ES2284726T3 - Sintesis de derivados polimericos no peptidicos de alto peso molecular. - Google Patents
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Abstract
Un derivado polimérico activado, comprendiendo dicho derivado polimérico un (o más de uno) primer segmento polimérico no peptídico, soluble en agua, que tiene, al menos, aproximadamente 200 unidades repetidas unidas covalentemente a través de, al menos, un resto de unión a, al menos, un segundo segmento polimérico no peptídico, soluble en agua, que no tiene más de aproximadamente 120 unidades repetidas, en el que dichas unidades de dichos primer y segundo segmentos poliméricos pueden ser iguales o diferentes, en el que el mencionado (al menos uno) resto de unión no altera sustancialmente las propiedades de dicho derivado polimérico, teniendo dicho derivado polimérico, al menos, un resto activo seleccionado entre el grupo constituido por restos electrófilos y restos nucleófilos, localizados en uno de los mencionados primer y segundo segmentos poliméricos, y en el que el primer y segundo segmentos poliméricos se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por poli(alquilenglicol), poli(alcolhol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(alfa-hidroxiácido), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), y copolímeros, terpolímeros, y mezclas de los mismos.
Description
Síntesis de derivados poliméricos no peptídicos
de alto peso molecular.
La invención se refiere a derivados de
poli(etilenglicol) y se refiere a polímeros y procedimientos
para su síntesis. Más particularmente, la invención se refiere a
derivados de alto peso molecular y a procedimientos para la
generación de derivados de alto peso molecular.
La unión covalente del polímero hidrófilo
poli(etilenglicol), abreviado PEG, conocido también como
poli(óxido de etileno), abreviado PEO, a moléculas y superficies es
de considerable utilidad en biotecnología y medicina. En su forma
más común, el PEG es un polímero lineal terminado con grupos
hidroxilo en cada extremo:
HO-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH
El polímero anterior, \alpha,
\omega-dihidroxipoli(etilenglicol), se
puede representar de forma abreviada como
HO-PEG-OH en la que se entiende que
el símbolo -PEG- representa la siguiente unidad estructural:
CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-
en la que n oscila típicamente
entre aproximadamente 3 y aproximadamente
4000.
El PEG se utiliza comúnmente como
metoxi-PEG-OH, o abreviado mPEG, en
el que un extremo consiste en el grupo relativamente inerte,
metoxi, mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo, que esta
sujeto a modificación química rápida. La estructura del mPEG se
muestra a continuación.
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH
Los copolímeros de óxido de etileno y óxido de
propileno están estrechamente relacionados con PEG en su química, y
se pueden sustituir por PEG en muchas de sus aplicaciones.
HO-CH_{2}CHRO-(CH_{2}CHRO)_{n}-CH_{2}CH_{2}-OH
en la que R = H o alquilo, tal como
CH_{3}.
El PEG se utiliza también comúnmente en formas
multibrazo en las que los PEG lineales están unidos a un núcleo
central:
R(-O-PEG-OH)_{n}
en la que R es un núcleo derivado
de, por ejemplo, pentaeritritol u oligómeros de glicerol. Los PEG se
pueden preparan también con enlaces degradables en la estructura
principal.
El PEG es un polímero que tiene las propiedades
de: solubilidad en agua y en muchos disolventes orgánicos, falta
de toxicidad y falta de inmunogenicidad. Una utilización del PEG es
para unir covalentemente el polímero a moléculas insolubles para
hacer soluble al "conjugado" PEG-molécula
resultante. Por ejemplo, se ha mostrado que la droga insoluble en
agua paclitaxel, cuando se acopla a PEG se convierte en soluble en
agua. Greenwald, et al., J. Org.Chem., 60:
331-336 (1995).
Para acoplar PEG a una molécula, tal como una
proteína, es a menudo necesario "activar" el PEG para prepara
un derivado de PEG que tenga un grupo funcional en el extremo. El
grupo funcional puede reaccionar con ciertos restos de la proteína,
tal como un grupo amino, formando así un conjugado
PEG-proteína. Se han descrito muchos derivados
activados de PEG. Un ejemplo de uno de estos derivados activados es
el "éster activo" succinimidil succinato:
CH_{3}O-PEG-O_{2}C-CH_{2}CH_{2}-CO_{2}-NS
en el que NS
=
A partir de ahora, el resto éster succinimidilo
activo se representará como -CO_{2}-NS. Estos PEG
activados se pueden preparar también a partir de las formas
multibrazo descritas anteriormente o a partir de formas tales
como:
(PEG-O-CO-NH)_{2}LYS-NS
como se describe en Harris, et
al., documento US 5.932.462, de que se incorpora aquí en su
totalidad como
referencia.
Los grupos funcionales se pueden unir al extremo
del PEG por conversión directa del hidroxilo inicial a otras formas
o por unión de grupos espaciadores orgánicos al grupo hidroxilo. Por
ejemplo, el PEG succinato anterior se prepara por unión del
anhídrido succínico a PEG. Similarmente, se puede hacer reaccionar
ácido glutárico para preparar glutarato de PEG,
PEG-O_{2}C-CH_{2}CH_{2}CH_{2}-CO_{2}H.
Se pueden añadir incluso espaciadores alifáticos más largos. Como
se describe en Okamoto, et al., Eur. Polym. J., 19,
341-346 (1983), el PEG se puede convertir a un PEG
amina por reacción del PEG-OH con
ONC-(CH_{2})_{6}-NCO y convirtiendo
posteriormente el isocianato restante al producto amina
PEG-O_{2}CNH-(CH_{2})_{6}-NH_{2}.
Como las aplicaciones de la química de PEG se
han hecho más sofisticadas, ha habido una necesidad creciente de
derivados de PEG de alto peso molecular y de alta pureza. La
síntesis de estos compuestos es complicada debido a la dificultad
para eliminar las impurezas poliméricas que se acumulan durante las
preparaciones en múltiples etapas. Las impurezas de moléculas
pequeñas normalmente se eliminada fácilmente por procedimientos
sencillos tales como precipitación. Sin embargo, los subproductos
poliméricos de alto peso molecular son generalmente bastante
difíciles de eliminar y requieren la utilización de técnicas
cromatográficas que consumen tiempo y son caras. Permanece la
necesidad en la técnica de procedimientos mejorados para la
preparación de derivados de PEG de alto peso molecular.
La invención se refiere a derivados de polímeros
activados, como se define en las reivindicaciones acompañantes, y a
procedimientos para su fabricación. Incluye formas de realización
que implican un derivado de oligo(etilenglicol) ("OEG")
pequeño y difuncional o un oligómero similar o un polímero pequeño
que está unido covalentemente a un derivado polimérico
poli(etilenglicol) ("PEG") grande o a un polímero
similar. De esta forma, se pueden realizar la mayoría de las
transformaciones químicas sobre el compuesto oligomérico o
polimérico pequeño. Las impureza poliméricas grandes son más
difíciles de separar del producto deseado que las pequeñas, y los
productos de estas reacciones que implican a estos polímeros
incluyen típicamente reactivos que no reaccionan, componentes
difuncionales que pueden resultar en reticulación, componentes que
reaccionan parcialmente y otras impurezas poliméricas. Esta
invención evita estas impurezas mediante la reducción del número de
reacciones necesarias para generar el polímero grande.
Así, como se muestra continuación, se puede
fabricar un compuesto polimérico complicado en una etapa haciendo
reaccionar un oligómero complicado, por ejemplo,
Y'-OEG-Y, en la que Y e Y' son
restos activos, con un compuesto polimérico sencillo de alto peso
molecular, por ejemplo, mPEG-Z, en la que Z
reacciona con Y ó Y', para generar un nuevo grupo de enlace X entre
el PEG mayor y el PEG menor. De esta manera, las impurezas
polimérica no se acumulan. Y e Y' pueden se iguales o diferentes,
pero se deben elegir de forma que los dos restos sean compatibles y
no reaccionen uno con otro.
En una reacción típica para la producción de una
molécula grande monofuncional de alto peso molecular, se hace
reaccionar un monometoxi poli(etilenglicol) con un polímero
PEG menor, en el que el grupo funcional Z sobre el poliméro PEG
monofuncional mayor reacciona con el grupo funcional Y' sobre un
polímero heterobifuncional menor. El producto de alto peso
molecular retiene el grupo activo Y. Los reactivos se unen mediante
un grupo X formado por la reacción de los restos Z e Y'. Esta
reacción se puede ilustrar como sigue:
mPEG-Z +
Y'-OEG-Y \rightarrow
mPEG-X-OEG-Y
Por ejemplo, un mPEG-ácido propiónico de peso
molecular 32.000 que es un compuesto fabricado típicamente en
diversas etapas a partir de mPEG-OH, se puede
preparar en una única etapa mediante la reacción de un mPEG
carbonato 30.000 activado, que se ha preparado en una etapa a partir
de mPEG-OH, con el ácido
\alpha-amino-\omega-ácido
propiónico de peso molecular 2.000. La mayoría de las
transformaciones químicas se pueden realizar sobre la pequeña PEG
2000, menos cara y más fácil de purificar.
Las moléculas grandes, monofuncionales,
homobifuncionales y heterobifuncionales se puede preparar mediante
la práctica de la invención, aunque no en todos los casos
necesariamente con resultados equivalentes. Las reacciones que
tienden a introducir complicaciones en el componente polimérico
mayor de la molécula producto pueden reducir la eficiencia del
método si se incrementan las impurezas con las múltiples etapas de
reacción.
En una forma de realización algo más
generalizada que muestra un polímero de poli(etilenglicol)
con mayor especificidad, la estructura de los productos de la
invención se puede describir como sigue:
R-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-X-(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}-Y
\newpage
La estructura anterior se prepara mediante la
reacción de R-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-Z
con
Y'-(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}-Y,
en la que Z es un grupo reactivo con Y' y, ni Y ni R, son reactivos
con Z o con Y'.
R puede ser un resto bloqueado que incluye
varios restos alquilo, típicamente metoxi unido al PEG. R puede ser
también un grupo reactivo o un grupo reactivo protegido Y'', en el
que el grupo reactivo se puede desproteger y estar disponible para
la reacción en un tiempo deseado posterior. Y e Y'' pueden ser el
mismo si Y'' ha sido un grupo protegido o un grupo diferente que no
participa en las reacciones utilizadas para generar la molécula
producto. Los grupos funcionales incluyen, pero no se limitan a,
aldehido, maleimido, éster activo, tiosulfonato o amina. X en un
grupo de unión hidrófilo pequeño tal como amida o carbamato; n es de
aproximadamente 200 a 2000; y m es de aproximadamente 1 a 120. X es
deseablemente un resto pequeño e hidrófilo que no tendrá un impacto
adverso en las propiedades físicas y químicas del polímero de alto
peso molecular resultante.
Alternativamente, un segmento polimérico grande
que es bifuncional o que tiene una funcionalidad adicional se puede
unir a moléculas pequeñas en una o más funcionalidades. La
funcionalidad de la molécula producto grande se puede originar de
un segmento polimérico grande o de un segmento oligomérico menor o
de un segmento polimérico, como se desee. La cadena principal del
polímero puede tener, si se desea, grupos o grupos de unión sujetos
a hidrólisis o degradación enzimática incorporados en la cadena
principal, para el control de la degradabilidad de la molécula
producto.
