ES2285087T3 - Formas farmaceuticas de adn. - Google Patents
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Abstract
Forma farmacéutica de un agente farmacéutico de ADN, que tiene un elemento central denso revestido con un medio de depósito sólido que contiene el agente farmacéutico de ADN.
Description
Formas farmacéuticas de ADN.
La presente invención se refiere a formulaciones
farmacéuticas de ADN, y preferiblemente aquellas formulaciones que
son adecuadas para la liberación balística en la piel del cuerpo
humano. La presente invención proporciona una forma farmacéutica
nueva de un agente farmacéutico de ADN, que tiene un elemento
central denso que está revestido con un medio de depósito sólido
amorfo que contiene el agente farmacéutico de ADN en solución sólida
o suspensión dentro de ésta. El elemento central denso es
preferiblemente una perla de metal pequeña adecuada para la
liberación balística del agente en una célula, comúnmente tales
perlas son microperlas más o menos esféricas de tungsteno o de oro
de un tamaño de partícula medio que varía ente 0,5 y 10 micrómetros
de diámetro. Preferiblemente, el medio de depósito farmacéutico
sólido que reviste las perlas es un poliol, preferiblemente estando
un poliol en un estado amorfo. Preferiblemente el poliol es un
hidrato de carbono tal como trehalosa o sacarosa. El medio de
depósito farmacéutico sólido además puede comprender un agente
estabilizante que inhibe los efectos degenerativos de los radicales
libres, tal como un secuestrador de radicales libres o un quelante
de iones metálicos. Las formulaciones farmacéuticas de ADN de la
presente invención son estables en almacenamiento, en las que el
ADN se estabiliza en su forma superenrollada, y sólo liberan
sustancialmente el ADN después de la administración a la piel.
Además, se proporcionan los dispositivos de suministro de vacunas
para la administración de las vacunas de ADN en la piel,
procedimientos de su fabricación, y su uso en medicina.
La piel representa una barrera importante para
los agentes externos. En el Diccionario Ilustrado de Medicina de
Dorland, Edición 28, se proporciona un resumen de la piel humana.
Empezando por las capas externas, trabajando hacia dentro, la piel
comprende el epitelio que está constituido por el estrato córneo y
el epitelio viable, y debajo del epitelio se encuentra la dermis.
El epitelio viable está constituido por cuatro capas: Estrato
córneo, Estrato lúcido, Estrato granuloso, Estrato espinoso y
Estrato basal. El epitelio (incluyendo las cinco capas) es
la capa no vascular más alejada de la piel, y varía entre 0,07 mm y
0,12 mm de espesor (70-120 \mum). El epitelio
está poblado con queratinocitos, una célula que produce queratina y
constituye el 95% de las células epidérmicas dedicadas. El otro 5%
de células son melanocitos. La dermis subyacente normalmente se
encuentra en un intervalo de 0,3 mm hasta aproximadamente 3 mm por
debajo de la superficie del estrato córneo, y contiene glándulas
sudoríparas, folículos pilosos, terminaciones nerviosas y vasos
sanguíneos.
El estrato córneo domina la barrera de
permeabilidad de la piel y está constituido por una docena de capas
epiteliales córneas, queratinizadas. Los intersticios estrechos
entre los queratinocitos muertos o que mueren en esta región se
rellenan con lípidos multilaminares cristalinos. Éstos sellan de
forma eficiente los intersticios entre el interior del cuerpo o de
la piel y los alrededores proporcionando una barrera hidrófoba para
detectar la entrada de moléculas hidrófilas. Estando el estrato
córneo en el intervalo entre 30-70 \mum de
espesor.
Las células de Langerhans se encuentran por toda
la capa granular basal del epitelio viable (estrato espinoso y
estrato granuloso, (Small Animal Dermatology - Tercera Edición,
Muller - Kira - Scott, Ed.: Saunders (1983)) y se considera que
desempeñan una función importante en la defensa inicial del sistema
inmunológico contra organismos invasores. Por lo tanto, esta capa
de la piel representa una zona diana adecuada para algunos tipos de
vacuna.
Los modos convencionales para la administración
de agentes farmacéuticos en o a través de la piel, más comúnmente
por medio de una jeringa y aguja hipodérmica, están relacionados con
numerosas desventajas. Tales desventajas incluyen dolor, la
necesitad de profesionales entrenados para administrar el agente, y
también el riesgo de lesiones por pinchazos al administrador con el
riesgo adjunto de infección con una enfermedad de origen sanguíneo.
