ES2897470T3 - Alcanales poliméricos solubles en agua - Google Patents

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Abstract

Un polímero soluble en agua que tiene la estructura: **(Ver fórmula)** en donde: POLY es un segmento de polímero soluble en agua; X' es un resto enlazador que comprende uno o más átomos que no son una extensión de uno o más monómeros del segmento de polímero soluble en agua; z' es un número entero de 3 a 12; R1, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, y además en donde se aplica lo siguiente: - cuando POLY es lineal: (a) el número total de carbonilos presentes en dicho polímero sin contar el (los) carbono (s) aldehído es 0 o 2 o más, excepto cuando X 'comprende uno o más segmentos contiguos (-CH2CH2O-), (b) y además en menos uno de R1 donde X' es oxígeno o R2 en al menos un o comprende al menos un caso es un radical orgánico segmento (-CH2CH2O-), entonces al como se ha definido anteriormente o dicho polímero es heterobifuncional, donde POLY comprende un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxi, y - cuando POLY es ramificado: (c) (i) al menos uno de R1 o R2 en al menos una aparición es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o (ii) X' incluye -(CH2CH2O)b- donde b es de 1 a 20 en el caso donde POLY comprende un residuo de lisina, (d) y además en el que dicho POLY tiene 2 brazos de polímero, entonces ninguno de los brazos del polímero comprende oxígeno como único heteroátomo en el caso donde POLY comprende "C-H" como punto de ramificación, con la condición de que el polímero soluble en agua no sea uno de los siguientes: **(Ver fórmula)** OHC-(CH2)1-3NH- C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10-10.000-CH2CH2-O-(CH2)1-17-C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO OHC-(CH2)1-3NH- C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10-10.000-CH2CH2-NH-(CH2)1-17-C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO OHC-(CH2)1-3NH-C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10-10.000-CH2CH2-O-C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO OHC-(CH2)1-3NH-C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10-10.000-CH2CH2-NH-C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO donde R es un grupo con caperuza terminal y Z es una cadena lateral de un aminoácido.

Description

DESCRIPCIÓN
Alcanales poliméricos solubles en agua
Campo de la invención
La presente invención se refiere a derivados de aldehido poliméricos solubles en agua particulares y a métodos para preparar y utilizar dichos derivados de aldehído poliméricos.
Antecedentes de la invención
En los últimos años, los tratamientos humanos se ha expandido más allá de los fármacos de moléculas pequeñas tradicionales y han entrado en el ámbito de los biofármacos. El descubrimiento de nuevas proteínas y péptidos ha llevado a desarrollar numerosos biofármacos de proteínas y polipéptidos. Por desgracia, cuando las proteínas y los polipéptidos se utilizan como tratamientos, a menudo presentan propiedades que los hacen extremadamente difíciles de formular o administrar, tales como semividas circulantes cortas, inmunogenicidad, degradación proteolítica y baja solubilidad. Una estrategia para mejorar las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas de los biofármacos es la conjugación con polímeros naturales o sintéticos, tales como polietilenglicol (PEG). La adhesión covalente de PEG a una proteína terapéutica puede proporcionar diversas de ventajas, tales como (i) proteger los epítopos antigénicos de la proteína, reduciendo así su eliminación reticuloendotelial y el reconocimiento por parte del sistema inmunitario, (ii) reducir la degradación por enzimas proteolíticas y (iii) reducir la filtración renal.
Se ha dedicado mucho esfuerzo a desarrollar derivados poliméricos para su acoplamiento a biofármacos tales como péptidos y, en particular, a desarrollar derivados poliméricos para su acoplamiento a grupos amino reactivos de proteínas. Se dice que dichos derivados poliméricos están 'electrofílicamente activados', ya que llevan grupos electrófilos adecuados para reaccionar con nucleófilos tales como aminas. Como ejemplos de dichos derivados de PEG se incluyen diclorotriazina de PEG, tresilato de PEG, succinimidil carbonato de PEG, carbonilimidazol de PEG y succinimidil succinato de PEG. Por desgracia, el uso de estos reactivos particulares puede dar como resultado uno o más de los siguientes: reacciones secundarias no deseables en las condiciones de reacción necesarias para efectuar el acoplamiento, falta de selectividad y/o la formación de enlaces débiles (es decir, inestables) entre el biofármaco y el PEG.
Intentando superar algunos de estos problemas, se han desarrollado muchos PEG nuevos, electrofílicamente activados o de "segunda generación", tales como propionaldehído PEG y acetaldehído PEG (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.252.714 y 5.990.237, respectivamente). Los derivados de aldehídos son reactivos particularmente atractivos para el acoplamiento a proteínas y a otras biomoléculas, ya que los aldehídos reaccionan solo con aminas (es decir, su química de adhesión es selectiva). Los reactivos mencionados anteriormente ofrecen muchas ventajas: pueden estar preparados para evitar los problemas de contaminación por diol PEG, no están restringidos a mPEG de bajo peso molecular, forman enlaces amina estables tras el acoplamiento, y son selectivos. Aunque los derivados mencionados anteriormente ofrecen muchas ventajas sobre los reactivos de PEG de primera generación, los Solicitantes han observado algunos inconvenientes particulares de estos reactivos aldehídicos, que los hacen menos ideales en determinados casos.
Más específicamente, los Solicitantes han reconocido, en su exhaustivo trabajo con estos reactivos, que el acetaldehído de PEG es muy inestable, particularmente en medios básicos, y es difícil de aislar debido a la formación excesiva de sal resultante de la neutralización de la mezcla de reacción. En particular, el acetaldehído de PEG es muy susceptible a la dimerización por condensación aldólica. Aunque el propionaldehído de PEG es un reactivo mucho mejor en cuanto a su estabilidad, posee algunas desventajas debido a que durante su preparación pueden producirse reacciones secundarias, lo que dificulta la obtención del producto de propionaldehído PEG a una pureza elevada.
Más específicamente, los Solicitantes han descubierto que cuando se prepara in situ propionaldehído de PEG a partir de su precursor, aldehído de PEG hidratado, generalmente, los rendimientos del producto son de solo aproximadamente 50 %, debido a una reacción de eliminación que consume una parte significativa del reactivo acetal. Aunque se puede emplear una vía sintética mejorada para la síntesis de propionaldehído de PEG, es decir, a través de una reacción de 3-hidroxipropionaldehído dietil acetal con mesilato de PEG, catalizada por una base, los Solicitantes han descubierto que esta vía de reacción también conduce a una reacción de eliminación secundaria que produce cantidades significativas de éter vinílico de PEG, que es inestable y produce dihidroxi PEG original difícil de eliminar (también denominado diol de PEG). Por consiguiente, el rendimiento de esta reacción es generalmente menor que aproximadamente 85 a 90 %. Por otro lado, el uso de cualquiera de las síntesis de propionaldehído de PEG descritas anteriormente, requiere la hidrólisis del producto intermedio acetal a pH muy bajos, por ejemplo, a pH de 2 o más bajos. La hidrólisis a dichos pH tan bajos no es deseable ya que para neutralizar la mezcla de reacción a pH adecuados para la conjugación, se requieren grandes cantidades de base. Adicionalmente, el acoplamiento de propionaldehído de PEG a una proteína a pH básicos puede ser problemático debido a la formación de cantidades significativas de acroleína (como resultado de una reacción secundaria de tipo retro-Michael), que es bastante difícil de eliminar. La formación de dichos productos secundarios no deseables requiere una exhaustiva purificación para obtener un producto de calidad farmacéutica.
Por tanto, existe una necesidad de derivados poliméricos electrofílicamente activados, mejorados, para conjugarse con moléculas y superficies biológicamente activas, particularmente derivados poliméricos que (i) sean selectivos en cuanto a su química de acoplamiento, (ii) puedan prepararse con altos rendimientos y en pocas etapas de reacción, (iii) sean estables en un amplio intervalo de pH, (iv) puedan aislarse fácilmente, (iv) puedan prepararse a una pureza elevada (es decir, sustancialmente sin impurezas ni productos secundarios derivados de polímero) y (v) superen al menos algunos de los inconvenientes de los derivados poliméricos conocidos tales como los descritos anteriormente.
En el documento WO 03/049699 se describen aldehídos de polietilenglicol monofuncionales que tienen estructuras particulares adecuadas para la conjugación con proteínas terapéuticamente activas.
En el documento WO 03/040211 se describen polímeros ramificados solubles en agua, que tienen al menos dos brazos poliméricos adheridos a una molécula central de hidrocarburo alifático principal a través de enlaces de heteroátomo. Topchiyeva (Synthesis of biologically active polyethylene glycol derivatives. Una revisión, Polymer Science USSR, 1990, vol. 32, n.° 5, páginas 833-851) es una revisión de estrategias sintéticas para modificar polietilenglicol con objeto de producir derivados de PEG reactivos. En la patente de Estados Unidos n.° 4.002.531 se describe un proceso de acoplamiento reductor de los grupos amino libres de una enzima con un derivado de aldehído de monoalquil polietilenglicol.
En el documento WO 2004/013205 se describen derivados de aldehído particulares de polietilenglicol y sus productos intermedios.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un polímero soluble en agua que tiene la estructura:
Figure imgf000003_0001
en donde:
POLY es un segmento de polímero soluble en agua;
X' es un resto enlazador que comprende uno o más átomos que no son una extensión de uno o más monómeros del segmento de polímero soluble en agua;
z' es un número entero de 3 a 12;
R1, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido;
R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido,
y además en donde se aplica lo siguiente:
cuando POLY es lineal:
(a) el número total de carbonilos presentes en dicho polímero sin contar el (los) carbono (s) aldehído es 0 o 2 o más, excepto cuando X 'comprende uno o más segmentos contiguos (-CH2CH2O-), (b) y además en donde X' es oxígeno o comprende al menos un segmento (-CH2CH2O-), entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o dicho polímero es heterobifuncional, donde POLY comprende un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxi, y
- cuando POLY es ramificado:
(c) (i) al menos uno de R1 o R2 en al menos una aparición es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o (ii) X' incluye -(CH2CH2O)b- donde b es de 1 a 20 en el caso donde POLY comprende un residuo de lisina,
(d) y además en el que dicho POLY tiene 2 brazos de polímero, entonces ninguno de los brazos del polímero comprende oxígeno como único heteroátomo en el caso donde POLY comprende "C-H" como punto de ramificación, con la condición de que el polímero soluble en agua no sea uno de los siguientes:
Figure imgf000004_0001
OHC-(CH2)1-aNH-C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10.10000-CH2CH2-O-(CH2)1-17-C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO OHC-(CH2)1-sNH-C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10-10000-CH2CH2-NH-(CH2)1-17-C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO
OHC-(CH2)1-3NH-C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10-10000-CH2CH2-O-
C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO
OHC-(CH2)1-3NH-C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10-10000-CH2CH2-NH-
C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO,
donde R es un grupo con caperuza terminal y Z es una cadena lateral de un aminoácido.
La presente invención proporciona una familia única de alcanales poliméricos, es decir, polímeros que comprenden al menos una funcionalidad aldehído acoplada a un segmento de polímero por uno o más átomos de carbono interpuestos.
Los alcanales poliméricos de la invención son, en su mayor parte, menos reactivos que los derivados de aldehídos de la técnica anterior y, por tanto, más selectivos. Además, los alcanales poliméricos de la invención se preparan con alto rendimiento y determinadas estructuras se pueden preparar en un sencillo proceso de una etapa. Determinados de los aldehídos poliméricos descritos en el presente documento son más estables a pH básicos que los derivados de aldehídos conocidos anteriormente, y se forman sin cantidades significativas o incluso detectables de productos secundarios de reacción de tipo retro-Michael. Por otra parte, los alcanales poliméricos de la invención se forman a partir de los correspondientes precursores de acetal por hidrólisis en condiciones ácidas suaves, es decir, en condiciones ácidas mucho menos severas que las requeridas para acetaldehído PEG o propionaldehído PEG. Tales condiciones suaves permiten la conjugación directa in situ de los derivados poliméricos de la invención con proteínas, péptidos u otras dianas moleculares sin requerir una etapa de aislamiento intermedio. Los alcanales poliméricos de la invención también se preparan con alta pureza, lo que los hace particularmente ventajosos para acoplarse a fármacos y productos biofarmacéuticos para proporcionar composiciones conjugadas poliméricas que tienen una pureza suficiente para su administración a un sujeto mamífero.
Más particularmente, en un ejemplo, se describe en el presente documento un polímero soluble en agua que tiene la estructura:
Figure imgf000005_0001
En la estructura anterior, POLY representa un segmento de polímero soluble en agua; X' es un resto enlazador; z' es un número entero de 1 a aproximadamente 21; R1, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; y R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido.
En algunos casos, los alcanales poliméricos de la invención poseerán determinadas características. Por ejemplo, de acuerdo con una realización de la invención, cuando POLY es lineal: (a) el número total de carbonilos (excluyendo/sin contar el carbono del carbonilo del aldehído) presentes en el polímero es 0 o 2 o más, excepto cuando X' comprende uno o más segmentos (-CH2CH2O-) o (-CH2CH2NH-) contiguos. Cuando X 'comprende uno o más segmentos contiguos (-CH2CH2O-) o (-CH2CH2NH-), entonces el número total de carbonilos presentes en el polímero es 0 , 1 , 2 o mayor.
En otro ejemplo, cuando X 'es oxígeno o comprende al menos un segmento (-CH2CH2O-) y z' es de 2 a 12, entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos una aparición es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o el polímero es heterobifuncional, donde POLY comprende un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxilo.
Los alcanales poliméricos proporcionados en el presente documento pueden poseer cualquiera de una serie de geometrías o estructuras generales, que se describirán con mayor detalle en el presente documento. Preferentemente, cuando POLY es ramificado, entonces (i) al menos uno de R1 o R2 en al menos una aparición es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o (ii) X' incluye -(CH2CH2O)b- donde b es de 1 a 20 en el caso donde POLY comprende un residuo de lisina. Como alternativa, cuando POLY es ramificada y posee dos brazos de polímero, entonces ninguno de los brazos del polímero comprende oxígeno como único heteroátomo en el caso donde POLY comprende "C-H" como punto de ramificación.
En términos generales, los alcanales poliméricos de la invención poseen una estructura en la que z' cae dentro de uno de los siguientes intervalos: z' es de aproximadamente 3 a 12, de aproximadamente 3 a 8 , o de 3 a aproximadamente 6. También se describen en el presente documento alcanales poliméricos en donde z' es de aproximadamente 2 a 2 1.
En una realización particular de la invención, el polímero tiene la estructura:
Figure imgf000005_0002
I-A
donde POLY, X', cada R1 y cada R2 son como se han definido anteriormente. En la estructura precedente, C1 indica el aldehído carbonil carbono; C2 indica el carbono adyacente o a (alfa) al carbono carbonilo o C1; C3 indica el átomo de carbono una vez retirado del carbono carbonilo o en la posición p (beta); y C4 indica el átomo de carbono en la posición y. Los alcanales poliméricos que tienen la estructura global representada por I-A se denominan generalmente en el presente documento butanales poliméricos. En variaciones preferidas de la fórmula I-A anterior, R1 unido a C2 es alquilo, y todas las demás variables R1 y R2 son H. Preferentemente, el R1 unido a C2 es alquilo inferior. Como alternativa, el alcanal polimérico corresponde a la estructura I-A anterior, donde el R1 unido a C3 es alquilo, y todas las demás variables R1 y R2 son H. En otra realización preferida más, el alcanal polimérico se describe mediante la estructura I-A donde el R1 unido a C4 es alquilo, y todas las demás variables de R1 y R2 son H. Aún en otra realización particular, un alcanal polimérico de la invención corresponde a la fórmula I y posee un átomo de carbono adicional en la cadena de alquileno en comparación con la estructura I-A. En esta realización (véase la estructura I-B en el presente documento), z' es 4, el R1 unido a C2 es alquilo, y todas las demás variables R1 y R2 son H. Alternativamente, el R1 unido a C3 o C4 es alquilo, y todas las demás variables R1 y R2 son H.
Aún en otra realización particular que cae dentro de la fórmula I, z' es 5, el R1 unido a C2 es alquilo, y todas las demás variables R1 y R2 son H (véase la estructura I-C en el presente documento). Como alternativa, una de las variables R1 unidas a C3 o C4 o C5 es alquilo, y todas las demás variables R1 y R2 son H.
El alcanal polimérico de acuerdo con la fórmula I, en ciertas realizaciones, posee un resto enlazador descrito generalmente por la fórmula: -(CH2)c-De-(CH2)f- o -(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-, donde c varía de cero a 8; D es O, NH o S; e es 0 o 1; f varía de cero a 8; p varía de cero a 8; M es -NH u O; K es NH u O; q varia de cero a 8 y r y s son cada uno independientemente 0 o 1. Los enlazadores específicos que caen dentro de esta fórmula general se describen con mayor detalle a continuación.
El resto enlazador puede incluir opcionalmente un segmento oligomérico correspondiente a la estructura -(CH2CH2O)b- o -(CH2CH2NH)g-, donde b y g son cada uno independientemente 1 a 20. Preferentemente, b y g varían cada uno independientemente de aproximadamente 1 a 10, e incluso más preferentemente varían de aproximadamente 1 a aproximadamente 6. Estos enlazadores oligoméricos proporcionan estabilidad adicional a los alcanales de la invención y también proporcionan ventajas en la metodología sintética para preparar los polímeros, que se describirán con más detalle a continuación.
Más particularmente, en determinadas realizaciones, X' comprende un resto correspondiente a la estructura: -(CH2)c-De-(CH2)f-P- o -(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-T-, donde P y T son cada uno independientemente -(CH2CH2O)b- o -(CH2CH2NH)g y b y g varían cada uno independientemente de 1 a aproximadamente 20. En una realización específica de un alcanal polimérico de acuerdo con la fórmula I, X' comprende — C(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)- o — NHC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-.
Preferentemente, el segmento de polímero soluble en agua de un ancanal polimérico de la invención es un poli(óxido de alquileno), una poli(vinil pirrolidona), un poli(alcohol vinílico), una polioxazolina, una poli(acriloilmorfolina) o un poli(poliol oxietilado). En una realización preferida, el segmento de polímero es un poli(óxido de alquileno), preferentemente poli(etilenglicol).
De acuerdo con una realización, el segmento de poli(etilenglicol) comprende la estructura: Z-(CH2CH2O)n- o Z-(CH2CH2OVCH2CH2-, donde n varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000 y Z es un resto que comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en hidroxi, amino, éster, carbonato, aldehído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, hidrazida, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, lípido, fosfolípido, biotina y fluoresceína.
Como alternativa, POLY puede terminalmente, tener un resto con caperuza terminal, tal como alcoxi, alcoxi sustituido, alqueniloxi, alqueniloxi sustituido, alquiniloxi, alquiniloxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido. Los grupos con caperuza terminal repetidos incluyen metoxi, etoxi y benciloxi.
En general, POLY posee una masa molecular promedio nominal que se encuentra dentro de uno de los siguientes intervalos: de aproximadamente 100 daltons a aproximadamente 100.000 daltons, de aproximadamente 1.000 daltons a aproximadamente 50.000 daltons, o de aproximadamente 2.000 daltons a aproximadamente 30.000 daltons. Las masas moleculares preferidas para POLY incluyen 250 daltons, 500 daltons, 750 daltons, 1 kDa, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa y 50 kDa o incluso mayor.
Aún en otra realización particular, el alcanal polimérico de la invención comprende la estructura:
Figure imgf000006_0001
en donde POLY, cada X', cada (z'), cada R1 y cada R2 son como se han definido previamente. En una realización específica, POLY es lineal y el polímero es homobifuncional.
Como se ha indicado anteriormente, el segmento de polímero dentro del alcanal polimérico puede poseer cualquiera de varias geometrías, tales como lineal, ramificada, bifurcada, de múltiples brazos o dendrítica, que se describirán con mayor detalle a continuación.
Las realizaciones específicas de la invención incluyen alcanales poliméricos correspondientes a las siguientes estructuras:
Figure imgf000007_0001
En las estructuras anteriores, PEG es poli(etilenglicol), y b y g son cada uno independientemente de 0 a 20, a es de 0 a 6. Para las estructuras generalizadas proporcionadas en esta sección, las variables corresponden a los intervalos/valores proporcionados previamente a menos que se indique lo contrario.
En una realización específica, un alcanal polimérico de acuerdo con la invención corresponde a la estructura:
Figure imgf000007_0002
III-D
Un alcanal polimérico particularmente preferido que cae dentro de la estructura generalizada III-D posee la estructura:
Figure imgf000007_0003
También se describe en el presente documento una composición que comprende un polímero soluble en agua que tiene la estructura:
Figure imgf000007_0004
donde la composición está ausente, cantidades detectables de especies que contienen yodo o productos de reacción de tipo retro-Michael. Esto es particularmente ventajoso, ya que las especies que contienen yodo pueden conducir a la degradación de las cadenas de poli(etilenglicol) debido a la rotura de la cadena, lo que da como resultado un producto polimérico que tiene un valor de polidispersidad alto, por ejemplo, superior a aproximadamente 1,2. Preferentemente, un alcanal polimérico de la invención poseerá un valor de polidispersidad de menos de aproximadamente 1,2, preferentemente menos de aproximadamente 1,1, e incluso más preferentemente menos de aproximadamente 1,05. Incluso más preferidos son los alcanales poliméricos tales como los descritos en el presente documento caracterizados por una polidispersidad de 1,04, 1,03 o menos.
También se describe en el presente documento una composición que comprende un polímero soluble en agua que tiene la estructura:
Figure imgf000008_0001
donde POLY es un segmento de polímero soluble en agua lineal, terminalmente tiene una caperuza terminal y la composición carece de cantidades detectables de derivado de polímero de dialdehído.
Una característica adicional de los alcanales poliméricos de la invención es su estabilidad, por ejemplo, la estabilidad en almacenamiento, en comparación con otras composiciones de polímero aldehído conocidas. Por ejemplo, en el presente documento se proporciona una composición de ancanal polimérico que exhibe un 10% o menos de degradación del grupo aldehído del polímero cuando se almacena a 40 °C durante 15 días, como se determina por RMN.
También se describe en el presente documento una composición que comprende un ancanal polimérico correspondiente a la siguiente estructura:
Figure imgf000008_0002
V II-A .
En otro ejemplo, de acuerdo con la estructura VII-A, POLY posee la estructura Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-, donde X es O, n varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 4.000, y Z comprende un grupo funcional, resto de direccionamiento, indicador, grupo de protección o similares.
Otra composición descrita en el presente documento comprende un polímero de acuerdo con la estructura:
Figure imgf000008_0003
VIII
En aún otro aspecto de la invención, se proporcionan formas hidrato o acetal de los alcanales poliméricos descritos anteriormente que comprenden realizaciones de la invención.
Los acetales de la invención incluyen dimetil acetal, dietil acetal, di-isopropil acetal, dibencil acetal, 2,2,2-tricloroetil acetal, bis(2-nitrobencil) acetal, S,S'-dimetil acetal, S,S'-dietil acetal y dioxolanos.
Más particularmente, una forma de acetal o hidrato de un ancanal polimérico de la invención se puede describir en general mediante la siguiente estructura:
Figure imgf000009_0001
donde Wa y Wb son cada uno independientemente O o S, y R3 y R4 son cada uno independientemente H, o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en metilo, etilo, isopropilo, bencilo, 1,1,1-tricloroetilo y nitrobencilo o cuando se toman juntos, son -(CH2)2- o -(CH2)3-, formando un anillo de 5 o 6 miembros cuando se considera junto con Wa, C1 y Wb. Los acetales poliméricos son precursores útiles de los alcanales de la invención y pueden hidrolizarse para producir un alcanal polimérico.
En una realización particular, se proporciona un polímero soluble en agua que tiene la estructura:
Figure imgf000009_0002
En la estructura IX-A, el alcanal es uno que tiene solo metileno o -(CH2)- carbonos que separan la porción de acetal o hidrato de aldehído de la molécula del enlazador, X'.
Además, la invención está dirigida a conjugados formados por reacción de un agente biológicamente activo con los alcanales poliméricos descritos en el presente documento, sus hidratos y/o los correspondientes alcanales.
