JPH03500844A

JPH03500844A - 新規酵素

Info

Publication number: JPH03500844A
Application number: JP1501447A
Authority: JP
Inventors: 亜紀子藤原; 達雄星野; 雅子新城
Original assignee: エフ・ホフマン‐ラ　ロシユ　アーゲー
Priority date: 1988-01-14
Filing date: 1989-01-09
Publication date: 1991-02-28
Anticipated expiration: 2013-09-17
Also published as: DK454689D0; EP0373181A1; WO1989006688A2; US5352599A; DK454689A; DE68924761D1; DE68924761T2; ATE130030T1; EP0373181B1; JP2799380B2; WO1989006688A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規酵素本発明は、新規酵素すなわちＬ−ツルポリン脱水素酵素とその製造方法及び該酵素を用いた２−ケトーＬ−グロン酸の製造方法に関するものである。さらに、本発明は該酵素の遺伝子のクローニングおよび発現のだめの改良された方法ならびに２−ケトーＬ−グロン酸を高収率で生産可能な形質転換微生物を与える遺伝子工学的手法に関するものである。

化合物２−ケトーＬ−グロンａ（２−ＫｃＡ）は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）の合成における重要な中間体である。数多くの微生物がＤ−ソルビトールもしくはＬ−ソルボースから２−ＫＧＡを生産することが知られており、例を示せば、２−ＫＧＡ生産量は６９／Ｌ以下ではあるがアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の菌が知られている（特公昭５１−４０．１５４号）。一般的にＤ−ソルビトールから２−ＫＧＡへの経路は下記の如くに考えられている（Ｍａｋｏｖｅｒらの１９７５、ＢｉｏＬｅｃｈｎｏｌ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇ、上ヱ、第１４８５頁−第１５１４頁）。

Ｄ−ソルビトール→Ｌ−ソルボース→Ｌ−ソルボリン−２−ＫＧＡ微生物を用いてＬ−ツルポリンを２−ＫＧＡに変換する反応が知られている。いくつかの先行文献において、微生物の無細胞抽出液を用いたし一ツルポリンからの２−ＫＧＡ生産が報告されている。

米国特許明細書筒３．９０７．６３９号には、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｉｅｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）Ｊｌｉ、バチルス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロバクタ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌ　ｉｇｅｎｅｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎ　ｉｃ　ｉ　ｌ　ｌ　ｉｕｍ）属、キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属およびグルコノバクタ−属に属する微生物は、前記の様な変換を行いうろことが報告されている。

更に比相ら（Ｅｕｒｏｐ、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、第２巻、第１頁、１９７５）は、グルコノバクタ−・メラノゲ不ス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ３２９３から発見したし一ツルポリン酸化酵素が酵素活性発現に、補酵素や電子受容体のいずれも要求しないと報告している。

しかしながら、これまでに、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくは、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰ）等の補酵素に依存せずに、Ｌ−ツルポリンを２−ＫＧＡに酸化する活性を有する精製酵素に関する開示はなされていない。

特定の微生物の細胞の膜画分から単離精製した酵素が、ＮＡＤやＮＡＤＰの様な補酵素に依存せずにＬ−ツルポリンの２−ＫＧＡへの酸化を触媒することが見い出された。本発明は、この発見に基いて完成されたものである。

本発明の目的は、Ｌ−ツルポリンの２−ＫＧＡへの酸化を触媒する、新規な補酵素非依存型Ｌ−ツルポリン脱水素酵素を提供することにある。

また、それ以外の目的は、発酵法による該新規Ｌ−ツルポリン脱水素酵素の製造方法を提供することにある。更にまた、本発明の目的は、該新規Ｌ−ツルポリン脱水素酵素もしくは該酵素を生産する微生物を用いて、Ｌ−ツルポリンから２− ＫＧＡを製造する改良された方法を提供することにある。

更に本発明の別の観点からの目的は、改良された方法による該Ｌ−ツルポリン脱水素酵素の生産を可能にし、かつまた組み換え微生物によって生産される該酵素もしくは、発酵法による該組み換え微生物を用いてＬ−ソルボリンから２−ＫＧＡ生産を可能ならしめる遺伝子工学技術を提供することにある。この観点から、該新規Ｌ−ツルポリン脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ、ベクターおよび該ＤＮＡを有する組換え体もまた本発明の範囲に含まれる。

関連する該ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、組換え微生物および製造方法に関連して与えられるアミノ酸部分配列に関しては、前記アミノ酸配列の機能的同等物、即ち同じ目的を達成する同等物も含まれると理解される。

図面の説明第１図は、プラスミドｐＶＫ１０２の制限酵素地図を示す。

第２図は、本発明のプラスミドの制限酵素地図を示す。

第３図は、Ｌ−ツルポリン脱水素酵素をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡの制限酵素地図を示す。

第４図は、グルコノバクタ−・オキシダンスＩＦＯ１２２５８由来のＬ−ソルボリン脱水素酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。

下線部は、該酵素蛋白質のペプチド断片のアミノ酸配列分析から決定された部分的アミノ酸配列を示す。

本発明の新規Ｌ−ツルポリン脱水素酵素は、Ｌ−ソルボリンから２−Ｋ（１，Ａへの酸化反応において、ＮＤＡｌＮＤＡＰ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、７ラビン・アデニンジヌクレオチド（ＦＮＤ）等の様な補酵素に依存しない点に特徴がある。

本酵素の諸性質ならびにその製造方法を以下に示す。

（１）酵素活性本発明のし一ツルポリン脱水素酵素は、以下の反応様式に示す様に、電子受容体の存在下に、Ｌ−ツルポリンの２−ＫＧＡへの酸化を触媒する。

Ｌ−ツルポリン　＋　電子受容体本酵素は、分子状の酸素を受容体として利用しない。受容体としては、２．６− シクロロフエノールインドフエノール（ＤＣＩ　Ｐ）　、フエナジンメソサルフエイト、ヴルスターズ胃、フェリシアナイド、補酵素ＱまたはチトクロームＣが使用可能である。

酵素活性測定は、２５°Ｃで、６００ｎｍにおけるＤＣＩＰの吸光度の減少を吸光度計で測定することにより行なわれる。ｌユニットの酵素活性は、１分間あたり１マイクロモル（μｍｏｌｅ）のＤＣＩＰを還元する酵素の量と定義した。ｐＨ７，０におけるＤＣＩＰの吸光係数は、ｌｎ＋Ｍ当り９．４５である。基本的な反応溶液を以下に示す。本反応溶液は、活性測定の直前に調製した。

基本反応溶液：０．３％トライトンｘ−１００を含む０．１Ｍ燐酸カリ緩衝液（ｐＨ７，０）　６ｍ＋２２．５ｍＭ　ＤＣＩＰ　０．４５ｍ１２Ｈ！０　１０．３５ｍｆｆ１ｃｍの光路長のキュベツトに、０．４−の基本反応溶液、２０乙の１０ｍＭフェナジンメソサル７エイト、１０ｚＪの酵素溶液および２０にの照のキュベツトには、基質以外の全ての成分を入れる。反応は、基質を添加することによって開始した。酵素活性はＤＣＩＰの初期の還元速度により測定した。

（２）基質特異性本酵素の基質特異性は上記（１）と同様の酵素活性測定法により、各種基質溶液を用いて測定し得る。本発明の酵素は、後に示す実施例３に例示するように、各種のアルデヒド化合物の酸化を触媒する。

（３）物理化学的性質本発明の酵素は、以下の物理化学的性質を有する。

ａ）至適ｐＨ：約７．０、ｂ）至適温度：約３０°〜約４０°ＣＣ）分子構造二本酵素は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された分子量約４７，５００±５゜０００の１種類の型のひとつのユニットから成る。

ｄ）熱安定性＝３０°Ｃ以下で安定。

ｅ）阻害剤　：Ｃｕ”＋イオンで阻害される。

至適温度の範囲は、本酵素が至適温度範囲内でより長い時間培養した後分解されるかもしれないという事実とは別に、酵素が高い初期反応速度を示す温度範囲と関係することに注意すべきである。

（４）本酵素の生産本発明によりもたらされるし一ツルポリン脱水素酵素は、適当な微生物を培養し、菌体を破壊し、破壊された菌体の無細胞抽出液から、好ましくは、微生物の膜画分から単離精製して調製することができる。

本発明に用いられる微生物は、グルコノバクタ−属に属すぢ微生物もしくはその突然変異株である。最新の分類によれば、グルコノバクターに属する全ての株は、グルコノバクタ−・オキシダンス種に帰属する。

グルコノバクタ−・オキシダンス種に属する菌株の形態学的および生理学的特徴は、バージイズ・マニュアル・オブ・システマテインク・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｍｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１巻、第２７５頁−第２７８頁、１９８４年およびニア・ボンセル（Ｇｏｓｓａｌ　Ｉｅ）等、インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマテインク・バクテリオロジ−〇ｎｔｅｒｎａｔ４ｏｎａｌ　Ｊ、　５ｙｓｔｅ＋＋＋、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）第３３巻、第６５頁−第８１頁、１９８３年に記載されている。

