ES2284984T3 - Metodo para prevenir y tratar imnfecciones por flavivirus en animales. - Google Patents
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Abstract
Uso de un flavivirus quimérico en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar infecciones por flavivirus en un caballo en el que el flavivirus quimérico es un virus de la fiebre amarilla en el que está reemplazada al menos una proteína estructural del virus de la fiebre amarilla con una proteína estructural correspondiente de un segundo flavivirus diferente contra el que se busca inmunidad.
Description
Métodos para prevenir y tratar infecciones por
flavivirus en animales.
Esta invención se refiere a métodos para
prevenir y tratar infecciones por flavivirus en animales.
Los flavivirus son virus pequeños, con envuelta,
de ARN de cadena positiva que son importantes en muchos entornos
médicos y veterinarios en todo el mundo. El virus del Nilo
Occidental (WN), por ejemplo, que es un miembro de la familia de
flavivirus, es el agente causante de la encefalitis WN, una
enfermedad vírica infecciosa, no contagiosa, trasmitida por
artrópodos (Monath et al., Flaviviruses en Virology,
Fields (ed.), Raven-Lippincott, Nueva York, 1996,
páginas 961-1034). El virus se ha encontrado en
África, Asia Occidental, Oriente Medio, la región mediterránea de
Europa y, recientemente, en los Estados Unidos. Los mosquitos se
infectan con el virus después de alimentarse de aves salvajes
infectadas, y después transmiten el virus mediante picaduras a
seres humanos, aves, y animales, tales como caballos, ovejas, vacas
y cerdos.
En 1999, se encontraron veinticinco caballos en
Nueva York con síntomas neurológicos que tenían infección por el
virus WN. Estos caballos presentaban signos de ataxia, dificultad al
caminar, desviación de los nudillos, inclinación de la cabeza,
temblores musculares e incapacidad de elevación. De estos
veinticinco caballos, nueve murieron o se sacrificaron con
eutanasia, y se encontraron virus, así como anticuerpos específicos
de virus en muestras tisulares de estos caballos. Los dieciséis
caballos supervivientes se recuperaron y también desarrollaron
títulos de anticuerpo contra el virus WN. Desde entonces, se ha
confirmado una creciente cantidad de caballos infectados con el
virus del Nilo Occidental.
Las proteínas de flavivirus se producen mediante
la traducción de una única fase de lectura abierta larga para
generar una poliproteína que experimenta una serie compleja de
escisiones proteolíticas post-traduccionales
mediante una combinación de proteasas del hospedador y del virus
para generar proteínas víricas maduras (Amberg et al. J.
Virol. 73:8083-8094, 1999; Rice,
"Flaviviridae," en Virology, Fields (ed.),
Raven-Lippincott, Nueva York, 1995, Volumen I,
página 937). Las proteínas estructurales de los virus están
dispuestas en la poliproteína en el orden
C-prM-E, donde "C" es la
cápsida, "prM" es un precursor de las proteínas M (membrana)
unidas a la envuelta viral, y "E" es la proteína de envuelta.
Estas proteínas están presentes en la región
N-terminal de la poliproteína, mientras que las
proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5)
están localizadas en una región C-terminal de la
poliproteína.
Monath et al. (Current Drug Targets -
Infectious Diseases (2001) 1:37-50) examina los
efectos de la encefalitis del Nilo Occidental y analiza vacunas
quiméricas, atenuadas y vivas contra el virus de la fiebre amarilla
- Nilo Occidental. Arroyo et al. (Trends in Molecular
Medicine (2001) 7:350-354) informa de la
manipulación del virus 17D de la fiebre amarilla para inducir una
respuesta inmune protectora contra virus de la misma familia. El
documento WO 98/37911 describe virus atenuados quiméricos vivos que
comprenden el virus de la fiebre amarilla y secuencias de la
envuelta viral de un flavivirus diferente.
La invención proporciona métodos para prevenir o
tratar infecciones por flavivirus (por ejemplo, infección por virus
del Nilo Occidental) en caballos que implican administrar a los
caballos flavivirus quiméricos. La invención también proporciona el
uso de flavivirus quiméricos en la preparación de medicamentos para
el uso en tales métodos. Los flavivirus quiméricos pueden incluir,
por ejemplo, las proteínas de la cápsida y no estructurales de un
primer flavivirus (por ejemplo, un virus de la fiebre amarilla, tal
como un virus de la fiebre amarilla derivado de la cepa 17D) y las
proteínas prM y de la envuelta de un segundo flavivirus (por
ejemplo, el virus del Nilo Occidental).