Específicamente, la invención proporciona un conjugado que comprende la siguiente estructura:
Figure imgf000009_0003
en donde:
POLY es un segmento de polímero soluble en agua;
X' es un resto enlazador que comprende uno o más átomos que no son una extensión de uno o más monómeros del segmento de polímero soluble en agua;
z' es un número entero de 3 a 12;
R1, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido,
- "NH-agente biológicamente activo" representa un agente biológicamente activo que comprende un grupo amino, y además en el que se aplica lo siguiente:
- cuando POLY es lineal:
(a) el número total de carbonilos presentes en dicho polímero es 0 o 2 o mayor excepto cuando X 'comprende uno o más segmentos contiguos (-CH2CH2O-),
(b) y además en donde X' es oxígeno o comprende al menos un segmento (-CH2CH2O-), entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o dicho polímero es heterobifuncional, donde POLY comprende un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxi, y
- cuando POLY es ramificado:
(c) (i) al menos uno de R1 o R2 en al menos una aparición es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o (ii) X' incluye -(CH2CH2O)b- donde b es de 1 a 20 en el caso donde POLY comprende un residuo de lisina,
(d) y además en el que dicho POLY tiene 2 brazos de polímero, entonces ninguno de los brazos del polímero comprende oxígeno como único heteroátomo en el caso donde POLY comprende "C-H" como punto de ramificación, con la condición de que POLY-X'-[CR1R2]z'-CH2- no se obtenga a partir de uno de los siguientes:
Figure imgf000010_0001
OHC-(CH2)1-3NH-C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10.10000-CH2CH2-O-(CH2)1-17-C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO OHC-(CH2)1-3NH-C(O)-(CH2)1.17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10.10000-CH2CH2-NH-(CH2)1-17-C(O)-NH-(CH2)1.3-CHO OHC-(CH2)1-3NH-C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10.1000ü-CH2CH2-OC(O)-NH-(CH2)1-3-CHO, y
OHC-(CH2)1-3NH-C(O)-(CH2)1-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)1ü-10üüü-CH2CH2-NH-C(O)-NH-(CH2)1-3-CHO
donde R es un grupo con caperuza terminal y Z es una cadena lateral de un aminoácido.
También se describen en el presente documento hidrogeles formados a partir de los alcanales poliméricos descritos en la presente memoria o sus precursores.
De acuerdo con otro ejemplo más, se describen en el presente documento reactivos de aldehídos protegidos. Estos reactivos de aldehído protegido son particularmente útiles para formar los alcanales poliméricos de la invención, y corresponden generalmente a las siguientes estructuras:
Figure imgf000011_0001
donde G es un grupo funcional, y el resto de variables tienen los valores establecidos anteriormente.
En determinados ejemplos de las estructuras XI-A, B y C, G es un grupo saliente, tal como cloruro, bromuro, paratolilsulfonato éster, metilsulfonil éster, trifluorosulfonil éster y trifluoroetilsulfonil éster.
Como alternativa, G es un grupo funcional seleccionado entre el grupo que consiste en -OH, -NH2, -SH y formas protegidas de los mismos.
También se describe en este documento un método para preparar un alcanal polimérico soluble en agua, opcionalmente en forma protegida. Brevemente, el método incluye las etapas de hacer reaccionar un polímero soluble en agua que comprende al menos un grupo reactivo, Y, con un alcanal protegido que comprende de aproximadamente 2 a 20 átomos de carbono y un grupo reactivo, K, adecuado para el desplazamiento por, o alternativamente, la reacción con Y, en condiciones efectivas para formar un alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida. En este método, un polímero activado se acopla a un reactivo que lleva la porción alcalina del producto final, o un precursor del mismo.
Preferentemente, la reacción se realiza en una atmósfera inerte.
En un ejemplo específico, se prepara POLY-Y mediante polimerización directa.
El método también puede incluir la etapa adicional de hidrolizar el alcanal polimérico soluble en agua protegido, por ejemplo, en condiciones ácidas, para formar el alcanal polimérico soluble en agua correspondiente.
En un ejemplo preferido, la etapa de hidrolización se lleva a cabo a un pH no inferior a aproximadamente 3.
Las formas protegidas del reactivo alcanal para llevar a cabo el método incluyen acetales tales como dimetil acetal, dietil acetal, di-isopropil acetal, dibencil acetal, 2,2,2-tricloroetil acetal, bis(2-nitrobencil) acetal, S,S'-dimetil acetal y S,S'-dietil acetal, acetales cíclicos y tioacetales cíclicos.
En otro ejemplo más, el ancanal polimérico así producido se recupera elevando el pH de la mezcla de reacción de aproximadamente 6,0 a 7,5, extrayendo el alcanal polimérico en un disolvente orgánico y retirando el disolvente. En un ejemplo del método, el polímero soluble en agua corresponde a la estructura, "POLY-Y" y el reactivo alcanal protegido corresponde a la estructura:
Figure imgf000012_0001
Preferentemente, POLY comprende un poli(etilenglicol) que terminalmente, puede o no tener una caperuza terminal.
En un ejemplo particular del método, POLY-Y comprende la estructura Z-(CH2CH2O)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z se selecciona entre el grupo que consiste en — OCH3, -OCH2CH3 y -OCH2(CaH5). En una realización adicional, POLY-Y comprende la estructura Z-(CH2CH2O)nCH2CH2O" M+, donde
POLY-Y se prepara mediante polimerización aniónica con apertura de anillo de óxido de etileno en una sal de alcoholato con caperuza terminal, tales como Z-CH2CH2O- M+, preparado por metalación del grupo -OH terminal de Z-CH2CH2OH con una base fuerte. M+ representa un contraión metálico, tal como Na+, K+, Li+, Cs+, Rb+. El POLY-Y así preparado es adecuado para la reacción con un reactivo alcanal protegido como se describió anteriormente.
En otro ejemplo más, el alcanal recuperado carece de cantidades detectables de POLY-Y sin reaccionar (por ejemplo, Z-(CH2CH2O)nH) y productos de reacción de tipo retro-Michael.
En otro ejemplo más del método, POLY-Y corresponde a PEG-diol, es decir, POLY-Y posee la estructura HO-(CH2CH2O)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4.000, K se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000012_0002
y el método da como resultado la formación de un alcanal polimérico protegido que tiene la estructura:
Figure imgf000012_0003
r 4o - -C— -c — — n— - - ----- OR4
H | I H
L
R2 R 129
L -Iz' 1—
XII
En otro ejemplo más del método, POLY-Y comprende la estructura Z-(CH2CH2O)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4.000 y Z es hidroxilo protegido. En este caso, una realización preferida del método incluye desproteger el hidroxilo protegido después de la etapa de reacción, seguido opcionalmente por la conversión del hidroxilo terminal del poli(etilenglicol) en un grupo funcional distinto del hidroxilo.
Los grupos funcionales ejemplares incluyen amino, éster, carbonato, aldehído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida y silano. Preferentemente, el grupo funcional se selecciona entre el grupo que consiste en N-hidroxisuccinimidil éster, carbonato de benzotriazolilo, amina, amina protegida, vinilsulfona y maleimida.
De acuerdo con otro ejemplo más, "Y" en POLY-Y es un grupo ionizable o es un derivado de un grupo ionizable, tal como un ácido carboxílico, éster activo o amina. Preferentemente, POLY-Y se ha purificado cromatográficamente antes de su uso en la etapa de reacción. En una realización particular, POLY-Y se purifica antes de su uso mediante cromatografía de intercambio iónico. De manera ideal, al POLY-Y purificado cromatográficamente para uso en la etapa de reacción está esencialmente ausente de cantidades detectables de impurezas poliméricas. En una de tales realizaciones de este método, POLY-Y tiene caperuza terminal en los extremos y está esencialmente ausente de cantidades detectables de PEG-diol o impurezas de PEG difuncionales.
Como alternativa, al practicar el método descrito en el presente documento, el reactivo alcanal comprende la estructura:
Figure imgf000013_0003
donde g y b varían cada uno independientemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 20. Como ejemplo, un reactivo alcanal preferido corresponde a la estructura:
Figure imgf000013_0001
XI-H
y el producto de la etapa de reacción posee la estructura generalizada:
Figure imgf000013_0002
En otro enfoque más para preparar un alcanal polimérico de la invención, un alcanal polimérico como se describe en el presente documento se prepara construyendo el segmento de polímero directamente sobre un precursor de acetal, por ejemplo, mediante polimerización directa. Más específicamente, este método comprende las etapas de:
(i) proporcionar un precursor de acetal que comprende al menos un sitio aniónico activo adecuado para iniciar la polimerización,
(ii) poner en contacto el sitio aniónico del precursor acetal con un monómero reactivo capaz de polimerizar, para iniciar así la polimerización del monómero reactivo sobre el precursor acetal,
(iii) como resultado de dicha etapa de contacto, añadiendo monómeros reactivos adicionales al precursor de acetal para formar una cadena de polímero,
(iv) permitir que dicho contacto continúe hasta que se alcance la longitud deseada de la cadena de polímero, y (v) terminar la reacción para conseguir un polímero aldehído precursor de la invención.
El precursor de aldehído polimérico resultante se puede hidrolizar adicionalmente al alcanal correspondiente como se ha expuesto anteriormente, si se desea.
En un ejemplo particular del método anterior, el monómero reactivo es óxido de etileno y el sitio aniónico reactivo contenido dentro del precursor acetal es un anión alcóxido (0 -), preferentemente acompañado por un metal alcalino u otro contraión adecuado. El grupo terminal alcóxido presente en el precursor de acetal es activo para la polimerización por apertura de anillo aniónico de óxido de etileno para formar un ancanal polimérico de la invención. El precursor de acetal generalmente poseerá una estructura correspondiente a:
Figure imgf000014_0001
donde las variables poseen los valores descritos anteriormente, con la excepción de que X 'termina en un anión oxígeno, u O" (por ejemplo, en su forma neutra, X' normalmente termina en un grupo hidroxilo u -OH, que en presencia de una base fuerte, se convierte en la correspondiente sal de alcóxido). Las contraiones adecuadas incluyen Na+, K+, Li+ y Cs+. La etapa de terminación generalmente comprende neutralizar la reacción, por ejemplo, mediante la adición de ácido. Opcionalmente, el segmento de polímero se puede tapar mediante la adición de un reactivo alquilante u otro reactivo adecuado para proporcionar un extremo no reactivo.
Estos y otros objetos y características de la invención resultarán más evidentes cuando se lean junto con la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de la figura
FIG. 1 es un esquema de reacción general para preparar un ancanal polimérico de la invención mediante polimerización por apertura de anillo aniónico de óxido de etileno (EO) en un precursor acetal que tiene un sitio aniónico.
Descripción detallada de la invención
Cabe señalar que, como se usa en esta memoria descriptiva, las formas singulares "un/a" y "el/la" incluyen las referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a un "polímero" incluye un solo polímero así como dos o más polímeros iguales o diferentes, la referencia a un "conjugado" se refiere a un solo conjugado, así como a dos o más conjugados iguales o diferentes, la referencia a un "excipiente" incluye un solo excipiente así como dos o más excipientes iguales o diferentes, y similares.
Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones descritas a continuación.
Definiciones
Los siguientes términos, tal como se usan en el presente documento, tienen los significados indicados.
Tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el/la", incluyen las referencias en plural salvo que el contexto indique claramente lo contrario.
"PEG" o "poli(etilenglicol)", como se usa en el presente documento, pretende abarcar cualquier poli(óxido de etileno) soluble en agua. Normalmente, los PEG para su uso en la presente invención comprenderán una de las dos estructuras siguientes: "-(CH2CH2O)n-" o "-(CH2CH2O)n-iCH2CH2-", dependiendo de si el o los oxígenos terminales se han desplazado o no, por ejemplo, durante una transformación sintética. La variable (n) es de 3 a 3.000, y los grupos de terminales y la arquitectura del PEG general pueden variar. Cuando el PEG comprende además un resto enlazador (que se describirá con mayor detalle a continuación), los átomos que comprenden el enlazador (X'), cuando se unen covalentemente a un segmento de PEG, no dan como resultado la formación de (i) un enlace oxígeno-oxígeno (-O-O-, un enlace peróxido), o (ii) un enlace nitrógeno-oxígeno (N-O, O-N). "PEG" significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del 50%, de subunidades que son -CH2CH2O-. Los PEG para usar en la invención incluyen PEG que tienen una variedad de pesos moleculares, estructuras o geometrías (por ejemplo, PEG ramificados, lineales, bifurcados, dendríticos y similares), que se describirán con mayor detalle a continuación.
"Soluble en agua", en el contexto de un polímero de la invención o un "segmento de polímero soluble en agua" es cualquier segmento o polímero que sea soluble en agua a temperatura ambiente. Normalmente, un polímero o segmento soluble en agua transmitirá al menos aproximadamente el 75%, más preferentemente al menos aproximadamente el 95% de la luz, transmitida por la misma solución después de la filtración. En base al peso, un polímero soluble en agua o un segmento del mismo será preferentemente al menos aproximadamente un 35% (en peso) soluble en agua, más preferentemente al menos aproximadamente un 50% (en peso) soluble en agua, aún más preferentemente aproximadamente un 70%. (en peso) soluble en agua, y aún más preferentemente alrededor del 85% (en peso) soluble en agua. Sin embargo, lo más preferido es que el polímero o segmento soluble en agua sea aproximadamente 95% (en peso) soluble en agua o completamente soluble en agua.
Un grupo "con caperuza terminal" o "de caperuza terminal" es un grupo inerte presente en un extremo de un polímero tal como PEG. Un grupo con caperuza terminal es aquel que no se somete fácilmente a una transformación química en las condiciones típicas de reacción sintética. Un grupo con caperuza terminal es generalmente un grupo alcoxi, -OR, donde R es un radical orgánico compuesto por 1-20 carbonos y es preferentemente alquilo inferior (por ejemplo, metilo, etilo) o bencilo. "R" puede estar saturado o insaturado, e incluye arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo y formas sustituidas de cualquiera de los anteriores. Por ejemplo, un PEG con caperuza terminal comprenderá normalmente la estructura "RO-(CH2CH2O)n-", donde R es como se ha definido anteriormente. Como alternativa, el grupo con caperuza terminal también puede comprender ventajosamente un marcador detectable. Cuando el polímero tiene un grupo con caperuza terminal que comprende un marcador detectable, la cantidad o ubicación del polímero y/o el resto (por ejemplo, agente activo) al que está acoplado el polímero, puede determinarse usando un detector adecuado. Tales marcadores incluyen, sin limitación, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscentes, restos usados en marcadores de enzimas, colorimétrico (por ejemplo, tintes), iones metálicos, restos radioactivos y similares.
"De origen no natural" con respecto a un polímero de la invención significa un polímero que en su totalidad no se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, un polímero de la invención de origen no natural puede contener una o más subunidades o segmentos de subunidades de origen natural, siempre que la estructura general del polímero no se encuentre en la naturaleza.
"Masa molecular" en el contexto de un polímero soluble en agua de la invención, como PEG, se refiere a la masa molecular promedio nominal de un polímero, normalmente determinada por cromatografía de exclusión por tamaño, técnicas de dispersión de luz o determinación de la velocidad intrínseca en 1,2,4-triclorobenceno. Los polímeros de la invención son normalmente polidispersos, que poseen valores de polidispersidad bajos de menos de aproximadamente 1 ,2 0.
El término "reactivo" o "activado" cuando se usa junto con un grupo funcional particular, se refiere a un grupo funcional que reacciona fácilmente con un electrófilo o nucleófilo, normalmente presente en otra molécula, para experimentar una transformación. Esto contrasta con los grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción duras para reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte").
El término "protegido" o "grupo protector" o "grupo de protección" se refiere a la presencia de un resto (es decir, el grupo protector) que previene o bloquea la reacción de un grupo funcional químicamente reactivo particular en una molécula bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se esté protegiendo así como de las condiciones de reacción a emplear y la presencia de grupos reactivos o protectores adicionales en la molécula, si los hay. Los grupos protectores conocidos en la técnica se pueden encontrar en Greene, T.W., et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3a ed., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY (1999).
Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo pretende abarcar formas protegidas del mismo.
La expresión "resto enlazador" se usa en el presente documento para referirse a un átomo o una colección de átomos que se usan opcionalmente para unir restos de interconexión, tales como un segmento de polímero y un alcanal. Los restos enlazadores de la invención pueden ser hidrolíticamente estables o pueden incluir un enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable.
Un enlace "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" o "degradable" es un enlace relativamente débil que reacciona con el agua (es decir, se hidroliza) en condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependerá no solo del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales, sino también de los sustituyentes unidos a estos átomos centrales. Los enlaces débiles o hidrolíticamente inestables apropiados incluyen, pero no se limitan a, éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acetales, cetales, aciloxialquilo éter, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos.
Un "enlace enzimáticamente degradable" significa un enlace que está sujeto a degradación por una o más enzimas. Un enlace o enlace "hidrolíticamente estable" se refiere a un enlace químico, normalmente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua, es decir, no sufre hidrólisis en condiciones fisiológicas en ningún grado apreciable durante un período de tiempo prolongado. Los ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen, entre otros, los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretanos y similares. En general, un enlace hidrolíticamente estable es uno que exhibe una tasa de hidrólisis de menos de aproximadamente 1-2% por día en condiciones fisiológicas. Las tasas de hidrólisis de enlaces químicos representativos se pueden encontrar en la mayoría de los libros de texto de química estándar.
"Alcanal" se refiere a la porción de aldehído de un polímero soluble en agua de la invención (CHO), incluido el carbono carbonilo y cualquier metilenos o metilenos sustituidos adicionales (-C(R1)(R2)- hasta el resto enlazador que conecta la porción alcanal del polímero al segmento de polímero. Al nombrar un segmento alcanal, C1 corresponde al carbono carbonilo. El término "alcanal" como se usa en el presente documento pretende abarcar formas hidratadas y protegidas del grupo aldehído, así como análogos de calcógeno. Una forma protegida particularmente preferida de un alcano de la invención es un acetal.
"Número total de carbonilos", en referencia a ciertos alcanales poliméricos de la invención, es el número total de grupos carbonilo contenidos en el alcanal polimérico, sin contar el o los carbonos del aldehído.
"Ramificado" en referencia a la geometría o estructura general de un polímero se refiere a un polímero que tiene 2 o más "brazos" de polímero. Un polímero ramificado puede poseer 2 brazos de polímero, 3 brazos de polímero, 4 brazos de polímero, 6 brazos de polímero, 8 brazos de polímero o más. Un tipo particular de polímero altamente ramificado es un polímero dendrítico o dendrímero, que para los fines de la invención se considera que posee una estructura distinta de la de un polímero ramificado.
"Punto de ramificación" se refiere a un punto de bifurcación que comprende uno o más átomos en el que un polímero se divide o ramifica desde una estructura lineal en uno o más brazos de polímero adicionales.
Un "dendrímero" es un polímero monodisperso de tamaño globular en el que todos los enlaces emergen radialmente desde un punto focal central o núcleo con un patrón de ramificación regular y con unidades repetidas que cada una aporta un punto de ramificación. Los dendrímeros exhiben ciertas propiedades de estado dendrítico, como la encapsulación del núcleo, lo que los hace únicos de otros tipos de polímeros.
"Sustancialmente" o "esencialmente" significa casi total o completamente, por ejemplo, el 95% o más de una determinada cantidad.
Un "producto de tipo retro-Michael" se refiere a un producto que surge del reverso de una reacción de adición de tipo Michael. Una reacción de adición de Michael (dirección directa) se refiere a la adición de una especie de carbono nucleófilo a un doble enlace electrófilo. Normalmente, pero no necesariamente, el nucleófilo es un enolato o una enamina, aunque el nucleófilo también puede ser un alcóxido o una amina u otra especie. El electrófilo es normalmente una cetona, éster o nitrilo alfa, beta-insaturado, aunque otros grupos captadores de electrones también pueden activar un doble enlace carbono-carbono al ataque nucleofílico. Un producto que surge de la dirección inversa (o inversa) de una adición de tipo Michael como se describió anteriormente, es decir, una reacción de eliminación que resulta en la pérdida de una especie de carbono nucleofílico (que puede ser, pero no necesariamente, un enolato o enamina) y la formación de un doble enlace electrófilo tal como una cetona alfa, beta insaturada o similar como se describe anteriormente se considera un producto de tipo retro-Michael. Por ejemplo, una reacción de tipo retro-Michael de mPEG-propionaldehído da como resultado productos de tipo retro-Michael, mPEG-OH y acroleína (CH2=CH-CHO).
"Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, normalmente que varía entre aproximadamente 1 y 20 átomos de longitud. Tales cadenas de hidrocarburos están preferentemente, pero no necesariamente, saturadas y pueden ser de cadena lineal o ramificada, aunque se prefiere normalmente de cadena lineal. Los grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1 -metilbutilo, 1-etilpropilo, 3-metilpentilo y similares. Como se usa en el presente documento, "alquilo" incluye cicloalquilo cuando se hace referencia a tres o más átomos de carbono.
"Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y puede ser de cadena lineal o ramificada, como se ejemplifica por metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo.
"Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclico saturado o insaturado, que incluye compuestos con puentes, condensados o espirocíclicos, preferentemente compuesto de 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferentemente de 3 a aproximadamente 8.
Los "sustituyentes que no interfieren" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, normalmente no son reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula.
El término "sustituido" como en, por ejemplo, "alquilo sustituido", se refiere a un resto (por ejemplo, un grupo alquilo) sustituido con uno o más sustituyentes que no interfieren, tales como, pero sin limitación: cicloalquilo C3-C8, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo y similares; halo, por ejemplo, flúor, cloro, bromo y yodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior; fenilo sustituido; y similares. Para sustituciones en un anillo de fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para).
"Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, en donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferentemente alquilo CrC20 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, bencilo, etc.), preferentemente C1-C7.
Como se usa en el presente documento, "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado ramificado o no ramificado de 1 a 15 átomos de longitud, que contiene al menos un doble enlace, tal como etenilo, n-propenilo, isopropenilo, nbutenilo, isobutenilo, octenilo, decenilo, tetradecenilo y similares.
El término "alquinilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo hidrocarbonado ramificado o no ramificado de 2 a 15 átomos de longitud, que contiene al menos un triple enlace, etinilo, n-propinilo, isopropinilo, nbutinilo, isobutinilo, octinilo, decinilo y así sucesivamente.
"Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 o 6 átomos de carbono centrales. Arilo incluye múltiples anillos de arilo que pueden estar fusionados, como en naftilo, o no fusionados, como en bifenilo. Los anillos de arilo también pueden estar condensados o no fusionados con uno o más anillos cíclicos de hidrocarburos, heteroarilos o heterocíclicos. Como se usa en el presente documento, "arilo" incluye heteroarilo.
"Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos, preferentemente N, O o S o una combinación de los mismos. Los anillos heteroarilo también se pueden fusionar con uno o más anillos hidrocarbonados cíclicos, heterocíclicos, arilo o heteroarilo.
"Heterociclo" o "heterocíclico" significa uno o más anillos de 5-12 átomos, preferentemente 5-7 átomos, con o sin insaturación o carácter aromático y que tiene al menos un átomo de anillo que no es un carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxígeno y nitrógeno.
"Heteroarilo sustituido" es heteroarilo que tiene uno o más grupos que no interfieren como sustituyentes.
"Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas a partir de sustituyentes que no interfieren.
"Electrófilo" se refiere a un ion, átomo o colección de átomos que puede ser iónico, que tiene un centro electrófilo, es decir, un centro que busca electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo.
"Nucleófilo" se refiere a un ion o átomo o colección de átomos que pueden ser iónicos, que tienen un centro nucleófilo, es decir, un centro que busca un centro electrófilo y que puede reaccionar con un electrófilo.
Un "agente activo", como se usa en el presente documento, incluye cualquier agente, fármaco, compuesto, composición de materia o mezcla, que proporcione algún efecto farmacológico, a menudo beneficioso, que pueda demostrarse in vivo o in vitro. Esto incluye alimentos, complementos alimenticios, nutrientes, nutracéuticos, fármacos, vacunas, anticuerpos, vitaminas y otros agentes beneficiosos. Como se usa en el presente documento, estos términos incluyen además cualquier sustancia fisiológica o farmacológicamente activa que produzca un efecto localizado o sistémico en un paciente.
Las expresiones "excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable", se refieren a un excipiente que puede incluirse en las composiciones de la invención y que no causa efectos toxicológicos adversos significativos al paciente.
