ITTO20010411A1

ITTO20010411A1 - Metodo e dispositivo per l'esecuzione di test e saggi ad alta processivita' ed alto valore biologico su cellule e/o composti.

Info

Publication number: ITTO20010411A1
Application number: IT2001TO000411A
Authority: IT
Inventors: Nicolo' Manaresi; Gianni Medoro; Luigi Altomare; Marco Tartagni; Roberto Guerrieri
Original assignee: Silicon Biosystems S R L
Priority date: 2001-05-02
Filing date: 2001-05-02
Publication date: 2002-11-02
Also published as: EP1428027B1; WO2002088702A2; WO2002088702A9; ITTO20010411A0; ES2284864T3; AU2002256881A1; DE60219040T2; WO2002088702A8; ATE357660T1; EP1428027A2; US20040191789A1; WO2002088702A3; DE60219040D1; US7699969B2

Description

D E S C R I Z I O N E

di brevetto per invenzione industriale

CAMPO DELLA TECNICA

La presente invenzione si riferisce ad un metodo di manipolazione di particelle con forze di dielettro foresi per lo screening ad alto valore biologico di potenziali composti farmaceutici, per applicazioni ad analisi diagnostiche ed agroalimentari. L'invenzione si riferisce inoltre ad un dispositivo per la realizzazio ne del suddetto metodo.

STATO DELLA TECNICA

Nel campo in espansione della scoperta di nuovi farmaci e della chimica combinatoria per produrre nuovi composti candidati, sarebbe molto utile essere in grado di testare un gran numero di sostanze, attraverso un saggio altamente processivo, per il loro impatto fisio logico sugli animali e sull'uomo. Prima di provare l'efficacia di un candidato farmaco "parzialmente qua lificato" sugli animali, la sostanza dovrebbe essere prima saggiata per la sua potenziale attività tossica su cellule viventi.

Tradizionalmente, invece, composti promettenti vengono quasi subito provati in studi estensivi su mo delli animali, studi che sono nello stesso tempo lunghi e costosi. Inoltre l'uso estensivo di test sugli anima li sta diventando sempre meno culturalmente accettato negli Stati Uniti e in Europa. Saggiare composti dalla potenziale attività farmaceutica per le loro interazio ni con le cellule viventi, prima degli studi sui model li animali, può ridurre il numero d'animali richiesti nei successivi test eliminando molti candidati prima di giungere a quella fase.

Attualmente l'analisi dell'interazione cellula farmaco non permette né un'alta processività né un alto valore biologico, a causa del ridotto numero di cellule e composti che possono venire analizzati in un dato pe riodo di tempo, la scarsa praticità dei metodi richie sti per la somministrazione dei composti e i grandi vo lumi di composto richiesti.

Si è pertanto cercato di superare questi inconve nienti studiando metodi alternativi per l'analisi delle interazioni cellula farmaco o, più in generale, tra campioni biologici ed agenti biologicamente attivi, quali ad esempio quelli sotto riportati.

Matrici di cellule

Diversi metodi sono stati descritti per produrre matrici uniformemente micro-modellate di cellule, per esempio la fotolitografia (Mrksich & Whitesides, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 25:55-78, 1996). Secondo questo metodo, viene ottenuta, a partire da una lastra di vetro e tramite l'uso di materiale fotosensibile e di una foto maschera, una lastra che presenta una ma trice di spots reattivi o idrofilici su una superficie del resto idrofobica. La matrice di gruppi idrofilici fornisce un substrato per il legame non specifico e non covalente di certi tipi di cellule, comprese quelle di origine neuronaie (Kleinfeld et al., J. Neurosci.

8 :4098-4120,1988) .

In un altro metodo basato su interazioni specifi che ma non covalenti, il fotostampaggio è usato per produrre una superficie d'oro che presenta spots di laminina, una proteina che lega le cellule che viene nor malmente rinvenuta nella matrice extracellulare (Singhvi et al., Science 264: 696-698, 1994)

Un legame uniforme più specifico può essere rag giunto attraverso il crosslinking di specifiche moleco le, come proteine, a siti reattivi del substrato model lato (Aplin & Hughes, Analyt. Biochem. 113: 144-148, 1981) .

Un'altra elaborazione di un sistema ottico per mo dellare un substrato e creare degli spot reattivi è ba sato sull'utilizzo di radiazioni UV profonde attraverso una maschera ottica, che porta alla fine ad ottenere dei siti attivi costituiti da gruppi polari silanolo. Questi gruppi costituiscono gli spot della matrice e sono ulteriormente modificati attraverso l'accoppiamen to con altri gruppi reattivi, come descritto nel bre vetto USA Nr. 5,324,591. Questo metodo ottico per for mare matrici uniformi di cellule su un supporto richie de meno passaggi del metodo fotolitografico, ma richiede l'uso di luce ultravioletta ad alta intensità, e le fonti di luce con queste caratteristiche sono molto costose.

Inoltre, in tutti questi metodi la matrice di cellule risultante è uniforme, poiché le molecole biochi micamente specifiche sono legate alle matrici micro modellate chimicamente. Nel metodo fotolitografico, le cellule si legano a matrici di spot idrofilici e/o a specifiche molecole attaccate agli spot che legano le cellule. Dunque le cellule si legano a tutti gli spot della matrice nella stessa maniera. Nel metodo ottico, le cellule si legano a matrici di spot di gruppi aminoacidici liberi per adesione. Esiste poca o nessuna differenza fra questi spot. Ancora una volta le cellule aderiscono in tutti gli spot nella stessa maniera e dunque solo un certo tipo di interazione cellulare può essere studiata mediante queste matrici, perché ogni spot è essenzialmente lo stesso di un altro.

Questo tipo di matrici è pertanto poco flessibile come strumento per l'analisi di una specifica singola varietà di cellule o di interazione. Dunque esiste la necessità di produrre matrici di cellule non uniformemente micro-modellate per aumentare il numero di cellu le o di interazioni analizzabili simultaneamente.

Le domande di brevetto internazionale WO 00/39587 e WO 00/47996 illustrano un sistema di sensori e metodi per realizzare matrici, eventualmente composite, di mi crosfere o cellule ordinate casualmente sulla punta di matasse di fibre ottiche. Se da una parte le metodiche delineate in queste domande di brevetto hanno grosse potenzialità analitiche soprattutto per quel che ri guarda le proteine e gli acidi nucleici, esse presenta no però lo svantaggio di non permettere né la separa zione né, tanto meno, il recupero di popolazioni di in teresse eventualmente individuate.

Rilevamento della fisiologia cellulare e fluore scenza

Eseguire uno saggio ad alta processività di molte migliaia di composti richiede la manipolazione in parallelo e il trattamento di molti composti e dei rea genti componenti del saggio; inoltre deve esistere an che una metodica per evidenziare e rilevare, nella ma niera più semplice possibile, i risultati dell'esperimento. I·saggi standard più comuni usano mi scele omogenee di composti e reagenti biologici insieme a gualche composto indicatore, caricati in una matrice di pozzetti di microtiter standard con 96 o 384 pozzet ti (Kahl et al., J. Biomol. Scr. 2:33-40, 1997). I se gnali misurati da ciascun pozzetto, si tratti di emis sioni di fluorescenza, densità ottica o radioattività, s'integrano al segnale proveniente da tutto il materia le presente nel pozzetto dando una media generale della popolazione di tutte le molecole nel pozzetto. Questo tipo di saggio viene comunemente definito saggio omoge neo.

La fluorescenza è fra i sistemi più diffusi e sono stati perciò sviluppati una varietà di metodi per gene rare immagini di cellule fluorescenti con un microsco pio e estrarre informazioni sulla distribuzione spazia le e i cambiamenti nel tempo che avvengono in queste cellule. Molti di questi metodi e le loro applicazioni sono descritti nell'articolo di Taylor et al., Am. Scientist 80: 322-335,1992.

Questi metodi sono stati progettati e ottimizzati per la preparazione di un piccolo numero di campioni per la misurazione ad alta risoluzione spaziale e tem porale della distribuzione, quantità e contorno biochi mico delle molecole reporter fluorescenti presenti nel le cellule.

Trattare le cellule con coloranti e reagenti fluo rescenti per ottenerne immagini e/o modificare geneti camente le cellule per fargli produrre proteine fluore scenti, come la Green Fluorescent Protein (GFP) modifi cata, sono utili metodi di rilevamento. L'uso della GFP per lo studio dell'espressione genica e della localiz zazione delle proteine viene discusso ampiamente da Chalfic et al., in Science 263: 803-805.

Tuttavia, questi metodi sono comunque complessi, costosi, lenti e permettono di trattare solo gruppi di cellule per volta.

La dielettroforesi

La dielettroforesi riguarda il fenomeno fisico per cui particelle dielettriche, sottoposte all'azione di campi elettrici continui e/o alternati spazialmente non uniformi, subiscono una forza netta agente verso le re gioni dello spazio in cui l'intensità del campo è cre scente (pDEP) o decrescente (nDEP). Se l'intensità del le forze è paragonabile a quella della forza peso è possibile, in linea di principio, creare un equilìbrio di forze per ottenere la levitazione di piccole parti celle. L'intensità della forza di dielettroforesi, così come la direzione ed il verso in cui essa agisce, di pendono fortemente dalle proprietà dielettriche e con duttive del corpo e del mezzo in cui il corpo è immer so, proprietà che variano in funzione della frequenza.

Gli studi condotti sull'analisi degli effetti del le forze di dielettroforesi su microorganismi o loro parti (cellule, batteri, virus, DNA, ecc.) o su oggetti artificiali costituiti da materiali inorganici hanno suggerito da tempo l'idea di sfruttare tali forze per la selezione di un particolare corpo da un campione contenente una pluralità di microorganismi, la caratte rizzazione delle proprietà fisiche di microorganismi e in generale la loro manipolazione.

Ad esempio, la manipolazione di generici "pacchetti" di sostanze (liquide, solide o gassose) tramite forze di dielettroforesi generate tra elettrodi contigui di una matrice indirizzabile di elettrodi è descritta nella domanda internazionale di brevetto WO 00/47322. Tuttavia, il metodo descritto in questo docu mento non è adatto a condurre uno studio ad alto valore biologico su cellule e più in generale su microrganismi o parti (sequenze di DNA, RNA, plasmidi, eccetera) di microrganismi, in quanto da una parte il "pacchetto" viene sottoposto, per effettuarne la manipolazione per dielettroforesi, a notevoli tensioni e, dall'altra par te, è in generale soggetto ad attrito contro la super ficie del piano di reazione dal quale è portata la ma trice di elettrodi.