Los anteriores segmentos del polímero se pueden
considerar ampliamente como (Poli)_{a} para el segmento
del polímero mayor y (Poli)_{b} para el segmento de
polímero menor, en los que los segmentos del polímero se
seleccionan independientemente entre el grupo constituido por
poli(alquilenglicol), en particular
poli(etilenglicol), poli(alcohol olefínico),
poli(vinilpirrolidona),
poil(hidroxialquilmetacrilamida),
poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos),
poli(\alpha-hidroxiácido),
poli(alcohol vinilico), polifosfaceno, polioxazolina,
poli(N-acriloilmorfolina) y copolímeros,
terpolímeros y mezclas de los mismos.
Así, un polímero de alto peso molecular se puede
preparar a partir de un polímero de un peso molecular menor, a
partir del cual es mucho menos problemático eliminar las impurezas,
y un polímero de peso molecular mayor que no se ha sometido a
series de reacción o etapas de purificación complejas para eliminar
las impurezas poliméricas.
La presente invención se describirá más
detalladamente a partir de ahora. Esta invención, sin embargo, se
puede realizar de muchas formas diferentes y no debe interpretarse
como limitada por las formas de realización establecidas aquí, por
el contrario, estas formas de realización se proporcionan para que
esta revelación sea extensa y completa y darán a entender
totalmente el ámbito de la invención a los expertos en la
técnica.
Los términos "grupo funcional", "resto
activo", "grupo de activación", "sitio reactivo",
"grupo final", "grupo químicamente reactivo" y "resto
químicamente reactivo" se utilizan en la técnica y aquí para
referirse a partes o unidades definidas, distintas de una molécula.
Estos términos son sinónimos, de alguna manera, en las técnicas
químicas y se utilizan aquí para indicar las regiones de las
moléculas que realizan alguna función o actividad y que son
reactivas con otras moléculas. El término "activo" cuando se
utiliza junto con grupos funcionales, se refiere a aquellos grupos
funcionales que reaccionan fácilmente con grupos electrófilos o
nucleófilos presentes en otras moléculas, en contraste con aquellos
grupos que requieren una fuerte catálisis o unas condiciones de
reacción muy poco prácticas para reaccionar (esto es, grupos
"inertes" o "no reactivos"). Por ejemplo, como se podría
entender en la técnica, el término "éster activo" incluiría
aquellos ésteres que reaccionan fácilmente con grupos nucleófilos
tales como aminas. Los ejemplos de ésteres activos incluyen ésteres
N-hidroxisuccinimidilo o
1-benzotriazolilo. Típicamente, un éster activo
reaccionará con una amina en medio acuoso en materia de minutos,
mientras que ciertos ésteres, tales como los ésteres de metilo o
etilo, requieren una fuerte catálisis para poder reaccionar con un
grupo nucleófilo.
El término "alquilo" se refiere a cadenas
de hidrocarburo que típicamente oscilan entre aproximadamente 1 y
aproximadamente 12 átomos de carbono de longitud, e incluye cadenas
lineales y ramificadas. Las cadenas de hidrocarburo pueden ser
saturadas o insaturadas. El término "alquilo sustituido" se
refiere a un grupo alquilo sustituido con uno o más sustituyentes
que no interfieren, tales como, pero no limitados a, cicloalquilo
C_{3}-C_{6}, por ejemplo, ciclopropilo,
ciclobutilo, y similares; acetileno; ciano; alcoxi, por ejemplo,
metoxi, etoxi, y similares; alcanoiloxi inferior, por ejemplo,
acetoxi; hidroxi; carboxilo; amino; alquiamino inferior, por
ejemplo, metilamino; cetona; halo, por ejemplo cloro o bromo;
fenilo; fenilo sustituido, y similares.
Como se utiliza aquí, "no peptídico" se
refiere a una cadena principal de polímero sustancialmente libre de
enlaces peptídicos. Sin embargo, la cadena principal de polímero
puede incluir un número menor de enlaces peptídicos espaciados a lo
largo de la longitud de la cadena principal, tal como, por ejemplo,
no más de aproximadamente 1 enlace peptídico por aproximadamente 50
unidades de monómero.
Un "polímero conjugado" se refiere a una
cadena principal de polímero soluble en agua unida covalentemente a
una molécula biológicamente activa, como la definida aquí. En el
caso de que un polímero conjugado se haga reaccionar con un segundo
polímero de manera que forme una cadena principal de polímero
extendida, independientemente de que la molécula de unión de los
polímeros tenga o no un enlace peptídico u otro enlace, el término
"polímero conjugado" se refiere a la longitud total de
polímero unido al agente biológicamente activo.
El término "enlace", "conector", o
"grupo de unión" se utiliza aquí para referirse a los grupos o
enlaces que se forman normalmente como resultado de una reacción
química y son típicamente enlaces covalentes. Enlaces
hidrolíticamente estables significa que los enlaces son
sustancialmente estables en agua y que no reaccionan con agua a pHs
útiles, por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas durante un
periodo de tiempo extenso, preferentemente indefinidamente. Enlaces
hidrolíticamente inestables o degradables significa que los enlaces
se degradan en agua o en soluciones acuosas, que incluyen por
ejemplo, sangre. Enlaces enzimáticamente inestables o degradables
significa que el enlace se puede degradar por una o más enzimas.
Cuando se utilizan aquí los términos "molécula
biológicamente activa", "resto biológicamente activo",
"agente biológicamente activo", o "fármaco" se refieren a
cualquier sustancia que puede afectar cualquier propiedad física o
química de un organismo biológico, que incluye pero no se limita a
virus, bacterias, hongos, plantas, animales y seres humanos. En
particular, moléculas biológicamente activas, como se utiliza aquí,
incluye cualquier sustancia destinada al diagnóstico, cura de
mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad en seres
humanos o en otros animales, o a aumentar, de alguna otra forma, el
bienestar físico o mental de seres humanos o animales. Los ejemplos
de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a,
péptidos, proteínas, enzimas, pequeñas moléculas utilizadas como
fármacos, colorantes, lípidos, nucleósidos, oligonucleótidos,
células, virus, liposomas, micropartículas y micelas. Los tipos de
agentes biológicamente activos que son adecuados para su utilización
con la invención incluyen, pero no se limitan a, antibióticos,
fungicidas, agentes anti-virales, agentes
anti-inflamatorios, agentes
anti-tumorales, agentes cardiovasculares, agentes
anti-ansiedad, hormonas, factores de crecimiento,
agentes esteroideos, y similares.
Los términos "polímero de bajo peso" y
"polímero de bajo peso molecular" se refieren, ampliamente, a
cadenas principales de polímero lineal, ramificado, multibrazo o en
horquilla que comprenden un polímero no peptídico, soluble en agua,
que tiene de 1 a aproximadamente 120 unidades repetidas. Estos
polímeros tienen típicamente de 1 a 2 grupos funcionales,
localizados típicamente en extremos opuestos de un polímero lineal,
a aproximadamente 300, que se pueden localizar en los extremos de
estructuras altamente ramificadas o multibrazo, aunque un número
menor se puede localizar a lo largo de la cadena principal del
polímero. Los polímeros adecuados se seleccionan entre
poli(alquilenglicoles), tales como poli(etilenglicol)
(PEG), poli(propilenglicol) (PPG), copolímeros de
etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(poliol
oxietilado), poli(alcolhol olefínico),
poli(vinilpirrolidona),
poli(hidroxipropilmetacrilamida),
poli(\alpha-hidroxiácido),
poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina,
poli(N-acriloilmorfolina), y copolímeros,
terpolímeros, derivados y mezclas de los mismos. Se debe entender
que las longitudes oligoméricas o incluso monoméricas se tienen que
incluir en lo anterior. Aunque el peso molecular del polímero
pequeño o del oligómero pueden variar, están típicamente en el
intervalo de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 10.000 Da,
dependiendo, por supuesto, del peso molecular de las unidades
repetidas individuales. En el caso de PEG, una unidad de monómero de
PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 44 Da y los
polímeros de bajo peso tendrán un peso molecular de aproximadamente
44 Da a aproximadamente 5280 Da. Los pesos moleculares de 2000,
3200, 3400 y 5000 están comúnmente disponibles comercialmente. Las
personas con la experiencia habitual en la técnica reconocerán que
la lista anterior de cadenas principales de polímero
sustancialmente solubles en agua y no peptídicas, no pretende ser
exhaustiva y es meramente ilustrativa, y se contemplan todos los
materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas
anteriormente.
Los términos "polímero de alto peso" y
"polímero de alto peso molecular" se refieren, ampliamente, a
una cadena principal de polímero lineal, ramificada o multibrazo
que comprende un polímero no peptídico, soluble en agua, que tiene
más de aproximadamente 200 unidades repetidas. Estos polímeros
tienen típicamente de 1 a 2 grupos funcionales, localizados
típicamente en extremos opuestos de un polímero lineal, a
aproximadamente 300, que se pueden localizar a lo largo de la
cadena principal del polímero o en los extremos de estructuras
altamente ramificadas o multibrazo. También se contemplan las
estructuras en horquilla en las que un extremo está ramificado para
proporcionar dos funcionalidades. Son adecuados los mismos polímeros
de los que se selecciona el polímero de bajo peso. Aunque el peso
molecular del polímero puede variar, es típicamente mayor de
aproximadamente 8.000 Da dependiendo, por supuesto, del peso
molecular de las unidades de monómero individuales. En el caso del
PEG, los polímeros de alto peso tienen un peso molecular por encima
de aproximadamente 8.800 Da. Los PEG disponibles comercialmente
incluyen los que tienen un peso molecular nominal de 10.000, 12.000,
15.000, 18.000 y 20.000, 30.000, 40.000 y mayores. Los PEG
ramificados están disponibles fácilmente a altos pesos moleculares.
Las personas con la experiencia habitual en la técnica reconocerán
que la lista mencionada anteriormente de cadenas de polímero,
sustancialmente no peptídico, soluble en agua, no pretende ser
exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que se contemplan todos
los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas
anteriormente.
Como se utiliza aquí "PEG" se refiere,
ampliamente, a una cadena principal de polímero lineal, multibrazo
o ramificada que comprenden un polímero no peptídico, soluble en
agua, que tiene unidades CH_{2}CH_{2}O repetidas. El polímero
\alpha,
\omega-dihidroxipoli(etilenglicol) se puede
representar de forma abreviada como
HO-PEG-HO en el que se entiende que
el símbolo -PEG- representa la siguiente unidad estructural
-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-,
en la que n oscila típicamente entre aproximadamente 3 y
aproximadamente 2000. La familia de polímeros PEG exhibe
generalmente las propiedades de solubilidad en agua y en muchos
disolventes orgánicos, falta de toxicidad y falta de
inmunogenicidad. El término PEG se debería entender como inclusivo e
incluir los poli(etilenglicoles) en cualquiera de sus formas
lineal, ramificada o multibrazo, que incluyen alcoxi PEG, PEG
bifuncional, PEG en horquilla, PEG ramificado, PEG colgante, o PEG
con enlaces degradables en el mismo.
