ES2284089T3 - Probioticos para aplicaciones en alimentos para animales domesticos. - Google Patents
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Abstract
Empleo de Lactobacillus reuteri NCC2581 depositado con el nºCNCM I-2448, Lactobacillus reuteri NCC2592 depo-sitado con el nºCNCM I-2450, Lactobacillus rhamnosus NCC2583 depositado con el nºCNCM I-2449, Lactobacillus reuteri NCC2603 depositado con el nºCNCM I-2451, Lactobacillus reu-teri NCC2613 depositado con el nºCNCM I-2452, Lactobacillus acidophilus NCC2628 depositado con el nº CNCM I-2453, Enterococcus faecium SF68 depositado con el nº NCIMB 10415, para la preparación de una composición destinada para la regulación del sistema inmunológico en gatos y/o perros mediante la estimulación y/o modulación de las funciones inmunológicas.
Description
Probióticos para aplicaciones en alimentos para
animales domésticos.
La presente invención se refiere a nuevas
bacterias de ácido láctico y particularmente a microorganismos de
los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium y
Streptococcus (Enterococcus) que han sido aislados y
seleccionados para determinar su potencial probiótico. La presente
invención se refiere también al empleo de los mismos en la
preparación de composiciones de alimentos para animales domésticos
destinadas a mejorar la salud de los animales domésticos y a las
composiciones que los contienen.
El bienestar de los animales domésticos está
íntimamente relacionado con su alimentación. Una alimentación
correcta dará como resultado un animal doméstico en buen estado
físico y saludable. Además, al proporcionar un valor nutritivo, la
composición alimenticia influye sobre el equilibrio de la microflora
intestinal y puede conducir o evitar transtornos
gastrointestinales. Por lo tanto, el conocimiento del tracto
gastrointestinal y los procesos de digestión de animales saludables
forma parte de la comprensión de la práctica de alimentación
saludable. Como carnívoros, los gatos y perros se caracterizan por
un tracto digestivo corto y una rápida velocidad del flujo del bolo
de comida.
Entre los constituyentes de la microflora
gastrointestinal de gatos y perros, pueden encontrarse los
Bacteroides sp., Clostridium sp.,
Enterobacteriaceae, Bifidobacterium sp.,
Lactobacillus sp., Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp. y levaduras.
El número y composición de esta flora endógena
tiende a ser más bien estable, aunque la edad, y en un grado menor
el alimento, puede modificarlo. Se cree que la acidez gástrica, la
bilis, el peristaltismo intestinal y la inmunidad local son
factores importantes en la regulación de la flora bacteriana en el
intestino delgado de los seres humanos y de otros mamíferos.
A menudo, los transtornos gastrointestinales de
los animales caninos y felinos van unidos a un supercrecimiento
bacteriano y la producción de enterotoxinas producidas por bacterias
patogénicas.
Durante los últimos años, la investigación se ha
concentrado sobre algunas cepas valiosas de bacterias de ácido
láctico y su empleo potencial como agentes probióticos. Los
probióticos son preparaciones microbianas viables que se considera
que promueven la salud de los mamíferos preservando la microflora
natural del intestino. Los probióticos se cree que están ligados a
la mucosa intestinal, colonizan el tracto intestinal y con ello
evitan que microorganismos perjudiciales se fijen sobre el mismo. Un
requisito previo para su acción es que tienen que alcanzar la
mucosa del intestino en una forma correcta y viable y especialmente
no deben destruirse por la influencia del bajo pH existente en el
estómago. En particular, la fisiología del tracto digestivo de
gatos y perros difiere de los humanos. Por ejemplo, el pH medio del
estómago es aproximadamente de 3,4 para los perros y 4,2 para los
gatos.
La publicación de Hartemink, R. y Rombouts, F.M.
("Comparison of media for the detection of bifidobacteria,
lactobacilli and total anaerobes from faecal samples")
("Comparación de los medios para la detección de bifidobacterias,
lactobacilli y anaerobios totales de muestras fecales"), Journal
of Microbiological Methods ("Revista de métodos
microbiológicos"), 1999, vol. 36, p. 181-192), se
ocupa de los medios empleados para la detección y caracterización
de las cepas microbianas.
El artículo de Fujisawa, T. y Mitsuoka, T.
("Homofermentative Lactobacillus species predominantly
isolated from canine feces") ("Especies de
Lactobacillus homofermentativas aisladas predominantemente de
heces fecales"), Journal of Veterinary Medical Science
("Revista de la Ciencia médica veterinaria"), 1996, vol.58, nº
6, p. 591-593) describe el aislamiento de las cepas
de Lactobacillus de las heces de perros.
La patente US 5922375 se refiere al aislamiento
de una cepa de bifidobacterium de las heces de un niño y la
suplementación de alimentos con esta cepa. En este documento, el
pienso animal se suplementa con una cepa probiótica aislada de
humanos.
La patente WO 9608261 describe la inclusión de
micro-organismos probióticos y una carga, en
productos para alimentación animal de forma que los microorganismos
alcancen el intestino grueso y se desarrollen en el mismo. Los
micro-organismos probióticos obtenidos de
colecciones de cultivos adquiribles comercialmente o aislados de
heces humanas se administran a ratones y cerdos.
La patente WO 99/17788 describe un método para
la prevención o tratamiento de la candidiasis administrando a un
animal una cepa probiótica. Las cepas probióticas empleadas en los
mismos se originan en una variedad de fuentes, incluyendo el yogur,
heces humanas o animales y abejas de miel.
Finalmente, aunque la patente US 5968569
describe la inclusión de un microorganismo probiótico en un alimento
cereal para animales domésticos, ni dicha patente ni la técnica
disponible remanente proporciona información referente a cepas
específicamente orientadas a la salud de los animales
domésticos.
En consecuencia, existe una necesidad de
proporcionar nuevas cepas bacterianas que estén particularmente
adaptadas para los animales domésticos y que han sido seleccionadas
por sus altas propiedades probióticas beneficiosas para la salud de
los animales domésticos y para incorporar estas cepas a las
composiciones de alimentos para animales domésticos.
Se proporciona un nuevo microorganismo
probiótico de bacterias de ácido láctico, seleccionadas por su
capacidad de sobrevivir y colonizar el tracto gastrointestinal de
un animal doméstico y ejercer una actividad probiótica beneficiosa
sobre la salud del animal doméstico.
La cepa probiótica puede seleccionarse de
lactobacilos, bifidobacterias o enterococos.
La cepa probiótica puede seleccionarse del grupo
formado por Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus
johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei,
Lactobacillus rahmnosus, Lactobacillus fermentum y
Bifidobacterium spp., Enterococcus faecium y
Enterococcus spp.
En una versión preferida, la capa probiótica se
selecciona del grupo formado por Lactobacillus reuteri
(NCC2581; CNCM I-2448), Lactobacillus
reuteri (NCC2592; CNCM I-2450), Lactobacillus
rhamnosus (NCC2583; CNCM I-2449),
Lactobacillus reuteri (NCC2603; CNCM I-2451),
Lactobacillus reuteri (NCC2613; CNCM I-2452),
Lactobacillus acidophilus (NCC2628; CNCM
I-2453), Enterococcus faecium SF68 (NCIMB
10415).
La nueva cepa bacteriana puede emplearse en
cualquier cantidad desde aproximadamente 1.0E+04 hasta
aproximadamente 1.0E+12 cfu/animal y día y de preferencia de
1.0E+05 hasta aproximadamente 1.0E+11 cfu/animal y día, con mayor
preferencia de 1.0E+07 hasta aproximadamente 1.0E+10 cfu/animal y
día.
La cepa bacteriana, como se ha descrito más
arriba, puede emplearse para la preparación de una composición
destinada al tratamiento y/o profilaxis de transtornos asociados con
la colonización del tracto intestinal de los animales domésticos
por microorganismos patogénicos.
En un aspecto, la invención se refiere al empleo
de la cepa bacteriana como se ha descrito más arriba, para la
preparación de una composición destinada para la regulación de la
respuesta inmunológica de los animales domésticos. Con el término
"regulación", de la respuesta inmunológica, se quiere
significar que las cepas bacterianas descritas más arriba tienen la
capacidad de, o bien estimular ciertas funciones inmunológicas que
son importantes para la salud del animal doméstico, o bien modular
otras funciones inmunológicas que podrían potencialmente estar
implicadas en transtornos inmunológicos tales como inflamación,
alergia, etc. La estimulación o modulación de estas funciones
inmunes puede lograrse empleando diferentes combinaciones de cepas
bacterianas descritas más
arriba.
arriba.
Puede efectuarse un método para mantener o
mejorar la salud del tracto gastrointestinal, la piel y/o el sistema
de pelaje o el sistema inmunológico de un animal doméstico, el cual
comprende el paso de alimentar un animal doméstico con una
composición alimenticia para animales domésticos que contiene por lo
menos una cepa aislada como se ha descrito más arriba.
Puede efectuarse además, un método para el
tratamiento y/o profilaxis de transtornos asociados con la
colonización del tracto gastrointestinal de animales domésticos por
micro-organismos patogénicos, el cual comprende el
paso de alimentar un animal doméstico con una composición
alimenticia para animales domésticos que contiene por lo menos una
cepa aislada de acuerdo con la presente invención.
Puede efectuarse un método para regular la
respuesta inmunológica en animales domésticos, que comprende el
paso de alimentar un animal doméstico con una composición
alimenticia para animales domésticos que contiene por lo menos una
cepa aislada de acuerdo con la presente invención.
Puede efectuarse un método para mejorar o
reducir los efectos de envejecimiento en un animal doméstico, el
cual comprende el paso de alimentación de un animal doméstico con
una composición alimenticia para animales domésticos que contiene
por lo menos una cepa aislada de acuerdo con la presente
invención.
Estos microorganismos seleccionados tienen un
impacto particular beneficioso sobre los animales domésticos en su
tracto gastrointestinal, sobre su piel y/o pelaje, sobre su sistema
inmunológico, y sobre los efectos del envejecimiento.
Tienen también un impacto particular beneficioso
sobre los patógenos intestinales tales como las cepas de
Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Shigella
dysenteriaea u otros animales colonizadores patogénicos
Enterobacteriaceae o parásitos tales como helmintos (Toxocara
spp.), protozoarios (Cryptosporidium spp, Giardia spp.,
Pentatrichomonas hominis, Entamoeba histolytica, Toxoplasma
gondii, ...) o levaduras.
