ES2283614T3 - Composiciones inmunogenicas que comprenden un antigeno y una proteina m purificada del virus respiratorio sincitial. - Google Patents
Composiciones inmunogenicas que comprenden un antigeno y una proteina m purificada del virus respiratorio sincitial. Download PDFInfo
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Abstract
Composición inmunogénica que comprende proteína M purificada del virus respiratorio sincitial o por lo menos un fragmento eficaz de manera inmunitaria de la misma y un vector de ácido nucleico que codifica para un antígeno del virus respiratorio sincitial o por lo menos un fragmento inmunogénico del mismo, en la que dicha proteína M o fragmento eficaz de manera inmunitaria se proporciona en una cantidad para proporcionar una respuesta inmunitaria potenciada frente a dicho antígeno del virus respiratorio sincitial en un huésped que presenta una respuesta inmunitaria específica de M del virus respiratorio sincitial preexistente, en la que el vector de ácido nucleico comprende una parte que codifica para antígeno y un promotor para efectuar la expresión de la parte que codifica para antígeno en el huésped.
Description
Composiciones inmunogénicas que comprenden un
antígeno y una proteína M purificada del virus respiratorio
sincitial.
La presente invención se refiere al campo de la
inmunología y se ocupa particularmente de potenciar una respuesta
inmunitaria frente a un antígeno.
Durante muchos años se han usado adyuvantes para
mejorar la respuesta inmunitaria del huésped frente a antígenos de
interés en vacunas, especialmente vacunas de componentes o
subunidades compuestas de proteínas recombinantes. Los adyuvantes
son inmunomoduladores que normalmente están unidos de manera no
covalente a antígenos y se formulan para potenciar la respuesta
inmunitaria del huésped. Los ejemplos incluyen hidróxido de aluminio
y fosfato de aluminio (en general comúnmente denominado alumbre).
Aunque se observa poca o ninguna toxicidad sistémica con alumbre,
su utilización está asociada a reacciones locales tales como
eritema, nódulos subcutáneos, hipersensibilidad de contacto e
inflamación granulomatosa. Tales reacciones locales pueden ser de
particular preocupación en el contexto de inmunizaciones
frecuentes, por ejemplo, anuales.
Los adyuvantes potencian la inmunogenicidad de
un inmunógeno pero no son necesariamente inmunógenos en sí. Se han
identificado adyuvantes que potencian la respuesta inmunitaria
frente a antígenos administrados por vía parenteral. Sin embargo,
algunos de estos adyuvantes son tóxicos, y pueden producir efectos
secundarios no deseados haciéndolos inadecuados para su utilización
en seres humanos y muchos animales. De hecho, solamente hidróxido
de aluminio y fosfato de aluminio (en general comúnmente denominado
alumbre) se usan rutinariamente como adyuvantes en vacunas humanas
y veterinarias. Para inducir eficazmente respuestas inmunitarias
humorales (HIR) e inmunidad mediada por células (CMI), con
frecuencia se emulsionan inmunógenos (antígenos) en adyuvantes.
Muchos adyuvantes son tóxicos, induciendo granulomas, inflamaciones
agudas y crónicas (adyuvante completo de Freund, FCA), citólisis
(saponinas y polímeros pluronic) y pirogenicidad, artritis, y
uveítis anterior (LPS y MDP). Aunque el FCA es un adyuvante potente
y ampliamente usado en investigación, no está autorizado para su
utilización en vacunas humanas o veterinarias debido a su
toxicidad.
El virus respiratorio sincitial (RSV) humano es
una causa principal de infecciones del aparato respiratorio. A
escala mundial se producen cada año 65 millones de infecciones dando
como resultado 160.000 muertes (referencia 1; al final de la
descripción aparece una lista de referencias). En USA solos, 100.000
niños, pueden requerir hospitalización por neumonía y
bronconeumonía producida por RSV en un solo año (referencias 2).
Proporcionar cuidados ambulatorios y de pacientes hospitalizados
para niños con infecciones por RSV cuesta por encima de 340
millones de \textdollar anualmente en USA.
El RSV es una causa principal de enfermedad del
aparato respiratorio inferior grave en ancianos y adultos
inmunocomprometidos (referencias 3). Los brotes en residencias de
ancianos u hogares de pensionistas están bien documentados
(referencia 3) y una proporción significativa de enfermedad que
implicaba el aparato respiratorio inferior en brotes se asoció a
mortalidad. Aproximadamente el 7% de la comunidad hospitalizada que
adquirió neumonía se ha atribuido al RSV (referencia 4). La
mortalidad debida al RSV puede superar a la debida a la gripe en
del 60 al 80% (referencia 5). Los costes anuales atribuidos a las
hospitalizaciones por neumonía por RSV en los ancianos en USA se ha
estimado de manera conservadora en entre 150 y 680 millones de
\textdollar (referencia 6). Una vacuna de RSV podría por tanto
desempeñar un papel importante para reducir la morbimortalidad en
los ancianos y disminuir los costes de asistencia sanitaria.