\newpage
El PEG, en cualquiera de las formas descritas
aquí, es típicamente claro, sin coloración, sin olor, soluble en
agua, estable al calor, inerte frente a muchos agentes químicos, no
se hidroliza o deteriora (a menos que esté específicamente diseñado
para ello), y generalmente no es tóxico. El
poli(etilenglicol) se considera biocompatible, lo que
significa que el PEG es capaz de coexistir con tejidos vivos u
organismos sin causarles daño. Más específicamente, el PEG es
sustancialmente no inmunogénico, lo que significa que no tiende a
producir una respuesta inmune en el cuerpo. Cuando se una a una
molécula que tiene alguna función deseable en el cuerpo, tal como
un agente biológicamente activo, el PEG tiende a enmascarar al
agente y puede reducir o eliminar cualquier respuesta inmune de
forma que un organismo puede tolerar la presencia del agente. Los
conjugados de PEG tienden a no producir una respuesta inmune
sustancial o a causar coagulación u otros efectos no deseados.
Más adelante, se muestran copolímeros al azar o
de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, que pueden
utilizarse también como la cadena principal del polímero de los
polímeros de alto o de bajo peso de la invención, en los que -PEG-
se reemplaza por:
-CH_{2}CHRO(CH_{2}CHRO)_{c}CH_{2}CHR-
y en los que cada R es
independientemente H o CH_{3}, y c es como se describió
anteriormente para m y n, dependiendo de si la molécula es pequeña
o
grande.
El término "derivado polimérico" se utiliza
algunas veces para describir el producto polimérico de alto peso de
la invención que tiene un segmento de polímero de alto peso y un
segmento de polímero de bajo peso unidos por un enlace. El término
es meramente de conveniencia, y se utiliza para diferenciar el
producto polimérico de sus componentes poliméricos de alto y de
bajo peso cuando así se indique.
En una forma útil en la invención, el polímero
de alto peso molecular es un PEG lineal terminado en un extremo con
un grupo hidroxilo y en el otro extremo con un grupo funcional,
Z:
HO-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-Z
El polímero anterior se puede representar de
forma abreviada como HO-PEG-Z en el
que el símbolo -PEG- representa la siguiente unidad
estructural:
-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-
en la que n es mayor de 200, y
oscila típicamente entre aproximadamente 200 y 2000 para el polímero
de alto peso. Este polímero se puede representar también más
genéricamente como R-(poli)_{a}-Z, en el
que (Poli)_{a} representa el componente mayor del polímero
de la invención y R es una molécula bloqueante o un grupo reactivo
adecuado o un grupo reactivo protegido,
Y''.
Otro tipo de PEG útil como polímero de alto peso
de la invención, (Poli)_{a} es
metoxi-PEG-Z, o de forma abreviada
mPEG-Z, en el que un extremo es el grupo
relativamente inerte metoxi, mientras que el otro extremo es un
grupo funcional, Z. La estructura de mPEG viene dada por:
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-Z
en la que n es como se describió
anteriormente. La utilización de un mPEG, que tiene un grupo
funcional Z, o que tiene otros sitios activos del polímero
distintos de Z, bloqueados por alquilo, arilo u otros grupos no
reactivos, previene al polímero de alto peso de polimerizar consigo
mismo y de combinarse indeseablemente con otras moléculas presentes
en la mezcla de
reacción.
El grupo funcional, Z, del polímero de alto peso
se selecciona de forma que el grupo Z forme fácilmente un enlace
covalente con las correspondientes especies reactivas, Y o Y', que
se encuentran en el polímero de bajo peso, formando de esta forma
un enlace, X, entre el polímero de alto peso y el de bajo peso
cuando estos reaccionan. Los grupos funcionales adecuados se
discutirán más adelante.
Como una forma ejemplar útil en la practica de
la invención, el polímero de bajo peso molecular es un polímero de
PEG lineal terminado en un extremo con un grupo funcional, Y o Y',
capaz de formar fácilmente un grupo de unión hidrolíticamente
estable cuando reacciona con el componente Z del polímero de alto
peso, y un grupo funcional adicional, Y o Y', capaz de formar un
enlace covalente con un agente biológicamente activo o de ser
modificado hasta una forma que sea capaz de formar un enlace
covalente con un agente biológicamente activo:
Y'-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-CH_{2}CH_{2}-Y
\newpage
El polímero anterior se puede representar de
forma abreviada como Y'-PEG-Y en el
que se entiende que el símbolo -PEG- representa la siguiente unidad
estructural:
-CH_{2}CH_{2}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-CH_{2}CH_{2}-
en la que m oscila de 1 a
aproximadamente 120, y es típicamente menor de aproximadamente 60,
para el polímero de bajo peso. Más genéricamente, el polímero se
puede representar como Y'-(Poli)_{b}-Y, en
el que (Poli)_{b} representa un componente pequeño del
polímero de la invención. Los grupos funcionales Y' e Y del polímero
de bajo peso se seleccionan de forma que no se unan fácilmente uno
con otro bajo las condiciones de reacción, evitando así la
polimerización consigo mismo del polímero de bajo peso. Los grupos
Y' e Y aceptables se discutirán con en detalle más
adelante.
Las cadenas principales del polímero pueden
comprender también una estructura ramificada, que típicamente tiene
un resto nuclear central ramificado y una pluralidad de cadenas de
polímero, preferentemente cadenas de polímero lineales, unidas al
núcleo central. En una forma de realización, el PEG se utiliza en
una forma ramificada preparada, por ejemplo, por la adición de
óxido de etileno a varias estructuras de un núcleo central poliol,
tal como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol y
sorbitol. En la práctica de la invención, se puede utilizar
cualquier poliol que proporcione una pluralidad de grupos hidroxilo,
disponibles para la conjugación a las cadenas de polímero. La
estructura nuclear de poliol ramificado puede proporcionar
aproximadamente de 3 a 100 grupos hidroxi disponibles, y
típicamente proporciona de 3 a 20, de forma que la estructura del
polímero ramificada tiene de aproximadamente 3 a 100 cadenas de
polímero. Las moléculas ramificadas de poli(etilenglicol) de
este tipo se pueden representar de forma general como
R(-PEG-OH)_{a} en las que R se deriva de un
resto nuclear central, tal como glicerol, oligómeros de glicerol,
pentaeritritol, y "a" representa el número de brazos,
típicamente aproximadamente de 3 a
20.
20.
Para su utilización como polímero de alto peso
molecular, los grupos hidroxilo del PEG ramificado se convierten
normalmente a grupos funcionales Z antes de su combinación con el
polímero de bajo peso. Los polímeros ramificados o multibrazo de
alto peso tienen la forma R(-PEG-Z)_{a}, y
son capaces de unir aproximadamente de 3 a 20 polímeros de bajo
peso de la invención, dependiendo del grado de ramificación o del
número de brazos que tienen grupos activos. El resto nuclear
central de la molécula ramificada puede derivar de cualquiera de
numerosos aminoácidos, tales como lisina, en el que el resto
nuclear central típicamente proporciona dos o más sitios, por
ejemplo, grupos amino, para la unión a las cadenas de polímero. Las
moléculas PEG multibrazo, tales como las descritas en la Patente de
EE.UU. No. 5.932.462, que se incorpora aquí en su totalidad como
referencia, se pueden utilizar también como cadena principal del
polímero.
La cadena principal del polímero de alto peso
molecular puede comprender alternativamente un PEG en horquilla. Un
ejemplo de PEG en horquilla está representado por
PEG-ACHZ_{2}, en el que A en un grupo de unión y Z
es un grupo terminal activado unido a CH por una cadena de átomos
de longitud definida. La Solicitud Internacional No.
PCT/US99/05333, el contenido de la cual se incorpora aquí como
referencia, revela varias estructuras PEG en horquilla para su
utilización en una forma de realización de la invención. La cadena
de átomos que une los grupos funcionales Z al átomo de carbono
ramificado sirve como un grupo unidor y puede comprender, por
ejemplo, cadenas alquilo, cadenas éter, cadenas éster, cadenas amida
y combinaciones de las mismas. Los grupos funcionales Z se pueden
utilizar en la presente invención para reaccionar con uno de los
grupos funcionales, Y o Y', sobre el polímero de bajo peso para
formar un enlace entre los polímeros de bajo y de alto peso
molecular.
Bien la cadena principal del polímero de bajo o
bien la del de alto peso puede comprender una molécula PEG colgante
que tiene grupos funcionales, Z, Y o Y', según el caso, unidos
covalentemente más bien a lo largo de la longitud de la cadena
principal de PEG que al extremo de la cadena PEG. Los grupos
reactivos colgantes se pueden unir a la cadena principal PEG
directamente o a través de un resto de unión, tal como
alquileno.
En el caso de un polímero de alto peso que tiene
más de un grupo funcional, Z, existen muchos sitios a lo largo del
polímero a los que se puede unir el correspondiente grupo funcional,
Y o Y', del polímero de bajo peso. Los derivados del polímero
generados de los mismos se representan por conveniencia como:
PEG-[X-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-Y]_{q}
en los que PEG es un
poli(etilenglicol) lineal, un
alcoxi-poli(etilenglicol), un
poli(etilenglicol) ramificado, o un
poli(etilenglicol) en horquilla, en los que el PEG tiene un
grado de polimerización de al menos aproximadamente 200,
preferentemente mayor de aproximadamente 1000, y preferentemente
menor de aproximadamente 2000, X es un resto de unión, m es de 1 a
aproximadamente 120, y preferentemente menor de 60, Y es un grupo
funcional, que incluye un grupo electrófilo o nucleófilo terminal,
para la unión a un agente biológicamente activo, y q es igual al
número de grupos terminales del polímero y puede ser de 1 a
aproximadamente 500. Cuando q es 2, entonces los Y's pueden ser el
mismo o diferentes, pero si q es mucho mayor de 3 ó 4, los Y's
normalmente serian todos del mismo grupo. Más genéricamente, en la
estructura anterior, el PEG puede ser (Poli)_{a} y la
unidad de monómero CH_{2}CH_{2}O se puede representar como
(Poli)_{b} para incluir pequeños polímeros similares, como
se definió anteriormente, copolímeros, oligómeros y
similares.
Además de las formas de PEG descritas
anteriormente, cualquiera de los polímeros anteriores se puede
preparar con uno o más enlaces débiles o degradables en la cadena
principal. Por ejemplo, el PEG se puede preparar con enlaces éster
en la cadena principal del polímero que están sujetos a hidrólisis.
Como se muestra a continuación, esta hidrólisis resulta en la
rotura del polímero en fragmentos de menor peso molecular:
-PEG-CO_{2}-PEG-
+ H_{2}O \hskip0,1cm \longrightarrow \hskip0,1cm
-PEG-CO_{2}H +
HO-PEG-
Similarmente, una cadena principal de polímero
se puede unir covalentemente a un agente biológicamente activo a
través de un resto de unión débil o degradable. Por ejemplo, las
uniones éster formadas por la reacción de PEG ácidos carboxílicos o
PEG ácidos carboxílicos activados con los grupos alcohol de un
agente biológicamente activo generalmente se hidrolizan bajo
condiciones fisiológicas para liberar el agente.