Las expresiones "cantidad farmacológicamente eficaz", "cantidad fisiológicamente eficaz", y "cantidad terapéuticamente eficaz", se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a la cantidad de un conjugado de agente activo con PEG, presente en una preparación farmacéutica, que es necesaria para proporcionar un nivel deseado de agente activo y/o conjugado en el torrente circulatorio o en el tejido diana. La cantidad exacta dependerá de numerosos factores, por ejemplo, del agente activo particular, de los componentes y de las características físicas de la preparación farmacéutica, de la población de pacientes prevista, de aspectos relacionados con el paciente, y factores similares, y puede determinarla fácilmente un experto en la materia, basándose en la información proporcionada en el presente documento y disponible en la bibliografía pertinente. En el contexto de un polímero de la invención, "multifuncional" significa una cadena principal polimérica que tiene, en su interior, 3 o más grupos funcionales, donde los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes, y normalmente están presentes en los extremos del polímero. Los polímeros multifuncionales de la invención contendrán normalmente de aproximadamente 3-100 grupos funcionales, o de 3-50 grupos funcionales, o de 3-25 grupos funcionales, o de 3-15 grupos funcionales, o de 3 a 10 grupos funcionales, o contendrán 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 grupos funcionales en la cadena principal polimérica.
Un polímero "difuncional" significa un polímero que tiene dos grupos funcionales contenidos en su interior, normalmente en los extremos del polímero. Cuando los grupos funcionales son iguales, se dice que el polímero es homodifuncional. Cuando los grupos funcionales son diferentes, se dice que el polímero es heterobifuncional Un reactivo básico o ácido descrito en el presente documento incluye grupos neutros, cargados, y cualquiera de sus formas salinas correspondientes.
"Alcohol poliolefínico" se refiere a un polímero que comprende una cadena principal polimérica de olefina, tal como polietileno, que tiene múltiples grupos hidroxilo colgantes adheridos a la cadena principal polimérica. Un alcohol poliolefínico ilustrativo es el alcohol polivinílico.
Como se usa en el presente documento, "no peptídico" se refiere a una cadena principal polimérica que carece sustancialmente de enlaces peptídicos. Sin embargo, el polímero puede incluir un pequeño número de enlaces peptídicos separados a lo largo de las subunidades monoméricas repetidas, tal como, por ejemplo, no más de aproximadamente 1 enlace peptídico por aproximadamente 50 unidades monoméricas.
Como se usa en el presente documento, "hidrato" se refiere a un aldehído hidratado resultante de la adición de una molécula de agua al grupo aldehído, que sustituye la funcionalidad carbonilo por dos grupos hidroxilo. Los aldehídos alcanzan el equilibrio con el correspondiente hidrato en agua.
La expresión "análogo de calcógeno" se refiere a análogos de aldehído en los que el átomo de oxígeno se sustituye por otro heteroátomo, generalmente azufre, selenio o telurio.
El término "paciente", se refiere a un organismo vivo que padece una afección, o que es propenso a la misma, que puede prevenirse o tratarse mediante la administración de un polímero de la invención, normalmente, pero no necesariamente, en forma de un conjugado polímero-agente activo, e incluye tanto seres humanos como animales. "Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita posteriormente puede ocurrir o no, de modo que la descripción incluye casos en los que ocurre la circunstancia y casos en los que no.
EL POLÍMERO
En un primer aspecto, la invención proporciona un polímero soluble en agua que tiene un grupo aldehído reactivo. Los polímeros de la invención son exclusivos en muchos aspectos. No sólo se preparan con un alto rendimiento, sino que también son estables durante se almacenamiento debido a la ausencia de productos secundarios de reacción nocivos que pueden conducir a la degradación de la cadena polimérica y a una mala polidispersidad de la misma. Los polímeros, en particular polímeros con caperuza terminal (end-capped), se preparan adicionalmente con alta pureza, por ejemplo, sin cantidades detectables de derivados de PEG diol y otras impurezas poliméricas. Esta característica es particularmente ventajosa para preparar polímeros de PEG con caperuza terminal de alto peso molecular, por ejemplo, que tienen un peso molecular de aproximadamente 30 kDa o mayor, donde la cantidad de impurezas de p Eg diol en la materia prima, tal como el mPEG, puede variar entre aproximadamente el 2 % en peso y el 30 % en peso o mayor, dependiendo del proveedor. Por otro lado, en determinadas realizaciones, los polímeros de la invención son menos reactivos que otros aldehídos poliméricos conocidos, haciéndolos más discriminatorios en las reacciones de conjugación y más estables durante la transformación, manipulación y estudio de la reacción. CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES GENERALES Y PORCIÓN ALCANAL
En términos generales, el polímero de la invención posee un segmento de polímero conectado a de 3 a 12 metilenos contiguos o metilenos sustituidos que terminan en una función aldehído (es decir, la porción alcalina) mediante un resto enlazador interpuesto. Una estructura generalizada correspondiente al polímero de la invención se proporciona a continuación como Estructura I.
Figure imgf000018_0001
En referencia a la descripción anterior, cuando se ve junto con la estructura I, el segmento de polímero está representado por POLY, el resto enlazador está representado por X', y los metilenos contiguos (que forman una cadena de alquileno) o metilenos sustituidos (que forman una cadena de alquilenos sustituidos) están representados por -C(R1)(R2)-. Más específicamente, en la Estructura I, POLY es un segmento de polímero soluble en agua; X' es un resto enlazador; y z' es un número entero de 3 a 12. R1, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico, tal como alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. R2, en cada aparición, es también independientemente H o un radical orgánico, tal como del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Aunque muchas de las estructuras proporcionadas explícitamente en el presente documento son aldehídos, debe entenderse que estas mismas estructuras y, de hecho, la invención en su conjunto se pretende que se extiendan a los correspondientes hidratos de aldehido. También se describen los aldehidos en forma protegida y los análogos del calcógeno, donde el oxígeno del carbonilo en la estructura I se reemplaza por un azufre, selenio o telurio.
La presente invención proporciona una flexibilidad considerable con respecto al tamaño de la cadena de alquileno conectada al grupo aldehído. La longitud de la cadena de carbono se considera como el carbono del carbonilo (CI) más el número de átomos de carbono que intervienen, (por ejemplo, el número total de Cs que comprenden la porción [-C(R1)(R2)]z' del polímero), conectando el carbono carbonilo al enlazador. La longitud de la cadena de carbono es de 4 a aproximadamente 13 átomos de carbono. En referencia a la estructura I anterior, esto significa que el valor de z' varía de 3 a 12. Más explícitamente, el valor de z' es uno de los siguientes: 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12. Un alcanal polimérico particularmente preferido de la invención es uno donde z' es 3.
En referencia a la estructura I anterior, se prefieren particularmente determinados tipos de alcanales. Tales compuestos incluyen alcanales como se ha descrito anteriormente que tienen al menos un radical orgánico posicionado en al menos una "C" en la cadena de carbono. El radical orgánico puede ser cualquiera de los radicales orgánicos mencionados anteriormente, por ejemplo, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, prefiriéndose alquilo. Normalmente, el grupo alquilo es alquilo inferior de cadena lineal o alquilo inferior ramificado, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, secbutilo, pentilo, etc., prefiriéndose generalmente la cadena lineal. Un sustituyente alquilo particularmente preferido es metilo.
Aunque la porción alcalina del polímero puede poseer más de un radical orgánico posicionado en uno o más "C" en la cadena de carbono, un tipo de alcano preferido es aquel en el que solo una "C" en la cadena de carbono está sustituida con una radical orgánico y todos los demás R1 y R2 son H. Por ejemplo, independientemente de la longitud de la cadena de alquileno, se prefieren los alcanales donde todas las variables R1 y R2 son H, con la excepción de que: (i) uno de R1 o R2 posicionado en C-2 es alquilo, o (ii) uno de R1 o R2 posicionado en C-3 es alquilo; o (iii) uno de R1 o R2 posicionado en C-4 es alquilo; o (iv) uno de R1 o R2 posicionado en C-5 es alquilo y así sucesivamente. Un tipo de sustituyente particularmente preferido a este respecto es alquilo inferior tal como metilo, etilo o propilo. La síntesis de un alcano ilustrativo 2-metil sustituido de la invención, mPEG-2-metilbutiraldehído, se describe en el Ejemplo 17.
Centrándonos actualmente en la porción alcalina del polímero, a continuación se muestran determinados alcanos preferidos.
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La estructura I-A es aquella en la que el valor de z' de la estructura I es 3. Esta estructura, independientemente de si uno o más de C2, C3 o C4 está sustituido con un alquilo u otro radical orgánico como se describió anteriormente, se denomina en el presente documento "butiraldehído" o "butanal". Los butiraldehídos poliméricos ilustrativos de la invención incluyen aquellos donde la porción alcanal del polímero es 2-metilbutiraldehído, 3-metilbutiraldehído o 4-metilbutiraldehído, 2-etilbutiraldehído, 3-etilbutiraldehído o 4-etilbutiraldehído.
Figure imgf000019_0002
La estructura I-B es aquella en la que el valor de z' de la estructura I es 4. Esta estructura, independientemente de si uno o más de C2 , C3, C4 o C5 está sustituido con un alquilo u otro radical orgánico como se describió anteriormente, se denomina en el presente documento "pentanal" o "valeraldehído". Los pentanales poliméricos ilustrativos de la invención incluyen aquellos en los que la porción alcalina del polímero es 2-metilpentanal, 3-metilpentanal, 4-metilpentanal o 5-metil pentanal. Los pentanales de polímero adicionales incluyen aquellos en los que la porción alcalina del polímero es 2-etilpentanal, 3-etilpentanal, 4-etilpentanal o 5-etilpentanal.
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La estructura I-C es aquella en la que el valor de z' en la estructura I es 5. Esta estructura, independientemente de si uno o más de C2, C3, C4, C5 o C6 está sustituido con un alquilo u otro radical orgánico como se describió anteriormente, se denomina en el presente documento "hexanal". Los hexanales poliméricos ilustrativos de la invención incluyen aquellos en los que la porción alcanal del polímero es 2-metilhexanal, 3-metilhexanal, 4-metilhexanal, 5-metilhexanal, 6 -metilhexanal, 2-etilpentanal, 3-etilpentanal, 4-etilpentanal o 5-etilpentanal.
Los componentes alcanales adicionales de un polímero de la invención incluyen heptanos, octanales, nonanales y similares.
EL RESTO ENLAZADOR
Volviendo ahora al resto enlazador, un resto enlazador o simplemente "enlazador" de la invención está representado generalmente por la variable, X'. El resto enlazador es la parte del polímero total que une la parte alcalina del polímero con el segmento de polímero (que se describirá con mayor detalle a continuación). Un enlazador de la invención puede ser un solo átomo, tal como un oxígeno o un azufre, dos átomos o varios átomos. Un enlazador es normalmente, pero no necesariamente, de naturaleza lineal. La longitud total del enlazador variará normalmente entre 1 y aproximadamente 40 átomos, donde por longitud se entiende el número de átomos en una sola cadena, sin contar los sustituyentes. Por ejemplo, -CH2- cuenta como un átomo con respecto a la longitud total del enlazador, -CH2CH2O- cuenta como 3 átomos de longitud. Preferentemente, un enlazador tendrá una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 átomos.
Un enlazador de la invención puede ser un solo grupo funcional, tal como una amida, un éster, un uretano, o una urea, o puede contener metileno u otros grupos alquileno que flanquean cualquier lado del grupo funcional único. Como alternativa, un enlazador puede contener una combinación de grupos funcionales que pueden ser iguales o diferentes. Además, un enlazador de la invención puede ser una cadena de alquileno, que contiene opcionalmente uno o más átomos de oxígeno o azufre (es decir, un éter o tioéter). Los enlazadores preferidos son aquellos que son hidrolíticamente estables. Cuando se ve en el contexto de la estructura I, un enlazador es uno que cuando se considera como parte del polímero global, no da como resultado una estructura global que contenga un enlace peróxido (-O-O-) o un enlace -N-O- u -O-N-.
Los enlazadores ilustrativos, X', son los correspondientes a cualquiera de las siguientes estructuras:
-(CH2)c-De-(CH2)f-
o
-(CH2)p-MrC(O)-Ks-(CH2)q-
Al referirse a las estructuras de enlace anteriores, la variable "c" varía de cero a 8 ; "D" es O, NH o S; la variable "e" es 0 o 1; la variable "f' varía de cero a 8 ; la variable "p" varía de cero a 8 ; "M" es -NH u O; "K" es NH u O; la variable "q" varía de cero a 8 , y las variables "r" y "s" son cada una independientemente 0 o 1.
En el contexto de la estructura I, un enlazador de la invención, X', puede ser cualquiera de los siguientes: — O-, -NH-, -S-, -C(O)-, C(O)-NH, NH-C(O)-NH, O-C(O)-NH, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, grupo cicloalquilo bivalente, -N(R6)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j- y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, en donde (h) es de 0 a 6 , (j) es de 0 a 20, R6 es H o un radical orgánicos seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Otros enlazadores específicos tienen las estructuras: -C(O)NH-(CH2)i-6NH-C(O)- o -NHC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)- o -OC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-, donde los valores del subíndice que siguen a cada metileno indican el número posible de metilenos contenidos en la estructura del enlazador, por ejemplo, (CH2)1-6 significa que el enlazador puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 metilenos.
Para los fines de la presente descripción, sin embargo, una serie de átomos no se considera como un resto enlazador cuando la serie de átomos está inmediatamente adyacente a un segmento de polímero, POLY, y la serie de átomos no es más que otro monómero, de modo que el resto enlazador propuesto representaría una mera extensión de la cadena del polímero. Por ejemplo, dada la estructura parcial "POLY-X'-", donde POLY en este caso se define como "CH3O(CH2CH2O)n-", el resto enlazador no sería "-Ch2CH2O-" ya que tal definición simplemente representaría una extensión del polímero. Sin embargo, eso no quiere decir que un enlazador de la invención no pueda poseer una o más porciones -CH2CH2O- contiguas. Por ejemplo, un enlazador puede contener una o más subunidades (-CH2CH2O-) flanqueadas en uno o ambos lados por uno o una combinación de enlazadores ilustrativos como se proporcionó anteriormente.
Es decir, un enlazador como se describe anteriormente también puede incluir un oligómero, tal como -(CH2CH2O)b- o -(CH2CH2NH)g-, donde b y g varían cada uno independientemente de 1 a aproximadamente 20. Los solicitantes han descubierto que la inclusión de tales oligómeros dentro del enlazador puede dar estabilidad al producto alcanal polimérico final al extender la distancia entre la funcionalidad aldehído y cualquier grupo reactivo contenido dentro del enlazador. De esta forma, se desfavorecen las interacciones intramoleculares, lo que conduce a mayores rendimientos durante la preparación y una estabilidad mejorada del producto alcanal polimérico. Preferentemente, las variables b y g oscilan entre aproximadamente 1 y 1 0 , o en determinados casos, oscilan entre aproximadamente 1 y 6. La síntesis de un ancanal polimérico ilustrativo que tiene cuatro unidades contiguas -(CH2CH2O)- en el enlazador se describe en el Ejemplo 5.
A continuación se muestran ejemplos adicionales de enlazadores específicos que contienen segmentos oligoméricos -(CH2CH2O)b- o -(CH2CH2NH)g-, donde X' incluye o se define por la siguiente:
-(CH2)c-De-(CH2)f-P-o
-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-T-
En las estructuras ilustrativas anteriores, P y T son cada uno independientemente -(CH2CH2O)b- o -(CH2CH2NH)g, b y g son cada uno independientemente de 1 a 2 0 , y las variables restantes son como se han definido anteriormente. Ejemplos de enlazadores preferidos de este tipo son -O-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-, -C(O)-NH-(CH2CH2O)b-, -NH-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-, -O-C(O)-NH-(CH2CH2NH)g-, -C(O)-NH-(CH2CH2NH)g- y -NH-C(O)-NH-(CH2CH2NH)g-.
En determinados casos, por ejemplo, cuando POLY representa un segmento de polímero lineal, entonces preferentemente el número total de carbonilos presentes en el ancanal polimérico es 0 o 2 o mayor, donde el número total de carbonilos no incluye el aldehído carbonilo(s). Sin embargo, cuando el enlazador, X' incluye uno o más segmentos contiguos (-CH2CH2O-), entonces preferentemente el número total de carbonilos presentes en el ancanal polimérico es 0, 1, 2, 3 o mayor.
Volviendo a la estructura I, en otra realización preferida de la invención, cuando X 'es oxígeno o incluye al menos un segmento (-CH2CH2O-), y z' varía de 3 a 12, entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos al menos una aparición es un radical orgánico como se ha definido anteriormente, o de manera alternativa, el polímero es heterobifuncional. En tal caso donde el polímero es heterobifuncional, el segmento de polímero, POLY, posee preferentemente un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxi.
Preferentemente, el enlazador es hidrolíticamente estable y puede contener uno o más de los siguientes grupos funcionales: amida, uretano, éter, tioéter o urea. Sin embargo, enlaces hidrolíticamente degradables, tal como éster de carboxilato, éster de fosfato, ortoéster, anhídrido, imina, acetalo, cetal, oligonucleótido o péptido, también puede estar presente en un enlazador de la invención. Los enlazadores heteroátomos tales como O o S, son particularmente preferidos, al igual que los enlazadores que contienen segmentos oligoméricos -(CH2CH2O)b- o -(CH2CH2NH)g como se ha descrito anteriormente.
EL SEGMENTO POLÍMERO/POLÍMEROS PARA LA PREPARACIÓN DE UN ALCANAL POLÍMERO
Como se muestra en las estructuras ilustrativas anteriores, un ancanal polimérico de la invención contiene un segmento de polímero soluble en agua. Los POLY representativos incluyen poli(alquilenglicoles), tales como poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(ahidroxiácido), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina). POLY puede ser un homopolímero, un copolímero alterno, un copolímero aleatorio, un copolímero de bloques, un tripolímero alterno, un tripolímero aleatorio o un tripolímero de bloques de cualquiera de los anteriores. El segmento de polímero soluble en agua es preferentemente, aunque no necesariamente, un poli (etilenglicol) o "PEG" o un derivado del mismo.
El segmento de polímero puede tener cualquiera de varias geometrías diferentes, por ejemplo, POLY puede ser lineal, ramificado o bifurcado. Lo más normalmente, POLY es lineal o ramificado, por ejemplo, tiene 2 brazos de polímero. Aunque gran parte de la discusión en este documento se centra en PEG como un POLY ilustrativo, la discusión y las estructuras presentadas en este documento se pueden ampliar fácilmente para abarcar cualquiera de los segmentos poliméricos solubles en agua descritos anteriormente.
Puede usarse cualquier polímero soluble en agua que tenga al menos un extremo reactivo para preparar un ancanal polimérico de acuerdo con la invención y la invención no está limitada a este respecto. Aunque se pueden usar polímeros solubles en agua que tienen un solo término reactivo, los polímeros que tienen dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más extremos reactivos adecuados para la conversión a un ancanal polimérico como que se expone en el presente documento. De manera ventajosa, a medida que aumenta el número de hidroxilo u otros restos reactivos en el segmento de agua-polímero, aumenta el número de sitios disponibles para introducir un grupo alcanal. Los ejemplos no limitantes del límite superior del número de restos hidroxilo y/o reactivos asociados con el segmento de polímero soluble en agua incluyen 500, 100, 80, 40, 20 y 10.
Volviendo ahora al POLY preferido, PEG, "PEG" incluye poli(etilenglicol) en cualquiera de sus formas lineales, ramificadas o de brazos múltiples, incluyendo PEG con caperuza terminal, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG colgante y PEG que contiene uno o más enlaces degradables que separan las subunidades de monómeros, que se describirán con más detalle a continuación.
Para preparar un ancanal polimérico de la invención, un material de partida de PEG comúnmente utilizado es PEG libre, un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-OH.
El polímero anterior, alfa-,omega-dihidroxilpoli(etilenglicol), puede representarse en forma abreviada como HO-PEG-OH, y también se denomina en el presente documento como PEG-diol, donde "-PEG-" en "HO-PEG-OH" corresponde a:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-1-CH2CH2-y (n) normalmente varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 4.000, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 3.000, o más preferentemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 1.000. En referencia a la estructura I, POLY puede ser, por ejemplo, un PEG terminado en hidroxi, tal como HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-1-CH2CH2-.
Otro tipo de PEG útil para preparar los alcanales poliméricos de la invención es el PEG con caperuza terminal, donde el PEG está rematado terminalmente con un grupo de caperuza terminal inerte. Los PEG con caperuza terminal preferidos son aquellos que tienen como resto con caperuza terminal un grupo tal como alcoxi, alcoxi sustituido, alqueniloxi, alqueniloxi sustituido, alquiniloxi, alquiniloxi sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido. Se prefieren los grupos con caperuza terminal, tales como metoxi, etoxi y benciloxi.
Refiriéndonos ahora a las estructuras I e I-A a I-C, POLY, en determinadas realizaciones, es o comprende un poli(etilenglicol) correspondiente a la estructura:
"Z-(CH2CH2O)n-"
o
"Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-"
, donde n varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 4.000, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 4.000, y Z es o incluye un grupo funcional tal como hidroxi, amino, éster, carbonato, aldehído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, hidrazida, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, lípido, fosfolípido, biotina y fluoresceína. De nuevo, las estructuras POLY mostradas inmediatamente arriba pueden representar segmentos poliméricos lineales, o pueden formar parte de un segmento polimérico ramificado o bifurcado. En un caso donde el segmento polimérico está ramificado, las estructuras POLY inmediatamente anteriores pueden corresponder, por ejemplo, a los brazos poliméricos que forman parte de la estructura POLY global. Como alternativa, en un caso donde POLY posea una estructura bifurcada, la estructura POLY anterior puede corresponder, por ejemplo, a la porción lineal del segmento de polímero antes del punto de ramificación.
POLY también puede corresponder a una molécula de PEG ramificada que tiene 2 brazos, 3 brazos, 4 brazos, 5 brazos, 6 brazos, 7 brazos, 8 brazos o más. Los polímeros ramificados usados para preparar los alcanales poliméricos de la invención pueden poseer entre 2 y 300 o más extremos reactivos. Se prefieren los segmentos poliméricos ramificados que tienen 2 o 3 brazos poliméricos. Un POLY ramificado ilustrativo, como se describe en la Patente U.S. n.° 5.932.462, corresponde a la estructura:
Figure imgf000023_0001
En esta representación, R "es un resto no reactivo, como H, metilo o un PEG, y P y Q son enlaces no reactivos. En una realización preferida, el segmento de polímero de PEG ramificado es lisina disustituida con metoxi poli (etilenglicol).
En la configuración ramificada particular anterior, el segmento de polímero ramificado posee un único sitio reactivo que se extiende desde el punto de ramificación "C" para posicionar el grupo alcanal reactivo a través de un enlazador. Los PEG ramificados como estos para su uso en la presente invención tendrán normalmente menos de 4 brazos de PEG y, más preferentemente, tendrán 2 o 3 brazos de PEG. Tales PEG ramificados ofrecen la ventaja de tener un único sitio reactivo, junto con una nube de polímero más grande y densa que sus homólogos de PEG lineales.
Un tipo particular de alcanal de PEG ramificado corresponde a la estructura:
(MeO-PEG-)iG-X'-alcanal, donde i es igual a 2 o 3, y G es una lisina u otro residuo de aminoácido adecuado.
Un alcanal polimérico ramificado ilustrativo de la invención tiene la estructura que se muestra a continuación:
Figure imgf000023_0002
En este caso, el enlazador corresponde a C(O)-NH, que contiene opcionalmente un segmento oligomérico -(CH2CH2O)g -(CH2CH2NH)g colocado entre el nitrógeno amídico y la porción alcalina del polímero como se muestra en la Estructura V-B a continuación. Los segmentos oligoméricos ejemplares poseerán valores de b o g en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 30. Preferentemente b o g posee valores de alrededor de 20 o menos. Preferentemente, b o g tendrá uno de los siguientes valores: 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10 o más. En una realización particularmente preferida, b o g varía de 2 a 6 , y mPEGa y mPEGb son iguales o diferentes.
Figure imgf000024_0001
Se prefieren determinadas realizaciones para los alcanales poliméricos que tienen una estructura ramificada. Por ejemplo, en una realización particular, por ejemplo, cuando POLY en la Estructura I está ramificado, entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos una aparición es un radical orgánico como se ha definido anteriormente. En una realización preferida alternativa, por ejemplo, cuando POLY en la Estructura I está ramificado, entonces X 'incluye -(CH2CH2O)b- donde b es de 1 a aproximadamente 20, en el caso en el que POLY comprende un residuo de lisina. En ocasiones en las que POLY tiene 2 brazos poliméricos, es preferible que ninguno de los brazos poliméricos comprenda oxígeno como único heteroátomo en el caso en el que POLY comprende "C-H" como punto de ramificación.