本発明において使用するグルコノバクタ−属に属する微生物は、自然界から単離することが出来、また寄託機関からも入手可能である。また、それらから誘導された変異株も本発明において使用可能である。

本発明において使用される変異株は、野生株を紫外線照射、Ｘ線照射もしくは、 γ線照射のような変異原性因子処理するか、または亜硝酸もしくは他の適当な突然変異原と接触させることにより、または自然的突然変異により生ずるクローンを単離することにより得ることができる。

これらの野生株またはその突然変異株の突然変異は、その目的のために、それ自体当業者によく知られたいずれの方法によって起すことができる。

これらの方法の多くは、例えば、山鳥、吉日および賀田編、講談社すイエンス社、１９７３年発行の“化学的変異原”等の種々の出版物に記載されている。

本発明における突然変異株は、グルコノバクタ−・オキシダンス種に属する菌株の細胞融合および変異誘発および／または細胞融合との組合せによっても得ることができる。

本発明において使用される最も好ましい菌株の例は、グルコノバクタ−・オキシダンス（カタログにはメラノゲ不ス（ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓ）として収載されている）ＩＦＯ１２２５？、グルコノバクタ−・オキシダンス（カタログにはメラノゲネス（ｍｅ　Ｉａｎｏｇｅｎｅｓ）として収載されている）ＩＦＯ１２２５８等である。

これらの微生物は、好気的条件下、適当な栄養源を補った液体培地中で培養することができる。培養は、ｐＨ４，０〜約８．０、好ましくはｐｕ５．５〜７．５で行うことができる。培養時間は、用いる微生物および栄養培地によって異るが、好ましくは約１０〜１００時間である。培養を行うのに好適な温度範囲は、約１０℃〜４０℃で、好ましくは２５°Ｃ〜３０″Ｃである。

培地は、通常、同化し得る炭素源；例えばグリセロール、Ｄ〜マンニトール、Ｄ −ソルビトール、エリスリトール、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、ズルシトール、Ｄ−リポース、マルトースおよび蔗糖、好ましくは、Ｌ−ソルボース、Ｄ−ソルビトールもしくはグリセロール、消化可能な窒素源：例えばペプトン、酵母エキス、大豆粉及びコーンスチープリカー等の有機物質、例えば硫安、塩化アンモニウムおよび硝酸カリ等の無機物質；ビタミン類および微量元素類等の栄養源を含む必要がある。

以下、培養後に、該微生物からＬ−ツルポリン脱水素酵素を単離および精製するだめの一実施態様を簡単に記述する。

（１）遠心分離によって培養液から細胞を採取する。

（２）細胞を、緩衝液にけん濁し、ホモジナイザー、超音波処理器またはリゾチーム処理等により破壊し、細胞の破壊溶液を得る。

（３）破壊した細胞の無細胞抽出液、好ましくは微生物の膜画分からＬ−ツルポリン脱水素酵素を単離精製する。

本発明により提供されるＬ−ツルポリン脱水素酵素は、Ｌ−ツルポリンから２− ＫＧＡを生産するだめの触媒として有用である。反応は、例えばＤＣＩＰ、７エナジンメソサル７エイト、ヴルスターズ青、フェリシアナイド、補酵素Ｑ１チトクロームＣ等の電子受容体の存在下、燐酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等の溶液中、ｐＨ値約５．０〜約１０．０で行なわなければならない。反応を行なわせるに好ましい温度範囲は、約り０℃〜約５０℃である。ｐＨおよび温度を各々、約７．０−８．０および３０℃に設定した場合、反応は最も好ましい結果をもたらす。溶液中のし一ツルポリンの濃度は他の反応条件によって種々異なるが、一般的には、約１０−１００，９　／Ｑが好ましく、約３０〜４０．？／ｆｆが最も好ましい。

反応において、酵素は、適当な担体で固定化した状態で使用することもできる。

一般知られている酵素固定化のいかなる手段も使用することができる。例えば、官能基を有する樹脂の膜、微粒子等に酵素を直接結合してもよく、または、グルグルアルデヒド等の二官能基を有する橋状化合物を介して樹脂に結合させてもよい。

本発明は、該酵素、酵素の製造方法および先に説明した酵素を用いた２−ＫＧＡの製造方法の外に、該酵素遺伝子のクローニングおよび発現のための遺伝子工学技術、酵素生産のために有用な遺伝子材料および該遺伝子材料を用いた２−ＫＧＡ生産のための改良された方法にも関する。

より詳しくは、本発明は該酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子を導入した組換え微生物を用いた補酵素非依存型Ｌ−ツルポリン脱水素酵素の生産ならびに該組換え微生物それ自体に関する。

本発明は、更に該遺伝子および上記組換え微生物を構築するために利用可能な該遺伝子を含む組換え分子にも関する。

さらに本発明はＬ−ツルポリンを該組換え微生物から生産される酵素と接触させることにより、２−ケトーＬ−グロン酸を生産する方法および上記組換え微生物の発酵により、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ−ツルポリンから２ −ＫＧＡを製造する方法に関する。

最後に、本発明は、また、グルコノバクタ−の菌株を用いて、上記組換え体としての接合伝達体を製造する方法に関する。

概略的には、本発明で利用される組換え微生物は、次の工程により得ることができる：（１）補酵素非依存型Ｌ−ツルポリン脱水素酵素を生産しうる適切なグルフッバクター属に属する菌株の染色体ＤＮＡから、遺伝子ライブラリーを構築し、（２）該酵素またはその誘導体を発現するクローンを得るため、上記遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、（３）必要に応じて、該酵素の発現に必須な極力小さいサイズのＤＮＡ断片を含むサブクローンを得るために、上記クローンのサブクローニングをし、および（４）必要に応じて、高生産ならしめるべく、組換えＤＮＡ分子の再構築をする。

本発明の上記項目の中で用いられる材料および技術の詳細な説明を次に示す。

新規Ｌ−ソルボソン脱水素酵素をコードする遺伝子のクローニングと組換え体の構築本発明の補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素をコードする遺伝子は、該酵素を生産し得るゲルコノバクター属に属する微生物、好ましくはグルコノバクタ −・オキシダンスＩＦＯ１２２５Ｂ株、グルコノバクタ−・オキシダンスＩＦＯ１２２５７株もしくは、それらの変異株からクローン化することができる。

Ｂ）遺伝子ライブラリーの構築公知の手法により、上記起源の菌株より単離された染色体ＤＮＡを、制限酵素たとえば、５ａｌＩ、　ＨｉｎｄＩＩ［、ＸｈｏＩまたはＥｃｏＲＩなどで部分消化する。生じた大分子量を有する好ましくは、１５から３５ｋｂのＤＮＡ断片を集め、適切なベクターを適当な制限酵素で切断され、好ましくは細菌または牛腸のアルカリ性フォスファターゼで処理された適当なベクターと、リガーゼ処理により結合する。該ベクターとしては、プラスミドおよびファージのいずれも利用できる。本発明において、最も望ましいベクターは、たとえばｐＶＫｌｏｏ　（ＡＴＣＣ３７１５６）、もしくはｐＶＫ　Ｉ　Ｏ２（ＡＴＣＣ３７１５８）またはそれらの誘導体、すなわち、λファージのＣＯ５部位、ＭＯｂ部位、ＲＫ２の複製オリジンおよび抗生物質耐性遺伝子等の１つ以上のマーカー遺伝子を含有する誘導体等のコスミドベクターである。

かくして得られた、適切なベクター上に保持される組換えＤＮＡは、適切な宿主微生物へ形質転換法、形質導入法または接合伝達法などの様なりＮＡ導入系のいずれかにより導入される。

本願においては、上の様にした得られた組換えＤＮＡから成る遺伝子ライブラリーを、グルコノバクタ−・オキシダンス株を宿主として、次の様な手順で構築することができる。

（２）　グルコノバクタ−・オキシダンス株を宿主とする遺伝子ライブラリーを得るＩ：めには、組換えＤＮＡをまず、大腸菌（Ｅ　５ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ。

１ｉ）のいずれかの株に移し、大腸菌での遺伝子ライブラリーを作成する。

この目的には、ベクターとしてコスミドベクターを用いるラムダ（λ）７アージのイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）パッケージング系を用いることができる。

コスミドベクターを用いるこの系は、大分子量のＤＮＡのクローニングに適している。該イン・ビトロパッケージング系に適した宿主には、大腸Ｗｃ６００株大腸菌ＨＢＩＯＩ株、もしくは大腸菌ＥＤ８７６７株が挙げられる。このイン・ビトロパッケージング系は、商業的に入手可能であり、使用の際しては、製造業者の指示に従って、使用することができる。この様な系は、文献記載の方法（たとえばＴ、Ｍａｎｉａｔｉｓらの、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ１Ａ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２５６−２６８　（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＰｒｅｓｓＳＣｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳＮ、Ｙ、）に従ってもまた調製し、使用できる。

（２）次に組換えＤＮＡを、ＤＮＡ供与体としての大腸菌（Ｅ　、ｃｏｌ　ｉ）から二親間接合伝達法もしくは二親間接合伝達法により受容菌としてのグルコノバクタ−属の適切な株へ、移す。

