ES2337893T3 - Vacuna del virus del nilo occidental. - Google Patents
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Abstract
Molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias que codifican las proteínas de la envoltura y de la premembrana del virus del Nilo Occidental y las proteínas no estructurales y de la cápsida del virus de la fiebre amarilla, en la que dicha proteína de la envoltura comprende una mutación atenuante en la posición 107.
Description
Vacuna del virus del Nilo Occidental.
La presente invención se refiere a vacunas
contra el virus del Nilo Occidental
Desde que se detectara por primera vez en el
hemisferio norte, el virus del Nilo Occidental (WN) ha seguido
propagándose con rapidez por toda Norteamérica. Los primeros casos
se diagnosticaron en 1999 en el área de Nueva York. En el año 2002,
el índice de mortalidad humana aumentó hasta más de 150 casos y su
propagación ha continuado hasta llegar a California. La aparición
de pájaros infectados o muertos indica la existencia de un grupo
significativo de mosquitos infectados en las áreas geográficas de
incidencia. Hasta la fecha, no existe un tratamiento farmacológico
eficaz contra el virus del Nilo Occidental, y los métodos de
vigilancia y prevención no han tenido un impacto significativo en
el número de casos de infección en humanos. Por lo tanto, los
riesgos de migración del virus al hemisferio sur del continente
americano y de surgimiento de epidemias en países industrialmente
menos desarrollados son extremadamente elevados.
El virus del Nilo Occidental es un miembro de la
familia Flavivirus. Estos virus son pequeños, con envoltura
y de ARN de cadena positiva que resultan de interés en el ámbito
médico y veterinario mundial. Entre los ejemplos de este género de
virus se encuentran, además del virus del Nilo Occidental, el virus
de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa y el
virus del dengue.
Las proteínas de los flavivirus se
producen mediante la traducción de un marco de lectura abierto largo
y único para generar una poliproteína que sufre una compleja serie
de divisiones proteolíticas postraduccionales por medio de una
combinación de proteasas huésped y virales, para generar proteínas
virales maduras (Amberg y col., J. Virol.,
73:8083-8094, 1999; Rice, "Flaviviridae",
Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott,
Nueva York, 1995, Volumen I, p. 937). Las proteínas estructurales
del virus se organizan en la poliproteína con la forma
C-prM-E, donde "C" es la
cápsida, "prM" (o "premembrana") es una precursora de la
proteína M (de membrana) ligada a la envoltura y "E" es la
proteína de la envoltura. Estas proteínas están presentes en la
región del extremo amino de la poliproteína, mientras que las
proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5)
están localizadas en la región del extremo carboxilo de la
poliproteína.
La invención proporciona moléculas de ácido
nucleico que incluyen las secuencias que codifican las proteínas de
la envoltura y de la premembrana del virus del Nilo Occidental y las
proteínas no estructurales y de la cápsida del virus de la fiebre
amarilla. Las proteínas de la envoltura o de la premembrana del
virus del Nilo Occidental de estas quimeras comprenden una o varias
mutaciones atenuantes como, por ejemplo, la sustitución de
aminoácidos en las posiciones 107, 316 y/o 440 de la proteína de la
envoltura. Como ejemplos específicos la sustitución de aminoácidos
en la posición 107 puede ser de leucina por fenilalanina (o un
aminoácido conservador de la misma); la sustitución de aminoácido
en la posición 316 puede ser de alanina por valina (o un aminoácido
conservador de la misma); y la sustitución en la posición 440 puede
ser de lisina por arginina (o un aminoácido conservador de
la
misma).
misma).
La invención también incluye flavivirus
híbridos codificados por las moléculas de ácidos nucleicos descritas
en la presente memoria, así como distintas utilizaciones de los
mismos, con el fin de inducir en un individuo una respuesta inmune
al virus del Nilo Occidental. Además, la invención incluye la
utilización de dichos flavivirus híbridos en vacunaciones y
para preparar medicamentos destinados a tales usos. Las
utilizaciones descritas en la presente memoria se aplican a
individuos con riesgo de desarrollar el virus del Nilo Occidental
pero que no lo han contraído, así como a sujetos infectados por el
virus del Nilo Occidental. La invención también proporciona métodos
para producir los flavivirus híbridos descritos en la
presente memoria.
