ES2301118T3 - Interfaz preconcentrada de acoplamiento de electromatografia capilar con electroforesis capilar de zona. - Google Patents

Abstract

Dispositivo para separación bidimensional de una mezcla compleja de analitos que comprende una columna de electrocromatografía capilar (CEC) como primer dispositivo de separación para la separación en una primera dimensión; un canal de electroforesis capilar de zona (CZE) como segundo dispositivo separación para la separación en una segunda dimensión; y una zona de interfaz entre el primer dispositivo de separación y el segundo dispositivo de separación, caracterizado porque la zona de interfaz comprende una zona que incluye dos o más electrodos para concentrar las fracciones de muestra individuales o componentes de la muestra que abandonan el primer dispositivo de separación antes de introducir dichas fracciones de muestra o componentes de muestra dentro del segundo dispositivo de separación.

Description

Interfaz preconcentradora de acoplamiento de electrocromatografía capilar con electroforesis capilar de zona.

Sector de la invención

La presente invención se refiere a un dispositivo y un método para llevar a cabo la separación bidimensional de una mezcla compleja de, por ejemplo, péptidos. En particular, la presente invención se refiere a electrocromatografía capilar (CEC) seguida por electroforesis capilar de zona (CZE) inyectada directamente dentro de un espectrómetro de masas.

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Antecedentes de la invención

Los métodos bidireccionales de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS) comienzan a desempeñar un papel clave en la investigación y aplicaciones proteómicas debido a que se ha encontrado que la LC 2D supera algunas de las limitaciones decisivas para la electroforesis bidimensional con gel de poliacrilamida (PAGE), descrita a fondo en [ref. 1]. Las ventajas principales son la automatización, el menor tiempo de análisis, la mayor sensibilidad y el aumento de la reproducibilidad. Las muestras diluidas pueden concentrarse en columna y es posible realizar el acoplamiento con diferentes sistemas de detección, tal como sistemas de UV, LIF y especialmente MS que permiten una identificación y una cuantificación más rápidas.

El análisis al nivel del péptido resulta preferente por varias razones, pero principalmente debido a que los péptidos son inicialmente más solubles en una mayor variedad de solventes y son más fáciles de separar que las proteínas madre. Sin embargo, existe una desventaja al trabajar con péptidos, que es el aumento de la cantidad de especies que deben resolverse, demandando por tanto una mayor resolución durante la separación y haciendo más importante la utilización de técnicas de fraccionamiento previo.