二親間接合伝達法を用いる際には、供与体の大腸菌は、その染色体ＤＮＡ上にＴｒａ遺伝子を有していることが必要である。そして遺伝子ライブラリーが作成された大腸菌が、このＴｒａ遺伝子を有していない場合には、該組換えＤＮＡを、Ｔｒａ遺伝子を有する別の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）に移すことが要求される。Ｔｒａ遺伝子を有する株としては、大腸菌５１７−１株が、好ましい。ある大腸菌中の組換えＤＮＡを、Ｔｒａ遺伝子を有する別の大腸菌へ導入するには、通常の形質転換法により行なうことができ、この様にして、次に行なう接合伝達時に、ＤＮＡ供与体として用いられる大腸菌中で、新しい遺伝子ライブラリーを作成することができる。

この二親間接合伝達を行なう際に、伝達されるビークルがＭｏｂ部位を有していることも必要である。前に記載したベクターｐＶＫ　１００．　ｐＶＫ１０２またはＭｏｂ部位を有するこれらの誘導体は、該Ｍｏｂ部位保持ビークルを構築するｌ；めにも好適である。

次に、ＤＮＡ供与体として、上記の様に調製した大腸菌中での、遺伝子ライブラリーの各々のクローンを液体培養する。同時に、受容菌としてのグルコノバクタ −属菌株も対数増殖期から、定常期初期まで適切な培地を含む試験管中で培養する。このグルコノバクタ−の培養液を、次いで大腸菌の培養液の各々と、約ｌ：１０から約１０：１までの種々の割合で混合する。各混合液をグルコノバクタ− および大腸菌両者の成育に適した培地の寒天平板の表面に置いたニトロセルロース・フィルター上に、スポットした後、３時間から７旦間靜置する。

（３）接合伝達体は、許容体である大腸菌、非接合伝達されないグルフッバクターおよび接合伝達を受けたグルコノバクタ−からなる混合体から適当な方法、たとえば抗生物質耐性やアミノ酸要求性を利用した選択法により、選ぶことができる。

（４）上記接合伝達体を敵と適当な数集めることにより、グルコノバクタ−属菌株中での遺伝子ライブラリーを作成することができる。

接合伝達体は、供与体としての組換えプラスミドを保持する大腸菌、ヘルパーとしてのＲＫ２もしくはｐＲＫ２０１３の様なＴａｒ遺伝子を有する大腸菌および受容菌としてのグルコノバクタ−属、菌株を用いて、三親間接合伝達によっても得ることができる。

ここで用いる受容菌としてのグルコノバクタ−株は、グルコノバクタ−属に属するいずれの菌株でもよい。特に、２−ケトーＬ−グロン酸を生産するグルコノバクタ−・オキシダンスＩＦ０３２９２株、グルコノバクタ−・オキシダ７スＩＦ０３２９３株（ＥＦＲＭ−Ｎｏ、８３５６）、グルコノバクタ−・オキシダンスＩＦ０３２９４株およびそれらの誘導体、あるいはＬ−ソルボソンを蓄積するグルコノバクタ−・オキシダンス０Ｘ−４株や、２−ケトーＬ−グロン酸高生産株のグルコノバクタ−・オキシダンスＮ４４−１株もしくはグルコノバクタ−・オキシダンスリー１３株（ＦＥＲＭ−ＢＰ　Ｎｏ、Ｉ２６９）およびそれらの誘導株を用いることができる。これらの誘導株は、前に記載の通常の変異処理により得られる。

Ｃ）スクリーニング一般的に遺伝子ライブラリーは、次に示す方法を用いて、スクリーニングすることが可能である。

（１）該酵素の適当なアミノ酸配列に従って合成したオリゴヌクレオチドグローブを用いて遺伝子ライブラリーをコロニーハイブリ・グイゼーションにより、スクリーニングする方法。

（２）該酵素を抗原として用いて調製した抗体を利用する遺伝子ライブラリーの免疫学的スクリーニング法。

（３）適切な宿主中での、遺伝子ライブラリーの直接発現にょるスクリーニング法。

本発明においては、前に記載の説明に従ってグルコノバクタ−中に作成した遺伝子ライブラリーを試験に供する直接発現スクリーニング法が好適に用いられる。

この直接発現スクリーニングは、以下に示す手順を用いて行なうことができる。

グルコノバクタ−中で作成した遺伝子ライブラリーの各々の株を、マーカーとして有用な適当な抗生物質を含む寒天平板上で、ｌＯｏＣかも４０℃、好ましくは２５℃から３０℃で、１日から７日間生育させる。得られた菌株を休止菌体反応に供する。この反応系は、菌体を１から５％のし一ソルボソンまたはＬ−ソルボース、０，３％ＮａＣｆ１および１％ＣａＣ０１を含む反応溶液に懸濁し、それをｌＯｏＣかも４０℃、好ましくは２５℃から３０℃で１日から７日間静置して行なう。反応後の反応混合液を、薄層クロマトグラフィーに供し、陽性クローンとして、Ｌ−ソルボソン又はＬ−ソルボースから２−ケトーＬ−グロン酸を蓄積するクローンを、もしくはＬ〜ソルボソン蓄積する宿主を用いる時はＬ−ソルボースから蓄積するＬ−ソルボソンを消費するクローンを、選択する。

この様にクローン化された補酵素非依存型、Ｌ−ソルボソン脱水素酵素をコードするＤＮＡは、良く知られた方法に従って、制限酵素地図の作成８よび／または塩基配列の決定により、特徴づけられる。

Ｄ）組替えプラスミドの安定性組換えＤＮＡ技術の分野で良く知られている通り、大部分の組換え微生物は、外来グラスミドの脱落を防ぐためには、抗生物質などの選択圧を必要とする。しかしながら、醗酵液への抗生物質や他の薬剤の添加は、食品、飲料、医薬品などの様な醗酵生産には極力避けられるべきである。

さらに生産工程の簡略化のためにも、薬剤添加を避けるべきである。

したがって、現在まで組換え体の系の安定性改善に向け、種々の技術たとえばプラスミドへのｐａｒ領域の導入や低コピー数プラスミドの使用もしくは温度シフトやＩＰｒＧ（イソプロビルチオガラフトシド）添加による誘導などを用いて、様々な検討が行なわれてきている。

プラスミドの安定性は、宿主微生物とプラスミドの組合せに依存することが知られている。

プラスミドｐＶＫ１００およびｐＶＫ１０２から誘導される組換えプラスミドは、いかなる培養、たとえばＭＢ培地、ＦＢ培地および２−ケト−グロン酸培地における培養においてグルコノバクタ−属の菌株中で、ｐＶＫＩＯＣＩよびｐＶＫ１０２そのものと同様の安定性を示すことを見この様に、本発明は、グルコノバクタ−中での補酵素非依存型Ｌ−ンルポンン脱水素酵素生産、およびＤ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースまたはＬ−ソルボソンからの２−ケトーＬ−グロン酸生産に有用なグルコノバクタ−属の菌株中で安定に保持される組換えプラスミドを提供するものである。

本発明におけるこの安定な組換え発現プラスミドは、少なくともプラスミドｐＶＫｌｏＯもしくはｐＶＫ１０２由来のＤＮＡ断片、グルコノバクタ−属の菌株中で発現する構造遺伝子、および所望ならば該構造遺伝子に機能的に接合されｔ；発現制御領域から成ることを特徴とする。

Ｅ）形質転換された微生物目的の酵素を発現できる形質転換体は、該酵素の構造遺伝子を含む上記のクローン化されたグラスミドを適当な宿主中に導入することにより取得できる。該プラスミドが、その構造遺伝子用の適切な発現制御領域を有さない場合は、その構造遺伝子上流に機能的に連結する様、プロモーター配列および／／ＳＤ（シャインーダルガルノ）配列を導入することにより、発現プラスミドを再構築してもよい。

本発明の実施例においては、グルコノバクタ−属の菌株からクローン化された該酵素の発現制御領域と構造遺伝子との両者を含むＤＮＡ断片の例が示されている。この場合、該ＤＮＡ断片が挿入されるプラスミドは、宿主としてのグルコノバクタ−の菌株もしくは、適当な微生物中で、目的の酵素の構造遺伝子を発現することができる。

形質転換された微生物を用いたＬ−ソルボソン脱水素酵素生産Ａ）生産と単離上記のごとく得られた形質転換された微生物は、醗酵および単離操作によってＬ −ソルボソン脱水素酵素生産に用いることができる。

この形質転換体の醗酵条件は、通常、宿主微生物に依存して選択される。宿主微生物がグルコノバクタ−属の菌株である時は、前に記載の醗酵条件を該形質転換体に適用することができる。

該形質転換体により生産されたＬ−ソルボソン脱水素酵素の単離は、蛋白質化学の分野で周知の方法を用いて行なうことができる。

Ｂ）組換え体生産物と天然型生産物との比較組換え体の生産するＬ−ソルボソン脱水素酵素と、天然型酵素の同一性は、両酵素の触媒特性、！；とえば至適ｐＨ１至適温度、分子量、熱安定性などの性質の比較に加えて周知の免疫学的試験によっても確認することができる。