La invención proporciona varias ventajas. Por
ejemplo, tal y como se expone a continuación con mayor detalle, las
mutaciones atenuantes de los virus de la invención tienen como
resultado una reducción de la neurovirulencia, pero no afectan de
forma adversa a la capacidad de los virus para inducir una respuesta
inmune efectiva. Por lo tanto, los virus de la invención
proporcionan un enfoque eficaz y seguro para la prevención y el
tratamiento de la infección del virus del Nilo Occidental.
Otras características y ventajas de la invención
resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente
y las reivindicaciones que se exponen a continuación.
La figura 1 es un gráfico que representa los
resultados del valor de los anticuerpos neutralizantes recíprocos
(PRNT_{50}) en ratones ICR vacunados con YF/WN wt o YF/WN_{FVR}.
Se representan los valores de los anticuerpos neutralizantes contra
el virus YF/WN wt. Los símbolos blancos representan a los ratones
que no sobrevivieron a la reinmunización IP con la cepa WNV
NY-99. Se obtuvo una supervivencia del 100% en los
grupos vacunados con una dosis de 10^{3} PFU de YF/WN wt y con
una dosis de 10^{5} PFU de YF/WN_{FVR}. Del grupo de ratones
vacunado con 10^{3} PFU de YF/WN_{FVR} sólo sobrevivió a la
reinmunización el 40%.
La invención proporciona vacunas y utilizaciones
para la prevención y el tratamiento de la infección del virus del
Nilo Occidental (WN). Las utilizaciones de la invención implican la
utilización de un flavivirus híbrido atenuado compuesto de
un virus de la fiebre amarilla en el que las proteínas de la
envoltura y la premembrana se han sustituido por las del virus del
Nilo Occidental conforme a la invención para la vacunación de un
individuo. Las proteínas del virus del Nilo Occidental de las
quimeras de la invención incluyen una o varias mutaciones
atenuantes, tal y como se detalla a continuación.
Los métodos generales de creación y
administración de flavivirus híbridos que puedan ser
utilizados en la presente invención aparecen descritos
detalladamente, por ejemplo, en las solicitudes de patente US nº
09/007,664, 09/121,587 y 09/452,638; en las solicitudes
internacionales PCT/US98/03894 (WO 98/37911) y PCT/US00/32821 (WO
01/39802); y en el documento de Chambers y col., J. Virol.,
73:3095-3101,1999. Tal y como se expone a
continuación, para la utilización de acuerdo con la presente
invención se insertan una o varias mutaciones atenuantes en las
secuencias del virus del Nilo Occidental. En el documento
PCT/US03/01319 (WO 03/060088 A2) también se describen métodos que
se pueden usar para producir virus en la invención.
En un ejemplo de un virus híbrido de la
invención, la mutación atenuante se encuentra en la posición 107, o
en la posición 316 y en la 440 (o en una combinación de las mismas),
de la proteína de la envoltura del virus del Nilo Occidental. Como
ejemplo específico, y utilizando como referencia la secuencia de la
cepa del virus del Nilo Occidental flamenco-NY99
382-99 (número de registro del GenBank AF196835), la
lisina se puede sustituir por fenilalanina en la posición 107, la
alanina se puede sustituir por valina en la posición 316 y/o la
lisina se puede sustituir por arginina en la posición 440. Además de
los aminoácidos indicados, también se pueden hacer sustituciones
con otros aminoácidos, como los que producirían una modificación
conservadora al sustituir a los aminoácidos mencionados. Las
sustituciones conservadoras habituales comprenden las de los grupos
siguientes: glicina, alanina, valina, isoleucina y leucina; ácido
aspártico, ácido glutámico, asparagina y glutamina; serina y
treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. En un
ejemplo específico, una quimera de la invención incluye cada una de
las sustituciones específicas indicadas anteriormente. Además, tal
y como se expone a continuación, los residuos adicionales (por
ejemplo, las posiciones 138, 176 y/o 280) también se pueden alterar
en los virus híbridos de la presente invención.