Combinados con alimentos, estos microorganismos
ejercen particularmente sus efectos probióticos beneficiosos sobre
la sabrosidad, digestión y buena salud, la función inmunológica y
condiciones sanitarias, estas últimas por vía de contribuir a una
reducción del volumen fecal y por lo menos una parcial
desodorificación de las heces caninas. Así, una composición de
alimento para animales domésticos puede comprender un microorganismo
que tiene una alta actividad probiótica en animales domésticos,
siendo capaz de supervivencia y colonización del tracto
gastrointestinal del animal doméstico que lo ingiere.
De acuerdo con ello, puede emplearse una
composición alimenticia para animales domésticos destinada a la
salud del tracto gastrointestinal de animales domésticos, la cual
contiene por lo menos una cepa probiótica aislada como se ha
descrito más arriba, asociada a un soporte ingerible o una matriz
farmacéutica.
La invención se refiere también a una
composición para animales domésticos destinada a la regulación de la
respuesta inmunológica de animales domésticos, la cual contiene por
lo menos una cepa aislada como se ha descrito más arriba, asociada
con un soporte ingerible o una matriz farmacéutica.
Puede emplearse también una composición
alimenticia para animales domésticos destinada a la mejora o
reducción de los efectos del envejecimiento en animales domésticos,
la cual contiene por lo menos una cepa como se describe más arriba,
asociada a un soporte ingerible o una matriz farmacéutica.
Finalmente, puede emplearse una composición
alimenticia para animales domésticos destinada a la salud de la
piel y/o pelaje de los animales domésticos, la cual contiene por lo
menos una cepa aislada como se ha descrito más arriba asociada a un
soporte ingerible o una matriz farmacéutica.
En una versión, el soporte ingerible comprende
una composición alimenticia nutricionalmente equilibrada para
animales domésticos. Dicha composición contiene de preferencia
suficiente cantidad de la cepa aislada, para ser eficaz en
proporcionar dicho efecto profiláctico cuando la composición se
administra a un animal doméstico como una comida completa.
Dentro de la siguiente descripción, la
abreviación cfu
("colony-forming-unit")
("unidad formadora de colonias") designa el número de células
bacterianas detectadas mediante contaje microbiano sobre placas de
agar.
Además, "NCC" significa Nestlé Culture
Collection ("Colección de cultivos Nestlé") (Nestlé Research
Center,
Vers-chez-les-Blanc,
Lausanne, Suiza).
Con respecto al primer objetivo de la presente
invención, se seleccionaron por screening, 20 lactobacilos y 18
bifidobacterias aislados de las heces de gatos y perros, teniendo en
cuenta sus parámetros tecnológicos y fisiológicos.
Una primera selección para potenciales
aplicaciones probióticas se efectuó in vitro (ver ejemplos 1
y 2): características de crecimiento, tolerancia a la acidez
gástrica a diferentes pH y diferentes concentraciones de sales
biliares presentes en el duodeno, de manera similar a como se
encuentra en gatos y perros.
Además, la buena supervivencia de las células
liofilizadas en dos medios crioprotectivos diferentes se demostró
claramente a 4ºC y 20ºC como se indicó en un ensayo acelerado de
almacenamiento.
Estas cepas se caracterizan por unos tiempos
cortos de generación, altos contajes (mayores de 1.0E+08 cfu/ml)
durante su fase estacionaria y estabilidad en altos números de 8 a
24 horas post-inoculación, estabilidad al
liofilizado seguida de cualesquiera condiciones de almacenamiento,
resistencia a concentraciones fisiológicas de bilis encontradas en
el duodeno (2% de bilis) y baja inhibición cuando crecen en
presencia de hasta el 4% de bilis. Además, se tomaron en cuenta los
resultados del análisis de ADN, para seleccionar bacterias
representativas de la diversidad
investigada.
investigada.
Las cepas destinadas para la salud de los gatos
y perros pueden crecer hasta por lo menos 1.0E+06 cfu/ml en
presencia de hasta 2,0% de sales biliares. Las cepas pueden crecer
también hasta por lo menos 1.0E+06 cfu/ml después de
aproximadamente 2 horas a un margen de pH desde aproximadamente 3,4
hasta aproximadamente 4,2.
Las cepas bacterianas de acuerdo con la
invención pueden seleccionarse a partir del grupo formado por
Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii,
Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus
rahmnosus, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium sp.,
Enterococcus faecium, Enterococcus sp.
Las siguientes cepas Lactobacillus
reuteri NCC2581, Lactobacillus rahmnosus NCC2583,
Lactobacillus reuteri NCC2592, Lactobacillus reuteri
NCC2603, Lactobacillus reuteri NCC2613, y Lactobacillus
acidophilus NCC2628, fueron depositados a vía de ejemplo, bajo
el Tratado de Budapest, en la Colección Nacional de Cultivo de
Microorganismos, calle Dr. Roux 25, 75724 París, Francia, el 19 de
Abril de 2000, bajo las siguientes referencias CNCM
I-2448, CNCM I-2449, CNCM
I-2450, CNCM I-2451, CNCM
I-2452, CNCM I-2453,
respectivamente. Todas las restricciones a la disponibilidad de
estos depósitos serán retiradas después de la primera publicación de
esta solicitud u otra solicitud que reivindique el beneficio de
prioridad a esta solicitud.
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Se ensayaron además, treslactobacilos aislados
de gatos (NCC2581, NCC2592, NCC2583), tres lactobacilos de perros
(NCC2603, NCC2613, NCC2628), unabifidobacteria de gatos (NCC2627) y
una bifidobacteria de perros
(NCC2657), para detectar su actividad probiótica potencial en animales domésticos (ver ejemplos 3 y 4).
(NCC2657), para detectar su actividad probiótica potencial en animales domésticos (ver ejemplos 3 y 4).
En otra versión, la presente invención se
refiere al empleo de cepas bacterianas como se describe más arriba,
para la preparación de una composición alimenticia capaz de mejorar
o mantener la salud de animales domésticos.
Puede ser empleado en su forma viable, forma
inactivada, como un sobrenadante de un cultivo o fracciones del
mismo, p. ej., paredes celulares, peptidoglicano, citoplasma,
proteínas purificadas, metabolitos funcionales, moléculas
bioactivas.
Se emplean de preferencia en una cantidad desde
aproximadamente 1.0E+04 cfu/g hasta aproximadamente 1.0E+11 cfu/g y
de preferencia desde 1.0E+05 cfu/g hasta aproximadamente 1.0E+10
cfu/g, con mayor preferencia desde 1.0E+06 cfu/g hasta 1.0E+09
cfu/g.
En una versión preferida, pueden emplearse como
aditivos de la dieta para aumentar la calidad del alimento de los
animales domésticos y pueden incluirse en una cantidad desde
aproximadamente 1.0E+04 cfu/g hasta aproximadamente 1.0E+11 cfu/g.
Como aditivos de la dieta pueden estar encapsulados o pueden
proporcionarse en forma de polvo y envasarse conjuntamente con, o
separadamente de, una comida principal en húmedo o en seco. Por vía
de ejemplo, un polvo que contiene microorganismos seleccionados de
acuerdo con la invención, puede envasarse en bolsitas en forma de
polvo o en un gel o lípido u otra carga adecuada. Estas unidades
envasadas separadamente pueden ser proporcionadas juntas con una
comida principal o en envases de multiunidades para emplear con una
comida principal o como recompensa, de acuerdo con las
instrucciones al usuario. En otro ejemplo, la(s)
cepa(s) puede(n) proporcionarse en una envase unidad
de múltiples cámaras juntamente con un segundo componente ingerible,
por ejemplo una comida espesa húmeda o con un contenido medio de
humedad, o una partida del tamaño de una comida de galletas
desmenuzadas secas en una configuración de bolsa flexible. Una
primera cámara en la bolsa contendría la cepa probiótica y una
segunda cámara separada sellada contendría el segundo
componente
ingerible.
ingerible.
Estos microorganismos seleccionados tienen un
impacto particularmente beneficioso en los animales domésticos
sobre su tracto gastrointestinal, sobre su piel y/o pelaje, sobre su
sistema inmunológico, sobre su salud dental u oral, sobre sus
huesos y sobre los efectos del envejecimiento.
Se ha encontrado también que mejoran la
sabrosidad del alimento, la digestión, la función inmunológica y las
condiciones sanitarias (reducción del volumen fecal y parcial
desodorización de las heces caninas) en los animales
domésticos.
La presente invención se refiere también a una
composición alimenticia para animales domésticos para la mejora o
mantenimiento de la salud de los animales domésticos la cual
contiene por lo menos una cepa probiótica que tiene las
características anteriores, asociada con un soporte ingerible o una
matriz farmacéutica.
Por lo menos una cepa bacteriana que tiene las
características anteriores puede ser administrada a un animal
doméstico como suplemento a su dieta normal o como componente de un
alimento para animales domésticos, nutricionalmente completo.
La composición alimenticia para animales
domésticos nutricionalmente completa de acuerdo con la invención,
puede estar en forma de polvo seco o como un producto alimenticio
húmedo, congelado o autoestable para animales domésticos. Estos
alimentos para animales domésticos pueden producirse por métodos ya
conocidos en la técnica actual, con la condición de que cuando se
desea la actividad de un microorganismo, debe tenerse en cuenta el
asegurar la supervivencia de dicho microorganismo. Aparte de las
cepas bacterianas y/o su medio de fermentación, estos alimentos
para animales domésticos pueden incluir una cualquiera o varias
fuentes de almidón, una fuente de proteína y una fuente de
lípidos.
Fuentes adecuadas de almidón son por ejemplo,
cereales y legumbres tales como maíz, arroz, trigo, cebada, avenas,
soja y mezclas de los mismos.
Fuentes adecuadas de proteínas pueden
seleccionarse de cualquier animal adecuado o fuente vegetal de
proteínas; por ejemplo carne y harina, harina de pollo, harina de
pescado, concentrados de proteína de soja, proteínas de leche,
gluten y similares. Para animales mayores es preferible que la
fuente de proteína contenga una proteína de alta calidad.
Fuentes de lípidos adecuadas incluyen carnes,
grasas animales y grasas vegetales.
La elección de las fuentes de almidón, proteína
y lípidos estará en gran parte determinada por las necesidades
nutricionales del animal, consideraciones de sabrosidad y tipo de
producto aplicado. Para animales mayores, el alimento de los
animales domésticos contiene de preferencia proporcionalmente menos
grasa que los alimentos de animales domésticos para animales más
jóvenes. Además, las fuentes de almidón pueden incluir uno o más
del grupo arroz, cebada, trigo y maíz.