以上の様に、本発明の組換え技術を用いて生産されるし一ソルボソン脱水素酵素は、Ｌ−ソルボソンからの２−ケト−グロン酸培地の触媒として有用である。このＬ−ソルボソンからの２−ケトーＬ−グロン酸生産は、該酵素のみならず、組換え微生物の無細胞抽出液、休止菌体および増殖菌体によっても、行なうことができる。

この組換え微生物は、また休止菌体系もしくは、増殖菌体系を用いたＤ−ソルビトールやＬ−ソルボースからの２−ケトーＬ−グロン酸生産にも、有用である。

単離された組換え酵素または、無細胞抽出液を用いたＬ−ソルボソンから２−ケトーＬ−グロン酸への変換の典型的な条件は、前に記載した天然型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素のものと同じである。

本発明の組換え微生物は、宿主微生物がグルコノバクタ−属の菌株である場合には、Ｄ−ソルビトールもしくはＬ−ソルボースからの２−ケトーＬ−グロン酸生産において、その親株である微生物よりもかなり有利である。この組換え微生物は、適当な栄養源を補った液体培地中で、好気的条件下培養できる。この培養時、出発原料としてのＤ−ソルビトールもしくはＬ−ソルボースを、醗酵の適当な時期、好ましくは開始点で、加えることができる。この出発原料、たとえばＤ− ソルビトールの濃度範囲は、１０から４００ｇ／Ｌ程度であり、この培養液は、約１０°Ｃから４０℃、好ましくは、２５°Ｃから３０℃に保つ。この培養は、ｐＨ約４．０から８．０、好ましくは、５．５から７．５で行なう。培養期間は、用いる組換え微生物および栄養培地により変化しうるが、好ましくは、約２０から２００時間である。

本発明を次に示す実施例によりさらに例示する。

実施例■ グルコノバクタ−・オキシダンス株によるＬ−ソルボソンからの２−ケ）−Ｌ− グロン酸の生産グリセロール　５　ｇ／　Ｌ　、酵母エキス　５ｇ／Ｌ−１ＭｇＳＯ，・７Ｈ２ｏ　５ｇ／ＬからなるＮｏ、４培地の寒天平板上で成育したグルコノバクタ−オキシダンス株ｒＦ０３２９２、ＩＦＯ３２９４、ＩＦＯ１２２５７、ＩＦＯ１２２５８、ＡＴＣＣ９９３７及びＩＦＯ３２９３（ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、８３５６）を、グリセロール　７０ｇ／Ｌ１酵母エキス１５ｇ／Ｌ、Ｍｇ５ｏ、・７Ｈ，０２，５ｇ／Ｌ、およびＣａＣＯ５１０ｇ／Ｌから成るＮｏ、３８．Ｇ培地５ｍ（＋を含む試験管に接種した。試験管振盪機上で、３０℃にて３日間培養した後、その培養液１ｍ１２は、新鮮なＮｏ、３Ｂ、Ｇ培地５０ｍ（ｌを含む５００ｍＱ容三角フラスコに接種するために使用された。このフラスコを回転式振盪機（１８０ｒ、ｐ、ｍ）上で３０°Ｃ３日間培養した。各培養液２ＱｍＱを、５００ｒｐｍで１５分間遠心し、細ｍｌと残存ＣａＣ０，を含む固型分を集め、１．ＯｍＱの０，３％殺菌ＮａＣＱで２度洗浄し、ＮａＣＱ　３ｇ／Ｌ、Ｌ−ソルボソン　３０ｇ／Ｌ、ＣａＣ０゜１０ｇ／Ｌを含む反応溶液６ｍＱに懸濁した。反応は、試験管中で３０℃、２３時間、試験管振盪機上で行なった。２−ＫＧＡの収量を第１表中に要約しである。培養中の蒸発損失は補正していない。

実施例２グルコノバクタ−・オキシダンスＴＦＯ１２２５８からのＬ−ソルポリグルコノパクター・オキシダンスＩＦＯ１２２５８の寒天斜面培養を、グリセロール　７０ｇ／Ｌ、酵母エキス（オリエンタル社製）１５ｇ／ＬおよびＭｇ５Ｏ＋　・７ＨｘＯ２−５ｇ／Ｌよりなる培地５ｍＱを含む試験管に接種し、３０°Ｃで２日間、試験管振盪機（２８０ｒ−ｐ−ｍ）上で培養した。本培養液２ｍＱを同一の培地１００ｍ１２を含む５００ｍ＜１の三角フラスコに接種し、３０°Ｃで２０時間、回転振盪機（１８０ｒ、ｐ、ｍ）上で培養した。この様して調製した培養液を２０Ｌの同一の培地を仕込んだ３０Ｌ容ジャーファーメンタ−の種培養として用いた。ジャー７−メンタ−は、３０°Ｃ１撹拌は２５　Ｏｒ、ｐ、ｍ、および通気量は２０Ｌ／分で運転した。４０時間培養後、培養液を集め、遠心分離（８，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ）によって菌体を回収した。２ＯＬの培養液から、５００ｇ　（湿重量）の菌体が得られた。菌体歯、使用するまで一２０℃で凍結保存した。

（２）膜画分の調製グルコノバクタ−・オキシダンスＩＦＯ１２２５８の凍結菌体（５００ｇ、湿重量）を溶解し、２，５００ｍ＋２の０．８５％食塩水にけん濁した。

次いで、該細胞けん濁液を、ダイノミルホモジナイザ−（Ｗｉｌｌｙ　Ａ。

Ｂ　ａｃｈｏｆｅｎ　Ｃｏ、Ｂａ５ｔｅ）を用い、ガラスピーズ（直径０　、１　ｍｍ）存在下、４℃で２　、　ＯＯＯｒ、ｐ、ｍ、で４分間処理し、細胞を破砕した。

得られた細胞破砕液は、１．８００ｇで１０分間遠心して菌体細片およびガラスピーズを除去した。得られた上溝を８０．０００Ｘｇで６０分間遠心し、得られた沈澱を膜画分（２００ｇ、湿重量）として集めた。

（３）膜画分からのし一ツルポリン脱水素酵素の可溶化膜画分（２００ｇ、湿重量）を、９００ｍ（２の１％トライトンＸ−１００を含む５０ｍＭ燐酸カリ緩衝液（ｐＨ，７，０）に懸濁し、１５時間撹拌した後８０．０００Ｘｇで１時間遠心し上溝（８５０ｍＱ）を得た。

（４）ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−トヨバール（ポリビニル型）６５０５　（東洋ソーダ社製）カラムクロマトグラフィー前記の工程で得られた上清（３３０ｍ（２）を０．１％トライトンＸ−１００を含む１ｍＭ燐酸カリ緩衝液２０Ｌに１５時間透析後、同上の緩衝液であらかじめ平衡化しておいたＤＥＡＥ− トヨパール６５０８カラム（２，３Ｘ４０ｃ＋＋＋）にかけた。カラムを同上の緩衝液で洗浄後、酵素を０．０Ｍから０．４Ｍまでの食塩の直線濃度こう配を使って溶出した。

（５）ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロラドグラフィー前工程で得られた活性画分を合し、０．１％トライトンｘ−ｉｏｏを含む１ｍＭ燐酸カリ緩衝液（ｐＨ７，０）に１５時間透析後、同上の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（２，５ＸｌＯｃ＋ｎ）にかけた。カラムを同一の緩衝液で洗浄後、酵素を０．０Ｍから０゜４Ｍまでの食塩の直線濃度勾配を用いて溶出した。

（６）ＣＭセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフイー前工程で得られた活性画分を合し、０．１％トライトンＸ−１００を含む１．０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）に１５時間透析後、同一の緩衝液で平衡化したＣＭセファロースＣＬ−６Ｂカラム（２−５Ｘ　１４．５ｃｍ）にかけた。カラムを同一の緩衝液で洗浄後、酵素を０．０Ｍから０．４Ｍまでの食塩の直線濃度勾配で溶出した。

前工程で得られた活性画分を合し、０．１％トライトンＸ−１００を含む１．０ｍＭ燐酸カリ緩衝液（ｐＨ７、０）に１５時間透析後、同一の緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトＨＣＡ１００Ｓカラム（１゜７ＸＩ８ｃｍ）にかけた。カラムを、同一の緩衝液で洗浄後、酵素を０゜１％トライトンＸ−１００を含むｌＱｍＭ燐酸カリ緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。

前工程で得られた活性画分を合し、メンブランフィルタ−（Ｄａｉｆｌ。

ＰＭ−３０、Ａｍｌｃｏｎ社製）を用いて限外口過し、少量になるまで濃縮した（約１．５ｍ（２）、次いで、得られた濃縮液を、０−１％トライトンＸ−１００を含む５０ｍＭ燐酸カリ緩衝液で平衡化したＴＳＫゲルトヨパールＨＷ６０ｓカラム（１−５Ｘ８０ｃｎ＋）にかけた。該カラムは、同一の緩衝液で展開した。