Otros enlaces degradables hidrolíticamente,
útiles como un enlace degradable en una cadena principal de polímero
o como un enlace degradable que conecta una cadena principal de
polímero a un agente biológicamente activo, incluyen los enlaces
carbonato; enlaces imina que resultan, por ejemplo, de la reacción
de un amina y un aldehido (ver, por ejemplo, Ouchi et al.
Polymer Preprints, 38 (1): 582-3 (1997), que se
incorpora aquí como referencia.); enlaces éster fosfato formados,
por ejemplo, por reacción de un alcohol con un grupo fosfato;
enlaces hidrazona que se forman típicamente por reacción de una
hidracida y un aldehido; enlaces acetal que se forman típicamente
por reacción entre un aldehido y un alcohol; enlaces ortoéster que
se forman, por ejemplo, por reacción entre un formato y un alcohol;
enlaces peptídicos formados por un grupo amina, por ejemplo, en el
extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un
péptido; enlaces oligonucleótido formados por, por ejemplo, un
grupo fosforamidito, por ejemplo, en el extremo de un polímero, y el
grupo 5' de un oligonucleótido.
Muchos otros polímeros son también adecuados
para la invención. Las cadenas principales de polímero que son no
peptídicas y solubles en agua que se pueden utilizar en lugar de PEG
en la forma especificada anteriormente son: otros
poli(alquilenglicoles), tales como
poli(propilenglicol) (PEG), copolímeros de etilenglicol y
propilenglicol y similares, poli(alcohol olefínico),
poli(vinilpirrolidona),
poil(hidroxialquilmetacrilamida),
poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos),
poli(\alpha-hidroxiácido),
poli(alcohol vinilico), polifosfaceno, polioxazolina,
poli(N-acriloilmorfolina), tal como se
describe en la Patente de EE.UU. No. 5.629.384, que se incorpora
aquí en su totalidad como referencia; y copolímeros, terpolímeros y
mezclas de los mismos.
Como se mencionó, el método y el polímero
funcionalizado resultante se pueden representar por:
R-(Poli)_{a}-Z +
Y'-(Poli)_{b}-Y \rightarrow
Y-(Poli)_{b}-X-(Poli)_{a}-X-(Poli)_{b}-Y
Z es un grupo terminal funcionalizado del
polímero de alto peso (Poli)_{a} e Y e Y' son grupos
terminales funcionalizados del polímero de bajo peso
(Poli)_{b}. R puede incluir un grupo terminal Z
funcionalizado, si se desea, para producir un polímero
homobifuncional como el mostrado, o un grupo activo protegido para
un acoplamiento posterior a otro polímero menor activado, activado
con un grupo diferente Y'', si se desea un polímero largo
hetero-
funcional.
funcional.
Varios grupos reactivos Y, Y', Y'' y Z incluyen,
pero no se limitan a; carbonato de N-succinimidilo
(ver las Patentes de EE.UU. Nos. 5.281.698, 5.468.478), amina (ver,
por ejemplo, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182: 1379
(1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)),
hidracida (ver, por ejemplo, Andresz et al., Makromol. Chem.
179: 301 (1978)), propionato de succinimidilo y butanoato de
succinimidilo (ver, por ejemplo, Olson et al., en
Poly(etilen glicol) Chemistry & Biological Applications,
pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS,
Washington, DC, 1977; ver también la Patente de EE.UU. No.
5.672.662), succinato de succinimidilo (ver, por ejemplo,
Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984) y
Joppich et al., Macrolol. Chem. 180: 1381 (1979), éster de
succinimidilo (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No.
4.670.417), carbonato de benzotriazol (ver, por ejemplo, la Patente
de EE.UU. No. 5.650.234), éter de glicidilo (ver, por ejemplo,
Pitha et al., Eur. J. Biochem. 94: 11 (1979), Elling et
al., Biotech. Appl. Biochem. 13: 354 (1991),
oxicarbonilimidazol (ver, por ejemplo, Beauchamp, et al.,
Anal. Biochem. 131: 25 (1983), Tondelli et al., J.
Controlled Release 1: 251 (1985)), carbonato de
p-nitrofenilo (ver, por ejemplo, Veronese et
al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); y Sartore et
al., Appl. Biochem. Biotech., 27: 45 (1991)), aldehido (ver,
por ejemplo, Harris et al., J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341
(1984), Patente de EE. UU. No. 5.824.784, Patente de EE. UU. No.
5.252.714), maleimida (ver, por ejemplo, Goodson et al.,
Bio/Technoloty 8: 343 (1990), Romani et al., en Chemistry of
Peptides and Proteins 2:29 (1984)), y Kogan, Synthetic Comm. 22:
2417 (1992)), disulfuro de ortopiridilo (ver, por ejemplo, Woghiren,
et al., Bioconj. Chem. 4: 314 (1993)), acrilol (ver, por
ejemplo, Sawhney et al., Macromolecules, 26: 581 (1993)),
vinilsulfona (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No.
5.900.461). Todas las referencias anteriores se incorporan aquí como
referencia).
Los grupos terminales Z y los grupos Y, Y' o Y''
reactivos con Z se seleccionan de forma que los restos de los
grupos terminales sean complementarios, lo que significa que los
grupos terminales reaccionan fácilmente uno con otro, bajo las
condiciones de reacción, para formar un grupo de unión X que es
típicamente hidrolíticamente estable bajo condiciones fisiológicas.
La formación del grupo de unión X es la que une el polímero de alto
peso molecular al polímero de bajo peso molecular, formando de esta
forma un derivado polimérico funcionalizado de alto peso molecular
global.
Y, Y' o Y'' pueden ser el mismo o diferente con
tal que no reaccionen uno con otro. Adicionalmente, al menos un
grupo reactivo Y o Y' no debería reaccionar con Z de forma que
proporcione funcionalidad al polímero completo.
Los grupos funcionales o grupos químicamente
reactivos del polímero de bajo peso se pueden seleccionar entre el
grupo constituido por hidroxilo, hidroxilo protegido, éster activo,
carbonato activo, acetal, aldehido, hidratos de aldehido,
alquenilo, acrilato, metacrilato, sulfona activa, amina, amina
protegida, hidracida, hidracida protegida, tiol, tiol protegido,
ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato,
isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina,
vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos,
tosilatos, tiosulfonato y tresilato.
Los grupos finales reactivos se pueden
seleccionar entre uno o una combinación de los siguientes:
-(CH_{2})_{r}CO_{2}H,
-(CH_{2})_{r'}CO_{2}NS,
-(CH_{2})_{r'}CO_{2}Bt,
-(CH_{2})_{r}CH(OR)_{2},
-(CH_{2})_{r}CHO,
-(CH_{2})_{2}-NH_{2},
-(CH_{2})_{r}M,
-(CH_{2})_{r}-S-SO_{2}-R,
en los que r es 1-5, r' es 0-5, R
es arilo o alquilo, NS es N-succinimidilo, Bt es
1-benzotriazolilo, y M es
N-maleimidilo.
Típicamente, el resto de unión X es hidrófilo y
corto. Sin embargo, el grupo de unión se puede preparar da partir
de componentes hidrofóbicos con tal que, tanto si es hidrófilo como
hidrofóbico, el grupo de unión no altere sustancialmente las
propiedades del polímero. Esto es, en el caso de PEG, el grupo de
unión no debería alterar las propiedades establecidas anteriormente
en la definición del PEG.
Los disolventes adecuados que proporcionan un
medio para la reacción de los grupos terminales Z y de los Y, Y' o
Y'' en la formación de los grupos de unión X incluyen pero no se
limitan a tolueno, tetrahidrofurano, dioxano, acetonitrilo, cloruro
de metileno, cloroformo, dimetilformamida, dimetilsulfóxido,
benceno, xilenos y disolventes con características químicas
similares.
Se ha visto que los polímeros de bajo peso
conjugados y modificados de la invención se pueden filtrar, separar
y purificar con mayor eficiencia y con mejores resultados que los
polímeros de alto peso conjugados o modificados del pasado. En
general, es más fácil separar mezclas de polímeros de bajo peso en
las especies componentes que con polímeros similares de mayor
peso.
La modificación de los grupos terminales y la
conjugación es, generalmente, un proceso en múltiples etapas y cada
etapa de la funcionalización resulta en impurezas poliméricas. Si la
purificación no es eficiente, que puede ser el caso cuando se trata
con polímeros de alto peso, las impurezas se acumulan a través de la
funcionalización del polímero hasta un nivel inaceptable. Mediante
la realización, en primer lugar, de los procedimientos de
funcionalización y purificación de un polímero de bajo peso y
posterior unión el polímero de bajo peso purificado con un polímero
de alto peso de acuerdo con esta invención, se minimizan las etapas
del procedimiento que implican al polímero de alto peso, lo que
resulta en un derivado del polímero conjugado o funcionalizado de
alto peso de la pureza global
deseable.
deseable.
Un polímero de alto peso molecular, soluble en
agua, no peptídico, que tiene al menos un grupo funcional, Z, se
une covalentemente a un polímero de bajo peso molecular, típicamente
oligomérico, soluble en agua, no peptídico, que tiene al menos dos
grupos funcionales Y e Y', que pueden ser el mismo o diferente, con
tal de que Y no sea reactivo con Y' y de que Z sea reactivo con al
menos uno de Y o Y'. La invención también incluye las formas de
realización de conjugación de un derivado del polímero con un agente
biológicamente activo, después de que se produzca el derivado del
polímero funcionalizado de acuerdo con la invención.
En general, el procedimiento y el polímero
funcionalizado resultante se representan por:
(Poli)_{a}-Z +
Y'-(Poli)_{b}-Y \rightarrow
(Poli)_{a}-X-(Poli)_{b}-Y
en la que (Poli)_{a} tiene
al menos 200 unidades repetidos, típicamente al menos
aproximadamente 1000, y más típicamente entre 1000 y 2000; y
(Poli)_{b} tiene hasta aproximadamente 120, y típicamente
menos de 60 unidades repetidas. Y e Y' pueden ser el mismo o
diferente, con tal de que Y' no sea reactivo con Y, y son grupos
funcionales, y X es una molécula de unión formada por la reacción de
Z y los componentes Y o Y'. En el ejemplo anterior Z es reactivo
con Y' para formar el enlace X. (Poli)_{a} puede
funcionalizarse adicionalmente para producir un polímero
homobifuncional con grupos reactivos Y de cada extremo. Si el grupo
adicional se protege de la reacción, el grupo protector se puede
eliminar del polímero conjugado resultante para generar un polímero
heterobifuncional.