Los PEG ramificados para usar en la preparación de un ancanal polimérico de la invención incluyen adicionalmente los representados más generalmente por la fórmula G(PEG)n, donde G es una molécula central o central desde la que se extienden 2 o más brazos de PEG. La variable n representa el número de brazos de PEG, donde cada uno de los brazos de polímero puede tener caperuzas terminales de forma independiente o, alternativamente, poseer un grupo funcional reactivo en su terminal, tal como un alcanal u otro grupo funcional reactivo. Los PEG ramificados tales como los representados generalmente por la fórmula, G(PEG)n, anterior poseen 2 brazos poliméricos hasta aproximadamente 300 brazos poliméricos (es decir, n varía de 2 a aproximadamente 300). Los PEG ramificados como estos poseen preferentemente de 2 a aproximadamente 25 brazos poliméricos, más preferentemente de 2 a aproximadamente 20 brazos de polímero, e incluso más preferentemente de 2 a aproximadamente 15 brazos de polímero o menos. Los más preferidos son los polímeros de múltiples brazos que tienen 3, 4, 5, 6 , 7 u 8 brazos.
Las moléculas de núcleo preferidas en PEG ramificados como se ha descrito anteriormente son polioles. Tales polioles incluyen polioles alifáticos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono y de 1 a 10 grupos hidroxilo, incluyendo etilenglicol, alcano dioles, alquil glicoles, alquiliden alquil dioles, alquil cicloalcano dioles, 1,5-decalindiol, 4,8-bis(hidroximetil)triciclodecano, cicloalquiliden dioles, dihidroxialcanos, trihidroxialcanos y similares. También se pueden emplear polioles cicloalifáticos, incluyendo azúcares de cadena lineal o de anillo cerrado y alcoholes de azúcar, tales como manitol, sorbitol, inositol, xilitol, quebrachitol, treitol, arabitol, eritritol, adonitol, dulcitol, facosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, ramnosa, galactosa, glucosa, fructosa, sorbosa, manosa, piranosa, altrosa, talosa, tagitosa, piranósidos, sacarosa, lactosa, maltosa y similares. Los polioles alifáticos adicionales incluyen derivados de gliceraldehído, glucosa, ribosa, manosa, galactosa y estereoisómeros relacionados. Otros polioles centrales que pueden usarse incluyen éter corona, ciclodextrinas, dextrinas y otros carbohidratos como almidones y amilosa. Los polioles preferidos incluyen glicerol, pentaeritritol, sorbitol y trimetilolpropano.
Los PEG de brazos múltiples para usar en la preparación de un alcanal polimérico de la invención incluyen PEG de brazos múltiples disponibles en Nektar, Huntsville, Alabama. En una realización preferida, un alcanal polimérico de múltiples brazos de la invención corresponde a lo siguiente, donde los detalles de la porción alcalina de la molécula se proporcionan en otra parte del presente documento.
alcanal alcanal alcanal
alcanal-P
Figure imgf000025_0001
- alcanal
n = O a 4
Estructura Xll-A.
Como alternativa, el alcanal polimérico puede poseer una estructura general bifurcada. Un ejemplo de PEG bifurcado corresponde a la estructura: PEG-Y-CH-(X'-[C(R1)(R2)]z'-CHO)2, donde PEG es cualquiera de las formas de PEG descritas en el presente documento, Y es un grupo de enlace, preferentemente un enlace hidrolíticamente estable, y las otras variables correspondientes al enlazador y la porción alcanal son como se han definido anteriormente.
Los derivados de alcanales de PEG bifurcados ilustrativos adicionales corresponden a lo siguiente:
PEG-Q-CH-[(CH2)m-Xü,1-C(O)-Y-V-alcanal]2 Estructura XIII-B
. donde PEG es cualquiera de las formas de PEG descritas en el presente documento. Q es un enlace hidrolíticamente estable, tal como oxígeno, azufre o -C(O)-NH-; m varía de 1 a 10, (es decir, m puede ser igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10) pero preferentemente m es 1, 2, 3 o 4; X es un átomo opcional, y cuando está presente, es O o N; Y es NH u O; y V es un segmento oligomérico opcional, tal como -(CH2CH2O)b- o (CH2CH2NH)g- como se ha descrito previamente. Un ejemplo de PEG ramificado correspondiente a "PEG" en la fórmula anterior es lisina disustituida en mPEG, donde "PEG" corresponde a:
Figure imgf000025_0002
Como alternativa, el segmento de polímero de PEG para usar en la preparación de un ancanal polimérico de la invención puede ser una molécula de PEG que tiene grupos reactivos colgantes a lo largo de la cadena de PEG en lugar de en los extremos, para producir un alcanal polimérico que tiene uno o más grupos alcano colgantes unidos a la cadena de PEG mediante un enlazador, X'.
Además, el segmento de polímero puede poseer uno o más enlaces débiles o degradables, tales como enlaces éster que están sujetos a hidrólisis. Otros enlaces hidrolíticamente degradables que pueden estar contenidos en POLY incluyen carbonato, imina, éster de fosfato e hidrazona.
En general, la masa molecular media nominal del segmento de polímero soluble en agua, POLY, variará. En general, la masa molecular promedio nominal de POLY se encuentra en uno o más de los siguientes intervalos: de aproximadamente 100 daltons a aproximadamente 100.000 daltons; de aproximadamente 500 daltons a aproximadamente 80.000 daltons; de aproximadamente 1.000 daltons a aproximadamente 50.000 daltons; de aproximadamente 2.000 daltons a aproximadamente 25.000 daltons; de aproximadamente 5.000 daltons a aproximadamente 20.000 daltons. Las masas moleculares promedio nominales ejemplares para el segmento de polímero soluble en agua POLY incluyen aproximadamente 1.000 daltons, aproximadamente 5.000 daltons, aproximadamente 10.000 daltons, aproximadamente 15.000 daltons, aproximadamente 20.000 daltons, aproximadamente 25.000 daltons, aproximadamente 30.000 daltons y aproximadamente 40.000 daltons. Los POLY de bajo peso molecular poseen masas moleculares de aproximadamente 250, 500, 750, 1.000, 2.000 o 5.000 daltons.
ALCANALES POLIMÉRICOS REPRESENTATIVOS
Siguiendo la descripción general anterior, las siguientes son algunas estructuras ilustrativas que demuestran los alcanales poliméricos preferidos de acuerdo con la invención.
Por ejemplo, el alcanal polimérico de la invención, cuando es lineal, puede poseer una estructura homobifuncional o heterobifuncional de acuerdo con la estructura II a continuación. Una estructura homobifuncional de acuerdo con la estructura siguiente es aquella en la que ambos extremos son iguales.
Figure imgf000026_0001
Los valores preferidos para X' y -CR1R2- son los indicados anteriormente. Las estructuras particularmente preferidas de acuerdo con la estructura II son aquellas en las que POLY es poli(etilenglicol) y X' es -O-C(O)-NH-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-(CH2CH2O)b-, -C(O)-NH-(CH2CH2O)b- o -NH-C(O)-NH-(CH2CH2O)b- y z' varía de 3 a 12, y es más preferentemente 3, 4, 5 o 6. Más específicamente, los alcanales poliméricos representativos de la invención incluyen los siguientes:
Figure imgf000026_0002
Estructura lll-C.
Figure imgf000027_0001
en donde PEG es poli(etilenglicol), b y g son cada uno independientemente de 0 a 20, a es de 0 a 6 y las demás variables son las definidas previamente. Se prefieren las estructuras en las cuales b y g oscilan entre 1 y 8 o alternativamente oscilan entre 1 y aproximadamente 6. Aunque z' varía de 3 a 12, se prefieren las estructuras en las cuales z' es 3 o 4.
A continuación se proporcionan representaciones estructurales de dos alcanales poliméricos donde la variable "a" (como se muestra en las estructuras inmediatamente anteriormente) es cero.
Figure imgf000027_0002
Un polímero butanal ilustrativo posee la estructura:
Figure imgf000027_0003
Los PEG particularmente preferidos correspondientes a la Estructura III-D anterior incluyen Z-(CH2CH2O)n- o Las estructuras ramificadas adicionales de acuerdo con la invención son las siguientes, donde b es normalmente de 0 a 20, s es normalmente de 0 a 6 y d es 1, 2 o 3,
Figure imgf000028_0003
En las estructuras VI-A y B anteriores, el PEG puede ser lineal o ramificado. Preferentemente, R1 y R2 en cada aparición son H, y z' varía de 3 a 12, y es incluso más preferentemente 3, 4, 5 o 6. A modo de ejemplo, un polímero de acuerdo con la Estructura VI-B es uno en el que PEG corresponde a la estructura:
Figure imgf000028_0001
donde Z es un grupo funcional o de caperuza terminal como se ha descrito previamente.
Otro alcanal polimérico ilustrativo de la invención posee la estructura que se muestra a continuación:
Figure imgf000028_0002
En la realización anterior, el alcanal polimérico también tiene una estructura bifurcada y es adecuado para la adhesión covalente a dos agentes biológicamente activos. La estructura anterior contiene, en las porciones que se extienden desde el punto de ramificación -CH, un enlazador que contiene segmentos oligoméricos -(CH2CH2O)-, donde el número de tales segmentos en cada porción es 3. El número de tales segmentos oligoméricos en la estructura anterior se puede variar de acuerdo con la descripción generalizada proporcionada anteriormente.
Otras estructuras de alcanales poliméricos ejemplares incluyen las siguientes, donde las variables se han definido previamente:
Figure imgf000029_0001
Preferentemente, una cualquiera de las estructuras anteriores se proporciona como una composición que tiene una o más de las características únicas de la composición descritas con mayor detalle a continuación.
CARACTERISTICAS DE LAS COMPOSICIONES ALCANALES POLIMERAS FORMADAS Y METODOS DE PREPARACIÓN
Los alcanales poliméricos de la invención poseen varias ventajas sobre los aldehídos poliméricos preparados previamente. En primer lugar, los alcanales poliméricos se preparan con rendimientos muy altos, en parte debido a la simplicidad del enfoque sintético empleado, particularmente para los alcanales que tienen oxígeno como resto enlazador. Por otra parte, al examinar la estabilidad de los butanos de la invención, se descubrió que estos tipos de alcanales son más estables a pH básicos que los derivados de aldehídos poliméricos conocidos anteriormente (por ejemplo, propionaldehídos, acetaldehídos), y se forman sin cantidades significativas o incluso detectables de productos secundarios de reacción de tipo retro-Michael. Por ejemplo, como se demuestra en el Ejemplo 3, en condiciones básicas, el propionaldehído mPEG sufre una reacción de tipo retro-Michael, produciendo mPEG-OH y el producto de eliminación, acroleína, en cantidades significativas (después de 24 horas a temperatura ambiente y pH 8 , casi el 40% del PEG-propionaldehído se había descompuesto). Por el contrario, mPEG butiraldehído es significativamente más estable en condiciones básicas, demostrando esencialmente que no hay descomposición de este tipo en las condiciones empleadas.
Además, el derivado de polímero de butanal de la invención alcanza el equilibrio en agua con su correspondiente hidrato a aproximadamente 50% de hidrato, muy por debajo del 70% de equilibrio de hidrato exhibido por el propionaldehído y el 100% de hidrato exhibido por el acetaldehído. La menor reactividad de los derivados poliméricos de la invención también se pone de manifiesto por la estabilidad marcadamente mayor de los derivados de la invención en condiciones básicas (véase el Ejemplo 3 a continuación). No se observa ningún subproducto de acroleína durante las reacciones de conjugación entre los derivados de aldehído de la invención y proteínas u otras moléculas a pH básico. La menor reactividad de los derivados de aldehído de la invención sugiere que los derivados de la invención son más selectivos, lo que significa que los derivados de la invención son capaces de reaccionar con mayor selectividad o especificidad con grupos amino específicos, particularmente grupos amino N-terminales, sobre proteínas o péptidos, en contraposición a la reacción no selectiva o aleatoria con cualquier número de grupos amino en una molécula de proteína o péptido. En muchas aplicaciones, se prefiere la adhesión N-terminal selectiva de la cadena principal del polímero para preservar mejor la conformación de la proteína y la actividad biológica.
Por otra parte, los alcanales poliméricos de la invención se forman a partir de los correspondientes precursores de acetal por hidrólisis en condiciones ácidas suaves, es decir, en condiciones ácidas mucho menos severas que las requeridas para acetaldehído PEG o propionaldehído PEG. Si se desea, tales condiciones suaves permiten la conjugación directa in situ de los derivados poliméricos de la invención con proteínas, péptidos u otras dianas moleculares sin que sea necesario un paso de aislamiento intermedio. Además, debido a los enfoques sintéticos empleados, los alcanales poliméricos de la invención también se proporcionan en especies que contienen yodo de alta pureza, a menudo ausentes o que pueden promover la descomposición del segmento polimérico.
Debido a la suavidad del enfoque sintético empleado, y además debido a la naturaleza estable de las estructuras proporcionadas aquí, los alcanales poliméricos de la invención se proporcionan adicionalmente como composiciones que están esencialmente ausentes de productos de reacción de tipo retro-Michael. Por lo tanto, las composiciones de alcanales poliméricos proporcionadas en el presente documento son particularmente estables al almacenamiento, presentando cantidades muy limitadas, si es que hay alguna, de descomposición polimérica. Como ejemplo, en base a los datos de estabilidad recopilados a lo largo del tiempo, se encontró que los alcanales poliméricos de la invención exhiben menos de aproximadamente un 1 0 % de degradación del grupo aldehído polimérico cuando se almacenan a 40 °C durante 15 días. Este porcentaje de degradación se determinó mediante análisis de RMN. Adicionalmente, se proporcionan alcanales de polímero de mPEG lineales de la invención que están sustancialmente libres del PEG-dialcanal correspondiente (es decir, una impureza de PEG homobifuncional que surge de la presencia de una cantidad de PEG-diol en la materia prima de mPEG-OH).
Volviendo ahora más específicamente al método para hacer un ancanal polimérico de la invención, un alcanal polimérico generalmente se prepara haciendo reaccionar un polímero soluble en agua que tiene al menos un grupo reactivo, Y, con un reactivo de alcanal protegido que contiene un grupo reactivo, K, adecuado para el desplazamiento por o alternativamente, la reacción con Y, en condiciones eficaces para formar un ancanal polimérico soluble en agua en forma protegida. En general, un reactivo de alcanal protegido poseerá de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 átomos de carbono. Después, el alcanal polimérico soluble en agua en forma protegida así formado se hidroliza normalmente, por ejemplo, en condiciones ácidas para formar el alcanal polimérico soluble en agua deseado.
Normalmente, la reacción de acoplamiento (es decir, el acoplamiento del polímero reactivo y el reactivo de alcanal protegido) se lleva a cabo en un disolvente orgánico tal como tolueno, cloroformo, cloruro de metileno, acetonitrilo, acetona, dioxano, metanol y etanol. La reacción se lleva a cabo preferentemente en atmósfera inerte, a temperaturas que oscilan entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 150 °C. La hidrólisis para formar el alcano deseado normalmente se promueve con ácido y se lleva a cabo a pH por debajo de 7,0, con pH preferidos que oscilan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 6,5. La hidrólisis se puede realizar a un pH de aproximadamente 3, 4, 5 o 6 , prefiriéndose pH más bajos alrededor de 3.
En los Ejemplos 1, 2, 5 y 17 se proporcionan ejemplos detallados del enfoque sintético descrito anteriormente.
Lo más normalmente, el acoplamiento del segmento polimérico al reactivo de alcanal protegido se produce mediante una síntesis de éter de Williamson. Más específicamente, el grupo reactivo Y del polímero es hidroxilo (que en presencia de una base fuerte se convierte en su correspondiente forma aniónica o alcoxi), y el grupo reactivo K del reactivo de alcanal protegido acetal es un buen grupo saliente, tal como un haluro (preferentemente CI- o Br-) o metilsulfato (un éster sulfonato), que puede ser fácilmente desplazado por el anión de oxígeno colocado en el extremo del polímero. El enlace preferido resultante es un enlace éter (0-) que conecta POLY al alcanal.
Después de la adhesión a POLY, el alcanal protegido se hidroliza a un pH ácido para formar el grupo funcional aldehído o alcanal correspondiente. Como se señaló anteriormente, los alcanal acetales tales como acetal butanal se hidrolizan en condiciones más suaves que los correspondientes acetales propanal o etanal. Por ejemplo, cuando z' es 3 o mayor, un alcanal acetal de la invención se puede hidrolizar a un pH de aproximadamente 3 o 4 o superior, particularmente cuando R1 y R2 en todos los casos son H. Como se señaló en los Ejemplos 2 y 4, el grupo acetal butanal descrito allí se hidroliza en aproximadamente 3 horas a un pH de 3. La capacidad de formar este grupo funcional alcanal en condiciones ácidas suaves es ventajosa ya que permite el uso in situ del polímero funcionalizado con aldehído para la conjugación con una proteína u otra molécula biológicamente activa después de la neutralización de la solución que contiene el ancanal polimérico a un pH adecuado. para la conjugación (normalmente un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 10). Por el contrario, los propionaldehídos de polímero lineal requieren aislamiento antes de la conjugación debido a la cantidad de base requerida para neutralizar la solución de pH bajo y la cantidad correspondientemente mayor de sales generadas durante tal etapa de neutralización.
En el método empleado, el reactivo de alcanal protegido es normalmente un acetal tal como dimetil acetal, dietil acetal, di-isopropil acetal, dibencil acetal, 2,2,2-tricloroetil acetal, bis(2-nitrobencil) acetal, S,S'-dimetil acetal y S,S'-dietil acetal. Como alternativa, el acetal puede ser un acetal cíclico o un tioacetal cíclico.
Más específicamente, el alcanal protegido normalmente poseerá una estructura como sigue a continuación:
Figure imgf000031_0001
Estructura Xl-D.
En esta estructura, z' es un número entero de 1 a aproximadamente 21. En cuanto a los aldehidos poliméricos proporcionados anteriormente, R1, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; y R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Wa y Wb son cada uno independientemente O o S, y R3 y R4 son cada uno independientemente H, o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en metilo, etilo, isopropilo, bencilo, 1 ,1,1 -tricloroetilo y nitrobencilo o cuando se toman juntos, son -(CH2)2- o -(CH2)3-, formando un anillo de 5 o 6 miembros cuando se considera junto con Wa, C1 y Wb.
Preferentemente, K es uno de los siguientes grupos reactivos:
Figure imgf000031_0002
En este método, el alcanal polimérico en forma protegida se forma normalmente con un rendimiento superior a aproximadamente el 85%, e incluso más preferentemente con un rendimiento superior a aproximadamente el 90 al 95%.
Después de la hidrólisis para obtener el polímero funcionalizado con aldehido deseado, el producto puede aislarse si se desea neutralizando la mezcla de reacción, por ejemplo, elevar el pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,5, seguido de la extracción del alcanal polimérico en un disolvente orgánico y la retirada del disolvente, por ejemplo, por evaporación rotatoria, liofilización o destilación.
Debido a la simplicidad de este enfoque que no utiliza métodos oxidativos directos ni especies que contienen yodo para proporcionar la función aldehído deseada, los productos así formados son muy puros, demuestran una estabilidad de almacenamiento mejorada en comparación con otros aldehidos poliméricos conocidos y poseen valores de polidispersidad bajos (menos de aproximadamente 1,5, preferentemente menos de aproximadamente 1,2, y normalmente polidispersidades menos de aproximadamente 1,1, 1,08, 1,05, 1,04 y 1,3). Se han preparado así polímeros que tienen polidispersidades tan bajas como 1,03, 1,02 y 1,01.
Un alcanal polimérico aislado de la invención tendrá preferentemente una pureza de al menos aproximadamente el 95%, en base a los contaminantes poliméricos.
Los ejemplos 1 y 2 ilustran la formación de alcanales poliméricos de mPEG. En los casos en los que el material de partida polimérico es PEG-diol, uno de los grupos hidroxilo de PEG generalmente está protegido antes de la reacción con el reactivo de alcanal protegido, seguido de desprotección posterior al acoplamiento. Todo el alcanal protegido con polímero ilustrativo así formado se muestra mediante la Estructura XI-E a continuación.
Figure imgf000031_0003
El extremo hidroxi del PEG puede convertirse entonces, si se desea, en un grupo funcional para proporcionar un alcano protegido homobifuncional o heterobifuncional. Los grupos funcionales adecuados incluyen amino, éster, carbonato, aldehído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, hidrazida, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida y silano. Se prefieren grupos funcionales tales como éster de N-hidroxisuccinimidilo, carbonato de benzotriazolilo, amina, vinilsulfona y maleimida, carbonato de N-succinimidilo, hidrazida, propionato de succinimidilo, butanoato de succinimidilo, succionato de succinimidilo, éster succinimidílico, éter de glicidilo, oxicarbonilimidazol, carbonato de p-nitrofenilo, aldehído, disulfuro de ortopiridilo y acrilol.
Otros reactivos de alcanal representativos se describen mediante las estructuras:
Figure imgf000032_0001
En aún otro enfoque, un alcanal polimérico de la invención se prepara ventajosamente a partir de un POLY-Y purificado cromatográficamente. De esta manera, las impurezas poliméricas, si están presentes, y en particular las impurezas difuncionales que surgen del PEG-diol, se retiran para permitir la formación de un producto de alcanal polimérico extremadamente puro como se ha descrito anteriormente. Este enfoque se ejemplifica en el Ejemplo 5. En el Ejemplo 5 se proporciona un sumario del enfoque sintético general empleado, sus ventajas, su aplicabilidad a los métodos generales descritos en este documento, así como los detalles específicos de las reacciones llevadas a cabo.
Aunque se puede usar cualquier método de separación cromatográfica, se prefiere particularmente la cromatografía de intercambio iónico, donde Y en POLY-Y es un grupo ionizable o es un derivado de un grupo ionizable tal como un ácido carboxílico, éster activo, amina o similares.
Los alcanal acetales poliméricos ilustrativos de la invención pueden poseer cualquiera de las siguientes estructuras, donde las variables se han descrito previamente:
Figure imgf000032_0002
En otro enfoque más para preparar un alcanal polimérico de la invención, se puede preparar un alcanal polimérico construyendo el segmento de polímero, POLY, directamente sobre un precursor de acetal, por ejemplo, mediante polimerización directa. Más específicamente, en este método, en primer lugar se proporciona un precursor de acetal que tiene al menos un sitio aniónico activo adecuado para iniciar la polimerización. A continuación, el sitio aniónico del precursor de acetal se pone en contacto con un monómero reactivo capaz de polimerizar, para iniciar de ese modo la polimerización del monómero reactivo sobre el precursor de acetal. Como resultado de la etapa de contacto, se añaden monómeros reactivos adicionales al precursor de acetal para formar una cadena de polímero. Se deja que el contacto continúe hasta que se alcanza la longitud deseada de la cadena polimérica, seguido de la terminación de la reacción para conseguir un precursor polimérico aldehído de la invención.
El precursor de aldehído polimérico resultante se puede hidrolizar adicionalmente al alcanal correspondiente como se ha expuesto anteriormente, si se desea. Lo más preferentemente, el monómero reactivo es óxido de etileno y el sitio aniónico reactivo contenido dentro del precursor acetal es un anión alcóxido (0 -), preferentemente acompañado de un metal alcalino u otro contraión adecuado. El grupo terminal alcóxido presente en el precursor de acetal es activo para la polimerización por apertura de anillo aniónico de óxido de etileno para formar un ancanal polimérico de la invención.
Más particularmente, el precursor de acetal generalmente poseerá una estructura correspondiente a:
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donde las variables poseen los valores descritos anteriormente, con la excepción de que X 'termina en un anión oxígeno, u O" (por ejemplo, en su forma neutra, X' normalmente termina en un grupo hidroxilo u -OH, que en presencia de una base fuerte, se convierte en la correspondiente sal de alcóxido). Las contraiones adecuadas incluyen Na+, K+, Li+ y Cs+. La etapa de terminación generalmente comprende neutralizar la reacción, por ejemplo, mediante la adición de ácido. Opcionalmente, el segmento de polímero se puede tapar mediante la adición de un reactivo alquilante u otro reactivo adecuado para proporcionar un extremo no reactivo.