膜結合型Ｌ−ツルポリン脱水素酵素の精製法の概要を第２表に示した。

実施例３Ｌ−ツルポリン脱水素酵素の性質（１）　電気泳動による分析比活性が６．７ユニツト／ｍｇ蛋白を示す精製された酵素をドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）で処理し、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって該酵素の精製度を分析した。その結果、本酵素は分子量４７゜５００±ｓｏ、ｏｏｏの単一で均質なサブユニットからなることが明らかになった。

（２）触媒作用に関する性質精製されたし一ツルポリン脱水素酵素は、２，６−シクロロフエノールインドフエノールもしくはフェナジンメソサルフェートの様な電子受容体の存在下でのみ活性を示した。

精製された本酵素の基質特異性を第３表に示す。各種のアルデヒド化合物が酸化された。その中でも、メチルグリオキサールが最も効率良く酸化され、その反応速度は、Ｌ−ツルポリンに対する時のそれの２倍高い値を示した。

Ｌ−ツルポリンに対するみかけ上のミカエリス定数は、ｐＨ７，０下で１６．７ｍＭであった。

第４表に示す様に、Ｌ−ツルポリン脱水素酵素のメチルグリオキサールの酸化における至適温度は、３０℃〜４０℃の間に認められた。

Ｌ−ツルポリンの酸化におけるｐＨの影響について第５表に示した。

本酵素は至適ｐＨを７．０に示した。Ｌ−ツルポリンの酸化に対する金属の効果について検討したところ、検討した金属の中で、Ｃｕ”イ゛オンが酵素を強く阻害することが分つＩ；（第６表）。第７表に示した様に、モノヨード酢酸は、本酵素を中程度に阻害した。

精製された本酵素のｐＨ安定性を調べた。本酵素を各種のｐＨの緩衝液中で４℃ で４８時間処理した後、残存酵素活性をｐＨ７，０で測定した。

第８表に示す様に、本酵素は、調べたｐＨの領域では比較的安定であった。ｐＨ４，０においては、約３分の１の活性が失なわれた。

Ｌ−ツルポリン脱水素酵素の熱安定性をしらべた。第９表に示した様に、約７０％の酵素活性が４０℃ｌＯ分間の処理によって失なわれた。

実施例４グルコノバクタ−オキシダンス　ＩＦＯ１２２５８株のし一ソルボソン脱水素酵素遺伝子のクローニング体Ｄ　Ｎ　Ａの抽出グルコノバクタ−オキシダンス　＋Ｆｏ１２２５８株を、マンニトール　２５ｇ／Ｌ、バクトペプトン　３ｇ／Ｌ、酵母エキス　５ｇ／Ｌから成るマンニトールブロス（ＭＢ）培地２００ｍ４中で、３０℃、４８時間培養した。得られた細胞を遠心分離し、トリス（ｌ　ＯｍＭ）−ＥＤＴＡ（１ｍＭ）緩衝液１００−で洗浄し、トリス（１０ｍＭ）−ＥＤＴＡ　（２０ｍＭ）緩衝液５０社中に再懸濁した。

この様にして調製した細胞懸濁液を２ｍＱのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍ（１）を加えて、３７℃、３０分間処理し、続いて４０００ユニツトのプロナーゼで、３７℃、３０分間処理後、ｌＯｍＱの５％ＳＤＳを加え、３７°ｃＳ　１時間静置し、透明な溶菌液を得た。該ＤＮＡは、４％オクタツールを含むクロロホルムと中和したフェノールの１＝１混液６０ｎｕ２で、４℃、３０分間、ゆっくり回転させることにより、抽出した。この混合液を１５．０００ｒ、ｐ、ｍ、１５分間遠心分離し、得られた上溝を、クロロホルム：オクタツール（９６：　４）を６０＋ｎＱ用いて、４°０１１０分間ゆっくり回転させて抽出しＩ；。

この混合液を１５，００　Ｏｒ、ｐ、ｍ、１５分間遠心分離後得られた上清５０ｍＱに、３Ｍ酢厳ナリトウム５ｍ（＋を加え統いて、冷エタノール５５−を静かに注いだ７、粗精製ＤＮＡは、ガラス捧でまきとった後、リボヌクレアーゼＴ１及びリボヌクレアーゼＡ酵素により３７°ｃＳ０分間処理し、さらに再びプロナーゼで３７℃、３０分間処理した。上記フェノール及びクロロホルムによる抽出を繰返し、精製染色体ＤＮＡを得た。

（１）−ｂ）　ベクタープラスミドの調製コスミドベクターｐＶ　Ｋ　１０２　（Ｅ　、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒら、Ｐ　Ｉａｓｍｉｄ　８．４５−５４．１９ｇ２）は、アルカリ法（Ｈ、Ｃ、Ｂ　ｉｒｎｂｏｉｍとＪ　、Ｄｏｌｙｘ　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１ヱ、１５１３−１５２３．１９７９）により、ｐＶＫＩ０２保持大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　Ｉ　Ｏ１より調製した。その制限酵素地図を第１図に示す。

（１）−ｃ）　インビトロ　パッケージンググルコノバクタ−オキシダンス　ＩＦＯ１２２５８株の全染色体ＤＮＡを、制限酵素５ａＱＩ（宝酒造社製）で部分消化し、得られたＩ５から３５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により分離した。（１）−ｂ）で調製したプラスミドｐＶＫ１０２は、制限酵素５ａ（２Ｉで完全消化し、牛腸アルカリフォスターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）で処理した。次にこれら１５ｋｂから３５ｋｂのＤＮＡ断片と直鎖状ｐＶＫ１０２をＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）で、連結しｔ二。

該連結された断片は、パッケージングキット（Ａ　ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｉｅ、）を用いたインビトロパッケージングに使用した。得られた７ア一ジ粒子を、大腸菌ＥＤ８７６７株（Ｍｕｒｒａｙ、　Ｎ　、　ＥらＭｏＱ、　Ｇｅｎ。

ＧｅｎｅＬ、上５０．５３．１９７７）に感染させ、その細胞懸濁液を、５０　ｍｇ／　Ｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天平板に塗抹した。

（１）−ｄ）　大腸菌５１７−１株中での、遺伝子ライブラリーの構築５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天平板上の、Ｋｍ’Ｔｃ’マーカー（カナマイシン耐性及びテトラサイクリン感受性）を有する１、０００コロニーをかきとり、組換えプラスミド混合物を調製した。該プラスミドＤＮＡを大腸菌５１７−１株（Ｓｍ’、Ｔｒａつ　（サイモノら（Ｓｉｍ。

ｎ、Ｒ，ら、Ｂ　ｉｏ／　Ｔｅｃｈｈｏｌｏｇｙ　上、７８４−７９Ｌ　１９８２）により構築されたの形質転換に使用した。

１．４００の形質転換株を、１００μｇ／＋＋＋Ｑのストレプトマイシン、５０ｐｇ／ｍｆｆのカナマイシン含有ＬＢ培地を含むマイクロタイタープレートに移植し、−晩靜置培養後、グリセロールを１５％濃度になるよう添加し、大腸菌５１７−１株中でのグルフッバクター　オキシダンス　ＩＦ０１２２５８株の遺伝子ライブラリーとして一８０℃で、凍結保存した。このライブラリーの平均挿入断片長は、２５ｋｂから３０ｋｂであった。

（２）大腸菌５１７−１株中のコスミド遺伝子ライブラリーのグルコノバクタ− オキシダンス　０Ｘ−４株への接合伝達大腸菌５１７−１中のグルコノバクタ− オキシダンス　ＩＦＯ１２２５８のコスミド遺伝子ライブラリーを、Ｌ−ツルポリン蓄積変異株であるグルコノバクタ−オキシダンス０Ｘ−４（ヨーロッパ特許出願公開第２１３，５９１号に記載されているような突然変異処理により、グルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ３２９３より得た）に、両株間の二親間接合伝達によって導入した。

マンニトールブロスに生育した受容菌グルコノバクタ−オキシダンス０Ｘ−４株の対数増殖期の培養液２００μＱを、個々の挿入ＤＮＡ断片保持ｐＶＫ１０２を有スル大腸菌Ｓ　ｌ　７−１ａｌ　ＯＯｐＱト混合し、その混液を５０ｇ／Ｌフラクトース、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌポリペプトンから成るＦＢ培地の寒天平板表面に置いたニトロセルロースフィルター上にスポットし、３０℃で一晩静置培養した。生じたコロニーを、ｌＯμｇ／ｍｆｆポリミキシンＢ１５０μｇ／ｍＱカナマイシン含有ＭＢ培地（ＭＰＫ）寒天平板上に、移植し、３０℃で４時間静置培養した。生じた接合体を、更にＭＰＫ寒天寒天上板上移植し、純化した。

