ES2227711T3 - Antigenos derivados de filagrinas y su utilizacion para el diagnostico de la poliartitis reumatoide. - Google Patents

Antigenos derivados de filagrinas y su utilizacion para el diagnostico de la poliartitis reumatoide.

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ES2227711T3 ES97938965T ES97938965T ES2227711T3 ES 2227711 T3 ES2227711 T3 ES 2227711T3 ES 97938965 T ES97938965 T ES 97938965T ES 97938965 T ES97938965 T ES 97938965T ES 2227711 T3 ES2227711 T3 ES 2227711T3
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Mireille Sebbag
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN ANTIGENO ARTIFICIAL IDENTIFICADO ESPECIFICAMENTE POR AUTO-ANTICUERPOS ANTIFILAGRINA PRESENTES EN EL SUERO DE PACIENTES QUE PADECEN POLIARTRITIS REUMATOIDE, Y CONSTITUIDO POR UN POLIPEPTIDO QUE COMPRENDE TODO O PARTE DE LA SECUENCIA DE UNA UNIDAD DE FILAGRINA O DE UNA MOLECULA EMPARENTADA, EN LA QUE AL MENOS UN RESIDUO DE ARGININA HA SIDO SUSTITUIDO POR UN RESIDUO DE CITRULINA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA UTILIZACION DE ESTE ANTIGENO PARA EL DIAGNOSTICO DE LA POLIARTRITIS REUMATOIDE.

Description

Antígenos derivados de filagrinas y su utilización para el diagnóstico de la poliartritis reumatoide.
La presente invención se refiere a nuevas preparaciones de antígenos reconocidos específicamente por autoanticuerpos específicos de la poliartritis reumatoide.
La poliartritis reumatoide (abreviada a continuación como "PR") es el más frecuente de los reumatismos inflamatorios crónicos. Se trata de una enfermedad autoinmune, y el suero de pacientes afectados contiene autoanticuerpos de los que algunos son específicos y pueden constituir un marcador de esta enfermedad, permitiendo su diagnóstico incluso en estados precoces. Se han efectuado investigaciones con vistas a identificar los antígenos reconocidos por estos anticuerpos, con el fin de obtener preparaciones purificadas utilizables en las técnicas clásicas de diagnóstico inmunológico.
Se han descrito autoanticuerpos presentes específicamente en enfermos aquejados de PR y que reaccionan con un antígeno epitelial esofágico de rata por primera vez por B.J.J. YOUNG et al. en Br. Med. J. 2: 97-99, (1979). Estos autoanticuerpos se han denominado en su momento "anticuerpos antiqueratinas".
Durante trabajos precedentes, el equipo de inventores ha obtenido, a partir de epitelio malpigiano humano y de murina, preparaciones de antígenos emparentados con la filagrina y la profilagrina reconocidos específicamente por los anticuerpos presentes en el suero de pacientes aquejados por poliartritis reumatoide, y han mostrado que los "anticuerpos antiqueratinas" eran de hecho autoanticuerpos anti-filagrina (denominados a continuación "AAF"). La solicitud EP 0511116 describe estas preparaciones antigénicas y su utilización para el diagnóstico de la poliartritis reumatoide.
Las filagrinas son una familia de proteínas que se han identificado en diversas especies, entre otras en el hombre, la rata, el ratón y la cobaya, al nivel de epitelio malpigiano queratinizante [para revisión de las filagrinas, véase DALE et al. [The Keratinocyte Handbook, Cambridge University Press, pág. 323-350, (1994)]. Derivan de la desfosforilación y proteólisis de un precursor, la profilagrina, que está constituida esencialmente por dominios repetidos de filagrina separados por segmentos peptídicos interdominios.
El gen que codifica la profilagrina se compone de subunidades repetidas de las que cada una codifica una molécula de filagrina, separadas por porciones que codifican los segmentos peptídicos interdominios. Todas las unidades de repetición que codifican alguna de las filagrinas humanas tienen la misma longitud (972 pares de bases en el hombre); sin embargo, en el hombre, se observan variaciones importantes (10-15%) de secuencia de una subunidad a otra. Aunque la mayoría son conservativas, ciertas de estas variaciones inducen cambios de aminoácidos y en ciertos casos cambios de la carga eléctrica de la proteína. Así, las filagrinas humanas forman, independientemente de las modificaciones postranscripcionales, una población heterogénea de moléculas de tamaño similar pero de secuencias y de cargas diferentes (pHi igual a 8,3 \pm 1,1) [GAN et al., Biochem. 29, pág. 9432-9440 (1990)].