Además, varios otros ingredientes, por ejemplo
azúcar, sal, especias, condimentos, vitaminas, minerales, agentes
saborizantes, grasas y similares, pueden también ser incorporados en
el alimento para animales domésticos como se desee.
Para alimentos secos para animales domésticos es
un procedimiento adecuado la cocción por extrusión aunque pueden
emplearse el cocido al horno y otros procedimientos adecuados.
Cuando se cuece por extrusión el alimento para animales domésticos,
seco, se proporciona habitualmente en forma de galleta desmenuzada.
Si se emplea un hidrato de carbono probiótico, el probiótico puede
mezclarse con otros ingredientes del alimento seco para animales
domésticos, antes del procesado. Un proceso adecuado se describe en
la solicitud de la patente europea nº 0850569. Si se emplea un
microorganismo probiótico y se desea una actividad en el producto
final, el organismo es mejor que se incorpore recubriendo por
encima o se introduzca dentro del alimento seco para animales
domésticos. Un proceso adecuado se describe en la solicitud de
patente europea nº 0862863. Cuando no es necesaria la supervivencia
del microorganismo éste puede añadirse a la mezcla de extrusión,
como se desee.
Para alimentos húmedos, los procesos descritos
en las patentes US 4.781.939 y 5.132.137 pueden emplearse para
producir productos que simulen carne. Para la producción de
productos en pedazos grandes, pueden emplearse otros
procedimientos; por ejemplo cociendo en un horno de vapor.
Alternativamente pueden producirse productos tipo hogaza de pan,
emulsionando un material cárnico adecuado para producir una emulsión
cárnica, añadiendo un agente de gelificación adecuado, y calentando
la emulsión cárnica antes de envasar en latas u otros recipientes.
Como en el caso de la producción de alimentos secos para animales
domésticos en donde no es esencial la supervivencia de las especies
probióticas escogidas, puede añadirse la mezcla alimenticia antes de
cocer o calentar, o en cualquier fase apropiada o conveniente del
proceso de producción.
La cantidad de probiótico en el alimento para
animales domésticos es de preferencia inferior aproximadamente al
20% en peso y con mayor preferencia inferior aproximadamente al 10%
en peso. Por ejemplo, el probiótico puede comprender desde
aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 5% en peso del
alimento para animales domésticos. Para los alimentos para animales
domésticos que emplean achicoria como probiótico, la achicoria
puede incluirse desde aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente 10%
en peso de la mezcla alimenticia; con más preferencia desde
aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 5% en peso.
Los piensos para animales domésticos contienen
otros agentes activos tales como ácidos grasos de cadena larga.
Ácidos grasos de cadena alarga adecuados incluyen el ácido
alfa-linoleico, ácido
gamma-linoleico, ácido linoleico, ácido
eicosapentanoico, ácido docosahexanoico. Los aceites de pescado son
una fuente adecuada de ácidos eicosapentanoicos y ácido
docosahexanoico. El aceite de borraja, aceite de semilla de casis y
el aceite de onagra son fuentes adecuadas de ácido
gamma-linoleico. Los aceites de cártamo, aceites de
girasol, aceites de maíz y aceites de haba de soja son fuentes
adecuadas de ácido linoleico.
Si es necesario, los piensos para animales
domésticos se suplementan con minerales y vitaminas de forma que
sean nutricionalmente completos.
Además, si se desea, la cepa bacteriana puede
estar encapsulada; por ejemplo, en una matriz de azúcar, una matriz
de grasa o una matriz de polisacárido. También puede estar
recubierta como se describe en la patente EP 862 863.
La nueva cepa probiótica se emplea de
preferencia de manera que el pienso para animales domésticos
contenga de preferencia aproximadamente desde 1.0E+04 hasta 1.0E+10
células del microorganismo probiótico por gramo de pienso para
animales domésticos; con más preferencia desde aproximadamente
1.0E+06 hasta aproximadamente 1.0E+08 células del microorganismo
probiótico por gramo. El pienso para animales domésticos puede
contener desde aproximadamente 0,005% hasta aproximadamente 10% en
peso de la mezcla del microorganismo probiótico. De preferencia
contiene aproximadamente del 0,02% hasta aproximadamente el 6% en
peso y con más preferencia, aproximadamente del 1% hasta
aproximadamente el 6% en peso.
La cantidad de pienso para animales domésticos a
consumir por el animal doméstico para obtener un efecto beneficioso
depende del tamaño del animal doméstico, tipo de animal doméstico, y
edad del animal doméstico. Sin embargo, una cantidad del pienso
para animales domésticos para proporcionar una cantidad diaria de
aproximadamente 1.0E+03 - 1.0E+14 cfu de por lo menos una cepa
bacteriana de ácido láctico y/o el medio de fermentación
equivalente, sería habitualmente el adecuado. Aproximadamente se
administra 1.0E+09 a 1.0E+11 cfu/día para perros ó 1.0E+07 a
1.0E+10 cfu/día para gatos.
La composición de acuerdo con la invención tiene
una alta actividad probiótica y/o se encuentra que es
particularmente efectiva para mejorar y/o mantener saludable la
función digestiva en los animales domésticos, y mejorar y mantener
el tracto gastrointestinal, la piel y/o el pelaje, y/o el sistema
inmunológico, la salud de los animales domésticos. Esta composición
tiene también un impacto beneficioso sobre los efectos del
envejecimiento en gatos y perros.
La presente invención no está limitada en su
ámbito por las versiones específicas descritas en la presente. Los
ejemplos van precedidos de una breve descripción de las figuras.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Proliferación de linfocitos de células
mononucleares de sangre periférica canina (PMBC) después de la
estimulación con mitógenos o ésteres de forbol. Células PMBC
procedentes de perros adultos alimentados durante 4 semanas con
(barras negras) o sin (barras blancas) L. acidophilus NCC2628,
fueron estimuladas con diferentes mitógenos a dosis (\mug/ml)
indicadas en el gráfico. Mitógenos son PHA (fitohemaglutina), ConA
(concanavalina A), PWM (mitógeno Pokeweed) y éster de forbol son el
PMA/iono (miristato acetato de forbol y ionomicina). * = P<0,05,
ensayo t de Student.
Figura 2: Citocinas producidas por leucocitos
caninos estimulados con diferentes cepas de probióticos. Se
estimularon leucocitos de perros adultos normales con diferentes
cepas de lactobacillus aislados de animales domésticos durante 18
horas. Los cultivos de control contenían solamente el medio (control
negativo) o un aislado de lactobacillus humano ST11 (control
positivo). La identificación de citocinas se efectuó mediante una
RT-PCR. Su cuantificación se efectuó mediante
escaneado de geles de agarosa teñido con bromuro de etidio, y
determinando los pixeles relativos de cada banda empleando el
programa NIH Image. Los resultados están expresados como la media
de dos experimentos independientes en unidades arbitrarias (A)
IL-12, (B) IL-10, (C) IFN\gamma,
(D) TGF\beta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Numerosas cepas (de la colección Nestlé de
cultivos = NCC) se seleccionaron para su empleo probiótico potencial
para gatos y perros. En particular, fueron dictaminados los
potenciales de crecimiento, resistencia al liofilizado con
subsiguiente almacenamiento, tolerancia a la acidez gástrica y
diferentes concentraciones de sales bílicas encontradas en el
tracto gastrointestinal de gatos y perros, para los 20 lactobacilos
y 18 bifidobacterias aislados de las heces de gatos y perros, que
figuran en la tabla 1.
\newpage
Lactobacilos
Bifidobacterias
Los 20 lactobacilos y las 18 bifidobacterias se
aislaron de gatos y perros mantenidos con diferentes dietas, como
se muestra en la tabla 1. La identificación inicial se efectuó
mediante las características morfológicas y fisiológicas. Se
emplearon los sistemas API-50CH y
Rapid-ID32A (BioMérieux) para los lactobacilos y
bifidobacterias, respectivamente. Se congelaron cepas puras y se
depositaron a -80ºC en la
Nestec-Culture-Collection
("Colección Nestec de Cultivos") (NCC).
Para los ensayos, se cultivaron todas las
bacterias en un medio-caldo. Una muestra de cada
cepa reactivada se almacenó a -80ºC en 1 ml de medio crioprotector
(40% de glicerina + 60% de LL). Los cultivos se mantuvieron
preparando subcultivos sobre la base de una semana con el 1% de
inóculo en 10 ml de medio de crecimiento e incubación anaeróbica a
37ºC.
Los Lactobacilos fueron crecidos en MRS durante
18 horas: Las bifidobacterias fueron crecidas o bien en MRS + 0,05%
(p/v) de hidrocloruro de L-cisteína
(MRS-C) durante 32 horas, o bien en BHI + 0,05% de
hidrocloruro de L-cisteína (BHI-C)
durante 48 horas, partiendo de un inóculo al 5%.
Todos los cultivos fueron almacenados a +4ºC
entre las diferentes transferencias. La anaerobiosis se obtuvo
generalmente empleando un sistema anaeróbico
hidrógeno-dióxido de carbono (GasPak, Becton
Dickinson, USA). Las bifidobacterias se guardaron siempre en estos
recipientes durante el período de almacenamiento.
Ejemplo
2
Esta selección in-vitro
se basó sobre las características de producción para una aplicación
industrial de células viables, su capacidad de supervivencia a las
condiciones inhibidoras o perjudiciales gastrointestinales, y su
diversidad genómica. Se tuvo en cuenta la diversidad de cepas o la
similaridad genómica de las cepas no caracterizadas, empleando RAPD
y ribotipificación.
Las cepas que son capaces de producir
rápidamente un alto número de células tienen que ser identificadas.
Su ciclo de crecimiento bacteriano puede caracterizarse por una fase
de adaptación corta, un período de generación corto, contajes
máximos altos, y una fase estacionaria larga. Por lo tanto, las
cepas se compararon considerando tres variables: la duración de su
fase de adaptación, su período de generación (en horas) y sus
contajes máximos, las cuales corresponden a las características más
importantes.
200 ml de caldo MRS preincubado a 37ºC se
inocularon con 1% de un subcultivo recién preparado. Muestras de 1
ml se recogieron cada hora después de la inoculación, durante ocho
horas. Se tomó una muestra final después de 24 horas. Un ml de cada
muestra se diluyó 10 veces formando una serie de diluciones en TS
para el recuento. Fueron crecidos cultivos en agar de MRS (técnica
de vertido en placas), anaeróbicamente a 37ºC durante 48 horas.