（３）グルコノバクタ−オキシダンス　０Ｘ−４株注の遺伝子ライブラリ−のスクリーニングこのスクリーニングは、ミニ休止菌体反応により行なった。約１４００株の挿入ＤＮＡ断片を有するグルコノバクタ−オキシダンス０Ｘ−４／ｐＶＫ１０２を、別々に、３ｇ／Ｌ　ＮａＣ，Ｑ、ｌ　Ｏｇ／Ｌ　ＣａＣ○、及び３０ｇ／Ｌ　Ｌ −ソルボース又は、Ｌ−ソルボソンを含む５０μＱの反応溶液に懸濁し、３０℃ で１から５日間、静置培養した。２−ＫＧＡ産生の分析は、シリカゲルの薄層クロマトグラフィーで行なった。

その結果、陽性クローン、プラスミドｐ７Ａ６を得た。

組換えプラスミドｐ７Ａ６をＢ　ｉｒｎｂｏｉｍｊ５よびＤ’ｏｌｙのアルカリ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　７．１５１３−１５２３　（１９７９））で調製し、次に示す制限酵素で断片化した：　ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈａｅｍ、ＨｉｎｃＩＩ、ＮｒｕＩ、５ａＩ２Ｉ、　５ａｕ３Ａ、　ＸｈｏＩＩ　（ベーリンガー、マンハイム社製）　、ＢａｍＨＩ、　Ｂａ１２１１、ＤａｒＩ、ＨｉｎｄＩ［Ｉ、ＳｍａＩ（宝酒造社製）。この中で、ＥｃｏＲＩ　ｓ　Ｈ１ｎｃｌ［、Ｎｒｕｌ及び５ａＱＩを用いた時、ｐ７Ａ６の挿入断片（２５ｋｂ）は、８から１１本の断片に分解された。

Ｈａｅｍ、５ａｕ３Ａ及びＸ、ｈｏｌｌによる消化では、多数の断片を生じた。

サブクローニングの第一段階の制限酵素として、５ａ１２Ｉを選択した。

５ａｉｌで部分消化したプラスミドｐ７Ａ６を、５ａ１２Ｉで消化後、脱リン酸化処理したベクターｐＶＫ１０２と結合した。そのＤＮＡ混合物を、形質転換法により、大腸菌５１７−１株に導入し、次に実施例４−（２）に述べている通り、二親間接合伝達によりグルコノバクタ−オキシダンス　０Ｘ−４株に移した。

得られた２００株の接合伝達体の中からミニ休止菌体反応により最小のサブクローンｐ７Ａ６△２が、これは９．２ｋｂの挿入断片を保持していた。（図２−（ａ））。第二段階のサブクローニングでは、ｐ７Ａ６△２のＥ、−Ｅ２断片を欠失させた。かくして得られたｐ７Ａ６△３（図２−（ｂ））のＥ％−５ｍ３断片を欠失させて、更に短縮した。得られたサブクローンｐ７Ａ６△４　（図２−（ｃ））は、ｐＶＫ１０２の小欠失部分５ｍ２−５ｍ３を有する３　、　１　ｋｂ挿入物をベクターＤＮＡ中に含んでいる。この様にして得られた３　、　１　ｋｂのＳ、−３，−Ｅ％（ＳＳＥ）断片の詳細な制限酵素地図を第３図に示す。

（５）　リコンビナント　Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の生産とその性質プラスミドｐ７Ａ６を実施例４−（２）に記載されているように二親間接合伝達により、大腸菌Ｓ　１７−１／ｐ７Ａ６株からグルコノバクタ−オキシダンスＮ４４−１株（該株は、グルコノバクタ−オキシダンス０Ｘ−４について述べたと同様にして得られる）へ導入した。得られた、接合伝達体グルコノバクタ−オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６株を５０　ｍｇ／　Ｌのカナマイシンを含む、１００ｇ／Ｌ−ソルボース、１５ｇ／Ｌ酵母エキス、２．５ｇ／Ｌ　Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０，０、５ｇ／　Ｌ　グリセロール及び２０ｇ／Ｌ　ＣａＣ０，から成るＮ０１５培地５００＋ｎｆｆ中にて、３０℃で２日間培養した。得られた菌体を、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７゜０中にて７レンチプレスホモジナイザーを用いて破砕し、ＭｇＣ（ｋ存在下デオキシリボヌクレアーゼ処理した後、６　、０００　ｒ、ｐ、ｍ、で１５分間遠心分離処理した。この遠心上清を、４５．０００ｒ−ｐ、ｍ、（８０，０００ｇ）における７時間の延伸分離処理により、粗膜画分を得た。Ｌ−ソルボソン脱水素酵素を、２％のトライトンＸ−１００により膜画分から可溶化し、クロマト−フォーカシング（すなわち等電的クロマトグラフィ：蛋白質の等電点の差異に基づく、蛋白質のクロマト的分離方法）及びハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにより部分精製した。次に活性染色法によりポリアクリドアミドゲル中に検出された活性蛋白を、ゲルから溶出し、これを５ＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量４７，５００の明瞭な単一バンドを示した。従って、Ｎ４４−１／ｐ７Ａ６由米のし一ソルボソン脱水素酵素のサブユニットの分子量は、４７．５００と測定され、この分子量は、実施例３−（１）記載のグルコノバクタ−オキシダンス　ＩＦ０１２２５８株から単離されたＬ−ソルボソン脱水素酵素の分子量と同じであった。５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶出した後、アセトン沈澱を行なって得た３００ｒｇの酵素蛋白をアミノ酸部分配列の決定に使用した。Ｎ−末端の１５個のアミノ酸配列が次のとおり決定された：Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −Ｖａｌ　−Ａ　Ｉａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａ　Ｉａ−Ｖａ　h　− 更に、該酵素蛋白質の蛋白消化物をＨＰＬＣ上のクロマトグラフィにかけた。

数個のピークを別々に集め、該蛋白質の内部アミノ酸配列の決定に使用した。

こうして、６個のアミノ酸部分配列が次のように決定された：Ａｒｇ−Ａｓｐ− 丁ｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ− Ａｒｇ。

Ｌｙｓ−Ａ　Ｉａ−Ｖａ　Ｉ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｙ −Ｔｙｒ−Ａｓｎ　。

Ａｒｇ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａ　ｌ　ａ−Ｔｈｒ　−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｌｙｓ　。

Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ　−Ａ　１ａ−Ｔｒｐ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ　］　］ｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−ＶａｌＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ。

Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｔｙｒ−Ａ　ｒｇ−Ｖａ　Ｉ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｙｒ− Ｖａ　Ｉ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ −Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、　ａｎｄＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ −Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−ｔ、ｙｓ。

これらの配列のし一ソルボソン脱水素酵素上の配置は、第４図中に下線部分として示しである。

組換え体である、グルコノバクタ−オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６株から精製した酵素蛋白は、免疫学的にも、グルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ１２２５８株の当該酵素と同等であることが示された。

第３図に示すＳＳＥ断片（３，１ｋｂ）から得られた種々の断片を、ベクターＭ１３ｍｐ８及びＭｌ　３ｍｐ　ｌ　９（Ｍｅ　ｓ　ｓ　ｉ　ｎ　ｇ、　Ｊ　、とＶｉｅｒａ、Ｊ、Ｇｅｎｅ、１９，２６９−２７６．１９８２）へ、更にサブクローン化し、市販のシーフェンシングキット（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ）を用いて、その両塩基鎖にツいて配列決定を行なった。エキソヌクレアーゼ■酵素を用いた、段階的欠失法（宝酒造社製のキロシーフェンシングキット）も導入した。

クーデアザ−ｄＧＴＰ（２′−デオキシグアノシン−５′−三リン酸ＸＢ。

ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）をｄＧＴＰの替わりに用いた。この酵素蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列が、次に示される様にＳ　Ｓ　Ｅ断片のＤＮＡ配列上で確認された：５’　ＡＴＧ　ＡＣＣＣＧＴ　ＴＣＣＣＡＧ　ＡＴＣＡＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＴＣＧＣＧ　ＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＴＣ３’ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ１３４７塩基対より成４オープン・リーディング・フレームが見出され、その構造遺伝子のＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を第４図！＝示した。

実施例５精製されたグルフッバクター・オキシダンスＩＦＯ１２２５８のｉＭ合型し一ソルボソン脱水素酵素によるＬ−ソルボソンから２−ＫＧＡの生産］００−の精製された膜結合型Ｌ−ツルポリン脱水素酵素（全活性、１３０ユニツト）、５０−の０．５Ｍ燐酸カリ緩衝液（ｐＨ７，０）、５０ｍｆｆのｌＯ％Ｌ−ソルボソン溶液、１０ｍ＋２の０．２Ｍフエナジンメソサルフエイト溶液、および２９０＋ｎ４の水からなる反応混液を、ゆるやかに撹拌しながら３０°Ｃで振盪した。その結果、２−ＫＧＡは６５０ｍｇ／時間の速度で生成した。