Las vacunas de la invención se pueden
administrar en cantidades y con métodos que el experto en la materia
puede determinar con facilidad. Las vacunas se pueden administrar y
formular, por ejemplo, en forma de fluido cultivado a partir de
cultivos celulares infectados con el virus híbrido. El virus vivo
híbrido y atenuado puede formularse en forma de solución acuosa
estéril con una cantidad de unidades infecciosas de entre 10^{2}
y 10^{8}, por ejemplo, entre 10^{6} y 10^{7}, (p. ej.,
unidades de formación de placas [PFU] o dosis infecciosas de
cultivo de tejido) en una dosis con un volumen de entre 0,1 y 1,0
ml, con el fin de ser administrado, por ejemplo, por vía
subcutánea, intramuscular o intradérmica. Además, también es posible
seleccionar una vía mucosa, como la vía oral. Los expertos en la
materia pueden determinar la selección de una cantidad adecuada de
quimera para su administración, cantidad que puede variar en función
de numerosos factores como, por ejemplo, la talla y el estado
general de salud del individuo al que se le administre la quimera.
La vacunación del individuo puede efectuarse una sola vez o, en
caso necesario, puede realizarse una inmunización de
seguimiento.
Como se ha indicado anteriormente, las vacunas
se pueden administrar como profilácticos primarios a un individuo
con riesgo de contraer el virus del Nilo Occidental. Las vacunas
también se pueden usar como agentes secundarios para el tratamiento
de individuos que han contraído el virus del Nilo Occidental
mediante la estimulación de una respuesta inmune contra el virus
causante de la infección. Además, aunque no es un requisito
indispensable, se pueden utilizar adyuvantes para potenciar la
inmunogenicidad de las vacunas de virus del Nilo Occidental. Los
expertos en la materia pueden seleccionar con facilidad los
adyuvantes apropiados.
En particular, la invención proporciona en un
primer aspecto una molécula de ácidos nucleicos que comprende
secuencias que codifican las proteínas de la envoltura y de la
premembrana del virus del Nilo Occidental y las proteínas no
estructurales y de la cápsida del virus de la fiebre amarilla en las
que dicha proteína de la envoltura comprende una mutación atenuante
en la posición 107.
La invención proporciona además una molécula de
ácidos nucleicos que comprende secuencias que codifican las
proteínas de la envoltura y de la premembrana del virus del Nilo
Occidental y las proteínas no estructurales y de la cápsida del
virus de la fiebre amarilla en las que dicha proteína de la
envoltura comprende una mutación atenuante en la posición 316 y en
la posición 440.
En una forma de realización preferida del primer
aspecto, dicha mutación atenuante comprende además una sustitución
aminoacídica en las posiciones 316 y 440 de los aminoácidos. Resulta
además preferido que dicha sustitución aminoacídica de la posición
107 sea de leucina por fenilalanina, o por un aminoácido conservador
de la misma. Resulta asimismo preferido que dicha sustitución
aminoacídica de la posición 316 sea de alanina por valina, o por un
aminoácido conservador de la misma. Resulta asimismo preferido que
dicha sustitución de aminoácido de la posición 440 sea de lisina
por arginina, o por un aminoácido conservador de la misma.
La invención proporciona asimismo un
flavivirus híbrido codificado por la molécula de ácidos
nucleicos de la invención y la utilización de dicho
flavivirus híbrido para la preparación de una composición
farmacéutica que induzca en un individuo una respuesta inmune al
virus del Nilo Occidental. Se prefiere que dicho individuo se halle
en riesgo de desarrollar una infección del virus del Nilo Occidental
pero que no la haya contraído. En otra de las formas de realización
preferidas de la utilización, dicho individuo ha contraído el virus
del Nilo Occidental.
También se proporciona un método para producir
una vacuna de flavivirus híbrido que comprende la
introducción en las células de la molécula de ácidos nucleicos de
la invención.
Se proporciona además la utilización del
flavivirus híbrido de la invención en la preparación de una
composición farmacéutica para la vacunación contra el virus del
Nilo Occidental.
La invención se basa, en parte, en los
resultados experimentales siguientes.