Como tal, existe una necesidad de mejorar el procedimiento de
administración de todos los tipos de productos farmacéuticos en o a
través de la piel.
Se han descrito una serie de enfoques
alternativos con el fin de superar los problemas de administración
del agente a través del estrato córneo, incluyendo diversos
dispositivos de liberación balística de vacunas en flujo de gas
supersónico.
Por lo general, las vacunas de ADN están
constituidas por un vector plásmido bacteriano en el que se
introduce un promotor vírico potente, el gen de interés que
codifica un péptido antigénico y secuencias de una terminación
transcripcional/poliadenilación. El gen de interés puede codificar
una proteína completa o simplemente una secuencia de péptido
antigénico relacionada con el patógeno, tumor u otro agente contra
el que se pretende proteger. El plásmido puede cultivarse en
bacterias, tales como por ejemplo E. coli y después aislarse
y prepararse en un medio apropiado, dependiendo de la vía de
administración pensada, antes de administrarse al huésped. Después
de la administración, las células hospedadoras producen la proteína
o péptido codificado del plásmido. Los vectores del plásmido están
hechos por lo general sin un origen de replicación que es funcional
en células eucariotas, con el fin de evitar la replicación del
plásmido en el huésped mamífero y la integración dentro del ADN
cromosómico del animal en cuestión. La información en relación con
la vacuna de ADN se proporciona en Donnelly y col. "DNA
vaccines" Ann. Rev Immunol. 1997 15: 617:648, cuya
descripción se incluye en la presente memoria descriptiva en su
totalidad como
referencias.
referencias.
La liberación de genes basada en plásmidos, en
particular a efectos de terapia génica o inmunización, es conocida.
Por ejemplo, la administración de ADN desnudo por medio de la
inyección en el músculo de ratón se describe en el documento
WO90/11092. Johnston y col, documento WO 91/07487, describen
procedimientos para transferir un gen a células vertebradas, por
medio del uso de microperlas sobre las que se ha precipitado un
polinucleótido que codifica un gen de interés, y acelerando las
ADN/microperlas de tal forma que penetran la célula diana. En los
documentos US 5.630.796; WO 96/04947, WO 96/12513; WO 96/20022; WO
97/34652; WO 97/48485; WO 99/01168; WO 99/01169 se describen
dispositivos para la administración de perlas de tungsteno o de oro
revestidas con ADN en células de la piel. Los procedimientos de
vacuna usando formas cristalinas del agente farmacéutico liberado
balísticamente se describen en el documento WO 99/27961. La presente
invención proporciona formas de dosificación de ADN mejoradas para
usar dispositivos de liberación balística sin agujas, tales como los
que se describen en las publicaciones anteriores. Las
formulaciones en las que el ADN se precipita sobre perlas de oro,
como se describe en la técnica, tienen el problema de que es difícil
co-formular el ADN con agentes/excipientes
adicionales. La presente invención proporciona un procedimiento de
co-formulación de agentes adicionales.
En el documento WO 96/03978 se describen las
formas farmacéuticas sólidas que comprenden un agente farmacéutico
(incluyendo los plásmidos de ADN) y un poliol estabilizante (tal
como un azúcar) en donde las formas farmacéuticas están en forma de
polvos liberados balísticamente. La estabilización de agentes en
vidrios de azúcar amorfos se ha descrito en el documento US
5.098.893.
Los azúcares usados en las formulaciones
farmacéuticas pueden ser cristalinos o amorfos. Los sólidos amorfos
se distinguen de los cristalinos por su falta de orden de largo
alcance tridimensional encontrado en los materiales cristalinos.
