ES2284864T3 - Metodo dielectroforetico y aparato para seleccion de alto rendimiento. - Google Patents

Abstract

Método de realización de pruebas y ensayos de alto rendimiento y elevado valor biológico en una muestra que contiene material químico/biológico que consiste en entidades desconocidas caracterizado porque comprende las etapas de: (a)- introducir la muestra que incluye dichas entidades desconocidas dentro de una primera cámara de un dispositivo de pruebas que comprende al menos una serie de primeros electrodos excitables y direccionables de forma selectiva y al menos un segundo electrodo colocado enfrente de y orientado hacia los primeros electrodos, (b)- introducir material químico/biológico dentro de una primera cámara de dicho dispositivo de pruebas, que consiste en entidades conocidas identificables en el interior de dicho dispositivo de pruebas y que tienen una supuesta afinidad por las entidades desconocidas; (c)- crear de forma selectiva primer y segundo compartimentos de potencial dielectroforético móviles cerrados en el interior de dicha primera cámara generados mediante dichos primeros electrodos y segundo electrodo y atrapar al menos una parte de dichas entidades desconocidas en el interior de los primeros compartimentos móviles y al menos una parte de dichas entidades conocidas en el interior de los segundos compartimentos móviles; (d)- mover al menos uno dichos segundos compartimentos móviles que contienen las entidades conocidas hacia dichos primeros compartimentos móviles que contienen dichas entidades desconocidas y hacer que al menos una entidad desconocida interaccione con al menos una entidad conocida de al menos un primer tipo ocasionando la fusión de al menos un primer compartimento móvil y un segundo compartimento móvil que contienen las entidades relativas; (e)- verificar la creación o de otra manera un enlace estable entre dicha al menos una entidad desconocida y dicha al menos una entidad conocida del primer tipo para determinar si existe afinidad entre las dos e identificar en consecuencia dicha al menos una entidad desconocida.

Description

Método dielectroforético y aparato para selección de alto rendimiento.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de manipulación de partículas que utiliza fuerzas dielectroforéticas para procedimientos de selección de elevado valor biológico realizadas sobre compuestos farmacéuticos posibles, aplicable al análisis diagnóstico y agroalimentario. La invención también se refiere a un dispositivo para la ejecución del método descrito.

Antecedentes de la invención

En un campo de la técnica en expansión que abarca el descubrimiento de nuevos fármacos y la química combinatoria usada en la preparación de nuevos compuestos candidatos, sería especialmente ventajoso poder examinar un gran número de sustancias por medio de un procedimiento que proporcione un alto rendimiento, con el fin de observar su impacto fisiológico sobre animales y sobre seres humanos. Antes de probar la eficacia de un fármaco candidato "parcialmente satisfactorio" en animales, debe someterse a prueba la sustancia para determinar su posible toxicidad con respecto a las células vivas. Por el contrario, la práctica habitual es que los compuestos prometedores se sometan a prueba casi inmediatamente en estudios extensos sobre modelos animales, estudios que son al mismo tiempo largos y costosos. Además, la práctica de pruebas extensas sobre animales está volviéndose cada vez menos aceptable culturalmente en los Estados Unidos y en Europa. Si se someten a prueba compuestos farmacéuticos posibles para observar sus interacciones con células vivas antes de que se realicen los estudios en modelos animales, esto puede reducir el número de animales necesarios para los ensayos posteriores eliminando muchos de los candidatos antes de que se alcance la fase de pruebas sobre animales.

Los procedimientos actuales para el análisis de la interacción célula-fármaco no permiten ni un alto rendimiento ni un elevado valor biológico, debido al número limitado de células y compuestos que pueden analizarse en un periodo de tiempo dado, la escasa practicidad de los métodos necesarios para administrar los compuestos, y los volúmenes considerables del compuesto requeridos.

Por consiguiente, se han realizado esfuerzos para superar estos inconvenientes estudiando métodos alternativos para el análisis de las interacciones entre células y fármacos, o más generalmente entre muestras biológicas y agentes biológicamente activos, tales como los indicados más adelante a modo de ejemplo.

Matrices celulares

Se han descrito varios métodos para producir matrices celulares micromodeladas uniformemente, por ejemplo, la fotolitografía (Mrksich & Whitesides, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 25:55-78, 1996). Según este método, que usa una placa de vidrio, se emplean un material fotosensible y una máscara para obtener una placa que presenta una matriz de puntos hidrófilos o reactivos sobre una superficie que por el contrario es hidrófoba. La matriz de grupos hidrófilos proporciona un sustrato sobre el que se obtiene un enlace no específico y no covalente de ciertos tipos de células, incluyendo las de origen neuronal (Kleinfeld et al., J. Neurosci. 8:4098-4120,1988).

En otro método basado en interacciones específicas pero no covalentes, se usa la fotoimpresión para producir una superficie dorada que presenta puntos de laminina, una proteína de unión a células que se encuentra normalmente en la matriz extracelular (Singhvi et al., Science 264: 696-698, 1994).

Puede obtenerse un enlace uniforme más específico entrecruzando moléculas específicas, tales como proteínas, en los sitios reactivos del sustrato modelado (Aplin & Hughes, Analyt. Biochem. 113: 144-148, 1981).

Otro desarrollo de un sistema óptico para modelar un sustrato y crear puntos reactivos se basa en el uso de rayos UV profundos dirigidos a través de una máscara óptica, para obtener sitios activos que consisten en grupos de silanol polares. Estos grupos constituyen los puntos de la matriz y se modifican adicionalmente emparejándolos con otros grupos reactivos, tal como se describe en la patente estadounidense número 5.324.591. Este método óptico de formar matrices celulares uniformes sobre un sustrato requiere menos etapas que el método de fotolitografía, pero requiere luz ultravioleta de alta intensidad, y las fuentes de luz adecuadas son muy costosas.

Además en todos estos métodos, la matriz celular resultante es uniforme, ya que las moléculas bioquímicamente específicas están unidas a las matrices químicamente micromodeladas. Con el método de fotolitografía, las células se unen a matrices de puntos hidrófilos y/o a moléculas específicas unidas a los puntos que se unen a las células. Por consiguiente, las células se unen a todos los puntos de la matriz de la misma forma. Con el método óptico, las células se unen mediante adhesión a matrices que contienen puntos de grupos de aminoácidos libres. Hay muy poca o ninguna diferencia entre estos puntos. Aquí de nuevo, las células se unen a todos los puntos de la misma forma y sólo es posible estudiar un tipo dado de interacción celular usando estas matrices, ya que cualquier punto es esencialmente el mismo que el anterior.

\newpage

Por tanto, este tipo de matrices carece de flexibilidad como instrumento para el análisis de una única variedad específica de célula o interacción. En consecuencia, surge la necesidad de producir matrices celulares que no estén uniformemente micromodeladas, de modo que se aumente el número de células o interacciones que pueden analizarse simultáneamente.

Las solicitudes de patente internacionales WO 00/39587 y WO 00/47996 ilustran un sistema de detectores y métodos para preparar matrices, de material compuesto o de otro modo, de perlas o células ordenadas aleatoriamente en los extremos de haces de fibras ópticas. Mientras que por un lado los métodos descritos en estas solicitudes ofrecen un gran potencial analítico, especialmente en el caso de proteínas y ácidos nucleicos, existe el inconveniente de que no permiten al experimentador ni separar ni mucho menos recuperar poblaciones de interés que puedan identificarse.

Fisiología celular y fluorescencia

Realizar un ensayo de alto rendimiento sobre muchos miles de compuestos requiere la manipulación en paralelo y el tratamiento de muchos compuestos y de los reactivos incluidos en el ensayo; además, debe haber un método de identificación y medición de los resultados del experimento de la forma más sencilla posible. Los ensayos más comunes usan combinaciones homogéneas de compuestos y reactivos biológicos junto con al menos un compuesto marcador, cargados en una placa de microtitulación de 96 o 386 pocillos convencional (Kahl et al., J. Biomol. Scr. 2:33-40, 1997). Las señales medidas de cada pocillo, ya sean emisiones de fluorescencia, densidad óptica o radiactividad, se integran con la señal de todo el material que ocupa el pocillo para dar un promedio general de la población de todas las moléculas en el pocillo. Este tipo de ensayo se denomina comúnmente ensayo homogéneo.

Ya que la fluorescencia se encuentra entre los sistemas más ampliamente usados, se han desarrollado diversos métodos para generar imágenes de células fluorescentes con un microscopio y extraer información sobre la distribución espacial y los cambios que se producen a lo largo del tiempo en estas células. Muchos de estos métodos y sus aplicaciones se describen en un artículo de Taylor et al., Am. Scientist 80: 322-335,1992.

Los métodos propuestos se han diseñado y optimizado con la preparación de un pequeño número de muestras de manera que puede medirse la distribución, cantidad y perfil bioquímico de moléculas indicadoras fluorescentes presentes en las células obteniendo un elevado nivel de resolución espacial y temporal.

Los métodos útiles de detección incluyen tratar las células con reactivos colorantes y fluorescentes para obtener imágenes y/o modificar genéticamente las células de tal forma que produzcan proteínas fluorescentes, como proteína fluorescente verde (GFP) modificada. El uso de GFP en el estudio de la expresión génica y la localización de proteínas se trata en detalle por Chalfic et al., in Science 263: 803-805.

No obstante, estos métodos son complejos, costosos y lentos, y sólo pueden usarse para estudiar células en grupos, no individualmente.

Dielectroforesis

La dielectroforesis se refiere al fenómeno físico mediante el cual partículas dieléctricas sometidas a campos eléctricos c.c. y/o c.a. no uniformes espacialmente experimentan una fuerza neta dirigida hacia aquellas regiones del espacio caracterizadas por una intensidad de campo creciente (pDEP) o decreciente (nDEP). Si la intensidad de las fuerzas resultantes es comparable a la fuerza de la gravedad, en esencia es posible crear un equilibrio de fuerzas que permite la levitación de partículas pequeñas. La intensidad, dirección y orientación de la fuerza dielectroforética dependen en gran medida de las propiedades conductoras y dieléctricas del cuerpo y del medio en el que está inmerso, y a su vez, estas propiedades varían con la frecuencia.

Los estudios que analizan los efectos de las fuerzas dielectroforéticas sobre microorganismos o materia biológica en general (células, bacterias, virus, ADN, etc.), y sobre materia inorgánica, han sugerido durante algún tiempo la idea de explotar estas fuerzas como un medio para seleccionar un cuerpo particular a partir de una muestra que contiene una pluralidad de microorganismos, caracterizando las propiedades físicas de los microorganismos y en general permitiendo su manipulación.

A modo de ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 00/47322 enseña la manipulación de "paquetes" genéricos de sustancias (líquidas, sólidas o gaseosas) utilizando fuerzas dielectroforéticas generadas entre electrodos contiguos de una serie direccionable. Sin embargo, el método descrito en esta referencia no es adecuado para realizar un estudio de elevado valor biológico sobre células y más generalmente sobre microorganismos o partes de los mismos (secuencias de ADN y ARN, plásmidos, etc.), ya que por un lado se somete el "paquete" a voltajes significativos para permitir su manipulación mediante dielectroforesis, y por otro lado, se somete más generalmente a la fricción contra la superficie de reacción que lleva la serie de electrodos.

