ES2284162T3 - D-sorbitol dehidrogenasa. - Google Patents
D-sorbitol dehidrogenasa. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2284162T3 ES2284162T3 ES96102405T ES96102405T ES2284162T3 ES 2284162 T3 ES2284162 T3 ES 2284162T3 ES 96102405 T ES96102405 T ES 96102405T ES 96102405 T ES96102405 T ES 96102405T ES 2284162 T3 ES2284162 T3 ES 2284162T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- ifo
- gluconobacter
- suboxydans
- sorbitol
- acetobacter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/823—Acetobacter
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
LA DESHIDROGENASA DE D-SORBITOL EN SU FORMA PURIFICADA, QUE CATALIZA LA OXIDACION DE D-SORBITOL EN L-SORBOSA, TIENE UNA ESTRUCTURA MOLECULAR QUE CONSISTE EN SUBUNIDADES HOMOLOGAS DE PESO MOLECULAR 79.000 (MAS MENOS) 5.000, UNA ESPECIFICIDAD A UN SUSTRATO PARA LOS POLIOLES Y UN PH OPTIMO DE 6,0 A 7,0. DICHA DESHIDROGENASA DE D-SORBITOL SE PUEDE PRODUCIR SEGUN UN PROCEDIMIENTO QUE CONSISTE EN CULTIVAR UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE AL GENERO GLUCONOBACTER O ACETOBACTER, O UN MUTANTE O VARIANTE DEL MISMO, CAPAZ DE PRODUCIR LA DESHIDROGENASA DE D-SORBITOL EN LAS CELULAS Y AISLARLA DE LAS CELULAS, EJ., ROMPIENDO LAS CELULAS Y SEPARANDO EL EXTRACTO DE CELULAS LIBRES DE LAS CELULAS ROTAS. LA HIDROGENASA DE D-SORBITOL ASI AISLADA ES UTIL PARA CATALIZAR LA OXIDACION DE D-SORBITOL EN L-SORBOSA, SIENDO ESTA ULTIMA UN INTERMEDIO IMPORTANTE PARA LA PRODUCCION DE VITAMINA C.
Description
D-Sorbitol dehidrogenasa.
La presente invención concierne a una nueva
D-sorbitol dehidrogenasa, un proceso para producir
la misma y un proceso para producir cetosas, especialmente
L-sorbosa utilizando dicha enzima.
Como se mencionó anteriormente, la nueva
D-sorbitol dehidrogenasa (en lo adelante referida
como SLDH) proporcionada por la presente invención cataliza la
oxidación de D-sorbitol a L-sorbosa.
La L-sorbosa es un intermediario importante para la
producción de vitamina C.
Las enzimas que catalizan la oxidación de
D-sorbitol a L-sorbosa son
conocidas. L.T. Cummins, T.E. King y V.H. Cheldelin (J Biol. Chem.,
224, 323-329, 1957) reportaron que el extracto libre
de células de Acetobacter suboxydans (syn. Gluconobacter
suboxydans) contiene tres enzimas que participan en las rutas de
la oxidación del D-sorbitol. Dos de esas enzimas que
catalizan la oxidación de D-sorbitol a
L-sorbosa han sido purificadas. Una fue aislada como
L-sorbosa reductasa dependiente del fosfato
dinucleótido de nicotinamida y adenina (en lo adelante referido como
NADP) a partir de la fracción soluble de Gluconobacter
melanogenus IFO 3293 por T. Sugisawa, T. Hoshino y A. Fujiwara
(Agric. Biol Chem., 55, 2043-2049, 1991), y
la otra fue aislada como D-sorbitol dehidrogenasa de
enlace de membrana a partir de Gluconobacter suboxydans var.
\alpha IFO 3254 por E. Shinagawa, K. Matsushita, O. Adachi y M.
Ameyama (Agric. Biol. Chem., 46, 135-141,
1982).
Sin embargo, el SLDH proporcionado por la
presente invención es claramente distinto de las dos enzimas
anteriores en la estructura de sub-unidades de la
enzima, el peso molecular, especificidad del sustrato y pH óptimo.
