ES2337901T3

ES2337901T3 - Vacuna de subunidad contra infeccion por el virus respiratorio sincicial.

Info

Publication number: ES2337901T3
Application number: ES04761567T
Authority: ES
Inventors: Robert Anderson; Yan Huang; David S. Burt
Original assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Current assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date: 2003-07-15
Filing date: 2004-07-14
Publication date: 2010-04-30
Anticipated expiration: 2024-07-14
Also published as: EP2204188A1; AU2004257363A1; EP1651264A1; US20080226673A1; JP2007505033A; WO2005007189A1; DE602004024542D1; ATE451119T1; CA2532164A1; US20050042230A1; US7368537B2; EP1651264B1

Abstract

Uso de al menos un inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial (VRS) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 o fragmento de la misma, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección por VRS, en el que dicho al menos un inmunógeno de la proteína G tiene un epítope en la región que abarca desde el aminoácido 165 hasta el aminoácido 195 de SEQ ID NO:2 que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica o provocando una respuesta inmunopatológica reducida.

Description

Vacuna de subunidad contra infección por el virus respiratorio sincicial.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a la prevención de una enfermedad infecciosa y, más específicamente, a composiciones y al uso de las mismas que comprenden uno o más inmunógenos de la proteína G del virus respiratorio sincicial y fragmentos o variantes de los mismos que pueden provocar inmunidad protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica o con una respuesta inmunopatológica reducida (por ejemplo, reduciendo la patología pulmonar asociada).

Antecedentes

El virus respiratorio sincicial (VRS) es la causa más importante de infección del tracto respiratorio inferior (bronquiolitis aguda y neumonía) en la infancia (Glezen y col., Amer. J. Dis. Child. 140:543, 1986; Holberg y col., Am. J. Epidemiol. 133:1135, 1991; "Fields Virology", Fields, B. N. y col. Raven Press, N. Y. (1996), particularmente, capítulo 44, páginas 1313-1351 "Respiratory Syncytial Virus" de Collins, P., McIntosh, K., y Chanock, R. M.). Prácticamente todos los niños son infectados por el VRS a la edad de dos años y el 1-2% de todos los niños infectados requieren hospitalización (Holberg y col.; Parrott y col., Am. J. Epidemiol. 98:289, 1973). Los brotes de muertes por infección por VRS y del tracto respiratorio inferior en bebés y niños pequeños muestran una fuerte correlación (Anderson y col., J. Infect. Dis. 161:640, 1990) y las tasas de mortalidad entre los niños hospitalizados oscilan entre el 0,1-1% en EE.UU. y Canadá (Holberg y col.; Parrott y col.; Navas y col., J. Pediatr. 121:348, 1992; Law y col., Pediatr. Infect. Dis. J. 12:659, 1993; Ruuskanen y Ogra, Curr. Prob. Pediatr. 23:50,1993). Las consecuencias de la infección por VRS durante la infancia varían de bronquiolitis o neumonía hasta un riesgo elevado de asma infantil.

A pesar de los intensos esfuerzos que abarcan las cuatro últimas décadas, la búsqueda de una vacuna segura y eficaz contra el VRS sigue difícil de alcanzar. Las vacunas contra el VRS iniciales, que incluían virus inactivados con formalina y vivos atenuados (revisado en Murphy y col., Virus Res. 32:13, 1994), demostraron ser decepcionantemente no protectoras y en realidad condujeron a una enfermedad pulmonar más grave en los niños vacunados que posteriormente adquirieron infección por VRS natural. Las respuestas inmunopatológicas que especialmente implican la infiltración de células inflamatorias pueden subyacer probablemente a la lesión mediada por el VRS al tejido pulmonar. Los niños que recibieron la vacuna contra el VRS inactivado con formalina desarrollaron altos niveles de anticuerpos específicos de virus, pero los anticuerpos tenían bajos niveles de actividad neutralizante (Murphy y col., J. Clin. Microbiol. 24:197, 1986) y dejaron de protegerse contra la infección por VRS (Kim y col., Am. J. Epidemiol. 89:422, 1969; Kapikian y col., Am. J. Epidemiol. 89:405, 1969; Fulginiti y col., Am. J. Epidemiol. 89:435, 1969; Chin y col., Virol. 1:1, 1969).

Esfuerzos más recientes para el desarrollo de una vacuna contra el VRS se han centrado en procedimientos de subunidades y recombinantes. El VRS tiene dos glucoproteínas de superficie principales (designadas F y G) que se han examinado para uso en posibles vacunas. La proteína F participa en la fusión de membranas entre el virus y la célula diana (Walsh y Hruska, J. Virol. 47:171, 1983), mientras que se cree que la proteína G media en la unión del virus a un receptor celular (Levine y col., J. Gen. Virol. 68:2521, 1987). Tantos la proteína F como la G del VRS induce una fuerte inmunidad sérica y mucosa que son importantes para la protección contra infección por VRS (Glezen y col., 1986; Holberg y col.; Glezen y col., J. Pediatr. 98:708, 1981; Lamprecht y col., J. Infect. Dis. 134:211, 1976; Hemming y col., Clin. Microbiol. Rev. 8:22, 1995). Los estudios con ratones han demostrado que el VRS inactivado con formalina y algunos recombinantes de vacunas que codifican la proteína G indican una respuesta inflamatoria pulmonar perjudicial en la que los eosinófilos son un participante destacado (Connors y col., J Virol. 68:5321, 1994; Doherty, Trends Microbiol. 2:148, 1994; Waris y col., J. Virol. 70:2852, 1996; Graham y col., J. Immunol. 151:2032, 1993; Beasley y col., Thorax 43:679, 1988; Openshaw y col., Int. Immunol. 4:493, 1992).

Los eosinófilos y la citocina IL-5 atrayente de eosinófilos se consideran que son una característica de la denominada respuesta inmunitaria de tipo 2 que ha fomentado la idea que la inmunización con el antígeno del VRS tiene el potencial de desencadenar respuestas de tipo 2 dependientes de factores tales como la naturaleza de inmunógenos virales específicos y su ruta de presentación (Openshaw y col., 1992; Kakuk y col., J. Inject. Dis. 167:553, 1993; Openshaw y O'Donnell, Thorax 49:101, 1994). Un trabajo reciente indica que una parte de la región conservada de la proteína G del VRS participa en la inmunidad protectora contra el VRS y en la generación de respuestas inflamatorias, incluyendo la inducción de eosinofilia (Sparer y col., J. Expt'l. Med 187:1921, 1998; Tebbey y col., J. Expl'l. Med. 188:1967, 1998; Srikiatchachom y col., J. Virol. 73:6590, 1999; Varga y col., J. Immunol. 165:6487, 2000; Huang y Anderson, Vaccine 21:2500, 2003).

Por tanto, existe la necesidad de identificar y desarrollar composiciones terapéuticamente eficaces contra infecciones por el VRS, particularmente aquellas composiciones que puedan hacer de vacuna provocando inmunidad protectora sin inflamación pulmonar perjudicial asociada o con inflamación pulmonar perjudicial asociada reducida. Además, existe la necesidad de formulaciones de vacunas que puedan variarse para proteger contra o tratar la infección mediante diferentes subtipos y subgrupos inmunogénicos del VRS. La presente invención cumple tales necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.

Breve resumen de la divulgación

La presente invención proporciona el descubrimiento de formulaciones terapéuticas de inmunógenos del virus respiratorio sincicial (VRS), particularmente inmunógenos de la proteína G útiles para provocar una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica, o provocando una reducida.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infección por VRS que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende al menos un inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial o fragmento del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o fragmento de la misma, en la que dicho inmunógeno de la proteína G tiene un epítope en la región que abarca desde el aminoácido 165 hasta el aminoácido 195 de SEQ ID NO: 2 que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica, o provocando una reducida, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable a una dosis suficiente para provocar una respuesta inmunitaria específica para uno o más inmunógenos de la proteína G o fragmentos y variantes de los mismos. En una realización específica, el inmunógeno de la proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS:6. En todavía más realizaciones, la invención proporciona un procedimiento en el que la composición comprende además al menos un inmunógeno de la proteína F o inmunógeno de la proteína M del virus respiratorio sincicial, en el que los inmunógenos de la proteína F y la proteína M tienen un epítope que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica, o provocando una reducida, o tiene al menos dos inmunógenos de la proteína G.

En otra realización, cualquiera de los inmunógenos de la proteína G anteriormente mencionados y fragmentos o variantes de los mismos comprenden además una parte o resto hidrófobo (por ejemplo, para hacer de ancla o pie en un entorno lipídico tal como una membrana o proteosoma o liposoma), particularmente cuando se formulan con un vehículo de administración de adyuvante de proteosoma. En otras realizaciones, el resto hidrófobo comprende una secuencia de aminoácidos o un lípido. En ciertas realizaciones, el vehículo es un liposoma, y en otras realizaciones el liposoma contiene lípidos de Deinococcus radiodurans o \alpha-galactosilfosfotidilglicerolalquilamina. En otra realización, cualquiera de las composiciones anteriormente mencionadas comprende además un adyuvante, tal como alumbre, adyuvante de Freund o una formulación basada en proteosomas (por ejemplo, un sistema de liberación de adyuvante de proteosoma). Preferentemente, el adyuvante es adecuado para uso en seres humanos. En otras realizaciones, el inmunógeno de la proteína G o fragmento y variantes del mismo comprende además una segunda secuencia de aminoácidos para formar una proteína de fusión, pudiendo ser la segunda secuencia de aminoácidos una marca, una enzima o una combinación de las mismas, tal como una polihistidina, tiorredoxina, o ambas. En ciertas realizaciones, tales proteínas de fusión pueden comprender adicionalmente un resto hidrófobo. En otras realizaciones se proporciona cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados para uso cuando la respuesta inmunopatológica resultante de o asociada a la infección por VRS sea eosinofilia (tal como eosinofilia pulmonar) o asma. En todavía más realizaciones, la invención proporciona cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados para uso cuando la infección sea debida a un VRS del subgrupo A, subgrupo B, o tanto del subgrupo A como del subgrupo B. En realizaciones relacionadas, cualquiera de las composiciones desveladas puede administrarse en cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados mediante una vía seleccionada de enteral, parenteral, transdérmica, transmucosa, nasal o inhalación.

En otro aspecto, la invención proporciona una pluralidad de anticuerpos, células Th o ambos producidos mediante un procedimiento según uno cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados. En una realización se proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una infección por VRS que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable o un vehículo de administración de adyuvante de proteosoma, y una pluralidad de anticuerpos como se acaba de describir.

En otro aspecto adicional se proporciona una composición para uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infección por VRS que comprende un inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial formulado con un vehículo de administración de adyuvante de proteosoma, en el que dicho inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 o fragmento de la misma y en el que dicho inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo tiene un epítope en la región que abarca desde el aminoácido 165 hasta el aminoácido 195 de SEQ ID NO:2 que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica o con una respuesta inmunopatológica reducida. En otras realizaciones, la composición incluye cualquiera de los inmunógenos de la proteína G anteriormente mencionados y fragmentos de los mismos, proteínas de fusión, fusiones multivalentes, composiciones de mezcla o cualquier combinación de los mismos y otros aditivos tales como un adyuvante. En algunas realizaciones, el adyuvante es alumbre, proteosoma o protolina.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la inducción de anticuerpos de suero en ratones inmunizados con proteínas Trx-(poliHis)-G(128-229) de tipo natural o mutantes en alumbre y su capacidad para reconocer proteína G del VRS de tipo natural y el efecto de las mutaciones de la proteína G en tal inducción. Se resolvieron extractos de células HEp-2 infectadas por VRS mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas y se sondaron con sueros reunidos de cada grupo de ratones (los ratones se inmunizaron dos veces a intervalos de 14 días con PBS/alumbre, o proteínas Trx-(poliHis)-G(128-229) de tipo natural o mutantes con adyuvante de alumbre). Se muestra una inmunotransferencia de un gel de SDS-PAGE que ilustra la especificidad de sueros de ratón (dilución 1:100) para la proteína G del VRS.

Las Figuras 2A y 2B muestran cómo las variantes de la proteína G afectan la inmunidad protectora (A) y la infiltración eosinófila en fluidos broncoalveolares (B) en ratones inmunizados expuestos al VRS. Los ratones se inmunizaron dos veces subcutáneamente a intervalos de 14 días con PBS/alumbre o proteínas Trx-G128-229 de tipo natural o mutantes en alumbre, seguido por exposición al VRS. Los títulos de VRS en homogeneizados pulmonares, además de eosinófilos de lavado broncoalveolar (como % de células totales), se determinaron cuatro días después de la exposición al VRS. Los resultados se muestran como medias \pm DE.

Las Figuras 3A y 3B muestran la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:2) de la proteína G de la cepa Long del grupo A del VRS. En negrita se muestra una mutación a modo de ejemplo de un aminoácido (N191A, desde el codón AAC hasta GCC) para generar un inmunógeno de la proteína G de la invención cuyos fragmentos y variantes del mismo pueden usarse como se describe en este documento.

Las Figuras 4A y 4B muestran autorradiogramas en gel de poliacrilamida de ensayos de protección de ribonucleasa (EPR) de ARNm de citocinas en tejido pulmonar. Los resultados ilustran niveles relativos de ARNm de citocinas en pulmones de ratones ensayados cuatro días después de la exposición al VRS que han sido previamente inmunizados dos veces subcutáneamente a intervalos de 14 días con PBS/alumbre solo, proteína Trx-G128-229 de tipo natural con adyuvante de alumbre o proteínas Trx-G128-229 variantes. Los paneles A y B muestran diferentes regiones del gel de poliacrilamida que se expuso a la película radiográfica durante 3 días (A) o 1 hora (B).