La técnica anterior abarca otro sistema basado en la creación de compartimentos de manipulación celular tridimensionales construyendo microoctopolos (T. Schnelle et al., en Biochimica et Biophysica Acta, 1157:127-140); en este caso, se hace levitar el material celular y por tanto no se ve afectado por estrés por fricción u otro estrés mecánico, particularmente en el caso en el que las dimensiones de los sistemas de manipulación adoptados son comparables con aquellas de las partículas que están manipulándose, reduciendo así el orden de magnitud de los voltajes usados para crear las distribuciones de campo necesarias cuando aparecen efectos no deseables (Washizu & Kurosawa, Trans. Ind. Appl. 26:1165-1172, 1990; Washizu et al., Trans. Ind. Appl. 30:835-843, 1994).

Sin embargo, las estructuras propuestas en la bibliografía encuentran problemas de realización cuando las dimensiones de los compartimentos previstos se aproximan a las de las células reales (con el fin de atrapara una célula individual). En este caso, los problemas consisten en alinear las dos estructuras que, montadas entre sí a una escala micrométrica, constituyen el octopolo.

Este problema particular se resuelve según la solicitud de patente internacional WO 00/69565, que describe un aparato y un método para la manipulación de partículas (el término "partículas" se usa a continuación en el presente documento para referirse a elementos manipulados de forma dielectroforética utilizados en experimentos, ya sean entidades biológicas, sustancias combinadas con un agente de administración, o ambas; a partir del contexto podrá apreciarse cual de los tres casos se pretende) utilizando compartimentos de potencial dielectroforético cerrados. Se conocen más métodos a partir de los documentos WO 00/32774, EP-A-1088592, WO 99/38612, EPA-0915942 y WO 00/47322.

En cualquier caso, estos últimos métodos de manipulación basados en la levitación dielectroforética del material para análisis están actualmente limitados a la separación y/o recuento de las partículas manipuladas permitido mediante reconocimiento de las propias partículas usando detectores adecuados de tipo específico preparados e integrados en la serie de electrodos y/o dispuestos en el interior o el exterior de la cámara en la que tiene lugar la manipulación por levitación. Esto significa que tales métodos sólo pueden usarse para partículas con características distintivas intrínsecas (diferenciadas basándose en el tamaño, por ejemplo) detectables con detectores específicos, que deben prepararse según cada caso.

Sumario de la invención

El objeto la invención es superar los diversos inconvenientes encontrados en los métodos de la técnica anterior tal como se resumió anteriormente para la manipulación de células y más generalmente de material químico/biológico, con el fin de que los ensayos químicos y farmacológicos de alto rendimiento puedan realizarse de manera rápida, eficaz, económica, con precisión y sin la necesidad (al menos inicialmente) de usar animales como cobayas.

Material químico/biológico, en particular, aquí y a lo largo de la memoria descriptiva, significa cualquier "entidad" dada ya consista en un "compuesto" o una "unidad compuesta" tal como se define a continuación, o en una célula.

Aquí y a lo largo de la memoria descriptiva, se entiende que el término "compuesto" quiere decir cualquier sustancia dada que probablemente puede tener actividad farmacéutica, concretamente ADN posiblemente transformante o una sustancia química, tal como se encuentre o si es necesario inmovilizada adecuadamente sobre la superficie de microperlas o microencapsulada en una bicapa lipídica o liposoma, o en un virus, genéticamente modificado o por de otro modo, que puede funcionar como un vector para material genético. Aquí y a lo largo de la memoria descriptiva se entiende que el término "unidad compuesta" quiere decir un liposoma que contiene una cantidad predeterminada de un compuesto tal como se definió anteriormente, o un virus vector único. En el caso de que se usen sustancias químicas para recubrir una microperla, se entiende que "unidad compuesta" significa una microperla que tiene una cantidad de compuesto predeterminada inmovilizada sobre su superficie.

Teniendo presentes las anteriores definiciones, un primer objeto de la presente invención es proporcionar un método para realizar pruebas y ensayos de alto rendimiento y elevado valor biológico sobre entidades que consisten en células individuales o en unidades compuestas, cuya naturaleza puede incluso desconocerse en un principio, de forma que permitirá la identificación de células o unidades compuestas de naturaleza desconocida en una población inicialmente mixta y posiblemente separar después las células y/o unidades compuestas identificadas de la población inicial.

Un segundo objeto de la invención es proporcionar un método para realizar pruebas y ensayos de alto rendimiento y elevado valor biológico sobre células individuales, que permitirá identificar la actividad biológica de uno o más compuestos seleccionados sobre las células individuales, administrados posiblemente mediante una o más unidades compuestas identificables individualmente, monitorizando la respuesta de la célula a la administración de tales compuestos. Preferiblemente, también es un objeto de la invención proporcionar un método del tipo propuesto para someter a ensayo la actividad biológica que permitirá administrar un compuesto cada vez a las células, empleando preferiblemente dosificaciones ajustables y predeterminadas.

Un tercer objeto de la invención es proporcionar a dispositivo de pruebas que hace uso de la manipulación dielectroforética y que será adecuado para poner en práctica los métodos indicados anteriormente, permitiendo la levitación estable de partículas dieléctricas neutras o partículas cargadas eléctricamente (células o compuestos), con el fin de verificar y controlar la posición de cada célula individual y compuesto presente en el dispositivo.

Finalmente, un objeto adicional de la invención es proporcionar un método sencillo, rápido, eficaz y fiable para administrar compuestos o unidades compuestas a células o microorganismos. Considerando un primer aspecto de la descripción, la invención se refiere a un método para realizar pruebas y ensayos alto rendimiento y elevado valor biológico sobre una muestra que contiene material químico/biológico que consiste en entidades desconocidas, tal como se reivindica en la reivindicación 1. En particular tal método comprende las etapas de:

(a)-

introducir la muestra que incluye las entidades desconocidas dentro de una primera cámara de un dispositivo de pruebas que comprende al menos una serie de primeros electrodos excitables y direccionables de forma selectiva y al menos un segundo electrodo colocado enfrente de y orientado hacia los primeros electrodos;

(b)-

introducir material químico/biológico dentro de la primera cámara del dispositivo de pruebas, que consiste en entidades conocidas identificables en el interior de dicho dispositivo de pruebas y que tienen una supuesta afinidad con las entidades desconocidas;

(c)-

crear de forma selectiva compartimentos de potencial móviles cerrados en el interior de la primera cámara por medio de fuerza dielectroforética generada por los electrodos enfrentados y atrapar al menos una parte de las entidades desconocidas en el interior de los compartimentos móviles;

(d)-

mover al menos uno de los compartimentos móviles que contienen las entidades conocidas hacia los compartimentos móviles que contienen las entidades desconocidas y hacer que al menos una entidad desconocida interaccione con al menos una entidad conocida de al menos un primer tipo ocasionando la fusión de al menos un par de compartimentos móviles que contienen las entidades relativas;

(e)-

verificar la creación o de otro modo de un enlace estable entre al menos una entidad desconocida y al menos una ha entidad conocida del primer tipo, con el fin de determinar si existe afinidad entre las dos e identificar en consecuencia la al menos una entidad desconocida.

Las entidades desconocidas identificadas de esta manera se recuentan y se separan preferiblemente de las entidades restantes y se recuperan en el exterior del dispositivo de pruebas tras transferirse a una segunda cámara del dispositivo de pruebas.

De esta forma, y en particular utilizando microperlas como entidades conocidas (funcionalizadas por ejemplo con anticuerpos especiales o con un ligando), puede utilizarse el método según la invención en el campo del diagnóstico para identificar y posiblemente recontar un microorganismo dado en una muestra, para separar células basándose en las características antigénicas, por ejemplo tal como para separar células neoplásicas de células normales, o para estudiar la respuesta celular activada por la unión de un ligando a su receptor específico.

Considerando un segundo aspecto de la descripción, la invención se refiere a un método de realizar pruebas y ensayos de alto rendimiento y elevado valor biológico sobre una pluralidad de primeras entidades seleccionadas de un grupo que incluye células, virus, microorganismos, ácidos nucleicos y combinaciones de las mismas, y una pluralidad de segundas entidades que consisten en compuestos o unidades compuestas que van a someterse a prueba para determinar su actividad biológica sobre las primeras entidades tal como se reivindica en la reivindicación 20; en particular tal método comprende las etapas de:

(a)-

introducir las primeras y segundas entidades dentro de una primera cámara de un dispositivo de pruebas que comprende al menos una serie de primeros electrodos excitables y direccionables de forma selectiva y al menos un segundo electrodo colocado enfrente de y orientado hacia los primeros electrodos;

(b)-

crear de forma selectiva compartimentos de potencial móviles cerrados en el interior de la primera cámara por medio de fuerza dielectroforética generada por los electrodos enfrentados y atrapar al menos una parte de las entidades en el interior de los compartimentos móviles;

(c)-

mover al menos uno de los compartimentos móviles que contienen las primeras entidades hacia los compartimentos móviles que contienen las segundas entidades y hacer que al menos una primera entidad interaccione con al menos una segunda entidad de al menos un primer tipo ocasionando la fusión de al menos un par de compartimentos móviles que contienen las entidades relativas;

(d)-

verificar la actividad biológica de la segunda entidad sobre la primera entidad analizando la interacción resultante utilizando detectores que pueden de detectar cualquier prueba en la primera entidad de al menos uno de un grupo seleccionado de efectos, concretamente citostáticos, citotóxicos, mitóticos y expresión de un marcador.

Más exactamente, los efectos mitóticos, citotóxicos y citostáticos anteriormente mencionados se detectan verificando la presencia y/o la presencia cambiada de las primeras entidades en los compartimentos móviles creados a su alrededor y/o en proximidad a una pluralidad de primeros electrodos colocados inmediatamente adyacentes a los compartimentos móviles que contienen las primeras entidades y, previamente a la ejecución de la etapa (c) anteriormente mencionada, se dejan vacíos u ocupados por compartimentos móviles.

Así, se hace posible realizar muchos miles de experimentos en paralelo en el interior del mismo dispositivo. Pueden tratarse células del mismo tipo con una combinación de compuestos diferentes, o alternativamente puede tratarse una combinación de células con un compuesto, o también, puede utilizarse una combinación de ambas soluciones. El número de experimentos posibles con este método puede aumentarse adicionalmente haciendo variar la "dosificación" de los compuestos administrados a cada célula individual, o la cantidad de cierto tipo de compuesto.

Además de la ventaja del alto rendimiento, el método permite que se realicen experimentos a elevadas velocidades gracias al uso de volúmenes de reacción pequeños, es decir pequeñas cantidades de compuestos, también de tampones y otros reactivos. En efecto, la acción de colocar las partículas mediante levitación dielectroforética tiene el efecto de minimizar la manipulación del líquido usando sistemas microfluidos costosos e incómodos.

Esto también tiene un impacto positivo obvio y adicional sobre el coste de realización del experimento, ya que es posible reducir la necesidad de grandes cantidades de compuestos que son particularmente costosos y/o difíciles de obtener mediante síntesis.

Al contrario que los sistemas "tradicionales" para inmovilizar células (basados en una unión química (específica o de otro modo) con un sustrato), la disposición de las células según la presente invención se logra por medio de levitación dielectroforética, de forma que no hay contacto ni unión en absoluto entre el material y el dispositivo, y esto garantiza que la respuesta fisiológica es más natural.