La profilagrina es una proteína de peso molecular elevado (aproximadamente 400.000 en el hombre) soluble en presencia de altas concentraciones de sales o de urea. Posee un alto contenido de aminoácidos básicos (arginina e histidina), así como de glicina, serina y ácido glutámico. Es pobre en aminoácidos no polares y no contiene ni metionina ni cisteína ni triptófano. Está fuertemente fosforilada en los residuos de serina, lo que la confiere un punto isoeléctrico próximo a la neutralidad.
La profilagrina se escinde en unidades filagrina en el transcurso de un proceso complejo de maduración, que implica una desfosforilación, seguida de una escisión por proteasas al nivel de los segmentos interdominios. Esta escisión genera primero fragmentos de tamaño intermedio, después las moléculas funcionales de filagrina.
Las filagrinas surgidas de la desfosforilación y de la escisión de la profilagrina son proteínas básicas cuyo contenido de aminoácidos es similar al de las profilagrinas. Participan en la organización de los filamentos de queratina y experimentan una maduración progresiva en el transcurso de la cual los residuos de arginina básicos se convierten en residuos de citrulina neutros, bajo la acción de la peptidilarginina desiminasa [HARDING C.R. y SCOTT I.R., J. Mol. Biol. 170, pág. 651-673 (1983)]. Esto supone una reducción de su afinidad por las queratinas de las que se separan; entonces se degradan totalmente bajo la acción de diversas proteasas.
Las propiedades de las filagrinas y las profilagrinas se han estudiado particularmente bien en la rata, en el ratón y en el hombre. El tamaño de la profilagrina varía, según las especies, de 300 a 400 kD, y el de las filagrinas de 27 a 64 kD.
El polimorfismo observado en el hombre entre las secuencias de las unidades de filagrina en el interior de un mismo gen de profilagrina no aparece en la rata ni en el ratón. Las filagrinas presentan además una gran variabilidad inter- e intraespecífica al nivel de su secuencia. Esta variabilidad no afecta sin embargo a sus propiedades funcionales ni a su composición aminoacídica global, ni a sus propiedades bioquímicas. Igualmente, las localizaciones tisulares de la profilagrina y de las filagrinas son idénticas en los diferentes mamíferos estudiados.
Prosiguiendo sus trabajos, los inventores han constatado que la profilagrina presente en los gránulos de queratohialina de la epidermis humana no era reconocida por los AAF, contrariamente a las filagrinas [SIMON et al., Clin. Exp. Immunol. 100, 90-98 (1995)]. Han ensayado entonces la reactividad de los AAF con la filagrina recombinante, y han constatado que ésta no era ya reconocida. Por otro lado, se había observado anteriormente que las formas de las filagrinas epidérmicas humanas reconocidas principalmente por los AAF eran las formas ácidas-neutras descritas por SIMON et al. [J. Clin. Invest. 92, 1387 (1993)] y en la solicitud EP 0511116. El hecho de que estas formas ácidas-neutras correspondan a un estado tardío de la maduración de la filagrina permite suponer que todas o parte de las modificaciones postraduccionales que intervienen hasta este estado estaban implicadas en la formación de los epítopos reconocidos por los AAF.
Para verificar esta hipótesis, los inventores han intentado reproducir in vitro a partir de filagrina recombinante estas modificaciones postraduccionales, con el fin de determinar las que eran susceptibles de influir sobre la antigenicidad de la filagrina.
Se ha constatado así que, de hecho, la citrulinación de la filagrina bastaba para generar epítopos reconocidos por los AAF. Efectivamente, han observado al proceder a la desiminación in vitro de la filagrina recombinante, que el reemplazo de al menos una parte de las argininas por citrulinas permite la obtención de un antígeno reconocido específicamente por los AAF presentes en el suero de pacientes aquejados por PR.
La presente invención tiene como objeto un antígeno artificial reconocido específicamente por los AAF presentes en el suero de pacientes aquejados por PR, caracterizado porque está constituido por un polipéptido recombinante o sintético que comprende toda o parte de una secuencia derivada de la de una unidad de filagrina o de una molécula emparentada, mediante sustitución de al menos un residuo de arginina por un residuo de citrulina. Preferiblemente, un antígeno según la invención comprende al menos 5 aminoácidos consecutivos, y ventajosamente al menos 10 aminoácidos consecutivos, de los que al menos uno es citrulina, de dicha secuencia.