Todas las placas con números de colonias entre 30 y 350 se
registraron como unidades formadoras de colonias (cfu) por ml de
cultivo y fueron por lo tanto tomadas en consideración para el
recuento.
En ensayos preliminares, todas las cepas se
contaron después de 24 horas de crecimiento en MRS-C
y caldo de TPYG. Los resultados se expresaron en cfu/ml. Las curvas
de crecimiento se establecieron determinando los números de células
crecidas en MRS-C después de 0,4,12,24,32 y 48
horas, de acuerdo con el protocolo descrito para los lactobacilos.
Con el fin de determinar la influencia del medio de subcultivo y de
optimización del desgaseado del medio de crecimiento, este ensayo
se realizó:
- \bullet
- a partir de un subcultivo en BHI-C, almacenado 48 horas a 4ºC, e inoculado en MRS-C
- \bullet
- a partir de un subcultivo en BHI-C, almacenado 48 horas a 4ºC, e inoculado en MRS-C bien desgaseado (la eliminación del oxígeno se optimizó mediante esterilizado del medio en autoclave dos veces y almacenándolo directamente en frascos anaeróbicos)
- \bullet
- a partir de un subcultivo recién preparado, en MRS, e inoculado en MRS-C bien desgaseado y almacenado en condiciones anaeróbicas antes del experimento.
Los medios sólidos se obtuvieron por adición de
agar Difco Bacto (15 g,1^{-1}). Los medios fueron autoclavados a
121ºC durante 15 minutos. Los medios líquidos para bifidobacterias
fueron o bien almacenados en condiciones anaeróbicas o bien
desgaseados antes de ser utilizados.
Cuando se ingieren, los microorganismos tienen
que sobrevivir a las condiciones del estómago y del duodeno para
ser capaces de ejercer una actividad beneficiosa en el tracto
gastrointestinal del animal. El pH gástrico y las sales biliares
son los principales componentes responsables de la regulación de la
flora bacteriana. Por lo tanto, el grado de resistencia de las
cepas a la acidez y a la bilis tiene que ensayarse.
La fisiología del tracto digestivo de gatos y
perros difiere de la de los humanos. El promedio de pH fue del 3,4
y 4,2 respectivamente en perros y animales. Para los ensayos se
recomendó una bilis de animal doméstico reconstituida (tabla 4). La
concentración de bilis en el intestino delgado varía en el margen de
0,5 a 2% cuando el alimento se digiere.
De acuerdo con los valores extremos de pH
encontrados en gatos y perros, los contajes viables después de 10
minutos a pH 2,6 y después de dos horas, o bien a pH 3,4 (cepas
aisladas de perros), o bien a pH 4,2 (cepas aisladas de gatos) no
deberían ser inferiores a 1.0E+06 cfu/ml.
Todos los lactobacilos se inocularon al 1% en
caldo de MRS y crecieron anaeróbicamente a 37ºC durante la noche.
Las bifidobacterias, inoculadas al 5% en BHI-C
crecieron durante 48 horas a 37ºC en condiciones anaeróbicas. Los
cultivos se pasaron a dos tubos de reacción de dos ml (Eppendorf) y
se centrifugaron a 3.500xg/10 minutos/20ºC. Se lavaron las células
tres veces con solución de Ringer. La resistencia a las condiciones
ácidas del estómago se ensayaron in vitro en tres jugos
gástricos simulados con valores del pH de 2,6, 3,4 y 4,2 ajustados
con HCl (Merck). Se emplearon filtros de un solo uso (Nalgene) para
todas las esterilizaciones por filtrado. Se estudió la
supervivencia de cada suspensión bacteriana añadiendo un ml a una
serie de cinco ml de jugo gástrico simulado (diferentes pH)
suplementados con 1,5 ml de una solución de NaCl al 0,5%.
Las muestras se incubaron a 37ºC y los
organismos viables se contaron de la siguiente manera:
- \bullet
- 0,1,5,10 minutos con jugo gástrico de pH 2,6
- \bullet
- 0,1,30,60,120,180 minutos cuando el jugo gástrico tenía, o bien un pH de 3,4 (para cepas aisladas de perros), o bien de 4,2 (para cepas aisladas de gatos)
Las muestras se diluyeron en tampón de fosfato
(pH 7,0), se plaquearon en agar de MRS-C y se
contaron.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la evolución de los contajes
viables de lactobacilos crecidos durante 18 horas en presencia de
varias concentraciones de bilis de animales domésticos,
reconstituida.
Dos contajes viables fueron considerados
significativamente diferentes cuando la desviación de su log_{10}
fue superior a 0,25. Cada cepa fue caracterizada mediante dos
variables:
- \bullet
- la concentración máxima de sal biliar analizada, cuando no se encontró ninguna diferencia significativa con el control
- \bullet
- la velocidad de decrecimiento en la viabilidad cuando la concentración de bilis en el medio de crecimiento, aumenta.
Las cepas caracterizadas por una pérdida
superior al log_{10} de sus contajes viables cuando la
concentración de bilis supera en 1% los pasos, fueron consideradas
sensibles a la bilis. Una reducción superior al log_{10} entre
células crecidas en presencia de 0 y 2% de bilis, y un log_{10}
por tanto por ciento adicional de bilis (superior al 2%), se
consideró aceptable. Además, solo debían seleccionarse las cepas que
produjeron más de 1.0E+06 cfu/ml cuando crecieron en presencia de
hasta el 2% de sales biliares, con el fin de asegurar un efecto en
el tracto gastrointestinal.
Se preparó una bilis de animal doméstico
reconstituida, a partir de gatos o perros, como se indica en la
tabla 4, y se esterilizó por filtrado antes de su utilización. En
un primer ensayo, los lactobacilos fueron crecidos anaeróbicamente
durante 24 horas en caldo de MRS a 37ºC y transferidos a un caldo de
MRS recién preparado más 0, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 2, 4% de bilis de
animal doméstico reconstituida estéril, durante 18 horas
adicionales. Las muestras se diluyeron 10 veces en serie, en TS,
para el contaje. Las diluciones de 1.0E-03 y
1,0E-05 fueron plaqueadas sobre agar de MRS,
empleando un WASP ("Plaqueador Whitley Automático en Espiral";
Don Whitley Scientific Limited, Inglaterra). Una vez secas, las
placas se invirtieron e incubaron 48 horas a 37ºC en frascos
anaeróbicos.
Floch y otros (1972) definieron una inhibición
como significativa, cuando en la misma se redujeron por lo menos 2
logs en el ensayo, en comparación con el crecimiento en el tubo de
control. En base a esto, todos los lactobacilos sensibles a
concentraciones de bilis en el primer ensayo y dos lactobacilos
resistentes al 4% de bilis fueron ensayados de manera similar en
presencia de 0, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4% de bilis. El segundo ensayo
tenía por fin determinar la repetibilidad y establecer si el número
de bacterias viables descendía ostentosamente con un aumento de la
concentración de bilis.
Por otro lado, esto indicó que estas cepas
fueron resistentes a la bilis durante este período de 18 horas. Se
establecieron las curvas de crecimiento en presencia de sales de
bilis para determinar si la fase de adaptación y la velocidad de
crecimiento fueron afectadas o no. Los ensayos se efectuaron con
lactobacilos crecidos en caldo de MRS suplementado con bilis de
animales domésticos reconstituida al 1%, de acuerdo con el protocolo
descrito para una medición temprana del crecimiento.
Las bifidobacterias se subcultivaron y crecieron
32 horas/37ºC/anaeróbicamente, empleando caldo de
MRS-C con bilis de animal doméstico reconstituida
al 0, 1, 2, 3 y 4%. Se aplicó el mismo método de contaje a las
diluciones de 1.0E-03, 1.0E-04 y
1.0E-05, como para los lactobacilos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la evolución de la supervivencia. Los
contajes viables inferiores a 10E+05 CFU/ml se consideraron como
demasiado bajos.
Para cada cepa, se inocularon 200 ml de caldo de
MRS al 3% con un subcultivo recién preparado. Los cultivos
crecieron durante 16 horas a 37ºC. Las condiciones sin aireación
(recipientes cerrados) se asumieron como esencialmente anaeróbicas.
Se contabilizaron las células viables, empleando el método de
vertido en placa descrito anterior-
mente.
mente.
Los cultivos se cosecharon por centrifugación a
3,500xg/+7ºC/20 minutos (centrífugas RC3C de Sorvall Instrument) y
se resuspendieron en 10 ml de dos medios crioprotectores diferentes.
Cada cepa se resuspendió en dos diferentes crioprotectores. Se
contabilizaron las suspensiones bacterianas concentradas (método de
vertido en placa) y se pasaron a viales (0,5 ml por ampolla). Las
muestras se congelaron a -196ºC en nitrógeno líquido y se secaron
al aire durante 18 horas. Después de la liofilización, se introdujo
nitrógeno a través de una válvula de admisión de aire del
liofilizador y se sellaron todas las ampollas. Todos los viales se
almacenaron a +4ºC y +20ºC durante seis meses. El número de células
viables por ampolla (para cada bacteria y medio de suspensión) se
determinó mensualmente.
En el marco de la selección de probióticos
potenciales para gatos y perros, los resultados de esta selección
in vitro de 20 lactobacilus y 18 bifidobacterias, basados en
sus potenciales de crecimiento, resistencia al liofilizado con el
subsiguiente almacenamiento, resistencia al pH gástrico y
concentraciones de bilis encontradas en el tracto gastrointestinal
de gatos y perros, están representados en la tabla 5.
Los 20 lactobacilos se clasificaron de acuerdo
con los criterios que satisfacían el estudio actual. Cuatro cepas
mostraron buenos resultados con respecto a sus características de
crecimiento, resistencia al pH gástrico, resistencia a la bilis y
su supervivencia durante el almacenamiento después de la
liofilización; L. reuteri NCC2581 (CNCM
I-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM
I-2450), L. reuteri NCC2603 (CNCM
I-2451) y L. reuteri NCC2613 (CNCM
I-2452). Fueron satisfechas las siguientes
características:
\bullet el período de generación fue inferior
a una hora cuando el crecimiento fue en MRS
\bullet la fase de adaptación fue corta (menos
de dos horas)
\bullet los contajes bacterianos fueron altos
(más de 1.0E+08 CFU/ml) durante la fase estacionaria del ciclo de
crecimiento y estables 8 y 24 horas después de la inoculación
\bullet las cepas fueron estables a través de
la liofilización y un subsiguiente almacenamiento de seis meses a
4ºC y 20ºC
\bullet las cepas fueron resistentes a una
concentración extrema de bilis, similar a la encontrada en el
tracto gastrointestinal de gatos y perros (2%)
\bullet ninguna inhibición significativa en
presencia de hasta el 4% de bilis en el medio
\bullet las cepas toleraron el pH 2,6 por lo
menos durante 10 minutos y se mantuvieron a niveles más altos de
1.0E+08 CFU/ml
\bullet las cepas fueron resistentes a un pH
gástrico promedio, durante por lo menos dos horas.