El RSV es un virus ARN encapsulado de la familia
paramyxoviridae y del género pneumovirus. Se ha dilucidado la
estructura y composición del RSV y se describe en detalle en el
libro de texto "Fields Virology", Fields, B.N. Raven Press,
N.Y. (1996), páginas 1313-1351 "Respiratory
Syncytial Virus" por Collins, P., McIntosh, K., y Chanock, R.M.
(referencia 7).
Los estudios de neutralización cruzada han
mostrado que los aislados de RSV pueden clasificarse en dos grupos
antigénicos principales, designados A y B (referencia 8). La
glicoproteína G muestra la mayor divergencia entre los grupos,
mostrando una homología de aminoácidos del 53% entre RSV A y B
(referencia 9).
Los dos antígenos protectores principales de RSV
son las glicoproteínas de unión (G) y de fusión (F) de la cápsula
(referencia 10). La proteína F se sintetiza como una molécula (Fo)
precursora de aproximadamente 68 kDa que se escinde de manera
proteolítica en fragmentos polipeptídicos F2 (de aproximadamente 20
kDa) y F1 (de aproximadamente 48 kDa) unido a disulfuro (referencia
11). La proteína G (de aproximadamente 33 kDa) se
O-glicosila fuertemente dando lugar a una
glicoproteína de peso molecular aparente de aproximadamente 90 kDa
(referencia 12). Se han definido dos amplios subtipos A y B de RSV
(referencia 13). Las principales diferencias antigénicas entre
estos subtipos se encuentran en la glicoproteína G, mientras que la
glicoproteína F se conserva más (referencias 14).
\newpage
Los anticuerpos dirigidos contra la proteína F o
contra la proteína G pueden neutralizar el virus. Los anticuerpos
frente a la proteína F bloquean la propagación del virus entre
células.
Además de la respuesta de anticuerpo generada
por las glicoproteínas F y G, se ha mostrado que las células T
citotóxicas humanas producidas por infección por RSV reconocen la
proteína F de RSV, proteína matriz (M), nucleoproteína (N) de
proteína 22k (M22), proteína hidrófoba pequeña (SH), y la proteína
no estructural (1b.) (referencia 15). Se ha secuenciado el gen M de
RSV humano que codifica para la proteína matriz (referencia
18).
El documento WO 98/02180 describe un
procedimiento de inmunización de dos etapas contra la familia de
virus pyramyxoviridae usando la preparación de proteínas de
subunidades y cepas virales atenuadas.
Sería deseable potenciar la respuesta
inmunitaria frente a un antígeno, en particular un antígeno de RSV
para proporcionar una vacuna más eficaz.
La presente invención proporciona
procedimientos, composiciones y utilizaciones tal como se define en
las reivindicaciones y tal como se describe a continuación.
Por consiguiente, en un aspecto de la presente
invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende
proteína M purificada del virus respiratorio sincitial o por lo
menos un fragmento eficaz de manera inmunitaria de la misma y un
vector de ácido nucleico que codifica para un antígeno del virus
respiratorio sincitial o por lo menos un fragmento inmunogénico del
mismo, en la que dicha proteína M o fragmento eficaz de manera
inmunitaria se proporciona en una cantidad para proporcionar una
respuesta inmunitaria potenciada frente a dicho antígeno del virus
respiratorio sincitial en un huésped que presenta una respuesta
inmunitaria específica de M del virus respiratorio sincitial
preexistente, en la que el vector de ácido nucleico comprende una
parte que codifica para antígeno y un promotor para efectuar la
expresión de la parte que codifica para antígeno en el huésped.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un procedimiento para producir una composición
inmunogénica que comprende proporcionar proteína M purificada del
virus respiratorio sincitial o por lo menos un fragmento eficaz de
manera inmunitaria de la misma y un ácido nucleico que codifica para
un antígeno del virus respiratorio sincitial, en el que dicha
proteína M o fragmento eficaz de manera inmunitaria se proporciona
en una cantidad para proporcionar una respuesta inmunitaria
potenciada frente a dicho antígeno del virus respiratorio sincitial
en un huésped que presenta una respuesta inmunitaria específica de M
del virus respiratorio sincitial preexistente.
En un aspecto adicional de la presente invención
se proporciona la utilización de una proteína M purificada o
componente inmunogénico de la misma del virus respiratorio sincitial
como un adyuvante para la preparación de una composición
inmunogénica para su utilización en un huésped que presenta una
respuesta inmunitaria específica de M del virus respiratorio
sincitial preexistente, en la que dicha composición comprende un
antígeno del virus respiratorio sincitial y dicha proteína M.