Con el fin de aumentar el perfil de seguridad de
una vacuna híbrida de virus del Nilo Occidental y de la fiebre
amarilla, se investigó la posibilidad de que las mutaciones
puntuales de atenuación en la proteína de la envoltura reduzcan la
neurovirulencia. Tal y como se describe a continuación con mayor
detalle, se concibió una quimera de YF/WN sin la capacidad
neuroinvasiva del virus del Nilo Occidental en el ratón y menos
neurovirulenta que la cepa de vacuna de fiebre amarilla YF 17D en
modelos de ratón y de mono. A continuación se describe la
mutagénesis de la proteína de la envoltura y se evalúa la
seguridad, la inmunogenicidad y la eficacia de la misma y de virus
relacionados en modelos de ratón y de rhesus.
Los flavivirus híbridos se construyen
mediante la tecnología ChimeriVax^{TM}, que implica la utilización
de un sistema de dos plásmidos descrito en otros documentos (ver,
por ejemplo, las solicitudes de patente US nº 09/007,664,
09/121,587 y 09/452,638; las solicitudes internacionales
PCT/US98/03894 [WO 98/37911] y PCT/US00/32821 [WO 01/39802]; y el
documento de Chambers y col. de J. Virol.
73:3095-3101, 1999). El sistema de dos plásmidos
proporciona estabilidad plasmídica en E. coli así como un
método adecuado para manipular el esqueleto clonado de la fiebre
amarilla (YF), facilitando el reemplazo de los genes E y prM de YF
con los de la diana de flavivirus. Los genes E y prM del
virus del Nilo Occidental (WN) usados se clonaron a partir del
aislado de flamenco del WNV 383-99, con número de
registro del GenBank AF196835. El cDNA de prME del virus se obtuvo
mediante RT-PCR (equipo XL-PCR,
Perkin Eimer). El extremo 5' del gen prM del WN se clonó exactamente
en el extremo del gen de la cápsida 17D del YF mediante PCR de
extensión de solapamiento, utilizando la polimerasa Pwo (Roche).
Esta etapa de la clonación mantiene la integridad de la señal de
división/procesamiento codificada en el extremo 3' del gen de la
cápsida del YF. El extremo 3' del gen E también se clonó con
exactitud en el extremo 5' de la secuencia de codificación NS1 del
YF mediante PCR de extensión de solapamiento. La utilización de
este sistema de dos plásmidos para la clonación de la región prME
del virus del Nilo Occidental en el esqueleto 17D del YF ya fue
descrito anteriormente (Arroyo y col., Trends in Molecular
Medicine, 7(8):350-354, 2001). Las
mutaciones imperceptibles se introdujeron en la secuencia de prM y E
para crear los sitios de restricción únicos Bsp El y
Eag I. La digestión de los dos plásmidos con estas enzimas
produjo fragmentos de DNA que fueron purificados con gel y ligados
in vitro para producir un cDNA híbrido completo. El cDNA se
linealizó con Xho I para facilitar la transcripción in
vitro mediante la polimerasa SP6 (Epicentre). El producto de
RNA se introdujo en líneas celulares eucarióticas permisivas para la
traducción de RNA vírico y la replicación del virus.
Las mutaciones puntuales se introdujeron en
diversos codones del gen E para producir variantes de la quimera
original codificadora de la prME primitiva del WN. La tabla 1
muestra los sitios de mutación diana y las secuencias de
oligonucleótidos utilizadas para crear las quimeras de YF/WN
descritas a continuación. Las mutaciones de los sitios se
confirmaron mediante secuenciación de las proteínas de la envoltura
(región prME) de los virus resultantes. Las plantillas de cDNA del
virus para la secuenciación procedían de RNA extraído de
sobrenadantes del virus (Trizol LS, Invitrogen), seguidas de
RT-PCR (equipo XL-PCR, Perkin Eimer)
y secuenciación mediante la utilización de cebadores sintéticos
(Invitrogen) y un secuenciador CEQ 2000 (Beckman).