La idea básica de un sistema 2D-LC en línea es tener una separación lenta en la primera dimensión y una separación rápida en la segunda dimensión. A efectos de alcanzar los requisitos de alta resolución en la segunda dimensión sin reducir la velocidad de muestreo o ralentizar la primera dimensión, es necesario eluir en paralelo como mínimo dos columnas de la segunda dimensión. El enfoque de 2D-LC más citado y además el más aplicado y comercializado es el de cromatografía de intercambio iónico (IEX) seguida por RPLC. Las dos técnicas son totalmente ortogonales, la primera basada en un mecanismo de separación por carga (etapas de elución de sales), la segunda basada en hidrofobicidad (elusión de gradiente con solvente orgánico). La IEX no es compatible con la MS, por lo tanto es utilizada como primera dimensión. Fracciones de la IEX son atrapadas y lavadas en una o dos columnas de enriquecimiento en paralelo, luego son sometidas a una segunda separación por RPLC (una o dos columnas en paralelo), que puede estar acoplada directamente a la MS típicamente a través de una interfaz ESI. Una limitación de este enfoque es el largo tiempo total de análisis. Teóricamente, una de las combinaciones que ofrecen mayores ventajas es LC seguida por electroforesis capilar de zona (CZE) pero hasta ahora ninguna ha sido comercializada para este acoplamiento específico y poco puede encontrarse en la literatura. Estas dos técnicas son además ortogonales y compatibles entre ellas y con la espectrometría de masas. Ambas proporcionan alta resolución aumentando la capacidad máxima total y en conjunto pueden ser más rápidas que cualquier otra combinación 2D. La velocidad a la que pueden llevarse a cabo separaciones CZE permite el muestreo continuo del efluente de la primera columna hacia la segunda, completando el análisis 2D en el tiempo que se tarda en completar la primera dimensión, que es el tiempo que toma llevar a cabo una separación RPLC. El punto crítico que históricamente ha ralentizado el desarrollo de esta estrategia es probablemente la interfaz entre las dos técnicas de separación. Existen ideas interesantes, no siempre destinadas a este acoplamiento específico, que son soluciones más o menos válidas. En la literatura de patentes se dan a conocer unos pocos métodos alternativos basados en una válvula mecánica (US 5 240 577 A) y otros basados en una compuerta de flujo (US 5 496 460 A) o un concepto de compuerta óptica (US 5 269 900 A). Tal como se describe en la Patente US 6 192 768 B1, también podría utilizarse otro concepto basado en dispensar, de alguna de numerosas maneras, gotitas con volumen definido a partir de un flujo continuo hacia, por ejemplo, un capilar para electroforesis capilar (CE). Otros conceptos, por ejemplo basados en el control de EOF (flujo electrosmótico) se dan a conocer en la Patente US 6 475 363 B1. Sin embargo, en todos los casos, además de las limitaciones individuales, aún perdura una desventaja común, la cual es que la mayor parte del efluente es desechado, con el riesgo de pérdida de información y ciertamente impidiendo una mejora en la sensibilidad.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es dar a conocer una solución para superar la limitación en la etapa de interfaz entre la primera etapa de separación y la subsiguiente etapa de separación sin incurrir en las desventajas relacionadas con las ideas propuestas.

Un objetivo particular de la presente invención es dar a conocer una interfaz entre una primera separación CEC y una segunda separación CZE.

La presente invención da a conocer un dispositivo y un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 5, respectivamente, y da a conocer una utilización de acuerdo con la reivindicación 13.

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La presente invención da a conocer principalmente un método para muestreo del efluente de la primera columna hacia la segunda columna de manera que exista tiempo suficiente para la separación por electroforesis capilar de zona de una fracción inyectada sin contaminar el flujo continuo. Fracciones eluyentes de la primera columna son concentradas en un segmento corto, definido por dos electrodos, antes de la siguiente inyección entre una segunda separación y otra separación. Esto no sólo resulta en la conservación de toda la información contenida en la separación de la primera dimensión, sino que además resulta en una sensibilidad y una resolución muy mejoradas en la segunda dimensión. La preconcentración en columna utilizada en la electroforesis capilar no es nueva [ref. 10-11], pero estos métodos conocidos requieren sistemas de tampón discontinuos, por ejemplo para isotacoforesis y amplificación de campo, o la utilización de materiales aglutinantes o adsorbentes que generalmente también requieren un cambio en la fase o tampón móvil para llevar a cabo la desorción. Recientemente, la captura electrocinética ha sido mencionada en el documento US 6 428 666 B1, en el que las proteínas son atrapadas en partículas de sílice bajo la acción de un campo eléctrico aplicado y son eluidas por presión en ausencia de campo eléctrico. Muy recientemente, en paralelo e independientemente de dicha invención, se desarrolló y publicó [ref. 11-12] un dispositivo de electrocaptura fluida basado en el equilibrio entre fuerzas hidrodinámicas y eléctricas. Sin embargo, estaba destinado para aclarado de muestras en una etapa de péptidos y proteínas antes de, por ejemplo, una espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS) o preconcentración antes de un análisis unidimensional fuera de línea mediante electroforesis capilar y, de hecho, sólo ayuda a probar el principio en el que está basada la interfaz de esta
invención.