En un aspecto adicional de la presente invención
se proporciona la utilización de una proteína M purificada del
virus respiratorio sincitial, o fragmentos eficaces de manera
inmunitaria del mismo, para la fabricación de un medicamento que
comprende un vector de ácido nucleico que codifica para un antígeno
del virus respiratorio sincitial para potenciar la respuesta
inmunitaria frente a un antígeno del virus respiratorio sincitial en
un huésped que presenta una respuesta inmunitaria específica de M
del virus respiratorio sincitial preexistente.
Los huéspedes protegidos contra la enfermedad
producida por RSV incluyen seres humanos y las composiciones
inmunogénicas de la invención pueden usarse en procedimientos de
inmunización y protección de huéspedes contra la enfermedad
producida por infección por RSV. Las composiciones inmunogénicas de
la invención pueden administrarse a huéspedes susceptibles. Los
huéspedes pueden ser seres humanos ancianos u otros seres humanos
expuestos previamente a la proteína M de RSV y cebados
inmunológicamente para responder a la inmunización.
La presente invención se entenderá de manera
adicional a partir de la siguiente descripción haciendo referencia
a los dibujos, en los que:
la figura 1 es una representación gráfica de la
secreción de IFN-\gamma de las células del bazo de
ratones cebados con RSV vivo y a los que se ha administrado dosis
de refuerzo de diversos antígenos de RSV codificados por un vector
viral (NYVAC).
La figura 2 es una representación gráfica de la
respuesta CTL de los vectores virales de la figura 1, que muestra
el porcentaje de lisis específica de las células diana.
La figura 3 muestra la respuesta de las células
T en ratones frente a otros antígenos de RSV cuando se administra
conjuntamente la proteína M de RSV.
La figura 4 muestra la respuesta de anticuerpo
potenciada en ratones frente a otros antígenos de RSV cuando se
administra conjuntamente la proteína M de RSV.
Tal como se discutió anteriormente, la presente
invención proporciona una respuesta potenciada frente a antígenos
del virus respiratorio sincitial (RSV) mediante la utilización de la
proteína M del virus respiratorio sincitial. Aunque los inventores
no han identificado el mecanismo exacto de la respuesta inmunitaria
potenciada frente a un antígeno debida a la proteína M de RSV, se
cree que la proteína M moviliza la ayuda de las células T. En una
forma de realización preferida, los antígenos de RSV que han de
codificarse por el vector de ácido nucleico en las vacunas pueden
incluir las proteínas F, G y M22 de RSV. Las proteínas pueden
aislarse a partir de RSV mediante, por ejemplo, purificación por
inmunoafinidad, intercambio iónico u otros procedimientos
bioquímicos tal como se describe en, por ejemplo, la solicitud de
patente internacional nº WO 94/27636 de Hancock, publicada el 8 de
diciembre de 1994 o mediante el procedimiento descrito en la patente
US nº 5.194.595. Las proteínas de RSV y los fragmentos
inmunogénicos de las mismas pueden aislarse a partir de organismos
recombinantes que expresan las proteínas o fragmentos
inmunogénicos. El gen que codifica para la proteína F se describe en
la referencia 16. El gen que codifica para la proteína G se
describe en la referencia 17 y el gen que codifica para la proteína
M se describe en la referencia 18. La producción de organismos
recombinantes que expresan las proteínas de RSV o fragmentos
inmunogénicos de las mismas y la identificación y purificación de
los productos génicos expresados se describe en, por ejemplo, la
patente US nº 5.223.254. Tales recombinantes incluyen cualquier
transformante bacteriano, transformante de levadura, células de
insecto cultivadas infectadas con baculovirus recombinantes o
células de mamífero cultivadas tal como se conocen en la materia,
por ejemplo, células de ovario de hámster chino que expresan las
proteínas del virus RSV o fragmentos inmunogénicos de las
mismas.
Las proteínas de RSV y fragmentos inmunogénicos
de las mismas pueden sintetizarse también químicamente.
La proteína de fusión (F) puede comprender
proteínas de fusión (F) multiméricas que pueden incluir, cuando se
analizan en condiciones no reductoras, heterodímeros de peso
molecular de aproximadamente 70 kDa y formas diméricas y triméricas
de la misma:
La proteína de unión (G) puede comprender,
cuando se analiza en condiciones no reductoras, proteína G
oligomérica, proteína G de peso molecular de aproximadamente 95
kDa y proteína G de peso molecular de aproximadamente 55 kDa.
La proteína matriz (M) puede comprender, cuando
se analiza en condiciones no reductoras, proteína de peso molecular
de aproximadamente 28 a 34 kDa.