En comparación con los sistemas basados en cámaras múltiples (microtítulos, etc) una diferencia y ventaja adicional consiste en el hecho de que las interacciones célula-compuesto pueden producirse todas en la misma cámara de un dispositivo, y en la práctica, de forma simultánea. Esto reduce la incidencia de errores en el análisis que se producen con aparatos que tienen cámaras o pocillos separados, ya que las condiciones en las que se realiza el experimento se caracterizan por su mayor uniformidad.

El método descrito también permite analizar la respuesta de una célula individual y no sólo la de la media estadística en una población de células homogéneas, tal como se produce en casi todos los métodos propuestos hasta ahora. Esto se hace posible mediante la adopción de sistemas detectores de tipo capacitivo u óptico integrados, que permiten prescindir de los engorrosos instrumentos usados tradicionalmente con este objetivo en este campo (cámara de TV, microscopio), si bien es cierto que tales instrumentos pueden utilizarse igualmente bien para la monitorización visual de los acontecimientos que se producen en el interior del dispositivo, o simplemente si se prefiere por cualquier razón. Además, pueden emplearse técnicas de control de retroalimentación convencionales, tratando la información devuelta por los detectores integrados dentro del dispositivo, para realizar series de operaciones complejas de un modo completamente automático, tal como la recuperación selectiva de ciertas partículas que están sometiéndose a
análisis.

Puede automatizarse y controlarse electrónicamente casi todo el método, volviéndolo particularmente adaptable a los diversos requisitos del usuario. El alto nivel de automatización que puede obtenerse también limita la incidencia de error asociado comúnmente con las operaciones manuales repetitivas realizadas en otros procedimientos de selección.

Además, el método descrito puede utilizarse para administrar no sólo posibles compuestos farmacéuticos, microencapsulados o de otro modo, sino también microperlas oportunamente funcionalizadas.

Tales perlas pueden ser de dimensiones comparables a las de las células o de hecho mucho más pequeñas, y recubiertas mediante métodos convencionales por ejemplo con anticuerpos (Ac) u otras sustancias que pueden interaccionar con los receptores celulares.

Las microperlas recubiertas oportunamente con ADN (o ARN) sonda pueden hacerse interaccionar con otras recubiertas con ADN (o ARN) diana como parte de una prueba de hibridación, por ejemplo para identificar la diana (diagnóstico molecular) o en análisis de polimorfísmos de un único nucleótido (SNP).

Considerando un tercer aspecto de la descripción, la invención se refiere a un dispositivo de pruebas multifuncional compuesto por un primer módulo que comprende una serie de primeros electrodos, excitables y direccionables de forma selectiva e individual, al menos en parte, dispuestos sobre un soporte aislante; un segundo módulo que comprende al menos un segundo electrodo colocado enfrente de y orientado hacia los primeros electrodos y una estructura de soporte superior; también un elemento espaciador dispuesto entre el primer y segundo módulo y que delimita un entorno líquido o semilíquido durante el funcionamiento, caracterizado porque el elemento espaciador está realizado de tal manera que establece una primera cámara y al menos una segunda cámara en el interior del dispositivo, interconectadas hidráulicamente mediante al menos un paso estrecho y que delimita el entorno líquido o semilíquido, que se divide así mediante el al menos un paso estrecho en al menos dos entornos parciales no influidos hidráulicamente entre sí y que coinciden con las al menos dos cámaras.

Las dos cámaras están equipadas con orificios que pueden abrirse de forma selectiva y controlada que funcionan como entradas y salidas respectivas, mientras que la serie de primeros electrodos funciona como el fondo de las cámaras y del al menos un paso estrecho que permite la comunicación entre las cámaras.

Con esta solución, se hace posible realizar pruebas y operaciones en números que hasta ahora no podían manejarse con un único dispositivo de pruebas, ejecutadas de forma rápida y fiable, con facilidad y bajo coste (dado que los procedimientos pueden ponerse todos en práctica sin dificultad mediante programación electrónica). En efecto, las soluciones de la técnica anterior propuestas hasta ahora en el campo de la química combinatoria revelan varios problemas, muchos de los cuales pueden superarse con el dispositivo según la invención en virtud de su capacidad para crear una distribución espacial de partículas, o más sencillamente controlar su posición, empleando una distribución seleccionada como objetivo de campos eléctricos diseñados para crear compartimentos de potencial cerrados por medio de fuerza dielectroforética. Estos compartimentos pueden manipularse de tal manera se hace que una partícula atrapada en el interior de un compartimento correspondiente cubra distancias apreciables en el interior del dispositivo.

Finalmente, la invención se refiere a un método de administrar primeras entidades que consisten en compuestos o unidades compuestas, a segundas entidades, tal como se reivindica en la reivindicación 40, tal método comprende las etapas de:

(a)-

introducir las primeras y segundas entidades dentro de una cámara de un dispositivo de pruebas que comprende al menos una serie de primeros electrodos excitables y direccionables de forma selectiva y al menos un segundo electrodo colocado enfrente de y orientado hacia los primeros electrodos;

(b)-

crear de forma selectiva compartimentos de potencial móviles cerrados en el interior de la cámara mediante la fuerza dielectroforética generada por los electrodos enfrentado y atrapar al menos una parte de las entidades en el interior de los compartimentos móviles.

(c)-

identificar y seleccionar los compartimentos que contienen primeras entidades;

(d)-

mover al menos uno de los compartimentos móviles que contienen las primeras entidades hacia los compartimentos móviles que contienen las segundas entidades;

(e)-

hacer que al menos un compartimento móvil que contiene una primera entidad se fusione con un compartimento móvil que contiene una segunda entidad.

El método proporciona así la facilidad de poner en contacto sustancias seleccionadas con otras sustancias seleccionadas u organismos de forma controlada, rápida y eficazmente, no sólo con el fin de realizar pruebas sino también de inducir cambios o reacciones de forma intencionada mientras se mantienen los productos de reacción "dentro de unos límites", por ejemplo para producir alteraciones genéticas en microorganismos que posteriormente pueden recuperarse fácilmente.

Breve descripción de los dibujos

Otras características y ventajas de la invención surgirán más claramente a partir de la siguiente descripción de ciertas realizaciones a modo de ejemplo, y que no implican limitación, con la ayuda de los dibujos adjuntos

- La figura 1 ilustra parte de un dispositivo convencional para la manipulación de muestras mediante dielectroforesis, visto de forma esquemática y en perspectiva;

- La figura 2 es una vista tridimensional esquemática del dispositivo realizado según la presente invención;

- La figura 3 es una ilustración esquemática que muestra una de las estrategias de ordenación posibles que podrían utilizarse en el método según la invención, que consiste en la introducción y colocación puesta en práctica secuencialmente para los diferentes tipos de células;

- La figura 4 ilustra una estrategia de ordenación que consiste en la introducción simultánea de varias especies y la colocación selectiva de diferentes especies;

- La figura 5 muestra la curva descrita por la fuerza dielectroforética en condiciones de variación de frecuencia, para células (BIO) y para microperlas (PERLA);

- La figura 6 ilustra el funcionamiento del sistema dielectroforético utilizado según la invención cuando se fusionan dos compartimentos, uno que contiene una célula para análisis y otro que contiene una microperla recubierta con anticuerpos, de dimensiones comparables a las de la célula. En el caso de un emparejamiento (6a) y sin emparejamiento (6b) entre antígeno y anticuerpo;

- La figura 7 ilustra el funcionamiento del sistema dielectroforético utilizado según la invención cuando se fusionan dos compartimentos, uno que contiene una célula para análisis y otro que contiene microperlas recubiertas con anticuerpos, de dimensiones menores a las de la célula, en caso de emparejamiento entre antígeno y anticuerpo con una fuerza dielectroforética positiva predominante (7a), emparejamiento con una fuerza dielectroforética negativa predominante (7b) y sin emparejamiento (7c);

- La figura 8 incluye un gráfico que muestra varios mínimos de potencial, e ilustra el desplazamiento de una célula generada recientemente desde el mínimo ocupado por la célula original hacia el mínimo adyacente;

- la figura 9 ilustra las etapas de analizar y seleccionar células específicas utilizando microperlas funcionalizadas con anticuerpos específicos.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Con referencia a las figuras 1 y 2, la presente invención se basa en el uso de un dispositivo de pruebas que realiza una tecnología descrita en la solicitud de patente internacional WO 00/69565, presentada por el mismo solicitante, cuyo contenido se incorpora aquí en la medida que proporciona referencia útil para los fines de la presente descripción; en efecto, el dispositivo descrito en el presente documento incorpora características estructurales originales y nuevas no mencionadas en la solicitud mencionada anteriormente, diseñado especialmente de tal forma que los métodos de prueba y ensayo según la presente invención pueden realizarse de forma sencilla, eficaz, económica y con un uso racional del espacio.

El dispositivo propuesto, ilustrado esquemáticamente en la figura 1, comprende dos módulos principales, de los cuales el primero consiste en una serie M1 de electrodos LIJ dispuestos en filas ordenadas sobre una estructura A1 de soporte aislante. Los electrodos LIJ pueden prepararse a partir de cualquier material conductor dado, seleccionado preferiblemente de los metales compatibles con la tecnología de integración electrónica, mientras que el medio aislante de la estructura A1 de soporte puede ser óxido de silicona o de hecho cualquier otro material aislante.

La forma de los electrodos LIJ que constituyen la serie M1 puede seleccionarse de varios tipos; en la figura 1 los electrodos LIJ son cuadrados, si bien es cierto que esto no implica limitación. Cada elemento de la serie M1 consiste en un único electrodo LIJ que sirve para generar un compartimento S1 dielectroforético por medio del cual se manipula una muestra BIO biológica en el interior de un entorno L líquido o semilíquido delimitado por un elemento A3 espaciador.

Una región C bajo los electrodos sirve para colocar circuitos detectores integrados que pueden integrarse al dispositivo, es decir detectores de realización convencional (no ilustrados con el fin de simplificar), seleccionados de varios tipos, de forma que detectarán la presencia de una entidad que va a manipularse en el interior de los compartimentos S1 de potencial generados por los electrodos. En una realización preferida del dispositivo, el segundo módulo principal consiste sustancialmente en un único electrodo M2 grande, que cubre el dispositivo en su totalidad. Finalmente, el dispositivo también puede incluir una estructura A2 de soporte superior, que funciona como tapa para el dispositivo y que encierra el entorno L líquido o semilíquido.

La forma más sencilla para el segundo electrodo M2 es la de una superficie totalmente plana y uniforme; son posibles otras formas de mayor o menor complejidad (por ejemplo una rejilla de un tamaño de malla dado a través de la cual puede pasar la luz). El material más adecuado para el electrodo M2 superior será un material conductor transparente depositado sobre una estructura A2 de soporte de vidrio. Además de permitir la inclusión de circuitos detectores tal como se resumió anteriormente, esta solución también permitirá el uso de medios de inspección ópticos tradicionales (microscopio y cámara de TV) colocados sobre el dispositivo.

El diagrama esquemático de la figura 2 representa un dispositivo DE realizado según la invención y derivado del dispositivo de la figura 1, y por consiguiente, los detalles que parecen similares o idénticos en los dos dibujos se indican con el fin de simplificar usando las mismas referencias.