La Figura 5 muestra la detección por ELISA de anticuerpos IgG de suero específicos de ratones BALB/c inmunizados con proteínas de fusión Trx-(poliHis)-G(128-229) de tipo natural o mutantes solas, o con adyuvante con protolina o alumbre. Los ratones se inmunizaron tres veces con una dosis de 6 \mug o 2 \mug de proteínas de fusión Trx-(poliHis)-G(128-229). La protolina sola o las proteínas de fusión formuladas con protolina se administraron intranasalmente y el alumbre solo o las proteínas de fusión formuladas con alumbre se administraron subcutáneamente. Las muestras de suero se obtuvieron después de la segunda inmunización (día 35) y dos semanas después de la tercera inmunización (día 62).

La Figura 6 muestra la detección por ELISA de anticuerpos IgA de lavado broncoalveolar (BAL) específicos de ratones BALB/c inmunizados con proteínas de fusión Trx-(poliHis)-G(128-229) de tipo natural o mutantes solas, o con adyuvante con protolina o alumbre. Los ratones se inmunizaron tres veces con una dosis de 6 \mug o 2 \mug de proteínas de fusión Trx-(poliHis)-G(128-229). La protolina sola o las proteínas de fusión formuladas con protolina se administraron intranasalmente, y el alumbre solo o las proteínas de fusión formuladas con alumbre se administraron subcutáneamente. Las muestras de BAL se recogieron en el día 62 (dos semanas después de la tercera inmunización).

Descripción detallada

Como se expone anteriormente, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para usar y preparar inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial (VRS) para tratar o prevenir infección por el virus respiratorio sincicial. Aunque la protección contra la reinfección por el VRS (es decir, exposición) podría obtenerse con vacunas previas constituidas por diversas formas y modos de inmunización de la proteína G del VRS, esto se asoció frecuentemente a una inflamación pulmonar no deseada y perjudicial caracterizada por eosinofilia pronunciada. Además, la inmunización de sujetos propensos a enfermedad por el VRS grave (por ejemplo, sujetos humanos entre las edades de 2 y 7 meses de edad) puede ser difícil debido a posibles efectos inmunosupresores de anticuerpos neutralizantes del VRS de suero materno o debido a la inmadurez inmunológica del sujeto. Por tanto, la presente invención se refiere generalmente al sorprendente descubrimiento de que ciertos fragmentos de la proteína G del VRS pueden modificarse para inducir o provocar inmunidad protectora contra el VRS y no para inducir o tener un nivel reducido de un acontecimiento inmunopatológico concomitante que conduzca a, por ejemplo, inflamación pulmonar y enfermedad agravada con la posterior infección por el VRS. En particular, estos inmunógenos de la proteína G son útiles para tratar o prevenir infecciones que implican VRS. Más abajo se trata en más detalle inmunógenos de la proteína G o fragmentos y variantes de los mismos adecuados para uso dentro de la presente invención, además de composiciones representativas y usos terapéuticos.

En la presente descripción, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de razones o intervalo de números enteros debe entenderse que incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tales como un décimo y una centésima de un número entero), a menos que se indique lo contrario. Como se usa en este documento, "aproximadamente" o "constituido esencialmente por" significa \pm 15%. El uso de la alternativa (por ejemplo, "o") debe entenderse que significa una, las dos o cualquier combinación de las mismas de las alternativas. Además, debe entenderse que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de las diversas combinaciones de las secuencias, estructuras y sustituyentes descritos en este documento se desvelan mediante la presente solicitud en la misma medida que si cada compuesto o grupo de compuestos se expusiera individualmente. Por tanto, la selección de secuencias, estructuras o sustituyentes particulares está dentro del alcance de la presente invención.

Inmunógenos de la proteína G del VRS

La presente invención se refiere a composiciones para uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infección por VRS que comprenden inmunógenos del polipéptido inmunogénico del VRS de la proteína G que comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 o fragmentos de la misma en las que dicho al menos un inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo tiene un epítope en la región que abarca desde el aminoácido 165 hasta el aminoácido 195 de SEQ ID NO:2 que provoca una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por VRS sin provocar una respuesta inmunopatológica o con una respuesta inmunopatológica reducida. Los polipéptidos inmunogénicos de la presente invención puede disponerse o combinarse en una forma lineal, y cada inmunógeno puede o puede no repetirse, pudiendo producirse la reiteración una vez o múltiples veces. Además, una pluralidad de polipéptidos inmunogénicos del VRS diferentes (por ejemplo, diferentes variantes de proteína G, proteína F o proteína M y fragmentos o variantes de las mismas) puede seleccionarse y mezclarse o combinarse en una composición de mezcla o fusionarse, conjugarse o ligarse para proporcionar una vacuna multivalente para uso en la provocación de una respuesta inmunitaria protectora sin una respuesta inmunitaria asociada perjudicial.

Como se usa en este documento, "inmunógeno de la proteína G" o "inmunógeno del VRS" se refiere a todos los polipéptidos de longitud completa, y fragmentos de los mismos, fusiones multivalentes, composiciones de mezcla, proteínas de fusión o cualquier combinación de los mismos que puede provocar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por VRS sin provocar una respuesta inmunopatológica o con una respuesta inmunopatológica reducida, como se describe en este documento.

La presente invención proporciona además procedimientos para producir inmunógenos de polipéptidos del VRS multivalentes sintéticos o recombinantes que incluyen proteínas de fusión. Por ejemplo, las células huésped que contienen constructos de expresión de ácidos nucleicos que codifican inmunógenos de la proteína G pueden cultivarse para producir inmunógenos de la proteína G recombinantes y fragmentos o variantes de los mismos. También se contemplan procedimientos para tratar o prevenir infecciones por VRS o provocar una respuesta inmunitaria usando inmunógenos de la proteína G y fragmentos o variantes de los mismos como se reivindica en este documento, o una combinación de polipéptidos (incluyendo proteínas de fusión).

Como se usa en este documento, la frase "respuesta inmunopatológica" se refiere a una afección o enfermedad resultante de una reacción inmunitaria que puede o puede no tener síntomas clínicos detectables. Respuestas inmunopatológicas a modo de ejemplo incluyen hipersensibilidad o asma. Otra respuesta inmunopatológica a modo de ejemplo puede ser una inducción atípica de granulocitos en respuesta a citocinas de tipo 2 tal como se encuentra en eosinofilia de sangre o eosinofilia pulmonar que puede ser característica de un estado alérgico o una infección microbiana (tal como una infección parasítica o una infección por virus respiratorio sincicial).

A modo de antecedentes y no deseando ceñirse a la teoría, el VRS tiene un genoma de ARN monocatenario no segmentado de sentido negativo que codifica al menos 10 proteínas virales (G, F, SH, M, M2, N, P, L, NS1 y NS2). El VRS tiene dos glucoproteínas de superficie principales (designadas F y G) que también han sido examinadas para uso en posibles vacunas. La proteína F participa en la fusión de membranas entre el virus y la célula diana (Walsh y Hruska, J. Virol. 47:171, 1983), mientras que se cree que la proteína G media en la unión del virus a un receptor celular (Levine y col., J. Gen. Virol. 68:2521, 1987). Tantos la proteína F como la G del VRS induce una fuerte inmunidad sérica y mucosa que son importantes para la protección contra la infección por VRS (Glezen y col., 1986; Holberg y col.; Glezen y col., J. Pediatr. 98:708, 1981; Lamprecht y col., J. Infect. Dis. 134:211, 1976; Hemming y col., Clin Microbiol. Rev. 8:22, 1995). Los estudios con ratones han demostrado que el VRS inactivado con formalina y algunos recombinantes de vacunas que codifican la proteína G indican una respuesta inflamatoria pulmonar perjudicial en la que los eosinófilos son un participante destacado (Connors y col., J. Virol. 68:5321, 1994; Doherty, Trends Microbiol. 2:148, 1994; Waris y col., J. Virol. 70:2852, 1996; Graham y col., J. Immunol. 151:2032, 1993; Beasley y col., Thorax 43:679, 1988; Openshaw y col., Int. Immunol. 4:493, 1992). Un resultado sorprendente de la presente invención es la identificación de un inmunógeno de la proteína G (por ejemplo, una variante de proteína G de tipo natural; una proteína G de tipo natural a modo de ejemplo se expone en SEQ ID NO:4, que puede estar codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se expone en SEQ ID NO:3) que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica, o provocando una reducida. El inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial o fragmento del mismo como se reivindica en este documento que tiene un epítope que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica, o provocando una reducida, se usa para preparar composiciones útiles para tratar o prevenir infecciones por VRS.

En una cierta realización, los inmunógenos de la proteína G del VRS son un fragmento de SEQ ID NO:2 como se expone en SEQ ID NOS:6.

Según la invención, el inmunógeno de la proteína G como se exponen en SEQ ID NO:2 es una variante de la proteína G de tipo natural que tiene una mutación puntual en la que un aminoácido en la posición 191 (Asn) cambia a una Ala (véase la Figura 3, en lo sucesivo también se denomina N191A de la proteína G), y en una realización más preferida, una variante de inmunógeno de la proteína G es un fragmento de la proteína G de longitud completa como se expone en SEQ ID NO:2. Por ejemplo, un fragmento de la proteína G tal puede incluir desde aproximadamente el aminoácido 128 hasta aproximadamente el aminoácido 229, conteniendo el fragmento la mutación N191A (SEQ ID NO:6).

La variante de inmunógeno de la proteína G representativa reivindicada en este documento incluye una sustitución Ala. Además, el inmunógeno variante de la presente invención puede ser un resultado de modificaciones tales como por ciertos sustituyentes químicos que incluyen glucosilación, alquilación, etc. Cada una de las variantes de la presente divulgación puede provocar preferentemente una respuesta inmunitaria protectora contra el VRS sin provocar una respuesta inmunopatológica o con una respuesta inmunopatológica reducida (por ejemplo, eosinofilia).

Como se describe en este documento, los fragmentos preferidos de la proteína G son inmunógenos que conservan al menos un epítope que provoca una respuesta inmunitaria protectora contra el VRS y provoca una respuesta inmunopatológica reducida, o es incapaz de provocar una respuesta inmunopatológica. En ciertas realizaciones, el fragmento de inmunógeno del mismo tiene la mutación N191A en secuencias de aminoácidos que abarcan desde aproximadamente el aminoácido 120 hasta aproximadamente el aminoácido 300 de SEQ ID NO:2, preferentemente desde aproximadamente el aminoácido 125 hasta aproximadamente el aminoácido 250, más preferentemente desde aproximadamente el aminoácido 150 hasta aproximadamente el aminoácido 225, y lo más preferentemente desde aproximadamente el aminoácido 165 hasta aproximadamente el aminoácido 195. En una realización, el fragmento de inmunógeno de la proteína G incluye los aminoácidos 128 a 229 y las mutaciones pueden encontrarse en el intervalo de aproximadamente los aminoácidos 178 a aproximadamente 205 de la proteína G.

Las comparaciones de secuencias pueden realizarse usando cualquier programa de software estándar tal como BLAST, tBLAST, pBLAST o MegAlign. Otros incluyen los proporcionados en el juego informático de bioinformática Lasergene que se produce por DNASTAR® (Madison, Wisconsin). Las referencias para los algoritmos tales como ALIGN o BLAST pueden encontrarse en, por ejemplo, Altschul, J. Mol Biol. 219:555-565, 1991; o Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915-10919, 1992. BLAST está disponible en la página web del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.govBLAST). Otros procedimientos para comparar múltiples secuencias de nucleótidos o aminoácidos determinando el alineamiento óptimo son muy conocidos para aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu y col. (eds.), "Information and Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," en Methods in Gene Biotechnology, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2^{a} edición, Academic Press, Inc., 1998).

Como se usa en este documento, la "similitud" entre dos péptidos o polipéptidos se determina generalmente comparando la secuencia de aminoácidos de un péptido o polipéptido con la secuencia de aminoácidos y sustitutos de aminoácidos conservados de la misma de un segundo péptido o polipéptido. Los fragmentos o porciones de los inmunógenos de la proteína G o variantes de los mismos de la presente descripción pueden emplearse para producir los inmunógenos de la proteína G de longitud completa correspondientes mediante síntesis de péptidos; por tanto, los fragmentos pueden emplearse como productos intermedios para producir los inmunógenos de la proteína G de longitud completa. Similarmente, los fragmentos o porciones de los ácidos nucleicos de la presente invención pueden usarse para sintetizar ácidos nucleicos de longitud completa de la presente divulgación.

Como se describe en este documento, los inmunógenos de la proteína G y los fragmentos de los mismos de la presente divulgación tienen un epítope que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica o con una respuesta inmunopatológica reducida. Los fragmentos pueden identificarse usando ensayos in vivo e in vitro conocidos en la técnica; tales como estudios de inmunización animal (por ejemplo, usando un modelo de ratón o conejo) y análisis de inmunotransferencia de Western, respectivamente, y combinaciones de los mismos. Otros ejemplos incluyen ensayos de reducción en placas para evaluar si los inmunógenos de la proteína G y los fragmentos o variantes de los mismos de la presente descripción pueden provocar una respuesta inmunitaria, particularmente una respuesta inmunitaria protectora (neutralizante). Brevemente, un animal se inmuniza con uno o más inmunógenos de la proteína G, o composición de los mismos, mediante administración subcutánea, los sueros se recogen de los animales inmunizados y entonces los sueros se prueban para su capacidad para inhibir la infección por VRS de una monocapa de cultivo celular (midiéndose la infección como el número de placas que se forman; es decir, "orificios" en la monocapa que se forman a partir del VRS que hace que lisen las células) (véase, por ejemplo, el Ejemplo 8). Además, las respuestas inmunopatológicas alteradas (reducidas o potenciadas) pueden identificarse indirectamente mediante, por ejemplo, examen de los patrones de expresión de citocinas en animales expuestos al VRS después de la inmunización con inmunógenos de la proteína G de la invención. Por ejemplo, los niveles de citocinas específicas pueden medirse en tejidos de interés usando un ensayo de protección de ribonucleasa (EPR) para deducir si una respuesta de tipo 1 o tipo 2 es frecuente después de la inmunización con un inmunógeno de la proteína G de la invención y posterior exposición al VRS (véase el Ejemplo 9). Estos y otros ensayos conocidos en la técnica pueden usarse para identificar inmunógenos de la proteína G y fragmentos o variantes de los mismos que tienen un epítope que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin
provocar una respuesta inmunopatológica o con una respuesta inmunopatológica reducida, según la presente descripción.