En el sentido de la presente invención, se entiende por "unidad de filagrina" un polipéptido cuya secuencia es la del producto de traducción de una cualquiera de las subunidades que codifican un dominio de filagrina del gen de la profilagrina humana o de otra especie, o bien es una secuencia consenso, secuencia teórica obtenida a partir de las secuencias de dominios de filagrina.
En el sentido de la presente invención, se entiende por "molécula emparentada" cualquier molécula que tenga al menos un residuo de arginina susceptible de transformarse en residuo de citrulina bajo la acción de una PAD (peptidilarginina desiminasa); a modo de ejemplo, esta PAD puede ser una PAD de músculo de conejo, como muestran los ejemplos siguientes. Sin embargo, está al alcance de un experto en la técnica seleccionar cualquier otra PAD apropiada mediante ensayos rutinarios sencillos, haciéndola reaccionar con la filagrina humana no citrulinada.
El término "péptido" tal como se utiliza en la presente solicitud, significa especialmente proteína o fragmento de proteína u oligopéptido extraído, separado o sustancialmente aislado o sintetizado, especialmente aquellos obtenidos mediante síntesis química o mediante expresión en un organismo recombinante; cualquier péptido en cuya secuencia uno o varios aminoácidos de la serie L son reemplazados por un aminoácido de las serie D, y viceversa; cualquier péptido en el que al menos uno de los enlaces CO-NH, y ventajosamente todos los enlaces CO-NH de la cadena peptídica están reemplazados por uno o varios enlaces NH-CO; cualquier péptido en el que al menos uno de los enlaces CO-NH, y ventajosamente todos los enlaces CO-NH están reemplazados por uno o varios enlaces NH-CO, conservándose la quiralidad de cada residuo aminoacídico, esté implicado o no en uno o varios de los enlaces CO-NH anteriormente citados, o invirtiéndose con respecto a los residuos aminoacídicos que constituyen un péptido de referencia, estando también designados estos compuestos como imunoretroides, un mimotopo, etc.
Los antígenos según la invención pueden obtenerse por ejemplo mediante la acción de la PAD sobre proteínas o péptidos naturales, recombinantes o sintéticos que comprenden residuos de arginina; pueden obtenerse igualmente mediante síntesis peptídica, incorporando directamente uno o varios residuos de citrulina al péptido sintetizado.
Según un modo de realización preferido de un antígeno según la presente invención, está constituido por un polipéptido que comprende toda o parte de la secuencia correspondiente a los aminoácidos 144 a 314 de una unidad de filagrina humana, en la que al menos un residuo de arginina se ha sustituido por un residuo de citrulina, o bien toda o parte de la secuencia correspondiente a los aminoácidos 76 a 114 de una unidad de filagrina humana, en la que al menos un residuo de arginina se ha sustituido por un residuo de citrulina.
Un antígeno según la invención puede estar constituido por ejemplo por un péptido que comprende toda o parte de la secuencia correspondiente a los aminoácidos 71 a 119 de una unidad de filagrina humana, en la que al menos un residuo de arginina se ha sustituido por un residuo de citrulina.
Ventajosamente, un antígeno según la invención está constituido por un péptido que comprende toda o parte de al menos una secuencia derivada de una de las secuencias identificadas en la lista de secuencias adjunta con los números SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 6 mediante sustitución de al menos un residuo de arginina por un residuo de citrulina.
La presente invención tiene igualmente como objeto la utilización de antígenos según la invención tales como los definidos anteriormente para el diagnóstico in vivo de la PR.
La presente invención abarca particularmente composiciones antigénicas para el diagnóstico de la presencia de autoanticuerpos específicos de la PR en una muestra biológica, estando caracterizadas las composiciones porque contienen al menos un antígeno según la invención, eventualmente marcado y/o conjugado con una molécula vehículo.
La presente invención tiene igualmente como objeto un procedimiento de detección de autoanticuerpos de clase G específicos de la PR en una muestra biológica, estando caracterizado este procedimiento porque comprende:
-
la puesta en contacto de dicha muestra biológica con al menos un antígeno según la invención, tal como se define anteriormente, en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo con los autoanticuerpos específicos de la PR eventualmente presentes;
-
la detección, mediante cualquier medio apropiado, del complejo antígeno/anticuerpo eventualmente formado.
Este procedimiento de detección puede realizarse gracias a un kit que comprende al menos un antígeno según la invención, así como tampones y reactivos apropiados para la constitución de un medio de reacción que permite la reacción de un complejo antígeno/anticuerpo y/o medios de detección de dicho complejo antígeno/anticuerpo.