実施例６休止菌体反応系での、組換え体によるし一ソルボソンからの２−ケトーＬ−グロン酸生産グルコノバクタ−オキシダンスＩＦ０３２９２株、グルコノバクタ−オキシダンスＩＦ０３２９４株、グルコノバクタ−オキシダンスＩＦ０３２９３株、グルフッバクターオキシダンスＵ−１３株（ＦＥＲＭ−ＢＰＮｏ、１２６９）及び実施例４−（２）記載の方法で調製された、ｐ７八６△４を保持する上記株を、ＭＢ寒天平板から５ｍ１２のＮｏ、５培地へ接種し、３０℃で４８時間培養した。得られた各培養液の１ｍ１２を同じ培地５０ｍ（２に移植し、３０℃で４８時間回転振盪（１８０ｒ、ｐ、ｍ、）培養を行なった。この培養液の残存炭酸カルシウムを、５００ｒ、ｐ、ｍ、　５分間の遠心分離により除去した。菌体を集め、２５＋ｎΩの殺菌３ｇ／Ｌ食塩水で２回洗浄し、６ｍｆｌの３ｇ／Ｌ食塩水に懸濁した。

３ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ２．３６ｇ／Ｌ　Ｌ−ソルボソン、１０ｇ／Ｌ　ＣａＣｏ、及び２ｍ（２の上記細胞懸濁液を含む反応溶液を、試験管中で３０℃４日間、振盪培養した。１日及び４日の培養で蓄積された２−ＫＧＡ。

量を、Ｍ２Ｏ表に示す。

実施例７休止菌体反応系での組換体によるし一ソルボースがらの２−ケ）　−Ｌ　−クロン酸生産グルコノバクタ−オキシダンスＵ−１３株（ＦＥＲＭ−ＢＰ　Ｎｏ。

１２６９）及びｐ７Ａ６△４を保持するグルコノバクタ−オキシダンスＵ−１３株を、基質が、４０ｇ／ＬＬ−ソルボースである点を除き、実施例６に記載したと同様に休止菌体反応に供した。４日反応後の２−ＫＧＡの収量を第１１図に示した。

実施例８増殖系での組換体によるし一ソルボースからの２−ケトーＬ−グロン酸生産ｐＶＫ１０２またはｐ７Ａ６△４を保持するグルコノバクタ−オキシダンスＮ４４−１株の接合伝達体を、実施例４−（２）記載と同様な方法で調製した。各々の接合伝達体の菌体をカナマイシン含有ＭＢ寒天平板からカナマイシンを含むＮｏ、５培地またはカナマイシンを含まないＮｏ、５培地各５ｍＱを含む試験管中で、３０℃にて４８時間振盪培養した。得られた各培養液のＯ，１ｍｆｆを、カナマイシン含有または非含有の新鮮なＮ０１５培地５ｍ１２に移植し、３０′Ｃで１２０時間振盪培養した。

対照として、グルコノバクタ−オキシダンスＮ４４−１株を、カナマイシンを用いずｊこ培養した点を除いて同様に培養した。

生成した２−ＫＧＡの収量を、第１２表に示す。

実施例９２−ケト　Ｌ−グロン酸醗酵中の組換えプラスミドの安定性ｐｖＫ１０２を保持するグルコノバクタ−オキシダンスＮ４４−１株、またはｐ７Ａ６△４を保持するグルコノバクタ−オキシダンスＮ４４−１株の接合伝達体の菌体を、カナマイシン含有ＭＢ寒天平板から、カナマイシン非含有Ｎｏ、５培地５ａ＋Ｑを含む試験管に接種し、３０°０で４８時間振盪培養した（−次培養）。各々の培養液のＱ　、　ｌ　ｒＩＩＱ分別量を、カナマイシン非含有の新鮮なＮＯ６５培地５＋Ｊを含む試験管に移植し、３０°Ｃで４８時間振盪培養した（二次培Ｉり。更に、三次培養を、発酵時間が１２０時間である点を除き二次培養と同様の方法で行なった。醗酵後の６サンプルを、適当に希釈し、ＭＢ寒天平板に展開し、３０℃ で５日間培養した。生じたコロニーを釣り上げ（１サンプルあたり５０コロニー）、カナマイシン含有及び非含有ＭＢ寒天平板に、移植し、３０°Ｃで３時間培養した。

プラスミドの安定性は、次の様に計算した：この結果を第１３表に示す。

笈上衣Ｇ、オキシダンス株にょるＬ−ソルボソンからの２−ＫＧＡの生産菌株　２−ＫＧＡ（ｇ／Ｌ）グルフッバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９２７，６ＩＦＯ３２９４６，８ＩＦＯ１２２５７２８，５１ＦＯ１２２５８３０，８ＡＴＣＣ９９３７２，３１Ｆ０．３２９３（ＦＥＲＭ−ＰＮｏ、８３５６）　’　２．７Ｌ〜ソルボソンの開始濃度は３０ｇ／（ｌであった。

笈λ衣グルコノバクタ−・オキシダンスＩＦＯ１２２５８がらのＬ−ソルボソン脱水素酵素の精製総蛋白　全活性　比活性　収量分画　（＋ｎｇ）　（単位）　（単位／（％）溶解分画　２７７２　− ＤＥＡＥ−トーヨーハ−４６５０８４４０２２−８（ＬＯ５１００ＤＥＡＥ−セフ　７　ｏ　−スＣＬ−６Ｂ　２４７．５　１５．４　０．０６　６７．５ＣＭ −セフ　７　ロー　スＣＬ−６Ｂ　４．５　’　１０．０　２．２２　４３．９水酸化リン灰石ＨＣＡ　１００Ｓ　２．４　６．１　２．５４　２．６８グルコノバクタ−・オキシダンスＩＦＯ１２２５８由来の膜結合し一ツメチルグリオキザル　２００．０グリオキザル　Ｉ　Ｏ８，０グルタルアルデヒド　１０２．７グリオキザル酸　６３．２グリセリン・アルデヒド　５５．３ゲルコールアルデヒド　５５．３プロピオンアルデヒド　２９．０グルコノバクタ−・オキシダンスＩＦＯ１２２５８由来の膜結合Ｌ−ソ２０　６１．２３０　１０ｃＩＯ４０１００，０基質としてはメチルグリオキザルを使用した。

寒ｉ表グルフッバクターオキシダンスＩＦＯ１２２５８由来の膜結合し一ソルボソン脱水素酵素の至適ｐＨｐＨ緩衝剤（０，１Ｍ）　相対活性（％）６．０　燐酸カリウム　４６．１６．５　／／　６０．４７．０　／／　１００．０８．０トリス−ＨＣＱ　８２．６Ｌ−ソルボソンを基質として使用した。

四夏斐グルコノバクタ−・オキシダンスＩＦＯ１２２５８由来の膜結合し一ソルボソン脱水素酵素に対する金属イオンの効果金属イオン　濃度（ｍ　Ｍ　）　相対活性（％）なし　０　１００．０Ｃｕ”÷　１０　０Ｍｎ”＋　１０　６９．５Ｌ−ソルボソンを基質として使用した。

策り表グルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ１２２５８由来の膜結合し一ツルし一ソルボソンを基質として使用した。

第８表グルコノバクタ−・オキシダンスＩＦＯ１２２５ｇ由来の膜結合Ｌ−ソ４．５　ｔｔ　８９５．０　／／　８９６．０　リン酸カリウム　９２８．０トリス−ＭＣＩ２　１１０精製酵素は指定ペーハーを４８時間４°Ｃで維持し、残留酵素活性はｐＨ７，０で測定した。Ｌ−ソルボソンを基質として使用した。

第９表グルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ１２２５８由来の膜結合し一ソルボソン脱水素酵素の温度安定性温度（°Ｃ）　相対活性（％）２０８８．０３０８６．２４０　２９．４精製酵素は示しＩ；温度で１０分間処理し、残留酵素活性は、ｐＨ７，０で測定した。Ｌ−ソルボソンを基質として使用した。

第１Ｏ表休止系下の組換え微生物によるし一ソルボソンからの２−ＫＧＡの生産２−ＫＧＡ　＊　（ｇ／Ｌ）菌株　プラスミド　１日　４日オキシダンス　ＩＦＯ３２９２なし　−６，９Ｐ７Ａ６△４　−　３２．１１ＦＯ３２９４なし　−６，２Ｐ７Ａ６Δ４　−　３３．９ＩＦＯ３２９３なし　−２，０Ｐ７Ａ６Δ４　−　３４．２Ｕ−１３なし　５．７　８．９Ｐ７Ａ６Δ４　３３．３　３３．７Ｌ−ソルボソンの開始濃度は３６　ｇ／Ｌであった。

＊培養中の蒸発域は補正しｔ；。

第１１表休止系下での組換え微生物によるし一ソルボースからの２−ＫＧＡの生産菌株　プラスミド　２−　Ｋ　Ｇ　Ａ　＊（ｇ／Ｌ）Ｌ−ソルボースの初期濃度は４０ｇ／Ｌであった。

＊培養の間を通しての蒸発損失は補正した。

第１２表生育系における組換え微生物によるＬ−ソルボースからの２−ＫＧＡの生産プラスミド　Ｋ　ｍ　＊　２　Ｋ　Ｇ　Ａ　（ｇ　／　Ｌ　）宿主ニゲルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１第１３表２−ＫＧＡ醗酵の間におけるベクターおよび組換えプラスミドの安定性＊（％）プラスミド　Ｋｍ　４８時間　４８時間　１２０時間ｐＶＫ１０２　−　９６　９４　８２ｐ７Ａ６Δ４　−　９４　１００　８８ｌｔ″ｊ＋′＋ｌｌ＆６＠ｉ＋１１１Ｈｈａ、、、〒／ｌ’）ＲＯ７ｎｎ＾ｓ６国際調査報告　５，８．。。。１゜

