ES2283907T3 - Interfase de preconcentracion para acoplar una cromatografia liquida y una electroforesis pilar. - Google Patents

Abstract

Un dispositivo para la separación bidimensional de una mezcla compleja de analitos, que consiste en: una columna nano de cromatografía líquida en fase inversa (nano-RPLC) como primer dispositivo de separación en una primera dimensión, un canal de electroforesis capilar en zona (CZE) como dispositivo de segunda separación en una segunda dimensión y un área de interfase entre el primer y el segundo dispositivo. Este dispositivo está caracterizado por que el área de interfase comprende una zona de concentración que contiene dos electrodos, o más, para la concentración de las fracciones o componentes individuales de la muestra que salen del primer dispositivo de separación antes de la introducción de dichas fracciones o dichos componentes de la muestra en el segundo dispositivo de separación.

Description

Interfase de preconcentración para acoplar una cromatografía líquida y una electroforesis capilar.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con un dispositivo y un método para la separación bidimensional mediante cromatografía líquida de una mezcla compleja de, por ejemplo, péptidos. En concreto, la invención está relacionada con una cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) seguida de una electroforesis capilar (CE) que es pulverizada directamente en un espectrómetro de masas.

Antecedentes de la invención

Los métodos bidimensionales de cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS, siglas en inglés) comienzan a desempeñar un papel clave en la investigación y las aplicaciones de la proteómica debido al hecho de que se ha descubierto que la 2D LC supera algunas de las limitaciones que son cruciales para la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en 2D, bien documentado en [lit. 1]. Las ventajas principales son la automatización, un menor tiempo de análisis, una mayor sensibilidad y una mayor reproducibilidad. Las muestras diluidas pueden concentrarse en columna y es posible acoplar esto con diferentes sistemas de detección como los UV, la fluorescencia inducida por láser (LIF, siglas en inglés) y especialmente la espectrometría de masas (MS, siglas en inglés), lo que permite una identificación y cuantificación más rápidas.

El análisis a escala peptídica se prefiere por diversas razones, pero principalmente porque los péptidos son inicialmente más solubles en una variedad más amplia de solventes y son más fáciles de separar que las proteínas de las que proceden. No obstante, existe una desventaja en el trabajo con péptidos, que es el aumento del número de formas que se deben encontrar, de modo que se requiere una mayor resolución durante la separación y pasa a ser más importante el uso de técnicas de prefraccionamiento disponibles.

La idea básica de un sistema 2D-LC en línea es la de realizar una separación lenta en la primera dimensión y una separación rápida en la segunda. Para conseguir una resolución elevada en la segunda dimensión sin reducir la tasa de muestreo o disminuir la velocidad de la primera dimensión, es necesario eluir en paralelo al menos dos columnas de segunda dimensión. La estrategia de 2D-LC más comentada, pero además la más empleada y comercializada, es la cromatografía de intercambio iónico (IEX) seguida de la RPLC. Las dos técnicas son completamente ortogonales; la primera basada en un mecanismo de separación de cargas (fases de elución con sales) y la segunda basada en la hidrofobicidad (elución en gradiente con disolvente orgánico). La IEX no es compatible con la espectrometría de masas por lo que esta primera se emplea como dimensión primera. Se recogen y lavan fracciones de la IEX en una o dos columnas de enriquecimiento paralelas, seguidamente se someten a una segunda separación por RPLC (una o dos columnas paralelas) que a su vez puede acoplarse directamente con la espectrometría de masas mediante una interfase ESI (de electroespray). Aun así, el largo tiempo de análisis en global todavía constituye una limitación para esta estrategia. En teoría, una de las combinaciones que ofrece más ventajas es la LC seguida de la electroforesis capilar en zona (CZE), pero hasta el momento no se ha comercializado nada referente a este acoplamiento en concreto y en la literatura científica se puede encontrar poca información al respecto. Estas dos técnicas también son ortogonales y compatibles, entre sí y con la espectrometría de masas. Ambas proporcionan una alta resolución por lo que aumentan la capacidad máxima total, y juntas pueden ser más rápidas que cualquier otra combinación bidimensional. La velocidad a la que se pueden realizar las separaciones por CZE permite un muestreo continuo del efluente de la primera columna en la segunda, completando el análisis bidimensional en el tiempo que tarda en completarse la primera dimensión, es decir, el tiempo necesario para llevar a cabo una separación por RPLC. La cuestión problemática que tradicionalmente ha ralentizado el desarrollo de esta estrategia probablemente sea la interfase entre las dos técnicas de separación. Existen ideas interesantes, no siempre dirigidas hacia este acoplamiento específico de técnicas, que constituyen soluciones relativamente válidas. En la literatura de patentes se describen unos pocos métodos alternativos como los basados en una válvula mecánica (US 5 240 577 A) o los basados en un concepto de control de flujo (US 5 496 460 A) o de control óptico (US 5 269 900 A). Tal como se describe en la patente estadounidense 6 192 768 B1, también se podría utilizar otro concepto basado en la dispensación, mediante un sistema de entre varios, dentro de un capilar para CE de gotitas con volúmenes definidos procedentes de un flujo continuo. Otros conceptos basados p. ej. en el control del flujo electroosmótico (EOF) se describen en la patente estadounidense US 6 475 363 B1. Sin embargo, en todos los casos, aparte de las limitaciones individuales, todavía se mantiene una desventaja común que consiste en que se desecha la mayor parte del efluente con riesgo de perder información y, ciertamente, no se consigue mejorar la sensibilidad.