Los virus híbridos de YF/WN (es decir,
ChimeriVax^{TM}-West Nile) se prepararon mediante
transfección de RNA (virus del pase 1, P1) en una línea celular
Vero E6 (ATCC, CIDVR UMASS Medical Center Worcester, MA). Las cepas
madre de investigación (RMS) se prepararon mediante amplificaciones
adicionales (pases 2 o 3 a 0,001 MOI) en células Vero E6. Las
células Vero E6 se mantuvieron en MEM (Invitrogen) y un 10% de FBS
(Hyclone). La preparación de las cepas premadre (PMS) para la
preparación de la vacuna se inició mediante la transfección de RNA
en una línea celular Vero sin suero (SF-Vero) (ATCC,
Baxter/Immuno Orth, Austria), seguida de un pase de amplificación
en la misma línea celular SF-Vero para producir una
cepa premadre o PMS P2. La línea celular SF-Vero se
propagó y se mantuvo en un medio sin proteínas y sin suero
VT-Media (Baxter/ Immuno, Austria). El virus WN
primitivo utilizado era una cepa NY-99 (aislado de
flamenco NY99-35262-11) obtenida de
CDC, Fort Collins, CO (denominación de CDC B82332W) con dos pases
adicionales en células Vero E6 para producir un banco de virus
madre. YF 17D es una vacuna comercial (YF-VAX®,
Aventis Pasteur, Swiftwater, PA) usada aquí tras la reconstrucción
del producto liofilizado o tras un pase en células Vero E6 (ATCC,
Acambis Inc., Cambridge, MA).
Se inoculó virus WN primitivo a los ratones por
vía intraperitoneal (IP) para probar la neuroinvasión o durante la
reinmunización. Los volúmenes de inoculación IP fueron de
100-200 \mul, administrados con una jeringuilla
25G. Se probó la neurovirulencia, mediante inoculación intracerebral
(IC) en ratones adultos y lactantes. Para dicha administración IC
se utilizó un volumen de inoculación de 20 \mul, administrado en
el lado derecho del lóbulo frontal del cerebro. Los virus se
diluyeron en M199 con amortiguador HEPES (Invitrogen) y un 20% de
FBS (Hyclone), si no se indica de otro modo. Los ensayos de placas
en las células Vero se efectuaron para verificar el valor de las
inoculaciones de virus (Monathetal., J. Virol., 74(4):
1742-1751, 2000).
Se observó a los ratones durante un periodo de
21 días con el fin de definir la neuroinvasión, la neurovirulencia
o la supervivencia tras la reinmunización con el virus del Nilo
Occidental. La morbilidad y la mortalidad fueron
observadas/clasificadas y se sacrificó a los ratones que
sobrevivieron.
Con el fin de determinar los valores de
anticuerpos neutralizantes, se sangró a los ratones mediante la vía
retroorbital y se separó el suero mediante centrifugación. Los
valores de los anticuerpos neutralizantes del suero se midieron con
ensayos de neutralización de reducción de placas (PRNT).
La prueba en monos rhesus que determina la
neurovirulencia de las vacunas de la fiebre amarilla (YF), descrita
en las directrices de la OMS, se usó para determinar la seguridad de
las quimeras de YF/WN (Monath y col., J. Virol.,
74(4): 1742-1751, 2000). Se efectuó una
inoculación por vía IC en los animales y cada día se extrajeron
muestras de sangre para medir los niveles de viremia mediante la
técnica del ensayo de placas. Se observó a los animales a diario
para localizar posibles síntomas asociados a la enfermedad como, por
ejemplo, fiebre o temblores. Después de 30 días, se sacrificaron y
se les extrajo tejido de la médula espinal y del cerebro para
realizar la anatomía histopatológica. La neuropatología se clasificó
conforme al sistema definido por la OMS y se analizó la patología
de los valores en comparación con los del estándar de la vacuna YF
17D.
Se vacunó a los monos rhesus mediante
administración subcutánea de una dosis única de 0,5 ml de vacuna con
PFU 4 log 10 nominal. La viremia se midió mediante ensayos de
placas del suero diluido en las células Vero, utilizando muestras
de suero reunidas diariamente desde el primer día hasta el décimo
(Monath y col., J. Virol., 74(4):
1742-1751, 2000). Los niveles de anticuerpos
neutralizantes se midieron mediante ensayos del valor de la
neutralización de la reducción de placas (PRNT) (Monath y col.,
J. Virol., 74(4): 1742-1751, 2000).
Tras 64 días de la vacunación, se reinmunizó a los animales con
virus WN primitivo NY99.