Las composiciones inmunogénicas proporcionadas
en la presente memoria pueden formularse como una vacuna para su
administración in vivo a un huésped, que puede ser un
primate, lo más preferentemente un huésped humano, para conferir
protección contra la enfermedad producida por RSV. Las vacunas y
composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente memoria
pueden comprender por lo menos un material inmunogénico adicional
que puede ser un antígeno de un patógeno distinto de RSV, tal como
un antígeno viral o bacteriano para proporcionar una vacuna de
combinación para la protección contra una pluralidad de
enfermedades.
En esta memoria descriptiva, el antígeno M de
RSV se define como proteína M de RSV aislada y purificada o
fragmentos eficaces de manera inmunitaria de la misma, o vectores
que suministran proteína M de RSV. Los fragmentos eficaces de
manera inmunitaria de proteína M de RSV incluyen fragmentos o
péptidos que provienen de proteína M de RSV que pueden provocar el
aumento inmunológico frente a otro antígeno. En esta memoria
descriptiva, purificado significa aislado de otras proteínas de RSV
de modo que la proteína M de RSV representa el material dominante
cuando se somete a ensayo mediante ensayos SDS-PAGE
o ELISA específico de M por ejemplo. Preferentemente, la proteína M
debe tener una pureza superior a aproximadamente el 50%, más
preferentemente una pureza superior a aproximadamente el 70% y lo
más preferentemente una pureza superior a aproximadamente el
90%.
Cantidades preseleccionadas de proteína M de RSV
se refiere a cantidades definidas de la proteína M, por ejemplo tal
como se mide mediante ELISA específico de M, que se añaden a otro
antígeno de modo que hay una respuesta inmunitaria potenciada
frente al otro antígeno en el huésped si se compara con la misma
composición sin la proteína M de RSV. La respuesta inmunitaria
potenciada puede medirse mediante secreción de interferón gamma
(IFN \gamma), una respuesta CTL tal como se determina mediante la
lisis celular específica, secreción de IL-5, o
respuestas de anticuerpos tal como se miden mediante ELISA
específico. La respuesta inmunitaria puede medirse también mediante
cualquier otro ensayo disponible para un experto en la materia y no
se limita a los mostrados a título de ejemplo en la presente
memoria. Una medición adicional puede ser mediante eficacia
potenciada contra la enfermedad en un sistema modelo relevante. Las
cantidades preseleccionadas pueden diferir dependiendo del huésped
al que se administren. Ejemplos de cantidades de M de RSV pueden ser
de desde aproximadamente 0,1 \mug hasta aproximadamente 1.000
\mug, o de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 100
\mug. En otras situaciones puede ser preferible administrar entre
aproximadamente 1 \mug y aproximadamente 50 \mug de proteína M
de RSV.
La respuesta específica de M de RSV preexistente
se define como cualquier respuesta inmunitaria detectable frente a
la proteína M de RSV en el huésped. Esto incluye las respuestas de
las células T tal como se midieron mediante la producción de
citocinas, por ejemplo IFN \gamma de células T CD8+, tal como se
detecta mediante el ensayo ELISA específico de citocinas o ensayo
ELISPOT, ambos ensayos muy conocidos en la materia. El cebado
previo de proteína M de RSV induce las respuestas de citocinas
frente a proteínas heterólogas incluyendo virales derivadas de RSV
o cualquier otro antígeno de virus, bacteriano o tumoral, respuestas
CTL frente a antígenos heterólogos suministrados por un vector
(bacteriano, viral o de ácido nucleico, o antígenos formulados para
suministrar antígenos para la presentación de clase I tal como
liposomas) y respuestas de anticuerpo en una población sin
tratamiento previo o previamente inmunizada con RSV.
El antígeno de RSV que ha de codificarse por el
vector de ácido nucleico usado con la proteína M de RSV puede
aislarse a partir del microorganismo que produce enfermedad
(patógeno), o puede producirse de manera recombinante en cualquiera
de los sistemas de expresión eucariota o bacteriano muy conocidos.
El antígeno de RSV se suministra por un vector de ácido nucleico
como vectores de expresión de plásmido sin replicación que codifican
para el antígeno de elección, y que contienen un promotor para
efectuar la expresión de dicho antígeno en el huésped.
Alternativamente, el vector de ácido nucleico puede ser un vector
viral. Ejemplos de vectores virales sin replicación en el huésped
usados para efectuar la expresión de dicho antígeno son los vectores
de pox NYVAC y ALVAC (referencia 20). Los vectores virales pueden
ser también vectores virales de replicación tales como vectores de
alfavirus recombinantes tal como se describe en la patente US nº
6.224.879 y patente US nº 6.015.686.
Las composiciones inmunogénicas, adecuadas para
usarse como vacunas, pueden prepararse a partir de mezclas que
comprenden proteína M y un vector de ácido nucleico que codifica
para el antígeno de RSV. La composición inmunogénica provoca una
respuesta inmunitaria que produce anticuerpos, y/o respuestas
mediadas por células tales como respuesta de células T citotóxicas
frente al antígeno de RSV específico.