Los derivados del polímero de la invención
resultantes comprenden un segmento del polímero de alto peso
molecular, soluble en agua que esta conectado covalentemente, vía
un grupo de unión, a un segmento del polímero de bajo peso
molecular, soluble en agua. El segmento del polímero de bajo peso
molecular tiene un grupo terminal funcionalizado, Y, además del
grupo terminal que proporciona la unión con el segmento del polímero
de alto peso molecular. El grupo terminal funcionalizado adicional,
Y, en el segmento del polímero de bajo peso molecular, proporciona
un grupo de unión para la unión covalente de un agente
biológicamente activo o para la conversión en tal grupo.
Los siguientes ejemplos se muestran como
ejemplos no limitantes de la invención
Se formó un azeótropo de
\alpha-N-t-Boc
amino-\omega-hidroxi PEG (3400)
(PM 3318 Da, 4,0 g, 0,0012 moles) (Shearwater Corp.) en cloroformo
(80 ml) en un evaporador rotatorio a 35ºC a sequedad y se añadió
cloroformo (50 ml) al jarabe residual. La solución se enfrió a 4ºC
bajo atmósfera de argón y se inyectó trietilamina (0, 31 ml, 0,0022
moles), seguido por una inyección lenta de cloruro de
metanosulfonilo (0,15 ml, 0,0019 moles). La mezcla de reacción se
agitó durante toda la noche bajo atmósfera de argón mientras que se
permitía que la temperatura del baño aumentara hasta temperatura
ambiente. Se añadió carbonato sódico anhidro (4,0 g) a la mezcla de
reacción y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente
durante una hora. Posteriormente, la mezcla se filtró y el
filtrado se concentró a sequedad. Se añadió isopropanol (40 ml) y se
recogió el producto precipitado mediante filtración y secado bajo
vacío. Rendimiento: 3,7 g de
\alpha-t-Boc
amino-\omega-metanosulfonato PEG
(3400). RMN (DMSO-d_{6}): 1,37 ppm (s,
-OC(CH_{3})_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,31 ppm (t, -CH_{2}SO_{2}-), 6,76 ppm (-CH_{2}NH-CO-). Este ejemplo demuestra como el grupo funcional, Y, del polímero de bajo peso, \alpha-N-t-Boc amino-\omega-hidroxi PEG (3400), se modifica con un buen rendimiento de polímero de bajo peso modificado.
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,31 ppm (t, -CH_{2}SO_{2}-), 6,76 ppm (-CH_{2}NH-CO-). Este ejemplo demuestra como el grupo funcional, Y, del polímero de bajo peso, \alpha-N-t-Boc amino-\omega-hidroxi PEG (3400), se modifica con un buen rendimiento de polímero de bajo peso modificado.
Se formó un azeótropo de
\alpha-t-Boc
amino-\omega-metanosulfonato PEG
(3400) (el producto del Ej. 1) (1,0 g, 0,30 mmoles) a sequedad, en
cloroformo (30 ml) en un evaporador rotatorio a 35ºC y se añadió
etanol anhidro (15 ml) al jarabe residual. Se añadió
p-toluentiosulfonato potásico (292 mg, 1,25 mmoles)
y la mezcla se sometió a reflujo bajo atmósfera de argón durante
toda la noche. Se eliminó el disolvente en un evaporador rotatorio
a 40ºC y el residuo se secó bajo vació durante 30 minutos. El
producto crudo se disolvió en 100 ml de una solución tampón de 1M
NaH_{2}PO_{4-}Na_{2}HPO_{4} (contenía 10% en peso de NaCl) a
PH 5,8 y la solución resultante se extrajo con diclorometano (100
ml x 3). La fase de diclorometano se secó sobre sulfato sódico
anhidro, se filtró, y el filtrado se concentró hasta casi sequedad
en un evaporador rotatorio. El producto se precipitó por adición de
isopropanol/éter (40 ml/20 ml), se recogió mediante filtración y se
secó bajo vacío. Rendimiento: 0,7 g de
\alpha-t-Boc
amino-\omega-p-toluentiosulfonato
PEG (3400). RMN (DMSO-d_{6}): 1,37 ppm (s,
-OC(CH_{3})_{3}), 2,43 ppm (s,
CH_{3}-CH_{2}=CH_{2}/Ar), 3,51 ppm (s, cadena
principal PEG), 6,76 ppm (t, -CH_{2}NH-CO-), 7,49
ppm (dd, CH_{3}-CH_{2}=CH_{2}/Ar), 7,82 ppm
(dd, CH_{3}-CH_{2}=CH_{2}/Ar). Este ejemplo
demuestra de nuevo como el grupo funcional, Y, del polímero de bajo
peso, \alpha-t-Boc
amino-\omega-metanosulfonato PEG
(3400), se modifica con un buen rendimiento de polímero de bajo peso
modificado.
Se disolvió
\alpha-t-Boc
amino-\omega-p-toluentiosulfonato
PEG (3400) (el producto del Ej. 2) (0,7 g) en diclorometano anhidro
(3,5 ml) y ácido trifluoroacético (3,5 ml) bajo atmósfera de argón.
La solución se agitó a temperatura ambiente durante una hora y se
concentró a sequedad. Se añadió isopropanol (20 ml) y el producto
precipitado se recogió mediante filtración y se secó bajo vacío.
Rendimiento: 0,6 g de
\alpha-NH_{2}-\omega-p-toluentiosulfonato
PEG (3400). RMN (DMSO-d_{6}): 2,43 ppm (s,
CH_{3}-CH_{2}=CH_{2}/Ar), 2,95 ppm (t,
-OCH_{2}CH_{2}NH_{2}), 3,51 ppm (s, cadena principal PEG),
7,49 ppm (dd, CH_{3}-CH_{2}=CH_{2}/Ar), 7,82
ppm (dd, CH_{3}-CH_{2}=CH_{2}/Ar. Este
ejemplo demuestra de nuevo como el grupo funcional, Y, del polímero
de bajo peso, \alpha-t-Boc
amino-\omega-p-toluentiosulfonato
PEG (3400), se modifica con un buen rendimiento de polímero de bajo
peso modificado.
Se disolvieron mPEG (20
kDa)-1-benzotriazol (813 mg, PM 21
kDa, 0,039 mmoles) (Shearwater Corp.) y
PEG(3400)-\alpha-NH_{2}-\omega-p-toluentiosulfonato
(el producto del Ej. 3) (PM 3805 Da, 200 mg, 0,053 mmoles) en
diclorometano anhidro (20 ml) bajo atmósfera de argón y se inyectó
trietilamina (30,8 \mul, 0,22 mmoles). La solución se agitó a
temperatura ambiente durante toda la noche, posteriormente se
concentró a sequedad. Se añadió 2-propanol (10 ml) y
el producto precipitado se recogió mediante filtración y se secó
bajo vacío. Rendimiento: 843 mg. El mPEG (23,4
kDa)-p-toluentiosulfonato (560 mg)
crudo en 50 ml de agua destilada se cargó en una columna empaquetada
con 50 ml de medio Poros. La columna se eluyó con 100 ml de agua
destilada. Se añadió cloruro sódico (15 g) al eluyente y la solución
resultante se extrajo con diclorometano (100 ml x 3). El extracto
se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró, y el filtrado se
concentró hasta casi sequedad en un evaporador rotatorio. Se añadió
éter etílico (50 ml) para precipitar el producto. El producto se
recogió mediante filtración y se secó bajo vacío. Rendimiento: 495
mg de mPEG (23,4
Da)-p-toluentiosulfonato. RMN
(DMSO-d_{6}): 2,43 ppm (s,
CH_{3}-CH_{2}=CH_{2}/Ar), 3,51 ppm (s, cadena
principal PEG), 7,23 ppm (t, -NHCOO-), 7,49 ppm (dd,
CH_{3}-CH_{2}=CH_{2}/Ar), 7,82 ppm (dd,
CH_{3}-CH_{2}=CH_{2}/Ar. Este ejemplo
demuestra la combinación de un polímero de alto peso, mPEG (20
kDa)-1-benzotriazol, con un
polímero de bajo peso modificado,
PEG(3400)-\alpha-NH_{2}-\omega-p-toluentiosulfonato,
mediante la reacción del grupo funcional Z, benzotriazol, con el
grupo
funcional Y', amina, para formar un grupo de unión entre los segmentos del polímero de alto peso y de bajo peso.
funcional Y', amina, para formar un grupo de unión entre los segmentos del polímero de alto peso y de bajo peso.
2,8 mg de mPEG
p-toluentiosulfonato (el producto del Ej. 4) (24
kDa) se añadieron a una solución de
\alpha1-antitripsina (1 mg, Sigma, PM 25 KDa) en
100 mM de fosfato sódico (pH 7,2, 1 ml) y se agitó la solución
durante toda la noche a temperatura ambiente. La electroforesis
capilar indicó que el conjugado PEG
\alpha1-antitripsina se formó con un rendimiento
del 36%. La electroforesis en gel con SDS también demostró la
presencia del conjugado PEG. El tratamiento del conjugado PEG con
\beta-mercaptoetanol resultó en la formación de
\alpha1-antitripsina como se evidenció por
electroforesis en gel, lo que indicaba la presencia de un puente
disulfuro en el conjugado PEG
\alpha1-antitripsina. Este ejemplo demostró la
combinación de un agente biológicamente activo,
\alpha1-antitripsina, con el derivado del
polímero de alto peso molecular del Ej. 4 mediante la
funcionalización del grupo terminal Y,
p-toluentiosulfonato.
PEG (2 kDa)-ácido
\alpha-amino-\omega-propiónico
(0,24 g, 0,00012 moles) (Shearwater Corporation) y trietilamina
(0,060 ml) se añadieron a una solución de m-PEG (20
kDa)-carbonato de benzotriazol (2,0 g, 0,0001 moles)
(Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (20 ml) y la mezcla
de reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente
bajo atmósfera de argón. A continuación, la mezcla se filtro y el
disolvente se evaporó a sequedad. El producto crudo se disolvió en
cloruro de metileno y se precipitó con alcohol isopropílico. El
producto húmedo se secó bajo presión reducida. Rendimiento: 1,9 g.
RMN (d_{6}-DMSO): 2,44 ppm (t,
-CH_{2}-COO-), 3,11 ppm (q,
-CH_{2}-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,04 ppm (m,
-CH_{2}-O(C=O)-), 7,11 ppm (t,
-(C=O)-NH-). La cromatografía de intercambio
aniónico rindió m-PEG (22 kDa)-ácido propiónico
(93%) y m-PEG-20 kDa (7%). Este
ejemplo demuestra la combinación de un polímero de alto peso, mPEG
(20 kDa)-carbonato de benzotriazol, con un
polímero de bajo peso, PEG (2
kDa)-\alpha-amino-\omega-ácido
propiónico, mediante los grupos terminales carbonato
funcionalizado, Z, y amino, Y'.