Los sólidos amorfos son similares a los líquidos en un nivel
molecular en el que las moléculas se disponen aleatoriamente. Los
azúcares amorfos imparten estabilidad a las formulaciones
farmacéuticas cuando se almacenan a temperaturas inferiores a la
temperatura de transición al estado vítreo. Los azúcares amorfos
presentan una propiedad en la que existe un cambio en la movilidad
de las moléculas en la matriz del azúcar por debajo de una
temperatura denominada la temperatura de transición al estado
vítreo. Por debajo de esta temperatura (Tg), los azúcares amorfos
existen en un estado vítreo y por encima de esta temperatura en un
estado elástico. A temperaturas inferiores a Tg, la movilidad de las
moléculas del azúcar y cualquier molécula asociada o atrapada en la
matriz del azúcar es extremadamente baja, ocasionando la estabilidad
a largo plazo de tales formulaciones. En otras palabras, la
formación de un vidrio reduce espectacularmente la velocidad de
difusión de las moléculas. Esto también se acompaña de una
disminución en la capacidad térmica a presión constante (Cp) en 40%
a 100%. Esta transición se puede observar fácilmente por medio de
técnicas térmicas sensibles como la calorimetría diferencial de
barrido (Duddu, S. P., Zhang G, y Dal Monte, P. R., 1997., Pharm
Res., 14: 596-600). Las propiedades estabilizadoras
del azúcar también se han atribuido a sus propiedades de unión al
hidrógeno con moléculas biológicas como las proteínas.
Es conveniente para los agentes farmacéuticos
del ADN que se liberen en forma superenrollada. Se sabe que el ADN
superenrollado en preparaciones farmacéuticas líquidas se degrada
con el tiempo, dando como resultado la pérdida de la estructura
superenrollada y la formación relacionada de estructuras de ADN
lineales o en círculo abierto (Evans y col., 2000, Journal of
Pharmaceutical Sciences, 89(1), 76-87;
documento WO 97/40839). Un mecanismo por el que puede ocurrir esta
reacción de escisión de la cadena es la oxidación del ADN por medio
de radicales hidroxilos libres producidos a partir de oxígeno
disuelto en las soluciones de ADN, un procedimiento que se cataliza
por medio de iones metálicos. La reacción de la formación de
radicales libres se puede catalizar por medio de diversos iones
metálicos de transición, los más comunes de los cuales son, sin
embargo, los iones de hierro y cobre (Fe^{+3}, Fe^{+2},
Cu^{+2} ó Cu^{+1}; Evans y col. arriba).
La inestabilidad del ADN superenrollado es
evidente cuando el ADN está en solución líquida. Sin embargo, la
eliminación de iones metálicos traza de soluciones líquidas que
contienen ADN superenrollado con quelantes de iones metálicos, y/o
la limpieza de radicales libres en solución por medio de los
secuestradores no reductores de radicales libres, estabiliza el ADN
en forma superenrollada y protege el ADN de la oxidación (documento
WO 97/40839). El problema de la estabilización de formas secas de
ADN una vez revestidas sobre una perla de oro o de tungsteno no se
ha tratado en la técnica hasta ahora. De manera sorprendente, los
inventores presentes han observado que las formas secas del ADN,
sin la tecnología de la presente invención, cuando se revisten
sobre perlas de oro o de tungsteno, también son inestables.
La presente invención supera estos problemas y
proporciona una dosis de suministro de ADN que es capaz de
administrar y liberar los agentes de ADN de manera eficiente en la
piel, con o sin excipientes adicionales, y también en la que el ADN
se estabiliza en su forma superenrolladada.
Fig 1, pVAC1.ova
La Fig 2 muestra un gráfico del porcentaje de
plásmido superenrollado, (%ccc), tanto monomérico, (%cccmon), como
dimérico, (%cccdim), formas de plásmido; después del revestimiento y
liofilización sobre agujas de punción y almacenamiento a 37ºC. Las
formulaciones de plásmido usadas contienen cantidades de azúcar
variables: Fig 2A: Sacarosa al 5%, Fig 2B: Sacarosa al 10%, Fig 2C:
Sacarosa al 17,5, Fig 2D: Sacarosa al 40%, Fig 2E: Trehalosa al
40%, Fig 2F: Glucosa al 40%.
La Fig 3 muestra información de calorimetría
diferencial de barrido (DSC) para ADN de plásmido, (10 mg/ml),
formulaciones en sacarosa al 40%. Fig 3A y B: las formulaciones
también contienen TrisHCl 100 mM pH 8.0, EDTA 1 mM, metionina 10 mM
y etanol al 2,9%; Las Fig 3A y C representan un ciclo de
liofilización de 24 horas; Las Fig 3B y D representan un ciclo de
liofilización de 1 hora.