Las composiciones inmunogénicas que incluyen
vacunas pueden prepararse como inyectables, disoluciones líquidas,
suspensiones o emulsiones. Los componentes inmunogénicos activos
pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables que
son compatibles con ellos.
Tales excipientes pueden incluir agua, solución
salina, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
Las vacunas y composiciones inmunogénicas pueden contener además
sustancias auxiliares, tales como, agentes emulsionantes o
mojantes, agentes de tamponado de pH o adyuvantes para potenciar la
eficacia de las mismas. Las vacunas y composiciones inmunogénicas
pueden administrarse por vía parenteral, por inyección subcutánea,
intradérmica o inyección por vía intramuscular. Alternativamente,
las composiciones inmunogénicas formuladas según la presente
invención, pueden formularse y administrarse de una manera para
suscitar una respuesta inmunitaria en las superficies mucosas. Por
tanto, la composición inmunogénica puede administrarse a las
superficies mucosas mediante, por ejemplo, las vías nasal u oral
(intragástrica). Alternativamente, pueden ser deseables otros modos
de administración, incluyendo supositorios y formulaciones orales.
Para supositorios, aglutinantes y vehículos pueden incluirse, por
ejemplo, polialcalenglicoles o triglicéridos. Tales supositorios
pueden formarse a partir de mezclas que contienen el/los
componente(s) inmunogénicos activos en el intervalo de
aproximadamente el 10%, preferentemente de aproximadamente el 1 al
2%. Las formulaciones orales pueden incluir vehículos normalmente
empleados, tales como calidades farmacéuticas de sacarina, celulosa
y carbonato de magnesio. Estas composiciones pueden estar en forma
de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas,
formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen
aproximadamente del 1 al 95% de los principios activos,
preferentemente aproximadamente del 20 al 75%.
Las vacunas y preparaciones inmunogénicas se
administran de una manera compatible con la formulación de
dosificación, y en una cantidad tal que será terapéuticamente
eficaz, inmunogénica y protectora. La cantidad que ha de
administrarse depende del sujeto que va a tratarse, incluyendo, por
ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para
sintetizar anticuerpos, y, si fuera necesario; para producir una
respuesta inmunitaria mediada por células. La cantidad precisa de
principios activos requeridos para administrarse depende del
criterio del médico. Sin embargo, los intervalos de dosificación
adecuados son fácilmente determinables por un experto en la materia,
y pueden ser del orden de microgramos a miligramos de principios
activos por vacunación. Los regímenes adecuados para la
administración inicial y dosis de administración de refuerzo son
también variables, pero pueden incluir una administración inicial
seguida de posteriores administraciones de refuerzo. La dosificación
puede depender también de la vía de administración y variará según
el tamaño del huésped.
La concentración de los principios activos en
una composición inmunogénica según la invención es en general
aproximadamente del 1 al 95%. Una vacuna que contiene material
antigénico de solamente un patógeno es una vacuna monovalente.
La descripción anterior describe de manera
general la presente invención. Puede obtenerte un entendimiento más
completo mediante la referencia a los siguientes ejemplos
específicos.
Se recogen ampliamente en la bibliografía
científica métodos de determinación de la dosis_{50}
(TCID_{50}/ml) infecciosa de cultivos tisulares, títulos de
neutralización y placa, no descritos de manera explícita en esta
descripción y están bastante dentro del alcance de los expertos en
la materia. Se determinaron las concentraciones de proteínas
mediante el método del ácido bicinconínico (BCA) tal como se
describe en el Pierce Manual (23220, 23225; Pierce Chemical
company, USA) incorporado a la presente memoria como referencia.
Se usó el medio de cultivo CMRL 1969 para el
cultivo celular y crecimiento de virus. Las células usadas en este
estudio son células de riñón de mono verde africano de calidad de
vacuna (VERO lote M6) obtenidas del Instituto Merieux. Los virus RS
usados fueron el subtipo A (cepas Long y A2) de virus RS obtenido de
la American Type Culture Collection (ATCC) para su uso en el ensayo
de neutralización de virus y un reciente aislado clínico del
subtipo \Delta para la purificación de proteínas virales.
Este ejemplo ilustra un procedimiento para
purificar la proteína M de RSV.