En el método de acuerdo con la presente invención, el flujo nunca es interrumpido sino que es mantenido constante a la velocidad a la que se ejecuta la primera separación (por ejemplo 100 nl/min), independientemente del valor EOF durante la segunda etapa de separación o caídas de presión dentro del sistema por cualquier razón, por ejemplo, la aparición de obstrucciones o burbujas. Esto puedo ser posible gracias a los avances recientes en la tecnología de nanobombeo comercializada, por ejemplo, por Agilent Technologies y Dionex LC Packings. Una consecuencia de este hecho es que es posible asegurar el electrorrociado estable para análisis MS.

Por lo tanto, una alternativa a la presente invención dada a conocer en la solicitud prioritaria de la presente invención hace referencia a la combinación de nano-RPLC en lugar de micro-RPLC con CZE. Usualmente, la RPLC está basada en columnas con un diámetro interno que está dentro del rango entre 0,3 y 3 mm y con caudales típicos dentro del rango entre 1 y 500 \mul/min, mientras que la nano-RPLC está basada en columnas con un diámetro interno dentro del rango entre 75 y 100 micras y caudales típicos entre 0,1 y 1 \mul/min (100 a 1000 nl/min). Como consecuencia, los caudales aplicados en LC (<200 nl/min) son compatibles con la velocidad de separación de CZE que está perfectamente en línea con la primera columna y a la vez está acoplada con la MS mediante una interfaz ESI. En otras palabras, todo el efluente de la RPLC fluye directamente a través del canal CZE sin encontrar válvulas o volúmenes muertos, nada es desechado ni se llevan a cabo diluciones.

No es necesario cambiar el tampón antes del análisis por CZE en esta alternativa a la presente invención, tal como se reivindica en la solicitud prioritaria de la presente invención, dado que pueden encontrarse condiciones que sean compatibles con las separaciones por RPLC y por CZE y también con la espectrometría de masas. Esto ha sido probado en algunos experimentos en los que la resolución alcanzada por CZE para una mezcla de péptidos (digestión tríptica de IgG produciendo 30 péptidos) en una solución tampón compuesta por 20% de Acetonitrilo (ACN)/0,4% de Trietilamina (TEA)/0,3% de Ácido Trifluoroacético (TFA) (figura 1c, alternativa a la presente invención que es reivindicada en la solicitud prioritaria de esta invención) fue comparable con la resolución alcanzada en sistemas tampón conocidos e incompatibles con MS y RPLC debido al alto contenido de sal y la presencia de aditivos tales como la urea (figuras 1a y 1b). El tampón 1, de acuerdo con la figura 1a, consiste en ácido iminodiacético (IDA) 50 mM, hidroxietilcelulosa (HEC) 0,5% 7M urea. El tampón 2 consiste en 50 mM IDA/10% trifluoroetanol (TFE)/0,5% HEC. El gráfico de acuerdo con la figura 1c muestra una separación en la segunda dimensión que podría resultar a partir de la aplicación de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención se utiliza electrocromatografía capilar (CEC) como separación en la primera dimensión.