El peso molecular de L-sorbosa reductasa dependiente
de NADP es 60,000, pero aquel del SLDH proporcionado por la
presente invención consiste de sub-unidades
homólogas que tienen un peso molecular de 79,000 \pm 5,000, y no
requieren NAPD para catalizar la reacción. Por otra parte, la
D-sorbitol dehidrogenasa de enlace de membrana
aislada por E. Shinagawa y otros, consistió de tres tipos de
sub-unidades con peso molecular de 63,000, 51,000 y
17,000 y oxidó específicamente al D-sorbitol y
también oxidó al D-manitol al 5% de la velocidad de
la reacción con D-sorbitol, pero no oxidó al
D-arabitol o eritritol. Además, estas mostraron que
el pH óptimo de la enzima era de 4.5, que la actividad de la enzima
fue estable a pH 5.0 y que el 92% de la actividad se perdió a pH
7.0. Sin embargo, la SLDH de la presente invención oxida no
solamente el D-sorbitol y D-manitol,
sino también el D-arabitol y eritritol, el pH óptimo
es 6.0, y la actividad es estable incluso a pH 8.0
Es un objeto de la presente invención
proporcionar la nueva enzima SLDH en forma purificada la cual es
derivada de un microorganismo que pertenece al género
Gluconobacter o Acetobacter y el cual actúa sobre el
D-sorbitol para producir L-sorbosa
(es decir catalizar la oxidación de D-sorbitol a
L-sorbosa), y que tiene las siguientes propiedades
físico-químicas:
- a)
- Peso molecular de 800,000 \pm 50,000 Da
- b)
- Estructura molecular consistiendo de 10 sub-unidades homólogas que tienen un peso molecular de 79,000 \pm 5,000 Da cada una,
- c)
- Especificidad del sustrato: Activo en polioles,
- d)
- pH óptimo: 6.0-7.0, al cual la enzima oxida el D-sorbitol a L-sorbosa,
- e)
- Una estabilidad de pH en el rango de pH 7.0 a 9.0,
- f)
- Temperatura óptima en el rango de alrededor de 20 a 40ºC;
- g)
- Inhibición por Cu^{2+} y Fe^{3+}
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un proceso para producir la nueva enzima SLDH
cultivando un microorganismo que pertenece al género
Gluconobacter o Acetobacter, el cual es capaz de
producir la SLDH en las células, rompimiento de las células,
aislamiento y purificación de la misma a partir del extracto libre
de células de las células rotas, preferiblemente a partir de la
fracción de la membrana del microorganismo. Aún un objeto adicional
de la presente invención es proporcionar un proceso para producir
L-sorbosa utilizando dicha enzima SLDH.
Las propiedades físico-químicas
de la muestra purificada de la nueva SLDH preparada de acuerdo a los
Ejemplos en lo adelante son como sigue:
La nueva SLDH de la presente invención cataliza
la oxidación de D-sorbitol a
L-sorbosa en presencia de un aceptor de electrones
de acuerdo a la siguiente fórmula de reacción:
D-Sorbitol +
Aceptor de electrones \rightarrow L-Sorbosa +
Aceptor de electrones
reducido
La enzima no utiliza oxígeno como un aceptor de
electrones. Esto fue afirmado por la no actividad de catalización de
la enzima para convertir D-Sorbitol a
L-sorbosa usando oxígeno como un aceptor de
electrones posible. Además, no fue detectado consumo de oxígeno en
la mezcla de reacción como se detectó mediante una prueba de oxígeno
disuelto.
Sin embargo, cualquier compuesto convencional el
cual tiene la capacidad de actuar como un aceptor de electrones
puede ser utilizado en conjunción con la enzima de esta invención.
Como un aceptor de electrones, puede ser usado el
2,6-diclorofenolindofenol (en lo adelante referido
como DCIP), la fenazina metosulfato (en lo adelante referido como
PMS), la ferricianida o el citocromo c.
El ensayo de la enzima fue realizado como sigue.
La mezcla de reacción basal para ensayar la actividad de la
D-sorbitol dehidrogenasa consistió de 50 mM de
buffer de fosfato de potasio (pH 6.0), 0.25 mM DCIP y 0.325 mM de
PMS, el cual fue preparado justamente antes del ensayo. Una cubeta
con una trayectoria de luz de 1 cm contenía 0.4 ml de la mezcla de
reacción basal, 0.1 ml de de D-sorbitol 0.4 M y
solución de la enzima con un volumen total de 0.51 ml. La cubeta de
referencia contenía todos los componentes excepto para el sustrato.
La reacción fue comenzada a 25ºC con D-sorbitol y la
actividad de la enzima fue medida como la velocidad de reducción
inicial de DCIP a 600 nm. Una unidad de enzima es definida como la
cantidad de la enzima que cataliza la reducción de 1 \mumol de
DCIP por minuto. El coeficiente de extinción de DCIP a pH 6.0 fue
10.8 mM^{-1}.
La especificidad del sustrato de la enzima fue
determinado usando el mismo método de ensayo de la enzima como se
describió anteriormente en 1) excepto que varias soluciones de
sustratos (100 mM) fueron usadas en vez de
D-sorbitol. Los resultados de la medición son
mostrados en la Tabla 1. Entre las sustancias probadas, el
D-sorbitol, D-arabitol, eritritol y
el glicerol fueron altamente oxidados, y el
D-manitol y D-adonitol fueron
también oxidados, a 49.9 y 66.6% de la velocidad de reacción de
D-sorbitol.
La correlación entre la velocidad de reacción de
la SLDH y el pH fue determinada usando el mismo método de ensayo de
la enzima como se describió anteriormente en 1) excepto que varios
pH y buffers fueron usados. Los resultados son mostrados en la Tabla
2. La enzima mostró valores de pH óptimos de 6.0-7.0
y mostró la mayor actividad a pH 6.0.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima fue mantenida fija en buffers de
varios pH durante 16 horas a 4ºC, y luego la actividad residual fue
medida usando el mismo método de ensayo de la enzima como se
describió en 1). Los resultados de la medición son mostrados en la
Tabla 3. Más del 60% de la actividad se mantuvo a pH entre 7.0 y
9.0.
\vskip1.000000\baselineskip
La termo-estabilidad fue medida
incubando la enzima durante 5 minutos a varias temperaturas en
buffer de fosfato de potasio 0.01 M (pH 7.0). La actividad residual
fue medida usando el mismo método de ensayo de la enzima como se
describió anteriormente en 1), después de lo cual la enzima tratada
fue enfriada inmediatamente en agua helada. Los resultados son
mostrados en la Tabla 4. La enzima fue estable hasta 35ºC, y perdió
alrededor del 20, 70 y 90% de su actividad después que hubo sido
incubada a 40, 50 y 60ºC, respectivamente.