Se sedimentó un concentrado de RSV mediante
centrifugación durante 30 minutos a 5.000 x g y se extrajo el
sedimento viral con Triton® X-100 al 2% en fosfato
de sodio 1 mM pH 6,8, NaCl 300 mM agitando durante 1
hora a temperatura ambiente. Las condiciones de crecimiento y de
recogida para el RSV pueden encontrarse en la patente US nº
6.020.182. Se centrifugó el extracto durante 30 minutos a 15.000 x g
y se recogió el sobrenadante. Se diluyó el sobrenadante soluble dos
veces con fosfato de sodio 1 mM pH 6,8, Triton®
X-100 al 2% y a continuación se aplicó a una
columna de hidroxiapatita cerámica tipo II (Bio-Rad
Laboratories) equilibrada con fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl
50 mM y Triton® X-100 al 0,02%. Se lavó la columna
con el mismo tampón y luego se recogió una fracción rica en M de
RSV mediante elución con el fosfato de sodio 1 mM pH 6,8, NaCl 300
mM y Triton® X-100 al 0,02%. Se concentró la
combinación de elución usando un concentrador celular agitado Amicon
y una membrana de ultrafiltración YM-10 y luego se
dializó durante la noche contra Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 600 mM,
Triton® X-100 al 0,02%. Se aplicó el concentrado
dializado a una columna de exclusión molecular Sephacryl®
S-200 equilibrada con Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 600
mM, Triton® X-100 al 0,02% y se recogió el pico rico
en M. Se eliminaron cantidades traza de glicoproteínas G de RSV y F
de RSV haciendo pasar la combinación rica en M consecutivamente a
través de una columna de afinidad anti F y una columna de
jacalina-Sepharose®. Se concentró la M de RSV
purificada usando un concentrador celular agitado Amicon y una
membrana de ultrafiltración YM- 10 y luego se congeló a -70°C.
Este ejemplo ilustra la respuesta de células T
en ratones frente a otros antígenos de RSV cuando se suministran
mediante inmunización de vector viral.
Se cebaron ratones BALB/c de ocho semanas de
edad usados en este estudio con o bien PBS o bien 10^{3} ufp de
RSV vivo por vía intranasal. Se les administraron dosis de refuerzo
(i.m.) 4 semanas después con 10^{7} ufp de
NYVAC-M22 o NYVAC-F o NYVAC con o
sin proteína M de RSV a 1 \mug/ratón en PBS tal como se resume en
la tabla 1 a continuación. Se recogieron muestras de suero para
medir los títulos de F anti-RSV. Se extrajeron los
bazos 4 semanas después de la administración de refuerzo para buscar
la actividad CTL y la producción de citocinas. Se estimularon de
nuevo las células de bazo in vitro con células BC o BCH4
(infectadas de manera continua con RSV). Se recogieron los
sobrenadantes a las 72 h y se sometieron a prueba para detectar
IFN-\gamma e IL-5.
Para la detección de
IFN-\gamma en los sobrenadantes del cultivo, se
recubrieron los pocillos de las placas
Nunc-Immulon-Maxisorp con 50 ml de
anticuerpo (Biosource) de rata anti rIFN-\gamma de
ratón a 2 mg/ml en tampón carbonato 0,05 M /bicarbonato (pH 9,6),
durante la noche a temperatura ambiente. Se bloquearon los pocillos
con 200 ml de FBS al 10% en PBS durante 1 hora a temperatura
ambiente, seguido de 2 lavados en Tween 20 al 0,05% en PBS (tampón
de lavado). Se diluyeron los patrones de referencia y muestras en
tampón de muestra (Tween 20 al 0,05% en RPMI 1640) y se añadieron
100 ml de cada muestra a los pocillos. Se incubaron las placas a
37°C durante 2 horas, seguido de 5 lavados en tampón de lavado. Se
añadieron a cada pocillo cien ml de anticuerpo de rata anti
rIFN-g de ratón biotinilado diluido en tampón de
muestra hasta 2 mg/ml y se incubaron las placas a 37°C durante 1 h
seguido de 5 lavados con tampón de lavado. A continuación, se
añadieron a cada pocillo 100 ml de avidina-HRP
(dilución 1/2000) y se incubaron las placas durante una hora a
temperatura ambiente, seguido de 5 lavados con tampón de
lavado.
Se desarrolló la reacción coloreada añadiendo
100 ml de tetrametilbencidina (TMB)/H_{2}O_{2} y se terminó la
reacción tras 15 minutos añadiendo 50 ml de H_{2}SO_{4}. Se
leyeron las placas a 450 nm en un lector de placas Multiscan y se
calcularon los resultados usando el programa de reducción de datos
de Titersoft. Para la detección de IL-5 se siguió
un protocolo similar con los anticuerpos y patrones apropiados de
Pharmingen y Biosource International.