La invención proporciona varias ventajas. Por
ejemplo, como se analiza a continuación, los caballos tratados
usando los métodos de la invención no presentan efectos secundarios
adversos debidos a la vacunación, y sin embargo están protegidos
frente a una exposición sustancial al virus. Por tanto, los métodos
de la invención son altamente eficaces para proteger a los caballos
frente a flavivirus, por ejemplo, a la infección por el virus del
Nilo Occidental. Además, en referencia específicamente a la quimera
del virus de la fiebre amarilla - Nilo Occidental descrita en este
documento, el rango de hospedador del virus de la fiebre amarilla es
muy específico, estando limitado a primates. Por tanto, la eficacia
de la quimera del virus de la fiebre amarilla/Nilo Occidental para
proteger a los caballos frente a la exposición al virus del Nilo
Occidental fue sorprendente, ya que los caballos, que están sólo
ligeramente relacionados a los primates, están bastante fuera del
rango natural de hospedador del virus de la fiebre amarilla.
Además, debido a que los virus de la vacuna usados en la invención
son quiméricos, compuestos por material de más de un virus
diferente, se eliminan las posibilidades de reversión al virus de
tipo silvestre.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes de la siguiente descripción detallada y las
reivindicaciones.
La invención proporciona métodos para prevenir y
tratar infecciones por flavivirus (por ejemplo, virus del Nilo
Occidental (WN)) en caballos. Los métodos de la invención implican
la vacunación de caballos que están en riesgo de desarrollar o
tener una infección por flavivirus con un flavivirus quimérico
atenuado vivo. Estos virus constan de un flavivirus (es decir, un
flavivirus estructural) en el que se ha remplazado una proteína (o
proteínas) estructural con una proteína (o proteínas) estructural
correspondiente de un segundo flavivirus, frente al que se busca
inmunidad. Preferiblemente, las quimeras constan de un flavivirus
estructural en el que las proteínas prM y E se han reemplazado con
las proteínas prM y E del segundo flavivirus.
Los virus quiméricos que se usan en la invención
pueden constar de cualquier combinación de virus con la condición
de que, como se ha mencionado anteriormente, el virus frente al que
se busca inmunidad sea la fuente de la proteína o proteínas
estructurales insertadas. Por ejemplo, para vacunar un caballo
contra infección por el virus del Nilo Occidental, puede usarse un
flavivirus quimérico compuesto por un flavivirus estructural, tal
como el virus de la fiebre amarilla (YF), en el que se insertan las
proteínas estructurales del virus del Nilo Occidental (por ejemplo,
proteínas prM y E). En esta quimera las proteínas prM y E de YF se
reemplazan con las de WN. De forma similar, si se desea inmunidad
frente al virus de la encefalitis japonesa (JE), entonces se pueden
insertar las proteínas prM y E del virus JE en un flavivirus
estructural, tal como un virus de la fiebre amarilla, en el lugar
de las proteínas estructurales correspondientes. Otros flavivirus
que causan enfermedades en caballos, y para los que pueden usarse
virus quiméricos para inducir protección, incluyen los virus
Kunjin, de la encefalitis de Murray Valley y de la enfermedad de
Louping.
Por tanto, los ejemplos de flavivirus que se
pueden usar en la invención, como fuentes de virus estructural o
insertos de proteínas estructurales incluyen flavivirus trasmitidos
por mosquitos, tales como el virus de la encefalitis japonesa, el
dengue (serotipos 1-4), la fiebre amarilla, la
encefalitis de Murray Valley, la encefalitis de St. Louis, el Nilo
Occidental, Kunjin, encefalitis de Rocío, Wesselsbron e Ilheus;
flavivirus transmitidos por garrapatas, tales como el virus de la
encefalitis Centroeuropea, la encefalitis Siberiana, la encefalitis
Rusa de Primavera-Verano, la enfermedad del bosque
de Kyasanur, la fiebre hemorrágica de Omsk, la enfermedad de
Louping, Powasson, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi, y Hypr; así
como virus del género Hepacivirus (por ejemplo, el virus de la
Hepatitis C). Los virus adicionales que se pueden usar como fuente
de proteínas estructurales insertadas incluyen los virus del género
Pestivirus (por ejemplo, el virus de la diarrea bovina), y otros
virus, tales como los virus de Lassa, Ebola y Marburg. Como se ha
indicado anteriormente, el virus consta de un virus estructural de
la fiebre amarilla que contiene un inserto de virus del Nilo
Occidental.