Las actividades de la enzima fueron medidas a
temperaturas desde 20 a 60ºC en el mismo método de ensayo como se
describió anteriormente en 1). Los resultados son mostrados en la
Tabla 5. La enzima mostró una temperatura óptima de 20 a 40ºC y
mostró la mayor actividad a 30ºC. El decrecimiento de 60 y 70% en su
actividad fue observado a 45 y 50ºC, respectivamente, y no se
detectó más actividad a 60ºC.
Los efectos de los iones de metal e inhibidores
en la actividad de la SLDH fueron examinados midiendo la actividad
usando el mismo método de ensayo como se describió anteriormente en
1). Después de la adición de la solución de enzima a la mezcla de
reacción basal cada solución de metal fue agitada y la reacción fue
iniciada con la adición de D-sorbitol. Como es
mostrado en la Tabla 6, 8 a 17% de la actividad fue estimulada por
la adición de 0.91 y 1.79 mM de Co^{2+}. Sin embargo, la adición
de 0.91 mM de Cu^{2+} y Fe^{3+} en cada caso fue fuertemente
inhibitorio, y la adición de Zn^{2+} fue inhibitorio en 44 a 68%.
Los efectos de varios inhibidores sobre la actividad fueron
investigados. Como es mostrado en la Tabla 7, el hidrocloruro de
quinina y el monoiodoacetato fueron inhibitorios en 25% y 75%,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
| \begin{minipage}[t]{153mm} La actividad relativa es expresada como el porcentaje de la velocidad de reacción obtenida sin compuestos de metal mostrada en la tabla.\end{minipage} |
| \begin{minipage}[t]{153mm} La actividad relativa es expresada como el porcentaje de la velocidad de reacción obtenida sin inhibidores mostrada en la tabla.\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
La velocidad de la reacción de oxidación sobre
la variación de la concentración de D-sorbitol de
0.5 a 80 mM fue medida para determinar el valor Km para el
D-sorbitol. La constante de Michaelis aparente fue
calculada ser 18 mM con DCIP como un aceptor de electrones para la
reacción.
El peso molecular de la SLDH nativa fue
determinado usando una columna de gel de exclusión por tamaño a 280
nm y una velocidad de flujo de 1.0 ml por minuto. La SLDH purificada
consistió de sub-unidad homóloga con un peso
molecular de 79,000 \pm 5,000 en presencia de sodio dodecil
sulfato (SDS).
La purificación de la SLDH es efectuada mediante
la combinación de métodos de combinación conocidos tales como
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida,
cromatografía de adsorción, cromatografía de filtración en gel,
electroforesis en gel, precipitación por salado y diálisis.
La SLDH proporcionada por la presente invención
puede ser preparada cultivando un microorganismo apropiado,
rompiendo las células y aislando y purificando el mismo a partir del
extracto libre de célula de las células rotas, preferiblemente a
partir de la fracción de la membrana del microorganismo.
Los microorganismos usados para la presente
invención son microorganismos que pertenecen al género
Gluconobacter y Acetobacter.
Ejemplos de cepas más preferiblemente usadas en
la presente invención son Gluconobacter albidus IFO 3250,
Gluconobacter albidus IFO 3251, Gluconobacter albidus
IFO 3253, Gluconobacter capsulatus IFO 3462, Gluconobacter
cerinus IFO 3263, Gluconobacter cerinus IFO 3264,
Gluconobacter cerinus IFO 3265, Gluconobacter cerinus
IFO 3267, Gluconobacter cerinus IFO 3270, Gluconobacter
dioxyacetonicus IFO 3271, Gluconobacter dioxyacetonicus
IFO 3274, Gluconobacter gluconicus IFO 3171, Gluconobacter
gluconicus IFO 3285, Gluconobacter gluconicus IFO 3286,
Gluconobacter industrius IFO 3260, Gluconobacter
melanogenus IFO 3292, Gluconobacter melanogenus IFO 3293,
Gluconobacter melanogenus IFO 3294, Gluconobacter
nonoxygluconicus IFO 3276, Gluconobacter oxydans IFO
3189, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus IFO 12467,
Gluconobacter roseus IFO 3990, Gluconobacter
rubiginosus IFO 3244, Gluconobacter suboxydans IFO 3130,
Gluconobacter suboxydans IFO 3172, Gluconobacter
suboxydans IFO 3254, Gluconobacter suboxydans IFO 3255,
Gluconobacter suboxydans IFO 3256, Gluconobacter
suboxydans IFO 3257, Gluconobacter suboxydans IFO 3258,
Gluconobacter suboxydans IFO 3289, Gluconobacter
suboxydans IFO 3290, Gluconobacter suboxydans IFO 3291,
Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281, Acetobacter aceti
subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp.
xylinum IFO 3288, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO
13772 y Acetobacter liquefaciens IFO 12388. Estos
microorganismos, los cuales pueden ser empleados en el proceso de la
presente invención, incluyen aquellos los cuales están siendo
preservados en el depósito público (colección de cultivo) para
entregar a cualquiera a solicitud tal como el Instituto de
Fermentación de Osaka, Japón (IFO). De estos, un microorganismo
preferido y específico, el Gluconobacter suboxydans IFO 3255,
ha sido depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Alemania en Febrero 13, 1995 bajo el Tratado de
Budapest. El número de depósito asignado es DSM 9715.