La Fig 4 muestra la información de la
microscopia de luz polarizada, para ADN de plásmido, (10 mg/ml),
formulaciones en sacarosa al 40%. Fig 4A: las formulaciones también
contienen TrisHCl 100 mM pH 8.0, EDTA 1 mM, metionina 10 mM y
etanol al 2,9%; La Fig 4C sólo contiene sacarosa al 40% y la Fig 4D
muestra cristales de los excipientes descritos en la formulación
que se muestra en la Fig 4A. 1AM, 2AM y 3AM representan un ciclo de
liofilización de 24 horas, mientras que 1ST, 2ST y 3ST representan
un ciclo de liofilización de 1 hora.
La Fig 5 muestra la información de la
microscopia de luz polarizada, para ADN de plásmido liofilizado, (10
mg/ml), formulaciones en azúcares y polioles, que también
contienen: TrisHCl 100 mM pH 8.0, EDTA 1 mM, metionina 10 mM y
etanol al 2,9%. Fig 5A, muestra 1: ficoll al 40% p/v, muestra 2:
dextrano al 20% p/v, muestra 3: sacarosa al 40% p/v, muestra 4:
maltotriosa al 20% p/v. Fig 5B, muestra 5: lactosa al 20% p/v,
muestra 6: maltosa al 30% p/v, muestra 7: glucosa al 40% p/v,
muestra 8: trehalosa al 40% p/v.
La Fig 6 muestra la estabilidad del plásmido de
ADN superenrollado revestido sobre perlas de oro y almacenado
durante 1 semana a 25ºC.
La Fig 7 muestra la estabilidad del plásmido de
ADN superenrollado revestido sobre perlas de oro y almacenado
durante 3 semanas a 25ºC.
La presente invención proporciona una forma
farmacéutica nueva de agentes farmacéuticos de ADN, que tiene un
elemento central denso que está revestido con un medio de depósito
sólido que contiene el agente farmacéutico de ADN.
Las formas farmacéuticas de vacunas de ADN son
un aspecto preferido de la presente invención. En tales aplicaciones
el agente que se va a liberar es un polinucleótido que codifica un
antígeno o antígenos que derivan de un patógeno tal como
microorganismos o virus, o puede ser un antígeno propio en caso de
vacuna contra el cáncer u otro antígeno propio.
El componente de ADN de la presente invención
puede ser ADN de plásmido lineal, en círculo abierto o
superenrollado, pero en una forma relacionada de la presente
invención, el ADN puede estar en forma de un vector viral o
bacteriano vivo atenuado.
Ciertas realizaciones del dispositivo descrito
en la presente memoria descriptiva también tiene la ventaja
importante de almacenarse a temperatura ambiente, reduciendo así los
costes de logística y liberando espacio frigorífico valioso para
otros productos.
El medio de depósito amorfo sólido es
preferiblemente un poliol que cumple la función requerida para la
presente invención. El depósito debe ser capaz de adherirse a la
microperla en un grado suficiente que el depósito permanezca
físicamente estable y unido durante el almacenamiento prolongado, y
también permanezca sustancialmente intacto durante el procedimiento
de administración cuando la microperla revestida se proyecta a
través del estrato córneo. El depósito también debe ser capaz de
mantener o contener una suspensión o solución del agente que se va
a suministrar en cualquier forma seca o parcialmente seca, que se
libera en la piel durante la biodegradación del medio de
depósito.
La biodegradación del medio en el sentido de la
presente invención se refiere a que el medio de depósito cambia de
estado, de tal forma que cambia de su estado de no liberación al de
su liberación, por el cual el agente entra en la piel. La
liberación del agente activo puede implicar uno o más procesos
físicos y/o químicos tales como hidratación, difusión, transición
de fase, cristalización, disolución, reacción enzimática y/o
reacción química. Dependiendo de la elección del medio de depósito,
la biodegradación puede inducirse por uno o más de los siguientes:
agua, fluidos corporales, humedad, temperatura corporal, enzimas,
catalizadores y/o reactivos. Por lo tanto, el cambio del medio de
depósito puede inducirse por hidratación, y calentamiento
relacionado con la elevada humedad y temperatura de la piel.
Después, el medio de depósito se puede degradar por disolución y/o
hinchazón y/o cambio de fase (cristalina o amorfa), desintegrando
así o aumentando simplemente la permeación del medio.