Un altro sistema noto utilizza la creazione di gabbie tridimensionali per la manipolazione di cellule tramite la costruzione di micro ottupoli (T. Schnelle et al., in Biochimica et Biophysica Acta, 1157:127-140); in questo caso, il materiale cellulare viene le vitato e non è pertanto soggetto ad attriti od altre sollecitazioni meccaniche, in particolare nel caso in cui i sistemi di manipolazione utilizzati siano di di mensioni paragonabili a quelli delle particelle che si vuole manipolare, così da ridurre l'entità delle ten sioni per la creazione delle distribuzioni di campo ne cessarie alla manifestazione degli effetti desiderati (Washizu & Kurosawa, Trans. Ind. Appi. 26:1165-1172, 1990; Washizu et al., Trans. Ind. Appl. 30:835-843, 1994) .

Le strutture proposte in letteratura, tuttavia, si scontrano con problemi di realizzazione quando le di mensioni della gabbia che si vuole costruire diventano paragonabili a quelle delle cellule stesse (al fine di intrappolare una singola cellula). In questo caso, infatti, sorge il problema di allineare le due strutture che, assemblate l'una sull'altra in scala micrometrica, costituiscono l'ottupolo.

Tale ultimo problema viene risolto dalla domanda internazionale di brevetto WO 00/69565, che descrive un apparato e metodo per la manipolazione di particelle, (d'ora in poi si intenderà con il termine "particelle", gli elementi manipolati dielettoforeticamente che pren dono parte agli esperimenti, siano essi entità biologi che, sostanze da saggiare nella loro forma veicolata, o entrambe; quale dei tre casi di volta in volta si evin cerà semplicemente dal contesto) tramite l'utilizzo di gabbie di potenziale dielettroforetico chiuse.

Tuttavia, questi ultimi metodi di manipolazione basati sulla levitazione dielettroforetìca del materia le da analizzare sono attualmente limitati alla separazione e/o conta delle particelle manipolate tramite ri conoscimento delle stesse effettuato con opportuni, specifici sensori predisposti ed integrati nella matri ce di elettrodi e/o disposti internamente o esternamen te alla camera in cui avviene la manipolazione per le vitazione. Pertanto possono essere utilizzati solamente per particelle dotate di caratteristiche distintive in trinseche (ad esempio discriminate in base alla loro dimensione) di tipo rilevabile con sensori specifici, che devono venire di volta in volta predisposti.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Scopo dell'invenzione è dunque quello di superare gli inconvenienti dei metodi noti sopra descritti per la manipolazione di cellule e, più in generale, di ma teriale chimico-biologico, al fine di poter effettuare in modo rapido, efficiente, economico e precìso saggi chimico/farmacologici altamente processivi e senza ne cessità (almeno in prima battuta) dell'utilizzo di ca vie animali.

In particolare, per materiale chimico-biologico si deve intendere, qui e nella descrizione che segue, una qualsiasi "entità" indifferentemente costituita da un "composto", una "unità di composto", come sotto definìti, o da una cellula.

Con il termine "composto" si deve intendere, qui e nella descrizione che segue, una qualsiasi sostanza dalla probabile attività farmaceutica, quale DNA poten zialmente trasformante o una sostanze chimica, come ta le o, se necessario, opportunamente immobilizzata sulla superficie di microsfere (microbeads) o microincapsula ta in un doppio strato lipidico o liposoma, o in un vi rus, geneticamente modificato o meno, in grado di fun gere da vettore per materiale genetico.

Con il termine "unità di composto" si deve intendere, qui e nella descrizione che segue, un liposoma contenete una determinata quantità di composto, come sopra definito, oppure un singolo virus vettore. Qualo ra le sostanze chimiche vengano utilizzate per rivesti re una microsfera, con "unità di composto" si intenderà una microsfera avente una determinata quantità di com posto immobilizzata sulla propria superficie.

Sulla base delle definizioni sopra riportate, è in particolare uno primo scopo dell'invenzione quello di fornire un metodo per effettuare test e saggi ad alta processività ed elevato valore biologico su entità co stituite da singole cellule o da unità di composto anche di natura a priori incognita, che permetta l'identificazione delle cellule o unità di composto di natura incognita in una popolazione mista di partenza ed, eventualmente, la successiva separazione delle cellule e/o unità di composto così identificate dalla po polazione di partenza.

E' inoltre un secondo scopo dell'invenzione quello di fornire un metodo per effettuare, su singole cellu le, test e saggi ad alta processività ed elevato valore biologico per l'individuazione dell'attività biologica sulle cellule stesse di uno o più composti selezionati, eventualmente veicolati in una o più unità di composto singolarmente individuabili, tramite il monitoraggio della risposta cellulare alla somministrazione di tali composti. Preferibilmente è anche uno scopo dell'invenzione quello di fornire un metodo di saggio di attività biologica del tipo suddetto che permetta la somministrazione selettiva alle cellule, preferibilmen te con dosaggi prefissati e regolabili, di un composto alla volta.

E' un terzo scopo dell'invenzione quello di forni re un dispositivo di test adatto a realizzare i metodi sopra specificati che faccia uso, al fine di controlla re la posizione di ogni singola cellula e composto pre sente nel dispositivo, della manipolazione dielettroforetica, ovvero la levitazione stabile di particelle di elettriche neutre o elettricamente cariche (cellule o composti).

E' infine anche uno scopo dell'invenzione quello di fornire un metodo semplice, rapido, efficace ed af fidabile per la veicolazione di composti o unità di composto verso cellule o microrganismi.

In base ad un primo aspetto dell'invenzione, essa è dunque relativa ad un metodo per effettuare test e saggi ad alta processività ed alto valore biologico su un campione includente materiale chimico-biologico co stituito da entità incognite, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi:

(a)- introdurre detto campione includente dette entità incognite in una prima camera di un dispositivo di test comprendente almeno una matrice di primi elettrodi se lettivamente indirizzabili ed attivabili ed almeno un secondo elettrodo affacciato ai primi;

(b)- introdurre nella prima camera di detto dispositivo di test materiale chimico-biologico costituito da enti tà note, identificabili all'interno del detto disposi tivo di test ed aventi una affinità presunta verso le entità incognite;

(c)- generare selettivamente all'interno di detta prima camera gabbie mobili chiuse del potenziale per la forza di dielettroforesi tramite detti elettrodi affacciati ed intrappolare almeno una parte di dette entità all'interno di dette gabbie mobili;

(d)- muovere relativamente almeno una di dette gabbie mobili contenenti le entità note verso dette gabbie mobili contenenti le entità incognite e fare interagire almeno una entità incognita con almeno una entità nota di almeno un primo tipo producendo la congiunzione di almeno una coppia di gabbie mobili che le contengono; (e)- verificare la creazione o meno di un legame stabi le tra detta almeno una entità incognita e la detta al meno una entità nota del primo tipo, per determinare l'esistenza di una affinità tra le stesse e di conseguenza identificare detta almeno una entità incognita. Le entità incognite così identificate sono prefe ribilmente contate e separate dalle restanti entità e recuperate all'esterno del dispositivo di test dopo averle spostate in una seconda camera del dispositivo di test.

In questo modo, in particolare utilizzando come entità note microsfere funzionalizzate (ad esempio con appositi anticorpi o con un ligando) il metodo dell'invenzione può essere utilizzato in diagnostica per individuare, ed eventualmente anche contare, un da to organismo in un campione, per separare cellule sulla base delle loro caratteristiche antigeniche, ad esempio la separazione di cellule neoplastiche da cellule nor mali, oppure per studiare la risposta cellulare inne scata dal legame di un ligando al suo recettore speci fico .

In base ad un secondo aspetto del trovato, la pre sente invenzione è relativa ad un metodo per effettuare test e saggi ad alta processività ed alto valore biolo gico tra: una pluralità di prime entità scelte nel gruppo consistente in: cellule, virus, microorganismi, acidi nucleici, loro combinazioni; ed una pluralità di seconde entità costituite da composti o unità di compo sto da testare per la loro attività biologica verso dette prime entità; caratterizzato dal fatto di com prendere le seguenti fasi:

(a)- introdurre dette prime e seconde entità in una prima camera di un dispositivo di test comprendente al meno una matrice di primi elettrodi selettivamente indirizzabili ed attivabili ed almeno un secondo elettro do affacciato ai primi;

(b)- generare selettivamente all'interno di detta prima camera gabbie mobili chiuse del potenziale per la forza di dielettroforesi tramite detti elettrodi affacciati ed intrappolare almeno una parte di dette entità all'interno di dette gabbie mobili;

(c)- muovere relativamente almeno una di dette gabbie mobili contenenti le prime entità verso dette gabbie mobili contenenti le seconde entità e fare interagire almeno una prima entità con almeno una seconda entità di almeno un primo tipo producendo la congiunzione di almeno una coppia di gabbie mobili che le contengono; (d)- verificare l'attività biologica della seconda en tità sulla prima entità tramite l'analisi della inter azione avvenuta con l'utilizzo di sensori in grado di rilevare a carico della prima entità il verificarsi di almeno un effetto scelto nel gruppo consistente in: ci tostatico, citotossico, mitotico, espressione di un marcatore.

In particolare, detti effetto citostatico, cito tossico, mitotico vengono rilevati tramite la verifica della presenza e/o la variazione di presenza di dette prime entità nelle gabbie mobili che le contengono e/o in corrispondenza di una pluralità di primi elettrodi disposti immediatamente adiacenti a dette gabbie mobili che contengono le prime entità e che prima della esecu zione di detta fase (c) sono stati lasciati liberi o sono occupati da gabbie mobili vuote.

In questo modo si possono effettuare molte mi gliaia di esperimenti in parallelo all'interno del me desimo dispositivo. E' possibile trattare cellule dello stesso tipo con una combinazione di composti diversi o viceversa trattare una combinazione di cellule con un composto o ancora usare una combinazione di entrambe le soluzioni. Il numero di esperienze effettuabili con questo metodo può essere ulteriormente incrementato va riando la "posologia" dei composti somministrati ad ogni singola cellula ovvero quantità di composto di un certo tipo.

All'alta processività del metodo si unisce anche una elevata velocità di realizzazione degli esperimenti grazie all'utilizzo di bassi volumi di reazione, con ciò si intenda sia basse quantità di composti, che di tamponi e altri reagenti. Il posizionamento delle particelle tramite levitazione dielettroforetica consente, infatti, di ridurre ai minimi termini la manipolazione del liquido con scomodi e costosi sistemi microfluidici .

Ciò ha ovviamente un'ulteriore ricaduta positiva sui costi dell'esperimento poiché consente di limitare l'utilizzo di quantità elevate di composti particolar mente costosi e/o difficili da sintetizzare.

A differenza dei sistemi "tradizionali" per immo bilizzare le cellule (basati sul legame chimico - spe cifico o meno - ad un substrato) la disposizione delle cellule secondo la presente invenzione è effettuato tramite levitazione dielettroforetica e dunque non c'è né contatto né legame con il dispositivo. Ciò dovrebbe garantire una maggiore naturalezza della risposta fi siologica .

Rispetto ai sistemi basati su camere multiple (microtiter, eccetera) un'ulteriore differenza e vantaggio risiede nel fatto che le interazioni cellula/composto possano avvenire tutte nella stessa camera del disposi tivo e in pratica simultaneamente. Ciò riduce gli erro ri nell'analisi delle risposte rispetto a congegni che presentano camere o pozzetti separati, in quanto vi è una maggiore uniformità delle condizioni dell'esperi mento .