Los microorganismos pueden ser cultivados en un
medio acuoso suplementado con nutrientes apropiados bajo condiciones
aeróbicas. El cultivo puede ser conducido a un pH de 3.5 a 8.0,
preferiblemente 5.0 a 7.5. El período de cultivo varía dependiendo
del microorganismo y del medio nutriente a ser usado, y es
preferiblemente alrededor de 6 a 100 horas. Un rango de temperatura
preferida para llevar a cabo el cultivo es de 20ºC a 40ºC,
preferiblemente de 25ºC a 35ºC.
Es usualmente requerido que el medio de cultivo
contenga nutrientes tales como: fuentes de carbono asimilables, tal
como glicerol, D-manitol,
D-sorbitol, eritritol, ribitol, xilitol, arabitol,
inositol, dulcitol, D-ribosa,
D-fructosa, D-glucosa y sucrosa,
preferiblemente D-sorbitol,
D-manitol o glicerol; fuentes de nitrógeno digerible
tal como sustancias orgánicas, por ejemplo, peptona, extracto de
levadura, levadura de hornear y licor de maceración del maíz, y
sustancias inorgánicas, por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de
amonio y nitrito de potasio; vitaminas; y elementos traza.
A continuación, una realización para el
aislamiento y purificación de la SLDH a partir de microorganismos
después del cultivo es resumidamente descrita.
- (1)
- Las células son cosechadas del caldo de cultivo líquido por centrifugación o filtración.
- (2)
- Las células cosechadas son lavadas con agua solución salina fisiológica o una solución buffer teniendo un pH apropiado.
- (3)
- Las células lavadas son suspendidas en la solución buffer y rotas por medio de un homogenizador, sonicador, prensa Francesa o tratamiento con lisozima y similares para dar una solución de células rotas.
- (4)
- La SLDH es aislada y purificada a partir del extracto libre de células de células rotas, preferiblemente de la fracción de la membrana del microorganismo.
La SLDH proporcionada por la presente invención
es útil como un catalizador para la producción de
L-sorbosa a partir de D-sorbitol. La
reacción debe ser conducida a valores de pH de 5.5 a 8.0,
preferiblemente de 6.0 a 7.0, en presencia de un aceptor de
electrones, por ejemplo, DCIP, PMS, ferricianida, citocromo c
y similares en un solvente tal como buffer fosfato, buffer tris,
buffer citrato y similares. Un rango de temperatura preferido para
llevar a cabo la reacción es de 20ºC a 50ºC, preferiblemente de 20ºC
a 40ºC. Cuando el pH y la temperatura son establecidos en 6.5 a 7.5
y 30ºC, respectivamente, la reacción de manera general da
particularmente buenos resultados. Dependiendo de otras condiciones
de reacción tal como la cantidad de enzima,
D-sorbitol, aceptor de electrones, pH, temperatura o
velocidad de aereación, el D-sorbitol es
completamente convertido a L-sorbosa dentro de
alrededor de 2 a 24 horas, preferiblemente dentro de alrededor de 12
horas. La concentración de D-sorbitol en un solvente
varía en dependencia de otras condiciones de reacción, pero en
general es convenientemente desde alrededor de 10 a alrededor de 300
g/L, más preferiblemente desde alrededor de 10 a alrededor de 200
g/L.
En adición a lo anterior, las células cultivadas
son también útiles para la producción de cetosas a partir de
polioles, especialmente para la producción de
L-sorbosa a partir del D-sorbitol.
La L-sorbosa producida a partir del
D-sorbitol en un solvente es aislada mediante una
combinación de métodos convencionales como la centrifugación y la
concentración. Sin embargo, el solvente que contiene
L-sorbosa sin el paso de aislamiento puede ser usado
como el material de partida en la producción industrial de vitamina
C por el método de Reichstein.
En la reacción, la enzima puede ser también
usada en un estado inmovilizado con un portador apropiado. Cualquier
medio de inmovilizar una enzima generalmente conocido en el arte
puede ser usado. Por ejemplo, la enzima puede ser enlazada
directamente a una membrana, gránulos o similares o una resina que
tiene grupo(s) funcional(es), o la misma puede ser
enlazada a la resina a través de compuestos de enlace que tienen
grupo(s) bifuncional(les), por ejemplo,
glutaraldehído.
Los siguientes Ejemplos ilustran la presente
invención.