En una realización particular del método anterior, POLY-Y corresponde a la estructura Z-(CH2CH2O)nH, en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, y Z se selecciona entre el grupo que consiste en — OCH3, -OCH2CH3 y -OCH2(C6H5). En una realización adicional, POLY-Y corresponde a la estructura Z-(CH2CH2O)nCH2CH2O" M+, donde POLY-Y se prepara mediante polimerización aniónica con apertura de anillo de óxido de etileno en una sal de alcoholato con caperuza terminal, tales como Z -C ^ C ^ O - M+, preparado por metalación del grupo -OH terminal de Z-CH2CH2OH con una base fuerte. M+ representa un contraión metálico, tal como Na+, K+, Li+, Cs+, Rb+. El POLY-Y así preparado es adecuado para la reacción con un reactivo alcanal protegido como se describió anteriormente.
En la presente se proporciona un esquema generalizado que describe este enfoque como FIG. 1, y las condiciones para llevar a cabo tal reacción o serie de reacciones se proporcionan en el Ejemplo 15.
ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS ALCANALES POLIMERICOS
Preferentemente, los alcanales poliméricos de la invención se almacenan en una atmósfera inerte, tal como en argón o nitrógeno, ya que la funcionalidad aldehído puede reaccionar con el oxígeno atmosférico para producir el ácido carboxílico correspondiente. Debido a la posible reacción con agua de la parte aldehído de la molécula (por ejemplo, por exposición a la humedad para formar el hidrato correspondiente), también es preferible minimizar la exposición de los alcanales poliméricos de la invención a la humedad. Por tanto, las condiciones de almacenamiento preferidas son en argón seco u otro gas inerte seco a temperaturas por debajo de aproximadamente -15 °C. El almacenamiento en condiciones de baja temperatura reduce la velocidad de la hidrólisis del aldehído polimérico a la forma hidratada correspondiente. Adicionalmente, en casos en los que el segmento polimérico del alcanal polimérico sea PEG, la parte de PEG del alcanal puede reaccionar lentamente con el oxígeno para formar peróxidos con la parte de PEG de la molécula. La formación de peróxidos puede conducir en última instancia a la escisión de la cadena, aumentando así la polidispersidad del reactivo alcanal PEG. En vista de lo anterior, también se prefiere almacenar en la oscuridad los alcanales PEG de la invención.
CONJUGADOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS QUÍMICA DE ACOPLAMIENTO CONJUGACIÓN CON PROTEÍNAS - SELECTIVA ALEATORIA Y N-TERMINAL
Los alcanales poliméricos descritos anteriormente son útiles para la conjugación con superficies o agentes biológicamente activos que llevan al menos un grupo amino disponible para la reacción. Normalmente, un aldehido de PEG de la invención se acopla a un grupo amino mediante aminación reductora, dando como resultado la formación de un enlace de amina secundario entre el segmento polimérico y la superficie o el agente biológicamente activo. Al conjugar un alcanal polimérico de la invención con una superficie o un agente biológicamente activo que lleva un grupo amino, el alcanal polimérico se hace reaccionar en un disolvente adecuado con la molécula diana que lleva el grupo amino para formar el correspondiente producto intermedio ligado a imina, que después se reduce para formar un enlace de amina secundario entre el polímero y la superficie o el agente biológicamente activo. La reducción de la imina a la amina correspondiente se realiza mediante la adición de un agente reductor. Como agentes reductores ilustrativos se incluyen cianoborohidruro sódico, borohidruro sódico, hidruro de litio y aluminio y similares.
En general, los aldehídos poliméricos de la invención pueden utilizarse para dirigir selectivamente la modificación del extremo N en condiciones que diferencien la reactividad de la alfa amina en el aminoácido N-terminal. Determinados alcanales poliméricos de la invención parecen demostrar una mayor selectividad que los derivados de aldehído previamente conocidos y, por tanto, son más adecuados para aplicaciones donde se desea una modificación selectiva de proteínas en el extremo N. Las condiciones de reacción para preparar una proteína o un péptido modificado en el extremo N, incluyen (i) disolver la proteína o el péptido que se vaya a modificar en un tampón que no contenga amina (por ejemplo, a un intervalo de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6,5, preferentemente de aproximadamente 5 a 6,5, más preferentemente a un pH de aproximadamente 5 a 5,5), (ii) añadir, a la solución proteica o peptídica, un alcanal polimérico de la invención, (iii) permitir que la proteína o el péptido y el alcanal polimérico, reaccionen para formar el conjugado de polímero acoplado a imina, seguido de (iv) la adición de un agente reductor para formar el correspondiente conjugado de polímero acoplado a amina secundaria. Las condiciones de reacción para la adhesión aleatoria de un alcanal polimérico son esencialmente idénticas a las descritas anteriormente, con la excepción de que el pH es algo más alto (lo que se analizará más adelante con mayor detalle).
Para favorecer la modificación en el extremo N, un pH de aproximadamente 5 a 5,5 es el más preferido ya que se cree que facilita la modificación selectiva del extremo N debido a diferencias en el valor de pKa del grupo amino de un aminoácido N-terminal y del grupo amino de las lisinas. En términos generales, las condiciones que favorecen la selectividad N-terminal incluyen valores de pH por debajo de 7, y normalmente no inferiores a aproximadamente 4. El pH más favorable para promover la selectividad N-terminal puede determinarlo un experto en la materia y dependerá de la proteína particular que se vaya a modificar. Los tampones adecuados para realizar la conjugación incluyen fosfato sódico, acetato sódico, carbonato sódico y solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés). Normalmente, el alcanal polimérico se añade a la solución que contiene proteína en una cantidad equimolar o en un exceso molar con respecto a la proteína diana. El alcanal polimérico se añade a la proteína diana a una proporción molar de aproximadamente 1:1 (alcanal polimérico proteína), 1,5:1, 2 :1 , 3:1, 4:1, 5:1, 6 :1 , 8:1 o 10:1. Los excesos molares de alcanal-PEG en relación con la proteína diana están normalmente en el intervalo de aproximadamente 2 a 5. La reacción de aminación reductora se lleva a cabo normalmente a temperaturas iguales o inferiores a la temperatura ambiente (25 °C), aunque las temperaturas pueden variar de aproximadamente -15 °C a aproximadamente 100 °C, más preferentemente de aproximadamente 4 °C a 37 °C, durante aproximadamente una a veinticuatro horas. El agente reductor también se añade normalmente en exceso, es decir, en cantidades que varían de aproximadamente un exceso molar de 2 a 30 veces con respecto al conjugado polímero-proteína. Se prefiere añadir el agente reductor en un exceso molar de 10 a 20 veces con respecto al conjugado polímero-proteína. El tiempo de reacción exacto se determina controlando la evolución de la reacción a lo largo del tiempo. La evolución de la reacción se controla normalmente extrayendo alícuotas de la mezcla de reacción a diversos momentos y analizando la mezcla de reacción mediante s DS-PAGE o espectrometría de masas MALDI-TOF o cualquier otro método analítico adecuado. Los conjugados pegilados resultantes se caracterizan adicionalmente utilizando métodos analíticos tales como MALDI, electroforesis capilar, electroforesis en gel y/o cromatografía.
Más específicamente, para acoplar un derivado polimérico de aldehído a una proteína o péptido, se pueden emplear varias estrategias diferentes. Una estrategia (es decir, una estrategia de pegilación aleatoria) es adherir de manera covalente PEG a cualquier número de residuos de lisina que estén accesibles en la superficie. Para llevar a cabo dicha reacción, una proteína o péptido (tal como las biomoléculas ilustrativas proporcionadas a continuación), se hace reaccionar normalmente con un alcanal polimérico de la invención en un tampón que no contenga amina a pH suaves que generalmente varían entre aproximadamente 5 y 8. (Se prefieren tampones que no contengan amina, ya que los grupos amino en el tampón pueden competir con los grupos amino de la proteína para acoplarse al alcanal polimérico). Para realizar la química de conjugación, se selecciona un tampón sin amina adecuado que tenga un pK apropiado para el intervalo de pH deseado. La reacción de acoplamiento suele durar entre minutos y varias horas (por ejemplo, entre 5 minutos y 24 horas o más), y por término medio, el acoplamiento se consigue entre aproximadamente 0,2 y 4 horas para formar el conjugado acoplado a imina. A continuación, a la mezcla de reacción se añade uno cualquiera de diversos agentes reductores adecuados descritos anteriormente (por ejemplo, cianoborohidruro sódico). Después, la mezcla resultante generalmente se deja reaccionar en condiciones de temperatura baja a ambiental, por ejemplo, de 4 °C a 37 °C durante aproximadamente una hora a 48 horas. Preferentemente, la reacción de reducción finaliza en menos de aproximadamente 24 horas. El acoplamiento aleatorio se ve favorecido a pH entre más o menos aproximadamente 7 y 7,5, mientras que el acoplamiento en el N-terminal se ve favorecido a pH bajos (por ejemplo, más o menos aproximadamente 5,5).
Para aumentar el grado de modificación, es decir, para promover un aumento en cuanto al número de PEG que se adhieran de manera covalente en sitios disponibles en la molécula diana, se puede aumentar una cualquiera o más de las condiciones descritas anteriormente (por ejemplo, la relación molar de alcanal polimérico con respecto a la proteína o al péptido, la temperatura, el tiempo de reacción, el pH, etc.), ya sea de forma independiente o simultánea. Independientemente del peso molecular del alcanal PEG empleado, la mezcla de producto resultante se purifica preferentemente, aunque no necesariamente, para separar el exceso de reactivos, de proteínas no pegiladas (o de cualquier molécula diana), de conjugados multipegilados y de alcanales PEG libres o que no han reaccionado.
En los Ejemplos 4 y 6 se porporciona la pegilación aleatoria de proteínas ilustrativas. En los Ejemplos 7 a 13 se describe la pegilación selectiva de sitio de proteínas ilustrativas.
CARACTERIZACIÓN/SEPARACIÓN OPCIONAL DE MEROS DE PEG
Opcionalmente, los conjugados producidos haciendo reaccionar un aldehído de PEG de la invención con un agente biológicamente activo, se purifican para obtener/aislar diferentes especies PEGiladas. Como alternativa, y más preferentemente, para los PEG de menor peso molecular, por ejemplo, que tengan pesos moleculares menores que aproximadamente 2 0 kilodalton, preferentemente menores que, o iguales a, aproximadamente 10 kilodalton, la mezcla del producto puede purificarse para obtener una distribución en torno a un determinado número de PEG por molécula de proteína. Por ejemplo, la mezcla del producto puede purificarse para obtener un promedio de entre uno y cinco PEG por proteína, normalmente un promedio de aproximadamente 3 PEG por proteína. La estrategia de purificación de la mezcla de reacción de conjugado final dependerá de diversos factores tales como el peso molecular del polímero empleado, de la proteína particular, del régimen de dosificación deseado y de la actividad residual y de las propiedades in vivo de las especies de conjugado(s) individuales.
Si se desea, los conjugados de PEG que tienen diferentes pesos moleculares pueden aislarse utilizando cromatografía de filtración en gel. Es decir, la cromatografía de filtración en gel se utiliza para fraccionar diferentes meros (unidades monoméricas) de PEG (1, 2, 3 meros, etc.,) en función de sus diferentes pesos moleculares (donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de las cadenas de PEG). Por ejemplo, en una reacción ilustrativa, donde una proteína de 100 kDa que se conjuga aleatoriamente con un alcanal PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa, la mezcla de reacción resultante probablemente contendrá proteína no modificada (PM 100 kDa), proteína monopegilada (PM 120 kDa), proteína dipegilada (PM 140 kDa), etc. Aunque esta estrategia puede utilizarse para separar conjugados de PEG que tengan diferentes pesos moleculares, es generalmente ineficaz para separar isómeros posicionales que tengan diferentes sitios de pegilación dentro de la proteína. Por ejemplo, para separar entre sí otras mezclas de 1, 2, 3, etc., meros de PEG, puede utilizarse cromatografía de filtración en gel, aunque cada una de las composiciones de meros de PEG recuperadas, puede contener PEG adheridos a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, residuos de lisina) dentro de la proteína.
Las columnas de filtración en gel adecuadas para llevar a cabo este tipo de separación incluyen columnas Superdex™ y Sephadex™ disponibles de Amersham Biosciences. La selección de una columna en particular dependerá del intervalo de fraccionamiento deseado. La elución se lleva a cabo generalmente utilizando un tampón sin amina, tal como fosfato, acetato o similar. Las fracciones recogidas pueden analizarse mediante diversos métodos diferentes, por ejemplo, (i) a una DO de 280 nm para determinar el contenido de proteínas, (ii) análisis de proteínas con BSA (por sus siglas en inglés, seroalbúmina bovina), (iii) pruebas con yodo para determinar el contenido de PEG (Sims G. E. C., et al., Anal. Biochem., 107, 60-63, 1980), o como alternativa, (iv) mediante un proceso SDS PAGE (por sus siglas en inglés sodium dodecyl sulfate polyacrylamide, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico), seguido de tinción con yoduro de bario.
La separación de los isómeros posicionales se realiza mediante cromatografía de fase inversa utilizando una columna C18 de RP-HPLC (Amersham Biosciences o Vydac) o mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de intercambio iónico, por ejemplo, una columna de intercambio iónico Sepharose™ disponible en Amersham Biosciences. Para separar isómeros de biomoléculas de PEG que tengan el mismo peso molecular (isómeros posicionales), se puede utilizar cualquier estrategia.
ALMACENAMIENTO
Dependiendo del uso previsto para los conjugados de PEG resultantes, después de la conjugación y, opcionalmente, de etapas de separación adicionales, la mezcla de conjugado puede concentrarse, esterilizarse por filtración y almacenarse a bajas temperaturas de aproximadamente -20 °C a aproximadamente -80 °C. Como alternativa, el conjugado puede liofilizarse, con o sin tampón residual y almacenarse como un polvo liofilizado. En algunos casos, se prefiere cambiar un tampón utilizado para la conjugación, tal como acetato de sodio, por un tampón volátil tal como carbonato de amonio o acetato de amonio, que se pueda eliminar fácilmente durante la liofilización, de modo que la formulación en polvo liofilizado de conjugado de proteína carezca de tampón residual. Como alternativa, puede utilizarse una etapa de intercambio de tampón con un tampón de formulación, de modo que el conjugado liofilizado esté en una forma adecuada para su reconstitución en un tampón de formulación y finalmente para su administración a un mamífero.
CONJUGACIÓN CON MOLÉCULAS PEQUEÑAS
La conjugación de un alcanal PEG de la invención con una molécula pequeña, como anfotericina B, se realiza generalmente como se describe en el Ejemplo 14, aunque las condiciones exactas de la reacción variarán según la molécula pequeña que se vaya a modificar. Normalmente, la conjugación se realiza utilizando un ligero exceso molar de reactivo de PEG con respecto a la molécula pequeña, por ejemplo, un exceso molar de aproximadamente 1,2 -1,5, a aproximadamente de 5 a 10 veces. En algunos casos, dependiendo de la molécula, el fármaco de molécula pequeña en realidad puede utilizarse en exceso, tal como cuando el conjugado de PEG-molécula pequeña precipita en el disolvente de reacción, por ejemplo, éter, mientras que el fármaco que no ha reaccionado permanece en solución.
MOLÉCULAS DIANA Y SUPERFICIES
Los alcanales poliméricos reactivos de la invención pueden adherirse, ya sea de manera covalente o no covalente, a diversas entidades, incluidas películas, superficies de separación y purificación química, soportes sólidos, superficies de metal/óxido de metal como oro, titanio, tantalio, niobio, aluminio, acero y sus óxidos, óxido de silicio, macromoléculas y moléculas pequeñas. Adicionalmente, los polímeros de la invención también pueden utilizarse en sensores bioquímicos, interruptores bioelectrónicos y reguladores. Los alcanales poliméricos de la invención también pueden emplearse como transportadores en la síntesis de péptidos, en la preparación de superficies recubiertas de polímero e injertos de polímero, para preparar conjugados polímero-ligando en el reparto por afinidad, para preparar hidrogeles reticulados o no reticulados, y para preparar aductos polímero-cofactor para biorreactores.
Un agente biológicamente activo para su uso en el acoplamiento con un polímero de la invención puede ser uno o más de los siguientes, por ejemplo: somníferos y sedantes, antidepresivos, tranquilizantes, fármacos respiratorios, anticonvulsivos, relajantes musculares, agentes antiparkinsonianos (antagonistas de dopamina), analgésicos, antinflamatorios, fármacos contra la ansiedad (ansiolíticos), supresores del apetito, agentes antimigraña, contractores musculares, antiinfecciosos (antibióticos, antivíricos, antifúngicos, vacunas) antiartríticos, antipalúdicos, antieméticos, antiepilépticos, broncodilatadores, citocinas, factores de crecimiento, agentes anticancerosos, agentes antitrombóticos, antihipertensivos, fármacos cardiovasculares, antiarrítmicos, antioxidantes, agentes antiasmáticos, agentes hormonales, incluidos anticonceptivos, simpaticomiméticos, diuréticos, agentes reguladores de lípidos, agentes antiandrogénicos, antiparasitarios, anticoagulantes, neoplásicos, antineoplásicos, hipoglucemiantes, agentes y complementos nutricionales, complementos de crecimiento, agentes antienteritis, vacunas, anticuerpos, agentes de diagnóstico y agentes de contraste.
Más particularmente, el agente activo puede pertenecer a una de las diversas clases estructurales, incluyendo, pero sin limitación, moléculas pequeñas (preferentemente moléculas pequeñas insolubles), péptidos, polipéptidos, proteínas, polisacáridos, esteroides, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, grasas, electrolitos y similares. Preferentemente, para acoplarse con un alcanal polimérico de la invención un agente activo posee un grupo amino natural, o como alternativa, se modifica para que contenga al menos un grupo amino reactivo adecuado para acoplarse con un alcanal polimérico de la invención.
Como ejemplos específicos de agentes activos adecuados para la adhesión covalente a un polímero de la invención se incluyen, pero sin limitación, asparaginasa, amdoxovir (DAPD), antida, becaplermin, calcitonina, cianovirina, denileucina diftitox, eritropoyetina (EPO), agonistas de EPO (por ejemplo, péptidos con una longitud de aproximadamente 10-40 aminoácidos y que comprenden una secuencia central particular como se describe en el documento WO 96/40749), dornasa alfa, proteína estimuladora de la eritropoyesis (NESP), factores de coagulación, tales como Factor V, Factor VII, Factor VITa, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XII, Factor XIII, factor de von Willebrand; ceredasa, cerezima, alfa-glucosidasa, colágeno, ciclosporina, alfa defensinas, beta defensinas, exendina 4, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-GCSF), trombopoyetina (TPO), inhibidor de proteinasa alfa 1, elcatonina, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF), fibrinógeno, filgrastima, hormonas del crecimiento, hormona del crecimiento humano (hGH), hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH), GRO-beta, anticuerpo GRO-beta, proteínas morfogénicas óseas, tales como proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 6 , OP-1; factor de crecimiento ácido de fibroblastos, factor de crecimiento básico de fibroblastos, ligando CD-40, heparina, seroalbúmina humana, heparina de bajo peso molecular (HBPM), interferones, tales como interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interferón omega, interferón tau, interferón consenso; interleucinas y receptores de interleucina, tales como receptor de interleucina 1 , interleucina 2 , proteínas de fusión de interleucina 2, antagonista del receptor de interleucina 1, interleucina 3, interleucina 4, receptor de interleucina 4, interleucina 6 , interleucina 8 , interleucina 12, receptor de interleucina 13, receptor de interleucina 17; lactoferrina y fragmentos de lactoferrina, hormona liberadora de la hormona luteinizante (HLHL), insulina, proinsulina, análogos de insulina (por ejemplo, insulina monoacilada como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.922.675), amilina, péptido C, somatostatina, análogos de somatostatina, incluyendo octreótido, vasopresina, hormona foliculoestimulante (FSH), vacuna contra la gripe, factor de crecimiento insulínico (IGF), insulinatropina, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), activadores de plasminógeno, tales como alteplasa, urocinasa, reteplasa, estreptocinasa, pamiteplasa, lanoteplasa y teneteplasa; factor de crecimiento nervioso (NGF), osteoprotegerina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factores de crecimiento tisular, factor de crecimiento transformante 1 , factor de crecimiento endotelial vascular, factor inhibidor de leucemia, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento glial (GGF), receptores de linfocitos T, moléculas/antígenos de CD (del inglés cluster of differentiation, grupos de diferenciación), factor de necrosis tumoral (TNF), proteína quimioatrayente de monocitos 1, factores de crecimiento endotelial, hormona paratiroidea (PTH), péptido similar al glucagón, somatotropina, timosina alfa 1, inhibidor de timosina alfa 1 Mb/IMa, timosina beta 10, timosina beta 9, timosina beta 4, alfa 1 antitripsina, compuestos de fosfodiesterasa (PDE), VLA-4 (del inglés very late antigen-4, antígeno 4 muy tardío), inhibidores de VLA-4, bisfosfonatos, anticuerpos contra el virus sincicial respiratorio, gen regulador transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), desoxirribonucleasa (Dnasa), proteína bactericida/incrementadora de la permeabilidad (BPI) y anticuerpo anti CMV. Como anticuerpos monoclonales ilustrativos se incluyen etanercept (una proteína de fusión dimérica que consiste en la parte extracelular de unión al ligando del receptor del TNF humano de 75 kD ligado a la parte Fc de IgG1), abciximab, afeliomomab, basiliximab, daclizumab, infliximab, ibritumomab, tiuexetan, mitumomab, muromonab-CD3, conjugado de yodo 131 tositumomab, olizumab, rituximab y trastuzumab (herceptin).
Como agentes adicionales adecuados para la adhesión covalente a un polímero de la invención se incluyen, pero sin limitación, amifostina, amiodarona, ácido aminocaproico, aminohipurato sódico, aminoglutetimida, ácido aminolevulínico, ácido aminosalicílico, amsacrina, anagrelida, anastrozol, asparaginasa, antraciclinas, bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfán, cabergolina, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cilastatina sódica, cisplatino, cladribina, clodronato, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, camptotecina, ácido 13 cis retinoico, ácido todo transretinoico; dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, deferoxamina, dexametasona, diclofenaco, dietilestilbestrol, docetaxel, doxorrubicina, epirrubicina, estramustina, etopósido, exemestano, fexofenadina, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, epinefrina, L-Dopa, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, imatinib, irinotecán, itraconazol, goserelina, letrozol, leucovorina, levamisol, lisinoprilo, lovotiroxina sódica, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalán, mercaptopurina, bitartrato de metaraminol, metotrexato, metoclopramida, mexiletina, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, naloxona, nicotina, nilutamida, octreotida, oxaliplatino, pamidronato, pentostatina, pilcamicina, porfímero, prednisona, procarbazina, proclorperazina, ondansetrón, raltitrexed, sirolimus, estreptozocina, tacrolimus, tamoxifeno, temolozomida, tenipósido, testosterona, tetrahidrocannabinol, talidomida, tioguanina, tiotepa, topotecán, tretinoína, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, dolasetrón, granisetrón; formoterol, fluticasona, leuprolida, midazolam, alprazolam, anfotericina B, podofilotoxinas, antivíricos nucleosídicos, aroil hidrazonas, sumatriptán; macrólidos tales como eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiromicina, midecamicina, leucomicina, miocamicina, rokitamicina, andazitromicina y swinolida A; fluoroquinolonas tales como ciprofloxacino, ofloxacino, levofloxacino, trovafloxacino, alatrofloxacino, moxifloxicina, norfloxacino, enoxacina, grepafloxacino, gatifloxacina, lomefloxacino, esparfloxacino, temafloxacina, pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina, tosufloxacino, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina, clinafloxacina y sitafloxacina; aminoglucósidos tales como gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amikacina, kanamicina, neomicina y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato; polimixinas tales como polimixina B, capreomicina, bacitracina, penems; penicilinas, incluidos agentes sensibles a penicilinasa como penicilina G, penicilina V; agentes resistentes a penicilinasa como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina; agentes activos de microorganismos gramnegativos como ampicilina, amoxicilina y hetacilina, cilina y galampicilina; penicilinas antipseudomonas como carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina; cefalosporinas como cefpodoxima, cefprozil, ceftbuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefradrina, cefoxitina, cefamandol, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxilo, cefaloglicina, cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetrilo, cefepima, cefixima, cefonicida, cefoperazona, cefotetan, cefmetazol, ceftazidima, loracarbef y moxalactama, monobactamas como aztreonam; y carbapenemos como imipenem, meropenem, isetionato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocaína, sulfato de metaproterenol, diprepionato de beclometasona, acetónido de triamcinolona, acetónido de budesonida, fluticasona, bromuro de ipratropio, flunisolida, cromoglicato sódico y tartrato de ergotamina; taxanos tales como paclitaxel; SN-38 y tirfostinas.