Los polipéptidos de la proteína G del VRS, fragmentos de los mismos y proteínas de fusión de los mismos, además de ácidos nucleicos correspondientes de la presente invención, se proporcionan preferentemente en una forma aislada, y en ciertas realizaciones preferidas se purifican hasta homogeneidad. Como se usa en este documento, el término "aislado" significa que el material se elimina de su entorno original o natural. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o polipéptido que se produce naturalmente presente en un animal vivo o célula no está aislado, pero la misma molécula de ácido nucleico o polipéptido se aísla cuando se separa de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Las moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo, podrían ser parte de un vector y/o tales ácidos nucleicos o polipéptidos podrían ser parte de una composición y todavía aislarse porque tal vector o composición no es parte de su entorno natural.

La presente invención también se refiere a inmunógenos de la proteína G del VRS y fragmentos o variantes de los mismos producidos sintética o recombinantemente, y preferentemente recombinantemente. Los componentes de polipéptidos inmunogénicos de los inmunógenos pueden sintetizarse mediante procedimientos químicos estándar que incluyen la síntesis mediante un procedimiento automático. En general, los péptidos inmunogénicos se sintetizan basándose en la estrategia de protección estándar de Fmoc en fase sólida con HATU como agente de acoplamiento. El péptido inmunogénico se escinde de la resina de fase sólida con ácido trifluoroacético que contiene secuestrantes apropiados que también desprotege los grupos funcionales de las cadenas laterales. El péptido inmunogénico bruto se purifica adicionalmente usando cromatografía de fase inversa preparativa. Pueden usarse otros procedimientos de purificación tales como cromatografía de reparto, filtración en gel, electroforesis en gel o cromatografía de intercambio iónico. Pueden emplearse otras técnicas de síntesis conocidas en la técnica para producir péptidos inmunogénicos similares tales como la estrategia de protección de tBoc, el uso de diferentes reactivos de acoplamiento y similares. Además, puede usarse cualquier aminoácido que se produzca naturalmente o derivado del mismo incluyendo D- o L-aminoácidos y combinaciones de los mismos.

Como se describe en este documento, los inmunógenos de la proteína G y fragmentos de los mismos de ciertas realizaciones pueden ser recombinantes, expresándose un inmunógeno deseado de la proteína G en un polinucleótido que está operativamente ligado a una secuencia de control de la expresión (por ejemplo, promotor) en un constructo de expresión de ácido nucleico. Los inmunógenos de la proteína G recombinantes según la invención comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o sólo están constituidos por una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:2. Más preferentemente, un inmunógeno de la proteína G recombinante comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NOS:6.

"Ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligadura, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas. Los ácidos nucleicos pueden estar compuestos por monómeros que son nucleótidos que se producen naturalmente (tales como desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos), análogos de nucleótidos que se producen naturalmente (por ejemplo, formas \alpha-enantioméricas de nucleótidos que se producen naturalmente), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener modificaciones en restos de azúcar y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones en los azúcares incluyen, por ejemplo, sustitución de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden estar funcionalizados como éteres o ésteres. Además, todo el resto de azúcar puede estar sustituido con estructuras estérica y electrónicamente similares tales como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos muy conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden ligarse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. El término "ácido nucleico" también incluye los denominados "ácidos nucleicos de péptido" que comprenden bases de ácidos nucleicos que se producen naturalmente o modificadas unidas a un esqueleto de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser tanto monocatenarios como bicatenarios.

Además, una "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de polinucleótido en forma de un fragmento separado, o como un componente de un constructo de ácido nucleico mayor que se ha separado de su célula fuente (incluyendo el cromosoma en el que normalmente reside) al menos una vez en una forma sustancialmente pura. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un polipéptido de VRS, péptido o variante del mismo que se ha separado de una partícula de VRS o de una célula huésped infectada con o que alberga el VRS es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden estar constituidas por una amplia variedad de nucleótidos que incluyen ADN, ADNc, ARN, análogos de nucleótidos o alguna combinación de los mismos.

Una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia que codifica un inmunógeno de la proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o está constituida por SEQ ID NO:2, o un fragmento de inmunógeno de la proteína G como se reivindica en este documento.

En ciertos aspectos, los vectores y constructos de ácidos nucleicos incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican el inmunógeno de la proteína G o fragmentos del mismo de la presente invención. En otro aspecto se proporcionan células huésped que están genéticamente manipuladas con tales vectores o constructos, y para la producción y el uso en procedimientos para tratar o prevenir una infección por VRS o provocar una respuesta inmunitaria. Los polipéptidos de VRS y fragmentos de los mismos pueden expresarse en células de mamífero, levadura, bacteria u otras células bajo el control de secuencias de control de la expresión apropiadas. Los sistemas de traducción sin células también pueden emplearse para producir tales proteínas usando ARN derivados de dichos constructos de expresión de ácidos nucleicos de la presente invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes procariotas y eucariotas se describen, por ejemplo, por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY, (1989), y pueden incluir plásmidos, cósmidos, vectores lanzadera, vectores virales y vectores que comprenden un origen cromosómico de replicación como se desvela en este documento.

Ciertos constructos de expresión de ácidos nucleicos comprenden una secuencia de control de la expresión ligada operativamente a un polinucleótido que codifica un inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo como se reivindica en este documento.

En otras realizaciones, los constructos de expresión de ácidos nucleicos descritos en este documento tienen un promotor inducible que puede ser lac, tac, tro, ara, trp, fago \lambda, fago T7 y promotor del fago T5, y más preferentemente es una secuencia del control de la expresión del promotor del fago T5/operador lac (plásmido pT5) como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0143685. La "secuencia de control de la expresión" se refiere a cualquier secuencia suficiente para permitir la expresión de una proteína de interés en una célula huésped que incluye una o más secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, secuencias operadoras (por ejemplo, lacO) y similares. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido del VRS está en un plásmido, preferentemente en el plásmido pT5, y la célula huésped es una bacteria, preferentemente Escherichia coli.

Se ha mostrado que la inyección de mamíferos con vehículos de administración de genes (por ejemplo, ADN desnudo) que codifican antígenos de diversos patógenos da como resultado respuestas inmunitarias protectoras (Ulmer y col., Science 259:1745-9, 1993; Bourne y col., J Infect. Dis 173:800-7, 1996; Hoffman y col., Vaccine 12:1529-33, 1994). Desde la descripción original de la expresión in vivo de proteínas extrañas a partir de ADN desnudo inyectado en tejido muscular (Wolff y col., Science 247:1465-8, 1990) ha habido varios avances en el diseño y la administración de ADN para fines de vacunación.

Las vacunas contra el VRS descritas en este documento son idealmente aptas para la administración mediante ADN desnudo debido a que los anticuerpos establecen en última instancia inmunidad protectora. Por ejemplo, dentro de una realización, las secuencias de polinucleótidos que codifican un inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo están ligadas en plásmidos que están específicamente manipulados para la expresión de células de mamíferos (véase, por ejemplo, Hartikka y col., Hum Gene Ther 7:1205-17, 1996, que contiene el elemento promotor/potenciador del gen temprano del citomegalovirus, el péptido señal del activador de plasminógeno de tejido humano y un elemento terminador del gen de la hormona de crecimiento bovina). Los polipéptidos del VRS pueden clonarse en un plásmido que se usa para transfectar líneas celulares humanas para asegurar la expresión de proteínas recombinantes. El plásmido puede propagarse en bacterias tales como E. coli y purificarse en cantidades suficientes para estudios de inmunización mediante centrifugación en gradiente de cloruro de cesio. Animales tales como los ratones pueden inmunizarse con, por ejemplo, 50 \mug de un plásmido recombinante aislado en 50 \mul de solución salina intramuscularmente (i.m.). Las inyecciones de refuerzo de la misma dosis pueden administrarse adicionalmente a intervalos de tres y seis semanas después de la inyección inicial.

Asimismo, también puede utilizarse una amplia variedad de otros vehículos de administración de genes dentro del contexto de la presente invención que incluyen virus, retrotransposones y cósmidos. Ejemplos representativos incluyen vector adenovirales (por ejemplo, los documentos WO 94/26914, WO 93/9191; Yei y col., Gene Therapy 1:192-200, 1994; Kolls y col., PNAS 91(1):215-219, 1994; Kass-Eisler y col., PNAS 90(24):11498-502, 1993; Guzman y col., Circulation 88(6):2838-48, 1993; Guzman y col., Cir. Res. 73(6):1202-1207, 1993; Zabner y col., Cell 75(2):207-216, 1993; Li y col., Hum Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud y col., Eur. J. Neurosci. 5(10):1287-1291, 1993), vectores de tipo 1 adenoasociados ("AAV-1") o de tipo 2 adenoasociados ("AAV-2") (véase el documento WO 95/13365; Flotte y col., PNAS 90(22):10613-10617, 1993), vectores de la hepatitis delta, virus delta vivos atenuados, vectores vacunales y vectores virales de herpes (por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.288.641), además de vectores que se desvelan dentro de la patente de EE.UU. nº 5.166.320. Otros vectores representativos incluyen vectores retrovirales (por ejemplo, documentos EP 0 415 731; WO 90/07936; WO 91/02805; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; la patente de EE.UU. nº 5.219.740; documentos WO 93/11230; WO 93/10218). Los procedimientos de uso de tales vectores en la terapia génica son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Larrick, J.W. y Burck, KL., Gene Therapy: Application of Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, New York, 1991; y Kreigler, M., Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman y Company, New York, 1990).

Los vehículos de administración de genes pueden introducirse en una célula huésped utilizando un vehículo o mediante diversos procedimientos físicos. Ejemplos representativos de tales procedimientos incluyen la transformación usando la precipitación de fosfato de calcio (Dubensky y col., PNAS 81:7529-7533, 1984), microinyección directa de tales moléculas de ácidos nucleicos en células diana intactas (Acsadi y col., Nature 352:815-818, 1991) y electroporación por la que las células suspensas en una disolución conductora se someten a un campo eléctrico intenso con el fin de polarizar transitoriamente la membrana, permitiendo la entrada de las moléculas de ácidos nucleicos. Otros procedimientos incluyen el uso de moléculas de ácidos nucleicos ligadas a un adenovirus inactivo (Cotton y col., PNAS 89:6094, 1990), lipofección (Felgner y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7413-7417, 1989), bombardeo de microproyectiles (Williams y col., PNAS 88:2726-2730, 1991), compuestos policatiónicos (tales como polilisina), ligandos específicos de receptores, liposomas que atrapan las moléculas de ácidos nucleicos, fusión de esferoplastos por la que la E. coli que contiene las moléculas de ácidos nucleicos se deshacen de sus paredes celulares exteriores y se fusionan a células animales usando polietilenglicol, transducción viral (Cline y col., Pharmac. Ther. 29:69, 1985; y Friedmann y col., Science 244:1275, 1989) y ligando de ADN (Wu y col., J. de Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989), además de virus inactivados psoralenos tales como Sendai o adenovirus.

El suero de un sujeto inmunizado con vehículos de administración de genes que contienen inmunógenos del polipéptido del VRS y fragmentos o variantes de los mismos, y fusiones de los mismos, puede ensayarse para el título total de anticuerpos por ELISA usando polipéptidos nativos del VRS como antígeno. Los anticuerpos protectores del suero pueden ensayarse como se describe en este documento o como se conoce en la técnica. La eficacia protectora de las vacunas de polipéptidos del VRS de ADN puede determinarse, por ejemplo, mediante ensayos de protección animal directos (es decir, estudios de infección por exposición) usando un serotipo de VRS que está representado en la composición farmacéutica o vacuna (es decir, estudios de infección por exposición).

En ciertos aspectos, una secuencia de ácidos nucleicos puede modificarse para codificar un inmunógeno del VRS o variante funcional del mismo en la que los codones específicos de la secuencia de ácidos nucleicos han sido cambiados por codones que están favorecidos por un huésped particular y puede dar como resultado la potenciación de niveles de expresión (véase, por ejemplo, Haas y col., Curr. Biol. 6:315, 1996; Yang y col., Nucleic Acids Res. 24:4592, 1996). Por ejemplo, ciertos codones de los péptidos inmunogénicos pueden optimizarse sin cambiar la secuencia primaria de los péptidos para una mejora de la expresión en Escherichia coli. A modo de ilustración y no de limitación, los codones de arginina (Arg) de AGG/AGA pueden cambiarse a los codones de Arg de CGT/CGC. Similarmente, los codones de Arg de AGG/AGA pueden optimizarse a codones de CGT/CGC. Como se conoce en la técnica, los codones pueden optimizarse para un huésped en el que los inmunógenos de la proteína G y los fragmentos o variantes de los mismos van a expresarse, que incluyen bacterias, hongos, células de insecto, células de plantas y células de mamífero. Adicionalmente, los codones que codifican diferentes aminoácidos también pueden cambiarse, en los que uno o más codones que codifican diferentes aminoácidos pueden alterarse simultáneamente ya que se adaptaría mejor a un huésped particular (por ejemplo, pueden optimizarse todos los codones para arginina, glicina, leucina y serina o cualquier combinación de los mismos).

También se proporcionan procedimientos para producir los polipéptidos del VRS de la presente invención en los que pueden usarse cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos y células huésped descritas en este documento. En una realización preferida, un procedimiento para producir un inmunógeno de la proteína G y fragmentos del mismo (que tiene al menos un epítope que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica, o provocando una reducida) comprende cultivar una célula huésped que contiene un vector de expresión de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de control de la expresión ligada operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de VRS tal como un inmunógeno de la proteína G del VRS y fragmento del mismo como se reivindica en este documento, en condiciones y durante un tiempo suficiente para la expresión del polipéptido.