Se proporcionan detalles para preparar virus
quiméricos que puedan usarse en la invención, por ejemplo, en las
solicitudes de Patente de Estados Unidos números de serie
09/007.664, 09/121.587 y 09/452.638; Solicitudes Internacionales
PCT/US98/03894 y PCT/US00/32821; y Chambers et al., J. Virol.
73:3095-3101, 1999.
Las vacunas de la invención se pueden
administrar en cantidades y usando métodos que pueden determinar
fácilmente los especialistas en la técnica. Las vacunas se pueden
administrar y formular, por ejemplo, como un fluido recogido de
cultivos celulares infectados con el virus quimérico apropiado. El
virus quimérico vivo, atenuado se formula como una solución acuosa
estéril que contiene entre 10^{2} y 10^{8}, por ejemplo, entre
10^{6} y 10^{7} unidades infecciosas (por ejemplo, unidades
formadoras de placas (pfu) o dosis infecciosas de cultivo tisular)
en un volumen de dosis de 0,1 a 1,0 ml, a administrar mediante, por
ejemplo, vía subcutánea, intramuscular o intradérmica. Además, se
puede seleccionar una vía mucosa, tal como una vía oral. La
selección de una cantidad apropiada de quimera a administrar se
puede determinar por los especialistas en la técnica, y esta
cantidad puede variar debido a numerosos factores, por ejemplo, el
tamaño, tipo, y salud general del animal al que se administre la
quimera.
Como se ha indicado anteriormente, las vacunas
se pueden administrar como agentes profilácticos primarios a un
caballo que está en riesgo de infección por flavivirus. Las vacunas
también se pueden usar como agentes secundarios para tratar a
caballos infectados por flavivirus estimulando una respuesta
inmunológica frente al flavivirus infeccioso. Además, aunque no se
requiere, se pueden usar adyuvantes para potenciar la
inmunogenicidad de las vacunas quiméricas. La selección de
adyuvantes apropiados se puede realizar fácilmente por los
especialistas en esta técnica.
Se evaluó la seguridad y eficacia de
ChimerVax-WN en caballos. La eficiencia se definió
en términos de respuestas inmunes humorales y protección de la
exposición.
Se usaron once caballos en este estudio, como se
resume a continuación en Tabla 1. Los caballos se alojaron en un
edificio de contención ABSL3 mientras duró el estudio, y se
alimentaron con alfalfa, heno y cereales mixtos.
Se inmunizaron cuatro caballos (EQ1, EQ2, EQ3,
EQ4) mediante dos inyecciones, con un intervalo de tres semanas, de
virus ChimeriVax-WN. En cada inmunización, se les
inoculó por vía subcutánea una dosis de 10^{7} unidades
formadores de placas (pfu) de virus en 1 ml en el hombro
izquierdo.
Se analizó la viremia en los caballos vacunados
usando un ensayo de placas WN convencional. Las muestras se
ensayaron por duplicado, puras y a dilución 1:5. Se descubrió que,
aunque los niveles de viremia eran muy bajos del día 0 al día 7,
era detectable un pico de viremia en los días 3 y 4.
Se midieron los niveles de anticuerpos en
muestras tomadas de cada caballo después de la vacunación, como se
indica en la Tabla 2, usando un ensayo de neutralización de
reducción de placas (PRNT). En resumen, dos de los caballos
desarrollaron un título de reducción del 80% de 10 dos semanas de la
inmunización primaria, y los cuatro caballos tenían un título de 10
y 20 a las cuatro semanas (una semana después de la segunda
inmunización).
La exposición de caballos a WNV transmitido por
mosquitos normalmente produce viremia, pero la enfermedad clínica
es poco frecuente. Por tanto, para posibilitar una evaluación de la
inmunidad protectora contra WNV, se desarrolló un modelo de
exposición apropiado. El virus de exposición usado en estos estudios
era WNV NY99 (4132), que se aisló originalmente de un cuervo y del
que se hicieron pases una vez en células Vero y una vez en células
C636. Debido a las reacciones de hipersensibilidad observadas
después de inyecciones de vacuna de refuerzo, se hicieron pases del
virus una vez más en células BHK-21, se retiró por
lavado el inoculó que contenía FBS después de adsorción, y se
prepararon soluciones madre usando suero de caballo
WNV/SLE-seronegativo al 20%. Esta preparación libre
se diluyó en PBS y se ha usó en las exposiciones de los caballos
EQ1, EQ2, EQ4, EQ8, EQ9, EQ10 y EQ11.
La mayoría de los caballos se expuso por
inoculación intratecal. Para este procedimiento, se les anestesió
con una combinación de xilazina y quetamina, y se realizó una
punción cisternal en condiciones asépticas. Se retiraron dos ml de
CSF, y se inyectó 1,0 ml de virus. En todos los casos, la
recuperación del procedimiento fue sin incidentes.