Preferiblemente el medio se disuelve, y se
metaboliza o expulsa o excreta del cuerpo, pero el depósito puede
permanecer alternativamente unido a la microperla que se puede
expulsar del cuerpo a través de diversos mecanismos, incluyendo el
desprendimiento de células muertas de la piel durante el cambio
normal de la piel. Se prefiere la liberación del agente por
disolución del medio de depósito.
Preferiblemente el medio de depósito sólido es
un poliol (tal como los descritos en el documento WO 96/03978). Los
medios de depósito de poliol adecuados incluyen hidratos de carbono
(tales como azúcares), polisacáridos, polioles sustituidos tales
como hidratos de carbono derivatizados de forma hidrófoba,
aminoácidos, polímeros o copolímeros biodegradables tales como
poli(ácido hidroxi)s, polianhídridos,
poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido butí-
rico)s, poli(ácido valérico)s, y poli(lactida-co-caprolactona)s, o polilactida co-glicolida.
rico)s, poli(ácido valérico)s, y poli(lactida-co-caprolactona)s, o polilactida co-glicolida.
El depósito sólido puede estar en un estado
amorfo o cristalino y también puede ser parcialmente amorfo o
parcialmente cristalino. Más preferiblemente, sin embargo, todo o
sustancialmente todo el depósito está en un estado amorfo. Más
preferiblemente todavía es que el depósito amorfo está en forma de
un vidrio (documento US 5.098.893). Más preferiblemente el depósito
es un vidrio de azúcar. Un depósito vítreo puede tener cualquier
temperatura de transición al estado vítreo, pero preferiblemente
tiene una temperatura de transición al estado vítreo que estabiliza
el agente farmacéutico durante el almacenamiento y también facilita
la liberación rápida del agente después de la introducción del
depósito en la piel. Por consiguiente, la temperatura de transición
al estado vítreo es superior a 30ºC-40ºC, pero más
preferiblemente es aproximadamente la temperatura corporal (tal
como, pero no limitada a 40ºC-50ºC).
Los medios de depósito particularmente
preferidos son aquellos que estabilizan el agente que se va a
suministrar durante el periodo de almacenamiento. Por ejemplo, el
antígeno o agente disuelto o disperso en un cristal de poliol o
simplemente secado en un poliol están estables en almacenamiento
durante periodos prolongados de tiempo (documento US 5.098.893, US
6.071.428; WO 98/16205; WO 96/05809; WO 96/03978; US 4.891.319; US
5.621.094; WO 96/33744). Tales polioles forman el conjunto
preferido de medios de depósito.
Los polioles preferidos incluyen azúcares, que
incluyen mono, di, tri, u oligosacáridos y sus alcoholes de azúcar
correspondientes. Los azúcares adecuados para usar en la presente
invención se conocen bien en la técnica e incluyen trehalosa,
sacarosa, lactosa, fructosa, galactosa, glucosa, mannosa, maltulosa,
iso-maltulosa y lactulosa, maltosa, o dextrosa y
alcoholes de azúcar de los anteriormente mencionados, tales como
mannitol, lactitol y maltitol. Se prefieren Sacarosa, Glucosa,
Lactosa, Rafinosa y Trehalosa.
Los medios de depósito de la presente invención
pueden además contener preferiblemente un agente estabilizante que
inhibe los efectos degenerativos de los radicales libres. Los
agentes estabilizantes preferidos incluyen agentes quelantes de
iones metálicos estabilizantes, tales agentes quelantes de iones
metálicos preferidos incluyen hexafosfato de inositol,
tripolifosfato, ácido succínico y málico, ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), trometamina (TRIS), Desferal,
ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y ácido
etilendiaminodiortohidrofenilacético (EDDHA). Otros agentes
estabilizantes preferidos son los depuradores no reductores de
radicales libres, y preferiblemente tales agentes son etanol,
metionina o glutationa. Otros quelantes y depuradores adecuados (y
aquellos que no son adecuados) se pueden identificar fácilmente por
parte del experto en la técnica por experimentación rutinaria (como
se describe en el documento WO 97/40839).
Los medios de depósito sólidos preferidos en los
dispositivos de la presente invención contienen un agente quelante
de iones metálicos o un depurador no reductor de radicales libres.
Más preferiblemente, los medios de depósito sólidos preferidos en
los dispositivos de la presente invención contienen tanto un agente
quelante de iones metálicos como un depurador no reductor de
radicales libres.