Dicho kit puede comprender igualmente, según el caso, muestras de referencia tales como uno o varios sueros negativos y uno o varios sueros positivos.
La presente invención se comprenderá mejor con ayuda del complemento de descripción siguiente, que se refiere a ejemplos de preparación y realización de antígenos según la invención.
Ejemplo 1 Reactividad de los sueros procedentes de pacientes aquejados por poliartritis reumatoide sobre las filagrinas epidérmicas
Se tritura con ayuda de un triturador de tipo "potter" eléctrico un pedazo de epidermis humana en un tampón de alta concentración de urea (8 M), lo que permite disolver el conjunto de filagrinas epidérmicas.
Con este extracto epidérmico, se realiza una electroforesis bidimensional (gel 8-25% de acrilamida, en presencia de urea 6 M), la 1ª dimensión corresponde a una isoelectrofocalización sobre gel a un gradiente de pH que va de 5 a 8, y la segunda dimensión corresponde a una electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS. Después de la electroforesis, las proteínas del gel se transfieren a nitrocelulosa.
Las reacciones inmunológicas se efectúan según un protocolo clásico.
La membrana de nitrocelulosa se incuba durante una noche a 4ºC con un suero de paciente aquejado por PR diluido a 1/2000, después se detectan las inmunoglobulinas del suero que han reaccionado con los antígenos fijados sobre la membrana con ayuda de un anticuerpo secundario anti-IgG humanas marcado con peroxidasa. El revelado en presencia de sustrato de la peroxidasa se efectúa mediante el procedimiento ECL (quimioluminiscencia potenciada, AMERSHAM) según el protocolo preconizado por el fabricante.
En un segundo momento, se lava la misma membrana y después se incuba durante 1 hora y media a 20ºC, en presencia esta vez del anticuerpo monoclonal AHF1 descrito por SIMON et al. [J. Invest. Dermatol. 105, 432 (1995)] a una concentración de 0,2 \mug/ml, y después de un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa. La reacción se revela mediante el procedimiento ECL, como se indica anteriormente.
Los resultados se ilustran mediante la figura 1:
El anticuerpo monoclonal AHF1 reconoce las isoformas de filagrina en las que el pHi se extiende de 5,8 a 8,5. En contraposición, se detectan sólo las isoformas en las que el pHi se extiende de 5,8 a 7,4 por el suero de paciente aquejado por PR.
El hecho de que se detecten sólo las isoformas más ácidas de filagrinas, permite suponer que la acidificación de estas isoformas forma parte de modificaciones postraduccionales que serían necesarias para el reconocimiento de la filagrina por los anticuerpos presentes en los sueros de pacientes aquejados por PR.
Ejemplo 2 Desiminación in vitro de filagrina recombinante por la peptidilarginina desiminasa (PAD)
Se produce filagrina recombinante según el protocolo siguiente:
Se amplifica por PCR un fragmento de ADN que codifica una unidad de filagrina a partir de ADN genómico humano (células RAJI: ATCC CCL86) con ayuda de los 2 cebadores siguientes:
Cebador 5':
\vskip1.000000\baselineskip
5' TTCCTATACCAGGTGAGCACTCAT 3'
Cebador 3':
\vskip1.000000\baselineskip
5' AGACCCTGAACGTCCAGACCGTCCC 3'
Se clona el producto de amplificación en el sitio SmaI del vector pUC19. Se procede a la selección de los clones recombinantes verificando la presencia de un inserto de 972 pb obtenido después de la digestión con Sacl y XbaI. Este inserto se subclona a continuación en pUC19. El inserto resultante de esta subclonación se transfiere a continuación al vector pGEX (comercializado por la compañía PHARMACIA) entre los sitios EcoRI e HindIII. El vector de expresión así obtenido expresa, en E. coli, la filagrina fusionada con la glutation-S-transferasa (GST), bajo el control del promotor procariótico Tac. La síntesis de la proteína recombinante se induce mediante la adición de isopropil-\beta-D-galactosidasa (IPTG) al cultivo.
La filagrina recombinante así obtenida se denominará a continuación: "fil-gst".
Se constata después de la electroforesis la existencia de 9 fragmentos que son el resultado de una proteólisis postraduccional de la filagrina entera. Los emplazamientos de los diferentes cortes que generan estos fragmentos se indican en la Figura 2.