El constructo YF/WN wt (es decir,
ChimeriVax^{TM}-WN_{01}) sin mutaciones
atenuantes en la proteína E se pasó seis veces en las células Vero
E6, seguido de seis pases por vía IC en ratones lactantes. Los
constructos de cepas madre de investigación (Research Master
Seed) y de cepas premadre (preMaster Seed) YF/WN_{FVR} (es
decir, ChimeriVax^{TM}-WN_{02}) con 3 mutaciones
atenuantes introducidas en la proteína E se pasaron 12 y 10 veces,
respectivamente, en un sustrato de células SF-Vero
sin suero y sin proteínas. Todos los pases se efectuaron con MOI
inicial de 0,01, seguidos del cultivo al tercer día y continuando
sin valoración para determinar la potencia del virus. Los valores
del virus en cada pase se calcularon después mediante ensayo de
placas. La neurovirulencia de los virus en los que se efectuaron los
pases se midió con inoculaciones IC en ratones adultos o lactantes.
A continuación se secuenció el RNA vírico.
La quimera inicial del virus del Nilo Occidental
codificaba los genes de las proteínas de la premembrana y de la
envoltura de la cepa primitiva WN NY99 (es decir, YF/WN wt o
ChimeriVax^{TM}-WN_{01}). Este virus híbrido
carecía de la capacidad de provocar encefalitis tras una
incoculación IP en dosis de 10^{6} PFU en el ratón ICR (tabla 2).
La encefalitis se evaluó mediante la observación diaria de posibles
cambios en el comportamiento motor que deriven en parálisis y
muerte. La carencia de neuroinvasión de YF/WN wt en el ratón adulto
también fue observado en otros estudios con ratones inoculados con
la vacuna de YF 17D (Ryman y col., Virology,
230[2]:376-380,1997). En contraste, la
inoculación por vía IP de pequeñas cantidades (1-4
PFU) del virus WN NY99 primitivo fue letal en los ratones (Beasley y
col., Virology, 296:17-23, 2002). La IC
LD_{50} de YF/WN wt se estimó aquí entre 10^{3} y
10^{5} PFU. El fenotipo de neurovirulencia de YF/WN wt es
inferior al del virus YF 17D, en el que la IC LD_{50} de ratones
ICR se encuentra entre 10^{1}
y 10^{2} PFU. Sin embargo, el virus YF/WN wt no mostró un criterio de valoración claro en el ratón de 21 días (tabla 3).
y 10^{2} PFU. Sin embargo, el virus YF/WN wt no mostró un criterio de valoración claro en el ratón de 21 días (tabla 3).
Se modificaron los aminoácidos de la proteína de
la envoltura con el fin de determinar si dichas modificaciones
reducirían la virulencia de las quimeras de YF/WN. Se evaluaron las
modificaciones de la virulencia en el modelo de ratón y se
compararon con la neurovirulencia de la quimera YF/WN wt
original. Los residuos de aminoácidos correspondientes a las
posiciones génicas de la envoltura (E) de YF/WN wt
107,138,176 y 280 fueron mutados en un constructo singular para
codificar los residuos de aminoácidos F, K, V y M, respectivamente.
El nuevo virus híbrido se identificó como YF/WN_{FKVM}. A
continuación se construyeron quimeras en las que cada uno de los
residuos de aminoácidos del grupo FKVM se mutó por separado con el
fin de evaluar su función individual en la neurovirulencia (tabla
4). Además, en los residuos de aminoácidos 316 y 440 se efectuaron
mutaciones a V y R respectivamente, conforme a datos anteriores que
indican que es posible que las mutaciones de la proteína E
correspondientes a estas regiones tengan una función en la biología
del tercer dominio de la proteína E (Rey y col., Nature,
375[6529]: 291-298, 1995; Allison y col.,
J. Virol., 75[9]:4268-4275, 2001).
Las observaciones de la neurovirulencia de las quimeras después de
modificar aminoácidos en la proteína E indican que los residuos
107, 316 y 440 son los aminoácidos que más contribuyen a la
neurovirulencia del virus WN. De acuerdo con esta información, se
elaboró un constructo multicéntrico de YF/WN_{FVR} y se seleccionó
como candidato para la vacuna. Todas las quimeras multicéntricas
crecieron hasta valores de 10^{7} PFU/mL en células
SF-Vero sin suero.