El problema de la electrólisis y la formación de burbujas que se producen cuando se utilizan electrodos internos puede ser eliminado integrando en su lugar electrodos de puente salino o membranas conductoras, tal como se describe en [ref. 12-13]. Como parte de la presente invención, se utilizan dos microelectrodos para realizar la preconcentración que consisten, de acuerdo con un posible ejemplo, en microcanales en contacto con el canal CE mediante una abertura muy estrecha del orden de, por ejemplo, los 2 a 3 \mum y llenados por ejemplo con polímero Nafion® u otro material selectivo de iones. Nafion® es básicamente Teflon® con grupos de ácido sulfónico interpuestos, con una afinidad con el agua muy alta. Cada ácido sulfónico puede ligar hasta 13 moléculas de agua, atrayéndolas como hidratante. Las interconexiones entre los grupos de ácido sulfónico conducen a una transferencia muy rápida de agua a través del Nafion® y por lo tanto también de protones. Una de las aplicaciones principales del Nafion® es de hecho como membrana de intercambio de protones en celdas de combustible de electrodo polimérico. Eventualmente, otros iones positivos pequeños pueden atravesarla pero no pueden hacerlo los analitos del tamaño de un péptido. Esto hace posible que los péptidos eluídos de forma conjunta en un pico cromatográfico puedan ser concentrados dentro de una zona reducida, comprendida entre dos de dichos electrodos mediante la aplicación de un voltaje a través de los mismos, con polaridad opuesta a la carga de los péptidos (positivos en este caso) suficientemente intensa como para superar la fuerza de arrastre del flujo hidrodinámico. La inyección a la CE es llevada a cabo eliminando la diferencia de potencial entre los dos electrodos y permitiendo que el tapón de muestra compactado sea transportado por el flujo durante el tiempo necesario para que supere el segundo electrodo y abandone la zona de concentración. El voltaje aplicado para llevar a cabo la separación entre el segundo electrodo y el cátodo siempre está activo, mientras que entre los dos electrodos de concentración es desactivado sólo durante la inyección.

La invención es descrita con mayor detalle haciendo referencia a la figura 2, en la que se muestra una representación esquemática de la presente invención.

Después de un primer dispositivo de separación (1), tal como por ejemplo una columna RPLC, las muestras o fracciones separadas son introducidas en una zona intermedia (11) que termina y conduce a un dispositivo de separación adicional (3), tal como por ejemplo un canal de separación por CE. Una vez abandonado el canal de separación (3), las muestras se hacen avanzar y son inyectadas o rociadas dentro de un dispositivo de espectrometría de masas (5).

La zona intermedia (11) comprende dos electrodos (E1) y (E2) que están separados por una distancia entre la que existe la zona llamada de preconcentración (13).

Las fracciones que abandonan la columna (1) son en primer lugar preconcentradas en la zona de preconcentración (13) manteniendo los dos electrodos (E1) y (E2) a una diferencia de potencial de manera que los analitos en dichas fracciones no pueden atravesar el electrodo (E2). Después de transcurrido un determinado tiempo o tiempo de preconcentración, se desactivan los electrodos o se invierte la polaridad de manera que la fracción de analito preconcentrado pueda superar el electrodo (E2) y entrar en el segundo dispositivo de separación (3) que es, por ejemplo, un canal de separación por CE. Introduciendo una zona de preconcentración definida por los electrodos (E_{0}) y (E_{1}), es posible además impedir la entrada de componentes adicionales que abandonan el dispositivo RPLC en la zona de preconcentración (13) antes de que se complete la inyección dentro de la zona de CE (3).

Evidentemente, la figura 2 sólo muestra un ejemplo de diseño de acuerdo con la presente invención. Por supuesto, es posible disponer electrodos adicionales para definir zonas de preconcentración adicionales.

La gran ventaja de la disposición de la presente invención es que el flujo no es interrumpido y el flujo de cualquier solvente o líquidos de transporte permanecerá constante. Además, no se desechan efluentes, evitando el riesgo de la pérdida de información.

Para dar una idea de las dimensiones y valores de los métodos de la presente invención, los valores de los caudales, voltajes y tiempos de análisis se dan a modo de ejemplo los siguientes cálculos para una alternativa a la presente invención, reivindicada en la solicitud prioritaria de esta invención:

Para la RPLC puede utilizarse una columna C18 de 15 cm de longitud x 75 \mum de ID (diámetro interno) y puede aplicarse un caudal de 100 nl/mn para elución por gradiente. El canal de CE al que fluye el efluente de la RPLC puede tener 50 \mum de ID y una longitud efectiva de 5 cm en la que se produce la electroforesis. La zona de preconcentración antes de la separación por CE tiene 1 mm de longitud.