Los resultados de los estudios de desarrollo de
exposición se resumen a continuación.
A este caballo se le inoculó por vía intratecal
10^{4} pfu de WNV. El caballo parecía normal ese día y el
siguiente, pero se encontró recostado y poco sensible en la mañana
del día 2. Se sacrificó por eutanasia y se le hizo una necropsia, y
no se recuperaron virus de varias áreas del cerebro. Este animal
pudo haber caído durante la noche previa y se lesionó seriamente la
médula espinal, que no se examinó en la necropsia. Parece claro que
su muerte no estaba relacionada con infección por WNV.
A este caballo se le inoculó por vía subcutánea
10^{4} pfu de WNV; cuatro días después, se realizó una punción
cisternal con la idea de facilitar el paso de virus a través la
barrera hematoencefálica. En la mañana del día 10, estaba
notablemente inquieta y no estaba normal, aunque por la tarde, había
vuelto a la normalidad. No se observaron otros signos clínicos
durante las 6 semanas después de la exposición. Se ensayaron
muestras de suero recogidas dos veces al día durante los primeros
13 días después de la inoculación para el virus en células Vero -
no se recuperó virus de ninguna muestra. Se realizaron ensayos PRNT
usando suero recogido en el día de la inoculación y 3 semanas
después. Los títulos de neutralización del 80% (y del 90%) en estas
muestras fueron 10 (<10) y 40 (40) respectivamente. Se había
ensayado como serológicamente negativa antes de uso, de modo que
fue sorprendente el 1:10 en el titulo del 80% en el día de la
inoculación. Este animal puede haber tenido un caso leve de WN.
A este caballo se le inoculó por vía intratecal
10^{4} pfu de WNV; la retrotitulación reveló que la dosis era de
6 x 10^{3} pfu. Los signos clínicos de la enfermedad estuvieron
ausentes hasta el día 20, cuando se observó que el animal estaba
ansioso y nervioso. Durante los 2 días siguientes, su estado empeoró
con ansiedad aumentada, temblores de cabeza y el labio,
fasciculación muscular, y paresia de las extremidades posteriores.
Sin embargo, en la tarde del día 23, pareció recuperarse y los
signos clínicos disminuyeron considerablemente en gravedad. Se
sacrificó por eutanasia en el día 24 para permitir la confirmación
de que la enfermedad de hecho se debía a WNV. El examen
histopatológico del cerebro manifestó una encefalitis difusa,
extendida. Se ensayaron muestras de suero recogidas dos veces al
día del día 1 al día 9 para el virus por siembra en placa en
células Vero; no se aisló virus de ninguna de las muestras. Tampoco
se logró aislar virus de CSF y de homogeneizados del cerebro,
cerebelo y tronco cerebral recogidos en la necropsia (tejidos
ensayados como suspensiones al 10% y diluciones 1 y 2). Los títulos
PRNT (80 ó 90%) de sueros recogidos en el día 0, 7, 14, y 23 fueron
de <10, <10, 160, y 160.
Estos caballos se expusieron por inoculación
intratecal de 10^{5} pfu de WNV; la retrotitulación reveló que la
dosis administrada era de 2 x 10^{5} pfu. Ambos animales
permanecieron clínicamente normales durante 7 a 7,5 días, y después
desarrollaron progresivamente la enfermedad grave (descripciones
clínicas en los registros de los animales individuales). El
transcurso de la enfermedad en los dos caballos fue casi idéntico y
ambos se sacrificaron por eutanasia y se les hizo una necropsia en
el día 9. El examen histopatológico reveló encefalitis grave en
ambos caballos. Se ensayaron los sueros recogidos dos veces al día
después de la inoculación para la producción de placas en células
Vero. Los títulos de viremia (log_{10} pfu/ml) determinados
fueron:
Se ensayaron muestras de CSF, cerebro, cerebelo,
tronco cerebral y la médula cervical craneal en la necropsia para
el virus en células Vero. EQ8 tenía una traza (1,5 log_{10}
pfu/gramo) de virus en el tronco cerebral, y EQ8 tenía una pequeña
cantidad de virus (1,3 log_{10} pfu/gramo) en el cerebelo; todas
las otras muestras eran negativas. Ambos animales tenían títulos
PRNT de <10 en el momento de la exposición. en el momento de la
eutanasia, EQ8 y EQ9 tenían títulos PRNT (90%) de 160 y <10,
respectivamente.