Inoltre è anche possibile analizzare la risposta di una singola cellula e non solo quella media di una popolazione di cellule omogenee come avviene in quasi tutti i metodi finora proposti. Ciò è reso possibile dai sistemi di sensing integrati di tipo ottico o di tipo capacitivo, che permettono di svincolarsi dalla ingombrante strumentazione di rivelazione tradizional mente utilizzata in questo contesto (telecamera, micro scopio) , seppure non se ne escluda l'impiego per la monitorazione visiva di ciò che accade nel dispositivo o qualora sia semplicemente più conveniente.

Tecniche note di controllo in retroazione effettuate mediante l'elaborazione delle informazioni provenienti dai sensori integrati nel dispositivo, consentono poi di effettuare una serie di operazioni complesse in modo del tutto automatico, quali per esempio 1'eventuale recupero selettivo di alcune delle particelle sottoposte all'analisi.

Il metodo è virtualmente completamente automatizzabile e controllabile elettronicamente, il che lo ren de particolarmente adattabile alle diverse esigenze de gli utilizzatori. L'elevata automazione introducibile limita inoltre gli errori generati nell'effettuazione manuale di operazione ripetitive comuni in altri metodi di screening.

Il metodo proposto può venire utilizzato anche per veicolare, oltre che composti dalla probabile attività farmaceutica eventualmente microincapsulati, anche mi crosfere (microbeads) opportunamente funzionalizzate.

Tali sfere possono avere dimensioni paragonabili a quelle cellulari oppure essere anche molto più piccole e possono venire, secondo arte nota, rivestite ad esem pio con anticorpi (Ab) o altre sostanze che possono in teragire con i recettori cellulari.

Microsfere opportunamente rivestite di DNA (o RNA) sonda possono venire fatte interagire con altre rive stite dì DNA (o RNA) bersaglio per effettuare un test di ibridazione ad esempio per identificare il bersaglio (diagnostica molecolare) oppure alla ricerca di SNP (single nucleotide polymorphisms = polimorfismi di un singolo nucleotide).

In base ad un terzo aspetto dell'invenzione, essa è relativa ad un dispositivo di test multifunzionale, comprendente un primo modulo comprendente una matrice di primi elettrodi almeno in parte singolarmente e se lettivamente indirizzabili ed attivabili, disposti su di un supporto isolante; un secondo modulo comprendente almeno un secondo elettrodo disposto affacciato ai pri mi elettrodi ed una struttura di supporto superiore; ed un elemento distanziatore disposto tra il primo ed il secondo modulo e delimitante in uso un ambiente liquido o semiliquido; caratterizzato dal fatto che detto ele mento distanziatore è conformato in modo tale da defi nire all'interno del dispositivo almeno una prima came ra ed almeno una seconda camera collegate tra loro idraulicamente da almeno una restrizione e delimitanti detto ambiente, che risulta così suddiviso da detta al meno una restrizione in almeno due ambienti parziali idraulicamente non interferenti tra loro definiti da dette almeno due camere.

Inoltre, ciascuna detta camera è dotata di orifizi o opercoli ad apertura selettiva e comandata, di immis sione ed estrazione; detta matrice di primi elettrodi costituendo il fondo di dette camere e di detta almeno una restrizione di comunicazione tra le stesse.

In questo modo si possono eseguire facilmente, a basso costo (in quanto le procedure sono tutte facilmente implementabili tramite programmazione di proces sori), rapidamente ed in modo affidabile una quantità di test ed operazioni finora non realizzabili in un singolo dispositivo di test. Le soluzioni proposte fin ora nel campo della chimica combinatoria, infatti, pre sentano una serie di problemi, molti dei quali possono essere superati con il dispositivo dell'invenzione, il quale permette di creare una distribuzione spaziale di particelle, o più semplicemente controllarne la posi zione, tramite una distribuzione mirata di campi elet trici tali da realizzare delle gabbie di potenziale chiuse per la forza di dielettroforesi. Queste gabbie possono essere spostate trascinando la particella in trappolata all'interno per farle compiere tragitti lun ghi all'interno del dispositivo.

Infine, l'invenzione è relativa ad un metodo per la veicolazione di prime entità costituite da composti o unità di composto all'interno di seconde entità, ca ratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi: (a)- introdurre dette prime e seconde entità in una ca mera di un dispositivo di test comprendente almeno una matrice di primi elettrodi selettivamente indirizzabili ed attivabili ed almeno un secondo elettrodo affacciato ai primi;

(b)- generare selettivamente all'interno di detta carnera gabbie mobili chiuse del potenziale per la forza di dielettroforesi tramite detti elettrodi affacciati ed intrappolare almeno una parte di dette entità all'interno di dette gabbie mobili;

(c)— riconoscere e selezionare le gabbie contenenti prime entità;

(d)- muovere relativamente almeno una di dette gabbie mobili contenenti le prime entità verso dette gabbie mobili contenenti le seconde entità;

(e)- produrre la congiunzione di almeno una gabbia mo bile contenente una prima entità con una gabbia mobile contenente una seconda entità.

In questo modo è possibile far venire in contatto in modo controllato, rapido ed efficace selezionate so stanze con altre selezionate sostanze o selezionati or ganismi, allo scopo non soltanto di eseguire test, ma anche di produrre modificazioni desiderate o desiderate reazioni tenendo "confinati" i prodotti di reazione, ad esempio produrre alterazioni genetiche di microorgani smi che possono poi venire facilmente recuperati.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell'invenzione appariranno chiari dalla descrizione che segue di alcuni suoi esempi di attuazione non limi tativi, effettuata con riferimento alle figure dei di segni annessi.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

- la Figura 1 mostra una vista prospettica schema tizzata di una parte di un dispositivo di arte nota de dicata alla manipolazione di campioni mediante dielet troforesi ;

- la Figura 2 mostra una visione tridimensionale schematizzata del dispositivo come realizzato in base alla presente invenzione;

la Figura 3 illustra schematicamente una delle possibili strategie d'ordinamento utilizzabile nel me todo secondo il trovato, comprendente introduzione e posizionamento, che avviene sequenzialmente per le di verse specie di cellule;

- la Figura 4 illustra una strategia di ordinamen to comprendente l'introduzione simultanea di più specie e il posizionamento selettivo delle specie diverse;

- la figura 5 illustra l'andamento della forza di dielettroforesi al variare della frequenza per cellule (BIO) e microsfere (BEAD);

- la Figura 6 mostra il comportamento del sistema dielettroforetico utilizzato dall'invenzione quando si fanno fondere due gabbie, una contenente una cellula da analizzare e l'altra una microsfera, rivestita di anticorpi, di dimensioni paragonabili alla cellula, nel caso di match (6a) fra antigene e antìcorpo e non match (6b);

- la Figura 7 mostra il comportamento del sistema dielettroforetico utilizzato dall'invenzione quando sì fanno fondere due gabbie, una contenente una cellula da analizzare e l'altra microsfere, rivestite di anticor pi, di dimensioni inferiori a quelle cellulari, nel ca so di match fra antigene e anticorpo con prevalenza della forza di dielettroforesi positiva (7a), di match ma con prevalenza della forza di dielettroforesi nega tiva (7b) e non match (7c);

- la Figura 8 mostra un diagramma di alcune buche di potenziale, ed il dislocamento di una cellula neo generata dalla buca in cui si trova la cellula progeni trice a quella adiacente;

- la Figura 9 mostra le fasi di analisi e selezio ne di cellule specifiche con l'utilizzo di microsfere funzionalizzate con anticorpi specifici;

DESCRIZIONE DETTAGLIATA

Con riferimento alle figure 1 e 2, la presente in venzione è basata sull'utilizzo di un dispositivo di test utilizzante una tecnologia nota dalla precedente domanda di brevetto internazionale pubblicata WO 00/69565 della stessa Richiedente, il cui contenuto viene qui incorporato per le parti necessarie per sem plice riferimento; dispositivo di test che, tuttavia, risulta essere dotato di nuove ed originali caratteri stiche strutturali non anticipate nella suddetta doman da di brevetto e mirate appositamente a rendere possi bile l'esecuzione dei metodi di test e saggio secondo il trovato in modo semplice, efficiente, economico e con ridotti ingombri.

Il dispositivo noto, illustrato schematicamente in figura 1, comprende due moduli fondamentali; un primo modulo è costituito da una matrice Mi di elettrodi LIJ distribuiti regolarmente disposti su di un supporto isolante Al. Gli elettrodi LIJ possono essere di un ma teriale conduttore qualunque con preferenza per i me talli compatibili con la tecnologia di integrazione elettronica, mentre il mezzo isolante Al può essere os sido di silicio o un qualunque altro materiale isolan te.

La forma degli elettrodi LIJ della matrice MI può essere di vario tipo; in figura 1 sono rappresentati, non limitatamente, elettrodi LIJ di forma quadrata. Ciascun elemento della matrice MI è costituito da un elettrodo LIJ per generare una gabbia dielettroforetica SI adibita alla manipolazione di un campione biologico BIO; tutto avviene in un ambiente liquido o semiliquido L delimitato da un elemento distanziatore A3.

In una regione C sottostante gli elettrodi possono trovarsi circuiti integrati per il sensing, cioè senso ri (noti e non illustrati per semplicità), che possono essere di vario tipo, in grado di rilevare la presenza di una entità da manipolare all'interno delle gabbie di potenziale SI generate dagli elettrodi. Nella realizza zione preferenziale, il secondo modulo principale è co stituito sostanzialmente da un unico grande elettrodo M2, che copre l'intero dispositivo. Infine può essere presente una struttura di supporto superiore A2, costi tuente il coperchio del dispositivo e dell'ambiente L.

La forma più semplice da dare all'elettrodo M2 è quella di una superficie piana e omogenea; sono possi bili altre forme più o meno complesse (per esempio una griglia più o meno fitta al fine di permettere alla lu ce di passare attraverso). Il materiale più adatto da usare per l'elettrodo superiore M2 è un materiale con duttore e trasparente, depositato su un supporto A2 in vetro. In questo modo è possibile affiancare ai sensori eventualmente integrati nel dispositivo i tradizionali metodi di ispezione ottica dall'alto del dispositivo (microscopio e telecamera).

Con riferimento alla figura 2, in essa è illustra to schematicamente un dispositivo DE realizzato secondo l'invenzione e derivato dal dispositivo di figura 1; i dettagli simili od uguali a quelli già descritti sono indicati per semplicità con i medesimi numeri.