El dispositivo DE comprende un módulo A2 superior que soporta un único electrodo M2 (no indicado con el interés de simplificar), un módulo C inferior que lleva una serie M1 de electrodos LIJ excitables y direccionables de forma selectiva (no ilustrados), también un espaciador A3 interpuesto entre los dos módulos A2 y C principales y que abarca un entorno L líquido o semilíquido que en el funcionamiento consistirá en soluciones tampón adecuadas. Sin embargo, en este caso, según la invención el espaciador A3 está preparado de tal manera que se crean dos cámaras F y FL internas, interconectadas hidráulicamente por medio de al menos un paso D estrecho y delimitando el entorno L, que se divide así por el paso D en dos entornos parciales o influidos hidráulicamente entre sí y que coinciden con las dos cámaras F y FL. Cada cámara F y FL está equipada además con orificios que pueden abrirse de forma controlada y selectiva que funcionan como entradas y salidas, denominadas I1 y O1 (cámara F) e I2 y O2 (cámara FL) respectivamente, la serie M1 de electrodos LIJ funciona como el fondo de ambas cámaras F y FL y del paso D estrecho de interconexión.

El dispositivo así realizado se utiliza, según la invención, de la manera que se describe a continuación.

Selección de alto rendimiento

En el método según la presente invención, el experimentador puede introducir la muestra (ya sean células, posibles compuestos farmacéuticos microencapsulados o microperlas funcionalizadas) a través de la entrada I1 relativa (figura 2) y dentro del entorno de manipulación, usando instrumentos convencionales familiares para un experto en la técnica (bombas peristálticas, pipeteadores, jeringas Hamilton, etc), empleando un procedimiento que puede ser completamente automático o procediendo manualmente, según los requisitos. La muestra se somete a una fuerza dielectroforética de intensidad adecuada, de tal manera que la atrape dentro de un mínimo de potencia y haga que se desplace distancias mayores o menores en el interior del dispositivo. Antes de que puedan comenzar estas operaciones, en cualquier caso, las cámaras F y FL (figura 2) del dispositivo deben llenarse con una solución tampón adecuada por medio de los orificios I1 e I2. Durante esta etapa, los orificios O1 y O2 en el lado opuesto de las cámaras se dejan abiertos para evitar la formación de burbujas de aire que evitarían que el dispositivo DE funcionara correctamente.

El hecho de poder desplazar partículas que levitan únicamente mediante la fuerza de dielectroforesis tiene un papel decisivo en minimizar la manipulación del líquido usando sistemas fluidodinámicos costosos e incómodos (microfluidos). Las partículas seleccionadas pueden reunirse en la zona F de entrada (en la que hay transitoriamente un flujo elevado y posibles turbulencias), después se dirigen a través del paso D estrecho en el separador central y dentro de la cámara FL adyacente normalmente sin flujo, moviendo las partículas en lugar del líquido y evitando así el estrés por fricción y contacto. De esta forma las partículas pueden disponerse en una matriz ordenada o de forma más sencilla se permite que mantengan la posición que asumieron espontáneamente dentro de la cámara.

Habiendo generado y/o mantenido la colocación requerida, entonces es posible desplazar otras partículas, sean células o compuestos que se van a someter a ensayo, y ponerlas en contacto con las que van a analizarse.

Por tanto, es posible realizar miles de experimentos paralelos en el interior del mismo dispositivo. Pueden tratarse células del mismo tipo con una combinación de compuestos diferentes o alternativamente una combinación de células puede tratarse con un compuesto. También es posible tratar distintas células con distintos compuestos en el transcurso de un experimento. El número de experimentos posibles con este método puede aumentar además haciendo variar la "dosificación" de los compuestos administrados a cada célula individual, es decir, el número de unidades de un cierto tipo de compuestos, o incluso administrar distintos compuestos en sucesión a cada célula.

Esto se ilustra mediante la siguiente fórmula:

N_{E} = n \cdot 2^{(c \cdot p)}

En la que NE es el número de experimentos individuales que pueden realizarse dentro del experimento global, n es el número de células diferentes utilizadas, c el número de compuestos diferentes utilizados y p la dosificación de los compuestos.

Métodos de administración de sustancias

La manera en la que se van a administrar las sustancias a las células de interés dependerá en primer lugar y de manera más importante, de dónde tenga lugar la acción, en otras palabras, si la sustancia debe entrar en la célula o si puede interaccionar con un receptor en el exterior de la célula, así como de las propiedades físicas y químicas de la sustancia que está sometiéndose a prueba.

Sustancias que deben entrar en la célula

En los casos en los que la sustancia debe introducirse dentro de la célula para realizar su actividad hipotética, los métodos de administración cambiarán significativamente según las propiedades químicas y físicas de la propia sustancia:

\bullet Sustancias que NO requieren microencapsulación

Esta categoría comprende todas aquellas sustancias que pueden atravesar los límites celulares de forma natural (membrana, y pared si la hay), en otras palabras sustancias ampliamente apolares que generalmente forman una fase separada en soluciones acuosas (a excepción de algunas sustancias polares que se incorporan espontáneamente a la célula mediante proteínas transportadoras de membrana). Para muchas de estas sustancias apolares es suficiente producir emulsiones, usando métodos de la técnica anterior, en los que el diámetro de las perlas de sustancia en la emulsión son compatibles con las dimensiones de los compartimentos dielectroforéticos en los que van a manipularse. Otras (por ejemplo, ácidos retinóicos) se administran mediante un liposoma, intercalado con fosfolípidos como constituyentes de la capa de lípidos del liposoma.

\bullet Sustancias que requieren microencapsulación

Esta categoría engloba todas las sustancias polares que deben entrar en la célula para realizar su acción pero que se disuelven en soluciones acuosas (incluyendo ácidos nucleicos). Para entrar en la célula, estas sustancias necesitan estar microencapsuladas, por ejemplo, incrustadas en una bicapa de fosfolípidos (liposomas). Fusionándose con la pared de la célula diana, el liposoma puede administrar su contenido al citoplasma. También es posible usar microperlas impregnadas con la sustancia de interés, que absorberá la célula.

Alternativamente, tal como es el caso de los ácidos nucleicos, por ejemplo, pueden introducirse sustancias usando virus o como vectores, modificados genéticamente según sea apropiado mediante métodos convencionales. Aunque los virus son significativamente más pequeños que las células, la acción de manipularlos mediante dielectroforesis cae, sin embargo, dentro del alcance de la técnica anterior en este campo.

Sustancias que no deben entrar en la célula

Esta categoría incluye todas aquellas sustancias cuya acción corresponde a un mecanismo receptor-ligando. A menos que se trate de moléculas pequeñas solubles en el tampón seleccionado, deben administrarse con la ayuda de microperlas, es decir, recubrir microperlas de un material adecuado con estas mismas sustancias. Otros tipos de moléculas también pueden administrarse sobre la superficie de liposomas. Finalmente, otras células pueden administrar por sí mismas el ligando.

Estrategias para ordenar células y compuestos

Con el fin de realizar experimentos empleando el método descrito, el experimentador debe poder conocer necesariamente la posición y el tipo de cada célula y/o compuesto utilizado. Las estrategias para ordenar las células y compuestos se agrupan esencialmente en dos categorías:

\bullet Introducción secuencial

Un procedimiento posible es introducir las células y/o compuestos dentro del dispositivo secuencialmente. La figura 3 muestra un ejemplo de como se ordenan las células secuencialmente. En este caso, el tipo de células se conoce obviamente de antemano, y es suficiente disponer detectores de proximidad alineados con al menos una cavidad de electrodo del dispositivo. Los compartimentos que se mueven sobre esta cavidad pueden caracterizarse según la presencio o ausencia de la partícula. Si se detecta la presencia, se coloca la partícula en la serie; si no, se ignora el compartimento y se detecta el siguiente compartimento en secuencia. El procedimiento propuesto puede ponerse en práctica usando detectores externos tales como cámaras de TV conectadas a un microscopio, o alternativamente la estructura A1 de soporte puede incorporar tanto los electrodos que sirven para manipular las partículas biológicas como los dispositivos que sirven para detectarlas. Los detectores pueden ser de tipo capacitivo u óptico. Una vez introducidos mediante la entrada I1 (figura 3) dentro de la cámara F de flujo del dispositivo, los elementos o partículas biológicos se colocan en una disposición R2 ordenada en la cámara FL sin flujo, en la que puede haber ya otros tipos R1 de células, introducidos y ordenados previamente e incluidos en el mismo experimento. Si por otro lado, todas las cavidades están equipadas con detectores, entonces se simplifica la situación. Los compartimentos que contienen partículas se identifican en la cámara F de flujo inmediatamente tras la introducción de la nueva especie, y se mueven a las posiciones seleccionadas en la cámara FL sin flujo.

Pueden eliminarse las partículas en exceso introduciendo más líquido a través del orificio I1 de entrada de la cámara de flujo, purgando así las partículas de la cámara junto con el exceso de líquido por medio de la salida relativa O1.

\bullet Diferenciación en el interior del dispositivo

Se usan detectores que pueden identificar el tipo de célula o sustancia.

Más que introducir células o compuestos en secuencias ordenadas, existe la facilidad de, con un dispositivo que incorpora detectores que pueden detectar no solo la presencia sino también el tipo de célula o compuesto que puede estar atrapado en un compartimento, introducir las células aleatoriamente y dejar que el dispositivo las disponga automáticamente (tal como se describe en la patente PCT/WO00/69565). Del mismo modo, en este caso el procedimiento se realiza con la ayuda de o bien detectores ubicados en el exterior o bien de detectores capacitivos u ópticos integrados dentro del dispositivo.

La figura 4 muestra un ejemplo de esta solución. Las partículas biológicas se introducen por medio de la entrada I1 dentro de la primera cámara F del dispositivo activando un flujo temporal. Aquí se identifican según el tipo mediante los detectores de diferenciación. Después, cada partícula individual se ordena según el tipo en la cámara FL sin flujo junto con las otras de su tipo R1 y R2. Un detector diferenciador de tipo puede ubicarse por debajo de cada cavidad o incluso bajo una única cavidad. En el último caso, será ventajoso ubicar el detector bajo una cavidad cerca del paso D entre las dos cámaras a través del cual se dirigirán los compartimentos necesariamente.

En lo que respecta a la versión del método que implica el uso de microperlas funcionalizadas, el problema de ordenar las partículas incluidas en la prueba, y más especialmente de su identificación, se facilita en parte por las características de las microperlas. Una vez se ha generado y/o mantenido la disposición deseada de las células utilizando una de las estrategias descritas, el experimentador puede sencillamente introducir una mezcla de microperlas funcionalizadas con diferentes anticuerpos dentro del dispositivo, sin necesidad de adoptar un procedimiento secuencial. Es suficiente con que las sustancias tengan pares homogéneos de características físicas e inmunológicas, en otras palabras, que cada tipo específico de anticuerpo se empareje mediante características diferentes de la partícula mediante la cual se administra. Un ejemplo de esto se muestra en la tabla 1: se usar tres anticuerpos (Acm específicos) para tres antígenos diferentes de tres organismos diferentes para recubrir tres tipos de partículas, que se diferencian por un lado en cuanto al color y por otro lado en cuanto a la constante dieléctrica.