El Gluconobacter suboxydans IFO
3255 (DSM 9715) fue suministrado por el Instituto para la
Fermentación, Osaka (IFO), y usado a través de todo este estudio. El
medio consistió de 20 g de D-sorbitol, 3 g de
extracto de levadura, 3 g de extracto de carne, 3 g de licor de
maceración del maíz, 10 g de polipeptona, 1 g de urea, 1g de
KH_{2}PO_{4}, 0.2 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, y 1 g de
CaCO_{3} en 1 litro de agua des-ionizada. El pH
fue ajustado a 7.0 con hidróxido de sodio antes de la adición de
CaCO_{3}. El cultivo en un matraz fue llevado a cabo de manera
aeróbica con un agitador rotatorio durante un día, o aquel en un
fermentador de jarra de 30 litros fue llevado a cabo durante 21.5
horas a 30ºC, 500 rpm para la agitación y 15 L/min para la
aereación. El caldo fue centrifugado a 400 x g durante 10 minutos
para eliminar el carbonato de calcio, y luego a 10,000 x g para dar
forma de pelotitas a las células. La torta de células fue lavada una
vez con solución salina fisiológica. Así, las células intactas (200
g de peso húmedo) fueron obtenidas de 20 litros de cultivo. Las
células fueron congeladas a -20ºC hasta el uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células (100 g de peso húmedo) fueron
suspendidas en 200 ml de buffer de fosfato 50 mM (pH 7.0) y pasadas
a través de una prensa de células de presión Francesa a 20,000
psi. Después de la centrifugación para eliminar las células
intactas, el sobrenadante (extracto libre de células) fue
centrifugado a 80,000 x g durante una hora y este precipitado fue
designado como la fracción de membrana (2.28 g de peso húmedo).
\vskip1.000000\baselineskip
La SLDH fue aislada a partir de la fracción de
membrana de Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715).
Inicialmente, el método reportado por E. Shinagawa, K. Matsushita,
O. Adachi y M. Ameyama, (Agric. Biol. Chem., 46,
135-141, 1982), fue usado para solubilizar la SLDH.
La solubilización fue llevada a cabo tratando la membrana con buffer
de acetato de sodio 0.01 M (pH 5.0) conteniendo 1% de Triton
X-100, KCl 0.1 M, D-sorbitol 0.1 M y
alrededor de 10 mg/ml de proteína de la membrana durante 2 horas a
5ºC. Sin embargo, la actividad de la SLDH no fue recuperada de la
fracción de la membrana y las actividades completas en el
sobrenadante solubilizado y la fracción de membrana residual se
perdieron bajo las condiciones anteriores.
Por lo tanto, los efectos de las condiciones de
solubilización tal como un valor de pH, la concentración del buffer,
los detergentes y el KCl en la actividad de la SLDH fueron
estudiados. La recuperación de la actividad de la SLDH fue 74% en el
sobrenadante solubilizado de la fracción de membrana, cuando la
fracción de membrana fue mezclada en buffer de fosfato de potasio
0.05 M (pH 7.0) conteniendo 1% Triton X-100 y
D-sorbitol 0.04M durante 2 horas a 5ºC como es
mostrado en la Tabla 8. La enzima no fue solubilizada con
n-octil-\beta-D-glucopiranosido
y la actividad se perdió por la adición de KCl 0.1 M.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Para dar la fracción activa de SLDH para el paso
de aislamiento {Ejemplo 1 - (4)} de la fracción de membrana de
Gluconobacter suboxydants IFO 3255 (DSM 9715), membranas
congeladas fueron disueltas y suspendidas en el buffer (pH 7.0) para
dar alrededor de 10 mg/ml de proteína, y luego 1% de Triton
X-100 y D-sorbitol 0.1 M fueron
adicionados. La suspensión fue agitada a 180 rpm durante 2 horas, y
luego centrifugada a 80,000 x g durante 60 minutos para eliminar el
precipitado. La actividad de la SLDH fue recuperada en el
sobrenadante solubilizado (200 ml).
El sobrenadante solubilizado (200 ml) obtenido
en el Ejemplo 1-(3) fue colocado en una columna de
DEAE-celulosa (2.5 x 30 cm) equilibrada y lavada con
el buffer (pH 7.0) conteniendo D-sorbitol 0.05 M y
0.1% de Triton X-100. La elusión de la enzima fue
realizada con NaCl 0.1 M en el mismo buffer. Las fracciones que
tienen actividad de la enzima fueron recogidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones de enzimas combinadas (125 ml)
del paso previo fueron dializadas en dos lotes frente a un litro de
buffer conteniendo D-sorbitol 0.05M y 0.1% de Triton
X-100, y colocadas en una columna de
DEAE-Sefarosa (1.5 x 50 cm) equilibrada y lavada con
el mismo buffer, y la actividad de la SLDH fue eluida con un
gradiente lineal de NaCl (0 a 0.2 M). La mayor actividad de la
enzima fue eluida a concentraciones de NaCl que oscilan en el rango
de 0.16 a 0.18 M.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción activa combinada (40 ml) del paso
previo fue dializada frente a dos lotes de 500 ml de buffer
conteniendo D-sorbitol 0.05 M y 0.1% de Triton
X-100. Una parte de la enzima (5 ml) fue puesta en
una columna de hidroxilapatita (2.5 x 20 cm) equilibrada. La
actividad de la enzima fue eluida durante el lavado de la columna.
Después que la misma preparación fue repetida, fueron recogidas
fracciones que tienen actividad de la enzima. El volumen total fue
de 52 ml después que la fracción activa fue dializada frente al
buffer. Luego la fracción fue concentrada a 10 ml por
ultrafiltración (PM10, Amicon).
\vskip1.000000\baselineskip
Una porción de la fracción de la enzima (2 ml)
del paso previo fue puesta en una columna de Sefacril HR300 (1 x 120
cm) equilibrada con el buffer (pH 7.0) conteniendo NaCl 0.05 M,
D-sorbitol 0.05 M y 0.1% de Triton
X-100 y desarrollada. Este paso de fraccionamiento
fue repetido y la fracción activa fue combinada. La fracción activa
dializada frente al buffer (13 ml) fue combinada y almacenada a
-80ºC.