A una solución de PEG (22 kDa)-ácido propiónico
(el producto del Ej. 6) (1,1 g, 0,000050 moles) en cloruro de
metileno anhidro (10 ml), se le añadió
N-hidroxisuccinimida (0,0063 g, 0,000055 moles),
seguido por 1,3-diciclohexilcarbodiimida (solución
1,0 M en cloruro de metileno, 0,05 ml, 0,000055 moles). La mezcla de
reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente bajo
atmósfera de argón. A continuación, la mezcla se filtró y el
disolvente se evaporó. El producto crudo se disolvió en cloruro de
metileno, se precipitó con alcohol isopropílico, y se secó bajo
presión reducida. Rendimiento: 0,9 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 2,81 ppm (s,
-CH_{2}-CH_{2}-(succinato)), 2,92 ppm (t,
-CH_{2}-COO-), 3,11 ppm (q,
-CH_{2}-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,03 ppm (m,
-CH_{2}-O(C=O)-), 7,11 ppm (t,
-(C=O)-NH-). Este ejemplo demuestra la modificación
del grupo funcional, Y, del polímero producido en el Ej. 6 de ácido
propiónico a ácido propiónico, éster de
N-hidroxisuccinimida.
1-hidroxibenzotriazol (0,30 g),
4-(dimetilamino)piridina (1,0 g), alcohol metílico (3,2,
0,100 moles) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida
(solución 1,0 M en cloruro de metileno, 7,5 ml, 0,0075 moles) se
añadieron a una solución de PEG (2 kDa)-ácido
\alpha-amino-\omega-propiónico
(10 g, 0,0050 moles) (Shearwater Corporation) en cloruro de metileno
anhidro (100 ml). La mezcla de reacción se agitó durante toda la
noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. A
continuación, la mezcla se concentró hasta aproximadamente 50 ml, se
filtró y se añadió a 800 ml de éter dietílico frío. El producto de
precipitación se filtro y se secó bajo presión reducida.
Rendimiento: 9,5 g. RMN (d_{6}-DMSO): 2,53 ppm
(t, -CH_{2}-COO-), 2,95 ppm (t,
-CH_{2}-amina), 3,51 ppm (s, cadena principal
PEG). Este ejemplo demuestra la modificación del grupo terminal
funcional, Y, del polímero de bajo peso molecular, de PEG (2
kDa)-ácido
\alpha-amino-\omega-propiónico,
de ácido propiónico a ácido propiónico, éster metílico.
PEG (2 kDa)-ácido
\alpha-amino-\omega-propiónico,
éster metílico (el producto del Ej. 8) (0,24 g, 0,00012 moles) y
trietilamina (0,060 ml) se añadieron a una solución de
m-PEG (30 kDa)-carbonato de
benzotriazol (3,0 g, 0,0001 moles) (Shearwater Corporation) en
cloruro de metileno (20 ml) y la mezcla de reacción se agitó
durante toda la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de
argón. A continuación, la mezcla se filtró y el disolvente se
evaporó a sequedad. El producto crudo se disolvió en cloruro de
metileno, se precipitó con alcohol isopropílico y se secó bajo
presión reducida. Rendimiento: 2,8 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 2,53 ppm (t,
-CH_{2}-COO-), 3,11 ppm (q,
-CH_{2}-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,04 ppm (m,
-CH_{2}-O(C=O)-), 7,11 ppm (t,
-(C=O)-NH-). Este ejemplo demuestra la combinación
del polímero de bajo peso producido en el Ej. 8 con un polímero de
bajo peso, m-PEG (30 kDa)-carbonato
de benzotriazol, mediante los grupos funcionales, Z, carbonato de
benzotriazol, e Y', amino.
m-PEG (32 kDa)-ácido propiónico,
éster metílico (el producto del Ej. 9) (2,8 g, 0,000082 moles) se
disolvió en 20 ml de agua destilada y se ajustó el pH a 12,0 con
una solución de 0,5 M NaOH. La mezcla de reacción se agitó durante
1,5 h a pH=12,0+/-0,1. A continuación, se añadió cloruro sódico (3
g) y el pH se ajustó a 3 con 5% de ácido fosfórico. El producto se
extrajo 3 veces con cloruro de metileno y los extractos combinados
se secaron con cloruro de magnesio anhidro. El disolvente se eliminó
bajo presión reducida y el producto se secó bajo presión reducida.
Rendimiento: 1,6 g. RMN (d_{6}-DMSO): 2,44 ppm (t,
-CH_{2}-COO-), 3,11 ppm (q,
-CH_{2}-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,04 ppm (m,
-CH_{2}-O(C=O)-), 7,11 ppm (t,
-(C=O)-NH-). La cromatografía de intercambio
aniónico dio m-PEG (32 kDa)-ácido propiónico
(97,5%), m-PEG-30 kDa (2,5%). Este
ejemplo demuestra la modificación del grupo funcional, Y, del
polímero producido en el Ej. 9, de ácido propiónico, éster metílico
a ácido propiónico.
A una solución de PEG (32 kDa)-ácido propiónico
(el producto del Ej. 10) (1,6 g, 0,000050 moles) en cloruro de
metileno anhidro (10 ml), se le añadió
N-hidroxisuccinimida (0,0063 g, 0,000055 moles),
seguido por 1,3-diciclohexilcarbodiimida (solución
1,0 M en cloruro de metileno, 0,05 ml, 0,000055 moles). La mezcla de
reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente bajo
atmósfera de argón, se filtró y el disolvente se evaporó. El
producto crudo se disolvió en cloruro de metileno, se precipitó con
alcohol isopropílico, y se secó bajo presión reducida. Rendimiento:
0,9 g. RMN (d_{6}-DMSO): 2,81 ppm (s,
-CH_{2}-CH_{2}-(succinato)), 2,92 ppm (t,
-CH_{2}-COO-), 3,11 ppm (q,
-CH_{2}-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,03 ppm (m,
-CH_{2}-O(C=O)-), 7,11 ppm (t,
-(C=O)-NH-). Este ejemplo demuestra la modificación
del grupo funcional, Y, del polímero producido en el Ej. 9 de ácido
propiónico a ácido propiónico, éster de
N-hidroxisuccinimida.
PEG (3,4 kDa)-ácido
\alpha-amino-\omega-butanoico
(0,45 g, 0,00012 moles) (Shearwater Corporation) y trietilamina
(0,060 ml) se añadieron a una solución de m-PEG (20
kDa)-carbonato de benzotriazol (2,0 g, 0,0001 moles)
(Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (20 ml) y la mezcla
de reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente
bajo atmósfera de argón. A continuación, la mezcla se filtró y el
disolvente se evaporó a sequedad. El producto crudo se disolvió en
cloruro de metileno, se precipitó con alcohol isopropílico y se secó
bajo presión reducida. Rendimiento: 2,2 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 1,72 ppm (q, -
CH_{2}-CH_{2}-COO-), 2,24
ppm (t, -CH_{2}-COO-), 3,11 ppm (q,
CH_{2}-NH-), 3,24 (s,
-O-CH_{3}), 3,51 ppm (s, cadena principal PEG),
4,04 ppm (m, -CH_{2}-O(C=O)-), 7,11 ppm (t,
-(C=O)-NH-).
La cromatografía de intercambio aniónico rindió m-PEG (23,4 kDa)-ácido butanoico (92%) y m-PEG-20 kDa (8%). Este ejemplo demuestra la combinación de un polímero de bajo peso, PEG (3,4 kDa)-ácido \alpha-amino-\omega-butanoico, con un polímero de alto peso, PEG (20 kDa carbonato de benzotriazol, mediante los grupos funcionales, Z, carbonato de benzotriazol y amino, Y'.
La cromatografía de intercambio aniónico rindió m-PEG (23,4 kDa)-ácido butanoico (92%) y m-PEG-20 kDa (8%). Este ejemplo demuestra la combinación de un polímero de bajo peso, PEG (3,4 kDa)-ácido \alpha-amino-\omega-butanoico, con un polímero de alto peso, PEG (20 kDa carbonato de benzotriazol, mediante los grupos funcionales, Z, carbonato de benzotriazol y amino, Y'.
A una solución de PEG (23,4 kDa)-ácido butanoico
(el producto del Ej. 12) (1,17 g, 0,000050 moles) en cloruro de
metileno anhidro (10 ml), se le añadió
N-hidroxisuccinimida (0,0063 g, 0,000055 moles),
seguido por 1,3-diciclohexilcarbodiimida (solución
1,0 M en cloruro de metileno, 0,05 ml, 0,000055 moles). La mezcla de
reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente bajo
atmósfera de argón, se filtró y el disolvente se evaporó. El
producto crudo se disolvió en cloruro de metileno, se precipitó con
alcohol isopropílico, y se secó bajo presión reducida. Rendimiento:
1,0 g. RMN (d_{6}-DMSO): 1,83 ppm (q,
-CH_{2}-CH_{2}-COO-),
2,70 ppm (t, -CH_{2}-COO-), 2,81 ppm (s,
-CH_{2}-CH_{2}-(succinato)), 2,92 ppm, 3,11 ppm
(q, -CH_{2}-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,03 ppm (m,
-CH_{2}-O(C=O)-), 7,11 ppm (t,
-(C=O)-NH-). Este ejemplo demuestra la modificación
del grupo funcional, Y, del polímero producido en el Ej. 12 de ácido
butanoico a ácido butanoico, éster de
N-hidroxisuccinimida.
A una solución de m-PEG (20
kDa)-carbonato de benzotriazol (2,0 g, 0,0001 moles)
(Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (20 ml) se le
añadió trietilenglicol diamina, el peso fórmula (FW) medio es 148,21
(0,3g, 0,0020 moles) y la mezcla de reacción se agitó durante 2
horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. A
continuación, el disolvente se evaporó a sequedad y el producto
crudo se disolvió en cloruro de metileno y se precipitó con alcohol
isopropílico. El producto se secó bajo presión reducida.
Rendimiento: 1,8 g. RMN (d_{6}-DMSO): 2,64 ppm
(t, -CH_{2}-amina-), 3,11 ppm (q,
-CH_{2}-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,04 ppm (m,
-CH_{2}-O(C=O)-), 7,11 ppm (t,
-(C=O)-NH-). La cromatografía de intercambio
catiónico rindió m-PEG (20
kDa)-amina (97,5%). Este ejemplo demuestra la
combinación de un polímero de bajo peso, trietilenglicol diamina,
con un polímero de alto peso, m-PEG (20
kDa)-carbonato de benzotriazol, mediante los grupos
funcionales carbonato de benzotriazol, Z, y amino, Y'.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de PEG (3,4 kDa)-ácido
\alpha-hidroxi-\omega-propionaldehido,
dietil acetal (NOF) (1,0 g, 0,000294 moles) en una mezcla de
tolueno (20 ml) y diclorometano (5 ml), se le añadieron trietilamina
(0,07 ml, 0,000502 moles, 171% de cantidad estequiométrica) y
cloruro de metanosufonilo (0,028 ml, 0,000362 moles, 123% de
cantidad estequiométrica) y la mezcla resultante se agitó durante
toda la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno.