TABLA 1 Ejemplo de apareamiento entre características físicas e inmunológicas de microperlas funcionalizadas. Pueden asociarse las características antigénicas con diferentes características físicas de las microperlas

1

El número de partículas también puede aumentarse adoptando combinaciones de características físicas. Se muestra un ejemplo de esto en la tabla 2.

TABLA 2 Ejemplo de apareamiento entre características físicas e inmunológicas de microperlas funcionalizadas

2

Además del color, pueden determinarse fácilmente otras características tales como reflectancia y posiblemente fluorescencia con la ayuda de un detector externo adecuado. Pueden detectarse transparencia y diferencias en la constante dieléctrica con detectores integrados de tipo óptico y capacitivo, respectivamente.

De forma similar, los complejos formados por la interacción antígeno-anticuerpo entre la célula y las perlas, identificados simplemente mediante el emparejamiento entre las características físicas e inmunológicas de las microperlas, pueden tratarse en este punto adicionalmente según la invención, tal como se describió en su momento. Puede usarse discriminación basándose en las características físicas, usando fluorescencia en particular, para identificar partículas que consisten no sólo en microperlas funcionalizadas, sino también en liposomas que llevan compuestos dados o bien en el interior o bien sobre la superficie.

Con acción selectiva

Es posible explotar el modo en el que el comportamiento de las partículas en el dispositivo cambia con la variación en la frecuencia de los campos eléctricos aplicados. En efecto, según varía la frecuencia las células pueden experimentar un cambio en la dirección y/o intensidad de la fuerza dielectroforética neta que las conduce a regiones del dispositivo con una intensidad de campo decreciente (nDEP) o hacia regiones con intensidad de campo creciente (pDEP). Células diferentes tienen curvas de transición diferentes, dependiendo de sus propiedades conductoras y dieléctricas (sus denominadas "firmas espectrales"). En la práctica, este fenómeno puede utilizarse para atrapar y mover una especie celular individual (tal como se describe en la patente PCT/WO 00/69565) y separar así diversas especies a partir de un conjunto de organismos. En este caso, conociendo como migrarán las células a la frecuencia seleccionada y teniendo detectores que puedan detectar la presencia de la célula, el experimentador introduce una mezcla de organismos dentro de la cámara que se separarán después directamente mediante el dispositivo. De nuevo, puede detectarse la presencia de detectores mediante detectores que funcionan en el exterior o integrados dentro del dispositivo (ópticos o capacitivos).

Durante el transcurso de estas operaciones, la información devuelta por los detectores puede usarse para modificar el control y las operaciones que van a realizarse según el estado del sistema, y para cambiar o ajustar la programación del dispositivo. También es posible generar una representación virtual (gráfica, por ejemplo) del estado del sistema con el fin de optimizar la interfaz entre el dispositivo y el usuario con fines de programación y análisis de los resultados.

Ejecución de los experimentos Experimentos con liposomas, virus o sustancias que pueden emulsionarse en la solución tampón que va a utilizarse

En la práctica, este tipo de experimento consiste en generar o mantener en todos los casos una disposición ordenada de las células (o compuestos) y hacer que interaccionen con los compuestos (o células) que están sometiéndose a ensayo. Esto se consigue simplemente haciendo que se fusionen juntos los compartimentos de potencial dielectroforético que contienen/transportan las células y compuestos. En caso de compuestos apolares microemulsionados (por ejemplo, esteroides o triglicéridos), estos atraviesan espontáneamente los límites celulares y por tanto pueden ejercer su acción, si la tienen, dentro de la célula. En el caso de compuestos microencapsulados en liposomas, la bolsa de fosfolípidos se fusiona con la membrana celular liberando el compuesto dentro de la célula en la que producirá su acción, si la tiene. Cuando las partículas se asocian a vectores víricos modificados genéticamente, se inserta el gen de la sustancia que está sometiéndose a prueba dentro del ADN del virus mediante un procedimiento convencional. Mediante la acción de mecanismos particulares peculiares a él, el virus introducirá su material genético dentro de la célula en la que después producirá su acción, si la tiene.

Experimentos usando perlas funcionalizadas con anticuerpos

Las microperlas funcionalizadas con anticuerpos se usan en todos los casos en los que hay necesidad de diferenciar una célula basándose en moléculas características (antígenos) expuestas sobre su superficie (pared o membrana). Los ejemplos típicos son aplicaciones de diagnóstico y procedimientos relacionados con la separación de poblaciones particulares de células de otras que de otro modo no pueden distinguirse.

Las perlas funcionalizadas con anticuerpos pueden administrarse por medio de un compartimento de potencial dielectroforético a la célula y ponerse en contacto con la célula simplemente haciendo que el compartimento que contiene la perla se fusione con el compartimento que contiene la célula. Entre las características singulares del método según la invención está que puede usarse para realizar una comprobación de la unión entre el anticuerpo y el antígeno identificado.

El experimentador puede tratar de separar las células de las microperlas funcionalizadas, y por tanto llevar a cabo una verificación dependiente de la intensidad de la unión entre antígeno y anticuerpo, adoptando una de las siguientes estrategias:

Hacer variar la intensidad del campo eléctrico

A frecuencia constante, con la célula y las microperlas expuestas ambas a nDEP, el experimentador puede comprobar la intensidad de la fuerza de unión entre el anticuerpo que recubre la perla y el antígeno presente sobre la superficie de la partícula biológica, verificando la resistencia del complejo antígeno-anticuerpo frente a la fuerza de separación cuando se atraen dentro de dos compartimentos distintos haciendo variar la intensidad de \nabla(E_{rms})^{2}, es decir, la intensidad de la fuerza dielectroforética, que es:

<F> \propto Re[Fcm(\omega)] \nabla (Erms)^{2}

en otras palabras, proporcional a \nabla(E_{rms})^{2}. Aumentando los voltajes de los electrodos, es decir, aumentando la amplitud del voltaje aplicada entre los electrodos, también es posible aumentar la intensidad de la fuerza dielectroforética atrayendo las dos partículas dentro de compartimentos distintos.

Hacer variar la frecuencia del campo eléctrico

La respuesta de la frecuencia de la fuerza dielectroforética (Re[fcm] en la figura 5) generalmente es diferente en microperlas y células respectivamente. En efecto, hacer variar la frecuencia tiene el efecto de influir en el factor de fuerza fcm(\omega). Esto tiene poco efecto sobre las microperlas (PERLA en la figura 5), por lo que la fuerza dielectroforética permanece sustancialmente constante en el sector negativo (nDEP). En la práctica, las perlas siguen estando atraídas hacia el centro de los compartimentos de potencial dielectroforético. Para las células, en cambio (BIO en la figura 5), la fuerza dielectroforética cambia de negativa a positiva con la variación de frecuencia entre los electrodos. El efecto de esto en la práctica es que las células tienden a estar atraídas desde el centro de los compartimentos hacia los electrodos en los que el campo eléctrico es el más intenso.

Hacer variar la frecuencia y la intensidad del campo eléctrico simultáneamente

También es posible comprobar el emparejamiento de la unión entre antígeno y anticuerpo basándose en los dos parámetros mencionados anteriormente, haciendo variar tanto la frecuencia del campo eléctrico, es decir, la fuerza dielectroforética decreciente (nDEP) o creciente (pDEP), y la intensidad del campo eléctrico, es decir, el módulo del campo de la fuerza dielectroforética.

Ejemplos de comprobaciones de la especificidad de la unión antígeno-anticuerpo

Las situaciones que surgen dependen en gran medida de las dimensiones de las microperlas, de la fuerza dielectroforética predominante positiva o negativa, y de la existencia o de otro modo, de un enlace entre antígeno y anticuerpo:

\bullet Separación usando sólo nDEP

El siguiente método es particularmente adecuado en el caso de perlas que son de dimensiones comparables a las de la partícula BIO y del compartimento.

Emparejamiento (ilustrado en la figura 6a)

Inicialmente (tiempo T1 en la figura 6a), la célula BIO y la microperla PERLA funcionalizada ocupan dos compartimentos adyacentes. Los compartimentos se indican esquemáticamente mediante líneas S1 difusas relativas, indicando cada una la parte del espacio en la que se genera una fuerza dielectroforética significativa. A continuación (tiempo T2 en la figura 6a), se genera un compartimento más grande según convergen las dos partículas y entran por último en contacto físico en el interior de este mismo compartimento. En caso de emparejamiento, los anticuerpos sobre la microperla reconocen su antígeno específico y se unen a él. Después de esto (tiempo T3 en la figura 6a), vuelven a establecerse los compartimentos iniciales, pero la microperla continúa anclada a la célula a causa del enlace antígeno-anticuerpo y los dos siguen ocupando el mismo compartimento.

Sin emparejamiento (ilustrado en la figura 6b)

Inicialmente (tiempo T1 en la figura 6b,) la célula y la microperla funcionalizada ocupan dos compartimentos adyacentes. A continuación (tiempo T2 en la figura 6b), se genera un compartimento más grande según convergen las dos partículas y entran por último en contacto físico en el interior de este mismo compartimento. Sin embargo, si no hay emparejamiento, los anticuerpos sobre la microperla no reconocen ningún antígeno específico y por consiguiente no se unirán a la célula. Después de eso (tiempo T3 en la figura 6b), vuelven a establecerse los compartimentos iniciales y la microperla y la célula vuelven a ocupar sus posiciones originales.

\bullet Separación usando nDEP y pDEP

El siguiente método es adecuado en el caso de perlas que son o bien de dimensiones más pequeñas que las de la célula BIO o bien de dimensiones comparables a las de la célula BIO.

Emparejamiento con fuerza positiva predominante sobre el complejo microperla-célula

Inicialmente (tiempo T1/emparejamiento y pDEP predominante en la figura 7a), la célula BIO y varias microperlas PERLA funcionalizadas ocupan dos compartimentos adyacentes. Se hacen converger los compartimentos cambiando la polaridad de los electrodos en la serie M1 (véase la figura 7a). Como resultado (tiempo T2/emparejamiento y pDEP predominante en la figura 7a), las perlas entran en contacto físico con la célula y se agrupan alrededor de su superficie. En caso de que haya emparejamiento, los anticuerpos sobre las microperlas reconocen sus antígenos específicos y se unen a ellos. Ahora se aplica un cambio de frecuencia, cuyo efecto es someter la célula a la fuerza dielectroforética positiva y hacer que el complejo célula-microperlas caiga dentro de una zona de potencial máximo, o entre los electrodos (tiempo T3/emparejamiento y pDEP predominante en la figura 7a). Se manipulan los compartimentos en un intento de separar la célula de las perlas, pero estas siguen aferradas a la célula como resultado de una fuerza de unión antígeno-anticuerpo (tiempo T4/emparejamiento y pDEP predominante en la figura 7a). Después de eso, se evalúa la situación verificando la presencia de partículas en la proximidad del electrodo L100 y la ausencia de partículas en la proximidad del electrodo L200 (tiempo T5/emparejamiento y pDEP predominante en la figura 7a). Esto puede lograrse usando detectores ópticos (integrados o de otro modo) o detectores capacitivos.