Por lo tanto, se seleccionaron dos lactobacilos
aislados de gatos (L. reuteri NCC2581 y L. reuteri
NCC2592) y dos aislados de perros (L. reuteri NCC2603 y L.
reuteri NCC2613) para ser estudiados para determinar su
actividad probiótica potencial. Se identificaron las cepas NCC2581,
NCC2592, NCC2603 y NCC2613 L. reuteri mediante
identificación API 50CH. Sin embargo, la ribotipificación mostró que
las cepas NCC2581 y NCC2592 tenían modelos muy parecidos, así como
también las NCC2603 y NCC2613, indicando de esta forma una probable
íntima relación. La cepa NCC2581 mostró muy buenas características y
la NCC2603 tuvo una resistencia a la bilis, mejor que la
NCC2613.
Los resultados referentes a las ocho
bifidobacterias aisladas de heces de gatos, permitieron una
selección en función de sus características de crecimiento, su
resistencia al pH gástrico y su sensibilidad a la bilis. La cepa
NCC2623 no tenía ninguna de las características deseadas, y no fue
recomendada para posteriores estudios. Por otro lado, la cepa
NCC2627 satisfizo todos los criterios:
\bullet su tiempo de generación fue inferior a
una hora cuando se hizo crecer en MRS-C
\bullet la fase de adaptación fue tan corta
como para los lactobacilos
\bullet los contajes fueron altos y estables
durante la fase estacionaria del ciclo de crecimiento
\bullet la cepa fue resistente a la extrema
concentración de bilis de forma similar a lo encontrado en el
tracto gastrointestinal de gatos y perros (2%)
\bullet ninguna inhibición significativa en
presencia de hasta el 4% de bilis en el medio.
\bullet la cepa toleró un pH 2,6 durante por
lo menos 10 minutos y se mantuvo a niveles mayores de 1.0E+06
CFU/ml
\bullet las cepas fueron resistentes a un pH
gástrico pro-medio durante por lo menos dos
horas.
La cepa NCC2627 fue mucho más resistente que la
NCC2623 y la NCC2635, mientras que estas tres cepas mostraron un
modelo muy parecido mediante el ribotipificado, indicando por lo
tanto una probable íntima relación (digestión con dos enzimas de
restricción: EcoRI y EcoRV).
Las diez bifidobacterias aisladas de los perros
mostraron solamente dos diferentes modelos cuando fueron
caracterizadas mediante la ribotipificación. Por lo tanto los
ensayos de resistencia a la bilis se efectuaron solamente con
cuatro cepas (dos de cada grupo): NCC2657, NCC2660, NCC2671 y
NCC2677. Estas cuatro cepas fueron todas resistentes a la
concentración máxima de bilis que pudo encontrarse in vivo
(2% de bilis) y las cepas NCC2660 y NCC2657 no tuvieron ninguna
disminución en los contajes viables cuando fueron sometidas a un
valor máximo de 4% de bilis. Como consecuencia, todas las
bifidobacterias aisladas de las heces de perros son más bien
resistentes a una alta concentración de bilis.
Teniendo en cuenta las características de
crecimiento, estas diez bacterias podían dividirse en dos
grupos:
- \bullet
- Cepas resistentes a la bilis y con buenas características de crecimiento: NCC2657, NCC2651, NCC2663 y NCC2667.
- \bullet
- Cepas resistentes a la bilis pero con características de crecimiento que no necesitan ser optimizadas para la producción industrial: NCC2660, NCC2671, NCC2677, NCC2647, NCC2654 y NCC2674.
Los resultados completos sobre la resistencia a
un pH gástrico extremo encontrado durante la digestión de gatos y
perros deberían permitir una mejor determinación de las cepas a
seleccionar para estudios posteriores. Solamente la cepa NCC2651 no
satisfizo los criterios de selección para la resistencia al pH.
Respecto a los resultados corrientes, pudieron
seleccionarse una cepa bifidobacteriana aislada de gatos, y tres
bifidobacterias aisladas de perros (respectivamente, las NCC2627,
NCC2657, NCC2663 y NCC2667)
\vskip1.000000\baselineskip
Se pasaron porciones de 9 ml en tubos y se
esterilizaron en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
Finalmente, se seleccionaron 8 de las 38 cepas
para otros estudios (ver ejemplo 3); tres lactobacilos aislados de
gatos (NCC2581, NCC2592, NCC2583), tres lactobacilos de perros
(NCC2603, NCC2613, NCC2628), una bifidobacteria de gatos (NCC2627)
y una bifidobacteria de perros (NCC2657).
Estas cepas se caracterizan por tiempos de
generación cortos, contajes altos (más de 1.0E+08 cfu/ml) durante
su fase estacionaria y estabilidad en valores altos, 8 y 24 horas
después de la inoculación, estabilidad al liofilizado seguido por o
bien condiciones de almacenamiento, resistencia a concentraciones
extremas de bilis encontrada en el duodeno (2% de bilis) y baja
inhibición cuando crecen en presencia de hasta el 4% de bilis.
Además, los resultados de los análisis del ADN fueron tenidos en
cuenta para seleccionar las bacterias representativas de la
diversidad
investigada.
investigada.
Se ensayaron el L. reuteri NCC2581, L.
reuteri NCC2592, L. rhamnosus NCC2583, y
Bifidobacterium sp NCC2627 en pruebas de alimentación para
evaluar su capacidad de supervivencia a través del tracto
gastrointestinal del gato.
16 gatos machos y hembras lo más iguales
posible, se sometieron a 3 días de adaptación alimentándose con
Friskies Grand Menu Boeuf. El protocolo de alimentación consistía
en 7 días con "Friskies Grand Menu" y 7 días de ensayo
con "Friskies Grand Menu" conteniendo una de las cepas
más arriba mencionadas: L. reuteri NCC2581 (dieta A),
L. reuteri NCC2592 (dieta B), L. rhamnosus NCC2583
(dieta C) y Bifidobacterium sp. NCC2627 (dieta D). La
asignación de la dieta fue la siguiente:
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\vskip1.000000\baselineskip
Dichas cepas se prepararon en una cantidad
suficiente y en una forma liofilizada estable, para aplicar estas
ocho bacterias diferentes con vistas a determinar la supervivencia
de las cepas en el tracto gastrointestinal de los animales
ensayados. Todas las cepas se mezclaron con 4 g de trehalosa con el
fin de añadir un suficiente volumen de carga para la mezcla de las
cepas preparadas con la matriz del alimento para los animales. Las
cepas de bacterias se prepararon en tubos de plástico individuales
(1.0E+09 cfu/día) y se añadieron diariamente a una parte de la
comida para tener la seguridad de que el total de bacterias sería
ingerido.
Se obtienen muestras fecales frescas para
analizar los niveles de población bacteriana y compararlos con la
línea base (sin bacterias añadidas). Las heces se recogen el
- día
- 7 y 8 (línea base)
- \quad
- 14 y 15
- \quad
- 21 y 22 (línea base)
- \quad
- 28 y 29.
Se emplea una sonda rectal estéril para obtener
una muestra fecal estéril de por lo menos 0,1 g. Esta muestra se
pesa exactamente y 0,1 g se mezcla con 10 ml de solución fisiológica
(Ringer) conteniendo 10% de glicerina. Esta solución se transfiere
a continuación en criotubos de 1 ml y se congelan en nitrógeno
líquido. A continuación se almacenan todas las muestras a -80ºC
hasta el análisis.
Se contaron las poblaciones endógenas de
lactobacilos, Bacteroides, enterobacteriáceas, enterococos,
bifidobacterias y Clostridium perfringens. Las bacterias se
detectaron en medios selectivos o semiselectivos.
Se efectuó una serie de diluciones de cien veces
en solución Ringer conteniendo 0,5% de cisteína, a partir de
diluciones en el margen de -2 a -8. Se inocularon cápsulas de Petri
de varios medios selectivos, y se incubaron (ver tabla a
continuación).
| *: \hskip0.2cm Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual, V. Suter, D. Citron y S. Finegold, 3ª edición |
| **: \hskip0.1cm Fosfomicina (79,5 mg/l + sulfametoxazol (0,93 mg/l) + trimetoprima (5 mg/l) |
| ***: Agar NN de Lowbury y Lilly, 1995 |
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\vskip1.000000\baselineskip
Resultados: Los contajes bacterianos
están expresados como logaritmo de base 10 y presentados en la tabla
7.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante el tratamiento, hemos observado un
aumento de los contajes fecales de lactobacilos, debido a las
ingestiones de la citada bacteria probiótica. No hemos observado
ningún drástico aumento en el contaje de Enterobacteriáceas
lo cual indica que no se ha producido ningún daño en el ecosistema
intestinal relacionado con el empleo de los probióticos
seleccionados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se ensayaron las cepas L. reuteri
NCC2603, L. reuteri NCC2613, L. acidophilus NCC2628 y
Bifidobacterium sp. NCC2657 en pruebas de alimentación para
evaluar su capacidad de supervivencia a través del tracto
gastrointestinal del perro.
10 perros, 5 machos y 5 hembras de 4 a 7 años de
edad, se sometieron a esta prueba específica. El protocolo de
alimentación consistía en 5 días de adaptación con "Friskies
Vitality" sin achicoria y 5 días de ensayo con
"Friskies Vitality" sin achicoria y 3 días de
adaptación, 5 días de ensayo con "Friskies Vitality" sin
achicoria + bacterias: L. reuteri NCC2603 (dieta E), L.
reuteri NCC2613 (dieta F), L. acidophilus NCC2628 (dieta
G) y Bifidobacterium sp. NCC2657 (dieta H). La asignación de
dietas fue la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Dichas cepas se prepararon en suficiente
cantidad y en una forma liofilizada estable para aplicar estas ocho
diferentes bacterias en vistas a la supervivencia en el tracto
gastrointestinal de los animales objeto del ensayo. Todas las cepas
se mezclaron con 4 g de trehalosa con el fin de añadir un volumen
suficiente de carga para mezclar las cepas preparadas con la matriz
de alimento para los animales. Las cepas de las bacterias se
prepararon en tubos de plástico individuales (5.0E+09 cfu/día) y se
añadieron diariamente a una parte del alimento para tener la
seguridad de que todas las bacterias habían sido ingeridas.