En ciertas realizaciones se contemplan vacunas multivalentes. Por ejemplo, tales composiciones multivalentes pueden comprender una combinación de dos o más inmunógenos de la proteína G diferentes, o una combinación de uno o más inmunógenos de la proteína G con uno o más inmunógenos del VRS diferentes (tales como un inmunógeno de la proteína F o de la proteína M). La combinación de antígenos puede formularse como una mezcla (es decir, una mezcla de una pluralidad de inmunógenos diferentes), o la combinación puede ser una pluralidad de inmunógenos diferentes conjugados, ligados o fusionados juntos (químicamente o recombinantemente). Además, los inmunógenos fusionados pueden tener uno o más inmunógenos repetidos al menos una vez dentro de la proteína de fusión multivalente, reiteración que puede producirse en el extremo amino, el extremo carboxi, una posición interna de un polipéptido de inmunógeno multivalente seleccionado, en múltiples posiciones, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, tales inmunógenos del VRS híbridos multivalentes pueden comprender uno o más fragmentos de péptidos de la proteína G y uno o más fragmentos de péptidos de una proteína F o proteína M del VRS, y cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, tales composiciones de vacunas de inmunógenos del VRS híbridos multivalentes pueden combinar epítopes inmunogénicos de diferentes grupos antigénicos del VRS, por ejemplo, inmunógenos de los virus del subgrupo A (por ejemplo, Long y A2) o virus del subgrupo B (por ejemplo, CH-18537 y 8/60), o inmunógenos de ambos virus de los subgrupos A y B (o cualquier otro subgrupo del VRS que se encuentre para, por ejemplo, infectar a seres humanos).

En algunas realizaciones, los inmunógenos del VRS pueden ligarse mediante, por ejemplo, al menos dos aminoácidos codificados por una secuencia de ácidos nucleicos que es un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción, en los que los sitios de restricción pueden ser cualquiera o más de BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, KpnI, NcoI, NheI, PmlI, PstI, SalI, XhoI y similares. Los ligadores de aminoácidos adicionales también pueden añadirse sintéticamente, como se conoce en la técnica y se describe en este documento. Preferentemente, los aminoácidos adicionales no crean ninguna identidad en la secuencia que engloba un estiramiento de cinco aminoácidos de una proteína humana de manera que minimicen la posibilidad de producir anticuerpos de reactividad cruzada contra tejidos humanos. Además, los péptidos híbridos de la presente invención pueden comprender adicionalmente al menos un aminoácido del extremo carboxi adicional en el que el aminoácido adicional es un aminoácido D o L. Puede añadirse cualquiera de los veinte aminoácidos que se producen naturalmente o derivados de los mismos tales como cisteína, histidina, leucina y ácido glutámico. Por ejemplo, la adición de cisteína puede ser útil para unir (por ejemplo, enzimáticamente o mediante reticulación química) otros constituyentes tales como un lípido, una proteína portadora, una marca, una enzima y similares.

Como se describe en este documento, la invención también proporciona proteínas de fusión del inmunógeno del VRS que comprenden un inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo fusionado a una secuencia de polipéptidos funcional o no funcional adicional que permite, por ejemplo, la detección, el aislamiento y la purificación de las proteínas de fusión del polipéptido híbrido. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos funcional adicional puede ser una secuencia de marca que incluye proteínas de fusión que en ciertas realizaciones pueden detectarse, aislarse o purificarse mediante procedimientos de afinidad proteína-proteína (por ejemplo, receptor-ligando), afinidad por metales o afinidad de carga. En ciertas otras realizaciones, las proteínas de fusión de polipéptidos híbridos pueden detectarse mediante escisión de proteasas específicas de una proteína de fusión que tiene una secuencia que comprende una secuencia de reconocimientos de proteasas de forma que los péptidos híbridos pueden separarse de la secuencia de polipéptidos adicional. Además, los péptidos híbridos pueden prepararse sintéticamente incluyendo aminoácidos adicionales, una proteína portadora, una parte o resto hidrófobo (por ejemplo, un lípido) o una secuencia de marca que puede localizarse en el extremo amino, el extremo carboxi o en un sitio interno (no extremo) de la proteína de fusión. En realizaciones particularmente preferidas, por ejemplo, los inmunógenos del VRS recombinantes se fusionan en el marco a una marca, marca que puede ser una cualquiera de fosfatasa alcalina, tiorredoxina (Trx), \beta-galactosidasa, hexahistidina (6xHis), marca de epítope FLAG® (DYKDDDDK, SEQ ID NO:71), GST o similares, y cualquier combinación de las mismas.

Las realizaciones preferidas incluyen proteínas de fusión de polipéptidos híbridos que facilitan la detección de afinidad y el aislamiento de los péptidos híbridos y pueden incluir, por ejemplo, poli-His o los epítopes de péptidos antigénicos definidos descritos en la patente de EE.UU. nº 5.011.912 y en Hopp y col., (1988 Bio/Technology 6:1204), o la marca de epítope XPRESS^{TM} (DLYDDDDK, SEQ ID NO:72; Invitrogen, Carlsbad, CA) o tiorredoxina. La secuencia de afinidad puede ser una marca de hexa-histidina como se suministra por un vector. Por ejemplo, un pBAD/His (Invitrogen), un vector pET (Invitrogen) o un vector pQE (Qiagen, Valencia, CA) puede proporcionar una marca de polihistidina para la purificación de la fusión de proteínas maduras a partir de un huésped particular, tal como una bacteria, usando una columna de afinidad de níquel. Alternativamente, la secuencia de afinidad puede añadirse tanto sintéticamente como manipularse en los cebadores usados para generar recombinantemente la secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa) que codifica un péptido inmunogénico de VRS. Opcionalmente, cualquiera de los inmunógenos de la proteína G anteriormente mencionados y fragmentos o variantes de los mismos, y proteínas de fusión de los mismos, también pueden tener una parte hidrófoba (ancla o pie) que está conjugada, ligada o fusionada (químicamente o recombinantemente) al extremo amino o al extremo carboxi. Los restos hidrófobos representativos incluyen una secuencia de aminoácidos de al menos cinco aminoácidos tales como MFLLAVFYGG (SEQ ID NO:35) o GGYFVALLF (SEQ ID NO:36) o un lípido.

En ciertas realizaciones, los inmunógenos del VRS se fusionan a una marca de tiorredoxina o de polihistidina que están codificadas por una secuencia de ácidos nucleicos recombinante que codifica una proteína de fusión tal. En realizaciones preferidas, los fragmentos de inmunógeno de la proteína G del VRS se fusionan a una marca de tiorredoxina o de polihistidina que están codificadas por una secuencia de ácidos nucleicos como se expone en SEQ ID NOS: 25. Secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo de fragmentos de inmunógeno de la proteína G del VRS fusionadas a una marca de tiorredoxina o de polihistidina se exponen en SEQ ID NOS: 26. En realizaciones relacionadas se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión de inmunógeno de la proteína G del VRS que comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un resto hidrófobo o pie ligado o fusionado a la proteína de fusión del inmunógeno de G. Secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo de fragmentos de inmunógeno de la proteína G del VRS fusionados a una marca de tiorredoxina o de polihistidina, y que comprenden además una parte hidrófoba o pie se exponen en SEQ ID NOS: 30 y 34. En realizaciones preferidas, el resto hidrófobo es una secuencia de aminoácidos de MFLLAVFYGG (SEQ ID NO:35) fusionada al extremo amino de la proteína de fusión o GGYFVALLF (SEQ ID NO:36) fusionada al extremo carboxi de la proteína de fusión.

Una proteína de fusión puede comprender un resto hidrófobo fusionado al extremo amino o extremo carboxi de un inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo. Alternativamente, la proteína de fusión puede comprender una parte hidrófoba fusionada a un ligador (por ejemplo, uno o más aminoácidos, preferentemente dos o cuatro) que a su vez está fusionado al extremo amino o extremo carboxi de un inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo. En todavía otra realización, una proteína de fusión puede comprender un resto hidrófobo fusionado a una o más secuencias de aminoácidos (por ejemplo, una marca, tal como una tiorredoxina o una polihistidina) que a su vez está fusionada al extremo amino de un inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo, o una proteína de fusión puede comprender una o más secuencias de aminoácidos (por ejemplo, una marca, tal como una tiorredoxina o una polihistidina) fusionadas al extremo amino de un inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo que a su vez está fusionado a una parte hidrófoba. Como será apreciado por aquellos expertos en la materia, una proteína de fusión de la presente divulgación puede construirse para contener uno o más inmunógenos de la proteína G o fragmentos y variantes de los mismos, uno o más ligadores, una o más secuencias de marcas de aminoácidos adicionales, una o más partes hidrófobas, o cualquier combinación de los mismos.

Formulaciones terapéuticas y procedimientos de uso

Esta descripción también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen uno o más inmunógenos del VRS que pueden usarse para provocar una respuesta inmunitaria sin la respuesta inmunopatológica concomitante o al menos una respuesta inmunopatológica reducida. Esta descripción se refiere además a procedimientos para tratar y prevenir infecciones por VRS mediante la administración a un sujeto de un inmunógeno de la proteína G o fragmento y variantes del mismo, proteína de fusión, inmunógeno multivalente, o una mezcla de tales inmunógenos a una dosis suficiente para producir anticuerpos específicos para VRS, como se describe en este documento. Los inmunógenos de la proteína G o fragmentos y variantes de los mismos, o una mezcla de tales inmunógenos, son preferentemente parte de una composición farmacéuticamente aceptable cuando se usa en los procedimientos de la presente invención.

A modo de antecedentes, la infección natural o experimental de un animal o sujeto humano no parece provocar una respuesta inmunitaria de CTL CD8^{+} que reconoce la proteína G, mientras que a diferencia la proteína F no provoca una respuesta inmunitaria de CTL CD8^{+}. Por consiguiente, se espera una vacuna de antígeno del VRS compuesta por G más F de la presente descripción para provocar tanto una respuesta inmunitaria protectora de CD4^{+} como de CD8^{+} sin provocar una respuesta linfocítica proliferativa inmunopatológica, o provocando una reducida, siendo una respuesta tal perjudicial o de otro modo no deseada. Además, el uso de componentes basados en la tecnología de los proteosomas combinados con antígeno(s) del VRS puede influir en un desplazamiento en la respuesta inmunitaria fomentada para un antígeno del VRS de una respuesta predominantemente de tipo 2 hacia una respuesta de tipo 1 preferencial (como se determina por los perfiles de citocinas conocidos por aquellos expertos en la materia), y así eliminar o reducir de una manera estadísticamente significativa una respuesta eosinófila no deseada, una respuesta de IgE no deseada, o ambas, tras la inmunización con una vacuna o composición farmacéutica de la presente descripción. Por ejemplo, combinando uno o más epítopes inmunogénicos de CD8^{+} de clase I del CHM de la proteína F del VRS con uno o más epítopes inmunogénicos de clase II de CD4^{+} del CHM contenidos en la proteína G del VRS.

Como se conoce en la técnica, el patrón de expresión de citocinas y la activación de linfocitos CD4^{+} en el momento de la primera exposición a un antígeno del VRS influye el patrón de respuestas inmunitarias a exposiciones posteriores. Por tanto, junto con la protección de enfermedad respiratoria y eosinofilia, las composiciones inmunogénicas de la presente solicitud pueden demostrar ser útiles en la protección contra el asma infantil asociado a una infección por VRS. En una realización preferida, por ejemplo, una vacuna de la presente invención puede provocar una respuesta inmunitaria que protege de o modera de otra forma las consecuencias patológicas de una infección por VRS, mientras que al
mismo tiempo o destruye o disminuye de otra forma una posterior respuesta de anticuerpos IgE a alérgenos comunes.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende un inmunógeno de G del virus respiratorio sincicial o fragmento del mismo como se reivindica en este documento formulado con un proteosoma o un liposoma. Una realización es un inmunógeno de la proteína G que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:2 o que está constituida por SEQ ID NO:2. En otras realizaciones preferidas son inmunógenos de la proteína G que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOS:6. Preferentemente, los liposomas formulados para contener uno o más inmunógenos del VRS comprenden además lípidos de Deinococcus radiodurans o \alpha-galactosilfosfotidilglicerolalquilamina. La adición de tales lípidos a un liposoma puede potenciar la eficacia de una composición de vacuna contra el VRS, aumentando la inmunidad protectora y suprimiendo la eosinofilia perjudicial (véase, por ejemplo, Huang y Anderson, Vaccine 20:1586, 2002).

Los inmunógenos del virus respiratorio sincicial de la presente invención pueden incluir adicionalmente un resto hidrófobo covalentemente unido. Un resto hidrófobo puede ser, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos o un lípido, como se desvela en la patente de EE.UU. nº 5.726.292. En ciertas realizaciones, el resto hidrófobo es una secuencia de aminoácidos de MFLLAVFYGG (SEQ ID NO:35) fusionada al extremo amino de un inmunógeno o GGYFVALLF (SEQ ID NO:36) fusionado al extremo carboxi de un inmunógeno. La proteína G del VRS que se produce naturalmente contiene una secuencia de aminoácidos transmembrana hidrófoba que puede hacer de resto hidrófobo según la presente invención. En una realización, una composición de VRS (por ejemplo, una composición de vacuna) de la presente solicitud comprende un inmunógeno de la proteína G del VRS o fragmento del mismo como se describe en este documento formulado con un proteosoma o una protolina. Cuando se formula con un proteosoma o una protolina, los inmunógenos de la proteína G comprenden preferentemente además un resto hidrófobo que puede estar compuesto por una secuencia de aminoácidos hidrófoba o un lípido (como se usa en este documento, lípido se refiere a una característica de solubilidad y, por tanto, incluye alquilos, arilalquilos, arilos, ácidos grasos, glicéridos y éteres de glicerilo, fosfolípidos, esfingolípidos, alcoholes de cadena larga, esteroides, vitaminas y similares). En ciertas realizaciones, los inmunógenos de la proteína G, con o sin un resto hidrófobo, pueden contener adicionalmente una segunda secuencia de aminoácidos para formar una fusión, siendo la segunda secuencia de aminoácidos una marca, vehículo, enzima o una combinación de los mismos, como se describe en este documento. Otra vacuna preferida contra el VRS de la presente invención puede comprender un polipéptido del VRS no infeccioso o fragmento del mismo que es sumamente inmunogénico y que puede inmunoneutralizar el crecimiento del virus. En realizaciones preferidas de la presente invención, una vacuna de subunidad del VRS tal tiene efectos secundarios inmunopatológicos reducidos o deseados (por ejemplo, eosinofilia o asma) en un sujeto vacunado tal como un ser humano o animal.