Il dispositivo DE comprende un modulo superiore A2 supportante un elettrodo unico M2 (non indicato per semplicità), un modulo inferiore C portante una matrice MI di elettrodi LIJ selettivamente indìrizzabili ed at tivabili (non illustrati) ed un distanziale A3 disposto tra i moduli A2 e C e delimitante al proprio interno un ambiente liquido o semiliquido L in uso costituito da opportune soluzioni tampone. Secondo il trovato, però, il distanziale L è conformato in modo da definire al proprio interno due camere F e FL collegate tra loro idraulicamente da almeno una restrizione D e delimitan ti l'ambiente L, che risulta così suddiviso dalla re strizione D in due ambienti parziali idraulicamente non interferenti tra loro definiti dalle due camere F e FL. Ciascuna camera F ed FL è poi dotata di orifizi o oper coli ad apertura selettiva e comandata, di immissione ed estrazione, indicati rispettivamente con 11,01 (per la camera F) e 12,02 (per la camera FL); la matrice MI di elettrodi LIJ costituisce il fondo di entrambe le camere F e FL e della restrizione dì comunicazione D tra le stesse.

IL suddetto dispositivo viene utilizzato secondo l'invenzione come di seguito descritto.

Screening ad alta processività

Nel metodo secondo la presente invenzione, è pos sibile immettere dall'apposito opercolo del dispositivo (Il in Figura 2), il campione (siano cellule, composti dalla probabile attività farmaceutica microincapsulati o microsfere funzionalizzate) nella regione adibita al la manipolazione utilizzando gli appositi strumenti no ti agli esperti del settore (micropompe peristaltiche, pipettatrici, siringhe Hamilton, ecc.) in modo del tutto automatico oppure manualmente a seconda delle esi genze dell'utenza. Il campione subisce una adeguata forza di dielettroforesi; in questo modo è possibile intrappolarlo all'interno di buche di potenziale e far gli compiere tragitti più o meno lunghi all'interno del dispositivo stesso. Prima di svolgere queste operazioni è necessario comunque riempire le camere del dispositi vo (F e FL in Figura 2) con una soluzione tampone ap propriata attraverso le aperture II e 12. Durante que sta fase le aperture poste dalla parte opposta della camere (01 e 02) vengono lasciate aperte per impedire la formazione di bolle d'aria che impedirebbero al dispositivo DE di funzionare correttamente.

La capacità di spostare particelle levitanti grazie alla sola dielettroforesi consente di ridurre ai minimi termini la manipolazione del liquido con scomodi e costosi sistemi fluido-dinamici (microfluidica), per mettendo di accumulare le particelle selezionate dalla zona di immissione (dove è presente transitoriamente un elevato flusso ed eventualmente turbolenza fluidodinamica - F in Figura 2), passando attraverso l'apertura ristretta nel setto che separa le due strut ture (D in Figura 2), nella camera del sistema normal mente priva di flusso (FL in Figura 2), facendo muovere le particelle anziché il liquido, evitando in questo modo stress da attriti e contatti. In questo modo è possibile disporre le particelle a formare una matrice ordinata oppure più semplicemente mantenere la posizio ne che assumono spontaneamente nella camera del dispo sitivo .

Dopo avere generato e/o mantenuto la disposizione richiesta, allo stesso modo è possibile poi muovere al tre particelle, siano cellule o i composti da saggiare, e farle venire in contatto con quelle da analizzare Col presente metodo è possibile dunque effettuare migliaia di esperimenti in parallelo all'interno del medesimo dispositivo. E' possibile trattare cellule dello stesso tipo con una combinazione di composti diversi o viceversa trattare una combinazione di cellule con un composto. E' anche possibile trattare cellule diverse con composti diversi nel corso dello stesso esperimento. Il numero di esperienze effettuabili in contemporanea con questo metodo può essere ulteriormen te incrementato variando la "posologia" dei composti somministrati ad ogni singola cellula, cioè il numero di unità di un certo composto, o anche somministrando ad ogni singola cellula diversi composti in successio ne.

Ciò può essere rappresentato dalla seguente formu la:

Dove NE è il numero di esperienze realizzabili nell'esperimento, n il numero di cellule diverse uti lizzate, c il numero di composti diversi impiegati, p la posologia dei composti.

Metodi di veicolamento delle sostanze

Le modalità di veicolamento delle sostanze da som ministrare alle cellule sottoposte alla sperimentazione dipendono, in primis, dalle considerazioni su dove essa debba agire cioè se debba entrare nella cellula oppure possa interagire con qualche recettore esterno alla cellula e, poi, dalle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza da testare.

Per sostanze che devono entrare nella cellula Qualora si preveda che la sostanza debba essere introdotta all'interno della cellula per svolgere la sua ipotetica attività, i metodi di veicolamento cam bieranno drasticamente a seconda delle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza:

• Sostanze che NON necessitano di essere microincapsu late

Si tratta di tutte quelle sostanze naturalmente in grado di attraversare i confini cellulari (membrana ed eventuale parete) cioè generalmente di sostanze apolari che generalmente formano una fase separata nelle soluzioni acquose (fanno eccezione alcune sostanze polari che sono importate spontaneamente dalla cellula tramite proteine trasportatrici di membrana). Per molte di que ste sostanze apolari è sufficiente produrre delle emul sioni, secondo arte nota, in cui il diametro delle sfe rette della sostanza emulsionata siano compatibili con le dimensioni delle gabbie dielettroforetiche che devo no muoverle. Altre (es. gli acidi retinoici) sono vei colate tramite un liposoma, intercalate ai fosfolipidi, come costituenti dello strato lipidico del liposoma. • Sostanze che necessitano di essere microincapsulate Rientrano in questa categoria tutte le sostanze polari che devono entrare nella cellula per svolgere la loro azione ma che entrano in soluzione nelle soluzioni acquose (inclusi gli acidi nucleici). Per farle entrare all'interno della cellula sarà necessario microincapsularle ad esempio in un doppio strato fosfolipidico (li posoma) . Il liposoma, fondendosi con la parete cellula re della cellula bersaglio, può riversare il suo conte nuto all'interno del citoplasma. E<' >possibile utilizza re anche particolari microsfere impregnate della so stanza d'interesse che sono internalizzate dalla CellU la .

Alternativamente, come ad es. nel caso di acidi nucleici, si possono utilizzare come vettori dei virus, opportunamente modificati geneticamente secondo arte nota. Benché i virus siano di dimensioni notevolmente inferiori rispetto alle cellule, rientra nell'arte nota la possibilità di movimentarli tramite dielettroforesi.

Per sostanze che non devono entrare nella cellula Si tratta di tutte quelle sostanze che agiscono secondo un meccanismo di recettore-ligando. Qualora non si tratti di piccole molecole solubili nel tampone uti lizzato, bisogna veicolarle tramite l'ausilio di micro sfere, si procede cioè ricoprendo con queste sostanze delle microsfere di materiali opportuni. Alcuni tipi di molecole possono anche essere veicolate sulla superfi cie di liposomi. Infine, altre cellule possono fungere esse stesse da veicolo per il ligando.

Strategie di ordinamento delle cellule e dei composti Prerequisito necessario alla realizzazione degli esperimenti descritti in questo metodo è la capacità di conoscere la posizione e il tipo di ogni cellula e/o composto utilizzati.

Le strategie di ordinamento delle cellule e dei composti ricadono essenzialmente in due categorie:

• Introduzione sequenziale

Una possibilità è data dall'introduzione in se quenza delle cellule e/o dei composti nel dispositivo. Un esempio dell'ordinamento sequenziale di cellule è illustrato in figura 3. In questo caso il tipo cellula re è ovviamente già noto, ed è sufficiente disporre di sensori di presenza in corrispondenza di almeno una cella del dispositivo. Le gabbie che transitano su que sta cella possono essere caratterizzate in base alla presenza/assenza della particella. Nel caso di presen za, la particella viene disposta nella schiera, altri menti si può annullare la gabbia e procedere con la successiva. E' possibile utilizzare a tal fine sensori esterni come telecamere collegate ad un microscopio op pure realizzare sullo stesso substrato Al sia gli ele menti di attuazione, in grado di manipolare le parti celle biologiche, che i dispositivi di rilevamento del le stesse. Questi sensori possono essere di tipo capa citivo od ottico. Una volta introdotti attraverso l'ap posita apertura (Il in figura 3) nella camera del di spositivo in cui è presente flusso (F in figura 3), gli elementi biologici (particelle) vengono posizionati or dinatamente (R2 in figura 3) nella camera senza flusso (FL in figura 3), dove posso essere già presenti anche altri tipi cellulari, introdotti e ordinati in prece denza (RI in figura 3), che faranno parte dello stesso esperimento. Se invece ogni casella è dotata di sensore di presenza le cose si semplificano. Si individuano im mediatamente le gabbie contenenti particelle biologiche nella camera F in cui è stata introdotta la nuova spe cie e si spostano nella camera FL nella posizione desi derata.

Le particelle in eccesso possono essere rimosse immettendo ulteriore liquido, tramite l'apertura (Il in figura 3) d'ingresso della camera d'immissione, e fa cendole fluire al di fuori del dispositivo assieme al liquido in eccesso, attraverso l'apertura 01 d'uscita della camera d'immissione.

• Discriminazione nel dispositivo

Con sensori adatti ad individuare il tipo di cel-lula o di sostanza

Anziché introdurre le cellule o i composti ordina tamente in maniera sequenziale, è possibile, avendo sensori che siano in grado di riconoscere non solo la presenza ma anche il tipo di cellula o composto even tualmente presente in una gabbia, disporre automaticamente le cellule anche partendo da un miscuglio (come riportato nel brevetto PCT/WO 00/69565). Ancora una volta questo può essere effettuato con l'ausilio di sensori esterni o integrati nel dispositivo (ottici o capacitivi). Un esempio di questa modalità è riportato in figura 4. In questo caso le particelle biologiche sono introdotte attraverso l'apposita apertura II nella camera F del dispositivo grazie ad un temporaneo flusso. Qui sono identificate dai sensori di tipo di cellu la. Sulla base della tipologia, ogni singola particella viene ordinata insieme con le altre del suo genere (RI e R2 in figura 4) nella camera senza flusso FL. I sen sori adatti a riconoscere il tipo di cellula possono essere posti sotto ogni cella o al limite anche solo sotto una sola cella. Nell'ultimo caso, conviene che tale cella sia in prossimità all'apertura D fra le due camere dove le gabbie devono in ogni caso passare.

Nel caso della variante del metodo che utilizza microsfere funzionalizzate, il problema dell'ordinamento e, soprattutto, dell'identificazione delle particelle che prendono parte a test è in parte facilitato dalle caratteristiche delle microsfere. Una volta generato e/o mantenuto l'ordinamento desiderato di cellule, utilizzando una delle strategie descritte, si può semplicemente introdurre una miscela di micro sfere funzionalizzate con anticorpi diversi all'interno del dispositivo senza dover ricorrere all'introduzione sequenziale. E' sufficiente che esse presentino coppie omogenee di caratteristiche fisiche e immunologiche cioè che ad ogni tipo specifico di anticorpo corrispon dano caratteristiche diverse della particella che li veicola. Un esempio è riportato in Tabella 1: tre anticorpi (mAb specifici) per tre antigeni diversi di tre organismi diversi ricoprono tre tipi di particelle, che differiscono una volta per colore e una volta per costante dielettrica.