En este sistema la velocidad de flujo lineal (v_{f}) es 0,085 cm/s. La movilidad electroforética (\mu) de los péptidos, calculada a partir de las separaciones en el sistema tampón descrito anteriormente, típicamente está dentro del rango entre 1,0 x 10^{-4} cm^{2} seg^{-1} V^{-1} y 1,6 x 10^{-4} cm^{2} seg^{-1} V^{-1}. A partir de la ecuación v_{e}=\muE, en la que v_{e} es la velocidad de electroforesis y E es el campo eléctrico, un campo eléctrico de 2 KV/cm, es decir 10 kV a lo largo de 5 cm, producirá una v_{e} dentro del rango entre 0,2 cm/s y 0,36 cm/s. Por tanto, la velocidad total (V_{tot}), que es la suma de v_{f} y v_{e}, estará dentro del rango entre 0,285 cm/s y 0,445 cm/s, es decir un tiempo de detección entre 10s para el primer pico y 18s para el último pico, mientras que para un pico cromatográfico es razonable un tiempo estimado de 30s. Esto significa que existe suficiente tiempo para llevar a cabo la electroforesis al mismo tiempo que el siguiente pico cromatográfico es concentrado antes de la siguiente inyección. La generación de calor y pérdida de resolución por efecto Joule debido a los altos voltajes no es un gran problema debido a la baja fuerza iónica del sistema líquido, las dimensiones reducidas del canal y al caudal que continuamente aporta líquido fresco.

El valor del campo eléctrico de captación debe ser mayor que la proporción entre v_{f} y la más pequeña de las movilidades de los péptidos, es decir mayor que 850 V/cm, es decir mayor que 85 V a lo largo de 1 mm. El tiempo durante el cual este campo eléctrico debe ser igual a cero para permitir la inyección es entonces de 1,2 s.

Puede alcanzarse un factor de concentración muy elevado.

En otra versión de esta interfaz la zona de concentración, aún con dimensiones de 1 mm x 50 \mum, es llenada con material de intercambio de cationes y el apilado de la muestra se produce en ausencia de campo eléctrico en esta zona. Entonces, la desorción de la muestra es lograda aplicando un voltaje suficiente con una polaridad en la misma dirección que la del flujo. En este caso no se ha hecho una estimación del campo eléctrico necesario debido a que depende de la fase estacionaria final utilizada, sin embargo el bajo pH y la presencia de agentes de apareamiento iónico, tales como el TFA, deberían disminuir el valor de dicho campo eléctrico. El ejemplo anteriormente mencionado además de la representación esquemática mostrada en la figura 2 es utilizada para explicar adicionalmente la presente invención que evidentemente no está limitada en ningún sentido a dicho ejemplo y representación de la figura 2.

Referencias

[1]. Sarka Beranova-Giorgianni. Proteon analysis by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry: strengths and limitations. Trends in Anal. Chem. 2003, 22, 273-81.

[2]. Opiteck et al. Comprehensive two-dimensional high-performance liquid chromatography for the isolation of overexpressed proteins and protein mapping. Anal. Bioch. 1998, 258, 349-61.

[3]. Opiteck et al. Comprehensive on-line LC/LC/MS of proteins. Anal. Chem. 1997, 69, 1518-24.

[4]. Washburn et al. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nature Biotech. 2001, 19, 242-47.

[5]. Wolters et al. An automated multidimensional protein identification technology for shotgun proteomics. Anal. Chem. 2001, 73, 5683-90.

[6]. Wagner et al. An automated on-line multidimensional HPLC system for protein and peptide mapping with integrated sample preparation. Anal. Chem. 2002, 74, 809-820.

[7]. Moore et al. Rapid comprehensive two-dimensional separations of peptides via RPLC-optically gated capillary zone electrophoresis. Anal. Chem. 1995, 67, 3448-55.