La neurovirulencia en ratones de virus con
mutaciones puntuales o multicéntricas en el gen de la proteína de
la envoltura de YF/WN wt se midió en un ratón de 21 días, al
que se le inocularon por vía IC dosis de virus de entre 10^{4} y
10^{5} PFU. En este análisis se identificaron los residuos 107 y
280 (tabla 4) y la combinación 316/440 (tabla 5) como las
mutaciones atenuantes más dominantes, conforme a la medición
realizada según la mortalidad y la media de supervivencia (AST) de
los ratones. La quimera que se seleccionó como candidata a la
vacuna que tenía una combinación de las mutaciones F, V y R en los
residuos 107 316 y 440, respectivamente, no se mostró virulenta en
el ratón adulto (tabla 6). Sin embargo, sí se observó cierta
neurovirulencia en ratones lactantes de dos días, similar a la
vacuna ChimeriVax^{TM}-JE, que es segura para los
seres humanos (Monath y col., Vaccine,
20:1004-1018, 2002).
El fenotipo de neurovirulencia de las quimeras
del virus del Nilo Occidental en el mono rhesus se midió con el
constructo YF/WN wt y se comparó con el de la vacuna de YF
17D. Se inoculó YF/WN wt a los monos rhesus por vía IC y se
comparó con las inoculaciones con la vacuna de YF 17D. La quimera
indujo valores de viremia y duraciones similares a los de la vacuna
de YF 17D. Este virus no se mostró más neurovirulento que la vacuna
de YF, lo que indica que las quimeras de YF/WN son igual de seguras
que la vacuna de YF 17D.
Se comparó la inmunogenicidad de la quimera
YF/WN wt y el constructo YF/WN_{FVR}, que presenta
mutaciones en los residuos de la envoltura 107, 316 y 440. Se
inoculó a los ratones dosis de entre 2 y 5 log_{10} PFU de la
vacuna por vía subcutánea (SC). Después de la inmunización, se
recopiló suero durante cuatro semanas y se valoraron los
anticuerpos neutralizantes. Los datos de la figura 1 muestran que la
atenuación específica de un sitio en el constructo YF/WN wt
dio como resultado un virus menos inmunógeno. La reinmunización
intraperitoneal de los ratones inmunizados con virus primitivo de WN
N Y99 puso de manifiesto una correlación entre la potencia y la
eficacia de la vacuna con los constructos. Todos los ratones
inmunizados con una dosis de 10^{5} PFU ml de cualquiera de las
dos quimeras de YF/WN estaban protegidos contra la reinmunización
virulenta del virus.
En los monos rhesus, la inmunogenicidad de los
candidatos a vacunas con una, dos o tres mutaciones atenuantes,
YF/WN_{107}F, YF/WN, _{316}V_{440}R o YF/WN_{FVR}, fue
igual. No hubo diferencias significativas en los valores de los
anticuerpos correspondientes cuando se inoculó en los animales una
dosis de 10^{4} PFU de la vacuna. Los estudios de eficacia
establecidos mediante la reinmunización con virus primitivo de WN
NY99 mostraron claramente en la vacuna de WN que los candidatos
probados en el modelo de rhesus fueron eficaces al 100% en
comparación con los animales de control (tabla 7).
La viremia posterior a la vacunación en los
macacos rhesus fue de duración similar en comparación a la inducida
por la vacuna de YF 17D, pero su magnitud fue inferior, con una
correlación lineal con respecto al número de mutaciones atenuantes
únicas en las quimeras (tabla 8). Sin embargo, el análisis de la
seguridad basado en el viscerotropismo (o viremia posterior a la
vacunación) muestra que ninguno de los candidatos a vacuna probados
en el modelo de macaco es más seguro que seguro que YF 17D.