Tabella l.Esempio di accoppiamento fra caratteristiche fisiche e immunologiche di microsfere fimzionalizzate. Le caratteristiche antigeniche possono venire associate a diverse caratteristiche fisiche della microsfera.

Per aumentare il numero di particelle si può ricorrere anche a combinazioni delle caratteristiche fisiche. Un esempio è illustrato in tabella 2.

Tabella 2. Esempio di accoppiamento fra combinazioni di caratteristiche fisiche e caratteristiche

immunologiche di microsfere funzionalizzate.

Oltre al colore, altre caratteristiche quali la riflettanza e l'eventuale fluorescenza possono venire sempli cemente rilevati con l'ausilio di un opportuno sensore esterno. La trasparenza e la differente costante di elettrica possono essere rilevate con un sensore inte grato rispettivamente di tipo ottico e capacitivo.

Allo stesso modo, i complessi formati dall'interazione antigene anticorpo fra la cellula e le sferette, sem plicemente individuati sulla corrispondenza delle ca ratteristiche fisiche delle microsfere con quelle immu nologiche, possono a questo punto venire ulteriormente processati come descritto successivamente nel metodo. La discriminazione per caratteristica fisica, in parti colare facendo uso della fluorescenza, può essere usata non soltanto per identificare particelle costituite da microsfere funzionalizzate, ma anche da liposomi por tanti all'interno od in superficie composti prefissati.

Con attuazione selettiva

E’ possibile sfruttare il diverso comportamento delle particelle nel dispositivo al variare delle frequenze dei campi elettrici applicati. Al variare della frequenza le cellule, infatti, possono subire un cambiamento della direzione e/o dell'intensità della forza di dielettroforesi netta che le spinqe verso re gioni del dispositivo in cui l'intensità del campo è decrescente (nDEP) oppure verso regioni in cui è cre scente (pDEP). Cellule diverse hanno curve di transi zione differenti in base alle loro proprietà dielettri che e conduttive (si parla propriamente di "firme spet trali"). In pratica è possibile utilizzare questo feno meno per ingabbiare e spostare selettivamente (come ri portato nel brevetto PCT/WO 00/69565) una sola specie cellulare e dunque separare varie specie da un miscu glio di organismi. In questo caso, conoscendo come mi greranno le cellule alla frequenza scelta e disponendo di sensori che siano in grado di riconoscere la presen za della cellula, si introduce nella camera del dispo sitivo una miscela di organismi che verranno separati direttamente nel dispositivo. Ancora un volta i sensori di presenza della cellula possono essere esterni o integrati nel dispositivo (ottici o capacitivi).

Durante tutte queste operazioni, l'informazione proveniente dai sensori permette di modificare il con trollo e le operazioni da eseguire in base allo stato del sistema e variare la programmazione del dispositi vo. E' inoltre possibile una rappresentazione virtuale (ad esempio di tipo grafico) dello stato del sistema al fine di ottimizzare l'interfacciamento del dispositivo con l'utente nelle operazioni di programmazione e di analisi dei risultati.

Esecuzione degli esperimenti

Esperimenti con liposomi, virus o con sostanze emulsio natili nel tampone utilizzato

In pratica questo genere di esperienze consiste nel generare o al limite mantenere un ordinamento di cellule (o composti) e farli interagire con i composti (o cellule) da saggiare. Ciò viene effettuato semplicemente facendo fondere le gabbie di potenziale dielettroforetico che contengono/muovono le cellule e i com posti. Nel caso di composti apolari microemulsionati (es. steroidi o trigliceridi) essi attraversano sponta neamente i confini cellulari per andare a esplicare eventualmente la loro azione all'interno della cellula. Nel caso di composti microincapsulati in liposomi, la vescicola fosfolipidica si fonde con la membrana cellulare rilasciando il composto all'interno della cellula dove svolgerà eventualmente la sua azione. Nel caso dell 'utilizzo di vettori virali geneticamente modifica ti, il gene della sostanza da testare viene inserito, come da arte nota, nel DNA del virus. Il virus, tramite i suoi meccanismi peculiari, introdurrà il materiale genetico all'interno della cellula dove verrà eventual mente espresso e svolgerà la sua azione.

Esperimenti con sfere funzionalizzate con anticorpi L'utilizzo di microsfere funzionalizzate con anticorpi si riscontra in tutti i casi sia necessario discriminare una cellula sulla base di molecole carat teristiche (antigeni) esposte sulla sua superficie cel lulare (parete o membrana che sia). E' il caso delle applicazioni diagnostiche e di quelle volte alla sepa razione di popolazioni particolari di cellule da altre altrimenti non discriminabili.

Sfere funzionalizzate con anticorpi possono venire veicolate tramite una gabbia di potenziale dielettroforetico fino alla cellula e poste in contatto con essa semplicemente facendo fondere la gabbia che contiene la particella con quella che contiene la cellula. Fra le caratteristiche peculiari del metodo dell'invenzione spicca la possibilità di effettuare un controllo del l'affinità del legame dell'anticorpo all'antigene individuato (binding check).

E' possibile cercare di staccare le cellule dalle microsfere funzionalizzate, e dunque effettuare un va lido controllo della bontà del legame fra antigene an ticorpo, adottando una delle seguenti strategie:

□ Variazione dell'intensità del campo elettrico A frequenza costante, con la cellula e le micro sfere entrambe soggette a nDEP si può controllare l'intensità della forza di legame fra 1'anticorpo che riveste la sfera e l'antigene presente sulla superficie della particella biologica verificando la resistenza alla separazione del complesso antigene-anticorpo quan do le due particelle vengono attratte in due gabbie di forza distinte variando l'intensità del V(Erms)% cioè l'intensità della forza di dielettroforesi, che è :

cioè proporzionale a V(Erms)<2>. Dunque aumentando le tensioni agli elettrodi, cioè aumentando l'ampiezza della tensione applicata tra gli elettrodi, è possibile aumentare anche l'intensità della forza di dielettrofo resi che attrae le due particelle in gabbie distinte.

□ Variazione della frequenza del campo elettrico La risposta in frequenza della forza di dielettro foresi (Re[fon]in figura 5) è in genere differente fra microsfere e cellule. Variando la frequenza si agisce infatti sul fattore fcm(co) della forza. Ciò ha poco ef fetto per le microsfere (BEAD in figura 5) per le quali la forza di dielettroforesi sì mantiene sostanzialmente costante in negativo (nDEP). In pratica continua ad at tirarle al centro delle gabbie di potenziale dielettroforetico. Per le cellule (BIO in figura 5) invece la forza di dielettroforesi varia passando da negativa a positiva al variare della frequenza tra gli elettrodi. L'effetto pratico è che le cellule tendono ad essere attirate dal centro delle gabbie verso gli elettrodi dove sì trovano i massimi del campo elettrico.

□ Variazione in contemporanea della frequenza e dell'intensità del campo elettrico

E' possìbile anche un controllo del macthing del legame fra 1'antigene e 1'anticorpo basato su entrambi i fenomeni, agendo sia sulla frequenza del campo elet trico, cioè sul segno della forza (nDEP o pDEP), sia sull'intensità del campo elettrico, cioè sul modulo del campo di forza di dielettroforesi.

Esempi di controllo della specificità del legame anti-gene- anticorpo

Le situazioni che si presentano dipendono in larga misura dalle dimensioni delle microsfere, dalla preva lenza della forza di dielettroforesi positiva o negati va, dal legame o meno fra antigene e anticorpo:

• Separazione mediante l'uso di sola nDEP

Il seguente metodo è particolarmente adatto al caso in cui le sfere sono di dimensioni paragonabili alla particella BIO e alle dimensioni della gabbia.

Match (descritto in figura 6a)

Nella fase iniziale (tempo TI in figura 6a) la cellula BIO e la microsfera funzionalizzata BEAD occu pano due gabbie adiacenti. Le gabbie sono schematizzate con una linea tratteggiata (SI in figura 6) che indivi dua la porzione dello spazio in cui viene esercitata una forza di dielettroforesi significativa. Successiva mente viene generata una gabbia più grande in cui ven gono fatte convergere entrambe (tempo T2 in figura 6a) che a questo punto entrano in contatto fisico. Nel caso di match, gli anticorpi presenti sulla microsfera rico noscono il loro antigene specifico e vi si legano. Al termine vengono ricostituite le gabbie di partenza ma la microsfera rimane vincolata alla cellula in virtù del legame antigene-anticorpo e finisce per condivider ne la stessa gabbia (tempo T3 in figura 6a)

No Match (descritto in figura 6b)

Nella fase iniziale (tempo TI in figura 6b) la cellula e la microsfera funzionalizzata occupano due gabbie adiacenti. Viene generata una gabbia più grande in cui vengono fatte convergere entrambe (tempo T2 in figura 6b) che a questo punto entrano in contatto fisi co. Tuttavia nel caso in cui non si ha match gli anticorpi presenti sulla microsfera non riconoscono al cun antigene specifico e perciò non vi si legano. Al termine vengono ricostituite le gabbie di partenza e la microsfera e la cellula tornano nelle loro gabbie (tem po T3 in figura 6b)

• Separazione mediante l'uso di nDEP e pDEP

Il seguente metodo è adatto sia la caso in cui le sfere sono di dimensioni inferiori alla particella BIO sia la caso in cui le particelle sono di dimensioni pa ragonabili a quelle della particella BIO

Match/forza positiva prevalente sul complesso microsfere-cellula

Nella fase iniziale (tempo Tl/ Match&prevailing pDEP in figura 7a) la cellula BIO e alcune microsfere funzionalizzate BEAD occupano due gabbie adiacenti. Le gabbie vengono fatte convergere modificando la polarità degli elettrodi presenti nella matrice o schiera MI (figura 7a). Le sferette (tempo T2/ Match&prevailing pDEP in figura la) a questo punto entrano in contatto fisico con la cellula disponendosi sulla sua superfi cie. Nel caso in cui si ha match gli anticorpi presenti sulla microsfere riconoscono il loro antigeni specifici e vi si legano. Viene effettuato successivamente un cambiamento della frequenza, che assoggetta la cellula alla forza di dielettroforesi positiva e che ha come effetto quello di fare cadere il complesso cellulamicrosfere in un massimo di potenziale ovvero fra gli elettrodi (tempo T3/ Match&prevailing pDEP in figura 7a) . Si muovono le gabbie per cercare di separare la cellula dalle sferette ma queste continuano a restare adese alla cellula per effetto del legame antigene an ticorpo (tempo T4/ Match&prevailing pDEP in figura 7a). Al termine la situazione viene rilevata individuando la presenza di particelle presso l'elettrodo L100 e l'assenza di particelle presso L200 (tempo T5/ Match&prevailing pDEP in figura 7a). Ciò può avvenire grazie a sensori ottici (integrati o meno) o capaciti vi .