Por esta razón, es un objetivo de la presente invención proponer una solución para superar la limitación en el paso de interfase entre la primera separación y el paso de separación siguiente evitando las desventajas comentadas en relación con las ideas propuestas.

En particular, un objetivo de la presente invención es el de proponer una interfase entre la separación por RPLC y la posterior separación por CE.

La invención ofrece un dispositivo y un método de acuerdo con lo expresado en la reivindicación 1 y la reivindicación 10, respectivamente.

Esta invención describe principalmente un método para hacer un muestreo del efluente de la primera columna en la segunda de modo que se proporcione tiempo suficiente para la separación por electroforesis capilar en zona de una fracción inyectada sin que se produzca contaminación por el flujo continuo. Las fracciones eluidas de la primera columna se concentran en un segmento corto, definido por dos electrodos, previo a la siguiente inyección entre una segunda separación y otra. Este hecho no da solamente como resultado la conservación de toda la información que contiene la separación de la primera dimensión, sino también proporciona una sensibilidad y una resolución considerablemente aumentadas en la segunda dimensión. La preconcentración en columna con la electroforesis capilar no es un método nuevo [lit. 10-11], pero estos métodos conocidos requieren sistemas discontinuos de tampón, p. ej. para isotacoforesis y amplificación de campo, o el empleo de materiales adsorbentes o de unión que en general también necesitan un cambio en la fase móvil o en el tampón de desorción. En la patente estadounidense US 6 428 666 B1 se ha descrito también recientemente la cromatografía electrocinética, en la que se capturan proteínas en partículas de sílice bajo un campo eléctrico aplicado y se eluyen por presión en ausencia de campo eléctrico. Muy recientemente, a la vez que esta invención pero de forma independiente, se ha desarrollado y publicado un dispositivo de electrocaptura fluídica basado en el equilibrio entre las fuerzas hidrodinámicas y eléctricas [lit. 12-13]. Sin embargo, este dispositivo servía para la limpieza en un solo paso de muestras de péptidos y proteínas de forma previa a, p. ej., la espectrometría de masas asistida mediante matriz con desorción/ionización por láser (MALDI-MS, siglas en inglés) o para la preconcentración previa al análisis unidimensional off-line mediante electroforesis capilar; y, de hecho, solamente contribuye a probar el principio sobre el que está basada la interfase de esta
invención.

En el método de acuerdo con la presente invención, el flujo no se interrumpe nunca sino que se mantiene constante a la velocidad a la que se realiza la primera separación, como p. ej. RPLC (p. ej. a 100 nl/min), sin tener en cuenta el valor EOF durante la segunda fase de separación, como p. ej. la CE, o la presencia de gotas de presión dentro del sistema por una causa cualquiera, p. ej. colmatación o burbujas. Es posible realizar esto gracias a los recientes avances realizados en la tecnología de bombas nano, comercializada por ejemplo por Agilent Technologies y Dionex LC Packings.