[8]. Lewis et al. Comprehensive on-line RPLC-CZE-MS of peptides. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1997, 8, 495-500.

[9]. Han et al. Quantitative profiling of differentiation-induced microsomal proteins using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Biotech. 2001, 19, 946-51.

[10]. Damon et al. On-line preconcentration methods for capillary electrophoresis. Electrophoresis 2000, 21, 2768-79.

[11]. Astorga-Wells et al. A microfluidic electrocapture device in sample preparation for protein analysis by MALDI mass spectrometry. Anal. Chem. October 1, 2003, 75, 5213-19.

[12]. Astorga-Wells et al. Fluidic preconcentrator device for capillary electrophoresis of proteins. Anal. Chem. October 1, 2003, 75, 5207-12.

Claims (13)

1. Dispositivo para separación bidimensional de una mezcla compleja de analitos que comprende una columna de electrocromatografía capilar (CEC) como primer dispositivo de separación para la separación en una primera dimensión; un canal de electroforesis capilar de zona (CZE) como segundo dispositivo separación para la separación en una segunda dimensión; y una zona de interfaz entre el primer dispositivo de separación y el segundo dispositivo de separación, caracterizado porque la zona de interfaz comprende una zona que incluye dos o más electrodos para concentrar las fracciones de muestra individuales o componentes de la muestra que abandonan el primer dispositivo de separación antes de introducir dichas fracciones de muestra o componentes de muestra dentro del segundo dispositivo de separación.

2. Dispositivo, según la reivindicación 1, caracterizado porque los electrodos consisten en microcanales rellenados con un polímero Nafion u otro material selectivo de iones.

3. Dispositivo, según la reivindicación 2, caracterizado porque los microcanales están en contacto con el canal de CZE mediante una abertura muy estrecha del orden de 2 a 3 \mum.

4. Dispositivo, según la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque la zona de interfaz comprende como mínimo una zona de concentración adicional.

5. Método bidimensional de electrocromatografía capilar (CEC)/eletroforesis capilar de zona (CZE) que comprende la separación de una mezcla de analitos compleja en la CEC seguida por la CZE, caracterizado porque en la zona de interfaz entre la CEC y la CZE las fracciones que abandonan la CEC son concentradas antes de la inserción dentro de la CZE en una zona de concentración que comprende dos o más electrodos.

6. Método, según la reivindicación 5, caracterizado porque todo el efluente de la CEC fluye hacia el interior de la CZE con un caudal constante.

7. Método, según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque los electrodos consisten en microcanales rellenos con un polímero Nafion u otro material selectivo de iones.

8. Método, según la reivindicación 5, 6 ó 7, caracterizado porque las fracciones son concentradas aplicando como mínimo un campo eléctrico, y porque dichas fracciones concentradas son introducidas en la CZE en ausencia o durante la inversión de, como mínimo, un campo eléctrico.

9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado porque las fracciones que abandonan la CEC son concentradas mediante la aplicación de un voltaje entre los electrodos con una polaridad opuesta a la carga de los componentes de la fracción cuyo voltaje es suficientemente intenso para superar la fuerza de arrastre del flujo hidrodinámico, y porque la introducción de dicha fracción en la CZE es llevada a cabo eliminando la diferencia de potencial entre dichos electrodos.

10. Método, según la reivindicación 5, 6 ó 7, caracterizado porque la zona de concentración comprende además un material de intercambio de iones y porque el apilado del material de muestra que abandona la CEC se produce en ausencia de un campo eléctrico y porque la desorción de la muestra presente en la CZE es lograda mediante la aplicación de un voltaje entre dichos electrodos aplicando una polaridad en la misma dirección del flujo.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, caracterizado porque los componentes individuales de la fracción separada por CZE son rociados dentro de un espectrómetro de masas.

12. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, destinado a ser utilizado en proteómica como separación bidimensional.

13. Uso del dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la separación bidimensional de una mezcla de péptidos.