Match/forza negativa prevalente sul complesso microsfere-cellula

La situazione nelle fasi iniziale (tempi T1-T3 in figura 7b) è uguale a quella descritta precedentemente: la cellula e alcune microsfere funzionalizzate occupano due gabbie adiacenti (tempo Tl/ Match&prevailing nDEP in figura 7b). Anche qui le gabbie vengono fatte con vergere modificando la polarità degli elettrodi presen ti nella schiera e le microsfere (tempo T2/ Match&prevailing nDEP in figura 7b) entrano in contatto fisico con la cellula disponendosi sulla sua superfi cie. Siamo in un caso di match e dunque gli anticorpi presenti sulle microsfere riconoscono i loro antigeni specifici e vi si legano. Viene effettuato successiva mente un cambiamento della frequenza, che assoggetta la cellula alla forza di dielettroforesi positiva, ma per via dell'effetto prevalente di nDEP sulle microsfere, tuttavia, il complesso cellula-microsf ere si mantiene in levitazione (tempo T3/ Match&prevailing nDEP in fi gura 7b). Sì muovono ulteriormente le gabbie per cerca re di separare la cellula dalle sferette ma le cellule continuano a restare adese alle sferette per effetto del legame antigene-anticorpo (tempo T4/ Match&prevailing nDEP in figura 7b) e dunque il com plesso si muove unitariamente nella stessa gabbia al variare della polarità degli elettrodi. Al termine la situazione viene rilevata individuando l'assenza di particella nei pressi dell'elettrodo L100 e la presenza di particelle nei pressi di L200 (tempo T5/ Match&prevailing pDEP in figura 7b).

No Match

Nella fase iniziale (tempo Tl/ No Match in figura 7c) la cellula e alcune microsfere funzionalizzate oc cupano due gabbie adiacenti. Le gabbie vengono fatte convergere modificando la polarità degli elettrodi presenti nella schiera. La cellula e le microsfere (tempo T2/ No Match in figura 7c) a questo punto entrano in contatto fisico con la cellula disponendosi sulla sua superficie. In questo caso gli anticorpi presenti sulla microsfere non riconoscono alcun antigene specifico. Viene effettuato successivamente un cambiamento della frequenza, in seguito al quale le microsfere si manten gono in levitazione dentro una gabbia mentre la cellula cade fra gli elettrodi poiché è assoggettata a pDEP (tempo T3/ No Match in figura 7c). Si muovono ulterior mente le gabbie, la cellula continua a restare posizio nata fra gli elettrodi, mentre le microsfere si sposta no di gabbia in gabbia (tempo T4/ No Match in figura 7c). Al termine la situazione viene rilevata indivi duando la presenza di particelle nei pressi sia di L100 che di L200 (tempo T5/ No Match in figura le).

Osservazione della risposta della cellula

Una caratteristica dei metodi secondo la presente invenzione, oltre alla capacità di controllare ogni singola cellula per effettuare una molteplicità di esperimenti, consiste nella possibilità di analizzare direttamente la risposta fisiologica delle cellule, senza doverle recuperare dal manipolatore.

E' comunque possibile, grazie alle stesse caratte ristiche del dispositivo, recuperare le cellule di interesse senza particolari problemi qualora si desiderasse condurre su di esse ulteriori sperimentazioni. Una volta liberata la camera F del dispositivo da even tuali particelle residue con un flusso di tampone, si possono spostare le cellule di interesse dalla camera FL a quella F e poi portarle semplicemente fuori con un flusso di tampone.

Questo metodo permette in linea di principio di analizzare la risposta al composto di ogni singola cel lula mentre generalmente gli altri metodi sono in grado di analizzare solo la risposta media di una popolazione omogenea di cellule.

Gli effetti generati dal composto sono in prima approssimazione riconducibili a quattro tipi:

• Citostatico: un ritardo prodotto dal composto nei tempi di duplicazione cellulari.

• Citotossico: un'induzione da parte del composto di meccanismi di morte cellulare che portano infine al la lisi della cellula

• Mitotico: una stimolazione da parte del composto al la mitosi (duplicazione) cellulare ovvero una dimi nuzione dei tempi di generazione della cellula

• Complesso: una risposta fisiologica multifattoriale (induzione di secondi messaggeri, attivazione di uno o più geni, ecc.) i cui effetti possono non essere semplicemente osservabili, anche se infine possono ricadere in uno dei casi descritti precedentemente.

Gli effetti citotossico, citostatico e mitotico posso venire rilevati tramite l'ausilio di sensori ot tici esterni oppure tramite sensori integrati. Questi potrebbero essere di tipo capacitivo, cioè costituiti da un circuito capace di rilevare piccole differenze di capacità tra due elettrodi della matrice; la presen za/assenza della cellula, così come la sua eventuale lisi o duplicazione, modifica il valore di tale capaci tà permettendone non solo la rivelazione, ma anche la determinazione del numero di cellule. Si può anche uti lizzare un sensing di tipo ottico, in cui l'elemento discriminatore tra la presenza, l'assenza, la lisi o la duplicazione della particella è la quantità di fotoni che pervengono ad un sensore ottico posizionato al di sotto di una buca di potenziale. Se una cellula si trova intrappolata in una buca di potenziale, al di sotto della quale si trova un sensore ottico, la quantità di fotoni incidenti sul sensore sarà tanto inferiore quan to minore è la trasparenza della cellula rispetto al liquido in cui è sospesa.

Nel caso di effetto mitotico, una o più delle cel lule generate non riesce ad essere contenuta nella stessa gabbia della progenitrice e dunque cade in una adiacente, opportunamente lasciata libera, dove può ve nire rilevata dal sensore posto sotto a questa gabbia.

La figura 8 descrive quanto sopra esposto facendo riferimento ad uno schema del dispositivo e al relativo andamento spaziale del potenziale della forza di di elettroforesi, in istanti successivi.

Nel dettaglio: una cellula (BIO in figura 8) che ha, o non ha, appena ricevuto un composto si trova al l'interno di una gabbia (SI in Figura 8 indica una ge nerica gabbia di potenziale) ovvero di un minimo del campo dielettroforetico generato dal dispositivo (tempo TI in figura 8); per effetto del composto, o della sua mancata somministrazione, la cellula inizia a divider si. Fintanto che le due cellule sono ancora connesse esse non sfuggono alla gabbia (tempo T2 in figura 8); al termine della mitosi, le due cellule generate si troveranno transitoriamente fra due gabbie ovvero sui bordi di due buche di potenziale adiacenti verso le quali ricadono inesorabilmente (tempo T3 in figura 8); infine una volta che le cellule si sono divise, il si stema raggiunge un nuovo minimo di energia potenziale quando ciascuna cellula ha occupato una propria gabbia (tempo T4 in figura 8). Monitorando il numero di gabbie occupate è possibile, utilizzando il presente metodo, individuare l'avvenuta mitosi. In alternativa, si può immaginare un sensore capacitivo che produca una rispo sta analogica proporzionale al numero di cellule gene rate e tale dunque da permetterne un conteggio anche se le medesime si trovano all'interno di una stessa gab bia .

Per analizzare risposte fisiologiche cellulari di verse e complesse indotte da un composto, ovvero gli effetti non macroscopici o comunque non semplicemente identificabili, la modalità migliore consiste nell'uti lizzare cellule geneticamente modificate che contengano in un punto mirato delle vie metaboliche potenzialmente influenzabili dal composto un gene reporter ovvero un gene che esprime una proteina facilmente osservabile, tipicamente fluorescente, come ad esempio la green fluorescent protein (GFP), al posto del (o insieme a -ad esempio nel caso di una proteina di fusione) prodot to genico normale ma difficilmente visualizzabile. Si tratta di una tecnica ormai comune utilizzata da coloro che hanno ordinarie capacità nel settore biologico. In questo caso, i sensori di rilevazione potranno essere ovviamente soltanto di tipo ottico, integrati nel di spositivo oppure esterni.

La possibilità di analizzare risposte fisiologi che, complesse o meno, è facilitata dalla capacità di mantenere costante la temperatura desiderata all'interno del dispositivo, così come dalla possibilità di uti lizzare diversi tamponi che alle opportune caratteri stiche dielettroforetiche uniscono la presenza di so stanze metabolizzabili o meno da parte delle cellule e che dunque permettono la sopravvivenza in condizioni fisiologiche delle cellule all'interno del dispositivo per tutto il tempo necessario ad ottenere una risposta.

Applicazioni

Con sostanze veicolate o meno da liposomi

• Ricerca di base

La prima applicazione di questa metodica è ovvia mente la ricerca di base, dove la possibilità di con trollare interazioni a livello di singola cellula apre campi di sperimentazione totalmente nuovi, in particolare se il liposoma porta sulla sua superficie un ligando per un recettore. Si possono effettuare anche in terazioni liposoma-liposoma, utile nella ricerca di ba se: se un liposoma porta sulla sua superficie un ligando e l'altro il recettore e le altre proteine che me diano la risposta al segnale si può ricostruire un si stema minimo di segnalazione cellulare.

• Chimica combinatoria

Questo metodo trova utilizzo principalmente nel campo della chimica combinatoria dove è necessario sag giare librerie di composti che comprendono migliaia di sostanze, per il loro effetto su cellule di vario tipo cercando di limitare il più possibile sia il tempo che le quantità delle sostanze impiegate nel test. In que sto caso, il liposoma si fonde con la cellula e libera il suo contenuto all'interno del citoplasma. Si può inoltre produrre la fusione di due liposomi contenenti reagenti per ottenere un desiderato composto. Infine, effettuando interazione di liposomi con microsfere po rose è possibile veicolare molteplici liposomi all'interno dei pori delle microsfere

Con sostanze veicolate tramite microsfere

Fra le applicazioni del metodo che utilizza so stanze che funzionalizzano microsfere di vario genere, oltre a quelle possibili anche coi liposomi, ci sono inoltre:

• Diagnostica

Questo metodo può essere utilizzato in diagnostica per individuare un organismo in un campione biologico, utilizzando microsfere funzionalizzate con anticorpi, ad esempio monoclonali, contro un antigene specifico dell'organismo ricercato. I vantaggi principali di que sto metodo rispetto agli altri metodi immunologici sono soprattutto l'elevata specificità garantita dal con trollo del legame, la possibilità di utilizzare bassis sime quantità sia di anticorpo che di campione da saggiare, e, non ultima, l'elevata velocità di esecuzione del test garantita dalla semplicità e dal grado di au tomazione del metodo.

Una delle possibili modalità del test diagnostico sono descritte nella figura 9, che illustra schematica mente le modalità sia del test diagnostico, che del me todo per la separazione specifica di cellule (descritto successivamente) , essendo le fasi iniziali comuni ad entrambi i metodi. Nel dettaglio la metodica è genera lizzabile nella seguente maniera: il campione biologico contenente il tipo, o i tipi, cellulari desiderati vie ne mescolato con uno o eventualmente più tipi (qualora i tipi cellulari da individuare/recuperare fossero più d'uno) dì microsfere funzionalizzate con anticorpi spe cifici per il tipo o i tipi cellulari ricercati. I di versi tipi di microsfere devono essere identificabili facilmente sulla base delle loro caratteristiche fisi che. A questo punto la miscela viene introdotta in una delle camere del dispositivo.