Un efecto de este sistema es que también se puede garantizar un electroespray estable para el análisis por espectrometría de masas.

En consecuencia, la presente invención se refiere de un modo específico a la combinación de nano-RPLC, en lugar de micro-RPLC, con CZE. La micro-RPLC normalmente está basada en columnas con un diámetro interno que oscila entre 0,3 y 3 mm y que presentan unos caudales característicos situados entre 1 y 500 \mul/min, mientras que la nano-RPLC está basada en columnas con un diámetro interno que oscila entre 75 y 100 micras y unos caudales característicos entre 0,1 y 1 \mul/min (de 100 a 1000 nl/min) Por esta razón, los caudales aplicados en la cromatografía líquida (<200 nl/min) son compatibles con la velocidad de separación de CZE, que en este momento se encuentra perfectamente en línea con la primera columna y, a su vez, está acoplado con la espectrometría de masas mediante una interfase ESI. En otras palabras, todo el efluente de la RPLC fluye directamente a través del canal de CZE sin válvulas ni volúmenes muertos, no se desecha nada y no se produce ninguna dilución.

No es necesario cambiar el tampón antes del análisis por CZE ya que se pueden encontrar condiciones que sean compatibles con la separación tanto por RPLC como por CZE y también con la espectrometría de masas. Este hecho se comprobó con diversos experimentos en los que, mediante CZE para una mezcla de péptidos (digestión tríptica de IgG que produjo 30 péptidos) en un tampón formado por acetonitrilo (ACN) al 20%/trietilamina (TEA) al 0,4%/ácido trifluoroacético (TFA) al 0,3% (Fig. 1c), se alcanzó una resolución que era comparable con la resolución alcanzada en sistemas tampón óptimos y bien descritos que no son compatibles con la espectrometría de masas o la RPLC debido al elevado contenido en sales y a la presencia de aditivos como la urea (Fig. 1a y 1b). El tampón 1, según la figura 1a, está formado por ácido iminodiacético (IDA) 50 mM, hidroxietilcelulosa (HEC) al 0,5% y urea 7 M. El tampón 2 está formado por IDA 50 mM, trifluoroetanol (TFE) al 10% y HEC al 0,5%. El gráfico de la figura 1c muestra una separación en dos dimensiones que podría proceder de la presente invención.

El problema de la electrólisis y la formación de burbujas que aparece cuando se emplean electrodos internos se puede prevenir integrando en su lugar electrodos con puente salino o membranas conductoras como en [lit. 12-13]. Como parte de esta invención, para el proceso de preconcentración se emplean dos microelectrodos que consisten, según un posible ejemplo, en microcanales que están en contacto con el canal de CE por una abertura muy estrecha del orden de p. ej. 2-3 \mum y llenos, p. ej., de un polímero Nafion® o cualquier otro material selectivo de iones. Nafion® es básicamente Teflon® con grupos de ácido sulfónico intercalados en su interior, con una elevada afinidad por el agua. Cada ácido sulfónico puede unir hasta 13 moléculas de agua, atrayéndolas en forma de agua de hidratación. Las interconexiones entre los grupos de ácido sulfónico facilitan una transferencia muy rápida de agua a través del Nafion® y, por tanto, de protones. De hecho, una de las principales aplicaciones del Nafion® es su utilización como membrana intercambiadora de protones en pilas de combustible de electrodos poliméricos. Finalmente, a su través pueden pasar otros iones positivos pequeños, pero no analitos del tamaño de un péptido. Este hecho permite que los péptidos coeluidos en un pico cromatográfico se pueden concentrar en una zona pequeña comprendida entre dos de estos electrodos aplicando un voltaje a través de ellos, con una polaridad opuesta a la carga de los péptidos (positiva en este caso) que sea lo suficientemente fuerte como para superar la fuerza de arrastre del flujo hidrodinámico. La inyección para la CE se lleva a cabo eliminando la diferencia de potencial entre los dos electrodos y permitiendo que el flujo transporte el bolo de muestra compactado durante el tiempo necesario para sobrepasar el segundo electrodo y salir de la zona de concentración. El voltaje aplicado entre el segundo electrodo y el cátodo para la separación siempre está funcionando, mientras que el aplicado entre los dos electrodos de concentración solamente se apaga durante
la inyección.