Los caballos vacunados EQ1, EQ2, y EQ4 se
expusieron 24 semanas exactamente después de la inmunización
primaria. Dos caballos adicionales de control se expusieron
simultáneamente. Todas estas exposiciones consistían en inoculación
intratecal de 1,0 ml que contenía 10^{5} pfu de WVN (preparación
libre de FBS diluida en PBS). La retrotitulación del inóculo indicó
que los caballos recibieron aproximadamente 125.000 pfu de
virus.
Los dos caballos de control (EQ10 y EQ11)
desarrollaron enfermedad clínica grave que comenzó 7 a 8 días
después de la inoculación del virus y se sacrificaron por eutanasia
8,5 y 10 días después de la exposición, respectivamente. En el
momento de la eutanasia, sus títulos de anticuerpos PRNT eran de
1:40 y <10, respectivamente. Se ensayaron sueros recogidos a
intervalos de medio día entre el momento de la exposición y la
eutanasia por producción de placas en células Vero; los títulos de
viremia (log_{10} pfu/ml suero) se muestran en las siguientes
tablas (las muestras negativas de EQ11 tomadas después día 8,0 no se
muestran).
También se ensayaron muestras de CSF, cerebro,
cerebelo, y tronco cerebral en la necropsia y por producción de
placas en células Vero. No se aisló virus de cada muestra de CSF. Se
aislaron cantidades traza de virus (1-2 placas por
pocillo inoculado con 0,1 ml de suspensión al 10%) de las tres áreas
del cerebro del caballo EQ10, y sólo del tronco cerebral del
caballo EQ11. El examen histopatológico de los cerebros de EQ10 y
EQ11 reveló extendida.
En contraste marcado con los dos caballos de
control, los caballos vacunados EQ1, EQ2 y EQ4 no lograron mostrar
ninguna evidencia de enfermedad clínica en las 4 semanas después de
la exposición. Además no se aisló virus de ninguna de las muestras
de suero recogidas dos veces al día de estos animales durante los
primeros 10 días después de la exposición, ni de las muestras de
cerebro, cerebelo, tronco cerebral encéfalo, o CSF recogidas en el
día 28. El examen histopatológico de sus cerebros no reveló
lesiones, aparte de unos pocos hallazgos incidentales que no están
asociados con infección por WNV.
Se ensayaron los anticuerpos contra WNV en CSF
recogido en el momento de la inoculación al virus y en el momento
de eutanasia (día 28 para EQ1, EQ2, y EQ4; día 8,5 para EQ10, y día
10 para EQ11). Las muestras se ensayaron a diluciones de 1:5, 10 y
20. Las muestras recogidas en la necropsia del caballo EQ1 mostraron
una reducción del 87% en recuento de placas a 1:5, y la muestra
postmortem de EQ4 mostró una reducción del 98% a 1:5. Todas las
otras muestras tenían títulos de <5 a una reducción del 80%.
Se recogieron muestras de suero de los cuatro
caballos inmunizados semanalmente mientras duró su permanencia y se
almacenaron por duplicado. Se determinaron los títulos de
anticuerpos neutralizantes en un subconjunto de estas muestras,
usando un ensayo de neutralización de reducción de placas
convencional en células Vero. Sólo se realizaron algunos de los
ensayos usando suero humano al 8% en el inóculo de virus, como se
indica en la Tabla 2.
Claims (6)
1. Uso de un flavivirus quimérico en la
preparación de un medicamento para prevenir o tratar infecciones por
flavivirus en un caballo en el que el flavivirus quimérico es un
virus de la fiebre amarilla en el que está reemplazada al menos una
proteína estructural del virus de la fiebre amarilla con una
proteína estructural correspondiente de un segundo flavivirus
diferente contra el que se busca inmunidad.
2. El uso de reivindicación 1, en el que dicha
infección por flavivirus es infección por el virus del Nilo
Occidental.
3. El uso de reivindicación 1 ó 2, en el que
dicho flavivirus quimérico comprende las proteínas de la cápsida y
no estructurales de un virus de la fiebre amarilla y proteínas de la
envuelta de un segundo flavivirus diferente.
4. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho virus de la fiebre
amarilla se obtiene de la cepa 17D.
5. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el dicho segundo flavivirus
es un virus del Nilo Occidental.
6. El uso de flavivirus quimérico que comprende
las proteínas de la cápsida y no estructurales de un virus de la
fiebre amarilla y las proteínas prM y de la envuelta de un virus del
Nilo Occidental en la preparación de un medicamento para prevenir
la infección por el virus del Nilo Occidental en un caballo.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US34684501P | 2001-10-19 | 2001-10-19 | |
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