In alternativa le microsfere possono essere intro dotte nel dispositivo separatamente dal campione, even tualmente in maniera sequenziale qualora non fosse pos sibile discriminare nel dispositivo i diversi tipi di microsfere .

Cellule e microsfere adiacenti che non fossero già venute in contatto durante la miscelazione vengono fat te contattare tramite una prima movimentazione dielettroforetica (figura 9a e 9b). Si procede successivamen te cercando di separare le cellule dalle microsfere (figura 9c). I complessi che non risultassero separabi li, denunciano un avvenuto legame fra gli anticorpi fissati alle microsfere e gli antigeni presenti sulle cellule, e vengono così identificati. Le cellule non legate vengono accoppiate con microsfere di tipo diver so da quelle con cui sono state già fatte contattare (figura 9d e 9e). L'operazione descritta viene ripetuta fino all'identificazione ed eventuale enumerazione di tutte le cellule di interesse.

Nel settore della diagnostica molecolare un'applicazione del metodo prevede l'utilizzo di microsfere, riconoscibili o perché note prima dell'introduzione nel dispositivo, oppure semplicemente identificabili nel dispositivo sulla base delle loro caratteristiche fisi che, opportunamente rivestite di DNA (o RNA) sonda da fare interagire tramite movimentazione dielettroforetica con altre rivestite di DNA (o RNA) bersaglio. Questa metodica può venire utilizzata per effettuare un test di ibridazione per omologia per identificare il DNA (o RNA) bersaglio, tutto senza l'utilizzo di materiale ra dioattivo o fluorescente nella sonda, come richiesto invece nelle metodiche standard. Inoltre la stringenza delle condizioni sperimentali può venire facilmente controllata, ed eventualmente variata, elettronicamente (cioè cercando di separare le microsfere) in tempo rea le, senza cioè dover ripetere l'intera procedura. Tutto ciò è particolarmente utile ad esempio nella ricerca degli SNP (single nucleotide polymorphisms = polimorfi smi di un singolo nucleotide) tipici di alcune gravi malattie.

• Separazione specifica di cellule

Una delle applicazioni più interessanti dell'invenzione consiste nella possibilità di utilizza re microsfere funzionalizzate con anticorpi per effet tuare la selezione di una sotto popolazione omogenea di cellule da una mistura eterogenea che la comprenda (celi sorting).

Le caratteristiche del metodo permettono infatti un elevata specificità nel riconoscimento che consente di discriminare cellule che differiscono anche di po chissimo e soprattutto di separarle e recuperarle sem plicemente dalle altre con scarsissimi rischi di conta minazione da parte della popolazione cellulare indesi derata. Tale applicazione è particolarmente interessan te nel settore medico dell'oncologia.

Nel dettaglio la metodica è generalizzabile nella seguente maniera: il campione biologico contenente il tipo, o i tipi, cellulari desiderati viene mescolato con uno o eventualmente più tipi (qualora i tipi cellu lari da recuperare fossero più d'uno) di microsfere funzionalizzate con anticorpi specifici per il tipo o i tipi cellulari ricercati. I diversi tipi di microsfere devono essere identificabili sulla base delle loro ca ratteristiche fisiche. A questo punto la miscela viene introdotta in una delle camere del dispositivo.

In alternativa le microsfere possono essere intro dotte nel dispositivo separatamente dal campione, even tualmente in maniera sequenziale qualora non fosse possibile discriminare nel dispositivo i diversi tipi di microsfere.

Cellule e microsfere adiacenti che non fossero già venute in contatto durante la miscelazione vengono fatte contattare tramite una prima movimentazione dielettroforetica (figura 9a e 9b). Si procede successivamen te cercando di separare le cellule dalle mìcrosfere (figura 9c). I complessi che non risultassero separabi li, che denunciano un avvenuto legame fra gli anticorpi fissati alle microsfere e gli antigeni presenti sulle cellule, vengono così identificati. Le cellule non le gate vengono fatte accoppiare con microsfere di tipo diverso da quelle con cui sono già state fatte contattare (figura 9d e 9e). L'operazione descritta viene ri petuta fino all'esaurimento delle cellule da identifi care. Le cellule ancora complessate con le microsfere vengono sequenzialmente spostate nell'altra camera del dispositivo in gruppi omogenei e recuperati tramite un flusso di tampone (figura 9f e 9g). Alternativamente i complessi stabili dello stesso tipo vengono spostati nella altra camera del dispositivo; qui applicando una forza di separazione sufficiente, ottenuta variando l'intensità del campo elettrico e/o la frequenza del campo elettrico tra selezionati elettrodi, le microsfe re vengono separate dalle cellule e riutilizzate immet tendole nuovamente nella prima camera del dispositivo. Le cellule vengono invece recuperate dal dispositivo tramite un flusso di tampone.

• Studio risposte complesse innescate da interazione recettore-ligando

In questo metodo con l'utilizzo delle microsfere (microbeads) è possibile studiare la risposta cellulare innescata dal legame di un ligando al suo recettore specifico. Le microsfere, infatti, possono anche essere funzionalizzate con sostanze, diverse dagli anticorpi, che, pur legandosi anch'esse (più o meno transitoria mente) ad un recettore innescano risposte fisiologiche nella cellula. Moltissime risposte cellulari, infatti, sono mediate da interazioni di questo tipo in cui una sostanza che funge da messaggero, ma che non può entra re nella cellula, incontra un recettore specifico che trasmette il segnale attraverso i confini cellulari, senza necessariamente introdurre anche la sostanza. I messaggeri generalmente provocano una cascata di infor mazione che infine produce uno dei quattro effetti de scritti precedentemente: citostatico, citotossico, mitotico e complesso.

La possibilità di funzìonalizzare microsfere con il genere di sostanze descritto consente dunque di espandere la gamma di fenomeni studiabili con il metodo proposto a tutte quelle sostanze e sono la maggior par te, che non possono, o non devono, permeare i confini cellulari, ma ciononostante possono avere importanti ripercussioni sulla fisiologia cellulare.

Infine, microsfere funzionalizzate possono essere utilizzate nella ricerca di base, ad esempio facendole interagire con liposomi: se una microsfera porta sulla sua superficie un ligando e un liposoma il recettore e le altre proteine che mediano la risposta al segnale si può ricostruire un sistema minimo di segnalazione cel lulare. E' anche possibile utilizzare microsfere come vettori di introduzione di compositi o unità di compo sto in cellule o in un ambiente compartimentato, ad esempio isolato all'interno di un liposoma; infatti una microsfera funzionalizzata può venire internalizzata da una cellula con cui viene portata in contatto; lo stes so fenomeno è possibile con un liposoma.

Nel caso in cui l'obiettivo sia di introdurre un composto o unità di composto in una cellula (o liposo ma) questo composto o unità di composto potrà essere portata direttamente da una microsfera, liposoma o, al limite, in superficie da un'altra cellula, oppure con tenuto in un vettore (ad esempio un virus se il compo sto è un frammento di DNA/RNA) atto a penetrare all'interno di una cellula o liposoma una volta portato in contatto fisico con gli stessi, ed il vettore potrà essere eventualmente portato a sua volta da cellule e/o microsfere e/o liposomi.