Las moléculas pequeñas preferidas para acoplarse a un alcanal polimérico de la invención son las que tienen al menos un grupo amino. Las moléculas preferidas incluyen aminohipurato sódico, anfotericina B, doxorrubicina, ácido aminocaproico, ácido aminolevulínico, ácido aminosalicílico, bitartrato de metaraminol, pamidronato disódico, daunorrubicina, levotiroxina sódica, lisinoprilo, cilastatina sódica, mexiletina, cefalexina, deferoxamina y amifostina.
Como péptidos o proteínas preferidos para acoplarse a un alcanal polimérico de la invención se incluyen EPO, IFN-a, IFN-p, IFN-y, IFN consenso, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, IL-2, remicade (infliximab), Rituxán (rituximab), Enbrel (etanercept), Synagis (palivizumab), Reopro (abciximab), Herceptin (trastuzimab), tPA, Cerizyme (imiglucerasa), vacuna contra la hepatitis B, rDNAsa, inhibidor de proteinasa alfa 1, GCSF, GMCSF, hGH, insulina, FSH y PTH.
Los ejemplos anteriores de agentes biológicamente activos pretenden abarcar, cuando proceda, análogos, agonistas, antagonistas, inhibidores, isómeros y formas salinas farmacéuticamente aceptables de los mismos. En referencia a los péptidos y a las proteínas, la invención pretende abarcar formas sintéticas, recombinantes, naturales, glucosiladas y no glucosiladas, así como fragmentos biológicamente activos de los mismos. Las proteínas biológicamente activas mencionadas anteriormente se refieren además a variantes que tienen uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados, o similar, siempre que la proteína variante resultante posea al menos un cierto grado de actividad de la proteína precursora (natural).
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
En el presente documento también se describen preparaciones farmacéuticas que comprenden un conjugado como se proporciona en el presente documento en combinación con un excipiente farmacéutico. En general, el propio conjugado estará en forma sólida (por ejemplo, como un precipitado), que puede combinarse con un excipiente farmacéutico adecuado que puede estar en forma sólida o líquida.
Como excipientes ilustrativos se incluyen, sin limitación, los seleccionados del grupo que consiste en hidratos de carbono, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, tampones, ácidos, bases, y combinaciones de los mismos.
Como excipiente puede haber un hidrato de carbono, tal como un azúcar, un azúcar derivatizado, tal como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar. Como excipientes de hidratos de carbono específicos se incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol y similares.
El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o un tampón tal como ácido cítrico, cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, nitrato potásico, fosfato sódico monobásico, fosfato sódico dibásico, y combinaciones de los mismos.
La composición también puede incluir un agente antimicrobiano para impedir o detener el crecimiento microbiano. Como ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invención se incluyen cloruro benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol y combinaciones de los mismos.
En la composición también puede haber un oxidante. Los antioxidantes se usan para impedir la oxidación, por lo tanto, para impedir el deterioro del conjugado o de otros componentes de la preparación. Como antioxidantes adecuados para su uso en las preparaciones farmacéuticas descritas en el presente documento se incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, propil galato, bisulfito sódico, formaldehído sulfoxilato sódico, metabisulfito sódico, y combinaciones de los mismos. Un tensioactivo puede estar presente como un excipiente. Como ejemplos de tensioactivos se incluyen: polisorbatos, tales como "Tween 20" y "Tween 80", y pluronics tales como F6 8 y F88 (ambos disponibles en BASF, Mount Olive, Nueva Jersey); ésteres de sorbitán; lípidos, tales como fosfolípidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferentemente no en forma liposomal), ácidos grasos y ésteres grasos; esteroides, tales como colesterol; y agentes quelantes, tales como EDTA, cinc y otros cationes de este tipo adecuados.
En la composición puede haber ácidos o bases como un excipiente. Como ejemplos no limitantes de ácidos que pueden utilizarse se incluyen los ácidos seleccionados del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, y combinaciones de los mismos. Como ejemplos de bases adecuadas se incluyen, sin limitación, bases seleccionadas del grupo que consiste en hidróxido sódico, acetato sódico, hidróxido amónico, hidróxido potásico, acetato amónico, acetato potásico, fosfato sódico, fosfato potásico, citrato sódico, formiato sódico, sulfato sódico, sulfato potásico, fumarato potásico y combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmacéuticas abarcan todo tipo de formulaciones y en particular aquellas que son adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos que pueden reconstituirse así como suspensiones y soluciones. La cantidad de conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el polímero descrito en el presente documento) en la composición, variará dependiendo de diversos factores, pero será óptimamente una dosis terapéuticamente eficaz cuando la composición se almacene en un recipiente de dosis unitaria (por ejemplo, un vial). Además, la preparación farmacéutica se puede guardar en una jeringa. Mediante la administración repetida de cantidades crecientes del conjugado, puede determinarse experimentalmente una dosis terapéuticamente eficaz para determinar qué cantidad produce un criterio de valoración clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y las necesidades concretas de la composición. Normalmente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina a través de experimentación habitual, es decir, preparando composiciones que contengan diversas cantidades del excipiente (que varían desde bajas a altas), examinando la estabilidad y otros parámetros y después determinando el intervalo al cual se logra el comportamiento óptimo sin efectos adversos significativos.
Sin embargo, generalmente, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % en peso, preferentemente de aproximadamente 5 %-98 % en peso, más preferentemente de aproximadamente 15-95 % en peso del excipiente, siendo las concentraciones más preferidas inferiores al 30 %.
Estos excipientes farmacéuticos anteriores junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998) y en Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Normalmente, aunque no necesariamente, las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se administran mediante inyección y, por lo tanto, inmediatamente antes de su administración, son generalmente soluciones o suspensiones líquidas. La preparación farmacéutica también puede adoptar otras formas tales como jarabes, cremas, pomadas, comprimidos, polvos y similares. También se incluyen otros modos de administración, tales como pulmonar, rectal, transdérmica, transmucosa, oral, intratecal, subcutánea, intraarterial, etc.
Como se ha descrito anteriormente, los conjugados pueden administrarse inyectados por vía parenteral mediante inyección intravenosa, o menos preferentemente, mediante inyección intramuscular o subcutánea. Los tipos de formulación adecuados para la administración parenteral incluyen soluciones listas para inyección, polvos secos para combinar con un disolvente antes de su uso, suspensiones listas para inyección, composiciones secas insolubles para combinar con un vehículo antes de su uso, y emulsiones y concentrados líquidos para diluir antes de su administración, entre otros.
MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN
En el presente documento también se describe un método para administrar, a un paciente que padece una afección que responde al tratamiento con un conjugado, un conjugado como se proporciona en el presente documento. El método comprende administrar, generalmente por inyección, una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado (preferentemente proporcionada como parte de una preparación farmacéutica). El método de administración puede utilizarse para tratar cualquier afección que pueda remediarse o prevenirse mediante la administración del conjugado particular. Los expertos familiarizados con la técnica apreciaran qué afecciones puede tratar de manera eficaz un conjugado específico. La dosis real que se vaya a administrar, variará dependiendo de la edad, del peso y del estado general del sujeto, así como de la gravedad de la afección que se esté tratando, del criterio del profesional sanitario y del conjugado que se vaya a administrar. Los expertos en la técnica conocen y/o describen las cantidades terapéuticamente eficaces en los textos y en la bibliografía de referencia pertinentes. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz variará de aproximadamente 0 ,001 mg a 10 0 mg, preferentemente en dosis de 0 , 01 mg/día a 75 mg/día, y más preferentemente en dosis de 0,10 mg/día a 50 mg/día.
La dosis unitaria de cualquier conjugado dado (de nuevo, preferentemente proporcionado como parte de una preparación farmacéutica), puede administrarse en una variedad de programas de dosificación dependiendo del criterio del médico, de las necesidades del paciente, etc. Los expertos familiarizados con la técnica conocerán el programa de dosificación específico o podrán determinarlo experimentalmente utilizando métodos habituales. Los programas de dosificación ilustrativos incluyen, sin limitación, administración cinco veces al día, cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes, y cualquier combinación de los mismos. Una vez alcanzado el criterio de valoración clínico, se interrumpe la dosificación de la composición.
Una ventaja de administrar los conjugados de la presente invención es que se pueden escindir partes individuales de polímero soluble en agua. Dicho resultado es ventajoso cuando la eliminación del cuerpo es posiblemente un problema debido al tamaño del polímero. De manera óptima, la escisión de cada parte de polímero soluble en agua se facilita utilizando enlaces fisiológicamente escindibles y/o enzimáticamente degradables, tales como los enlaces que contienen uretano, amida, carbonato o éster. De esta manera, la eliminación del conjugado (mediante escisión de partes individuales de polímero soluble en agua) se puede modular seleccionando el tamaño molecular del polímero y el tipo de grupo funcional que proporcionaría las propiedades de eliminación deseadas. Un experto familiarizado con la técnica puede determinar el tamaño molecular del polímero así como el grupo funcional escindible adecuados. Por ejemplo, utilizando experimentación habitual, un experto familiarizado con la técnica, puede determinar un tamaño molecular y grupo funcional escindible adecuados preparando primero una variedad de derivados poliméricos con diferentes pesos de polímero y grupos funcionales escindibles, y después obteniendo el perfil de eliminación (por ejemplo, muestreando periódicamente sangre u orina) administrando el derivado polimérico a un paciente y tomando muestras periódicas de sangre y/u orina. Una vez obtenida una serie de perfiles de eliminación de cada conjugado analizado, se puede identificar un conjugado adecuado.
Ejemplos
MATERIALES Y MÉTODOS.
Todos los reactivos de PEG a los que se hace referencia en los ejemplos adjuntos están disponibles comercialmente a menos que se indique lo contrario. Todos los datos de RMN se generaron mediante un espectrómetro de RMN de 300 MHz fabricado por Bruker.
La lisozima se obtuvo de Sigma.
EJEMPLO 1
SÍNTESIS DE MPEG (2K)-BUTIRALDEHÍDO
Figure imgf000040_0001
A. Preparación de mPEG (2KDa)-Butiraldehído, dietil acetal.
^O C H 2CH3
CH30 -(CH2 CH20 )2kD-CH2 CH2 CH2CH
^ O C H 2CH3
Se secó azeotrópicamente una mezcla de mPEG (2KDa) (2,0 g) y tolueno (30 ml) mediante destilación del tolueno a presión reducida. El mPEG seco, peso molecular, 2 kilodaltons, se disolvió en tolueno anhidro (15 ml) al cual se le añadió una solución 1,0 M de tere-butóxido potásico en tere -butanol (4,0 ml, 0,004 moles) y 4-clorobutiraldehído dietil acetal (0,5 g, 0,00277 moles) (Alfa Aesar). La mezcla se agitó a 100-105 °C durante una noche en una atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y se añadió a 150 ml de éter etílico a 0-5 °C. El producto precipitado se retiró por filtración y se secó a presión reducida. Rendimiento: 1,6 g. La reacción procedió con un rendimiento esencialmente cuantitativo. Es decir, esencialmente todo el material de partida de mPEG se convirtió en el correspondiente acetal de dietilo, basándose en la ausencia de protones de hidroxilo correspondientes al material de partida de mPEG-OH de acuerdo con RMN 1H. RMN (d6-DMSO): 1,09 ppm (t, CH3-C-) 1,52 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3,24 ppm (s, -OCH3), 3,51 ppm (s, cadena principal de PEG), 4,46 ppm (t, -CH, acetal).
B. Preparación de mPEG (2kD)-Butiraldehído
Figure imgf000040_0002
Una mezcla de mPEG (2KDa) butiraldehído, acetal dietílico (1,0 g) de A. anterior, agua desionizada (20 ml) y una cantidad de ácido fosfórico al 5% para ajustar el pH a 3,0, se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. A esta mezcla se le añadió cloruro sódico (1,0 g) y el pH se ajustó a 6 , 8 mediante la adición de hidróxido sódico 0,1 M. El producto, mPEG (2kD) butiraldehído, se extrajo con diclorometano (3 x 20 ml). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida para proporcionar el producto de mPEG butiraldehído en forma aislada. Rendimiento: 0,72 g.
La reacción procedió con un rendimiento esencialmente cuantitativo. Es decir, esencialmente todo el mPEG butiraldehído dietil acetal se convirtió en el aldehído correspondiente, basándose en la ausencia de protones hidroxilo correspondientes al material de partida mPEG-OH así como la ausencia de protones hidroxilo correspondientes al acetal dietílico de acuerdo con RMN 1H.
RMN (d6-DMSO): 1,75 ppm (p, -CH2-CH2-CHO-) 2,44 ppm (dt, -CH2 -CHO), 3,24 ppm (s, -OCH3), 3,51 ppm (s, cadena principal de PEG), 9,66 ppm (t, -CHO).
EJEMPLO 2
SÍNTESIS DE MPEG (30 kD)-BUTIRALDEHÍDO
A. Preparación de mPEG (30 KDa)-Butiraldehído, dietil acetal,
mPEG30K-O-CH2(CH2)2-CH(OCH2CHa)2
Una mezcla de mPEG (30 kD) (solución al 60% en tolueno, 3,30 g), tolueno (30 ml) y BHT (hidroxitolueno butilado, 0,004 g) se secó azeotrópicamente separando el disolvente por destilación a presión reducida. El mPEG 30K seco se disolvió en tolueno anhidro (15 ml) y a esta solución se le añadieron tere-butóxido potásico 1,0 M en tere-butanol (4,0 ml, 0,004 moles), 4-clorobutiraldehído dietil acetal (0,5 g, 0,00277 moles) (Alfa Aesar) y bromuro potásico (0,05 g). La mezcla resultante se agitó durante una noche a 105 °C en una atmósfera de argón. La mezcla se filtró, se concentró a sequedad a presión reducida y el producto en bruto se disolvió en 20 ml de diclorometano. Esta solución que contenía el producto se añadió a éter etílico (300 ml) a temperatura ambiente para precipitar el producto. El producto precipitado se aisló por filtración y se secó a presión reducida. Rendimiento: 1,92 g.
RMN (d6-DMSO): 1,09 ppm (t, CH3-C-) 1,52 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3,24 ppm (s, -OCH3), 3,51 ppm (s, cadena principal de PEG), 4,46 (t, -CH, acetal).
Basándose en los rendimientos y el análisis del producto, la sustitución del reactivo acetal en el extremo hidroxi del reactivo mPEG-OH procedió con una eficacia muy alta, es decir, con una sustitución esencialmente del 100%. El producto resultante, sin requerir purificación adicional, se produjo con alta pureza, sin cantidades detectables o significativas de mPEG-OH sin reaccionar. Normalmente, los alcanales o acetales poliméricos de la invención se producen en purezas elevadas, es decir, normalmente, el producto alcanal deseado está presente en la composición final con al menos un 85% de pureza, preferentemente al menos un 90% de pureza e incluso más preferentemente, con al menos un 95% de pureza.
B. Preparación de mPEG (30 KDa)-Butiraldehído,
mPEG3nK-O-CH2(CH2)2-C(O)H
Una mezcla de mPEG (30KDa) butiraldehído, acetal dietílico (1,0 g) de A. anterior, agua desionizada (20 ml) y una cantidad de ácido fosfórico al 5% para ajustar el pH a 3,0, se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. A esta mezcla se le añadió cloruro sódico (1 , 0 g) y el pH se ajustó a 6 , 8 mediante la adición de hidróxido sódico 0,1 M. El producto se extrajo con diclorometano (3 x 20 ml). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se retiró por destilación. El producto húmedo se secó a presión reducida. Rendimiento: 0,82 g.
RMN (d6-DMSO): 1,75 ppm (p, -CH2-CH2-CHO-) 2,44 ppm (dt, -CH2 -CHO), 3,24 ppm (s, -OCH3), 3,51 ppm (s, cadena principal de PeG), 9,66 ppm (t, -CHO).
Sustitución: ~100 %.
La conversión al aldehído correspondiente procedió con un rendimiento esencialmente cuantitativo.
EJEMPLO 3
ESTABILIDAD COMPARATIVA DE MPEG-PROPIONALDEHÍDO Y MPEG-BUTIRALDEHÍDO A PH BÁSICO Se expusieron cada uno de ellos metoxi-PEG-propionaldehído y mPEG-butiraldehído a condiciones de pH alto durante períodos de tiempo prolongados para comparar la estabilidad relativa de cada polímero en condiciones de pH básico. Como se indica a continuación, cantidades significativas de propionaldehído PEG reaccionaron en estas condiciones para formar mPEG-OH y liberar acroleína (debido a una reacción de tipo retro-Michael), mientras que no se detectó pérdida del compuesto butiraldehído de PEG. Los detalles de este experimento se proporcionan a continuación.
A. Estabilidad de mPEG (2KDa)-Butiraldehído a pH básico
Se disolvió mPEG (2KDa) -butiraldehído (del Ejemplo 1) (0,5 g) en 10 ml de tampón fosfato 5 mM (pH = 8,0) y la solución resultante se agitó durante 24 ha temperatura ambiente. Se añadió NaCl (0,5 g) y el producto se extrajo con cloruro de metileno (3 x 10 ml). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida a 25 °C.
Basándose en análisis de RMN 1H, el producto permaneció sin cambios. Es decir, no se detectó descomposición del PEG-butanal, incluso después de un período de tiempo prolongado en estas condiciones básicas de pH.
B. Estabilidad de mPEG (5KDa)-Propionaldehído a pH básico
Se disolvió mPEG (5KDa)-propionaldehído (Shearwater Corporation, 82% de sustitución de aldehído) (0,5 g) en 10 ml de tampón fosfato 5 mM (pH = 8,0). La solución resultante se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. El análisis del espacio de cabeza por cromatografía de gases mostró que la solución contenía acroleína (CH2=CH-CHO), resultante de una reacción de eliminación en condiciones básicas como las que se emplean normalmente para la conjugación de proteínas. Se añadió NaCl (0,5 g) y el producto se extrajo con cloruro de metileno (3 x 10 ml). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida a 25 °C.
Basándose en análisis de RMN 1H, la sustitución de mPEG (5KDa)-propionaldehído cayó al 62% (es decir, el 38% del PEG-propanal se había descompuesto) y el producto contenía una cantidad sustancial de mPEG-OH, lo que de la pérdida del segmento C-3 correspondiente a la porción propanal del PEG-propanal.
EJEMPLO 4
PEGILACIÓN DE LISOZIMA
Figure imgf000042_0001
("Lisozima-NH2" pretende indicar la molécula de lisozima con uno de sus grupos amino reactivos mostrados).
A. PEGILACIÓN ALEATORIA USANDO UN ALCANAL DE PEG DE 2 KD. La proteína modelo, lisozima, una enzima secretora de 129 aminoácidos, se usó para demostrar el acoplamiento de un ancanal polimérico de la invención a una proteína ilustrativa. La lisozima contiene seis residuos de lisina como sitios potenciales para la pegilación.
Se disolvió lisozima (2,1 mg) en 1 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,6) al cual se le añadió mPEG (2 kD) -butiraldehído (del Ejemplo 1, 1,5 mg). A esta solución se le añadió el agente reductor, NaCNBH3 (cianoborohidruro sódico) y la solución se agitó durante 24 ha temperatura ambiente. El conjugado de lisozima resultante posee cadenas de PEG acopladas a grupos amino de lisozima mediante una cadena -(CH2)4 inversora.
El producto de reacción se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) y mostró picos correspondientes a tres especies PEGiladas de lisozima a 16208 Da, 18422 Da y 20520 Da, que difieren en masa en aproximadamente 2000 Da (correspondiente al tamaño del reactivo butanal PEG), así como proteína no modificada. Se determinó que la masa de lisozima no modificada (nativa) por MALDI-TOF era 14153. Por lo tanto, el conjugado formado era en realidad una mezcla de proteína monopegilada, proteína di-pegilada y proteína tri-pegilada (1 mero, 2 meros y 3 meros).
Lo anterior demuestra la pegilación aleatoria de una proteína ilustrativa de la invención para producir una distribución de productos pegilados. Si se desea, la mezcla de reacción se puede separar adicionalmente para aislar los conjugados de PEG individuales, es decir, lisozima que tiene una molécula de PEG unida al mismo, lisozima que tiene dos PEG unidos y lisozima que tiene tres PEG unidos. Dentro de cada una de las composiciones de conjugado descritas anteriormente (1 mero, 2 meros y 3 meros), la molécula de PEG puede unirse a diferentes sitios amino reactivos dentro de la molécula de lisozima.
B. PEGILACIÓN USANDO UN PEG ALCANAL DE 5 KD, MPEG-2-METiLBUTIRALDEHÍDO.
La conjugación de la proteína modelo, lisozima, se repitió usando el reactivo de PEG ramificado alfa, mPEG5kD-2 -metilbutiraldehído. Se disolvió lisozima (3 mg) en aproximadamente 1 ml de tampón de fosfato sódico a un pH que varía de aproximadamente 5,5 a 7,5. Se añadió un exceso molar de dos a cinco veces del reactivo de PEG, mPEG5kD-2 -metilbutiraldehído, a la solución de lisozima, y la solución resultante se colocó en un mezclador rotatorio y se dejó reaccionar a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 15 minutos, se añadió un exceso molar de 20 veces de NaCNBH3 y se dejó que continuara la reacción. Se extrajeron alícuotas a varios intervalos de tiempo (4 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, etc.) y el progreso de la reacción se controló mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas MALDI-TOF.
Una vez completada la reacción, la mezcla de conjugado resultante se concentró, se filtró en condiciones convencionales y se almacenó en condiciones de baja temperatura (-20 °C a -80 °C) hasta su uso posterior.
EJEMPLO 5
PREPARACIÓN DE PEG2 RAMIFICADO (40,3 KDA)-BUTIRALDEHÍDO
La preparación de un alcanal polimérico ejemplar que tiene un segmento de PEG ramificado se proporciona a continuación.
SUMARIO. La síntesis general involucró primero el acoplamiento de un espaciador de tetra (etilenglicol) a un precursor de alcanal reactivo, 4-clorobutiraldehído dietil acetal. La introducción de un espaciador oligomérico de etilenglicol proporciona una mayor estabilidad al producto resultante al extender la longitud de la cadena entre el grupo aldehído (o acetal) reactivo y un grupo reactivo que puede estar contenido en el resto enlazador, X', minimizando así la aparición de posibles reacciones secundarias y mejora de los rendimientos.
El uso de un espaciador oligomérico, como tetraetilenglicol, también proporciona un grupo funcional reactivo, en este caso, hidroxi, que puede convertirse, si es necesario, para acoplarse a un segmento de polímero que ha sido purificado cromatográficamente para retirar impurezas poliméricas, tales como PEG-diol, mPEG-OH y similares. De esta manera, las impurezas poliméricas funcionalizadas no deseadas, tales como PEG-dialdehído (resultante de PEG diol) y similares se retiraron del segmento de PEG antes del acoplamiento al precursor alcalino para proporcionar el producto final, un alcanal polimérico soluble en agua que está esencialmente libre de impurezas poliméricas.
Volviendo a la reacción específica a continuación, el acoplamiento del espaciador de tetra(etilenglicol) a 4-clorobutiraldehído dietil acetal conduce a la formación del producto mono-alcanal deseado contaminado con producto di-alcanal y tetra(etilenglicol) de partida. Sin embargo, un tratamiento sencillo que utiliza las diferencias en la solubilidad de todos los componentes en la mezcla de reacción permite la preparación rápida de un producto monoalcanal de alta pureza, es decir, teniendo la función alcanal (acetal) sustituida en solo uno de los grupos hidroxi reactivos de la molécula de tetra(etilenglicol). (REACCIÓN A.). El producto de la REACCIÓN A se convirtió luego en el mesilato correspondiente por reacción con cloruro de metanosulfonilo, es decir, el grupo hidroxi libre del tetra(etilenglicol) se convirtió primero en el mesilato (REACCIÓN B), seguido de la conversión del mesilato en un grupo amino primario (REACCIÓN C). El grupo amino reactivo del reactivo acetal se acopló después a un segmento de la cadena principal de polímero ramificado ilustrativo que tiene un carbono carbonilo reactivo adecuado para la reacción con el grupo amino del reactivo acetal. El precursor del reactivo de PEG, lisina disustituida con mPEG, se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico antes de la conversión en el correspondiente éster activado para eliminar las impurezas poliméricas. El éster N-hidroxisuccinimidílico de lisina disustituida en mPEG se hizo reaccionar después con un acetal aminoalcanal, mediante la formación de un enlace amida, para formar el acetal alcanal espaciador de PEG ramificado resultante. Después, el acetal se hidrolizó fácilmente en la reacción catalizada por ácido para formar el alcanal correspondiente y, en particular, el butiraldehído de PEG (40 KDa) ramificado de 2 brazos.