La mezcla se filtró y el disolvente se destiló bajo presión
reducida. El residuo se añadió a una mezcla de 16 ml de hidróxido
amónico concentrado y 1,6 g de cloruro amónico, se agitó durante 42
horas a temperatura ambiente. El producto de reacción se extrajo con
diclorometano (3 veces, 20 ml). El extracto se lavó con 5 ml de 1M
ácido clorhídrico, 5 ml de agua destilada y se secó con sulfato
sódico anhidro. A continuación, el disolvente se destiló bajo
presión reducida dando 0,78 g de PEG (3,4
kDa)-\alpha-hidrocloruro de
amina-\omega-propionaldehido,
dietil acetal. RMN (d_{6}-DMSO): 1,10 ppm (t,
CH_{3}-, acetal), 1,74 ppm (q, -OCH_{2}CH_{2}CH-,
acetal), 2,94 ppm (t, -CH_{2}-hidrocloruro de
amina), 3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,55 ppm (t, -CH-,
acetal), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Este ejemplo
demuestra la modificadión de un grupo terminal funcional, Y', de un
polímero de bajo peso, PEG (3,4 kDa)-ácido
\alpha-hidroxi-\omega-propionaldehido,
de un grupo hidroxi a un grupo amino.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de m-PEG (20
kDa)-carbonato de benzotriazol (2,0 g, 0,0001 moles)
(Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (20 ml) se le
añadió PEG (3,4
kDa)-\alpha-amina-\omega-propionaldehido,
dietil acetal (0,36 g, 0,000106 moles) y la mezcla de reacción se
agitó durante toda la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera
de argón. A continuación, el disolvente se evaporó a sequedad. El
producto crudo se disolvió en cloruro de metileno y se precipitó
con alcohol isopropílico. El producto se disolvió en cloruro de
metileno y se precitó con alcohol isopropílico. El producto húmedo
se secó bajo presión reducida. Rendimiento: 1,8 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 1,10 ppm (t, CH_{3}-, acetal)
1,74 ppm (q, -OCH_{2}CH_{2}CH-, acetal), 3,11 ppm (q,
-CH_{2}-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,04 ppm (m,
-CH_{2}-O(C=O)-), 4,55 ppm (t, -CH-,
acetal), 7,11 ppm (t, -(C=O)-NH-). Este ejemplo
demuestra la combinación del polímero de bajo peso producido en el
Ej. 15, PEG (3,4
kDa)-\alpha-amina-\omega-propionaldehido,
dietil acetal, con un polímero de alto peso, m-PEG
(20 kDa)-carbonato de benzotriazol, mediante los
grupos funcionales carbonato de benzotriazol, Z, y amino, Y'.
\vskip1.000000\baselineskip
m-PEG (23,4
kDa)-propionaldehido, dietil acetal (producto del
Ej. 16) (1,8 g) se disolvió en 20 ml de agua y se ajustó el pH de
la solución a 3 con ácido fosfórico diluido. La solución se agitó
durante 3 horas a temperatura ambiente y se utilizó 0,5 M
hidróxido sódico para ajustar el pH de la solución a 7. El producto
se extrajo con cloruro de metileno, el extracto se secó con sulfato
de magnesio anhidro, y el disolvente se destiló bajo presión
reducida. Rendimiento: 1,6 g. RMN (d_{6}-DMSO):
2,60 ppm (dt, -OCH_{2}CH_{2}CH-, aldehido), 3,24 ppm (q,
-CH_{2}-NH-), 3,51 ppm (s, cadena principal
PEG), 4,04 ppm (m, -CH_{2}-O(C=O)-), 7,11
ppm (t, -(C=O)-NH-), 9,65 ppm (t, -CH, aldehido).
Este ejemplo demuestra la modificación del grupo funcional, Y, del
polímero producido en el Ej. 16, de propionaldehido, dietil acetal a
propionaldehido.
\newpage
A una solución de PEG2 (40 kDa)-éster de
N-hidroxisuccinimida ramificado (1,0 g, 0,000025
moles) (Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (8 ml), se
le añadió PEG (3,4
kDa)-\alpha-hidrocloruro de
amina-\omega-propionaldehido,
dietil acetal (0,12 g, 0,0000352 moles) en trietilamina (0,01 ml) y
la mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a temperatura
ambiente bajo atmósfera de argón. A continuación, el disolvente se
evaporó a sequedad. El producto crudo se disolvió en cloruro de
metileno y se precipitó con éter dietílico. El producto húmedo se
secó bajo presión reducida. Rendimiento: 0,83 g. RMN
(d_{6}-DMSO): 1,10 ppm (t, CH_{3}-, acetal)
1,74 ppm (q, -OCH_{2}CH_{2}CH-, acetal), 3,24 ppm (s,
-OCH_{3}), 3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,55 ppm (t, -CH-,
acetal), Este ejemplo demuestra la combinación del polímero de bajo
peso, PEG (3,4
kDa)-\alpha-hidrocloruro de
amina-\omega-propionaldehido,
dietil acetal, con el polímero de alto peso ramificado, PEG2 (40
kDa)-éster de N-hidroxisuccinimida, mediante los
grupos funcionales éster de N-hidroxisuccinimida, Z,
e hidrocloruro de amina, Y'.
PEG (43,4 kDa)-propionaldehido,
dietil acetal ramificado (producto del Ej. 18) (0,4 g) se disolvió
en 10 ml de agua y se ajustó el pH de la solución a 3 con ácido
fosfórico diluido. La solución se agitó durante 3 horas a
temperatura ambiente y se utilizó 0,5 M hidróxido sódico para
ajustar el pH de la solución a 7. El producto se extrajo con
cloruro de metileno. El extracto se secó con sulfato de magnesio
anhidro y el disolvente se destiló bajo presión reducida.
Rendimiento: 0,35 g. RMN (d_{6}-DMSO): 2,60 ppm
(dt, -OCH_{2}CH_{2}CH-, aldehido), 3,24 ppm (s,
-OCH_{3}-), 3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 9,65 ppm (t, -CH,
aldehido). Este ejemplo demuestra la modificación del grupo
terminal, Y, del polímero producido en el Ej. 18, de
propionaldehido, dietil acetal a propionaldehido.
A una solución de m-PEG (20
kDa)-carbonato de benzotriazol (20,0 g, 0,001 moles)
(Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (200 ml) se le
añadió Maleimida-trietilenglicol-TFA
amina (0,68 g, 0,002 moles) y 4-metilmorfolina
(0,44 ml, 0,004 moles). La reacción se agitó durante 4 horas a
temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. A continuación, el
disolvente se evaporó a sequedad y se precipitó con alcohol
isopropílico (1000 ml). El precipitado se recuperó por filtración
en vacío y se seco bajo vacío durante toda la noche. Rendimiento:
19,5 g. RMN (d_{6}-DMSO): 3,11 ppm (q,
-CH_{2}-NH-), 3,24 ppm (s, -OCH_{3}),
3,51 ppm (s, cadena principal PEG), 4,04 ppm (m,
-CH_{2}-O(C=O)-), 7,04 ppm (s,
-(C=O)-CH=CH-(C=O)-), 7,11 (t,
-(C=O)-NH). Este ejemplo demuestra la combinación
de un polímero de alto peso, mPEG (20 kDa)-carbonato
de benzotriazol, con un polímero de bajo peso,
Maleimida-trietilenglicol-TFA amina,
mediante los grupos funcionales carbonato de benzotriazol, Z, y
amina, Y'.
Claims (36)
1. Un derivado polimérico activado,
comprendiendo dicho derivado polimérico un (o más de uno) primer
segmento polimérico no peptídico, soluble en agua, que tiene, al
menos, aproximadamente 200 unidades repetidas unidas covalentemente
a través de, al menos, un resto de unión a, al menos, un segundo
segmento polimérico no peptídico, soluble en agua, que no tiene más
de aproximadamente 120 unidades repetidas, en el que dichas unidades
de dichos primer y segundo segmentos poliméricos pueden ser iguales
o diferentes, en el que el mencionado (al menos uno) resto de unión
no altera sustancialmente las propiedades de dicho derivado
polimérico, teniendo dicho derivado polimérico, al menos, un resto
activo seleccionado entre el grupo constituido por restos
electrófilos y restos nucleófilos, localizados en uno de los
mencionados primer y segundo segmentos poliméricos, y en el que el
primer y segundo segmentos poliméricos se seleccionan
independientemente entre el grupo constituido por
poli(alquilenglicol), poli(alcolhol olefínico),
poli(vinilpirrolidona),
poli(hidroxialquilmetacrilamida),
poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos),
poli(\alpha-hidroxiácido),
poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina,
poli(N-acriloilmorfolina), y copolímeros,
terpolímeros, y mezclas de los mismos.
2. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que, al menos, un resto activo es un resto
sencillo localizado sobre dicho segundo segmento polimérico.
3. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que dicho primer segmento polimérico
comprende, además, un grupo funcional protegido.
4. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que dicho primer segmento polimérico tiene
de aproximadamente 200 a 2000 unidades de monómero repetidas.
5. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que dicho primer segmento polimérico tiene
de aproximadamente 200 a 700 unidades repetidas.
6. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que dicho segundo segmento polimérico tiene
de aproximadamente 1 a 120 unidades repetidas.
7. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que dicho segundo segmento polimérico tiene
de aproximadamente 40 a 80 unidades repetidas.
8. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que dichos primer y segundo segmentos
poliméricos son poli(etilenglicol).
9. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que dicho resto de unión entre los
mencionados primer y segundo segmentos poliméricos es un resto
hidrófilo seleccionado entre un enlace amida o carbamato.
10. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que dicho resto activo se selecciona entre
el grupo constituido por hidroxilo, hidroxilo protegido, éster
activo, carbonato activo, acetal, aldehido, hidratos de aldehido,
alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina,
amina protegida, hidracida, hidracida protegida, tiol, tiol
protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido,
isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina,
vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos,
tosilatos, tiosulfonato y tresilato.
11. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, en el que dichos segmentos poliméricos se
seleccionan entre el grupo constituido por segmentos poliméricos
lineales, ramificados y multibrazo.
12. Un derivado polimérico activado,
comprendiendo dicho derivado polimérico un segmento monometoxi
poli(etilenglicol) lineal que tiene de aproximadamente 200 a
700 unidades de monómero repetidas, unido covalentemente a través
de, al menos, un resto de unión amida o carbamato a un extremo de un
segmento de poli(etilenglicol) lineal que tiene de 1 a 120
unidades de monómero repetidas, y en el que dicho segmento de
poli(etilenglicol) lineal de 1 a 120 unidades de monómero
repetidas incluye, al menos, un resto activo, seleccionado entre el
grupo constituido por restos electrófilos y restos nucleófilos, en
el extremo del mismo opuesto a dicho segmento de
poli(etilenglicol) de 200 a 700 unidades de monómero
repetidas.