Las cantidades de los agentes estabilizantes se
pueden determinar por parte del experto en la técnica, pero
generalmente varían entre 0,1 mM-10 mM para los
quelantes de iones metálicos, el etanol está presente en una
cantidad hasta aproximadamente el 5% (v/v), la metionina está
presente en aproximadamente 0,1 mM a 100 mM y el glutatión está
presente en aproximadamente el 0,1% al 10% (v/v).
Las combinaciones preferidas de agentes
estabilizantes son (a) solución de etanol tamponada con fosfato en
combinación con metionina o EDTA, (b) EDTA tamponada con Tris en
combinación con metionina o etanol (o combinaciones de metionina y
etanol).
En particular, las formulaciones preferidas que
se pueden combinar con ADN y revestir sobre los elementos centrales
densos para formar formas de dosificación sólidas de la presente
invención, contienen polioles (preferiblemente sacarosa o
trehalosa) disueltos en agua desmetalizada o tampones basados en
Fosfato o Tris y además comprenden:
A. Metionina 10 mM y etanol al 2,9%, o
B. Etanol al 3,7% y EDTA 1 mM, o
C. Tris 100 mM, EDTA 1 mM y metionina 10 mM y
etanol 2,9%, o
D. Tris 100 mM, EDTA 1 mM y metionina 10 mM,
o
E. Tris 100 mM, EDTA 1 mM y etanol al 2,9%.
En los procedimientos preferidos de fabricación
de la presente invención el ADN se almacena y manipula en estos
agentes estabilizantes antes de la formulación final con el
azúcar.
Además de estos agentes estabilizantes, se
pueden tomar otras medidas para potenciar la estabilidad del ADN en
las vacunas sólidas. Por ejemplo, las formulaciones se pueden
realizar usando soluciones que se desmetalizaron ellas mismas antes
de usar (por ejemplo, usando resina desmetalizadora disponible en el
mercado, tal como Chelex 100 de Biorad) y/o la formulación se puede
finalizar en un pH elevado (tal como pH 8-10).
Preferiblemente, el ADN está en forma de un
plásmido superenrollado. Una ventaja principal de la presente
invención para estas formulaciones es el hecho de que el ADN está
estabilizado de tal forma que tras la liberación, permanece en gran
parte en su forma superenrollada, y preferiblemente en su forma
superenrollada monomérica.
La estabilidad del ADN de plásmido se puede
definir de una serie de formas y puede ser un fenómeno relativo
determinado por las condiciones de almacenamiento tales como pH,
humedad y temperatura. Para el almacenamiento en presencia de iones
de hierro sobre el depósito revestido, preferiblemente >50% del
plásmido permanece superenrollado, (ccc, circular cerrado
covalentemente), después del almacenamiento durante 3 meses a 4ºC.
Más preferiblemente, en las condiciones de almacenamiento descritas,
>60% del plásmido permanece ccc y más preferiblemente, en estas
condiciones de almacenamiento, >90% del plásmido permanece ccc
durante 3 meses a 4ºC. Para el revestimiento sobre agujas o
microagujas basadas en iones no metálicos, la estabilidad del ADN
de plásmido sería preferiblemente >60% y más preferiblemente 80%
y más preferiblemente >90% ccc después de 3 meses de
almacenamiento a 4ºC. Más preferiblemente, en estas condiciones de
almacenamiento, >90% del plásmido permanece ccc durante 1 año a
4ºC, y más preferiblemente >90% del plásmido permanece ccc
durante 2 años a 4ºC. Más preferiblemente, la estabilidad del ADN
anterior se consigue en estas condiciones durante los mismos
periodos de tiempo a 25ºC.
El ADN dentro de un medio de depósito sólido
(para facilidad de medida, cuando se reviste sobre agujas de
punción) se estabiliza preferiblemente en su forma superenrollada
(ccc) durante los estudios de estabilidad acelerada, y más
preferiblemente el ADN se estabiliza en su forma ccc monomérica. Un
ejemplo de un estudio de estabilidad acelerada es cuando las agujas
revestidas secas se mantienen a 37ºC durante 4 semanas seguido de
un análisis de la estructura del ADN en el transcurso del tiempo. En
este tipo de estudio, preferiblemente más del 50% del ADN permanece
en su forma ccc, más preferiblemente más del 60% permanece en su
forma ccc, más preferiblemente más del 70% permanece en su forma
ccc, más preferiblemente más del 80% permanece en su forma ccc y
más preferiblemente más del 90% permanece en su forma ccc. En estas
condiciones, y niveles preferidos de ccc, también se prefiere que
la relación de ADN ccc monomérica : dimérica sea aproximadamente 1
(tal como en el intervalo de 0,8-1,2, o más
preferiblemente en el intervalo de 0,9-1,1 y más
preferiblemente en el intervalo de 0,95-1,5), o
superior a 1.