Este enfoque sintético, es decir, no se limita a segmentos poliméricos ramificados, sino que puede emplearse para segmentos poliméricos que tengan cualquiera de las geometrías descritas en el presente documento.
SUMARIO DE LA SÍNTESIS GENERAL:
Figure imgf000043_0001
A. Tetra(etilenglicol) mono-butiraldehído, dietil acetal
HO-(CH2CH2O)4CH2CH2O-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2
Se secó azeotrópicamente una mezcla de tetra(etilenglicol) (97,1 g, 0,500 moles) y tolueno (200 ml) mediante destilación del tolueno a presión reducida (evaporador rotatorio). El tetra(etilenglicol) seco se disolvió en tolueno anhidro (180 ml) y se secaron una solución 1,0 M de terc-butóxido de potasio en terc-butanol (120,0 ml, 0,120 moles) y 4-clorobutiraldehído dietil acetal (18,1 g, 0,100 moles) (Alfa Aesar). La mezcla se agitó a 95-100 °C durante una noche en una atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y los disolventes se retiraron por destilación a presión reducida. El producto en bruto se disolvió en 1000 ml de agua desionizada y la solución resultante se filtró a través de carbono activo. Se añadió cloruro sódico (10 g) y el producto se extrajo con diclorometano (250, 200 y 150 ml). El extracto se secó (sobre MgSO4) y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida (por evaporación rotatoria).
El producto en bruto se disolvió en 300 ml de tampón fosfato al 10% (pH = 7,5) y las impurezas se extrajeron con acetato de etilo (2 x 50 ml). El producto se extrajo con diclorometano (200, 150 y 100 ml). El extracto se secó (sobre MgSO4) y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida (por evaporación rotatoria).
Rendimiento: 20,3 g. RMN (d6-DMSO): 1,10 ppm (t, CH3-C-) 1,51 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3,49 ppm (m a, -OCH2CH2O-), 4,46 ppm (t, -CH, acetal), 4,58 ppm (t, -OH). Pureza: ~100 % (sin signos de materiales de partida sin reaccionar).
B. Tetra(et¡lenql¡col)-a-mes¡lato-u)-but¡raldehído. dietil acetal,
CH3-S(O)2-O-(CH2CH2O)4CH2CH2O-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2
Una mezcla de tetra(etilenglicol) mono-butiraldehído, dietil acetal (12,5 g, 0,037 moles) y tolueno (120 ml) se secó azeotrópicamente mediante destilación del tolueno a presión reducida (evaporador rotatorio). El tetra(etilenglicol) mono-butiraldehído seco, dietil acetal se disolvió en tolueno anhidro (100 ml). A la solución se le añadieron 20 ml de diclorometano anhidro y 5,7 ml de trietilamina (0,041 moles). Después, se añadieron gota a gota 4,5 g de cloruro de metanosulfonilo (0,039 moles). La solución se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno durante una noche. Después, se añadió carbonato sódico (5 g) y la mezcla se agitó durante 1 h. Después, la solución se filtró y los disolventes se retiraron por destilación a presión reducida (evaporador rotatorio).
1,10 ppm (t, CH3-C-) 1,51 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3,17 ppm (s, CH3-metanosulfonato), 3,49 ppm (m a, -OCH2CH2O-), 4,30 ppm (m, -CH2-metanosulfonato), 4,46 ppm (t, -Ch , acetal).
Pureza: ~100 %.
C. Tetra(etilenglicol)-a-amino-u)-butiraldel'iído, dietil acetal
H2N-(CH2CH2O)4CH2CH2O-CH2(CH2)2-CH(OCH2CH2)2
Una mezcla de tetra(etilenglicol)-a-mesilato-w-butiraldehído, dietil acetal (14,0 g), hidróxido de amonio concentrado (650 ml) y alcohol etílico (60 ml) se agitó 42 h a temperatura ambiente. Después, todos los materiales volátiles se eliminaron por destilación a presión reducida. El producto bruto se disolvió en 150 ml de agua desionizada y el pH de la solución se ajustó a 12 con NaOH 1,0 M. El producto se extrajo con diclorometano (3 x 100 ml). El extracto se secó (MgSO4) y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida (evaporador rotatorio).
Rendimiento de 10,6 g. RMN (D2O): 1,09 ppm (t, CH3-C-) 1,56 ppm (m, C-CH2-CH2-), 2,69 ppm (t, CH2-N), 3,56 ppm (m a, -OCH2CH2O-), 4,56 ppm (t, -CH, acetal). Pureza: ~100 %.
D. PEG2(40,3 KDa)-butiraldehído ramificado, dietil acetal
Figure imgf000044_0001
Se preparó PEG2 (40 KDa)-N-hidroxisuccinimida a partir del correspondiente PEG2-lisina como se describe en la Patente U.S. n.° 5.932.462 (Harris, J., et al.). El precursor PEG-2 lisina, un PEG ramificado que tiene un grupo carboxilo ionizable, se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico, como también se describe en la Patente U.S. n.° 5.932.462.
A una solución de PEG2 (40 KDa)-N-hidroxisuccinimida (5,0 g, 0,000125 moles) (Shearagua Corporation) en cloruro de metileno (100 ml), tetra(etilenglicol)-a-amino-u>-butiraldehído, dietil acetal (0,50 g, 0,000148 moles) y trietilamina (0,035 ml) se le añadieron y la mezcla de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente en una atmósfera de argón. El disolvente se evaporó a sequedad usando un evaporador rotatorio. El producto en bruto se disolvió en cloruro de metileno y se precipitó con alcohol isopropílico. El producto húmedo se secó a presión reducida. Rendimiento de 4,8 g.
RMN (da-DMSO): 1,10 ppm (t, CH3-C), 1,51 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3,24 ppm (s, -OCH3), 3,51 ppm (s, cadena principal de PEG), 4,46 ppm (t, -CH-, acetal). Sustitución: ~100 %.
E. PEG2(40,3 KDa)-butiraldehído ramificado
Figure imgf000045_0001
Se disolvió PEG2 ramificado (40,3 KDa)butiraldehído, dietil acetal (4,8 g) en 100 ml de agua y se ajustó el pH de la solución a 3 con ácido fosfórico diluido. La solución se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente, seguido de la adición de hidróxido sódico 0,5 M suficiente para ajustar el pH de la solución a aproximadamente 7. El producto se extrajo con cloruro de metileno y el extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se retiró por destilación a presión reducida.
Rendimiento de 4,2 g. RMN (d6-DMSO): 1,75 ppm (p, -CH2-CH2-CHO-) 2,44 ppm (dt, -CH2 -CHO), 3,24 ppm (s, -OCH3), 3,51 ppm (s, cadena principal de PEG), 9,66 ppm (t, -CHO). Sustitución: ~100 %.
Lo anterior ilustra otra realización más de la invención, la preparación de un alcanal de PEG ramificado representativo. Lo anterior también ilustra una realización de la invención en la que el ancanal polimérico contiene un grupo oligomérico corto, en este caso, un tetraetilenglicol interpuesto entre la cadena principal del polímero y el segmento de alcanal de la molécula. Además, este ejemplo ilustra el uso de un segmento de polímero precursor que contiene un grupo ionizable de modo que dicho segmento de polímero se puede purificar mediante cromatografía de intercambio iónico antes de acoplarlo al reactivo de alcanal-acetal, eliminando así eficazmente las impurezas poliméricas al principio del esquema de reacción. En este caso, el producto formado está ausente de impurezas poliméricas difuncionales tales como las que surgen de reacciones de PEG-diol, o mPEG, o lisina monopegilada, o similares, que pueden haber estado presentes en el precursor de mPEG2-lisina pero se retiraron por cromatografía.
EJEMPLO 6
PREPARACION DE PROTEINA DE ALCANAL POLIMERICO CONJUGADA PEGILACION ALEATORIA DE EPO
La EPO recombinante (producida en E. coli, células de mamífero (por ejemplo, células CHO) u otra fuente microbiana) se acopla a mPEG-butiraldehído de 30 kDa (preparado como se describe en el Ejemplo 2).
Se disolvió EPO (~ 2 mg) en 1 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,6) y se añadió mPEG (30 kDa) -butiraldehído a 5 veces la concentración molar de EPO. Se añadió un agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agitó durante 24 ha temperatura ambiente para acoplar el reactivo PEG-butanal a la proteína mediante un enlace amina.
La mezcla de reacción se analizó mediante SDS-PAGE para determinar el grado de PEGilación. La confirmación del grado de PEGilación, 1 mero, 2 meros, etc. se realiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF). Los picos mostrados para especies nativas y mono-PEGiladas difieren en aproximadamente 30.000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene una mezcla de proteína nativa y monopegilada. Aumentar la relación de reactivo PEG a proteína aumenta el grado de polipegilación, es decir, la formación de 2 meros, 3 meros, etc.
El uso de alcanales de PEG de alto peso molecular que tienen un peso molecular superior a aproximadamente 20 kDa favoreció la formación de especies mono-PEGiladas. Los alcanales de PEG de menor peso molecular, cuando se acoplan a una proteína, son más propensos a la formación de especies poli-PEGiladas en estas condiciones.
Lo anterior demuestra la pegilación aleatoria de una proteína ilustrativa de la invención para producir una distribución de productos de EPO pegilados. Si se desea, la mezcla de reacción se puede separar adicionalmente para aislar los isómeros individuales como se describe a continuación.
Los conjugados de PEG que tienen diferentes pesos moleculares se separan luego mediante cromatografía de filtración en gel. Los diferentes conjugados de PEG (1 mero, 2 meros, 3 meros, etc.) se fraccionan basándose en sus diferentes pesos moleculares (en este caso, variando en aproximadamente 30 kDa). Específicamente, la separación se realizó mediante el uso de un sistema de columna en serie adecuado para la separación eficaz de productos en el intervalo de peso molecular observado, por ejemplo, una columna Superdex™200 (Amersham Biosciences). Los productos se eluyeron con 10 ml de tampón acetato a un caudal de 1,5 ml / min. Las fracciones recolectadas (1 ml) se analizaron mediante DO a 280 nm para el contenido de proteína y también usando una prueba de yodo para el contenido de PEG (Sims G. E. C., et al., Anal. Biochem, 107, 60-63, 1980). Como alternativa, los resultados se visualizan ejecutando un gel SDS PAGE, seguido de tinción con yoduro de bario. Las fracciones correspondientes a los picos eluidos se recogieron, se concentraron mediante ultrafiltración usando una membrana de corte de 10-30 kD y se liofilizaron. Este método da como resultado la separación/purificación de conjugados que tienen los mismos pesos moleculares pero no proporciona la separación de conjugados que tienen el mismo peso molecular pero diferentes sitios de pegilación (es decir, isómeros posicionales).
La separación de los isómeros posicionales se realiza mediante cromatografía de fase inversa usando una columna RP-HPLC C18 (Amersham Biosciences o Vydac). Este procedimiento es eficaz para separar isómeros de biomoléculas de PEG que tienen el mismo peso molecular (isómeros posicionales). La cromatografía de fase inversa se llevó a cabo usando una columna preparativa RP-HPLC C18 y se eluyó con un gradiente de agua/TFA al 0,05% (Eluyente A) y acetonitrilo/TFA al 0,05% (Eluyente B).
Se recogieron las fracciones correspondientes a los picos eluidos, se evaporaron para eliminar el acetonitrilo y el TFA, seguido de la eliminación del disolvente para aislar los isómeros de PEG posicionales individuales.
EJEMPLO 7
PREPARACIÓN DE PROTEÍNA DE ALCANAL POLIMÉRICO CONJUGADA N-TERMINAL PEGILACIÓN DE EPO La EPO recombinante (producida en E. coli, células de mamífero (tales como CHO, pero sin limitarse a) u otra fuente microbiana) se acopló a mPEG-butiraldehído, 30 kDa (Ejemplo 2). Se disolvió EPO (~2 mg) en 1 ml de acetato sódico 0,1 mM (pH 5) y se añadió mPEG (30 kDa) -butiraldehído (del Ejemplo 2) a 5 veces la concentración molar de EPO.
Se añadió un agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agitó durante 24 h a 4 °C para acoplar el reactivo PEG-butanal a la proteína mediante un enlace amina.
La mezcla de reacción se analizó mediante SDS-PAGE para determinar el grado de PEGilación. La confirmación del grado de PEGilación, 1 mero, 2 meros, etc. se llevó a cabo mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF). Los picos mostrados para especies nativas y mono-PEGiladas difieren en aproximadamente 30,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y monopegilada. Las especies mono-PEGiladas se purifican mediante cromatografía en columna para retirar la EPO libre y las especies de mayor peso molecular.
La confirmación de la PEGilación N-terminal se llevó a cabo mediante mapeo de péptidos. El aumento de la proporción de PEG a proteína aumenta el grado de PEGilación produciendo proteína poli-pegilada.
Lo anterior demuestra la pegilación de una proteína ilustrativa de la invención para producir una proteína pegilada única predominantemente N-terminal.
EJEMPLO 8
PEGILACIÓN N-TERMINAL DE GCSF
GCSF recombinante (producido en E. coli, células de mamífero (como células CHO) u otra fuente microbiana) se acopla a mPEG-butiraldehído, 30 kDa.
Se disolvió GCSF (~ 2 mg) en 1 ml de acetato sódico 0,1 mM (pH 5) y se añadió mPEG (30 kDa)-butiraldehído (del Ejemplo 2) a 5 veces la concentración molar de GCSF. El agente reductor, NaCNBH3, se añadió y la solución se agitó durante 24 h a 4 °C para acoplar el reactivo PEG-butanal a la proteína mediante un enlace amina.
La mezcla de reacción resultante se analizó mediante SDS-PAGE para determinar el grado de PEGilación. La confirmación del grado de PEGilación, 1 mero, 2 meros, etc. se llevó a cabo mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF). Los picos mostrados para especies nativas y mono-PEGiladas difieren en aproximadamente 30.000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de GCSF nativo y monopegilado. Las especies monoPEGiladas se purificaron mediante cromatografía en columna para retirar el GCSF libre y las especies de mayor peso molecular. La confirmación de la PEGilación N-terminal se realizó mediante mapeo de péptidos. El aumento de la proporción de PEG a proteína, aumentó el grado de PEGilación que produjo proteína poli-pegilada.
EJEMPLO 9
PEGILACIÓN N-TERMINAL DEL INTERFERÓN a
El IFN-a recombinante (producido en E. coli, células de mamífero (tales como CHO pero sin limitarse a) u otra fuente microbiana) se acopló a mPEG-butiraldehído, 30 kDa. Se disolvió interferón-a (~ 2 mg) en 1 ml de acetato sódico 0,1 mM (pH 5) y se añadió mPEG (30 kDa)-butiraldehído (del Ejemplo 2) a 5 veces la concentración molar de IFN. Un agente reductor, NaCNBH3, se añadió y la solución se agitó durante 24 h a 4 °C para acoplar el reactivo PEG-butanal a la proteína mediante un enlace amina.
La mezcla de reacción se analizó mediante SDS-PAGE para determinar el grado de PEGilación. La confirmación del grado de PEGilación, 1 mero, 2 meros, etc. se llevó a cabo mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDITOF). Los picos mostrados para especies nativas y mono-PEGiladas difieren en aproximadamente 30,000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y monopegilada. Las especies mono-PEGiladas se purifican mediante cromatografía en columna para retirar el interferón libre a y las especies de mayor peso molecular. La confirmación de la PEGilación N-terminal se realizó mediante mapeo de péptidos. El aumento de la proporción de PEG a proteína, aumentó el grado de PEGilación produciendo IFN poli-pegilado.
La conjugación de las proteínas hGH, IFN-B y FSH con otro PEG-alcanal ilustrativo, mPEG-2-metil butiraldehído, 20 kDa se lleva a cabo esencialmente como se describe en los ejemplos anteriores.
EJEMPLO 10
PEGILACIÓN N-TERMINAL DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANO
La hormona del crecimiento humana recombinante (producida en E. coli, células de mamíferos (como CHO, pero sin limitarse a ellas) u otra fuente microbiana) se acopla al mPEG-2-metil butiraldehído, 20 kDa.
Se disolvió hormona de crecimiento humana (~ 2 mg) en 1 ml de acetato sódico 0,1 mM (pH 5) y mPEG-2-metil butiraldehído, se añadieron 20 kDa a 5 veces la concentración molar de hGH. Se añadió un exceso molar de 5 a 20 veces del agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agitó durante 24 h a 4 °C para acoplar el reactivo de PEG-a metilbutanal a la proteína mediante un enlace amina.
El progreso de la reacción se analizó mediante espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDI-TOF para determinar el grado de PEGilación. La confirmación del grado de PEGilación, 1 mero, 2 meros, etc. se llevó a cabo mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDITOF). Los picos mostrados para especies nativas y mono-PEGiladas y otras difieren en aproximadamente 20.000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y monopegilada. Las especies mono-PEGiladas se purifican mediante cromatografía en columna para retirar la hGH libre y las especies de mayor peso molecular. La confirmación de la PEGilación N-terminal se realizó mediante mapeo de péptidos. El aumento de la proporción de aldehído de PEG a proteína aumenta el grado de PEGilación produciendo una población de hGH poli-pegilada.
EJEMPLO 11
PEGILACIÓN N-TERMINAL DEL INTERFERÓN B
El interferón B recombinante (producido en E. coli, células de mamíferos (como CHO pero no limitado a) u otra fuente microbiana) se acopló al mPEG-2-metil butiraldehído, 20 kDa.
Se disolvió interferón B (~ 2 mg) en 1 ml de acetato sódico 0,1 mM (pH 5) y mPEG-2-metil butiraldehído, se añadieron 20 kDa a 5 veces la concentración molar de IFN-B. Se añadió un exceso molar de 5 a 20 veces del agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agitó durante 24 h a 4 °C para acoplar el reactivo de PEG-a metilbutanal a la proteína mediante un enlace amina.
El progreso de la reacción se analizó mediante espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDI-TOF para determinar el grado de PEGilación. La confirmación del grado de PEGilación, 1 mero, 2 meros, etc. se llevó a cabo mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDITOF). Los picos mostrados para especies nativas y mono-PEGiladas y otras difieren en aproximadamente 20.000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y monopegilada. Las especies mono-PEGiladas se purifican mediante cromatografía en columna para retirar la IFN-B libre y las especies de mayor peso molecular. La confirmación de la PEGilación N-terminal se realizó mediante mapeo de péptidos. El aumento de la proporción de aldehido de PEG a proteína aumenta el grado de PEGilación produciendo una población de IFN-p poli-pegilado.
EJEMPLO 12
PEGILACIÓN N-TERMINAL DE FSH
La hormona estimulante del folículo recombinante (producida en E. coli, células de mamíferos (como CHO, pero sin limitarse a ellas) u otra fuente microbiana) se acopló al mPEG-2-metil butiraldehído, 20 kDa.
La hormona estimulante del folículo, FSH (~ 2 mg) se disolvió en 1 ml de acetato sódico 0,1 mM (pH 5) y mPEG-2-metilbutiraldehído, se añadieron 20 kDa a 5 veces la concentración molar de FSH. Se añadió un exceso molar de 5 a 20 veces del agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agitó durante 24 h a 4 °C para acoplar el reactivo de PEG­ a metilbutanal a la proteína mediante un enlace amina.
El progreso de la reacción se analizó mediante espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDI-TOF para determinar el grado de PEGilación. La confirmación del grado de PEGilación, 1 mero, 2 meros, etc. se llevó a cabo mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDITOF). Los picos mostrados para especies nativas y mono-PEGiladas y otras difieren en aproximadamente 20.000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y monopegilada. Las especies mono-PEGiladas se purifican mediante cromatografía en columna para retirar la FSH libre y las especies de mayor peso molecular. La confirmación de la PEGilación N-terminal se realizó mediante mapeo de péptidos. El aumento de la proporción de aldehído de PEG a proteína aumenta el grado de PEGilación produciendo una población de FSH poli-pegilado.
EJEMPLO 13
PEGILACIÓN N-TERMINAL DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANO
La hGH recombinante (producida en E. coli, células de mamíferos (tales como CHO pero sin limitarse a) u otra fuente microbiana) se une covalentemente a PEG2 (40,3 KDa)-butiraldehído ramificado (Ejemplo 5E).
Se disolvió hormona del crecimiento humana (~2 mg) en 1 ml de acetato sódico 0,1 mM (pH 5) y se añadió PEG2 (40,3 KDa)-butiraldehído ramificado a 5 veces la concentración molar de hGH. Se añadió un exceso molar de 5 a 20 veces del agente reductor, NaCNBH3, y la solución se agitó durante 24 h a 4 °C para acoplar el reactivo de PEG2 (40,3 KDa)-butiraldehído ramificado a la proteína mediante un enlace amina.
El progreso de la reacción se analizó mediante espectrometría de masas SDS-PAGE o MALDI-TOF para determinar el grado de PEGilación. La confirmación del grado de PEGilación, 1 mero, 2 meros (si los hay), etc. se llevó a cabo mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDITOF). Los picos mostrados para especies nativas y mono-PEGiladas y otras difieren en aproximadamente 40.000 Da. La mezcla de reacción resultante contiene principalmente una mezcla de proteína nativa y monopegilada, en particular debido al tamaño y geometría del reactivo alcanal de PEG ramificado. Las especies mono-PEGiladas se purifican mediante cromatografía en columna para retirar la hGH libre y las especies de mayor peso molecular. La confirmación de la PEGilación N-terminal se realizó mediante mapeo de péptidos.
EJEMPLO 14
PEGILACIÓN DE LA ANFOTERICINA B
El grupo amino de una molécula pequeña, anfotericina B, se modificó mediante la adhesión de un alcanal polimérico. A una solución de anfotericina B.HCl en agua desionizada se le añadió un exceso molar de 2 veces de mPEG2kbutiraldehído (Ejemplo 1) disuelto en tampón fosfato 0,1 M a pH 6,5. A esta mezcla se le añadió una solución de NaCNBH3 (con un exceso molar de 1,5 a 10 veces) en tampón fosfato a pH 6,5 y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de argón. Se extrajeron alícuotas de la mezcla de reacción a varios intervalos de tiempo para controlar el progreso de la reacción mediante RMN 1H. Tras completarse, la mezcla de reacción se diluyó adicionalmente mediante la adición de agua y se añadió NaCl para lograr la saturación. Después, el producto se extrajo con diclorometano y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron para retirar el agente secante y el disolvente se evaporó por evaporación rotatoria. Después, el producto se precipitó mediante la adición de éter dietílico y se secó al vacío durante la noche. El producto recuperado se analizó mediante cromatografía de permeación en gel para determinar el grado de conjugación.
El producto en bruto se purificó mediante cromatografía de intercambio catiónico usando resina de intercambio catiónico Poros 50 HS (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA). Después del lavado de la columna con agua desionizada, el producto se está eluyendo con solución 1 N de NaCl. Los extractos que contienen el conjugado se combinaron y el producto se extrajo con diclorometano. La solución orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y el disolvente se evaporó por evaporación rotatoria. El conjugado purificado se purificó mediante la adición de éter dietílico.
Si fuera necesario, el producto se purificó adicionalmente mediante cromatografía HPLC de fase inversa utilizando una columna Betasil C18, Keystone Scientific).