Emparejamiento con fuerza negativa predominante sobre el complejo microperla-célula

La situación durante las etapas iniciales (tiempos T1-T3 en la figura 7b) es la misma que la descrita anteriormente, con la célula BIO y varias microperlas PERLA funcionalizadas que ocupan dos compartimentos adyacentes (tiempo T1/emparejamiento y nDEP predominante en la figura 7b). Del mismo modo, en este ejemplo los compartimentos se hacen converger cambiando la polaridad de los electrodos en la serie M1, y las microperlas entran en contacto físico con la célula, agrupándose alrededor de su superficie (tiempo T2/emparejamiento y nDEP predominante en la figura 7b). Esto es de nuevo un ejemplo de emparejamiento, reconociendo los anticuerpos presentes sobre las microperlas sus antígenos específicos y uniéndose a ellos. Se aplica un cambio de frecuencia, como resultado de lo cual se somete la célula a fuerza dielectroforética positiva, pero dado el nDEP predominante sobre las microperlas, el complejo célula-microperlas se mantiene en levitación (tiempo T3/emparejamiento y nDEP predominante en la figura 7b). Se manipulan los compartimentos adicionalmente en un intento de separar la célula de las perlas pero las células siguen aferradas a las perlas como resultado de la fuerza de la unión antígeno-anticuerpo (tiempo T4/emparejamiento nDEP en la figura 7b) de forma que el complejo se mueve como una única entidad en dentro de un compartimento según dicta la variación en la polaridad de los electrodos. Finalmente, se evalúa la situación verificando la ausencia de partículas en la proximidad del electrodo L100 y la presencia de partículas en la proximidad del electrodo L200 (tiempo T5/emparejamiento y pDEP predominante en la figura 7b).

Sin emparejamiento

Inicialmente (tiempo T1/sin emparejamiento en la figura 7c), la célula BIO y varias microperlas PERLA funcionalizadas ocupan dos compartimentos adyacentes. Se hacen converger los compartimentos cambiando la polaridad de los electrodos en la serie M1. Las microperlas entran ahora en contacto físico con la célula y se agrupan alrededor de su superficie (tiempo T2/sin emparejamiento en la figura 7c). En este ejemplo, los anticuerpos sobre las microperlas no reconocen ningún antígeno específico. Ahora se aplica un cambio de frecuencia, como resultado de lo cual las microperlas permanecen en levitación en el interior de un compartimento mientras que la célula cae hacia los electrodos, estando sometida a pDEP (tiempo T3/sin emparejamiento en la figura 7c). Se mueven adicionalmente los compartimentos, la célula permanece cerca de los electrodos, mientras que las microperlas se desplazan de compartimento en compartimento (tiempo T4/sin emparejamiento en la figura 7c). Finalmente, se evalúa la situación verificando la presencia de partículas en la proximidad tanto del electrodo L100 como del electrodo L200 (tiempo T5/sin emparejamiento en la figura 7c).

Observación de la respuesta celular

Además de la facilidad de comprobar cada célula individual con el fin de llevar a cabo una variedad de experimentos, los métodos según la presente invención proporcionan la ventaja de que puede analizarse directamente la respuesta fisiológica de las células, sin tener que recuperarlas del dispositivo de pruebas.

No obstante, sigue siendo posible, dadas las características del dispositivo, recuperar las células de interés sin excesiva dificultad en el caso que se desee llevar acabo experimentos adicionales sobre ellas. Una vez que la cámara F de flujo del dispositivo se ha limpiado de cualquier partícula residual con solución tampón, las células de interés pueden devolverse desde la cámara FL sin flujo a la cámara F de flujo y extraerse bombeando más solución tampón.

El método propuesto permite esencialmente al experimentador analizar la respuesta de cada célula individual al compuesto, mientras que otros métodos generalmente permiten el análisis de la respuesta sólo en cuanto a un valor medio que refleja una población de células homogénea.

Los efectos generados por los compuestos pueden clasificarse ampliamente en 4 tipos:

\bullet

citostáticos: el compuesto produce un retraso en el tiempo que tarda en producirse la división celular;

\bullet

citotóxicos: el compuesto induce los mecanismos de muerte celular que conducen por último a la lisis celular;

\bullet

mitóticos: el compuesto estimula la mitosis celular (división celular), o una reducción en el tiempo que tarda en generarse una célula;

\bullet

complejos: respuesta fisiológica multifactorial (inducción de segundos mensajeros, activación de uno o más genes, etc.) cuyos efectos no pueden observarse fácilmente pero no obstante pueden coincidir en última instancia con uno de los anteriores.

Los efectos citotóxicos, citostáticos y mitóticos pueden observarse con la ayuda de detectores ópticos externos o detectores integrados. Tales detectores pueden ser de tipo capacitivo, es decir, que consisten en un circuito que puede de detectar pequeñas diferencias en la capacitancia entre dos electrodos de la serie; la presencia o ausencia de la célula o igualmente su posible lisis o duplicación, alterarán el valor de capacitancia, permitiendo al experimentador no sólo detectar la célula sino también determinar el número de células presentes. Del mismo modo puede utilizarse la detección óptica, en cuyo caso el factor que permite la diferenciación entre la presencia y ausencia o la lisis y duplicación de la célula es la cantidad de fotones que alcanzan un detector colocado por bajo de un mínimo de potencial. Si una célula queda atrapada en tal mínimo, o vacío, bajo el cual se ubica un detector, los fotones que inciden sobre el detector serán menos en el grado en que la célula es menos transparente que el líquido en el que está suspendida.

En caso de un efecto mitótico, una (o más) de las células generadas no puede(n) contenerse en el mismo compartimento que la célula original y por consiguiente cae en un compartimento adyacente que se deja libre para tal fin, en el que puede detectarse mediante el detector colocado en el mismo compartimento. La figura 8 ilustra la secuencia de acontecimientos anterior mostrada en una representación esquemática del dispositivo y en una gráfica que indica la variación espacial de la fuerza dielectroforética desde un momento hasta el siguiente.

Más exactamente, una célula BIO que puede o no haber recibido un compuesto ocupa un compartimento S1, o mejor una parte mínima del campo dielectroforético generado por el dispositivo (tiempo T1 en la figura 8); ya sea estimulada por el efecto del compuesto o beneficiándose de su ausencia, la célula comienza a dividirse. Siempre que las dos nuevas células permanezcan conectadas no escaparán del compartimento (tiempo T2 en la figura 8); con la mitosis terminada, las dos células generadas estarán atrapadas momentáneamente entre dos compartimentos, en efecto sobre la parte superior de dos mínimos de potencial adyacentes, en los que caerán inevitablemente (tiempo T3 en la figura 8); una vez que las células se han dividido eficazmente, el sistema alcanza una nueva energía potencial mínima cuando cada célula ha ocupado un compartimento relativo (tiempo T4 en la figura 8). Monitorizando el número de compartimentos ocupados se hace posible, utilizando el presente método, identificar la mitosis completada. Alternativamente, puede hacerse uso de un detector capacitivo que produce una respuesta análoga, proporcional al número de células generadas y, por tanto, tal que permitirá que se cuenten las células incluso cuando estén atrapadas en el interior del mismo compartimento.

Para analizar distintas respuestas celulares fisiológicas y complejos inducidos por un compuesto, o efectos no macroscópicos o efectos que no son fácilmente identificables, el método preferido es usar células genéticamente modificadas que contienen un gen indicador en un punto seleccionado de las rutas metabólicas que pueden estar influidas por el compuesto, o un gen que expresa una proteína fácilmente observable, normalmente fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde (GFP), en lugar de (o junto con, por ejemplo en caso de una proteína de fusión) el producto génico normal pero no observable fácilmente. Esta es una técnica actualmente frecuente y utilizada expertos en el campo técnico de la microbiología. De nuevo en este caso, los detectores pueden ser integrados o externos, pero obviamente deben ser sólo de tipo óptico.

La posibilidad de analizar las respuestas fisiológicas, complejos o de otro modo, se facilita por el hecho de que puede mantenerse una temperatura seleccionada constante en el interior del dispositivo, y de forma similar por la libertad de utilizar diferentes tampones que además de tener las características dielectroforéticas correctas también incluirán las sustancias que pueden metabolizarse o de otro modo por las células y que permiten así a las células sobrevivir en condiciones fisiológicas en el interior del dispositivo durante el tiempo que sea necesario para obtener una respuesta.

Aplicaciones Con sustancias transportadas o de otro modo por liposomas \bullet Investigación básica

La aplicación principal de este método es obviamente la de la investigación básica, en la que la posibilidad de comprobar interacciones relativas a una célula individual abre campos de experimentación completamente nuevos, en particular si el liposoma lleva un ligando específico de receptor sobre su superficie. Otra ventaja en cuanto a la investigación básica es que pueden observarse las interacciones liposoma-liposoma: si un liposoma lleva un ligando sobre su superficie, llevando el otro liposoma el receptor y otras proteínas que se sabe que median la respuesta de la señal, se hace posible reconstruir un sistema de señalización celular mínimo.

\bullet Química combinatoria

El método encuentra aplicación para aventajar en el campo de la química combinatoria en el que los experimentadores deben examinar bibliotecas de compuestos que comprenden miles de sustancias para verificar sus efectos sobre células de diversos tipos, buscando al mismo tiempo limitar tanto el tiempo como las cantidades de sustancias empleadas en la realización de la prueba. En este ejemplo, el liposoma se fusiona con la célula y libera su contenido dentro del citoplasma. También es posible ocasionar la fusión de dos liposomas que contienen reactivos con el fin de obtener un compuesto dado. Finalmente, puede usarse la interacción entre liposomas y microperlas porosas para transportar una variedad de liposomas dentro de los poros de las microperlas.

Con sustancias administradas usando microperlas

Entre las aplicaciones para el método que usa sustancias que pueden funcionalizar microperlas de diversos tipos, además de las posibles con liposomas, otras incluyen:

\bullet Diagnóstico

El método puede usarse para identificar un organismo en una muestra biológica utilizando microperlas funcionalizadas con anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, para ubicar un antígeno específico del organismo. Las principales ventajas de este método sobre otros métodos inmunológicos son en particular el alto grado de especificidad garantizado por la comprobación de la unión, la facilidad de usar cantidades notablemente pequeñas tanto del anticuerpo como de la muestra que está sometiéndose a prueba y, no menos importante, la elevada velocidad de ejecución que proporcionada mediante el procedimiento gracias a su simplicidad y al nivel de automatización incorporado.

Una de las posibles aplicaciones para fines de diagnóstico se muestra en la figura 9, que proporciona una ilustración esquemática tanto de la manera de llevar a cabo la prueba de diagnóstico como del procedimiento para efectuar una separación específica de células (descrita en su momento), dado que las etapas iniciales son las mismas en cada caso. El procedimiento puede caracterizarse ampliamente tal como sigue: la muestra biológica que contiene el tipo o tipos de células de interés está mezclado con un, o (si el número de tipos de células que van a identificarse/recuperarse es más de uno), posiblemente más tipos de microperlas funcionalizadas con anticuerpos específicos frente al tipo o tipos de células de interés. Los diferentes tipos de microperlas deben ser fácilmente identificables basándose en sus características físicas. En este punto se introduce la mezcla dentro de una de las cámaras del dispositivo.

Alternativamente, pueden introducirse las microperlas dentro del dispositivo separadas de la muestra, procediendo secuencialmente si no puede diferenciarse entre los diferentes tipos de microperlas en el interior del dispositivo.