El resumen de los pasos de purificación de la
enzima es mostrado en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La enzima purificada con una actividad
específica de 45.43 unidades por mg de proteína (0.2 mg/ml) fue
usada para los análisis siguientes.
El peso molecular de la
D-sorbitol dehidrogenasa nativa fue determinado por
HPLC (detección, 254 \mum; velocidad de flujo 1 ml/min) usando una
columna de gel de exclusión por tamaño (columna SWxL G3000 gel TSK,
7.8 por 300 mm) equilibrada con buffer de fosfato de potasio 0.1 M
(pH 7.0) conteniendo NaCl 0.3 M. Cianocobalamina (1.35 K),
mioglobina (17 K), ovalbumina (44 K),
\gamma-globulina (158 K) y tiroglobulina (670 K)
de peso molecular estándares fueron usados. La enzima purificada
mostró un pico único y el peso molecular fue determinado en
alrededor de 80,000 \pm 50,000.
En presencia del sodio dodecil sulfato (SDS), la
enzima mostró una banda única con un peso molecular de alrededor de
79,000 \pm 5,000. A partir de estos resultados, la SLDH purificada
consistió de diez sub-unidades homólogas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar el producto convertido de cada
sustrato, la mezcla de reacción (1 ml) conteniendo
D-sorbitol, D-manitol,
D-arabitol, eritritol, D-adonitol y
glicerol cada uno de 0.04 M, y 8 mM de PMS fue incubada durante 4
horas a 30ºC en buffer de fosfato de potasio 0.2 M (pH 7.0) con 2.0
unidades de la enzima purificada. El producto de reacción fue
analizado por HPLC y cromatografía en capa delgada. Fueron
producidas L-sorbosa, D-frutosa,
D-xilulosa, eritrulosa, D-ribulosa y
dihidroxiacetona a partir de D-sorbitol,
D-manitol, D-arabitol, eritritol,
D-adonitol y glicerol, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de reacción (volumen total 1.04 ml)
conteniendo 0.2 ml de SLDH purificada (0.04 mg de proteína), 0.04 ml
de PMS 0.2 M, 0.1 ml de D-sorbitol 0.4 M, 0.4 ml de
buffer de fosfato de potasio 0.5 M (pH 7.0) y 0.3 ml de agua fue
incubada a 30ºC con agitación suave. Como resultado, fue formada
L-sorbosa a una velocidad de alrededor de 1.3
mg/hora.
\vskip1.000000\baselineskip
La distribución de la D-sorbitol
dehidrogenasa de enlace de membrana en varias bacterias de ácido
acético fue inspeccionada por el ensayo de transferencia
inmunológica usando el anticuerpo frente a la SLDH proporcionada en
la presente invención. Cada homogenizado de células de varias
bacterias de ácido acético fue tratado con SDS para poner cada 20
\mul de la solución conteniendo 3 a 5 \mug de proteína en gel de
poliacrilamida SDS, y luego fue llevada a cabo la electroforesis.
Las bandas de proteínas desarrolladas en el gel fueron
electroforéticamente transferidas a la membrana de nitrocelulosa y
reaccionadas con el anticuerpo. Luego la membrana de nitrocelulosa
fue tratada usando el kit Immuno-Blot
Bio-Rad para Conejo Anti-Cabra, y
fue investigado cual microorganismo mostró la banda positiva en la
posición de peso molecular (PM) 79,000 \pm 1,000. Como es mostrado
en la Tabla 10, todas las cepas de Gluconobacter y
Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter
aceti subsp. xylinum IFO 3288 y Acetobacter aceti xylinum
IFO 13772 mostraron la banda positiva. El homogenizado de célula de
Acetobacter aceti subsp. aceti IF0 328l y Acetobacter
liquefaciens IFO 12388 mostraron banda débilmente positiva en la
posición de PM 79,000 \pm 1,000.
Claims (10)
1. D-Sorbitol dehidrogenasa en
forma purificada la cual es derivada de un microorganismo que
pertenece al género Gluconobacter o Acetobacter y la
cual cataliza la oxidación de D-sorbitol a
L-sorbosa, dicha enzima teniendo las siguientes
propiedades físico-químicas:
- a)
- Peso molecular de 800,000 \pm 50,000 Da
- b)
- Estructura molecular consistiendo de 10 sub-unidades homólogas que tienen un peso molecular de 79,000 \pm 5,000 Da cada una,
- c)
- Especificidad del sustrato: Activo en polioles,
- d)
- pH óptimo al cual la enzima oxida el D- sorbitol a L-sorbosa en el rango de pH 6.0 a 7.0
- e)
- Una estabilidad de pH en el rango de pH 7.0 a 9.0
- f)
- Temperatura óptima en el rango de alrededor de 20 a 40ºC
- g)
- Inhibición por Cu^{2+} y Fe^{3+}.