La mezcla de los 9 fragmentos se somete a una desiminación in vitro por la peptidilarginina desiminasa.
Se utiliza una preparación de peptidilarginina desiminasa de músculo de conejo (681 U/ml) comercializada por TAKARA BIOMED EUROPE, según el protocolo preconizado por el fabricante.
Las condiciones operativas son las siguientes:
-
medio de reacción: Tris-HCl 0,1 M, CaCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM, pH 7,4;
-
relación enzima/sustrato: 140 mU/\mumol de filagrina que contiene un 10% de arginina o 4 mU/\mumol de arginina;
-
incubación: entre 0 y 60 min a 50ºC;
-
detención de la reacción: calentamiento durante 3 min en tampón de LAEMLI.
Se efectúan en paralelo las 8 reacciones siguientes:
(1)
BSA (albúmina de suero bovino) incubada en medio de reacción (1 h, 50ºC) sin PAD.
(2)
BSA incubada en medio de reacción (1 h, 50ºC) con 60 mU de PAD.
(3)
fil-gst incubada en medio de reacción (1 h, 50ºC) sin PAD.
(4)
fil-gst incubada en medio de reacción (5 min a 50ºC) con 60 mU de PAD.
(5)
fil-gst incubada en medio de reacción (15 min a 50ºC) con 60 mU de PAD.
(6)
fil-gst incubada en medio de reacción (30 min a 50ºC) con 60 mU de PAD.
(7)
fil-gst incubada en medio de reacción (1 h a 50ºC) con 60 mU de PAD.
(8)
fil-gst incubada en medio de reacción (1 h a 50ºC) con 60 mU de PAD y en presencia de N-etilmaleimida 10 mM (inhibidor de la PAD).
Se deposita 1 \mul de cada muestra en un gel de electroforesis (gel PHAST®-SDS al 12,5%, PHARMACIA) y se realiza la electroforesis con el aparato PHAST-SYSTEM® (PHARMACIA) en las condiciones preconizadas por el fabricante. Después de transferir a nitrocelulosa, se revela con un conjunto de 5 sueros de pacientes aquejados por PR diluidos a 1/2000 (Figura 3a), o bien con el anticuerpo monoclonal anti-filagrina AHF2 [SIMON et al., J, Invest. Dermatol. 105, 432 (1995)] a una concentración de 0,2 \mug/ml (Figura 3b).
Se revela el complejo antígeno/anticuerpo con la ayuda de un anticuerpo secundario acoplado con peroxidasa mediante la técnica ECL.
Los resultados se ilustran por la Figura 3.
Carril 1: BSA (1 hora, 50ºC)
Carril 2: BSA + PAD (1 hora, 50ºC)
Carril 3: fil-gst (1 hora, 50ºC)
Carril 4: fil-gst + PAD (5 minutos, 50ºC)
Carril 5: fil-gst + PAD (15 minutos, 50ºC)
Carril 6: fil-gst + PAD (30 minutos, 50ºC)
Carril 7: fil-gst + PAD (1 hora, 50ºC)
Carril 8: fil-gst + PAD + inhibidor (1 hora, 50ºC).
En ausencia de reacción de citrulinación, la fil-gst no se reconoce por los sueros de pacientes aquejados por PR (Figura 3a, carril 3), mientras que después de 5 minutos de citrulinación (Figura 3a, carril 4), se detecta por estos sueros. Se constata un aumento de la reactividad con el conjunto de sueros cuando se hace agitar la PAD durante 60 minutos a 50ºC (Figura 3a, carril 7).
-
los fragmentos 1, 2, 3 (bandas señaladas por puntos) de fil-gst se reconocen fuertemente, después de la citrulinación, por los sueros de pacientes aquejados por PR. Los fragmentos 4 y 5 (bandas señaladas por asteriscos) se reconocen igualmente. Estos resultados permiten suponer que existe uno o varios epítopos de fuerte afinidad en el resto COOH-terminal de la filagrina (144 a 314), estando repetido este epítopo entre las posiciones 76 y 144.
-
el anticuerpo monoclonal AHF2 reconoce todos los fragmentos de fil-gst, citrulinada o no.