La composición farmacéutica incluirá preferentemente al menos uno de un vehículo, soporte, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, además de uno o más inmunógenos del VRS o proteína de fusión de los mismos y, opcionalmente otros componentes. Por ejemplo, los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para uso con una composición de un inmunógeno de la proteína G o proteína de fusión del mismo, o mezcla de dos o más inmunógenos de la proteína G o proteínas de fusión de los mismos, o mezcla de inmunógenos G, F y M o proteínas de fusión de los mismos, pueden incluir, por ejemplo, un espesante, un agente de tamponamiento, un disolvente, un humectante, un conservante, un agente quelante, un adyuvante y similares, y combinaciones de los mismos.

Adyuvantes a modo de ejemplo incluyen alumbre (hidróxido de aluminio, REHYDRAGEL®), fosfato de aluminio, adyuvante de proteosoma con LPS (protolina) o sin LPS (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.726.292 y 5.985.284 y las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. nº 2001/0053368 y US 2003/0044425), virosomas, liposomas con y sin lípido A, Detox (Ribi/Corixa), MF59 u otros adyuvantes de tipo emulsiones de aceite y agua tales como nanoemulsiones (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.716.637) y emulsiones submicrométricas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.961.970), y adyuvante de Freund completo e incompleto. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son muy conocidos en la técnica farmacéutica y como se describen en este documento y, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R Gennaro, ed., 18^{a} edición, 1990) y en CRC Handbook of Food, Drug, and Cosmetic Excipients, CRC Press LLC (S.C. Smolinski, ed., 1992).

En ciertas realizaciones, los inmunógenos de la proteína G y fragmentos o variantes de los mismos (incluyendo proteínas de fusión y composiciones multivalentes) se formulan con proteosoma. Como se usa en este documento, "proteosoma" o "Projuvant" se refiere a preparaciones de proteínas de membrana externa (PME, también conocidas como porinas) de bacterias gram-negativas tales como especies Neisseria (véase, por ejemplo, Lowell y col., J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lowell y col., Science 240:800, 1988; Lynch y col., Biophys. J. 45:104, 1984; Lowell, en "New Generation Vaccines" 2ª ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, página 193, 1997; la patente de EE.UU. nº 5.726.292; la patente de EE.UU. nº 4.707.543), que son útiles como vehículo o un adyuvante para inmunógenos tales como antígenos bacterianos o virales. Los proteosomas son hidrófobos y seguros para uso humano y comparables en tamaño a ciertos virus. Los proteosomos tienen la interesante capacidad de autoensamblarse en vesículas o agrupaciones de PME similares a vesículas de 20-800 nm, y de incorporarse, coordinarse, asociarse (por ejemplo, electrostáticamente o hidrófobamente) o cooperar de otro modo no covalentemente con antígenos de proteína (Ag), particularmente antígenos que tienen un resto hidrófobo. Cualquier procedimiento de preparación que dé como resultado el componente de proteína de la membrana exterior en forma vesicular o similar a vesículas, que incluye estructuras membranosas multimoleculares o composiciones de PME similares a glóbulos fundidos de una o más PME, se incluye dentro de la definición de proteosoma. Los proteosomas pueden prepararse, por ejemplo, como se describe en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.726.292 ó 5.985.284).

En ciertas realizaciones, los inmunógenos de la proteína G y fragmentos o variantes de los mismos (incluyendo proteínas de fusión y composiciones multivalentes) se formulan con protolina. Como se usa en este documento, "proteosoma:LPS" o "protolina" (también conocida como "IVX-908") se refiere a preparaciones de Projuvant mezclado como se describe en este documento con al menos un tipo de liposacárido para proporcionar una composición de PME-LPS (que puede hacer de una composición inmunoestimulante). Por tanto, el adyuvante de PME-LPS puede estar constituido por dos de los componentes básicos de protolina que incluyen (1) una preparación de proteína de membrana externa de proteosomas (es decir, Projuvant) preparada a partir de bacterias gram-negativas tales como Neisseria meningitides, y (2) una preparación de uno o más liposacáridos. También se contempla que los componentes de protolina puedan ser o incluir lípidos, glicolípidos, glucoproteínas, moléculas pequeñas o similares. La protolina puede prepararse, por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2003/0044425.

Projuvant se usa generalmente conjuntamente con antígenos (que se producen naturalmente o modificados) que poseen un resto hidrófobo o parte que se produce naturalmente, modificado o complementario (también denominado en lo sucesivo un "pie" o "ancla"). La protolina (que contiene LPS exógenamente añadido) también puede usarse con un antígeno que no contiene un dominio de pie hidrófobo y que puede ser de naturaleza ampliamente hidrófila. La protolina puede mezclarse o combinarse con un antígeno que contiene un pie hidrófobo, un antígeno que carece de un pie hidrófobo, o con una combinación de antígenos que tienen y que no tienen una parte hidrófoba o pie.

Como se usa en este documento, "liposacárido" (tal como el usado en la preparación de protolina) se refiere a lipopolisacárido o lipooligosacárido nativo (aislado o preparado sintéticamente con una estructura nativa) o modificado (también denominado conjuntamente en lo sucesivo "LPS") derivado de bacterias gram-negativas tales como Shigella flexneri o Plesiomonas shigelloides, u otras bacterias gram-negativas (incluyendo Alcaligenes, Bacteroides, Bordetella, Borrellia, Brucella, Campylobacrer, Chlamydia, Citrobacter, Edwardsiella, Ehrlicha, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Gardnerella, Hemophillus, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Leptospira (incluyendo Leptospira interrogans), Moraxella, Morganella, Neiserria, Pasteurella, Proteus, Providencia, otras Plesiomonas, Porphyromonas (incluyendo Porphyromonas gingivalis), Prevotella, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Serratia, otras especies de Shigella, Spirillum, Veillonello, Vibrio o Yersinia). El liposacárido puede estar en una forma desintoxicada (es decir, que tiene quitado el núcleo del lípido A) o puede estar en una forma que no ha sido desintoxicada. En la presente divulgación, el liposacárido no necesita estar desintoxicado y preferentemente no está.

Los dos componentes de un adyuvante de PME-LPS pueden formularse a relaciones iniciales específicas para optimizar la interacción entre los componentes dando como resultado la asociación estable y la formulación de los componentes para uso en la preparación de una composición inmunogénica de la invención. El procedimiento implica generalmente la mezcla de componentes en una disolución de detergente seleccionada (por ejemplo, Empigen® BB, Triton® X-100 o Mega-10) y luego efectuar la complejación de los componentes de PME y LPS mientras que se reduce la cantidad de detergente hasta una concentración predeterminada preferida mediante diálisis o, preferentemente mediante metodologías de diafiltración/ultrafiltración. La mezcla, la coprecipitación o la liofilización de los dos componentes también pueden usarse para efectuar una asociación o formulación adecuada y estable. En una realización preferida, una composición inmunogénica comprende uno o más inmunógenos de la proteína G y un adyuvante, en la que el adyuvante comprende un Projuvant (es decir, proteosoma) y liposacárido.

En ciertas realizaciones, el contenido de liposacárido final en peso como porcentaje de la proteína de proteosoma total puede estar en un intervalo de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 500%, más preferentemente en un intervalo de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 200%, o en un intervalo de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 150%. Otra realización incluye un adyuvante en el que los proteosomas se preparan a partir de Neisseria meningitides y el liposacárido se prepara a partir de Shigella flexneri o Plesiomonas shigelloides, y el contenido de liposacárido final está entre el 50% y el 150% de la proteína de proteosoma total en peso. En otra realización, los proteosomas se preparan con contenido de lipooligosacárido endógeno (LOS) que oscila de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 5% de PME total. Otra realización de la presente invención proporciona proteosomas con liposacárido endógeno en un intervalo de aproximadamente el 12% a aproximadamente el 25%, y en una realización preferida entre aproximadamente el 15% y aproximadamente el 20% de PME total. La presente divulgación también proporciona una composición que contiene liposacárido derivado de cualquier especie de bacterias gram-negativas que puede ser de las mismas especies de bacterias gram-negativas que es la fuente de proteosomas o es una especie bacteriana diferente.

En ciertas realizaciones, la relación de proteosoma o protolina respecto a inmunógeno de la proteína G en la composición inmunogénica es superior a 1:1, superior a 2:1, superior a 3:1 o superior a 4:1. La relación puede ser de hasta 8:1 o superior. En otras realizaciones, la relación de proteosoma o protolina respecto al antígeno de coronavirus de la composición inmunogénica oscila de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:500, preferentemente la relación es al menos 1:5, al menos 1:10, al menos 1:20, al menos 1:50 o al menos 1:100. Una ventaja de las relaciones de protolina:inmunógeno de la proteína G que oscilan de 1:2 a 1:200 es que la cantidad de adyuvante basado en proteosoma puede reducirse espectacularmente sin efecto significativo sobre la capacidad de un inmunógeno de la proteína G para provocar una respuesta inmunitaria.

Como se usa en este documento, "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales de los compuestos de la presente invención derivadas de la combinación de tales compuestos y un ácido orgánico o inorgánico (sales de adición de ácido) o una base orgánica o inorgánica (sales de adición de base). Los compuestos de la presente invención pueden usarse tanto en formas de base libre como de sal, considerándose ambas formas dentro del alcance de la presente invención.

Además, la composición farmacéutica de la presente invención puede incluir adicionalmente un diluyente o excipiente tal como agua o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Preferentemente, un diluyente o excipiente es PBS con un intervalo de concentración de fosfato final de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1 M, más preferentemente de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 500 mM, incluso más preferentemente de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, y lo más preferentemente de aproximadamente 2,5 mM a aproximadamente 10 mM; y los intervalos de concentración de sal finales de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM y lo más preferentemente de aproximadamente 125 mM a aproximadamente 175 mM. Preferentemente, la concentración de PBS final es aproximadamente fosfato 5 mM y aproximadamente sal 150 mM (tal como NaCl). En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación que comprenden cualquiera de los inmunógenos del VRS descritos en este documento o mezclas de inmunógenos del VRS son estériles.

Las composiciones pueden ser estériles tanto preparándolas bajo un entorno aséptico como esterilizándolas terminalmente usando procedimientos disponibles en la técnica. Muchos productos farmacéuticos se preparan para ser estériles y este criterio está definido por la USP XXII <1211>. La esterilización en esta realización puede llevarse a cabo por varios medios aceptados en la industria y enumerados en la USP XXII <1211> que incluyen esterilización con gas, radiación ionizante o filtración. La esterilización puede mantenerse por lo que se llama el procesamiento aséptico también definido en la USP XXII <1211>. Los gases aceptables usados para la esterilización con gases incluyen óxido de etileno. Los tipos de radiación aceptables usados para procedimientos de radiación ionizante incluyen gamma, por ejemplo de una fuente de cobalto 60 y haz de electrones. Una dosis típica de radiación gamma es 2,5 MRad. Cuando sea apropiado, la filtración puede llevarse a cabo usando un filtro con un tamaño de poro adecuado, por ejemplo 0,22 \mum, y de un material adecuado, por ejemplo Teflon®. El término "USP" se refiere a la Farmacopea de EE.UU. (véase www.usp.org; Rockville, MD).

La presente descripción también se refiere a procedimientos para tratar o prevenir infección por VRS que comprenden administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende al menos un inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial o fragmento del mismo como se reivindica en este documento y vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable a una dosis suficiente para provocar una respuesta inmunitaria específica para uno o más inmunógenos de la proteína G o fragmento de los mismos. En ciertas realizaciones, una infección es debida a un subgrupo A, subgrupo B, o ambos subgrupos A y B del VRS. En ciertas realizaciones preferidas, los inmunógenos de la proteína G usados en cualquiera de las composiciones y procedimientos descritos en este documento tienen una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NOS:6.

La presente descripción también se refiere a procedimientos para reducir el riesgo de una respuesta inmunopatológica asociada a infección por VRS que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición que comprende al menos un inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial o fragmento del mismo como se reivindica en este documento y vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable a una dosis suficiente para provocar una respuesta inmunitaria específica para uno o más inmunógenos de la proteína G o fragmento de los mismos. En ciertas realizaciones, una infección es debida a un subgrupo A, subgrupo B, o ambos subgrupos A y B del VRS. En ciertas realizaciones preferidas, los inmunógenos de la proteína G usados en cualquiera de las composiciones y procedimientos descritos en este documento tienen una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NOS:6.

Un sujeto adecuado para el tratamiento con una formulación de inmunógeno del VRS puede identificarse mediante indicadores de riesgo bien establecidos para el desarrollo de una enfermedad o distintivos bien establecidos de una enfermedad existente. Por ejemplo, indicadores de una infección incluyen fiebre, pus, cultivos positivos para microorganismos, inflamación y similares. Las infecciones que pueden tratarse o prevenirse con una vacuna de inmunógeno del VRS de la presente invención incluyen las producidas por o debidas al VRS, tanto la infección es primaria como secundaria, oportunista o similares. Ejemplos del VRS incluyen cualquier subtipo, cepa, variante antigénica y similares de estos virus. Para fines preventivos, por ejemplo, ciertos factores de riesgo conocidos para adquirir una infección por VRS incluyen nacimiento prematuro, niños con enfermedad pulmonar crónica, niños que van a guarderías infantiles, presencia de hermanos en edad escolar en el hogar, exposición al humo pasivo en el hogar y sujetos inmunocompetentes (adulto y niños).