Se obtienen muestras fecales frescas para
analizar los niveles de la población bacteriana y compararlos con
la línea base (sin bacterias añadidas).
- Las heces se recogen el día
- 7 y 8 (línea base)
- \quad
- 14 y 15
- \quad
- 21 y 22 (línea base)
- \quad
- 28 y 29
Se emplea una sonda rectal estéril para obtener
una muestra fecal de por lo menos 0,1 g. Esta muestra se pesa
exactamente y 0,1 g se mezcla con 10 ml de solución
fisiológica (Ringer) conteniendo 10% de glicerina. Esta solución
se transfiere a continuación en criotubos de 1 ml y se congelan en
nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenan a continuación a
-80ºC hasta el análisis. Las bacterias se contaron en el mismo
medio que se describe en el ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados: los contajes microbianos
expresados como logaritmo de base 10, están registrados en la tabla
8.
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\vskip1.000000\baselineskip
Durante el tratamiento no observamos ningún
cambio importante en los contajes fecales de lactobacilos, debido a
las ingestiones de bacterias probióticas seleccionadas excepto en el
caso de la cepa L. acidophilus NCC2628. En las condiciones
ensayadas, el efecto inhibidor del C. perfringes no fue
significativo puesto que el nivel de base del C. perfringes
fue muy bajo. No observamos ningún aumento drástico en el contaje
de enterobacteriáceas que indicara que no había ningún transtorno
del ecosistema intestinal relacionado con el empleo de probióticos
seleccio-
nados.
nados.
Ejemplo
5
Estudiamos el efecto de sobrenadantes filtrados
de cultivos de cepas de Lactobacilos aisladas de gatos y perros.
Cepas bacterianas y cultivos: Los
microorganismos pertenecientes al género Lactobacillus procedían de
Nestlé Culture Collection. Las bacterias fueron crecidas en medio
MTYI. Los sobrenadantes conteniendo metabolitos de lactobacilos
fueron neutralizados a pH 6 y esterilizados por filtración.
Se efectuaron controles mediante acidificación
del medio MTYI con ácido láctico al mismo pH que el de los cultivos
bacterianos. A continuación, se ajustó el pH al valor 6 con NaOH
0,1N. El origen de la cepa en estudio y el pH de los sobrenadantes
y controles están mostrados en la tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parásitos: La cepa Giardia intestinalis
WB (ATCC 30957) se adquirió en American Type Culture Collection
(Rockville, USA). Los trofozoitos se crecieron en medio
TYI-S-33 modificado con Keister,
conteniendo por litro: digesto de caseína (Difco), 20 g; extracto
de levadura (BBL), 10 g; dextrosa (Merck), 10 g; bilis bovina
(Difco), 0,75 g; NaCl (Merck), 2 g; L-cisteína.HCl
(Sigma), 2 g; sal sódica del ácido ascórbico (Fluka), 0,2 g;
K_{2}HPO_{4} (Merck), 0,6 g; citrato férrico amonio (Sigma),
22,8 mg; suero bovino adulto (Sigma), 100 ml;
penicilina/streptomicina (Gibco, 1000 IU/ml, 1000 \mug/ml), 15
ml, el pH se ajustó a 6,9 con NaOH 5N antes de la esterilización
por filtrado (0,22 \mum de tamaño de poro).
Los parásitos se cultivaron en frascos de
poliestireno de cultivo de tejidos (LUX, Miles Laboratories, Inc.
Naperville IL 60540) llenados con 40 ml de medio de cultivo. Se
efectuaron subcultivos, descartando el sobrenadante con parásitos
no unidos, añadiendo 5 ml de medio de cultivo enfriado con hielo,
incubando en un baño de hielo durante 10 minutos para despegar los
tropozoitos adheridos e inoculando 0,2 ml de la suspensión
resultante en medio recién preparado. Las incubaciones de
efectuaron a 37ºC en la oscuridad.
Ensayos de proliferación: Doscientos microlitros
de suspensiones de tropozoitos (1,4 x 10^{5} parásitos/ml) se
mezclaron con 100 \mul de sobrenadantes o controles y se añadió 1
\muCi de H^{3} timidina. Las muestras se incubaron a 37ºC
durante 24 horas en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos
(Nunc Brand Products). A continuación se recogieron los parásitos y
se evaluó la incorporación de timidina.
La incorporación de timidina se muestra en la
tabla 10. La cepa NCC 2628 aislada de un perro, produjo una fuerte
inhibición de la proliferación de la cepa WB (91%). Otras cepas
estudiadas no inhibieron el crecimiento de los trofozoitos.
En este experimento se pudo demostrar que los
metabolitos funcionales producidos durante el crecimiento del L.
acidophilus NCC 2628 tienen un efecto inhibidor muy fuerte
sobre el crecimiento de la Giardia intestinalis.
Ejemplos 6 a
8
Para identificar cepas con fuertes propiedades
antagonistas contra los patógenos del intestino delgado, se
efectuaron experimentos de co-cultivo en un sistema
de modelo simulando las condiciones del intestino delgado canino
(pH, bilis, composición y concentración, mucina, pancreatina). El
jugo del intestino delgado canino simulado contenía, bilis canina
reconstituida (0,345 g/litro de tauroquenodesoxicolato de Sigma,
Alemania; 0,7 g/litro de taurodesoxicolato, Sigma, Alemania; 3,04
g/litro de taurocolato, Sigma, Alemania; 0,006 g/litro de colato
Fluka, Suiza), mucina de porcino (1,9 g/litro de Sigma, Alemania),
pancreatina porcina (2,42 g/litro, Sigma, Alemania) y solución de
electrolitos (5 g/litro de NaCl, 0,6 g/litro de KCl, 0,25 g/litro de
CaCl_{2} todo de Merck, Alemania). El pH del jugo se ajustó a pH
6,5 \pm 0,5 con NaOH 0,1 N.
Se seleccionaron cuatro cepas potencialmente
patogénicas: S. typhimurium SL 1344, E. coli ETEC
08:H9 y E. coli 0149:K88 (aislado canino patogénico) y un
aislado clínico de Sh. dysenteriae (de origen humano,
amablemente proporcionado por el Centre Hospitalier Universitaire
Vaudoise - CHUV Lausanne, Suiza). Con la excepción del S.
typhimurium SL1344 propagado en caldo Luria Bertani (Difco,
USA), todas las enterobacteriáceas fueron crecidas en caldo
de Brain Heart Infusión ("infusión de sesos y corazón") (Difco,
USA) a 37ºC con agitación (240 rpm).
Se seleccionó un amplio margen de lactobacilos
de origen canino y felino, que incluían el L. acidophilus
NCC2628 (CNCM I-2453), L. rhamnosus NCC2583
(CNCM I-2499, L. reuteri NCC2581 (CNCM
I-2448), L. reuteri NCC2592 (CNCM I.2450), a
partir de la Nestlé Culture Collection (NCC, Nestec, Suiza) y se
sometieron a screening en el modelo de intestino delgado canino
para determinar la supervivencia, actividad fisiológica y efectos
inhibidores sobre los patógenos del intestino delgado mencionados.
Los lactobacilos fueron cultivados anaeróbicamente
(anaerocult, Oxoid, Inglaterra) en caldo Man Rogosa Sharp (Difco,
USA) a 37ºC.
Se diluyeron las muestras en tampón de fosfato
estéril (NaH_{2}PO_{4}, pH 7,02 M), y diluciones de 10 veces se
plaquearon en superficie, sobre las siguientes placas de agar: agar
MRS (Difco, USA) para lactobacilos, agar de
Salmonella-Shigella (Oxoid, Inglaterra) para S.
typhimurium y Sh. dysenteriae, y agar de Sorbitol Mac
Conkey (Oxoid, Inglaterra) para E. coli. Las placas de agar
se incubaron 48 horas a 37ºC anaeróbicamente para los lactobacilos,
y 24 horas a 37ºC para las enterobacteriáceas. Para ensayos
de co-cultivo, el crecimiento de las
enterobacteriáceas sobre agar de MRS fue inhibido mediante la
adición de polimixin (Oxoid, Inglaterra).
Se efectuaron experimentos de
co-cultivo con LAB potencialmente probióticas y
cepas patogénicas, a 37ºC en 20 ml (tubos Falcon) de jugo de
intestino delgado canino simulado enriquecido con diferentes fuentes
de carbono (azúcar, comida para animales domésticos) para favorecer
la actividad metabólica de los cultivos. Las LAB fueron inoculadas
con 10E+08 cfu/ml, los patógenos con 10E+02 cfu/ml, 10E+04 cfu/ml y
10E+06 cfu/ml. Las muestras se tomaron en diferentes momentos hasta
8 horas y se determinaron los contajes de células viables mediante
el plaqueado en superficie de diluciones de 10 veces sobre los
respectivos medios.
Se efectuaron ensayos de
co-cultivo en diferentes condiciones que incluían el
enriquecimiento de jugo de intestino delgado canino simulado, con
dextrosa (5 g/litro) y diferentes concentraciones de comida para
animales domésticos extrusionada comercialmente adquirible (5, 25 ó
100 g/litro; Friskies ALPO Complete, USA). Este último se
homogeneizó (Stomacher Lab Blender) y se suspendió en solución de
electrolitos. Todos los experimentos se efectuaron por
duplicado.
Se efectuaron experimentos de
co-cultivo entre cuatro lactobacilos y cuatro cepas
potencialmente patogénicas E. coli ETEC O8:H9, E.
coli O149:K88, S. typhimurium SL1344 y Sh.
dysenteriae, en jugo duodenal canino simulado enriquecido con 5
g/litro de dextrosa (Difco). Los lactobacilos se inocularon a 10E+08
cfu/ml y las cepas indicadoras gram negativas a 10E+02 cfu/ml. Los
resultados están compilados en la tabla 11.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los cuatro lactobacilos investigados demostraron
tener actividad antimicrobiana pero solamente el L.
acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) y L.
rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) demostraron
tener una alta actividad contra todos los patógenos ensayados.
Ambas cepas fueron no solamente capaces de inhibir el crecimiento
sino que fueron también capaces de inactivar completamente los
patógenos contenidos en el sistema de ensayo (ninguna célula viable
presente).