EJEMPLO 15
PREPARACIÓN DE PEG (3500 DA)-a-HIDROXI-w-BUTIRALDEHÍDO POR POLIMERIZACIÓN DE APERTURA DE ANILLO ANIÓNICO DE ÓXIDO DE ETILENO DIRECTAMENTE SOBRE UN PRECURSOR ACETAL ANIÓNICO
En este ejemplo, se preparó un precursor de acetal que tiene un sitio adecuado para iniciar la polimerización por apertura de anillo con óxido de etileno haciendo reaccionar 4-clorobutiraldehído dietil acetal con el di-alcohol, etilenglicol. De esta manera, un halo-acetal se convirtió en un acetal terminado en hidroxilo. El grupo hidroxilo, cuando se convirtió en el anión alcóxido correspondiente, proporcionó un sitio para iniciar la polimerización del óxido de etileno (EO), para formar de ese modo un precursor de alcanal polimérico. El precursor de alcanal polimérico (acetal), tras la hidrólisis, se convirtió en el alcanal polimérico deseado.
En la FIG. 1 se muestra un esquema generalizado para este enfoque sintético para preparar un alcanal polimérico de la invención. 1.
A. Preparación de 2-(4,4-d¡etox¡-butoxi)etanol (Compuesto 15A).
Figure imgf000049_0001
H0-CH2CH2-0-CH2CH2CH2CH(0CH2CH3)2
Se agitó una mezcla de etilenglicol anhidro (120 g, 1,93 moles), una solución 1,0 M de terc-butóxido potásico en terc-butanol (70 ml, 0,07 moles) y 4-clorobutiraldehído dietil acetal (11 g, 0,061 moles). durante la noche a 100 °C en una atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se añadió a 600 ml agua destilada. El producto se extrajo con diclorometano (150, 125 y 125 ml). Después, los extractos combinados se secaron con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. A continuación, el producto se sometió a destilación al vacío (kugelrohr, t = 90 - 110 °C, 0,10 mm de Hg). Rendimiento de 5,5 g. RMN (d6-DMSO): 1,11 ppm (t, 6 H), 1,53 ppm (m, -CH?CH. 2H), 1,64 ppm (m, -CH2CH2CH. 2H), 3,37 ppm (t, -O-CH2CH2CH2CH. 2H), 3,53 ppm (t, HO-CH2CH2O-, 2H), 3,62 ppm (c, -CH?CH3, 4H), 3,70 ppm (t, HO-CH2-, 2H), 4,38 ppm (t, -CH acetal, 1h ), 4,54 ppm (t, 1H, -OH).
B. Preparación de PEG(3,500 Da)-a-hidroxi-w-butiraldehído dietil acetal
naftalida potásica
Figure imgf000049_0002
H0-(CH2CH20)nCH2CH2-O-CH2CH2-0-CH2CH2CH2CH(0CH2CH3)2
Se añadieron el compuesto 15A (0,51 g, 0,00247 moles), 200 ml de THF y naftalida potásica (solución 0,3 mol/L-tetrahidrofurano, 20 ml, 0,006 moles) a un reactor de vidrio y se agitó durante 3 minutos en una atmósfera de argón. A esta solución se le añadió óxido de etileno (8 , 8 g, 0,20 moles) y la mezcla de reacción se agitó durante 44 h a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla se purgó con argón y se añadió tampón fosfato 0,1 M (pH = 8 , 100 ml): La capa de THF se separó y se descargó. El naftaleno se retiró de la solución mediante extracción con éter etílico. El producto se extrajo del residuo con diclorometano (3 x 50 ml). El extracto se secó con sulfato sódico anhidro y se concentró a aproximadamente 30 ml. A continuación, se añadió éter etílico (250 ml) y la mezcla se agitó durante 15 min a 0 °C. El producto precipitado se filtró y se secó a presión reducida.
Rendimiento de 7,2 g.
RMN (d6-DMSO): 1,09 ppm (t, CH3-, 3H) 1,52 ppm (m, C-CH2-CH2-, 4H), 3,51 ppm (s, cadena principal), 4,46 ppm (t, -CH, acetal, 1H), 4,57 ppm (t -OH, 1H).
C. PEG(3,500 DaVa-hidroxi-w-butiraldehído
Una mezcla de acetal dietílico de PEG (3500)-a-hidroxi-u>-but¡raldehído (1,0 g), agua desionizada (20 ml) y ácido fosfórico al 5% para ajustar el pH a 3,0 se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añadió cloruro sódico (1,0 g) y el pH se ajustó a 6 , 8 con hidróxido sódico 0,1 M. El producto se extrajo con diclorometano (3 x 20 ml). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se retiró por destilación. El producto húmedo se secó a presión reducida. Rendimiento: 0,82 g.
RMN (d6-DMSO): 1,75 ppm (p, -CH2-CH2-CHO-) 2,44 ppm (dt, -CH2 -CHO), 3,51 ppm (s, cadena principal), 4,57 ppm (t, -OH), 9,66 ppm (t, -CHO).
EJEMPLO 16
PREPARACIÓN DE METOXI-PEG (3500 DA) BUTIRALDEHÍDO
Este ejemplo demuestra la preparación de un PEG-alcanal con caperuza terminal ilustrativo a partir de un a-hidroxiw-alcanal acetal de PEG.
A. mPEG (3500 Da)-butiraldehído dietil acetal
Una mezcla de acetal dietílico de PEG (3500 Da)-a-hidroxi-w-butiraldehído (3,5 g, 0,001 moles), tolueno (50 ml), solución 1,0 M de ferc-butóxido potásico en ferc-butanol (5 ml, 0,005 moles) y p-toluenosulfonato de metilo (0,75 g, 0,004 moles) se agitó durante la noche a 45 °C. Después, los disolventes se retiraron por destilación a presión reducida (rotoevaporador). El producto bruto se disolvió en diclorometano y se añadió a éter etílico frío. El producto precipitado se retiró por filtración y se secó a presión reducida. Rendimiento: 3,1 g.
RMN (d6-DMSO): 1,09 ppm (t, CH3-, 3H) 1,52 ppm (m, C-CH2-CH2 -, 4H), 3,24 ppm (s, CH3O-, 3H), 3,51 ppm (s, cadena principal), 4,46 ppm (t, -CH, acetal, 1H).
B. mPEG(3,500 Da)-butiraldehído
Una mezcla de mPEG (3.500)-butiraldehído dietil acetal (1,0 g), agua desionizada (20 ml) y ácido fosfórico al 5% para ajustar el pH a 3,0 se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añadió cloruro sódico (1,0 g) y el pH se ajustó a 6 , 8 con hidróxido sódico 0,1 M. El producto se extrajo con diclorometano (3 x 20 ml). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se retiró por destilación. El producto húmedo se secó a presión reducida. Rendimiento: 0,85 g.
RMN (d6-DMSO): 1,75 ppm (p, -CH2-CH2-CHO-, 2H) 2,44 ppm (dt, -CH2 — CHO, 2H), 3,24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3,51 ppm (s, cadena principal), 9,66 ppm (t, -CHO, 1H).
EJEMPLO 17
PREPARACIÓN DE METOXI-PEG (2 KDA) 2-METILBUTIRALDEHÍDO
Este ejemplo describe la síntesis de un ancanal polimérico sustituido en 2-alquilo ilustrativo de la invención. Este polímero, en lugar de poseer una cadena de alquileno lineal que separa el carbono aldehído del enlazador, posee un sustituyente metilo en la posición C-2.
VISIÓN GENERAL: El reactivo de acetal protegido, 17-A, se preparó a partir de un material de partida disponible comercialmente, 2-metil-4-clorobutanoato, reduciendo primero el carbón butanoato al alcohol correspondiente, seguido de oxidación al butiraldehído. Después, se protegió el butiraldehído como el acetal correspondiente para proporcionar un reactivo acetal protegido para el acoplamiento a PEG. Después del acoplamiento a PEG, el polímero acetal resultante se hidrolizó en ácido para proporcionar el ancanal polimérico deseado.
A. Preparación de 4-cloro-2-met¡lbut¡raldehído dietil acetal
Preparación de 4-cloro-2-metilbutanol-1
Se añadió gota a gota una solución de 4-clorobutanoato de 2-metilo (TCI America) (22,0 g, 0146 moles) en éter etílico (80 ml) durante 30 min a una solución agitada de hidruro de litio y aluminio (4,55 g, 0,12 moles) en éter etílico (360 ml) a 0 °C en una atmósfera de argón. A continuación, se añadió gota a gota metanol (12 ml) durante un período de 30 minutos y después se añadió gota a gota HCl 2 N enfriado con hielo (420 ml) durante un período de 20 minutos. La mezcla de reacción se transfirió a un embudo de decantación y la capa de éter, que contenía 4-cloro-2-metilbutanol -1, se separó. Se extrajo más producto de la capa de agua con éter etílico (3 x 200 ml). Los extractos etéreos se combinaron, se secaron con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se destiló a presión reducida. Rendimiento de 18,6 g.
RMN (d6-DMSO): 0,84 ppm (d, -CH3, 3H), 1,50 ppm (m, -CH?CH?Cl. 1H), 1,68 ppm (m, -CH-, 1H), 1,82 ppm (m, -CH?CH?Cl. 1H) 3,26 ppm (t, -CH2OH, 2H), 3,66 ppm (m, -CH2Cl, 2H), 4,50 ppm (t, -OH, 1H).
4-Cloro-2-metilbut¡raldehído
Se añadió gradualmente clorocromato de piridinio (23,6 g, 0,110 g) a una solución agitada de 4-cloro-2-metilbutanol-1 (8,80 g, 0,078 moles) en diclorometano anhidro (470 ml). La mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente en una atmósfera de argón. Se añadió éter seco (820 ml); la mezcla se agitó durante 20 minutos y después se filtró para retirar el exceso de agente oxidante. Después, la solución se filtró a través de una columna llena con 400 g de Florisil y los disolventes se retiraron por destilación a presión reducida. Rendimiento de 6,0 g. RMN (d6-DMSO): 1,06 ppm (d, -CH3, 3H), 1,74 ppm (m, -CH2CH2CL 1H), 2,14 ppm (m, -CH2CH2CL 1H), 2,56 ppm (m, -CH, 1H), 3,69 ppm (m, -CH2C 2H), 9,60 ppm (t, -CHO, 1H).
4-Cloro-2-met¡lbut¡raldehído dietil acetal
Se agitó una mezcla de 4-cloro-2-metilbutiraldehído (4,8 g, 0,040 moles), ortoformiato de trietilo (6,48 g, 0,044 moles), alcohol etílico (3,0 g) y ácido p-toluensulfónico monohidrato (0,0144 g, 0,000757 moles) a 45 °C durante la noche en una atmósfera de argón. A continuación, después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió Na2CO3 (0,40 g) y la mezcla se agitó durante 15 min. La mezcla de reacción se filtró y se retiraron por destilación alcohol etílico y ortoformiato de trietilo residual a presión reducida. El residuo se sometió a destilación fraccional al vacío dando 3,2 g de 4-cloro-2-metilbutiraldehído dietil acetal puro.
RMN (d6-DMSO): 0,85 ppm (d, -CH3, 3H) 1,13 ppm (m, -CH3, 6 H), 1,52 ppm (m, -CH-, 1H), 1,87 ppm (m, -CH?CH?Cl.
2H), 3,35 - 3,75 ppm (m a, -OCH^CHa, 4H y -CH2C 2H), 4,22 ppm (d, -CH acetal, 1H).
B. mPEG (2KDa)-2-Met¡lbut¡¡aldehído. dietil acetal
Se secó azeotrópicamente una solución de mPEG (2KDa) (2,0 g, 0,001 moles) en tolueno (30 ml) mediante destilación del tolueno a presión reducida. El mPEG 2K seco se disolvió en tolueno anhidro (15 ml) y una solución 1,0 M de ferc-butóxido potásico en ferc-butanol (4,0 ml, 0,004 moles) y 4-cloro-2-metilbutiraldehído dietil acetal de A anterior (0,5 g, 0,00277 moles). A continuación, se añadió bromuro de litio (0,05 g) y la mezcla se agitó a 100 °C durante una noche en una atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y se añadió a 150 ml de éter etílico a 0-5 °C. El producto precipitado se retiró por filtración y se secó a presión reducida. Rendimiento: 1,5 g.
RMN (d6-DMSO): 0,83 ppm (d, -CH3, 3H) 1,10 ppm (m, -CH3O, 6 H), 1,24 ppm (m, -CH-, 1H), 1,72 ppm (m, PEG-O-CH2-CH2-, 2H), 3,24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3,51 ppm (s, cadena principal), 4 , 1 8 ppm (d, -c H acetal, 1H).
Sustitución: ~100 %.
C. mPEG (2KDa)-2-Metilbutiraldehído
Una mezcla que contenía mPEG (2KDa)-2-metilbutiraldehído, dietil acetal de B anterior (1,0 g), agua desionizada (20 ml) y ácido fosfórico al 5% para ajustar el pH a 3,0 se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añadió cloruro sódico (1,0 g) y el pH se ajustó a 6 , 8 con hidróxido sódico 0,1 M. El producto se extrajo con diclorometano (3 x 20 ml). El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. Rendimiento: 0,83 g.
RMN (d6-DMSO): 1,01 ppm (d, -CH3, 3H) 1,56 ppm (m, -CH, 1H), 1,90 ppm (m, PEG-O-CH2-CH2-, 1H), 2,45 ppm (m, PEG-O-CH2-CH2-, 1H), 3,24 ppm (s, -OCH3, 3 H), 3,51 ppm (s, cadena principal), 9,56 ppm (d, -CH aldehído, 1H). Sustitución: ~100 %.

Claims (33)

REIVINDICACIONES
1. Un polímero soluble en agua que tiene la estructura:
Figure imgf000052_0001
I
en donde:
POLY es un segmento de polímero soluble en agua;
X' es un resto enlazador que comprende uno o más átomos que no son una extensión de uno o más monómeros del segmento de polímero soluble en agua;
z' es un número entero de 3 a 12;
R1, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, y además en donde se aplica lo siguiente:
- cuando POLY es lineal:
(a) el número total de carbonilos presentes en dicho polímero sin contar el (los) carbono (s) aldehído es 0 o 2 o más, excepto cuando X 'comprende uno o más segmentos contiguos (-CH2CH2O-),
(b) y además en donde X' es oxígeno o comprende al menos un segmento (-CH2CH2O-), entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o dicho polímero es heterobifuncional, donde POLY comprende un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxi, y
- cuando POLY es ramificado:
(c) (i) al menos uno de R1 o R2 en al menos una aparición es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o (ii) X' incluye -(CH2CH2O)b- donde b es de 1 a 20 en el caso donde POLY comprende un residuo de lisina,
(d) y además en el que dicho POLY tiene 2 brazos de polímero, entonces ninguno de los brazos del polímero comprende oxígeno como único heteroátomo en el caso donde POLY comprende "C-H" como punto de ramificación,
con la condición de que el polímero soluble en agua no sea uno de los siguientes:
Figure imgf000052_0002
OH
R-(CH2CH20) 10.10.000 -CHjCHzNH-ÍCH^Ti c (c h 2)i -8 NH-ÍCH^.a-CHO
H
Figure imgf000053_0001
OHC-(CH2)i -3NH-C(O)-(CH2)l-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)10.10000-CH2CH2-O-(CH2)l-17-C(O)-NH-(CH2)l-3-CHO
OHC-(CH2)i -3NH-C(O)-(CH2)l-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)i0-10000-CH2CH2-NH-(CH2)l-17-C(O)-NH-(CH2)l-3-CHO
OHC-(CH2)i-3NH-C(O)-(CH2)i-i7-OCH2CH2-(CH2CH2O)i0-i0000-CH2CH2-O-C(O)-NH-(CH2)i-3-CHO
OHC-(CH2)i-3NH-C(O)-(CH2)i-i7-OCH2CH2-(CH2CH2O)i0-i0.000-CH2CH2-NH-C(O)-NH-(CH2)i-3-CHO donde R es un grupo con caperuza terminal y Z es una cadena lateral de un aminoácido.
2. El polímero de la reivindicación 1, que tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000053_0002
en donde en cada una de las estructuras anteriores, POLY, X', cada R1 y cada R2 son como se han definido previamente.
3. Una cualquiera de las estructuras poliméricas de la reivindicación 2, en donde el R1 unido a C2 es alquilo, y todas las demás variables de R1 y R2 son H.
4. La estructura polimérica I-A de la reivindicación 3, en donde el R1 unido a C2 es alquilo inferior.
5. Una cualquiera de las estructuras poliméricas de la reivindicación 2, en donde el R1 unido a C3 es alquilo, y todas las demás variables de R1 y R2 son H.
6. El polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde X' comprende un resto correspondiente a la estructura:
-(CH2)c-De-(CH2)fo
-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q--en donde:
c es de cero a 8,
D es O, NH o S,
e es 0, 1
f es de cero a 8,
p es de cero a 8,
M es — NH, O
K es NH, O
q es de cero a 8, y
r y s son cada uno independientemente 0, 1.
7. El polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde X' comprende -(CH2CH2O)b- o -(CH2CH2NH)g- y b y g son cada uno independientemente de 1 a 20.
8. El polímero de la reivindicación 7, en donde los valores de b y g varían cada uno independientemente de 1 a 10 o de 1 a 6.
9. El polímero de la reivindicación 6, en donde X' comprende:
-(CH2)c-De-(CH2)f-P-o
-(CH2)p-Mr-C(O)-Ks-(CH2)q-T--en donde:
P y T son cada uno independientemente -(CH2CH2O)b- o -(CH2CH2NH)g,
b y g son cada uno independientemente de 1 a 20,
y las restantes variables son como se definen en la reivindicación 6.
10. El polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha X' comprende -C ^N H ^C H ^- i^NH-C(O)- o — N-HC(O)NH-(CH2)1-6NH-C(O)-.
11. El polímero de una cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en donde POLY se selecciona entre el grupo que consiste en poli(óxido de alquileno), poli(vinil pirrolidona), poli(alcohol vinílico), polioxazolina, poli(acriloilmorfolina) y poli(poliol oxietilado).
12. El polímero de la reivindicación 11, en donde POLY es un poli(óxido de alquileno).
13. El polímero de la reivindicación 12, en donde POLY es a poli(etilenglicol).
14. El polímero de la reivindicación 13, en donde el poli(etilenglicol) está rematado terminalmente con un resto de remate seleccionado del grupo que consiste en alcoxi, alcoxi sustituido, alqueniloxi, alqueniloxi sustituido, alquiniloxi, alquiniloxi sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido.
15. El polímero de la reivindicación 14, en donde el resto con caperuza terminal se selecciona entre el grupo que consiste en metoxi, etoxi y benciloxi.
16. El polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde el poli(etilenglicol) tiene una masa molecular promedio nominal seleccionada del grupo que consta de 100 daltons a 100.000 daltons, de 1.000 daltons a 50.000 daltons y de 2.000 daltons a 30.000 daltons.
17. El polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en donde dicho poli(etilenglicol) tiene una estructura seleccionada entre el grupo que consiste en lineal, ramificado y bifurcado.
18. El polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 6 a 13, que comprende la estructura:
Figure imgf000055_0001
en donde POLY, cada X', cada (z') y cada R1 y cada R2 son como se han definido anteriormente.
19. El polímero de la reivindicación 18, en donde dicho POLY es lineal y el polímero es homobifuncional.
20. El polímero de la reivindicación 13, en donde dicho poli(etilenglicol) comprende la estructura:
Z-(CH2CH2O)no
Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-, donde n es de 10 a 4.000, y Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en hidroxi, amino, éster, carbonato, aldehído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, hidrazida, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, lípido, fosfolípido, biotina y fluoresceína.
21. El polímero de la reivindicación 1, que tiene una estructura seleccionada entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000055_0002
Figure imgf000056_0001
IV-C
en donde PEG es poli(etilenglicol), b y g son cada uno independientemente de 0 a 2 0 , a es de 0 a 6 , y las variables restantes son como se definen en la reivindicación 1.
22. El polímero de la reivindicación 21, en donde PEG tiene una estructura que es lineal, ramificada o bifurcada.
23. El polímero de la reivindicación 21 o 22, en donde los valores para b, g, z' y a se seleccionan cada uno independientemente entre el grupo que consiste en:
(i) b y g cada uno varía independientemente de 1 a 8 o de 1 a 6 ,
(ii) z' varía de 2 a 6 , o es 3, y
(iii) a es 0 o 1.
24. El polímero de la reivindicación 21, que tiene la estructura:
Figure imgf000056_0002
lll-D
25. El polímero de la reivindicación 24, en donde "PEG" tiene una estructura correspondiente a:
Z-(CH2CH2O)n-,
o
Figure imgf000056_0003
en donde n en cada aparición es independientemente de 10 a 4.000, y Z comprende un resto seleccionado entre el grupo que consiste en hidroxi, éster, carbonato, aldehído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, fosfolípido, biotina y fluoresceína.
26. El polímero de la reivindicación 25, en donde Z es alcoxi, y n en cada caso es el mismo y varía de 100 a 600.
27. El polímero de la reivindicación 1, que tiene la estructura:
Figure imgf000057_0002
en donde:
PEG es un poli (etilenglicol) que es lineal o ramificado,
b es de 0 a 2 0 ,
s es de 0 a 6 ,
d es 1, 2 o 3,
y las restantes variables son como se definen en la reivindicación 1.
28. El polímero de la reivindicación 27, en donde d es 2 y PEG corresponde a la estructura:
Figure imgf000057_0001
en donde n es de 10 a 4000, Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en hidroxi, éster, carbonato, aldehído, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, maleimida, hidrazida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, alcoxi, benciloxi, silano, lípido, fosfolípido, biotina y fluoresceína, y las demás variables son como se definen en la reivindicación 27.
29. Una forma de hidrato o acetal del polímero soluble en agua de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
30. El acetal de la reivindicación 29, en donde dicho acetal se selecciona del grupo que consiste en dimetil acetal, dietil acetal, di-isopropil acetal, dibencil acetal, 2,2,2-tricloroetil acetal, bis(2-nitrobencil) acetal, S,S'-dimetil acetal y S,S'-dietil acetal y dioxolanos.
31. Un conjugado formado por reacción de una molécula diana que lleva al menos un grupo amino reactivo con el polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
32. El conjugado de la reivindicación 31, en donde dicha molécula diana es un agente biológicamente activo.
33. Un conjugado que comprende la siguiente estructura:
Figure imgf000058_0001
en donde:
POLY es un segmento de polímero soluble en agua;
X' es un resto enlazador que comprende uno o más átomos que no son una extensión de uno o más monómeros del segmento de polímero soluble en agua;
z' es un número entero de 3 a 12;
R1, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido; R2, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico seleccionado entre el grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, - "NH-agente biológicamente activo" representa un agente biológicamente activo que comprende un grupo amino, y además en el que se aplica lo siguiente:
- cuando POLY es lineal:
(a) el número total de carbonilos presentes en dicho polímero es 0 o 2 o mayor excepto cuando X 'comprende uno o más segmentos contiguos (-CH2CH2O-),
(b) y además en donde X' es oxígeno o comprende al menos un segmento (-CH2CH2O-), entonces al menos uno de R1 o R2 en al menos un caso es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o dicho polímero es heterobifuncional, donde POLY comprende un grupo reactivo en un extremo que no es hidroxi, y
- cuando POLY es ramificado:
(c) (i) al menos uno de R1 o R2 en al menos una aparición es un radical orgánico como se ha definido anteriormente o (ii) X' incluye -(CH2CH2O)b- donde b es de 1 a 20 en el caso donde POLY comprende un residuo de lisina,
(d) y además en el que dicho POLY tiene 2 brazos de polímero, entonces ninguno de los brazos del polímero comprende oxígeno como único heteroátomo en el caso donde POLY comprende "C-H" como punto de ramificación,
con la condición de que POLY-X'-[CR1R2]z'-CH2- no se obtenga a partir de uno de los siguientes:
Figure imgf000058_0002
Figure imgf000059_0001
OHC-(CH2)i -3NH-C(O)-(CH2)l-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)l0-10000-CH2CH2-O-(CH2)l-17-C(O)-NH-(CH2)l-3-CHO OHC-(CH2)i -3NH-C(O)-(CH2)l-17-OCH2CH2-(CH2CH2O)i0-10000-CH2CH2-NH-(CH2)l-17-C(O)-NH-(CH2)l-3-CHO OHC-(CH2)i-3NH-C(O)-(CH2)i-i7-OCH2CH2-(CH2CH2O)io-ioooo-CH2CH2-O-C(O)-NH-(CH2)i-3-CHO OHC-(CH2)i-3NH-C(O)-(CH2)i-i7-OCH2CH2-(CH2CH2O)io-io.ooo-CH2CH2-NH-C(O)-NH-(CH2)i-3-CHO
donde R es un grupo con caperuza terminal y Z es una cadena lateral de un aminoácido.
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