Las células y microperlas que pueden no haber entrado en contacto cuando se mezclan se ponen juntas mediante una etapa de manipulación dielectroforética inicial (figuras 9a y 9b). Ahora se intenta separar las células de las microperlas (figura 9c). Cuando no pueden separarse los complejos, se supone que los anticuerpos fijados en las microperlas se han unido a los antígenos sobre las células, y estos se identifican en consecuencia. Después se emparejan las células separadas con microperlas de un tipo diferente a aquél con el que estuvieron en contacto anteriormente (figuras 9d y 9e). Se repite la operación hasta que todas las células de interés se hayan identificado y si es posible, enumerado.

Una aplicación para el método en el campo del diagnóstico molecular implica el uso de microperlas, que pueden reconocerse o bien por conocerse antes de su introducción en el dispositivo o bien simplemente porque pueden identificarse en el interior del dispositivo basándose en sus características físicas, que están recubiertas adecuadamente con ADN (o ARN) sonda y que se hacen interaccionar por medio de manipulación dielectroforética con otras que tienen un recubrimiento de ADN (o ARN) diana. Este método puede usarse para realizar una prueba de hibridación para identificar el ADN (o ARN) diana, y sin utilizar material radioactivo o fluorescente en la sonda, tal como se requiere, al contrario, en los métodos convencionales. Además, la rigurosidad de las condiciones experimentales se controla fácilmente, y se hace variar si es necesario, por medios electrónicos (es decir, buscando separar las microperlas) y a tiempo real, en otras palabras, sin tener que repetir en procedimiento completo. Esto es particularmente ventajoso por ejemplo en la localización de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) típicos de ciertas enfermedades graves.

\bullet Separación específica de células

Una de las aplicaciones de mayor interés de la presente invención es la de clasificación de células, y más exactamente, el uso de microperlas funcionalizadas con anticuerpos para permitir la selección de una subpoblación homogénea de células a partir de una masa heterogénea.

En efecto, las características del método son tales como para garantizar una elevada especificidad de reconocimiento, permitiendo distinguir células que difieren incluso mínimamente, y por encima de todo, permitiendo su separación y recuperación de otras de manera sencilla y con un riesgo despreciable de contaminación con la parte no deseada de la población de células. Esta aplicación es de particular interés en el campo médico de la oncología.

El procedimiento puede caracterizarse ampliamente tal como sigue: la muestra biológica que contiene el tipo o tipos de células de interés se mezcla con un, o (si el número de tipos de células que van a recuperarse es más de uno), posiblemente más tipos de microperlas funcionalizadas con anticuerpos específicos frente al tipo o tipos de células de interés. Los diferentes tipos de microperlas deben ser fácilmente identificables basándose en sus características físicas. En este punto, se introduce la mezcla dentro de una de las cámaras del dispositivo.

Alternativamente, pueden introducirse las microperlas dentro del dispositivo separadas de la muestra, procediendo secuencialmente si no puede diferenciarse entre los diferentes tipos de microperlas en el interior del dispositivo. Las células y microperlas que pueden no haber entrado en contacto cuando se mezclan se ponen juntas mediante una etapa de manipulación dielectroforética inicial (figuras 9a y 9b). Ahora se intenta separar las células de las microperlas (figura 9c). Cuando no pueden separarse los complejos, se supone que los anticuerpos fijados a las microperlas se han unido a los antígenos de las células, y éstas se identifican en consecuencia. Después las células separadas se emparejas con microperlas de un tipo diferente a aquél con el que estuvieron en contacto anteriormente (figuras 9d y 9e). Se repite la operación hasta que todas las células de interés se hayan identificado. Las células que aún están unidas a las microperlas se mueven secuencialmente a la segunda cámara del dispositivo en grupos homogéneos y se recuperan lavando con solución tampón (figuras 9f y 9g). Alternativamente, se mueven los complejos estables del mismo tipo a la segunda cámara del dispositivo, con lo que se aplica una fuerza de separación haciendo variar la intensidad y/o frecuencia del campo eléctrico entre los electrodos seleccionados, suficiente para separar las microperlas de las células de forma que puedan reutilizarse en la primera cámara. Se recuperan las células del dispositivo lavando con solución tampón.

\bullet Estudio de respuestas complejas activadas por la interacción receptor-ligando

Usando microperlas, puede usarse el método para estudiar la respuesta celular activada por la unión de un ligando a su receptor específico. En efecto, las microperlas también pueden funcionalizarse con sustancias distintas a anticuerpos, que a la vez que pueden unirse de forma similar a un receptor (transitoriamente en mayor o menor grado) también desencadenan respuestas fisiológicas en la célula. De hecho muchas respuestas celulares están mediadas por interacciones de este tipo en las que una sustancia que funciona como mensajero, pero que no puede entrar en la célula, encuentra un receptor específico que transmite la señal a través de los límites celulares, sin llevar necesariamente la sustancia a través de ellos. Generalmente los mensajeros activan una cascada de información que producirán en último lugar uno de los cuatro efectos descritos previamente: citostáticos, citotóxicos, mitóticos y complejos.

Dada la facilidad de funcionalización de microperlas con los tipos de sustancias descritas, el intervalo de fenómenos que pueden estudiarse con el método descrito, puede ampliarse para considerar todas esas sustancias, en efecto la mayoría de aquellas de interés, que o bien no pueden o bien no deben pasar a través de los límites celulares y que sin embargo aún pueden afectar significativamente a la fisiología de la célula.

Por último, las microperlas funcionalizadas pueden utilizarse en investigación básica, por ejemplo para hacer que interaccionen con liposomas: si una microperla lleva un ligando sobre su superficie, y un liposoma el receptor y las otras proteínas mediante las cuales está mediada la respuesta a la señal, se hace posible reconstruir un sistema de señalización celular mínimo. También pueden usarse las microperlas como vector para la introducción de compuestos o unidades compuestas dentro de células o dentro de un entorno compartimentalizado, por ejemplo aislado internamente un liposoma; en efecto, una célula puede internalizar una microperla funcionalizada cuando se ponen en contacto; esto también es válido en caso de un liposoma.

En caso de que el objetivo sea introducir un compuesto o una unidad compuesta dentro de una célula (o liposoma) este mismo compuesto o unidad compuesta puede llevarlo directamente una microperla o un liposoma, o puede concebirse sobre la superficie de otra célula, o contenerse en un vector (un virus, por ejemplo, si el compuesto es un fragmento de ADN/ARN) diseñado para penetrar en el interior de una célula o liposoma cuando se pone en contacto físico con ésta, y el propio vector también pueden llevarlo células y/o microperlas y/o liposomas.

Claims (43)

1. Método de realización de pruebas y ensayos de alto rendimiento y elevado valor biológico en una muestra que contiene material químico/biológico que consiste en entidades desconocidas caracterizado porque comprende las etapas de:

(a)-

introducir la muestra que incluye dichas entidades desconocidas dentro de una primera cámara de un dispositivo de pruebas que comprende al menos una serie de primeros electrodos excitables y direccionables de forma selectiva y al menos un segundo electrodo colocado enfrente de y orientado hacia los primeros electrodos,

(b)-

introducir material químico/biológico dentro de una primera cámara de dicho dispositivo de pruebas, que consiste en entidades conocidas identificables en el interior de dicho dispositivo de pruebas y que tienen una supuesta afinidad por las entidades desconocidas;

(c)-

crear de forma selectiva primer y segundo compartimentos de potencial dielectroforético móviles cerrados en el interior de dicha primera cámara generados mediante dichos primeros electrodos y segundo electrodo y atrapar al menos una parte de dichas entidades desconocidas en el interior de los primeros compartimentos móviles y al menos una parte de dichas entidades conocidas en el interior de los segundos compartimentos móviles;

(d)-

mover al menos uno dichos segundos compartimentos móviles que contienen las entidades conocidas hacia dichos primeros compartimentos móviles que contienen dichas entidades desconocidas y hacer que al menos una entidad desconocida interaccione con al menos una entidad conocida de al menos un primer tipo ocasionando la fusión de al menos un primer compartimento móvil y un segundo compartimento móvil que contienen las entidades relativas;

(e)-

verificar la creación o de otra manera un enlace estable entre dicha al menos una entidad desconocida y dicha al menos una entidad conocida del primer tipo para determinar si existe afinidad entre las dos e identificar en consecuencia dicha al menos una entidad desconocida.

2. Método según la reivindicación 1, en el que las entidades introducidas dentro de la primera cámara del dispositivo de pruebas son entidades conocidas de una pluralidad de tipos diferentes, identificables en el interior del dispositivo, y se repiten las etapas (d) y (e) de movimiento y verificación para cada una de dichas entidades desconocidas no unidas de forma estable a una entidad conocida del primer tipo, haciendo selectivamente que una entidad conocida de un tipo diferente al primer tipo interaccione con cada entidad desconocida hasta que se hayan eliminado todos los tipos de entidades conocidas introducidas.

3. Método según la reivindicación 1 o 2 que comprende la etapa adicional, realizada antes de la etapa (d) de movimiento, de identificar los compartimentos móviles que contienen dichas entidades desconocidas.

4. Método según la reivindicación 3 en el que la etapa de identificación se realiza con la ayuda de detectores localizados en el interior o el exterior de dicho dispositivo de pruebas o se realiza directamente sobre dichas entidades desconocidas antes de su introducción en dicho dispositivo de pruebas.

5. Método según las reivindicaciones anteriores en el que dichas entidades conocidas son unidades compuestas que consisten en microperlas o liposomas que llevan un compuesto seleccionado de un grupo que incluye al menos un anticuerpo para un antígeno específico y al menos un ligando para un receptor específico y al menos una sonda de ADN o ARN y combinaciones de los mismos.

6. Método según las reivindicaciones anteriores en el que dichas entidades conocidas se introducen dentro de la primera cámara del dispositivo de pruebas junto con dichas entidades desconocidas.

7. Método según la reivindicación 6, que comprende las etapas de crear una mezcla de dichas entidades conocidas y dichas entidades desconocidas en el exterior de dicha primera cámara y después introducir dicha mezcla dentro de la primera cámara.

8. Método según las reivindicaciones 1 a 5 en el que dichas entidades conocidas y dichas entidades desconocidas se introducen dentro de la primera cámara separada y sucesivamente.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dichas entidades conocidas se identifican en el interior de la prueba moviendo los compartimentos móviles en los que están atrapadas en posiciones predeterminadas que corresponden a dichos primeros electrodos predeterminados de la serie y memorizando las mismas posiciones.

10. Método según las reivindicaciones 5 a 8 en el que dichas entidades conocidas se identifican en el interior del dispositivo de pruebas basándose en al menos una característica física detectable por medio de un detector colocado en el interior o el exterior de dicho dispositivo.

11. Método según la reivindicación 10, en el que dicha al menos una característica física se selecciona de un grupo que incluye color, fluorescencia, constante dieléctrica y combinaciones de las mismas.

12. Método según las reivindicaciones anteriores que comprende la etapa adicional de contar el número entidades desconocidas identificadas basándose en su unión estable a las entidades conocidas.