Las composiciones farmacéuticas que contienen uno o más inmunógenos del VRS de la presente descripción pueden estar en cualquier forma que permita que la composición se administre a un sujeto tal como un ser humano o animal. Por ejemplo, pueden prepararse composiciones de inmunógeno de la proteína G, de proteína de fusión y multivalentes de la presente descripción y administrarse como una disolución líquida o prepararse como una forma sólida (por ejemplo, liofilizada) que puede administrarse en forma sólida, o resuspenderse en una disolución conjuntamente con la administración. La composición de polipéptido híbrido se formula de manera que permita que los principios activos contenidos en ella estén biodisponibles con la administración de la composición a un sujeto o paciente o biodisponibles mediante liberación lenta. Las composiciones que se administrarán a un sujeto o paciente toman la forma de una o más unidades de dosificación en las que, por ejemplo, un comprimido puede ser una unidad de dosificación única, y un recipiente de uno o más compuestos de la invención en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación. En ciertas realizaciones preferidas, cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en este documento que comprenden un inmunógeno del VRS o mezcla de inmunógenos de la invención están en un recipiente, preferentemente en un recipiente estéril.

En una realización, la composición terapéutica se administra nasalmente, pudiendo captar las células, tales como las células localizadas en el tejido linfoide asociado nasal, una composición de inmunógeno del VRS o de mezcla de esta divulgación. Otras vías de administración típicas incluyen, sin limitación, enteral, parenteral, transdérmica/transmucosa, nasal e inhalación. El término "enteral" como se usa en este documento es una vía de administración en la que la composición inmunogénica se absorbe por el tracto gastrointestinal o la mucosa oral que incluye oral, rectal y sublingual. El término "parenteral" como se usa en este documento describes vías de administración que evitan el tracto gastrointestinal que incluyen inyección intraarterial, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, submucosa e intravaginal o técnicas de infusión. El término "transdérmica/transmucosa" como se usa en este documento es una vía de administración en la que la composición inmunogénica se administra por o mediante la piel, que incluye tópica. Los términos "nasal" e "inhalación" engloban técnicas de administración en las que una composición inmunogénica se introduce en el árbol pulmonar que incluye intrapulmonar o transpulmonar. Preferentemente, las composiciones de la presente invención se administran nasalmente.

En otra realización, las presentes composiciones que comprenden al menos un inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial o fragmento del mismo como se define en este documento pueden usarse en procedimientos profilácticos. Por ejemplo, una composición de inmunógeno del VRS o de mezcla de la invención puede administrarse a una madre durante la gestación para prevenir una infección por VRS en la madre y para proporcionar inmunidad pasiva al feto o recién nacido. Un procedimiento profiláctico puede comprender administrar a un primer sujeto una composición que comprende un inmunógeno del VRS y vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, seguido por administración a un segundo sujeto de una segunda composición que comprende al menos un inmunógeno del virus respiratorio sincicial en el que dicha primera composición comprende un inmunógeno del VRS diferente al que se administra al segundo sujeto y la segunda composición comprende al menos un inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial o fragmento del mismo como se define en este documento y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el inmunógeno de la proteína G tiene un epítope que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica, o provocando una reducida. En ciertas realizaciones, los inmunógenos de la proteína G para uso profiláctico pueden tener una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NOS:6.

Un primer sujeto representativo puede ser una madre durante la gestación y un segundo sujeto representativo puede ser el niño recién nacido de la madre. Cada composición se proporciona a una dosis suficiente para provocar una respuesta inmunitaria específica para uno o más inmunógenos del VRS (tales como inmunógenos de la proteína G descritos en este documento). Por ejemplo, sin desear ceñirse a la teoría, los inmunógenos de la proteína G y las composiciones de los mismos pueden administrarse sistémicamente (por ejemplo, intravenosamente) a la madre, lo que produciría anticuerpos IgG similares a los anticuerpos que ya tiene la madre debido a la exposición al VRS. Entonces, el niño recién nacido puede inmunizarse por la mucosa (por ejemplo, intranasalmente), lo que produciría anticuerpos IgA secretores - de ahí que los inmunógenos de la proteína G administrados por la mucosa no fueran detectados por los anticuerpos maternos sistémicos (IgG) que heredó el niño debido a que los anticuerpos IgG no estaban en la interfase mucosa. Es decir, los anticuerpos maternamente heredados no afectarán adversamente la respuesta de IgA provocada por la inmunización intranasal del niño. En ciertas realizaciones, las composiciones administradas pueden prevenir una infección debida a un subgrupo A, subgrupo B, o ambos subgrupos A y B del VRS. Un sujeto adecuado para el tratamiento con una formulación de inmunógeno del VRS puede identificarse por indicadores de riesgo bien establecidos para el desarrollo de una enfermedad o distintivos bien establecidos de una enfermedad existente como se describe en este documento y se conoce en la técnica. Las infecciones que pueden tratarse con un inmunógeno del VRS de la presente invención incluyen las producidas por o debidas al VRS, tanto si la infección es primaria como secundaria, oportunista o similares. Ejemplos del VRS incluyen cualquier cepa, subtipo, variante antigénica y similares de estos virus.

La divulgación proporciona una pluralidad de anticuerpos producidos mediante el procedimiento para prevenir una infección por VRS que comprende administrar a un sujeto una composición de la presente invención a una dosis suficiente para producir anticuerpos específicos para uno o más inmunógenos del VRS en el que dicho inmunógeno de la proteína G tiene un epítope que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica, o provocando una reducida. En una realización, los anticuerpos comprenden al menos una especie de anticuerpos de un subgrupo A del VRS, o un subgrupo B del VRS, o de ambos subgrupos A y B del VRS. En otra realización, un procedimiento para tratar o prevenir una infección por VRS comprende administrar a un sujeto una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, con o sin un adyuvante, y una pluralidad de anticuerpos de la presente invención.

En otro aspecto, los inmunógenos de la proteína G del VRS y fragmentos, variantes de los mismos de la presente invención se utilizan para producir anticuerpos específicos para al menos un epítope presente en los inmunógenos de la proteína G y fragmentos o variantes de los mismos proporcionados en este documento. Por consiguiente, la presente invención también proporciona tales anticuerpos. En realizaciones preferidas, los anticuerpos se unen a epítopes protectores específicos presentes en una proteína G del VRS. Dentro del contexto de la presente invención, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos anti-idiotípicos, fragmentos de los mismos tales como fragmentos F(ab')_{2} y Fab, y anticuerpos recombinantemente o sintéticamente producidos. Tales anticuerpos incorporan las regiones variables que permiten que un anticuerpo monoclonal se una específicamente, que significa que un anticuerpo puede unirse selectivamente a un péptido o polipéptido de una proteína G del VRS del subtipo A o B. "Específica para" se refiere a la capacidad de una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) para unirse selectivamente a un polipéptido o péptido codificado por una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína G del VRS del subtipo A o B, o una proteína G del VRS sintetizada del subtipo A o B, de esta invención. Asociación o "unión" de un anticuerpo a un antígeno específico implica generalmente interacciones electrostáticas, enlace de hidrógeno, interacciones de Van der Waals e interacciones hidrófobas. Uno cualquier de estos o cualquier combinación de los mismos puede desempeñar una función en la unión entre un anticuerpo y su antígeno. Un anticuerpo tal se asocia generalmente a un antígeno, tal como un inmunógeno de la proteína G, con una constante de afinidad (K_{a}) de al menos 10^{4}, preferentemente al menos 10^{5}, más preferentemente al menos 10^{6}, todavía más preferentemente al menos 10^{7} y lo más preferentemente al menos 10^{8}. Un experto en la materia puede determinar las constantes de afinidad usando técnicas muy conocidas (véase Scatchard, Ann. N.Y. Acad Sci. 51:660-672, 1949). Un experto en la materia puede determinar fácilmente la afinidad de un anticuerpo monoclonal o anticuerpo (véase Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949).

Además, el término "anticuerpo" como se usa en este documento incluye anticuerpos que se producen naturalmente, además de anticuerpos que no se producen naturalmente que incluyen, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, bifuncionales y humanizados, anticuerpos completamente humanos, además de fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Tales anticuerpos que no se producen naturalmente pueden construirse usando síntesis de péptidos en fase sólida, pueden producirse recombinantemente o pueden obtenerse, por ejemplo, cribando bibliotecas combinatorias constituidas por cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (Huse y col., Science 246:1275-1281 (1989)). Estos y otros procedimientos de preparación de, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, injertados en CDR, de cadena sencilla y bifuncionales son muy conocidos en la técnica (Winter y Harris, Immunol. Today 14:243, 1993; Ward y col., Mature 341:544, 1989; Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1992; Borrabeck, Antibody Engineering, 2ª ed., Oxford Univ. Press, 1995; Hilyard y col., Protein Engineering: A practical approach, IRL Press, 1992).

Los anticuerpos policlonales pueden ser fácilmente generados por un experto en la materia a partir de una variedad de animales de sangre caliente que incluyen caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, pavos, conejos, ratones o ratas. Brevemente, el inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo deseado, o mezclas de inmunógenos del VRS, o variantes de los mismos, se administran para inmunizar un animal mediante inyecciones parenterales, intraperitoneales, intramusculares, intraoculares o subcutáneas. La inmunogenicidad del polipéptido híbrido de interés puede aumentar mediante el uso de un adyuvante tal como alumbre y adyuvante de Freund completo o incompleto. Tras varias inmunizaciones de refuerzo durante un periodo de semanas se recogen pequeñas muestras de suero y se prueban para la reactividad con el inmunógeno deseado. Una vez el título del animal ha alcanzado una meseta en términos de su reactividad respecto a un inmunógeno de la proteína G de la invención, fácilmente podrán obtenerse mayores cantidades de suero inmunológico policlonal bien mediante sangrados semanales o mediante exangüe del animal.

Los inmunógenos del VRS de la presente invención pueden identificarse fácilmente usando ensayos in vitro e in vivo conocidos en la técnica y como se describen en este documento. Los ensayos representativos se describen en los ejemplos. Similarmente, están disponibles varios ensayos como se describe en este documento para examinar la actividad de los anticuerpos producidos por los inmunógenos del VRS de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de proteosomas

Los inmunógenos de la presente invención pueden formularse con proteosomas a modo de interacciones no covalentes para formar una composición de vacuna que pueda provocar una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto humano o animal inmunizado. Los proteosomas de la presente solicitud son vehículos de administración de adyuvante mucoso que comprenden proteínas de membrana externa purificadas de, por ejemplo, Neisseria meningitides de tipo 2 del grupo B. El uso de proteosomas para la formulación de vacunas se ha revisado por Lowell, G. H., en "New Generation Vaccines" 2ª ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong (1997) páginas 193-206. Los proteosomas de la presente invención pueden prepararse mediante extracción de pasta bacteriana destruida en fenol con una disolución de Empigen BB al 6% (EBB) (Albright and Wilson, Whithaven, RU) en cloruro de calcio 1 M seguido por precipitación con etanol, solubilización en EBB-Tris al 1%/solución salina de EDTA y luego precipitación con sulfato de amonio. Los precipitados se resolubilizan en tampón de EBB al 1%, se dializan y se guardan en EBB al 0,1% a -70ºC. Pueden usarse procedimientos alternativos en la preparación de proteosomas, por ejemplo, los proteosomas pueden prepararse omitiendo la etapa de precipitación de sulfato de amonio para acortar el procedimiento. La preparación de proteosomas se desvela en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2001/0053368 y en la patente de EE.UU. nº 6.476.201 B1.

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Ejemplo 2 Preparación de liposomas

Los inmunógenos de la presente invención pueden combinarse no covalentemente con liposomas como una composición de vacuna que puede provocar una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto humano o animal inmunizado. Los inmunógenos pueden encapsularse con liposomas multilaminares según procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia usando, por ejemplo, un procedimiento de reconstitución acoplado a deshidratación (Kirby y Gregoriadis, Biotechnology 2:979, 1984). Brevemente, los liposomas se preparan mediante sonicación de dioleoilfosfatidilcolina (DOPC/colesterol, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; 5:1, peso/peso) a un concentración final de lípidos de 30 mg/ml en PBS o generando liposomas usando lípidos de Deinococcus radiodurans o (\alpha-galactosilfosfotidilglicerolalquilamina como se describe en Huang y Anderson, Vaccine 20:1586, 2002, en presencia o ausencia de antígeno. El liposoma, con o sin uno o más inmunógenos, se liofiliza y se resuspende en agua estéril. El inmunógeno que no se ha incorporado en liposomas puede eliminarse mediante lavado repetido y centrifugación (por ejemplo, microcentrifugación durante 1 min a 13.200 rpm) de los liposomas en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El contenido de proteínas de liposomas lavados, con y sin inmunógeno, se determina, por ejemplo, mediante SDS-PAGE cuantitativa teñida con plata usando cantidades calibradas de patrones de proteínas conocidos tales como albúmina de suero. El contenido de proteínas de los liposomas se determina y se ajusta según se desee, por ejemplo, el contenido de proteínas puede ajustarse a 0,3 mg por mg de lípido (como liposomas) por ml.

En algunos casos, para evaluar el modo en el que el antígeno de proteína interactúa con un liposoma, los liposomas que contienen alícuotas de inmunógenos de la proteína G y fragmentos de los mismos (tipo natural o mutante) pueden incubarse durante 1 hora a 37ºC en PBS con proteinasa K (GibcoBRL) a 1,0, 0,1 y 0,01 \mug/ml. Algunas incubaciones también pueden contener Triton X-100 al 1% para romper liposomas, permitiéndose así el acceso completo de la proteinasa K a las proteínas, proteínas de fusión o fragmentos de polipéptidos de las mismas. Las incubaciones terminan y las muestras se analizan por SDS-PAGE y tinción con plata. Tales procedimientos pueden usarse para determinar el grado de encapsulación de liposomas de la preparación de inmunógenos (por ejemplo, una o más proteínas virales).