Ejemplo 3 Especificidad del reconocimiento de la fil-gst citrulinada por los sueros
En una primera serie de experimentos (Figura 4a), se compara la reactividad de la fil-gst no citrulinada (fil-gst sola, 30 minutos a 50ºC) y de la fil-gst citrulinada por PAD 30 minutos a 50ºC con los sueros humanos compuestos por:
-
sueros de personas normales: T(2) y T(3),
-
sueros de pacientes aquejados por PR que presentan titulaciones elevadas de AAF detectadas por inmunotransferencia sobre las variantes ácidas-neutras de la filagrina humana, y mediante inmunofluorescencia indirecta sobre criocortes de esófago de rata: PR(6) y PR(8),
-
anticuerpos anti-filagrina purificados a partir de suero de un paciente aquejado por PR mediante cromatografía de afinidad sobre una columna injertada con las isoformas ácidas-neutras de la filagrina humana: AAF.
Se realiza también un control positivo con el anticuerpo monoclonal AHF2.
En una segunda serie de experimentos (Figura 4b), se confirma la reactividad de la fil-gst citrulinada con una serie mayor de sueros:
-
4 sueros testigo: T(4),
-
4 sueros de pacientes aquejados por PR que no presentan AAF detectables en inmunotransferencia o en inmunofluorescencia indirecta: PR(4),
-
9 sueros de pacientes aquejados por PR con titulaciones elevadas de AAF (tres de entre ellos (*) se han ensayado también en la primera serie de experimentos): PR(9),
-
anticuerpos anti-filagrina purificados mediante cromatografía de afinidad sobre una columna injertada con las isoformas ácidas-neutras de la filagrina, a partir de un conjunto de sueros de 40 pacientes aquejado por PR: AAF,
-
los anticuerpos monoclonales AHF (1-7).
Se utilizan los sueros a una dilución de 1/2000; se utilizan los anticuerpos anti-filagrina purificados mediante cromatografía de afinidad a una concentración de 4 \mug/ml; se utilizan los anticuerpos monoclonales a una concentración de 0,2 \mug/ml.
Los resultados son los siguientes:
-
la citrulinación de la filagrina recombinante es necesaria para el reconocimiento por los AAF de los sueros de pacientes aquejados por PR (14 sueros positivos sobre 14 la reconocen);
-
los autoanticuerpos anti-filagrina, purificados mediante cromatografía de afinidad a partir de sueros de pacientes aquejados por PR, muestran la misma reactividad sobre fil-gst citrulinada que los sueros de pacientes aquejados por PR (reconocimiento de los fragmentos correspondientes a las bandas 1 a 5). Esto muestra que son los AAF presentes en estos sueros los que reconocen la fil-gst citrulinada.
Ejemplo 4 Citrulinación de los péptidos s-47-s y s-35-r mediante pad, y ensayo de la reactividad de los péptidos citrulinados
Se han preparado mediante síntesis peptídica el péptido de 49 aminoácidos S-47-S de secuencia (código de 1 letra):
NH_{2}-STGHSGSQHSHTTTQGRSDASRGSSGSRSTSRETRDQEQSGDGSRHS GS-COOH
correspondiente a los aminoácidos 71 a 119 de la secuencia de una unidad de filagrina humana, y que comprende 6 residuos de arginina, y
el péptido de 37 aminoácidos S-35-R de secuencia (código de 1 letra):
NH_{2}-SQDRDSQAQSEDSERRSASASRNHRGSAQEQSRDGSR-COOH
correspondiente a los aminoácidos 155 a 191 de la secuencia de una unidad de filagrina humana, y que comprende 7 residuos de arginina. Los péptidos S47-S y S-35-R se representan en la lista de secuencias adjunta con los números respectivos SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 4.
Estos 2 péptidos, así como la fil-gst, se han citrulinado mediante la acción de la PAD durante 30 minutos a 50ºC en el mismo medio de reacción que el indicado en el ejemplo 2. Las condiciones específicas para cada péptido y para la fil-gst son las siguientes:
- péptido S-47-S: 4 mU/\mumol de arginina,
- péptido S-35-R: 2,7 mU/\mumol de arginina,
- fil-gst: como se indica en el ejemplo 2.
Se compara mediante "transferencia de mancha" la reactividad de cada péptido y la de la fil-gst antes y después de la acción de la enzima frente al anticuerpo monoclonal AHF4 y al suero de un paciente aquejado por PR.
Las condiciones operativas son las siguientes:
-
0,5 \mug por depósito de cada antígeno (péptidos, fil-gst, variantes ácidas-neutras de la filagrina (VAF)),
-
tratamiento de la nitrocelulosa 45 minutos a 80ºC antes de la inmunodetección;
-
suero PR utilizado a una dilución de 1/2000; anticuerpo monoclonal AHF4 utilizado a una concentración de 0,2 \mug/ml.