Los estudios para determinar la estabilidad del
plásmido son bien conocidos para los expertos en la técnica y se
describen en (Evans y col. arriba; documento WO 97/40839). Estos
incluyen técnicas para medir y cuantificar el porcentaje de ADN de
plásmido, ccc, superenrollado o bien por electroforesis en gel de
agarosa, HPLC de intercambio de aniones, (Ferreira, G. y col.,
1999, Pharm. Pharmacol. Commun., 5, págs.
57-59) o electroforesis capilar en gel, (Schmidt y
col., 1999, Anal. Biochem., 274, 235-240). La
relación de ccc monomérica : dimérica se puede medir por análisis
de intensidad de la imagen después de la electroforesis en gel de
agarosa (en ausencia de cualquier agente de intercalación) y teñido
con EtBr, usando el software disponible en el mercado tal como
Labworks 4.0 que funciona en un sistema Bioimaging de UVP.
En el contexto de la presente invención el medio
de depósito sólido reviste los elementos centrales de una forma que
la formulación resultante es adecuada para la administración por
medio de dispositivos de liberación balística. Por consiguiente,
cada elemento central puede estar cubierto totalmente o parcialmente
por el depósito, o una pluralidad de elementos pueden estar
atrapados en una matriz del depósito sólido. En un procedimiento
relacionado para producir las formas de dosificación de la presente
invención, una gran cantidad de depósito que abarca una gran serie
de elementos centrales puede triturarse en partículas más pequeñas
que son adecuadas para la administración a través de dispositivos
de liberación balística.
Otros excipientes adecuados que se pueden
incluir en la formulación incluyen tampones, aminoácidos,
inhibidores de cambio de fase ("envenenadores de cristal") que
se pueden añadir para evitar el cambio de fase del revestimiento
durante el procesamiento o almacenamiento, o inhibidores para evitar
reacciones químicas nocivas durante el procesamiento o
almacenamiento tales como los inhibidores de la reacción de Maillard
como aminoácidos.
Las formas de dosificación sólidas de la
presente invención se usan en la transfección balística de células
de la piel usando dispositivos que arrastran las partículas
revestidas de ADN en un flujo de gas. Las partículas pasan a través
del estrato córneo y entran en una célula en la que se libera el ADN
y se expresa por medio de la célula hospedadora. De forma
alternativa, la partícula entra en el espacio extracelular y libera
el ADN en éste. Por consiguiente, los elementos centrales que son
adecuados para usar en la presente invención son aquellos que son
adecuados para este propósito. Los elementos centrales imparten,
tras la forma farmacéutica final, fuerza e impulso suficientes para
penetrar en el estrato córneo en cualquier dispositivo de liberación
balística proporcionado. Se prefiere que los elementos centrales
tengan densidad suficiente para impartir el impulso suficiente a
las partículas revestidas de ADN, los elementos centrales densos
adecuados han resultado ser microperlas de oro o de tungsteno. El
tamaño de los elementos centrales es preferiblemente el que imparte
masa suficiente para proporcionar el impulso necesario a las
partículas revestidas de ADN, mientras que no sea demasiado grande
de tal forma que las células de la piel sufran demasiado daño. Los
tamaños de partículas de los elementos centrales adecuados son
aquellos que cuando se revisten forman partículas de un tamaño medio
que varía entre 0,5 \mum y 100 \mum, preferiblemente entre 1
\mum y 50 \mum, más preferiblemente entre 1 \mum y 10 \mum,
y más preferiblemente entre aproximadamente 2 \mum de
diámetro.
En general, los elementos centrales son más o
menos esféricos, aunque se pueden usar formas no regulares. Más
preferiblemente los elementos centrales son microperlas de oro o de
tungsteno.
La presente invención reivindica que un azúcar
amorfo cuando está presente con partículas metálicas y ADN
impartirá estabilidad a largo plazo a la formulación. Otros
excipientes como tensioactivos y tampones se pueden incluir en la
formulación.