La invención se describe con más detalle, por ejemplo, en referencia a la figura 2, en la que se muestra una representación esquemática de la invención.

Después de un primer dispositivo de separación, como p. ej. una columna de RPLC, las muestras o fracciones separadas son inseridas respectivamente en una zona intermedia (11) que enlaza con otro dispositivo de separación (3), como p. ej. un canal de separación por CE. Cuando salen del canal de separación (3), las muestras se dirigen hacia un espectrómetro de masas (5) donde se inyectan o pulverizan.

La zona intermedia (11) contiene dos electrodos E1 y E2 que están dispuestos a una distancia entre sí que define una zona denominada de preconcentración (13).

Las fracciones que salen de la columna 1 se preconcentran en primer lugar en la zona de preconcentración (13) manteniendo los dos electrodos E1 y E2 con una diferencia de potencial de modo que los analitos de las fracciones no pueden pasar del electrodo E2. Pasado un cierto tiempo o un tiempo de preconcentración, respectivamente, los electrodos se desconectan o bien se invierte la polaridad de manera que la fracción de analito preconcentrada puede pasar el electrodo E2 y entrar en el segundo dispositivo de separación (3) que es, p. ej. un canal de separación por CE. Si se introduce una zona de preconcentración previa definida por los electrodos E0 y E1, es aún más factible evitar la entrada en la zona de preconcentración (13) de más componentes procedentes del dispositivo de RPLC antes de completar la inyección dentro de la zona de CE (3).

Por supuesto, la figura 2 muestra solamente un ejemplo de un diseño de acuerdo con la presente invención. Pero es evidente que es posible montar otros electrodos para definir otras zonas para la preconcentración.

La gran ventaja del dispositivo de la invención es que el flujo en sí no se interrumpe y el flujo de cualquiera de los solventes o líquidos de transporte debe mantenerse constante. Además, no se desecha efluente alguno de modo que se evita el riesgo de perder información.

Para dar una idea de las dimensiones y los valores de los métodos de la invención, de los valores de los caudales, los voltajes y el tiempo de análisis se pueden realizar los siguientes cálculos a modo de ejemplo.

Para la RPLC se puede emplear una columna C18 de 15 cm de largo x 75 \mum de diámetro interno y aplicar un caudal de elución en gradiente de 100 nl/min. El canal de CE por el que fluye el efluente de la RPLC puede tener 50 \mum de diámetro interno y la longitud efectiva a la que se produce la electroforesis puede ser de 5 cm. La zona de preconcentración previa a la separación por CE tiene una longitud de 1 mm.

En este sistema, la velocidad del flujo lineal (v_{f}) es de 0,085 cm/s. La movilidad electroforética (\mu) de los péptidos, calculada de las separaciones en el sistema tampón antes descrito, oscila de forma característica entre 1,0 x 10^{-4} cm^{2} sec^{-1} V^{-1} y 1,6 x 10^{-4} cm^{2} sec^{-1} V^{-1}. A partir de la fórmula v_{e} = \muE, en la que v_{e} es la velocidad de migración y E el campo eléctrico, un campo eléctrico de 2 kV/cm (es decir, 10 kV a través de 5 cm) produciría una v_{e} entre 0,2 cm/s y 0,36 cm/s. Así que la velocidad total (v_{tot}), que es la suma de v_{f} y v_{e}, tendría un valor entre 0,285 cm/s y 0,445 cm/s, lo que implica un tiempo de detección entre 10 s para el primer pico y 18 s para el último, mientras que para un pico de cromatografía una estimación de 30 s es razonable. Esto significa que hay tiempo de sobras para realizar la electroforesis mientras el próximo pico cromatográfico es concentrado antes de la siguiente inyección. La generación de calor y la pérdida de resolución por el efecto Joule causado por el elevado voltaje no supone un gran problema debido a la baja fuerza iónica del sistema líquido, las pequeñas dimensiones del canal y el caudal que proporciona líquido nuevo de forma continua.