Los resultados se ilustran mediante la Figura 5, que muestra que:
-
AHF4 reconoce el péptido S-47-S y la fil-gst citrulinados o no, pero no reconoce S-35-R, citrulinado o no.
-
S-47-S es reconocido, después de la citrulinación, por el suero de pacientes aquejados por PR, mientras que S-35-R, citrulinado o no, no es reconocido. El mismo suero reconoce además los VAF y la fil-gst citrulinada, pero no reconoce la fil-gst no citrulinada.
\newpage
Ejemplo 5 Síntesis de los péptidos E-12-H y E-12-D citrulinados y no citrulinados y ensayo de reactividad de los péptidos
Se han determinado los péptidos E-12-H y E-12-D por referencia a las secuencias nucleotídicas del gen de la profilagrina humana descritas por GAN S.Q. et al., [Biochemistry, 29: 9432-9440, (1990)].
El péptido de 14 aminoácidos E-12-H de secuencia (código de 1 letra):
NH_{2}-EQSADSSRHSGSGH-COOH
comprende 1 residuo de arginina, y
el péptido de 14 aminoácidos E-12-D de secuencia (código de 1 letra):
NH_{2}-ESSRDGSRHPRSHD-COOH
comprende 3 residuos de arginina.
Los péptidos E-12-H y E-12-D se representan en la lista de secuencias adjunta con los números respectivos SEC Nº ID 5 y SEC Nº ID 6.
Estos péptidos se han preparado mediante síntesis peptídica en fase sólida.
Los péptidos E-12-H y E-12-D citrulinados se han sintetizado directamente mediante incorporación de una citrulina para reemplazar una arginina.
Para el péptido E-12-D, se ha reemplazado sólo el residuo de arginina correspondiente al 8º aminoácido de la secuencia por una citrulina en la síntesis peptídica.
Se ha ensayado la reactividad de cada péptido citrulinado y no citrulinado respectivamente frente a un suero normal, dos sueros de pacientes PR, anticuerpos anti-filagrina (AFA) purificados a partir de un conjunto de 45 sueros de pacientes PR y anticuerpos anti-filagrina purificados a partir de 12 sueros de pacientes PR.
Protocolo experimental
Se han revestido los pocillos de placas de microvaloración NUNC MAXISORP respectivamente con ayuda de los péptidos E-12-D y E-12-H no citrulinados y citrulinados, diluidos a una concentración de 5 \mu/ml en un tampón PBS (pH 7,4) e incubados durante 1 noche a 4ºC (volumen final: 100 \mug/pocillo). Se han saturado los pocillos durante 30 minutos a 37ºC con 0,05% de PBS-Tween 20, 2,5% de gelatina a 200 \mul/pocillo. Se ha diluido el suero de control negativo (suero normal) a 1/120. Se han diluido los anticuerpos anti-filagrina en 0,05% de PBS-Tween 20, 0,05% de gelatina, 0,5% de (PBS TG) de modo que las concentraciones finales de autoanticuerpos anti-filagrina sean las indicadas en la tabla I adjunta. Se han añadido el suero de control negativo, los sueros PR y los anticuerpos anti-filagrina (volumen final: 100 \mul/pocillo) y se han sometido a incubación durante 1 hora a 37ºC y una noche a 4ºC. Se han añadido anticuerpos de cabra anti-cadenas pesadas gamma de inmunoglobulinas humanas marcadas con peroxidasa (comercializadas por la compañía SOUTHERN BIOTECHNOLOGIES) a cada pocillo (dilución en PBSTG: 1/2000, volumen final: 100 \mul/pocillo) y se han sometido a incubación durante 1 hora a 37ºC. El revelado se ha efectuado mediante la adición de orto-fenilendiamina (2 mg/ml) durante 10 minutos).
Los resultados presentados en la tabla I adjunta se dan con relación a la DO a 492 nm: péptido señal citrulinado/péptido señal no citrulinado.
Estos resultados muestran que, en la mayoría de los casos, la relación de DO de péptido citrulinado/péptido no citrulinado es superior a 1, e ilustran por tanto la buena estabilidad de los péptidos citrulinados con relación a los péptidos no citrulinados por su reactividad frente a los anticuerpos anti-filagrina.