13. Método según las reivindicaciones anteriores que comprende las etapas adicionales de

-

mover los compartimentos móviles de tal forma que se transfieran solo las entidades desconocidas unidas de forma estable a entidades conocidas de un único tipo homogéneo, y por tanto identificable de ser de un único tipo homogéneo, dentro de una segunda cámara del dispositivo que está en comunicación con la primera cámara por medio de un paso estrecho;

-

purgar las entidades que ocupan dicha segunda cámara del dispositivo;

-

repetir las etapas de movimiento y purga para todos los otros tipos homogéneos de entidades desconocidas identificadas, secuencialmente.

14. Método según la reivindicación 13 que comprende las etapas adicionales, realizadas en el interior de dicha segunda cámara y antes a la etapa de purga, de separar las entidades desconocidas identificadas de dichas entidades conocidas de un único tipo homogéneo unidas a ellas de forma estable y devolver las entidades conocidas separadas a la primera cámara por medio de dichos compartimentos móviles.

15. Método según la reivindicación 14 en el que dicha etapa de separación se logra por medio de fuerza dielectroforética, haciendo variar uno de los parámetros de funcionamiento del dispositivo de pruebas, concretamente la intensidad del campo eléctrico entre los electrodos seleccionados, la frecuencia del campo eléctrico entre los electrodos seleccionados, y combinaciones de las mismas.

16. Método según las reivindicaciones anteriores, en el que dicha etapa (e) de verificación se realiza restableciendo un par de compartimentos móviles fusionados previamente y establecer por medio de detectores ubicados en el interior o el exterior del dispositivo de pruebas si dichas entidades están presentes en ambos compartimentos móviles del par o en uno sólo.

17. Método según la reivindicación 16 en el que los detectores empleados son ópticos o capacitivos.

18. Método según las reivindicaciones 16 o 17 que comprenden la etapa adicional de comprobar la fuerza de la unión estable entre dicha al menos una entidad desconocida y dicha al menos una entidad conocida que se logra haciendo variar uno de los parámetros de funcionamiento del dispositivo de pruebas concretamente la amplitud del voltaje entre los electrodos seleccionados, la frecuencia del voltaje entre los electrodos seleccionados, y combinaciones de las mismas.

19. Método según las reivindicaciones anteriores, en el que dichas entidades desconocidas se seleccionan de un grupo que incluye células, virus, microorganismos y unidades compuestas por células y/o microperlas y/o liposomas que llevan ADN y/o ARN diana, usados en la realización de pruebas de hibridación.

20. Método de realización de pruebas y ensayos de alto rendimiento y elevado valor biológico entre una pluralidad de primeras entidades seleccionadas de un grupo que consiste en células y microorganismos, y una pluralidad de segundas entidades que consisten en compuestos o unidades compuestas que van a someterse a prueba para determinar su actividad biológica con respecto a dichas primeras entidades; caracterizado porque comprende las etapas de:

(a)-

introducir dichas primeras y dichas segundas entidades dentro de una primera cámara de un dispositivo de pruebas que comprende al menos una serie de primeros electrodos excitables y direccionables de forma selectiva y al menos un segundo electrodo colocado enfrente de y orientado hacia los primeros electrodos;

(b)-

crear de forma selectiva compartimentos de potencial móviles cerrados en el interior de la primera cámara por medio de fuerza dielectroforética generada por dichos primeros electrodos y segundo electrodo y atrapar al menos una parte de las entidades en el interior de los compartimentos móviles;

(c)-

mover al menos uno de compartimentos móviles que contienen dichas primeras entidades hacia compartimentos móviles que contienen dichas segundas entidades y hacer que al menos una primera entidad interaccione con al menos una segunda entidad de al menos un primer tipo ocasionando la fusión de al menos un par de compartimentos móviles que contienen las entidades relativas;

(d)-

verificar la actividad biológica de la segunda entidad sobre la primera entidad analizando la interacción resultante utilizando detectores que pueden detectar cualquier prueba en la primera entidad de al menos uno de un grupo seleccionado de efectos, concretamente citostáticos, citotóxicos, mitóticos y expresión de un marcador.

21. Método según la reivindicación 20 en el que se detectan dichos efectos citostáticos, citotóxicos y mitóticos verificando la presencia y/o presencia cambiada de dichas primeras entidades en los compartimentos móviles creados a su alrededor y/o cerca de una pluralidad de primeros electrodos colocados inmediatamente adyacentes a dichos compartimentos móviles que contienen las primeras entidades y, antes de la ejecución de la etapa (c) de movimiento, se dejan vacíos u ocupados por compartimentos móviles vacíos.

22. Método según la reivindicación 20 o 21 en el que dichos detectores se seleccionan de un grupo que incluye detectores ópticos ubicados en el interior o el exterior del dispositivo de pruebas, detectores capacitivos, y combinaciones de los mismos.

23. Método según las reivindicaciones 20 a 22, que comprende la etapa adicional de reconocer al menos una pluralidad de entidades seleccionadas de un grupo que consiste dichas primeras entidades y dichas segundas entidades.

24. Método según la reivindicación 23 en el que etapa de reconocimiento se realiza antes o después de dicha etapa de introducir las entidades dentro del dispositivo de pruebas.

25. Método según la reivindicación 24 en el que dicha etapa de reconocimiento se realiza por medio de detectores seleccionados de un grupo que incluye detectores de tipo óptico ubicados en el interior o el exterior del dispositivo y detectores de tipo capacitivo.

26. Método según la reivindicación 25 en el que dicha etapa de reconocimiento se realiza dentro de dicho dispositivo basándose en la respuesta de las entidades de al menos una de dicha pluralidad de entidades a la fuerza dielectroforética generada en el interior del dispositivo.

27. Método según las reivindicaciones 23 a 26 que comprende la etapa, realizada antes de las etapas (c) y (d) de movimiento y verificación, de utilizar dichos compartimentos móviles para establecer una distribución espacial predeterminada en el interior del dispositivo de dicha al menos una pluralidad de entidades de al menos un tipo identificado.

28. Método según las reivindicaciones 20 a 27, en el que cada uno de los compartimentos móviles que atrapa dicha pluralidad de primeras entidades contiene al menos una única de dichas primera entidades.

29. Método según la reivindicación 28, en el que se atrapa al menos una parte de las primeras entidades en un compartimento de potencial dielectroforético móvil que tiene asociado a él un detector que puede de generar una señal proporcional al número de primeras entidades presentes en el compartimento.

30. Método según las reivindicaciones 20 a 29, en el que dicho marcador es una molécula indicadora que se expresa en el interior de la primera entidad.

31. Método según la reivindicación 30 en el que dichas unidades compuestas se seleccionan de un grupo que incluye microperlas, liposomas, y células que llevan un compuesto diseñado para activar la expresión de dicha molécula indicadora.

32. Método según la reivindicación 31 en el que se introduce dicho compuesto dentro de dicha primera entidad durante la etapa de interacción.

33. Método según la reivindicación 31 en el que dicho compuesto activa la expresión de dicha molécula indicadora mediante un mecanismo de interacción de tipo ligando-receptor.

34. Dispositivo de pruebas multifuncional (a partir de aquí con referencia a las figuras (DE) compuesto por un primer módulo (C) que comprende una serie (M1) de primeros electrodos (LIJ) excitables y direccionables de forma selectiva e individual al menos en parte, dispuestos sobre un soporte (A1) aislante; un segundo módulo que comprende al menos un segundo electrodo (M2) colocado enfrente de y orientado hacia los primeros electrodos (LIJ) y una estructura (A2) de soporte superior; también un elemento (A3) espaciador dispuesto entre el primer y segundo módulo y que delimita un entorno (L) líquido o semilíquido durante el funcionamiento, caracterizado porque el elemento (A3) espaciador se realiza de tal manera que establezca al menos una primera cámara (F) y al menos una segunda cámara (FL) en el interior del dispositivo interconectadas de forma hidráulica por al menos un paso (D) estrecho y que delimita el entorno (L) líquido o semilíquido, que está por tanto dividido por al menos un paso (D) estrecho en al menos dos
entornos parciales que no tienen influencia hidráulica entre sí y que coinciden con las al menos dos cámaras (F y FL).

35. Dispositivo según la reivindicación 34 en el que las primeras y segundas cámaras (F y FL) están equipadas con orificios que pueden abrirse de forma controlada y selectiva que funcionan como entradas (I1, I2) y salidas (O1, O2) respectivas, y dicha serie (M1) de primeros electrodos (LIJ) funciona como el fondo de dichas cámaras (F y FL) y del al menos un dicho paso (D) estrecho que permite la comunicación entre las cámaras.

36. Dispositivo según la reivindicación 34 o 35, en el que dicha serie (M1) de primeros electrodos (LIJ) está diseñada para funcionar junto con dicho segundo electrodo en la generación de una pluralidad de compartimentos (S1) dielectroforéticos por medio de los cuales se manipula una muestra (BIO) biológica.

37. Dispositivo según las reivindicaciones 34 a 36, en el que dicho primer módulo (C) está equipado con al menos un detector integrado colocado junto o en estrecha cercanía a al menos uno de los primeros electrodos.

38. Dispositivo según la reivindicación 37 en el que dicho al menos un detector se coloca para coincidir con dicho al menos un paso (D) estrecho.

39. Dispositivo según la reivindicación 37 o 38 en el que dicho al menos un detector es de tipo óptico o capacitivo.

40. Método de transporte de las primeras entidades que consiste en compuestos o unidades compuestas dentro de las segundas entidades, que comprende las etapas de:

(a)-

introducir la primera y segunda entidades dentro de una cámara de un dispositivo de pruebas que comprende al menos una serie de primeros electrodos excitables y direccionables de forma selectiva y al menos un segundo electrodo colocado enfrente de y orientado hacia los primeros electrodos;

(b)-

crear de forma selectiva compartimentos de potencial móviles cerrados en el interior de dicha cámara por medio de fuerza dielectroforética generada mediante dichos electrodos y atrapar al menos una parte de dichas primeras entidades dentro de los primeros compartimentos móviles y de dichas segundas entidades en el interior de los segundos compartimentos móviles;

(c)-

identificar y seleccionar los compartimentos que contienen las primeras entidades;

(d)-

mover al menos uno de dichos compartimentos móviles que contienen las primeras entidades hacia dichos compartimentos móviles que contienen las segundas entidades;

(e)-

hacer que al menos un compartimento móvil que contiene una primera entidad se fusione con un compartimento móvil que contiene una segunda entidad; caracterizado porque en dichas primera y segunda entidades y dicha etapa de fusión de al menos un compartimento móvil que contiene una primera entidad con un compartimento móvil que contiene una segunda entidad son de tal forma que se provoca que las primeras entidades penetren dentro de las segundas entidades cuando ponen contacto físico con éstas últimas.

41. Método según la reivindicación 40, en el que dichas segundas entidades se seleccionan de un grupo que incluye células, microorganismos, liposomas, microperlas y similares, y se atrapan en compartimentos móviles.

42. Método según la reivindicación 41, en el que dichas segundas entidades que consisten en células o microorganismos se fijan a microperlas y/o se llevan en la superficie o en el interior de liposomas.

43. Método según las reivindicaciones 40 a 42, en el que dichas primeras entidades que consisten en dichos compuestos o dichas unidades compuestas se llevan directamente por células y/o microperlas y/o liposomas, o mediante vectores diseñados para penetrar en el interior de dichas segundas entidades una vez que se han puesto en contacto físico con las mismas segundas entidades, pudiendo transportarse a s vez el vector vez por células y/o microperlas y/o liposomas.