Se efectuaron experimentos de
co-cultivos entre los lactobacilos L.
acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453), L.
rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) y S.
typhimurium SL1344 en jugo duodenal canino simulado enriquecido
con comida para animales domésticos seca extrusionada comercialmente
adquirible (5,25 ó 100 g/litro; Friskies ALPO Complete, USA). Los
lactobacilos se inocularon a 10E+08 cfu/ml y las cepas indicadoras
gram negativas se inocularon a 10E+02 cfu/ml. Los resultados están
compilados en la tabla 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados demostraron el alto potencial
especialmente del L. acidophilus NCC2628 (CNCM
I-2453) para inhibir el crecimiento e incluso para
inactivar completamente los patógenos del intestino delgado en
condiciones muy prácticas tales como en una mezcla de jugo de
intestino delgado simulado y comida para animales domésticos. La
actividad antimicrobiana del L. acidophilus NCC2628 fue muy
alta incluso con bajos niveles de enriquecimiento con comida
comercial para animales domésticos sirviendo de fuente de azúcares
para el organismo. En contraste con esta observación hecha para el
L. acidophilus NCC2628, la efectividad del L.
rhamnosus NCC2583 (CNCM I-2449) fue función del
nivel de enriquecimiento con comida para animales domésticos, de
manera que se observó una creciente actividad antimicrobiana con
cantidades crecientes de comida para animales domésticos añadidos
al sistema de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se efectuaron experimentos de
co-cultivo con L. acidophilus NCC2628 (CNCM
I-2453) y diferentes niveles de inoculación de
S. typhimurium SL1344, en jugo duodenal canino simulado
enriquecido con dextrosa (5 g/litro, Difco). El L.
acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) se inoculó
a 10E+08 cfu/ml, S. typhimurium SL1344 se inoculó a 10E+02
cfu/ml, 10E+04 cfu/ml y 10E+06 cfu/ml. Los resultados están
compilados en la tabla 13.
\vskip1.000000\baselineskip
| + \hskip0.28cm Inhibición del crecimiento |
| ++ \hskip0.1cm Inhibición del crecimiento y parcial inactivación |
| +++ Inhibición del crecimiento y completa inactivación |
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad antimicrobiana del L.
acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) fue
suficientemente alta para inactivar completamente incluso, una alta
concentración inicial de S. typhimurium SL1344.
\newpage
Ejemplo
9
Se investigó el potencial estimulador
inmunológico para cepas aisladas de animales domésticos de
probióticos, en una prueba clínica empleando la cepa L.
acidophilus NCC 2628.
20 perros de 4 a 7 años de edad fueron sometidos
a esta prueba. El protocolo de alimentación consistió en una semana
de adaptación con "Friskies Vitality" sin achicoria y 4
semanas de ensayo con "Friskies Vitality" sin achicoria
+ bacterias de L. acidophilus NCC2628.
El L. acidophilus NCC2628 se preparó en
una cantidad suficiente y en una forma liofilizada estable con
vistas a la supervivencia de la cepa en el tracto gastrointestinal
de los animales ensayados. Las bacterias se mezclaron con 4 g de
trehalosa con el fin de añadir un volumen suficiente de carga para
la mezcla de las bacterias preparadas con la matriz de alimento
para los animales. Las bacterias se prepararon en tubos individuales
de plástico (5.0E+08 cfu/día) y se añadieron diariamente a una
parte de la comida para tener la seguridad de que el total de las
bacterias habían sido ingeridas.
Se recogió sangre de los perros después de
cuatro semanas de administración probiótica. La sangre se fraccionó
a través de una columna Vaccutainer^{TM} (Becton Dickinson,
Mountain View, CA). Las PBMC se recubrieron de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante.
Las células se estimularon con diferentes
mitógenos o ésteres de forbol que inducen una fuerte proliferación
de células T (concanavalina A (coc A), Phytohemaglutinina (PHA)),
células B (Pokeweed mitogen (PWM)), y de todas las células
(Forbol-miristato-acetato/Ionomicina
(PMA/Iono)). Se incubaron 10^{5} por pocillo con mitógenos o
ésteres de forbol (las dosis respectivas están indicadas en la
figura 1) en un volumen final de 200 \mul de medio de cultivo
RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal
y antibióticos en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo plano
(Nunc).
Las células se conservaron en atmósfera de 5% de
CO_{2} humidificada a 37ºC durante 48 horas. Las células se
marcaron a impulsos con 1 \muCi de [H^{3}]timidina
(Amersham Pharmacia Biotech, Suiza) durante 18 horas más. A
continuación, las células se recogieron sobre filtros de
nitrocelulosa (Packard) y la [H^{3}]timidina unida se
midió por centelleo (TopCount; Packard, Suiza). La proliferación
celular se calculó como la media de triplicados (contajes por
minuto (c.p.m.) (\pm desviación estándar).
Figura 1: Se observó un claro aumento de la
proliferación celular en respuesta a todos los mitógenos en el
grupo del perro alimentado con L. acidophilus NCC2628
comparado con el grupo de control. Este aumento fue significativo
en cultivos estimulados con los ésteres de forbol PMA + ionomicina.
Estos datos muestran que las células linfoides de perros
alimentados probioticamente fueron más reactivas después de la
activación in vitro y sugieren que el sistema inmunológico
de los perros alimentados probioticamente ha sido estimulado.
Se efectuó un screening in vitro de
diferentes cepas de lactobacilos aislados de animales domésticos
descritos más arriba para determinar su modulación inmunológica
potencial. Para esta finalidad, medimos su capacidad para inducir
citocinas proinflamatorias (IL-12, IFN\gamma) y/o
citocinas antiinflamatorias (IL-10,
TGF-\beta) (Anand A.C., Adya C.M. 1999, Trop.
Gastroenterol.; 20(3):97-106; Spellberg
B., Edwards J.E. Jr 2001, Clin. Infect. Dis.;
32(1):76-102). Esto tiene el objetivo de
seleccionar cepas de candidatos potenciales para funciones
fuertemente anti-patogénicas o funciones
inmunológicas anti-cancerosas así como también
funciones antagonistas contra patologías intestinales caninas tales
como la alergia e inflamación (enfermedades inflamatorias del
intestino). Se efectuaron cultivos adicionales con medio solo
(control negativo), con Enterococcus faecium cepa SF68
(NCIMB 10415, Cerbios-Pharma, Suiza) y con un
aislado de lactobacilo humano ST11 (NCC 2461, CNCM
I-2116) (control positivo).
Sangre de perros adultos normales, se trató 5
minutos a temperatura ambiente con tampón ACK de lisis (150 mM de
NH_{4}Cl, 1 mM de KHCO_{3} y 0,1 mM de Na_{2}EDTA en H_{2}O,
pH = 7,4). Los leucocitos se lavaron dos veces con medio RPMI (sin
antibióticos) y se sembraron a 2.10^{6} células/ml en placas de
cultivo de tejidos de 24 pocillos. Se añadió a cada pocillo, 1 ml
de una suspensión bacteriana (descrita más adelante) que contenía
10^{6} CFU.
Para el tratamiento de control, se añadió medio
solamente a los leucocitos. Las muestras se incubaron 18 horas a
37ºC y 5% de CO_{2}. A continuación se recogieron los leucocitos,
se lavaron en PBS y se centrifugaron. El sedimento de células se
lisó con 500 \mul de reactivo Trizol (Gibco BRL). Se extrajo el
ARN de los lisados celulares empleando el kit de ARN Nucleospin
(Macherey-Nagel). Se efectuaron
RT-PCR para amplificaciones de citocinas caninas
empleando el kit de genes AB (Merck). Las referencias de los
cebadores (todos producidos por Microsynth) están indicadas más
adelante. Se efectuó el análisis densitométrico de las bandas de la
PCR aparecidas en los geles de agarosa pulverizada con bromuro de
etidio, empleando el programa de software NIH Image. Todas las
bandas se normalizaron con la respectiva banda del producto PCR
\beta-actina obtenida con cada muestra (control
interno) y los resultados se expresaron en forma de unidades
arbitrarias reflejando las densidades de píxeles de cada banda del
producto PCR citocina (figura 2).
- -
- Preparación de las bacterias: las diferentes cepas de lactobacilos fueron crecidas en medio MRS durante aproximadamente 8 horas hasta que alcanzaron idéntica densidad. Las bacterias se diluyeron en medio RPMI sin antibióticos hasta la concentración final de 10^{6} CFU/ml.
- -
- Cebadores empleados para las RT-PCRs de las citocinas:
Figura 2: Los datos muestran que los perfiles de
citocina inducidos por los lactobacilos son dependientes de la
cepa. Por ejemplo, la cepa NCC2628 indujo altos niveles de
IL-10 y TGF-\beta destacando el
potencial particular para esta cepa para la modulación inmunológica
de los transtornos inflamatorios tales como la alergia y
enfermedades inflamatorias del intestino. En contraste, la cepa
NCC2583 indujo fuertes niveles de IFN\gamma y
IL-12, lo cual hizo que esta cepa fuera un buen
candidato para la actividad antipatogénica o
anti-cancerosa.
Se utilizan tres comidas secas para animales
domésticos. Las mismas, se designan como "A", "B" y
"C". La comida para animales domésticos "A" es una comida
para animales domésticos, seca, nutricionalmente completa,
adquirible con el nombre comercial de ALPO (ALPO es una marca
registrada de la firma SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A. de
Suiza).
La comida para animales domésticos B es la misma
comida para animales domésticos, seca, nutricionalmente completa,
que la comida para animales domésticos A, pero está suplementada con
una mezcla en polvo de microorganismos probióticos seleccionados,
que se suministra aparte en una bolsa que la contiene. La mezcla
comprende substancialmente iguales cantidades de L.
acidophilus NCC2628 y bifidobacterium sp. NCC2657. Dicha
mezcla se esparce sobre el alimento en cada comida a administrar,
siendo la dosificación suministrada aproximadamente 1.0E8
cfu/día.
La comida para animales domésticos C es una
comida para animales domésticos, seca, nutricionalmente completa,
substancialmente idéntica a la comida para animales domésticos A
pero que contiene 1,2% en peso de un sobrenadante seco de un
cultivo de Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415).
Se emplearon 30 perros en el estudio. Los perros
se alimentaron previamente durante 8 semanas empleando la comida
para animales domésticos A. A continuación, los perros se dividen en
tres grupos de 10 perros cada uno, que se designan como grupos A, B
y C y se alimentan con las dietas designadas correspondientemente
con la misma letra, durante 8 semanas:
Los perros tienen libre acceso al agua y se
alimentan una vez al día. La prevalencia de la caspa en el pelaje
se determina por un panel de evaluación de 30 expertos, al inicio y
a continuación, 7 semanas más tarde.