1
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: BIOMERIEUX
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Chemin de l'Orme
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: MARCY-L'ETOILE
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 69280
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: SERRE, Guy
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Résidences du Lac, apt. 46, 10 avenue Winston Churchill
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: TOULOUSE
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 31100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: GIRBAL-NEUHAUSER Elisabeth
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 22 rue Matelache
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: TOULOUSE
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 31000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: VINCENT, Christian
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 16, avenue de la Saune
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: LAUZERVILLE
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 31650
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: SIMON, Michael
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 152, chemin du Pech
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ESCALQUENS
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 31750
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: SEBBAG, Mireille
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 3 rue, A. Fredeau
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: TOULOUSE
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 31500
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: DALBON, Pascal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 6, boulevard Jules aAbre
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: LYON
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 69006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: JOLIVET-REYNAUD, Colette
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 16, avenue des Colonnes
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: BRON
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 69500
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: ARNAUD, Michael
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 63, rue Gervais Bussiére
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: VILLERBAUNE
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 69100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: JOLIVET, Michael
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 16, avenue des Colonnes
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: BRON
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 69500
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTÍGENOS DERIVADOS DE FILAGRINAS Y SU UTILIZACIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA POLIARTRITIS REUMATOIDE
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Patentin Release nº 1,0, versión nº 1.30 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES DE LA SEC Nº ID 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCCTATACC AGGTGAGCAC TCAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES DE LA SEC Nº ID 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGACCCTGAA CGTCCAGACC GTCCC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES DE LA SEC Nº ID 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 3:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES DE LA SEC Nº ID 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 4:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES DE LA SEC Nº ID 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Ser Ala Asp Ser Ser Arg His Ser Gly Ser Gly His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES DE LA SEC Nº ID 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ser Ser Arg Asp Gly Ser Arg His Pro Arg Ser His Asp}

Claims (8)

1. Antígeno artificial reconocido específicamente por los auto-anticuerpos anti-filagrina presentes en el suero de pacientes aquejados por poliartritis reumatoide, caracterizado porque está constituido por un polipéptido recombinante o sintético que comprende toda o parte de una secuencia derivada de la de una unidad de filagrina mediante sustitución de al menos un residuo de arginina por un residuo de citrulina.
2. Antígeno artificial según la reivindicación 1, caracterizado porque está constituido por un péptido que comprende toda o parte de al menos una secuencia derivada:
-
de la secuencia correspondiente a los aminoácidos 144 a 314 de una unidad de filagrina humana, o bien
-
de la secuencia correspondiente a los aminoácidos 76 a 144 de una unidad de filagrina humana,
mediante sustitución de al menos un residuo de arginina por un residuo de citrulina.
3. Antígeno artificial según la reivindicación 2, caracterizado porque está constituido por un péptido que comprende toda o parte de al menos una secuencia derivada de la secuencia correspondiente a los aminoácidos 71 a 119 de una unidad de filagrina humana, mediante sustitución de al menos un residuo de arginina por un residuo de citrulina.
4. Antígeno artificial según la reivindicación 1, caracterizado porque está constituido por un péptido que comprende toda o parte de al menos una secuencia derivada de una de las secuencias de SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5, SEC Nº ID 6, mediante sustitución de al menos un residuo de arginina por un residuo de citrulina.
5. Utilización de un antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el diagnóstico in vitro de la poliartritis reumatoide.
6. Composición antigénica para el diagnóstico de la presencia de autoanticuerpos específicos de la poliartritis reumatoide en una muestra biológica, caracterizada porque está constituida por al menos un antígeno artificial según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, eventualmente marcado y/o conjugado con una molécula vehículo.
7. Procedimiento de detección de autoanticuerpos específicos de la poliartritis reumatoide en una muestra biológica, estando caracterizado el procedimiento porque comprende:
-
la puesta en contacto de dicha muestra biológica con al menos un antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una composición antigénica según la reivindicación 6, en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo con los autoanticuerpos específicos de la poliartritis reumatoide eventualmente presentes;
-
la detección, mediante cualquier medio apropiado, del complejo antígeno/anticuerpo eventualmente formado.
8. Kit para la detección de autoanticuerpos específicos de la poliartritis reumatoide en una muestra biológica, caracterizado porque comprende al menos un antígeno según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una composición antigénica según la reivindicación 6, así como tampones y reactivos apropiados para la constitución de un medio de reacción que permita la formación de un complejo antígeno/anticuerpo, y/o medios de detección de dicho complejo antígeno/anticuerpo.
ES97938965T 1996-08-30 1997-09-01 Antigenos derivados de filagrinas y su utilizacion para el diagnostico de la poliartitis reumatoide. Expired - Lifetime ES2227711T3 (es)

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