13. Un derivado polimérico seleccionado entre el
grupo constituido por monometoxi
poli(etilenglicol)-p-toluentiosulfonato;
monometoxi poli(etilenglicol)-ácido propiónico; monometoxi
poli(etilenglicol)-ácido propiónico, éster de
N-hidroxisuccinimida; monometoxi
poli(etilenglicol)-ácido propiónico, éster de metilo;
monometoxi poli(etilen-
glicol)-ácido butanoico; monometoxi poli(etilenglicol)-ácido butanoico, éster de N-hidroxisuccinimida; monometoxi poli(etilenglicol)-ácido butanoico, éster de metilo; monometoxi poli(etilenglicol)-amina; monometoxi poli(etilenglicol)-propionaldehido; monometoxi poli(etilenglicol)-propionaldehido, dietilacetal; di-monometoxi poli(etilenglicol)-lisina propionaldehido; di-monometoxi poli(etilenglicol)-lisina propionaldehido, éster de dietilo, y monometoxi poli(etilenglicol)-maleimida; teniendo dicho derivado polimérico un peso molecular de, al menos, aproximadamente 10.000 daltons y teniendo al menos dos segmentos poli(etilenglicol) distintos unidos mediante un grupo de unión.
glicol)-ácido butanoico; monometoxi poli(etilenglicol)-ácido butanoico, éster de N-hidroxisuccinimida; monometoxi poli(etilenglicol)-ácido butanoico, éster de metilo; monometoxi poli(etilenglicol)-amina; monometoxi poli(etilenglicol)-propionaldehido; monometoxi poli(etilenglicol)-propionaldehido, dietilacetal; di-monometoxi poli(etilenglicol)-lisina propionaldehido; di-monometoxi poli(etilenglicol)-lisina propionaldehido, éster de dietilo, y monometoxi poli(etilenglicol)-maleimida; teniendo dicho derivado polimérico un peso molecular de, al menos, aproximadamente 10.000 daltons y teniendo al menos dos segmentos poli(etilenglicol) distintos unidos mediante un grupo de unión.
14. El derivado polimérico según la
Reivindicación 13, conjugado a una molécula biológicamente
activa.
15. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, que tiene la estructura
(Poli)_{a}-X-(Poli)_{b}-Y,
en la que (Poli)_{a} es un segmento polimérico no
peptídico, soluble en agua, que tiene más de aproximadamente 200
unidades repetidas, X es un resto de unión que no altera
sustancialmente las propiedades del derivado polimérico,
(Poli)_{b} es un segmento polimérico no peptídico, soluble
en agua, que tiene de 1 a aproximadamente 120 unidades repetidas,
que pueden ser las mismas o diferentes de las de
(Poli)_{a}, e Y es un resto electrófilo o nucleófilo.
16. El derivado polimérico según la
Reivindicación 1, que tiene la estructura
Y-(Poli)_{b}-X-(Poli)_{a}-X-(Poli)_{b}-Y,
en el que (Poli)_{a} es un segmento polimérico no
peptídico, soluble en agua, que tiene más de 200 unidades
repetidas, X es un resto de unión que no altera sustancialmente las
propiedades del derivado polimérico, (Poli)_{b} es un
segmento polimérico no peptídico, soluble en agua, que tiene de 1 a
aproximadamente 120 unidades repetidas, y en el que Y es un resto
electrófilo o nucleófilo.
17. El polímero según la Reivindicación 1, en el
que el resto activo se selecciona entre el grupo constituido por
-(CH_{2})_{r}CO_{2}H,
-(CH_{2})_{r'}CO_{2}NS,
-(CH_{2})_{r'}CO_{2}Bt,
-(CH_{2})_{r}CH(OR)_{2},
-(CH_{2})_{r}CHO,
-(CH_{2})_{2}-NH_{2},
-(CH_{2})_{r}M,
-(CH_{2})_{r}-S-SO_{2}-R,
en el que r es 1-5, r' es 0-5, R es
arilo o alquilo, NS es N-succinimidilo, Bt es
1-benzotriazolilo, y M es
N-maleimidilo.
18. El polímero según la Reivindicación 1, en
el que uno o ambos de dichos primer y segundo segmentos poliméricos
comprenden, además, grupos que se degradan hidrolíticamente o
enzimáticamente entre dichos monómeros.
19. Un polímero que tiene la composición
PEG-[X-(CH_{2}CH_{2}O)_{m}-Y]_{q}
en la que:
PEG es un polímero no peptídico, soluble en
agua, seleccionado entre poli(etilenglicol) lineal,
alcoxi-poli(etilenglicol),
poli(etilenglicol) ramificado, poli(etilenglicol) en
horquilla, con o sin enlaces degradables hidrolíticamente o
enzimáticamente, en el que el poli(etilenglicol) tiene al
menos 200 unidades de monómero repetidas,
X es un resto de unión,
m es de 1 a aproximadamente 120,
Y es un resto que tiene un grupo terminal
electrófilo o nucleófilo, y
q es de 1 a aproximadamente 500.
20. El polímero según la Reivindicación 19, en
el que Y se selecciona entre el grupo constituido por hidroxilo,
hidroxilo protegido, éster activo, carbonato activo, acetal,
aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato,
acrilamida, sulfona activa, amina, amina protegida, hidracida,
hidracida protegida, tiol, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido
carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida,
vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido,
glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tiosulfonato y
tresilato.
21. El polímero según la Reivindicación 19, en
el que para q=2, Y se selecciona independientemente entre el grupo
constituido por hidroxilo, hidroxilo protegido, éster activo,
carbonato activo, acetal, aldehido, hidratos de aldehido,
alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina,
amina protegida, hidracida, hidracida protegida, tiol, tiol
protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido,
isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina,
vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas,
mesilatos, tosilatos, tiosulfonato y tresilato.
22. El polímero según la Reivindicación 19, en
el que Y se selecciona entre -(CH_{2})_{r}CO_{2}H,
-(CH_{2})_{r'}CO_{2}NS,
-(CH_{2})_{r'}
CO_{2}Bt, -(CH_{2})_{r}CH(OR)_{2}, -(CH_{2})_{r}CHO, -(CH_{2})_{2}-NH_{2}, -(CH_{2})_{r}M, -(CH_{2})_{r}-S-SO_{2}-R, en los que r es 1-5, r' es 0-5, R es arilo o alquilo, NS es N-succinimidilo, Bt es 1-benzotriazolilo, y M es N-maleimidilo.
CO_{2}Bt, -(CH_{2})_{r}CH(OR)_{2}, -(CH_{2})_{r}CHO, -(CH_{2})_{2}-NH_{2}, -(CH_{2})_{r}M, -(CH_{2})_{r}-S-SO_{2}-R, en los que r es 1-5, r' es 0-5, R es arilo o alquilo, NS es N-succinimidilo, Bt es 1-benzotriazolilo, y M es N-maleimidilo.
23. El polímero según la Reivindicación 19, en
el que X es un enlace amida o carbamato.
24. El polímero según la Reivindicación 19, en
el que el poli(etilenglicol) tiene de 200 a 2000 unidades
repetidas.
25. Un polímero de la composición
R-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-X-(
CH_{2}CH_{2}-O)_{m}-Y
en la que:
R se selecciona entre un grupo alquilo que tiene
de 1 a 5 átomos de carbono y un resto funcional que tiene un grupo
terminal electrófilo o nucleófilo,
n es mayor de 200
m es entre 1 y aproximadamente 120,
X es un resto de unión, e
Y es un resto que tiene un grupo terminal
electrófilo o nucleófilo, que puede ser el mismo o diferente de
R.
26. Un procedimiento para generar un polímero no
peptídico, soluble en agua, con al menos un grupo funcional,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
proporcionar un primer polímero no peptídico,
soluble en agua, compuesto por, al menos, aproximadamente 200
unidades repetidas y que tiene, al menos, un primer grupo
funcional;
proporcionar un segundo polímero no peptídico,
soluble en agua, compuesto por, al menos, de 1 a aproximadamente
120 unidades repetidas y que tiene, al menos, un segundo grupo
funcional, en el que dicho segundo grupo funcional es reactivo con
el mencionado primer grupo funcional del polímero de alto peso, en
el que, al menos, uno de los mencionados primer y segundo
polímeros, comprenden, además, un grupo funcional que no es reactivo
con cualquiera de los mencionados primer y segundo grupos
funcionales, y en el que dicho primer y segundo segmentos
poliméricos se seleccionan independientemente entre el grupo
constituido por poli(alquilenglicol), poli(alcolhol
olefínico), poli(vinilpirrolidona),
poli(hidroxialquilmetacrilamida),
poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos),
poli(\alpha-hidroxiácido),
poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina,
poli(N-acriloilmorfolina), y copolímeros,
terpolímeros, y mezclas de los mismos; y
hacer reaccionar los mencionados primer y
segundo grupos funcionales, uniendo, con ello, covalentemente dichos
primer y segundo polímeros para proporcionar un polímero no
peptídico, soluble en agua, con al menos un grupo funcional.
27. El procedimiento según la Reivindicación
26, en el que el primer y segundo grupos funcionales se seleccionan
entre carbonato de N-succinimidilo, amina,
hidracida, propionato de succinimidilo y butanoato de succinimidilo,
succinato de succinimidilo, éster de succinimidilo, carbonato de
benzotriazol, éter de glicidilo, oxicarbonilimidazol, carbonato de
p-nitrofenilo, aldehido, maleimida, disulfuro de
ortopiridilo, acrilol, vinilsulfona.
28. El procedimiento según la Reivindicación 26,
en el que el grupo funcional que no es reactivo con el primer y
segundo grupos funcionales se selecciona entre el grupo constituido
por hidroxilo, hidroxilo protegido, éster activo, carbonato activo,
acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato,
metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, amina protegida,
hidracida, hidracida protegida, tiol, tiol protegido, ácido
carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato,
maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina,
yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos,
tiosulfonato y tresilato.
29. El procedimiento según la Reivindicación 26,
en el que se hacen reaccionar el primer y segundo grupos
funcionales en presencia de un disolvente seleccionado entre el
grupo constituido por tolueno, tetrahidrofurano, dioxano,
acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo, dimetilformamida,
dimetilsulfóxido, benceno, xileno, y combinaciones de los
mismos.
30. El procedimiento según la Reivindicación 26,
en el que cada uno de los polímeros es poli(etilenglicol)
seleccionado entre el grupo constituido por las formas monofuncional
y difuncional lineal, ramificada, multibrazo y en horquilla.
31. El procedimiento según la Reivindicación 26,
en el que el primer polímero es un
metoxi-poli(etilenglicol) lineal.
32. El procedimiento según la Reivindicación 26,
que comprende, además, la etapa de conjugación del grupo funcional
que no es reactivo con el primer y segundo grupos funcionales a un
agente biológicamente activo.
33. El procedimiento según la Reivindicación 32,
en el que el agente biológicamente activo se selecciona entre una
proteína, péptido, carbohidrato, oligonucleótido, ADN, ARN y
lípido.
34. El procedimiento según la Reivindicación 26,
en el que el primer polímero comprende un grupo reactivo protegido
y que incluye, además, la etapa de eliminación del resto protector
de los polímeros de alto y bajo peso, unidos covalentemente, para
generar una funcionalidad adicional.
35. El derivado polimérico de la Reivindicación
1, en el que dicho segmento del segundo polímero tiene un peso
molecular de, al menos, 100 daltons.
36. El procedimiento según la Reivindicación 26,
en el que el segundo polímero tiene un peso molecular de, al menos,
100 daltons.
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