2. D-Sorbitol dehidrogenasa de
acuerdo a la reivindicación 1 donde el microorganismo es
seleccionado de un grupo que consiste en Gluconobacter
albidus IFO 3250, Gluconobacter albidus IFO 3251,
Gluconobacter albidus IFO 3253, Gluconobacter
capsulatus IFO 3462, Gluconobacter cerinus IFO 3263,
Gluconobacter cerinus IFO 3264, Gluconobacter cerinus
IF0 3265, Gluconobacter cerinus IFO 3267, Gluconobacter
cerinus IFO 3270, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271,
Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3274, Gluconobacter
gluconicus IFO 3171, Gluconobacter gluconicus IFO 3285,
Gluconobacter gluconicus IFO 3286, Gluconobacter
industrius IFO 3260, Gluconobacter melanogenus IFO 3292,
Gluconobacter melanogenus IFO 3293, Gluconobacter
melanogenus IFO 3294, Gluconobacter nonoxygluconicus IFO
3276, Gluconobacter oxydans IFO 3189, Gluconobacter
oxydans subsp. sphaericus IFO 12467, Gluconobacter roseus
IFO 3990, Gluconobacter rubiginosus IFO 3244,
Gluconobacter suboxydans IFO 3130, Gluconobacter
suboxydans IFO 3172, Gluconobacter suboxydans IFO 3254,
Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715),
Gluconobacter suboxydans IFO 3256, Gluconobacter
suboxydans IFO 3257, Gluconobacter suboxydans IFO 3258,
Gluconobacter suboxydans IFO 3289, Gluconobacter
suboxydans IFO 3290, Gluconobacter suboxydans IFO 3291,
Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281, Acetobacter aceti
subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp.
xylinum IFO 3288, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO
13772 y Acetobacter liquefaciens IFO 12388.
3. Un proceso para producir una
D-Sorbitol dehidrogenasa de acuerdo a la
reivindicación 1 o 2 el cual comprende cultivar un microorganismo
que pertenece al género Gluconobacter o Acetobacter,
el cual es capaz de producir dicha D-sorbitol
dehidrogenasa en las células, y aislar dicha
D-sorbitol dehidrogenasa de las células.
4. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 3
donde el microorganismo es seleccionado de un grupo que consiste de
Gluconobacter albidus IFO 3250, Gluconobacter albidus
IFO 3251, Gluconobacter albidus IFO 3253, Gluconobacter
capsulatus IFO 3462, Gluconobacter cerinus IFO 3263,
Gluconobacter cerinus IFO 3264, Gluconobacter cerinus
IFO 3265, Gluconobacter cerinus IFO 3267, Gluconobacter
cerinus IFO 3270, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO
3271, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3274,
Gluconobacter gluconicus IFO 3171, Gluconobacter
gluconicus IFO 3285, Gluconobacter gluconicus IFO 3286,
Gluconobacter industrius IFO 3260, Gluconobacter
melanogenus IFO 3292, Gluconobacter melanogenus IFO 3293,
Gluconobacter melanogenus IFO 3294, Gluconobacter
nonoxygluconicus IFO 3276, Gluconobacter oxydans IFO
3189, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus IFO 12467,
Gluconobacter roseus IFO 3990, Gluconobacter
rubiginosus IFO 3244, Gluconobacter suboxydans IFO 3130,
Gluconohacter suboxydans IFO 3172, Gluconobacter
suboxydans IFO 3254, Gluconobacter suboxydans IFO 3255
(DSM 9715), Gluconobacter suboxydans IFO 3256,
Gluconobacter suboxydans IFO 3257, Gluconobacter
suboxydans IFO 3258, Gluconobacter suboxydans IFO 3289,
Gluconobacter suboxydans IFO 3290, Gluconobacter
suboxydans IFO 3291, Acetobacter aceti subsp. aceti IFO
3281, Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259,
Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288, Acetobacter
aceti subsp. xylinum IFO 13772 y Acetobacter liquefaciens
IFO 12388.
5. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 3
o 4 el cual comprende cultivar el microorganismo y posteriormente
romper las células y aislar y purificar la
D-sorbitol dehidrogenasa a partir del extracto libre
de células de las células rotas.
6. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5 el cual comprende conducir el cultivo del
microorganismo en un medio con nutrientes apropiados bajo
condiciones aeróbicas a un pH de 3.5 a 8.0 y en un rango de
temperatura de 20ºC a 40ºC.
7. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 6
el cual comprende conducir el cultivo del microorganismo a un pH de
5.0 a 7.5 y en un rango de temperatura de 25ºC a 35ºC.
8. Un proceso para producir
L-sorbosa a partir de D-sorbitol el
cual comprende oxidar el D-sorbitol en presencia de
D-sorbitol dehidrogenasa, como se definió en la
reivindicación 1 o 2, y de un aceptor de electrones en un medio
acuoso bajo condiciones aeróbicas.
9. Un proceso para producir
L-sorbosa a partir de D-sorbitol de
acuerdo a la reivindicación 8 donde la oxidación es efectuada a
valores de pH de 5.5 a 8.0 y en un rango de temperatura de 20ºC a
50ºC.
10. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 8
o 9 donde dicha L-sorbosa es posteriormente
convertida en vitamina C.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95102748 | 1995-02-27 | ||
| EP95102748 | 1995-02-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2284162T3 true ES2284162T3 (es) | 2007-11-01 |
Family
ID=8219019
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96102405T Expired - Lifetime ES2284162T3 (es) | 1995-02-27 | 1996-02-17 | D-sorbitol dehidrogenasa. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5747301A (es) |
| EP (1) | EP0728840B1 (es) |
| JP (1) | JP3874032B2 (es) |
| CN (1) | CN1136310C (es) |
| AT (1) | ATE360685T1 (es) |
| DE (1) | DE69637038T2 (es) |
| ES (1) | ES2284162T3 (es) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2239802A1 (en) | 1997-08-21 | 1999-02-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | D-sorbitol dehydrogenase gene |
| EP0955358B1 (en) * | 1998-03-13 | 2007-09-12 | DSM IP Assets B.V. | Genetically engineered L-sorbose reductase-deficient mutants |
| DE69937086T2 (de) * | 1998-03-13 | 2008-06-12 | Dsm Ip Assets B.V. | Genetisch veränderte, L-Sorbose Reduktase defiziente Mutanten |
| DE19907115A1 (de) * | 1999-02-19 | 2000-08-24 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose |
| EP1164192A4 (en) * | 1999-03-17 | 2003-03-05 | Fujisawa Pharmaceutical Co | SORBITOL-DEHYDROGENASE, CODING GENE AND THE USE THEREOF |
| US6204040B1 (en) | 1999-04-22 | 2001-03-20 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Gluconobacter suboxydans sorbitol dehydrogenase, genes and methods of use thereof |
| DE19963126A1 (de) * | 1999-12-24 | 2001-07-12 | Suedzucker Ag | Verfahren zur Herstellung von 6-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-sorbit |
| EP1743943A4 (en) | 2004-03-17 | 2012-01-18 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR PREPARING L-FUCULOSE AND METHOD FOR PRODUCING L-FUCOSE |
| ES2324128A1 (es) * | 2005-09-29 | 2009-07-30 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Metodo para el diagnostico de carcinoma hepatocelular mediante el empleo de marcadores moleculares. |
| KR20140046691A (ko) * | 2012-10-10 | 2014-04-21 | 주식회사 종근당바이오 | 6-하이드록시에틸 아미노-l-소르보스로의 생물전환 수율이 우수한 신규 글루코노박터 속 ｃｋｄｂｍ ０９０１ 균주 |
| KR101479133B1 (ko) * | 2013-04-17 | 2015-01-05 | 건국대학교 산학협력단 | 신규 ｄ－솔비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ－소르보스의 생산방법 |
| CN104357507B (zh) * | 2014-10-21 | 2017-08-22 | 帝斯曼江山制药（江苏）有限公司 | 一种高浓度l‑山梨糖发酵生产工艺 |
| FR3031983A1 (fr) * | 2015-01-23 | 2016-07-29 | Ifp Energies Now | Procede de transformation selective de polyols biosources en cetoses |
| CN105154457B (zh) * | 2015-09-21 | 2018-10-12 | 南京工业大学 | 一种来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用 |
| CN106434581A (zh) * | 2016-09-18 | 2017-02-22 | 南京工业大学 | 一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用 |
| EP4488376A1 (de) | 2023-07-07 | 2025-01-08 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend l-sorbose |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3311027A1 (de) * | 1983-03-25 | 1984-09-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Nad(p)-unabhaengige glycerindehydrogenase, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung von glycerin und triglyceriden |
-
1996
- 1996-02-17 DE DE69637038T patent/DE69637038T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-17 EP EP96102405A patent/EP0728840B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-17 ES ES96102405T patent/ES2284162T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-17 AT AT96102405T patent/ATE360685T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-22 JP JP05824996A patent/JP3874032B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-26 US US08/606,807 patent/US5747301A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-26 CN CNB961025336A patent/CN1136310C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0728840A2 (en) | 1996-08-28 |
| JPH08242850A (ja) | 1996-09-24 |
| EP0728840A3 (en) | 2001-12-19 |
| CN1141341A (zh) | 1997-01-29 |
| DE69637038D1 (de) | 2007-06-06 |
| ATE360685T1 (de) | 2007-05-15 |
| US5747301A (en) | 1998-05-05 |
| DE69637038T2 (de) | 2007-12-27 |
| EP0728840B1 (en) | 2007-04-25 |
| JP3874032B2 (ja) | 2007-01-31 |
| CN1136310C (zh) | 2004-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3874032B2 (ja) | Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造法、及び該酵素を用いたケトース類の製造法 | |
| US7544494B2 (en) | Vitamin C from sorbosone | |
| JPH03500844A (ja) | 新規酵素 | |
| US4916069A (en) | Enzyme and process for producing the same | |
| ES2215263T3 (es) | Aldehido deshidrogenasa. | |
| KR100478514B1 (ko) | 1,5-언히드로글루시톨의정량법및정량용시약 | |
| Adachi et al. | Crystallization and properties of NADPH-dependent L-sorbose reductase from Gluconobacter melanogenus IFO 3294 | |
| JP3086301B2 (ja) | Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素 | |
| EP0790301B1 (en) | Aldehyde Dehydrogenase | |
| US4902617A (en) | Enzyme and process for producing the same | |
| JP2726826B2 (ja) | 酵素およびその製造方法 | |
| EP1509599A1 (en) | Aldehyde dehydrogenase | |
| US20050153412A1 (en) | Aldehyde dehydrogenase II | |
| JPH0568542A (ja) | アルコール脱水素酵素およびその製造法 | |
| JP3040228B2 (ja) | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ、その製造方法及びｌ−フコースの定量法 | |
| JP2006503551A5 (es) | ||
| JPS63230082A (ja) | アルコ−ルデヒドロゲナ−ゼ | |
| JPS63230081A (ja) | アルデヒドデヒドロゲナ−ゼ |