Se estimularon de nuevo los esplenocitos con
células BC o BCH4 en el día 7 y luego se sometieron a prueba para
detectar la actividad CTL tras 12 días. Los ensayos de CTL se
llevaron a cabo tal como sigue. Se incubaron los esplenocitos (de
2,5 a 3 x 10^{6} células/ml) en RPMI completo que contenía
IL-2 10 U/ml y esplenocitos singénicos
2,5-3 x 10^{6} células/ml
\gamma-irradiados (3.000 rads) que se habían
infectado con RSV 1 ufp/célula durante 2 h a 37°C. Tras 5 días de
cultivo, se lavaron las células y se incubaron (4 h/37°C) a
diluciones de células efectoras variables con 2 x 10^{3} células
diana marcadas con ^{51}Cr (fibroblastos de BCH4 infectados de
manera continua con RSV). Los fibroblastos (células BC) de BALB/c no
infectados sirvieron como control. Se midieron las liberaciones
espontáneas y totales de cromo en sobrenadantes de las células
diana suspendidas en el medio o Triton-X 100 al
2,5%. Se calculó el porcentaje de lisis específica como (recuentos
- recuentos espontáneos)/(recuentos totales - recuentos espontáneos)
x 100. Los resultados se recogen como la lisis específica media de
los ensayos por triplicado. Cada experimento se realizó 3 veces.
Estos experimentos muestran que las
administraciones de refuerzo con antígeno proteico M de RSV
potencian las respuestas de las células T CD8 tal como se mide
mediante IFN-\gamma mostrado en la figura 1, y la
actividad CTL mostrada en la figura 2. El antígeno M de RSV puede
potenciar la respuesta específica frente por lo menos dos antígenos
de RSV sometidos a prueba, F y M22 de RSV.
Este ejemplo ilustra la respuesta de las células
T en ratones frente a otros antígenos de RSV cuando se administra
conjuntamente la proteína M de RSV.
Se cebaron grupo de ratones BALB/c con 10^{3}
ufp de RSV vivo por vía intranasal tal como anteriormente. Cuatro
semanas después del cebado, se administraron a los ratones dosis de
refuerzo de PBS, proteína F de RSV purificada (50 ng) en fosfato de
aluminio o F de RSV purificada más M de RSV purificada (1 \mug) en
fosfato de aluminio. Cuatro semanas tras la administración de
refuerzo se extrajeron los bazos tal como anteriormente, se
cultivaron y se incubaron in vitro con proteína M, G o F de
RSV purificada (0,5 \mug/ml final). Se colocaron las células en
placa a 3x10^{6} células/ml y se estimularon con el mismo número
de células de bazo singénicas \gamma-irradiadas a
3000 rads. Se recogieron los sobrenadantes a las 72 h y se
sometieron a ensayo para detectar IFN-\gamma tal
como se describe en el ejemplo 2. Los resultados de este ensayo se
muestran en la figura 3. No se encontraron niveles detectables de
respuestas anti F, G o M en los ratones a los que no se les
administró la dosis de refuerzo (PBS). Los ratones a los que se les
administró dosis de refuerzo de F más M (F+M) respondieron a F, M y
también G. La respuesta anti-G es atribuible a las
cantidades traza de G presentes en la F purificada. Los ratones que
recibieron solamente administración de refuerzo de F (F) no
produjeron IFN-\gamma significativo frente a
ninguna de las proteínas. La respuesta de
IFN-\gamma frente a F de RSV en el grupo F+M de
ratones se potenció si se compara con el grupo al que se administró
dosis de refuerzo solamente de F de RSV.
Este ejemplo ilustra la respuesta del anticuerpo
frente a otras proteínas de RSV en ratones cuando se administra
conjuntamente M de RSV.
Se cebaron grupos de ratones BALB/c con 10^{3}
ufp de RSV vivo por vía intranasal tal como anteriormente. Cuatro
semanas después se les administró a los ratones una dosis de
refuerzo o bien de PBS, o bien FI-RSV (inactivada
con formalina) 5 ng de F con 1 \mug de M en alumbre (fosfato de
aluminio) o 5 ng de F en alumbre. Se les administró de nuevo a los
animales una dosis de refuerzo cuatro semanas después y se
recogieron las muestras de suero para determinar las respuestas
anti-F mediante ELISA específico de F.
También se extrajeron los bazos y se estimularon
de nuevo con 500 ng/ml de F, M, G o 10^{6} UFP de RSV. Se
recogieron los sobrenadantes del cultivo 72 h después para
determinaciones de IFN-gamma e
IL-5.
Los resultados de anticuerpos mostrados en la
figura 4, muestran que la inclusión del antígeno M de RSV potencia
la respuesta de anticuerpos (título de anticuerpos) frente al
antígeno F de RSV en dos logaritmos si se compara con la
administración de refuerzo de solamente F de RSV.