La reinmunización IC posterior de los macacos
rhesus con 5,38 log_{10} PFU de WN NY99 no produjo viremia
detectable, y no se observaron indicios clínicos de enfermedad ni
mortalidad en los animales vacunados con constructos de YF/WN. En
los vacunados con YF 17D se detectó viremia significativa debido a
la replicación del WNV. Los niveles de viremia detectados en
animales de este grupo mostraron un valor medio de PFU log_{10}
de 2,25\pm0,62 y una duración media de 3,5 días. Estos niveles de
viremia son similares a los observados en el grupo de control no
vacunado (n=2), con un valor medio de PFU log_{10} de
2,33\pm0,47 y una duración media de 4,5 días. Dos de los cuatro
macacos rhesus vacunados con YF 17D sobrevivieron a la
reinmunización IC con la cepa WN NY99. Los que sobrevivieron
mostraron pérdida de apetito y síntomas de letargo a temperaturas
elevadas después de la reinmunización. Los animales
sacrificados
después de la reinmunización con la cepa WNV NY99 mostraban síntomas como, por ejemplo, fiebre y temblores.
después de la reinmunización con la cepa WNV NY99 mostraban síntomas como, por ejemplo, fiebre y temblores.
Se efectuaron estudios de pases de sustrato
in vitro e in vivo con quimeras YF/WN wt o
YF/WN_{FVR} con el fin de determinar la estabilidad genética de
los constructos al crecer en cultivos estacionarios. Después de
seis pases in vitro con células Vero E6 seguidos de seis
pases in vivo de cerebro de ratón adulto ICR con YF/WN wt,
no se descubrieron mutaciones no deseadas en la región génica de la
envoltura (prM, E) de esta quimera. Se identificó una mutación
heterocigótica de la proteína E en la posición E336, de cisteína a
serina, tras diez pases in vivo del virus YF/WN_{FVR} en
células Vero E6. En otro estudio distinto, el pase in vitro
de células SF-Vero con YF/WN_{FVR} resultó en la
selección de una mutación en la posición E 313, que modificó el
aminoácido de esta posición de glicina a arginina. Durante toda la
serie de pases el virus en células Vero, no se detectaron
reversiones ni mutaciones en los residuos blancos 107F, 316V o 440R,
relacionados con la neurovirulencia del virus.
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Claims (12)
1. Molécula de ácido nucleico que comprende las
secuencias que codifican las proteínas de la envoltura y de la
premembrana del virus del Nilo Occidental y las proteínas no
estructurales y de la cápsida del virus de la fiebre amarilla, en
la que dicha proteína de la envoltura comprende una mutación
atenuante en la posición 107.
2. Molécula de ácido nucleico que comprende las
secuencias que codifican las proteínas de la envoltura y de la
premembrana del virus del Nilo Occidental y las proteínas no
estructurales y de la cápsida del virus de la fiebre amarilla, en
la que dicha proteína de la envoltura comprende una mutación
atenuante en la posición 316 y en la posición 440.
3. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1, en la que dicha mutación atenuante comprende
además una sustitución de aminoácido en las posiciones de
aminoácido 316 y 440.
4. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1 ó 3, en la que dicha sustitución de aminoácido en
la posición 107 es de la leucina por la fenilalanina, o un
aminoácido conservador de la misma.
5. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 2 ó 3, en la que dicha sustitución de aminoácido en
la posición 316 es de la alanina por la valina, o un aminoácido
conservador de la misma.
6. Molécula de ácido nucleico según cualquiera
de las reivindicaciones 2, 3 ó 5, en la que dicha sustitución de
aminoácido en la posición 440 es de la lisina por la arginina, o un
aminoácido conservador de la misma.
7. Flavivirus híbrido codificado por la
molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6.
8. Utilización del flavivirus híbrido
según la reivindicación 7 para la preparación de una composición
farmacéutica para inducir una respuesta inmune al virus del Nilo
Occidental en un sujeto.
9. Utilización según la reivindicación 8, en la
que dicho individuo se halla en riesgo de desarrollar una infección
del virus del Nilo Occidental, pero no la ha contraído.
10. Utilización según la reivindicación 8, en
la que dicho sujeto está infectado con el virus del Nilo
Occidental.
11. Procedimiento de preparación de una vacuna
de flavivirus híbrido, que comprende la introducción en las
células de la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
12. Utilización del flavivirus híbrido
según la reivindicación 7 para la preparación de una composición
farmacéutica para la vacunación contra el virus del Nilo
Occidental.
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