El valor del campo eléctrico de captación debe ser mayor que la proporción entre v_{f} y la menor movilidad peptídica; es decir, debe ser mayor de 850 V/cm (85 V a lo largo de 1 mm). Por lo tanto, el tiempo durante el que este campo eléctrico debe ser nulo para permitir la inyección será de 1,2 s.

Se puede conseguir un factor de concentración muy elevado.

En otra versión de esta interfase, se llena la zona de concentración, todavía de 1 mm x 50 m, con material de intercambio catiónico y, en ausencia de un campo eléctrico en esta zona, tiene lugar una apilación de las muestras. A continuación, se consigue la desorción de las muestras aplicando suficiente voltaje con la polaridad en la misma dirección del flujo. En este caso no se realiza una estimación del campo eléctrico necesario puesto que esto depende de la fase estacionaria final que se emplee, sin embargo el pH bajo y la presencia de agentes emparejadores iónicos como el TFA deberían disminuir el valor de este campo. El ejemplo antes mencionado y la representación esquemática mostrada en la figura 2 sirven para explicar con más detalle la presente invención que, por supuesto, no se limita de ningún modo al ejemplo y la representación mostrada en la figura 2.

Lista de bibliografía Referencias

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Claims (13)

1. Un dispositivo para la separación bidimensional de una mezcla compleja de analitos, que consiste en: una columna nano de cromatografía líquida en fase inversa (nano-RPLC) como primer dispositivo de separación en una primera dimensión, un canal de electroforesis capilar en zona (CZE) como dispositivo de segunda separación en una segunda dimensión y un área de interfase entre el primer y el segundo dispositivo. Este dispositivo está caracterizado porque el área de interfase comprende una zona de concentración que contiene dos electrodos, o más, para la concentración de las fracciones o componentes individuales de la muestra que salen del primer dispositivo de separación antes de la introducción de dichas fracciones o dichos componentes de la muestra en el segundo dispositivo de separación.

2. Un formato de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los electrodos están formados por microcanales llenos de un polímero Nafion o de otro material selectivo de iones.

3. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque los microcanales están en contacto con el canal de CZE mediante una abertura muy estrecha del orden de 2-3 \mum.

4. Un dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizado porque el área de interfase comprende por lo menos otra zona de concentración más.

5. Un método bidimensional de nano cromatografía líquida en fase inversa (nano-RPLC)/electroforesis capilar en zona (CZE) que comprende la separación de una mezcla compleja de analitos en la nano-RPLC seguido de la CZE. El método está caracterizado porque en el área de interfase entre la nano-RPLC y la CZE se concentran las fracciones que salen de la nano-RPLC antes de la inserción en la CZE en una zona de concentración formada por dos o más electrodos.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque todo el efluente procedente de la nano-RPLC fluye dentro de la CZE con un caudal constante.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque los electrodos están formados por microcanales llenos de un polímero Nafion o de otro material selectivo de iones.

8. Un método de acuerdo con la reivindicaciones 5, 6 o 7, caracterizado porque las fracciones se concentran por aplicación de al menos un campo eléctrico, y porque las fracciones concentradas se insieren en la CZE en ausencia de inversión de al menos un campo eléctrico o durante la misma inversión.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 5 a la 8, caracterizado porque las fracciones que salen de la nano-RPLC se concentran por aplicación de un voltaje entre los electrodos con una polaridad opuesta a la carga de los componentes de la fracción, el voltaje es lo suficientemente fuerte como para superar la fuerza de arrastre del flujo hidrodinámico y la inserción dentro de la CZE se realiza eliminando la diferencia de potencial entre los electrodos.

10. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 5, 6 o 7, caracterizado porque la zona de concentración contiene además un material de intercambio iónico, el apilamiento de muestras del material de muestra que sale de la nano-RPLC sucede en ausencia de un campo eléctrico y la desorción de la muestra dentro de la CZE se consigue aplicando un voltaje entre los electrodos con la polaridad en la misma dirección del flujo.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 5 a la 10, caracterizado porque los componentes individuales de la fracción separados por la CZE se pulverizan dentro de un espectrómetro de masas.

12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 5 a la 11, cuya función es la separación bidimensional en el ámbito de la proteómica.

13. La utilización del dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 para la separación bidimensional de una mezcla de péptidos.