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｌ−ソルボソンに作用して２−ケト−グロン酸を生成し、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物に由来する均質な形態の補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素。
２．以下の理化学的性質、ａ）至適ｐＨ：約７．０、ｂ）至適温度：約３０℃から約４０℃ ｃ）分子構造：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定された分子量が約４７，５００±５，０００の１種類のユニットからなる、ｄ）熱安定性：３０℃以下で安定、及び、ｅ）阻害剤：Ｃｕ２＋イオンにより阻害されるを有する請求の範囲第１項に記載のＬ−ソルボソン脱水素酵素。
３．膜結合型酵素である請求の範囲第１項又は第２項に記載の補酵素非依存型Ｌ −ソルボソン脱水素酵素。
４．グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）ＩＦＯＩ２２５７、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯＩ２２５８又はその突然変異株の膜結合型酵素である請求の範囲第２項又は第３項に記載の補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素。
５．細胞内において新規なＬ−ソルボソン脱水素酵素を産生し得るグルコノバクター層に属する微生物又はその突然変異株を培養し、細胞を破壊し、破壊された菌体の無細胞抽出液、好ましくは微生物の膜画分から単離、精製することを特徴とする新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の製造方法。
６．前記微生物が、グルコノバクター・オキシダンスＩＦ０Ｉ２２５７、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯＩ２２５８又はその突然変異株である請求の範囲第５項に記載の方法。
７．Ｌ−ソルボソンと補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素を含んだグルコノバクター層に属する微生物由来の新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素とを接触させることによりＬ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することからなる２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。
８．前記微生物がグルコノバクター・オキシダンスＩＦＯＩ２２５７、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯＩ２２５８又はその突然変異株である請求の範囲第７項に記載の方法。
９．Ｌ−ソルボソンと該新規補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素を含んだグルコノバクター属に属する微生物とを接触させることによりＬ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することからなる２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。
１０．前記微生物がグルコノバクター・オキシダンスＩＦＯＩ２２５７、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯＩ２２５８又はその突然変異株である請求の範囲第９項に記載の方法。
１１．Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することのできる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ。
１２．下記アミノ酸部分配列、【配列があります】、（Ｎ末端）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、及び【配列があります】、を有する新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の遺伝子をコードする請求の範囲第１１項に記載のＤＮＡ。
１３．Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することのできる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素をコードする遺伝子を含む３．１ｋｂのＤＮＡ断片。
１４．該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下記のアミノ酸部分配列、【配列があります】、（Ｎ末端）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、及び【配列があります】、を有する請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ断片。
１５．下記の制限酵素地図 ▲数式、化学式、表等があります▼ ＡＴＧ：開始コドンＴＧＡ：停止コドンにより特徴付けられる請求の範囲第１３項に記載のＤＮＡ断片。
１６．Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することのできる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子。
１７．該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下記のアミノ酸部分配列、【配列があります】、（Ｎ末端）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、及び【配列があります】、を有する請求の範囲第１６項に記載の組換えＤＮＡ分子。
１８．バクテリア・ベクターの配列を含む請求の範囲第１６項に記載の組換えＤＮＡ分子。
１９．バクテリア・ベクターがコスミド・ベクターである請求の範囲第１８項に記載の組換えＤＮＡ分子。
２０．該コスミド・ベクターがプラスミドｐＶＫ１００、ｐＶＫ１０２又はその誘導体である請求の範囲第１９項に記載の組換えＤＮＡ分子。
２１．ｐ７Ａ６、ｐ７Ａ６Δ２、ｐ７Ａ６Δ３又はｐ７Ａ６Δ４である請求の範囲第１６項に記載の組換えＤＮＡ分子。
２２．プラスミドｐＶＫ１００、ｐＶＫ１０２又はその誘導体から誘導されるＤＮＡ断片を含むことを特徴とするグルコノバクター属に属する微生物内で安定である組換えＤＮＡ断片。
２３．Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することができる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子が導入された組換え微生物。
２４．該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下記のアミノ酸部分配列、【配列があります】、（Ｎ末端）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、及び【配列があります】、を有する請求の範囲第２３項に記載の組換え微生物。
２５．グルコノバクター属に属する請求の範囲第２３項又は第２４項に記載の組換え微生物。
２６．グルコノバクター・オキシダンスＯＸ−４／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４ −１／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＵ−１３／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９２／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９３／ｐ７Ａ６Δ４又はグルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９４／ｐ７Ａ６Δ４である請求の範囲第２５項に記載の組換え微生物。
２７．グルコノバクター属に属する菌株の接合伝達体である請求の範囲第２３項ないし第２６項の何れかに記載の組換え微生物。
２８．グルコノバクター属に属する微生物を受容体として使用し、該受容体をＭｏｂサイトを含むプラスミドを有する供与体と接触させ、Ｔｒａ遺伝子機能の助けにより該プラスミドを該供与体から該受容体に転移させることを特徴とする接合伝達体の製造方法。
２９．該プラスミドが、ｐＶＫ１００、ｐＶＫ１０２又はその誘導体である請求の範囲第２８項に記載の方法。
３０．Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することのできるＬ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子を導入した微生物を培養し、細胞を破壊し、破壊された細胞の無細胞抽出液、好ましくは微生物の膜画分から単離、精製することを特徴とする新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチドの製造方法。
３１．該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下記のアミノ酸部分配列、【配列があります】、（Ｎ末端）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、及び【配列があります】、を有する請求の範囲第３０項に記載の方法。
３２．該微生物がグルコノバクター属に属する請求の範囲第３０項に記載の方法。
３３．該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスＯＸ−４／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＵ−１３／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９２／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９３／ｐ７Ａ６Δ４又はグルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９４／ｐ７Ａ６Δ４である請求の範囲第３０項ないし第３２項の何れかに記載の方法。
３４．Ｌ−ソルボソンを、新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有してなる組換えＤＮＡ分子が導入された微生物由来の該ポリペプチドと接触させることによりＬ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。
３５．該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下記のアミノ酸部分配列、【配列があります】、（Ｎ末端）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、及び【配列があります】、を有する請求の範囲第３４項に記載の方法。
３６．該微生物が、グルコノバクター属に属する請求の範囲第３４項に記載の方法。
３７．該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスＯＸ−４／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＵ−１３／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９２／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９３／ｐ７Ａ６Δ４又はグルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９４／ｐ７Ａ６Δ４である請求の範囲第３４項ないし第３６項の何れかに記載の方法。
３８．Ｌ−ソルボソンを、２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することができる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子が導入された微生物を用いて、Ｌ− ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することを特徴とする２−ケト−Ｌ −グロン酸の製造方法。
３９．該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下記のアミノ酸部分配列、【配列があります】、（Ｎ末端）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、及び【配列があります】、を有する請求の範囲第３８項に記載の方法。
４０．該微生物が、グルコノバクター属に属する請求の範囲第３８項に記載の方法。
４１．該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスＯＸ−４／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＵ−１３／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９２／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９３／ｐ７Ａ６Δ４又はグルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９４／ｐ７Ａ６Δ４である請求の範囲第３８項ないし第４０項の何れかに記載の方法。
４２．Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することができる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子が導入された微生物を用いてＬ−ソルボースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。
４３．該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下記のアミノ酸部分配列、【配列があります】、（Ｎ末端）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、及び【配列があります】、を有する請求の範囲第４２項に記載の方法。
４４．該微生物が、グルコノバクター属に属する請求の範囲第４２項に記載の方法。
４５．該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスＯＸ−４／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＵ−１３／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９２／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９３／ｐ７Ａ６Δ４又はグルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９４／ｐ７Ａ６Δ４である請求の範囲第４２項ないし第４４項の何れかに記載の方法。
４６．Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することができる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子が導入された微生物を用いてＤ−ソルビトールを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することを特徴とする２−ケト−Ｌ− グロン酸の製造方法。
４７．該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下記のアミノ酸部分配列、【配列があります】、（Ｎ末端）【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、及び【配列があります】、を有する請求の範囲第４６項に記載の方法。
４８．該微生物が、グルコノバクター属に属する請求の範囲第４６項に記載の方法。
４９．該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスＯＸ−４／ｐ７Ａ６、グルコノバククー・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６、グルコノバクター・オキシダンスＮ４４−１／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＵ−１３／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９２／ｐ７Ａ６Δ４、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９３／ｐ７Ａ６Δ４又はグルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３２９４／ｐ７Ａ６Δ４である請求の範囲第４６項から第４８項までの何れかに記載の方法。
５０．前記の部分的アミノ酸配列の機能的同等物が使用されている請求の範囲第１１項、第１４項、第１７項、第３１項、第３５項、第３８項、第４３項及び第４７項に記載のＤＮＡ、ＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子、組換え微生物及び製造方法。