Claims

R IV E N D I CA Z IO N I 1. Metodo per effettuare test e saggi ad alta processività ed alto valore biologico su un campione inclu dente materiale chimico-biologico costituito da entità incognite, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi: (a)- introdurre detto campione includente dette entità incognite in una prima camera di un dispositivo di test comprendente almeno una matrice di primi elettrodi se lettivamente indirizzabili ed attivabili ed almeno un secondo elettrodo affacciato ai primi; (b)- introdurre nella prima camera di detto dispositivo di test materiale chimico-biologico costituito da entità note, identificabili all'interno del detto dispositivo di test ed aventi una affinità presunta verso le entità incognite; (c)- generare selettivamente all'interno di detta prima camera gabbie mobili chiuse del potenziale per la forza di dielettroforesi tramite detti elettrodi affacciati ed intrappolare almeno una parte di dette entità all'interno di dette gabbie mobili; (d)- muovere relativamente almeno una di dette gabbie mobili contenenti le entità note verso dette gabbie mo bili contenenti le entità incognite e fare interagire almeno una entità incognita con almeno una entità nota di almeno un primo tipo producendo la congiunzione di almeno una coppia di gabbie mobili che le contengono; (e)- verificare la creazione o meno di un legame stabi le tra detta almeno una entità incognita e la detta al meno una entità nota del primo tipo, per determinare l'esistenza di una affinità tra le stesse e di conse guenza identificare detta almeno una entità incognita.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che vengono introdotte nella prima camera del detto dispositivo di test entità note ed identificabili all'interno del dispositivo di una pluralità di tipi diversi; per ciascuna detta entità incognita non legata stabilmente ad una entità nota del primo tipo, sì ripe tono le fasi (d) ed (e) facendo interagire selettiva mente con ciascuna entità incognita, non legata ad una entità nota, una entità nota di un tipo diverso dal primo, fino ad esaurimento di tutti i tipi di entità note presenti.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratte rizzato dal fatto che prima di eseguire la fase (d), viene eseguita una fase di identificazione delle dette gabbie mobili contenenti le entità incognite.
4. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detta fase di identificazione viene ese guita mediante sensori interni o esterni a detto dÌSpOsitivo di test, o direttamente su dette entità incogni te prima della introduzione in detto dispositivo di test .
5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dette entità note sono costituite da unità di composto costituite da microsfere o liposomi portanti un composto scelto nel gruppo consistente in: almeno un antìcorpo per un anti gene specifico, almeno un ligando per un recettore spe cifico, almeno una sonda di DNA o RNA, e loro combina zioni .
6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che le dette enti tà note vengono introdotte nella prima camera del di spositivo di test insieme con dette entità incognite.
7. Metodo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che viene creata una miscela tra le dette en tità note e le dette entità incognite al di fuori di detta prima camera e detta miscela viene successivamen te introdotta nella prima camera.
8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, caratterizzato dal fatto che le dette entità note e le dette entità incognite vengono introdotte nella prima camera separatamente, in modo sequenziale.
9. Metodo secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che le dette entità note vengono identificate all'interno del dispositivo di test spostando le gabbie mobili in cui sono state intrappolate in posizioni pre fissate corrispondenti a prefissati primi elettrodi di detta matrice di elettrodi e memorizzando tali posizio ni.
10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 8, caratterizzato dal fatto che le dette entità note vengono identificate all'interno del dispositivo di test in base ad almeno una propria caratteristica fisica rilevabile tramite un sensore, interno od ester no a detto dispositivo.
11. Metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detta almeno una propria caratteristica fisica è scelta nel gruppo consistente in: colore, fluorescenza, costante dielettrica; loro combinazioni.
12. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre la fase di contare il numero di entità incogni te identificate in quanto legate stabilmente a dette entità note.
13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che comprende ul teriormente le fasi di: - spostare tramite dette gabbie mobili solo entità incognite legate stabilmente ad entità note di un singolo tipo omogeneo, e di conseguenza identificate di un solo tipo omogeneo, in una seconda camera di detto disposi tivo comunicante idraulicamente con la prima attraverso una restrizione; - flussare all'esterno del dispositivo le entità pre senti in detta seconda camera; - ripetere le fasi precedenti con tutti gli altri tipi omogenei di entità incognite identificate, in sequenza.
14. Metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizza to dal fatto che prima di detta fase di flussaggio vie ne eseguita in detta seconda camera una fase di separa zione tra le entità incognite identificate e le entità note di un sìngolo tipo omogeneo ad esse legate stabil mente; dette entità note, una volta separate, venendo riportate nella prima camera tramite dette gabbie mobili.
15. Metodo secondo la rivendicazione 14, caratterizza to dal fatto che detta fase di separazione viene effet tuata mediante la forza di dielettroforesi, variando uno dei seguenti parametri di funzionamento del dispo sitivo di test: intensità del campo elettrico tra sele zionati elettrodi; frequenza del campo elettrico tra selezionati elettrodi; combinazione dei precedenti.
16. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta fase (e) viene effettuata ricostruendo la coppia di gabbie mobi li precedentemente congiunte e verificando tramite sen sori interni od esterni al dispositivo di test la presenza di dette entità in entrambe o in una soltanto di detta coppia di gabbie mobili.
17. Metodo secondo la rivendicazione 16, caratterizza to dal fatto che vengono usati sensori di tipo ottico o capacitivo .
18. Metodo secondo la rivendicazione 16 o 17, caratte rizzato dal fatto che viene eseguita inoltre una fase di controllo della forza del legame stabile tra detta almeno una entità incognita e detta almeno una entità nota; detta fase di controllo venendo eseguita variando un parametro di funzionamento del dispositivo di test scelto nel gruppo consistente in: ampiezza della ten sione tra selezionati elettrodi; frequenza della ten sione tra selezionati elettrodi; combinazione dei pre cedenti .
19. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dette entità incognite sono scelte nel gruppo consistente in: cellu le, virus, microrganismi, unità di composto costituite da cellule e/o microsfere e/o liposomi portanti DNA e/o RNA bersaglio, per effettuare test di ibridazione.
20. Metodo per effettuare test e saggi ad alta processività ed alto valore biologico tra: una pluralità di prime entità scelte nel gruppo consistente in cellule e microorganismi; ed una pluralità di seconde entità co stituite da composti o unità di composto da testare per la loro attività biologica verso dette prime entità; caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fa si : (a)- introdurre dette prime e seconde entità in una prima camera di un dispositivo di test comprendente al meno una matrice di primi elettrodi selettivamente indirizzabili ed attivabili ed almeno un secondo elettro do affacciato ai primi; (b)- generare selettivamente all'interno di detta prima camera gabbie mobili chiuse del potenziale per la forza di dielettroforesi tramite detti elettrodi affacciati ed intrappolare almeno una parte di dette entità all'interno di dette gabbie mobili; (c)- muovere relativamente almeno una di dette gabbie mobili contenenti le prime entità verso dette gabbie mobili contenenti le seconde entità e fare interagire almeno una prima entità con almeno una seconda entità di almeno un primo tipo producendo la congiunzione di almeno una coppia di gabbie mobili che le contengono; (d)- verificare l'attività biologica della seconda entità sulla prima entità tramite l'analisi della inter azione avvenuta con l'utilizzo di sensori in grado di rilevare a carico della prima entità il verificarsi di almeno un effetto scelto nel gruppo consistente in: ci tostatico, citotossico, mitotico, espressione di un marcatore.
21. Metodo secondo la rivendicazione 20, caratterizza to dal fatto che detti effetto citostatico, citotossi co, mitotico vengono rilevati tramite la verifica della presenza e/o la variazione di presenza di dette prime entità nelle gabbie mobili che le contengono e/o in corrispondenza di una pluralità di primi elettrodi disposti immediatamente adiacenti a dette gabbie mobili che contengono le prime entità e che prima della esecuzione di detta fase (c) sono stati lasciati liberi o sono occupati da gabbie mobili vuote.
22. Metodo secondo la rivendicazione 20 o 21, caratte rizzato dal fatto che detti sensori sono scelti nel gruppo consistente in: sensori ottici, disposti inter namente od esternamente a detto dispositivo di test, sensori capacitivi, loro combinazioni.
23. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 20 a 22, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre una fase di riconoscimento di almeno una pluralità di enti tà scelta nel gruppo consistente in dette prime entità e dette seconde entità.
24. Metodo secondo la rivendicazione 23, caratterizza to dal fatto che detta fase di riconoscimento avviene o prima o dopo l'introduzione di dette entità nel dispo sitivo di test.
25. Metodo secondo la rivendicazione 24, caratterizza to dal fatto che detto riconoscimento avviene per mezzo di sensori scelti nel gruppo consistente in: sensori di tipo ottico interni od esterni al dispositivo, sensori di tipo capacitivo.
26. Metodo secondo la rivendicazione 25, in cui detto riconoscimento avviene all'interno di detto dispositivo sulla base della risposta delle entità di detta almeno una pluralità di entità alla forza di dielettroforesì esercitata all'interno del dispositivo.
27. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 23 a 26, caratterizzato dal fatto che prima di eseguire le fasi (c) e (d) viene stabilita all'interno del disposi tivo, tramite dette gabbie mobili, una distribuzione spaziale prefissata di detta almeno una pluralità di entità, di almeno un tipo identificato.
28. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 20 a 27, caratterizzato dal fatto che le gabbie mo bili in cui è intrappolata detta pluralità di prime en tità contengono ciascuna almeno una singola detta prima entità .
29. Metodo secondo la rivendicazione 28, in cui almeno una parte di dette prime entità è contenuta in una gab bia mobile di potenziale di dielettroforesi cui è asso ciato almeno un sensore in grado di generare un segnale proporzionale al numero di prime entità presenti nella gabbia .
30. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 20 a 29, caratterizzato dal fatto che detto marcato re è una molecola reporter espressa all'interno di det ta prima entità.
31. Metodo secondo la rivendicazione 30, in cui dette unità di composto sono scelte nel gruppo consistente in: microsfere, liposomi, cellule portanti un composto atto ad attivare l'espressione di detta molecola repor ter .
32. Metodo secondo la rivendicazione 31, in cui detto composto viene introdotto all'interno di detta prima entità durante la fase di interazione.
33. Metodo secondo la rivendicazione 31, in cui detto composto attiva l'espressione di detta molecola repor ter tramite un meccanismo di interazione del tipo ligando-recettore .
34. Dispositivo (DE) di test multifunzionale, compren dente un primo modulo (C) comprendente una matrice (MI) di primi elettrodi (LIJ) almeno in parte singolarmente e selettivamente indirìzzabili ed attivabili, disposti su di un supporto isolante (Al); un secondo modulo com prendente almeno un secondo elettrodo (M2) disposto af facciato ai primi elettrodi (LIJ) ed una struttura di supporto superiore (A2); ed un elemento distanziatore (A3) disposto tra il primo ed il secondo modulo e deli mitante in uso un ambiente liquido o semiliquido (L); caratterizzato dal fatto che detto elemento distanzia tore (A3) è conformato in modo tale da definire all'interno del dispositivo almeno una prima camera (F) ed almeno una seconda camera (FL) collegate tra loro idraulicamente da almeno una restrizione (D) e delimitanti detto ambiente (L), che risulta così suddiviso da detta almeno una restrizione (D) in almeno due ambienti parziali idraulicamente non interferenti tra loro defi niti da dette almeno due camere (F e FL).
35. Dispositivo secondo la rivendicazione 34, caratte rizzato dal fatto che ciascuna detta camera (F ed FL) è dotata di orifizi o opercoli ad apertura selettiva e comandata, di immissione (11,12) ed estrazione (01,02); detta matrice (MI) di primi elettrodi (LIJ) costituendo il fondo di dette camere (F e FL) e di detta almeno una restrizione di comunicazione (D) tra le stesse.
36. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni 34 o 35, caratterizzato dal fatto che detta matrice (MI) di primi elettrodi (LIJ) è atta a generare insieme a detto secondo elettrodo una pluralità di gabbie dielettroforetiche (SI) adibite alla manipolazione di un campione biologico (BIO).
37. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 34 a 36, caratterizzato dal fatto che detto primo modulo (C) è provvisto di almeno un sensore integrato al di sotto o in prossimità di almeno uno di detti primi elettrodi .
38. Dispositivo secondo la rivendicazione 37, in cui detto almeno un sensore è disposto in corrispondenza di detta almeno una restrizione (D).
39. Dispositivo secondo la rivendicazione 37 o 38, ca ratterizzato dal fatto che detto almeno un sensore è di tipo ottico o capacitivo.
40. Metodo per la veicolazione di prime entità costi tuite da composti o unità di composto all'interno di seconde entità, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi: (a)- introdurre dette prime e seconde entità in una ca mera di un dispositivo di test comprendente almeno una matrice di primi elettrodi selettivamente indirizzabili ed attivabili ed almeno un secondo elettrodo affacciato ai primi; (b)- generare selettivamente all'interno di detta came ra gabbie mobili chiuse del potenziale per la forza di dielettroforesi tramite detti elettrodi affacciati ed intrappolare almeno una parte di dette entità all'interno di dette gabbie mobili; (c)- riconoscere e selezionare le gabbie contenenti prime entità; (d)- muovere relativamente almeno una di dette gabbie mobili contenenti le prime entità verso dette gabbie mobili contenenti le seconde entità; (e)- produrre la congiunzione di almeno una gabbia mo bile contenente una prima entità con una gabbia mobile contenente una seconda entità.
41. Metodo secondo la rivendicazione 40, caratterizza to dal fatto che dette seconde entità sono scelte nel gruppo consistente in: cellule, microorganismi, liposomi, microsfere e simili; e sono imprigionate in gabbie mobili .
42. Metodo secondo la rivendicazione 41, caratterizza to dal fatto che dette seconde entità, quando sono scelte nel gruppo consistente in cellule e microorgani smi, sono immobilizzate su rispettive microsfere e/o portate in superficie o all'interno di liposomi.
43. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 40 a 42, caratterizzato dal fatto che detti composti od unità di composto costituenti dette prime entità sono portati direttamente da cellule e/o microsfere e/o liposomi, oppure da vettori atti a penetrare all'interno di dette seconde entità una volta portati in contatto fi-sico con le stesse, detti vettori essendo eventualmente portati a loro volta da cellule e/o microsfere e/o liposomi .