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Claims (16)
1. Composición inmunogénica que
comprende proteína M purificada del virus respiratorio sincitial o
por lo menos un fragmento eficaz de manera inmunitaria de la misma y
un vector de ácido nucleico que codifica para un antígeno del virus
respiratorio sincitial o por lo menos un fragmento inmunogénico del
mismo, en la que dicha proteína M o fragmento eficaz de manera
inmunitaria se proporciona en una cantidad para proporcionar una
respuesta inmunitaria potenciada frente a dicho antígeno del virus
respiratorio sincitial en un huésped que presenta una respuesta
inmunitaria específica de M del virus respiratorio sincitial
preexistente, en la que el vector de ácido nucleico comprende una
parte que codifica para antígeno y un promotor para efectuar la
expresión de la parte que codifica para antígeno en el huésped.
2. Composición según la reivindicación
1, que se formula como una vacuna, que contiene opcionalmente un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. Composición según la reivindicación 1
ó 2, en la que dicho antígeno del virus respiratorio sincitial se
selecciona de entre un antígeno G del virus respiratorio sincitial
libre de antígeno F del virus respiratorio sincitial, antígeno F
del virus respiratorio sincitial libre de antígeno G del virus
respiratorio sincitial, o un antígeno M22 del virus respiratorio
sincitial.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicha respuesta inmunitaria
específica de M del virus respiratorio sincitial preexistente es una
respuesta inmunitaria de células T.
5. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la cantidad de proteína M
purificada está comprendida entre 0,1 \mug y 1.000 \mug por
dosis.
6. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la cantidad de proteína M
purificada está comprendida entre 1 \mug y 100 \mug por
dosis.
7. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la cantidad de proteína M
purificada está comprendida entre 1 \mug y 50 \mug por
dosis.
8. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la proteína M purificada
presenta una pureza superior al 50% según se mide mediante análisis
SDS-PAGE o en un ensayo ELISA específico
de M.
de M.
9. Procedimiento para producir una
composición inmunogénica que comprende proporcionar proteína M
purificada a partir del virus respiratorio sincitial o por lo menos
un fragmento eficaz de manera inmunitaria de la misma y un ácido
nucleico que codifica para un antígeno del virus respiratorio
sincitial, en el que dicha proteína M o fragmento eficaz de manera
inmunitaria se proporciona en una cantidad para proporcionar una
respuesta inmunitaria potenciada frente a dicho antígeno del virus
respiratorio sincitial en un huésped que presenta una respuesta
inmunitaria específica de M del virus respiratorio sincitial
preexistente.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
en el que dicho antígeno del virus respiratorio sincitial se
selecciona de entre un antígeno G del virus respiratorio sincitial
libre de antígeno F del virus respiratorio sincitial, un antígeno F
del virus respiratorio sincitial libre de antígeno G del virus
respiratorio sincitial, o un antígeno M22 del virus respiratorio
sincitial.
11. Utilización de una proteína M purificada
o componente inmunogénico de la misma del virus respiratorio
sincitial como un adyuvante para la preparación de una composición
inmunogénica para su utilización en un huésped que presenta una
respuesta inmunitaria específica de M del virus respiratorio
sincitial preexistente, en la que dicha composición comprende un
antígeno del virus respiratorio sincitial y dicha proteína M.
12. Utilización según la reivindicación 11,
en la que dicho antígeno se selecciona de entre un antígeno G del
virus respiratorio sincitial libre de antígeno F del virus
respiratorio sincitial, un antígeno F del virus respiratorio
sincitial libre de antígeno G del virus respiratorio sincitial, o un
antígeno M22 del virus respiratorio sincitial.
13. Utilización de una proteína M purificada
del virus respiratorio sincitial, o fragmentos eficaces de manera
inmunitaria de la misma, para la fabricación de un medicamento que
comprende un vector de ácido nucleico que codifica para un antígeno
del virus respiratorio sincitial para potenciar la respuesta
inmunitaria frente a un antígeno del virus respiratorio sincitial
en un huésped que presenta una respuesta inmunitaria específica de
M del virus respiratorio sincitial preexistente.
14. Utilización según la reivindicación 13,
en la que dicho antígeno se selecciona de entre un antígeno G del
virus respiratorio sincitial libre de antígeno F del virus
respiratorio sincitial, un antígeno F del virus respiratorio
sincitial libre de antígeno G del virus respiratorio sincitial, o un
antígeno M22 del virus respiratorio sincitial.
\newpage
15. Utilización según la reivindicación 13,
para el tratamiento en dicho huésped de una enfermedad producida
por el virus respiratorio sincitial, en la que dicho antígeno es un
antígeno G del virus respiratorio sincitial, un antígeno F del
virus respiratorio sincitial o un antígeno M22 del virus
respiratorio sincitial.
16. Utilización según la reivindicación 15,
en la que dicha fabricación comprende:
- i)
- purificar la proteína M del virus respiratorio sincitial;
- ii)
- mezclar una cantidad preseleccionada de dicha proteína M purificada con un vector de ácido nucleico que codifica para un antígeno del virus respiratorio sincitial; y
- iii)
- formular dicha mezcla como una vacuna.
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