Los perros se acicalan antes de la evaluación
por el panel y los miembros del mismo no comparan sus notas durante
la evaluación.
En esta evaluación los perros se presentan a
cada uno de los panelistas individuales, en 20 parejas diferentes.
Los panelistas son requeridos para indicar en sus hojas de
puntuación qué perro de la pareja exhibida presenta (1) menos
caspa, (2) un mayor brillo del pelaje, y (3) menos olor en el
pelaje.
La condición total del pelaje de todos los
perros es visualmente y táctilmente buena como podía esperarse en
perros normales, saludables. Sin embargo, en los perros que fueron
alimentados con la dieta C, se observa que tienen sensiblemente
menos caspa que los alimentados con la dieta de control A. Los
alimentados con la dieta B exhiben sensiblemente un pelaje más
brillante y tiene sensiblemente menos olor de pelaje que los del
grupo A. Se observa que estas características no difieren
sensiblemente estadísticamente cuando se comparan con las de los
perros del
grupo B.
grupo B.
Se prepara una mezcla de alimentación con
aproximadamente el 58% en peso de maíz, aproximadamente el 6% en
peso de gluten de maíz, aproximadamente el 23% en peso de carne y
harina, completando el resto con sales, vitamina y minerales.
La mezcla de alimentación se introduce en un
preacondicionador y se humidifica. A esta mezcla se añade un polvo
que contiene una mezcla de las siguientes cepas de
Lactobacillus: Lactobacillus rhamnosus NCC2583 (CNCM
I-2449), Lactobacillus acidophilus NCC2628
(CNCM I-2453) y Enterococcus faecium SF68
(NCIMB 10415). El polvo se dispersa substancialmente homogéneamente
a través de la mezcla. La mezcla de alimentación humedecida se
introduce a continuación en una extrusionadoracocedora y se
gelatiniza. La matriz gelatinizada que deja la extrusionadora es
forzada a través de una tobera y se extrusiona. El producto
extrusionado se corta en trozos adecuados para la alimentación de
perros, se seca aproximadamente a 110ºC durante aproximadamente 20
minutos, y se enfría para formar pequeños gránulos. Los trozos
extrusionados se comprueban para determinar la actividad bacteriana
de las cepas añadidas. No se detecta ninguna.
Ejemplo
13
Se utilizan 24 perros en este estudio. El
conjunto incluye perros más jóvenes y perros más viejos, siendo
estos últimos de 8 a 12 años de edad. Los perros más viejos
seleccionados presentan signos externos de inflamación de las
articulaciones proporcionada a sus edades y a veces parecen
experimentar alguna dificultad de movimiento. Ciertos movimientos
parecen ser dolorosos. Estos síntomas se observan a menudo en los
perros más viejos y se cree que están relacionados con condiciones
artríticas.
Se emplean en el estudio, tres alimentos secos
para animales domésticos, los cuales se designan A, B y C. El
alimento A para animales domésticos es un alimento seco para
animales domésticos, nutricionalmente completo (ALPO Beefy Dinner).
Este es el alimento de control.
Los 24 miembros del grupo seleccionado se
alimentan previamente durante 8 semanas empleando el alimento para
animales domésticos A. Los perros se dividen a continuación en 3
grupos, A, B y C, teniendo cada uno 8 perros, y la misma proporción
de perros más jóvenes y perros más viejos en cada grupo. A
continuación, cada grupo se alimenta con las siguientes respectivas
dietas durante 8 semanas:
El alimento para animales domésticos B es un
alimento seco para animales domésticos nutricionalmente completo,
el cual es substancialmente idéntico al alimento para animales
domésticos A, pero que contiene una capa de hasta el 2% de su peso,
comprendiendo dicha capa los microorganismos de Enterococcus
faecium SF68 (NCIMB 10415). La cantidad de alimento
suministrado diariamente a cada perro se calcula de acuerdo con la
masa corporal individual, de manera que la dosificación es de
1.0E+09 cfu/día.
La dieta C comprende la galleta extrusionada
producida en el ejemplo 12 de más arriba. La cantidad de alimento
suministrado diariamente a cada perro se calcula de acuerdo con la
masa corporal individual, de forma que la dosificación de
microorganismos es de 1,0E+11 cfu/día.
Los perros tienen libre acceso al agua y son
alimentados una vez al día. Un medidor de actividad está sujeto al
collar de cada perro y se toman medidas diariamente. Se evalúa
también la actividad de los perros visualmente por el personal de
la perrera.
La condición de todos los perros es visualmente
y táctilmente buena, como puede esperarse de perros normales y
saludables. Sin embargo, los perros de los grupos que reciben las
dietas B y C de comida para animales doméstico son notablemente más
activos que sus oponentes de la dieta A. Las lecturas del contador
confirman estas observaciones.
Además, los perros mas viejos de los grupos B y
C después de ser alimentados con las dietas B y C durante el
período de ensayo, parecen tener menos signos externos de
inflamación en las articulaciones locales. Además, los perros
parecen experimentar niveles menores de dolor en el movimiento
físico y se mueven más libremente que antes. Puede concluirse que
las dietas B y C parecen proporcionar alivio con respecto a ciertas
señales de envejecimiento y mejoran la motilidad de los animales
domésticos más viejos.
Se prepara una mezcla alimenticia de
aproximadamente 58% en peso de maíz, aproximadamente 6% en peso de
gluten de maíz, aproximadamente 23% en peso de harina de pollo,
completando el resto, sales, vitaminas y minerales.
La mezcla alimenticia se pasa a un
preacondicionador y se humedece. El pienso humedecido se introduce a
continuación en una extrusionadoracocedora y se gelatiniza. La
matriz gelatinizada que abandona la extrusionadora es forzada a
través de una tobera y se extrusiona. El producto extrusionado se
corta en trozos adecuados para la alimentación de gatos, se seca a
aproximadamente 110ºC durante 20 minutos, y se enfría para formar
gránulos. En este momento se incorpora un polvo liofilizado de una
o más cepas de las siguientes especies de Lactobacillus para
su aplicación a los gránulos: Lactobacillus rhamnosus NCC2583
(CNCM I-2449), Lactobacillus acidophilus
NCC2628 (CNCM I-2453) ó Enterococcus faecium
SF68 (NCIMB 10415). Se añade de esta forma el polvo suficiente para
que la cantidad de ingesta de la dieta correspondiente para el gato
sea de aproximadamente 1.0E+07 - 1.0E+9 cfu/día. Parte del polvo se
mezcla en una primera masa de gránulos y se envasa en sacos. Se mide
una segunda cantidad de polvo y se mezcla con una carga lípida que
a continuación se pulveriza sobre una segunda masa de gránulos. Los
gránulos se envasan en sacos después de que esta capa se ha secado
suficientemente a 50-60ºC durante algunos
minutos.
Se prepara una mezcla del 73% de pollos muertos,
pulmones de cerdo e hígado de buey (molido), 16% de harina de
trigo, 2% de colorante, vitaminas y sales inorgánicas. Esta mezcla
se emulsiona a 12ºC y se extrusiona en forma de un pudding que a
continuación se cuece a una temperatura de 90ºC. Se enfría a 30ºC y
se corta a trozos. El 45% de estos trozos se mezcla con 55% de una
salsa preparada con 98% de agua, 1% de colorante y 1% de goma guar.
Se llenan latas de hojalata y se esterilizan a 125ºC durante 40
minutos. Como suplemento probiótico para ser mezclado con el
alimento para animales domésticos antes de servirlo, se adjunta un
envase aparte en forma de sobre con cepas de las siguientes
especies de Lactobacillus: Lactobacillus rhamnosus
NCC2583 (CNCM I-2449), Lactobacillus
acidophilus NCC2628 (CNCM I-2453) ó
Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). La cantidad
correspondiente para el animal doméstico es de aproximadamente
10^{6} - 10^{12} cfu/día, dependiendo de si se trata de un gato
o un perro, y de factores físicos tales como la masa corporal.
Estas cepas se suministran como suplemento en un sobre aparte
sujeto a la lata, separable, juntamente con las instrucciones de
alimentación.
Claims (7)
1. Empleo de Lactobacillus reuteri
NCC2581 depositado con el nº CNCM I-2448,
Lactobacillus reuteri NCC2592 depositado con el nº CNCM
I-2450, Lactobacillus rhamnosus NCC2583
depositado con el nº CNCM I-2449, Lactobacillus
reuteri NCC2603 depositado con el nº CNCM
I-2451, Lactobacillus reuteri NCC2613
depositado con el nº CNCM I-2452, Lactobacillus
acidophilus NCC2628 depositado con el nº CNCM
I-2453, Enterococcus faecium SF68 depositado
con el nº NCIMB 10415, para la preparación de una composición
destinada para la regulación del sistema inmunológico en gatos y/o
perros mediante la estimulación y/o modulación de las funciones
inmunológicas.
2. Empleo de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde la cepa está contenida en la composición en una cantidad
desde 1.0E+04 cfu/g hasta 1.0E+11 cfu/g.
3. Composición destinada a la regulación del
sistema inmunológico de gatos y/o perros mediante la estimulación
y/o modulación de funciones inmunológicas, que contiene por lo menos
una cepa de Lactobacillus reuteri NCC2581 depositado con el
nº CNCM I-2448, Lactobacillus reuteri NCC2592
depositado con el nº CNCM I-2450, Lactobacillus
rhamnosus NCC2583 depositado con el nº CNCM
I-2449, Lactobacillus reuteri NCC2603
depositado con el nº CNCM I-2451, Lactobacillus
reuteri NCC2613 depositado con el nº CNCM
I-2452, Lactobacillus acidophilus NCC2628
depositado con el nº CNCM I-2453, Enterococcus
faecium SF68 depositado con el nº NCIMB 10415, asociada con un
soporte ingerible o una matriz farmacéutica.
4. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 3, en donde la cepa seleccionada se encuentra en una
cantidad desde 1.0E+04 cfu/g hasta 1.0E+11 cfu/g.
5. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 3 ó 4, la cual contiene además un probiótico.
6. Una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, la cual está en forma
de
- i.
- un alimento para animales domésticos nutricionalmente completo, en forma de un polvo, seco o húmedo, congelado o autoestable, o,
- ii.
- un suplemento de la dieta.
7. Un suplemento de la dieta, de acuerdo con la
reivindicación 6, el cual se suministra junto con la comida para
animales domésticos en un envase adicional tal como, p. ej., una
bolsita.
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