citrulinada es obtenida por citrulinación
(proporción de citrulinación de los residuos arginina de 40%) de la
filagrina no citrulinada de acuerdo con el ejemplo 2.
Se ha realizado la detección de los anticuerpos
según las pruebas AKA por inmunofluorescencia y
AhFA-IB según los métodos descritos en C. Vincent
et al., Ann. Rheum. Dis. (1989)48,
712-722, y C. Vincent et al., J. Rheumatol.
(1998) 25, 838-846.
Se utiliza la prueba AhFA-ELISA
según el método descrito por L. Nogueira et al., Ann. Rheum.
Dis. (2001) 60, 882-846.
Se realiza la prueba CCP-ELISA
con el material Immunoscan^{TM} RA
(Euro-diagnostica, Arnhem, Países Bajos) utilizado
según las recomendaciones del fabricante.
Se ha empleado la prueba
ArFA-ELISA según la invención de acuerdo con el
protocolo C) descrito en el Ejemplo 3, a excepción del hecho de que
en el ejemplo presente, las muestras han sido dosificadas por
cuadriplicado. La variación media entre los ensayos para una misma
muestra era inferior a 6%.
Los resultados obtenidos para cada una de las
pruebas están presentados en la tabla 3.
Se desprende de esta tabla que la prueba según
la invención es la más fiable de las pruebas examinadas en la
detección de la PR.
<110> bioMérieux
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN DE
AUTOANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE LA POLIARTRITIS REUMATOIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PRdelta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 01 08068
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-06-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 399
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> filagrina recombinante de rata
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> péptido de la filagrina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> péptido de la filagrina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Ser Ala Asp Ser Ser Arg His Ser Gly
Ser Gly His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> péptido de la filagrina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ser Ser Arg Asp Gly Ser Arg His Pro Arg
Ser His Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> péptido de la filagrina de rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gln Ala Gly Gly Arg Gln Gly Ser Arg His
Glu Gln Gly Ser Ser}
\sac{Arg Gly Arg Ser Gly His Glu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> péptido de la filagrina de rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser His Arg Gln Gln Ser Ser Arg Arg Gln
Gly Ser Ser Arg Gly}
\sac{Gln Gln Ser Gly Gly Arg Gln Gly Ser Arg
His Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Procedimiento de detección de autoanticuerpos
(AAF) específicos de la poliartritis reumatoide (PR), en una
muestra biológica susceptible de contener dichos autoanticuerpos
(AAF) y de otros anticuerpos no específicos de la PR, según el
cual
se dispone, por una parte, de una filagrina
(FNC) o de un derivado de la filagrina (FNC) o de un péptido de la
filagrina (PFNC), comprendiendo dicho péptido después de la
citrulinación, un epítopo de la filagrina, y por otra parte, de
dicha filagrina citrulinada (FC) o de un derivado de dicha filagrina
citrulinada (FC) o de dicho péptido citrulinado (PFC), consistiendo
la citrulinación en la conversión de uno o de los residuos de
arginina en citrulina,
se pone dicha muestra biológica en contacto con,
por un lado, dicha filagrina (FNC) o dicho derivado de dicha
filagrina (FNC) o dicho péptido (PFNC), y por otro lado, dicha
filagrina citrulinada (FC) o dicho derivado de dicha filagrina
citrulinada (FC), o dicho péptido citrulinado (PFC), en unas
condiciones apropiadas para la formación de inmunocomplejos con los
autoanticuerpos (AAF),
se detecta y se cuantifica la formación de
inmunocomplejos formados entre los autoanticuerpos (AAF) u otros
anticuerpos presentes en la muestra y dicha filagrina (FNC) o dicho
derivado de la filagrina (FNC) o dicho péptido (PFNC), por un lado,
y dicha filagrina citrulinada (FC) o dicho derivado de dicha
filagrina citrulinada (FC) o dicho péptido citrulinado (PFC), por
otro lado, siendo expresada esta cuantificación por un valor
respectivamente X_{NC} y X_{C},
se resta el valor de X_{NC} al de X_{C}.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la filagrina se selecciona de entre la
filagrina humana y la filagrina de rata.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la filagrina es una filagrina
recombinante de rata y tiene la secuencia SEC ID nº: 1.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el péptido comprende una secuencia
peptídica seleccionada de entre la secuencia SEC ID nº: 2 a SEC ID
nº:6.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la filagrina citrulinada (FC) o el
péptido citrulinado (PFC) es obtenido por acción de la peptidil
arginina deiminasa.
6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y
5, caracterizado porque se dispone de una filagrina (FNC) y
porque al menos 20% de los residuos arginina de la FNC son
citrulinados para obtener dicha filagrina citrulinada (FC).
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque al menos 30%, preferentemente al menos
50% de los residuos arginina de la FNC son citrulinados.
8. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra biológica se selecciona de
entre la sangre, el plasma, el suero.
9. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se ponen en contacto los inmunocomplejos
formados con un conjugado constituido por un anticuerpo marcado
dirigido contra las inmunoglobulinas humanas, en unas condiciones
apropiadas para la formación de inmunocomplejos marcados, y se
detectan y se cuantifican a continuación los inmunocomplejos
marcados.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque el conjugado es un anticuerpo
antiinmunoglobulina humana marcado con fosfatasa alcalina o con
peroxidasa, y se detecta y se cuantifica a continuación la formación
de inmunocomplejos marcados por colorimetría o fluorimetría,
expresándose la cuantificación en valores X_{NC} y X_{C} de
densidad óptica o de fluorescencia.
11. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque si el valor X_{C} es superior al valor
X_{NC}, se han detectado y cuantificado, en dicha muestra, unos
autoanticuerpos (AAF) específicos de la PR.
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2002
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