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Ejemplo 3 Preparación de ácidos nucleicos y constructos de expresión que codifican inmunógenos de la proteína G y fragmentos de los mismos

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína G del VRS (cepa Long) correspondientes a los aminoácidos 128-229, además de, por ejemplo, las secuencias 128-229 mutantes, se amplificaron a partir de ARN viral mediante RT-PCR, y los productos de PCR resultantes se clonaron en los sitios EcoRI y XhoI de un plásmido de expresión bacteriana pET-32-LIC (Novagen, Madison, WI). La mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia de proteínas G128-229 del VRS se realizó según el protocolo de mutagénesis dirigida al sitio de Stratagene QuikChange®. Brevemente, la PCR se realizó en el ADN pET-32-LIC-G 128-229 de molde (la secuencia G128-229 se clonó en los sitios EcoRI y XhoI).

En estos experimentos, los pares de cebadores diseñados para la mutagénesis fueron del siguiente modo:

CCTGCTGGGCTGCCTGCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGG (SEQ ID NO:37) y CCTGGTTTTTTG
TTTGGTATTCTTTTGCAGGCAGCCCAGC AGG (SEQ ID NO:38) (para la G128-229, I185A mutante);

CTGCTGGGCTATCGCCAAAAGAATACCAAACAAAAAACCAGG (SEQ ID NO:39) y CCTGGTTTTTTG
TTTGGTATTCTTTTGGCGATAGCCCAGCAG (SEQ ID NO:40) (para la G128-229, C186A mutante);

CTGCTGGGCTATCTGCGCAAGAATACCAAACAAAAAACCAGG (SEQ ID NO:41) y CCTGGTTTTTTG
TTTGGTATTCTTGCGCAGATAGCCCAGCAG (SEQ ID NO:42) (para la G128-229, K187A mutante);

CTGCTGGGCTATCTGCAAAGCAATACCAAACAAAAAACCAGG (SEQ ID NO:43) y CCTGGTTTTTTG
TTTGGTATTGCTTTGCAGATAGCCCAGCAG (SEQ ID NO:44) (para la G128-229, R188A mutante);

CTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAGCACCAAACAAAAAACCAGG (SEQ ID NO:45) y CCTGGTTTTTT
GTTTGGTGCTCTTTTGCAGATAGCCCAGCAG (SEQ ID NO:46) (para la G128-229, I189A mutante);

CTGCTGGGCTATCTGCAAAAGAATAGCAAACAAAAAACCAGG (SEQ ID NO:47) y CCTGGTTTTTTG
TTTGCTATTCTTTTGCAGATAGCCCAGCAG (SEQ ID NO:48) (para la G128-229, P190A mutante);

CTGCAAAAGAATACCAGCCAAAAAACCAGGAAAGAAAACCACC (SEQ ID NO:49) y GGTGGTTTTCT
TTCCTGGTTTTTTGGCTGGTATTCTTTTGCAG (SEQ ID NO:50) (para la G128-229, N191A mutante);

CTGGGCTATCTGCAAAAGAATACCAAACGCAAAACCAGGAAAG (SEQ ID NO:51) y CTTTCCTGGTT
TTGCGTTTGGTATTCTTTTGCAGATAGCCCAG (SEQ ID NO:52) (para la G128-229, K 192A mutante);

GCAAAAGAATACCAAACAAAGCACCAGGAAAGAAAACCACCAC (SEQ ID NO:53) y GTGGTGGTTT
TCTTTCCTGGTGCTTTGTTTGGTATTCTTTTGC (SEQ ID NO:54) (para la G128-229, K193A mutante).

Las proteínas de fusión de tiorredoxina (Trx) que contenían fragmentos de la proteína G del VRS de tipo natural, y los mutantes anteriores, se prepararon como se describe en el Ejemplo 4.

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Ejemplo 4 Producción de inmunógenos de la proteína G y fragmentos de los mismos

Los inmunógenos de la proteína G del VRS pueden prepararse como composiciones farmacéuticas mediante mezcla con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, las secuencias de la proteína G del VRS descritas en este documento y codificadas por el ácido nucleico contenido en los plásmidos pET-32-LIC modificados se expresaron como proteínas de fusión de tiorredoxina (Trx) en células BL21/DE3 de E. coli transformadas tras la inducción con IPTG. Todas las proteínas de fusión de Trx se recuperaron de sedimentos transformados de células mediante extracción con urea 8 M, seguido por purificación de afinidad usando TALON® (Clontech, Palo Alto, CA) y diálisis contra PBS. Los polipéptidos Trx-G128-229 purificados se liberaron de la endotoxina contaminante mediante tratamiento con perlas de polimixina B (BioRad, Mississauga, ON, Canadá). Los detalles y las modificaciones de este procedimiento son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Con el uso para inmunización, los inmunógenos pueden combinarse adicionalmente o mezclarse con un adyuvante, tal como alumbre o un adyuvante basado en proteosoma.

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Ejemplo 5 Preparación del VRS

El VRS (cepa Long) se obtuvo de la Colección americana de cultivos tipo y se propagó en células HEp-2 cultivadas en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) que contenía penicilina G (100 U/ml) y sulfato de estreptomicina (100 ug/ml) y complementado con 1% de suero (suero bovino fetal/suero bovino, 1:3). Las células y los virus se verificaron negativos para la contaminación por micoplasma mediante el ensayo de PCR (Colección americana de cultivos tipo). Como se describe en este ejemplo, los cultivos de monocapa confluentes de células HEp-2 se inocularon con VRS (cepa Long) a una multiplicidad de infección (MOI) de 1, se adsorbieron 90 min a 4ºC, se lavaron y se incubaron a 37ºC en medio RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO) complementado con 1% de suero bovino fetal (Sigma, St. Louis, MO). Los cultivos se recogieron después de 24-30 h, momento en el que las monocapas de células estaban casi completamente fusionadas; los virus se desprendieron de las células mediante ruptura con una espátula de teflón de mano (Gibco-BRL) y el residuo celular se eliminó por microcentrifugación durante 5 min a 13.000 x g. El sobrenadante se usó como fuente de virus para los estudios de exposición de ratón (véase el Ejemplo 6).

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Ejemplo 6 Inmunización de ratones

Todas las inmunizaciones se realizaron usando ratones BALB/c (Charles River, Ste. Constance, QC, Canadá), que se anestesiaron con ketamina (2,3 mg/ratón; Bimeda-MTC Pharmaceuticals, Cambridge, ON, Canadá) y xilazina (0,5 mg/ratón; Bayer, Toronto, ON, Canadá). Para los experimentos de vacuna/exposición, grupos de siete a nueve ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) se inmunizaron dos veces subcutáneamente, a intervalos de 14 días, con PBS/alumbre, proteínas Trx-G 128-229 o Trx-G 128-229 mutantes, en PBS/alumbre (10 \mu de proteína en un volumen de 50 \mul). Catorce días después de la segunda dosis, los ratones se expusieron intranasalmente al VRS (2 x 10^{6} pfu en 50 \mul). Los ratones se sacrificaron cuatro días después usando pentobarbital de sodio y se ensayaron para los títulos virales pulmonares y la infiltración de leucocitos en fluidos broncoalveolares según procedimientos muy conocidos para una persona experta en la materia.

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Los análisis de inmunotransferencia demostraron que los anticuerpos de suero fomentados frente a los aminoácidos 128-229 de la proteína G del VRS pudieron reconocer específicamente la proteína G del VRS en ratones inmunizados con proteínas Trx-G 128-229 de tipo natural o mutante (Fig. 1). Los extractos de células HEp-2 infectadas por el VRS se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas (por ejemplo, membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF)). Las membranas que contenían proteína transferida se bloquearon (para prevenir interacciones no específicas) con 4% de leche desnatada y 0,5% de caseína (calidad Hammerstein) en TBST (NaCl al 0,8%, Tween-20 al 0,1%, Tris 20 mM, pH 7,6) mediante incubación durante la noche a temperatura ambiente. Entonces, las membranas bloqueadas se incubaron con muestras de suero, se lavaron con TBST, seguido por incubación de 1 hora con anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) y entonces la señal se detectó usando diaminobencidina (DAB; 1 mg/ml, NiCl2 al 0,03% y H2O2 al 0,1%, según procedimientos conocidos en la técnica. Se observó una fuerte respuesta del anticuerpo (IgG) específico de la proteína G con proteínas de tipo natural y mutantes N191A. Se observó muy poca señal específica de anticuerpos de la proteína G del VRS en sueros obtenidos a partir de ratones inmunizados con proteínas de fusión de polipéptidos de G del VRS mutantes I185A o K187A. El resto de las proteínas mutantes Trx-G 128-229 indujeron niveles intermedios de anticuerpos específicos de G del VRS (Fig. 1).

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Ejemplo 7 Exposición del VRS de ratones inmunizados

En estos experimentos, los ratones se inmunizaron (como se describe en el ejemplo 6) tanto con Trx-G 128-229 de tipo natural como con uno de cada uno de los 9 mutantes y luego se expusieron al VRS. La inducción de eosinofilia se determinó según procedimientos descritos en Mader y col. Vaccine 18:1110, 2000. Como se muestra en la figura 2A, la Trx-G128-229 de tipo natural y diversos mutantes individuales protegieron a los ratones de la exposición al VRS a grados variables. Comparativamente, la Trx-G128-229 mutada en N191A proporcionó mejor protección que los mutantes P190A, R188A y I189A. Las proteínas mutantes Trx-G128-229 restantes confirieron niveles intermedios de protección. Además, comparativamente, los mutantes R188A y N191A demostraron el mayor nivel de protección. Este sorprendente resultado indica que una única mutación puntual en una proteína G puede dar como resultado un polipéptido que puede provocar una respuesta inmunitaria protectora concomitantemente a una respuesta inmunopatológica más reducida (por ejemplo, eosinofilia pulmonar).

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Ejemplo 8 Ensayo de neutralización del VRS

En estos experimentos se mezclaron alícuotas del VRS pretitulado con muestras seriadamente diluidas de sueros de ratones individuales y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. El suero de los ratones individuales se recogió 14 días después de la segunda de las dos administraciones subcutáneas de un inmunógeno en alumbre, como se describe en el Ejemplo 6. Los sueros se ensayaron para anticuerpos neutralizantes del VRS mediante ensayo de reducción en placas. Las mezclas se aplicaron por duplicado a placas de 24 pocillos que contenían el 60-80% de monocapas confluentes de células HEp-2, se adsorbieron durante 90 minutos a 4ºC, seguido por el lavado y la incubación de las placas durante 40 h a 37ºC en 1 ml de medio RPMI complementado con 1% de suero bovino fetal. Después de la incubación, las monocapas se fijaron con formaldehído al 15% y se tiñeron con cristal violeta al 0,01% para la visualización de placas virales. La reducción en placas se calcula como el título de neutralización por reducción en placas_{50} (PRNT_{50}), que es la dilución recíproca de sueros requeridos para neutralizar el 50% de las placas del VRS sobre una monocapa subconfluente de células HEp-2.

Los resultados de un ensayo de reducción en placas del VRS se muestran en tabla 1. Los títulos de neutralización del VRS en sueros de ratones inmunizados mostraron una fuerte dependencia de las respuestas de anticuerpos neutralizadores con la secuencia de aminoácidos dentro de la región 185-193 de la proteína Trx-G128-229 usada para la inmunización (similares a los resultados de inmunización del ejemplo 6).

TABLA 1 Títulos de neutralización de sueros de ratones inmunizados con proteínas variantes Trx-G

1

Ejemplo 9 Respuesta de ARNm de citocinas a variantes de proteína G del VRS

Los niveles ARNm de citocinas en pulmones de ratones inmunizados con diversas variantes de proteína G del VRS se midieron usando un ensayo de protección de ribonucleasas que puede ser un indicador de si resultará una respuesta eosinófila perjudicial. Un lóbulo de cada pulmón de ratón se almacenó a -20ºC en disolución RNAlater^{TM} (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá) y posteriormente se procesó para una extracción de ARN usando el minikit RNeasy® (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá). El ARN se cuantificó y se sometió a ensayo de protección de ribonucleasas (RPA) usando un kit de transcripción (BD-Pharmingen, Mississauga, ON, Canadá) para sintetizar la sonda a partir de un molde de citocina (MCK-1) (BD-Pharmingen, Mississauga, ON, Canadá), se radiomarcó usando \alpha-^{32}P [UTP] y se siguió por hibridación y digestión con RNasa usando un kit RPAIII kit (Ambion, Austin, TX). Las mezclas de reacción se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 5%-urea 8 M según las instrucciones del fabricante seguido por secado y autorradiografía a -70ºC usando una pantalla intensificadora.

Los resultados del RPA ilustraron diferencias sorprendentes entre los ratones inmunizados con proteínas Trx-G de tipo natural o mutantes y posteriormente se expusieron al VRS (Figura 4). Como se muestra en la figura 4, las citocinas de tipo Th2 más propensas a la regulación por incremento fueron IL-4, IL-10, IL-13 y, en un menor grado, IL-5. Se encontró que las variantes de la proteína G K193A, P190A y I189A provocaron respuestas espectaculares de IL-4, IL-10 y IL-13. Las débiles respuestas de IL-4, IL-10 y IL-13 se observaron con otras variantes de la proteína G tales como N192A, N191A, R188A, K187A y C186A. Los resultados del presente estudio destacan la aparente importancia de IL-13, que recientemente ha participado en el asma (Grunig y col., Science 282: 2261, 1998), además de en la vacuna contra la enfermedad inducida por el VRS (Johnson y Graham, J. Virol. 73:8485, 1999). Altos niveles de IL-13 y IL-10 guardan una buena correlación con altos niveles de eosinofilia observada en ratones expuestos al VRS que habían sido inmunizados con tipo natural o mutantes I189A, P190A, K192A y K193A. A diferencia, los mutantes tales como N191A, K187A y R188A eran pobres inductores de IL-13, IL-10 y eosinofilia, a pesar de ser inductores aceptables de IL-4.

En comparación, el prototipo de citocina Th1, IFN-\gamma, fue elevado en todos los grupos de ratones experimentales. A modo de ejemplo y sin desear ceñirse a la teoría, esto puede reflejar la expresión de IFN-\gamma de células NK, además de células Th1 (Trinchieri, Adv. Immunol. 47:187, 1989), la rápida inducción de IFN-\gamma con la infección por VRS (Hussell y Openshaw, J. Gen. Virol. 79: 2593, 1998) y/o la naturaleza prevalente de la expresión de IFN-\gamma incluso en procesos inmunitarios en los que parece que predomina una respuesta de Th2 (Waris y col., J. Virol. 70:2852, 1996; Spender y col., J. Gen. Virol. 79: 1751, 1998; Srikiatkhachorn y Braciale, J. Virol. 71: 678, 1997).

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Ejemplo 10 Preparación de proteosomas que contienen inmunógenos de la proteína G del VRS

Pueden formularse partes de inmunógenos de productos de la proteína G del VRS de reserva (por ejemplo, péptidos de tipo natural o mutantes) con proteosomas usando, a modo de ejemplo, procedimientos de diafiltración/ultrafiltración o usando diálisis. Para cualquier procedimiento, el producto de la proteína G del VRS se disuelve, por ejemplo, en una solución salina tamponada que contiene el detergente deseado (por ejemplo, Empigen BB (EBB) al 1% o al 0,1%-2% de EBB u otro detergente adecuado dependiendo del tipo de detergente usado) y luego se mezcla con proteosomas en disolución de Empigen al 1% tamponada con solución salina (u otro detergente apropiado a concentraciones apropiadas) a diversas relaciones de proteosoma:G del VRS (peso/peso) que oscilan de 1:4 a 8:1, incluyendo 1:4, 1:1, 2:1, 4:1 y 8:1. Para eliminar Empigen, la mezcla puede entonces someterse a la tecnología de ultrafiltración/diafiltración o se dializa exhaustivamente a través de una membrana de diálisis con, por ejemplo, un corte de peso molecular de 10.000 (MWCO) o membranas funcionalmente similares con intervalos de MWCO de 1.000-30.000 contra solución salina tamponada durante 1-2 semanas a 4ºC intercambiando al menos 500 partes de tampón cada día. En diversas etapas pueden usarse ensayos inmunológicos tales como ELISA e inmunodifusión radial simple (SRID) para medir la potencia. La técnica de haloinmunodifusión se usa para determinar el contenido de antígeno de G del VRS formulado con proteosomas a diversas relaciones (para detalles sobre la preparación de proteosomas, véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. nº 2001/0053368).

Las vacunas multivalentes también pueden prepararse haciendo vacunas de proteosomas monovalentes individuales y luego combinándolas a las proporciones requeridas antes de la formulación final y envasándolas. Las preparaciones multivalentes también pueden formularse reuniendo antígenos de G del VRS individuales en las proporciones deseadas y formulando la mezcla con proteosomas. Las preparaciones de vacunas multivalentes pueden contener uno o más inmunógenos de la proteína F del VRS y/o uno o más inmunógenos de la proteína M en combinación con uno o más inmunógenos de la proteína G del VRS. La composición de vacuna se pasa entonces por filtros de membrana de 0,8 \mum de tamaño de poro y se guarda a 4ºC antes de y durante las inmunizaciones.

Los inmunógenos de la proteína G del VRS (por ejemplo, péptidos de tipo natural o mutantes en cualquiera de las formas previas) también pueden formularse con diversas cantidades de proteosoma-adyuvante de LPS como se desvela en, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.476.201 B1, y se describe en este documento.

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Ejemplo 11 Immunización con inmunógenos de la proteína G del VRS formulados con protolina

Los ratones se inmunizaron intranasalmente con proteínas G del VRS de tipo natural (aminoácidos 128-229) o mutantes (N191A) formuladas con protolina para determinar si se provocaron títulos sistémicos y mucosos específicos del VRS. Los ratones BALB/c se inmunizaron tres veces con una dosis de 6 \mug o 2 \mug de cualquiera de las proteínas de fusión Trx-(poliHis)-G(128-229) solas, o con adyuvante con protolina o alumbre. La protolina sola o las proteínas de fusión formuladas con protolina se administraron intranasalmente, y el alumbre solo o las proteínas de fusión formuladas con alumbre se administraron subcutáneamente. Se extrajo sangre de la vena safena después de la segunda dosis (día 35) y el suero se obtuvo mediante exangüe dos semanas después de la tercera dosis (día 62). También se recogieron muestras de lavado broncoalveolar (BAL) en el día 62.

Los títulos de IgG de suero específico de G del VRS e IgA de BAL se determinaron por ELISA. El aumento de 10 en los títulos de IgG de suero se observó en ratones inmunizados intranasalmente con Trx-(poliHis)-G(128-229) formulada con protolina en comparación con ratones inmunizados con Trx-(poliHis)-G(128-229) sola, a las dosis de 6 y 2 \mug (Figura 5). No hubo diferencia significativa en los títulos de IgG de suero entre los grupos inmunizados intranasalmente con formulaciones de protolina o subcutáneamente con formulaciones de alumbre. Se obtuvieron títulos comparables tanto para G(128-229) de tipo natural como la N191A de G(128-229) mutante cuando se administraron con cualquier adyuvante. Los títulos de IgA de BAL específico de G(128-229) del VRS títulos fueron significativamente superiores en los grupos que habían recibido los inmunógenos de G(128-229) (tipo natural o mutante) formulados con protolina en comparación con los grupos inmunizados con los inmunógenos solos (Figura 6). De nuevo se obtuvieron títulos comparables para ambos inmunógenos de G(128-229) de tipo natural y mutante. Como era de esperar, no se detectó IgA en los grupos inmunizados subcutáneamente con los inmunógenos de G(128-229) formulados con alumbre. Estos resultados indican que las vacunas de inmunógenos de G(128-229) formulados con protolina (tipo natural o mutante) son muy toleradas y son inmunogénicas cuando se administran intranasalmente.

<110> Anderson, Robert

\hskip1cm

Huang, Yan

\hskip1cm

Burt, David

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<120> VACUNA DE SUBUNIDAD CONTRA INFECCIÓN POR EL VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL

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<130> 484112.401

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<140> US

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<141> 07-09-2004

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<160> 72

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 917

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia mutante del VRS

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<221> misc_feature

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<222> 9

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<223> n = A, T, C o G

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 298

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia mutante del VRS

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<400> 2

3

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<210> 3

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<211> 917

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<212> ADN

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<213> Virus respiratorio sincicial

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> 9

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<223> n = A, T, C o G

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<400> 3

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4

400

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<210> 4

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<211> 298

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<212> PRT

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<213> respiratorio sincicial

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<400> 4

5

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<210> 5

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<211> 306

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Fragmento mutante del VRS

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<400> 5

6

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<210> 6

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Fragmento mutante del VRS

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<400> 6

7

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<210> 7

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<211> 306

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia mutante del VRS

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<400> 7

8

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<210> 8

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Fragmento mutante del VRS

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<400> 8

9

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<210> 9

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<211> 306

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Fragmento mutante del VRS

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<400> 9

10

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<210> 10

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Fragmento mutante del VRS

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<400> 10

11

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<210> 11

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<211> 306

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Fragmento mutante del VRS

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<400> 11

13

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<210> 12

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<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

15

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 825

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(825)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

28

280

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 825

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(825)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 852

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(852)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 852

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(852)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

36

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PPT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

38

380

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 852

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(852)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

41

410

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 852

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(852)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Anclaje hidrófobo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Anclaje hidrófobo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, I185A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgctgggc tgcctgcaaa agaataccaa acaaaaaacc agg

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, I185A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctggttttt tgtttggtat tcttttgcag gcagcccagc agg

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, C186A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctgggct atcgccaaaa gaataccaaa caaaaaacca gg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, C186A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctggttttt tgtttggtat tcttttggcg atagcccagc ag

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, K187A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctgggct atctgcgcaa gaataccaaa caaaaaacca gg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, K187A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctggttttt tgtttggtat tcttgcgcag atagcccagc ag

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, R188A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctgggct atctgcaaag caataccaaa caaaaaacca gg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, R188A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctggttttt tgtttggtat tgctttgcag atagcccagc ag

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, I189A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctgggct atctgcaaaa gagcaccaaa caaaaaacca gg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, I189A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctggttttt tgtttggtgc tcttttgcag atagcccagc ag

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, P190A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctgggct atctgcaaaa gaatagcaaa caaaaaacca gg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, P190A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctggttttt tgtttgctat tcttttgcag atagcccagc ag

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, N191A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgcaaaaga ataccagcca aaaaaccagg aaagaaaacc acc

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, N191A mutante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtggttttc tttcctggtt ttttggctgg tattcttttg cag

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, K192A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgggctatc tgcaaaagaa taccaaacgc aaaaccagga aag

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, K192A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttcctggt tttgcgtttg gtattctttt gcagatagcc cag

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, K193A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaaaagaat accaaacaaa gcaccaggaa agaaaaccac cac

\hfill

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la G128G128-229, K193A mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggtggttt tctttcctgg tgctttgttt ggtattcttt tgc

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento mutante del VRS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

62

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Marca de epítope

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211>8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Marca de epítope

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

65

Claims

1. Uso de al menos un inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial (VRS) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 o fragmento de la misma, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección por VRS, en el que dicho al menos un inmunógeno de la proteína G tiene un epítope en la región que abarca desde el aminoácido 165 hasta el aminoácido 195 de SEQ ID NO:2 que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica o provocando una respuesta inmunopatológica reducida.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho inmunógeno de la proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho inmunógeno de la proteína G comprende además un resto hidrófobo.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que dicho resto hidrófobo comprende una secuencia de aminoácidos.

5. El uso según la reivindicación 3, en el que dicha parte hidrófoba es un lípido.

6. El uso según la reivindicación 3, en el que dicho resto hidrófobo está en el extremo amino o en el extremo carboxi del inmunógeno de la proteína G.

7. El uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento comprende un liposoma.

8. El uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento comprende además un adyuvante.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que dicho adyuvante comprende un adyuvante seleccionado de alumbre, fosfato de aluminio, proteosoma con o sin LPS, liposomas o un adyuvante de tipo emulsión de aceite y agua.

10. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento comprende además al menos un inmunógeno de la proteína F o inmunógeno de la proteína M del virus respiratorio sincicial, en el que dicho inmunógeno de la proteína F y dicho inmunógeno de la proteína M tiene cada uno un epítope que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica o provocando una respuesta inmunopatológica reducida.

11. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento tiene al menos dos inmunógenos de la proteína G.

12. El uso según la reivindicación, 1 ó 2, en el que dicho inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo comprende además una segunda secuencia de aminoácidos para formar una proteína de fusión.

13. El uso según la reivindicación 12, en el que dicha segunda secuencia de aminoácidos es una marca o una enzima.

14. El uso según la reivindicación 12, en el que dicha segunda secuencia de aminoácidos es tiorredoxina, polihistidina, o una combinación de las mismas.

15. El uso según la reivindicación 12, en el que dicha proteína de fusión comprende además un resto hidrófobo.

16. El uso según la reivindicación 15, en el que dicho resto hidrófobo está en el extremo amino o en el extremo carboxi de la proteína de fusión.

17. El uso según la reivindicación 14, en el que dicha proteína de fusión comprende además un resto hidrófobo.

18. El uso según la reivindicación 1, en el que dicha respuesta inmunopatológica es eosinofilia o asma.

19. El uso según la reivindicación 18, en el que dicha eosinofilia es eosinofilia pulmonar.

20. El uso según la reivindicación 1, en el que la infección se debe a un virus respiratorio sincicial del subgrupo A o subgrupo B o es debida a un virus respiratorio sincicial tanto del subgrupo A como del subgrupo B.

21. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 8 ó 9, en el que la administración del medicamento es adecuada para una administración mediante una vía seleccionada del grupo que está constituido por administración enteral, parenteral, transdérmica, transmucosa o nasal, o inhalación.

22. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 8 ó 9, en el que la administración del medicamento es adecuada para administración nasal.

23. Una composición que comprende al menos un inmunógeno de la proteína G del virus respiratorio sincicial (VRS) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2 o fragmento de la misma para uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección por VRS en la que dicho al menos un inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo tiene un epítope en la región que abarca desde el aminoácido 165 hasta el aminoácido 195 de SEQ ID NO:2 que provoca una respuesta inmunitaria protectora sin provocar una respuesta inmunopatológica o provocando una respuesta inmunopatológica reducida.

24. La composición según la reivindicación 23, en la que dicho inmunógeno de la proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

25. La composición según la reivindicación 23, en la que dicho inmunógeno de la proteína G comprende además un resto hidrófobo.

26. La composición según la reivindicación 25, en la que dicho resto hidrófobo comprende una secuencia de aminoácidos.

27. La composición según la reivindicación 25, en la que dicho resto hidrófobo es un lípido.

28. La composición según la reivindicación 25, en la que dicho resto está en el extremo amino o en el extremo carboxi del inmunógeno de la proteína G.

29. La composición según una cualquiera de la reivindicación 23 a 25, en la que dicho inmunógeno de la proteína G o fragmento del mismo comprende además una segunda secuencia de aminoácidos para formar una proteína de fusión.

30. La composición según la reivindicación 29, en la que dicha segunda secuencia de aminoácidos es una marca o una enzima.

31. La composición según la reivindicación 30, en la que dicha segunda secuencia de aminoácidos es tiorredoxina, polihistidina, o una combinación de las mismas.

32. La composición según la reivindicación 29, en la que dicha proteína de fusión comprende además un resto hidrófobo.

33. La composición según la reivindicación 32, en la que dicho resto hidrófobo está en el extremo amino o en el extremo carboxi de la proteína de fusión.

34. Una preparación farmacéutica que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 33.

35. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 23-33, que comprende además un adyuvante.

36. La composición según la reivindicación 35, en la que el adyuvante comprende un adyuvante seleccionado de alumbre, fosfato de aluminio, proteosoma con o sin LPS, liposomas o un adyuvante de tipo emulsión de aceite y agua.

37. El uso según la reivindicación 10, en el que el adyuvante comprende un liposoma con lípido A.

38. La composición según la reivindicación 37, en la que el adyuvante comprende un liposoma con lípido A.