Los ejemplos de procedimientos para la
preparación de tales formulaciones que contienen azúcar amorfo
incluyen:
Mezclar la solución que contiene azúcar, ADN,
partículas de oro y rellenar en viales de vidrio. Estos viales se
taponan y se cargan parcialmente en un liofilizador. Después, la
temperatura del estante se reduce a -45ºC, llevando al producto en
los viales que se están congelando. Después de dejar que todos los
viales se congelen, el condensador se refrigera hasta una
temperatura por debajo de -60ºC. Después se realiza el secado
primario elevando la temperatura del estante hasta aproximadamente
-30ºC mientras que se aplica un vacío de aproximadamente 100 mT.
Durante el secado primario se sublima el agua de los cristales de
hielo que se forma. Después de que se complete el secado primario,
la temperatura del estante se eleva hasta por encima de la
temperatura ambiente y se aplica el vacío máximo. El secado
secundario elimina cualquier agua estrechamente unida y seca el
polvo para conseguir la estabilidad a largo plazo.
El secado por pulverización es un procedimiento
de deshidratación que utiliza el calor de una corriente de gas
caliente (normalmente aire) para evaporar las gotas dispersas
creadas por atomización de una alimentación de líquido continua.
Los productos en polvo resultantes se secan en unos segundos en
partículas finas. La viabilidad del secado por pulverización para
generar polvos de proteína terapéutica se ha demostrado ampliamente
((Broadhead, J., Rouan, S.K.E., Hau, I y Rhodes, C.T. 1994. J.
Pharm. Pharmacol. 46: 458-467.;Mumenthaler, M.,
Hsu, C.C., y Pearlman, R. 1994. Pharm. Res. 11:
12-20)). En una aplicación como tal para nuestras
mezclas de formulación, la solución formulada con ADN, partículas
de oro y azúcar se introducirá en un secador por pulverización con
una temperatura de entrada típica que varía entre 50ºC y 150ºC,
típicamente a una velocidad de flujo entre 0,1 y 10 ml/min. El
polvo resultante está seco y se recoge de la cámara de recogida.
El secado por congelación de pulverización es un
procedimiento en el que la solución que contiene ADN, partículas de
oro y azúcares se pulveriza sobre bandejas que contienen hielo seco
o nitrógeno líquido. Esto resulta en la congelación inmediata de las
gotas. Las bandejas se cargan después en un liofilizador y las
partículas se secan después por congelación de acuerdo con el
procedimiento descrito anteriormente.
Usando estas técnicas cada dosis de liberación
de ADN sólido puede cargarse con cantidades relativamente elevadas
de ADN. Las formulaciones resultantes de las técnicas anteriores se
pueden usar directamente o después de triturar o tamizar las perlas
centrales densas revestidas en el medio de depósito.
Preferiblemente, las formulaciones de vacunas de
la presente invención contienen ADN que codifica un antígeno o
composición antigénica capaz de provocar una respuesta inmune contra
un patógeno humano, cuyo antígeno o composición antigénica se
deriva del VIH-1, (tal como tat, nef, gp120 ó
gp160), herpesvirus humanos, tales como gD o derivados de los
mismos o proteína Temprana Inmediata tal como ICP27 de HSV1 ó HSV2,
citomegalovirus (esp. Humano) (tal como gB o derivados de los
mismos) Rotavirus (incluyendo virus vivos atenuados), virus de
Epstein Barr (tal como gp350 o derivados de los mismos), Virus
Varicela Zoster (tal como gpl, II y IE63), o de un virus de la
hepatitis tal como el virus de la hepatitis B (por ejemplo, antígeno
de la Superficie de la Hepatitis B o un derivado del mismo), virus
de la Hepatitis A, virus de la Hepatitis C y virus de la Hepatitis
E, o de otros patógenos víricos, tales como paramixovirus: virus
Sincitial Respiratorio (tal como las proteínas F y G o derivados de
las mismas), virus de la parainfluenza, virus del sarampión, virus
de las paperas, virus del papiloma humano (por ejemplo, HPV6, 11,
16, 18,...), flavivirus (por ejemplo, Virus de la Fiebre Amarilla,
Virus del Dengue, virus de la encefalitis
vector-garrapata, virus de la encefalitis japonesa)
o virus de la influenza (virus vivo entero o inactivado, virus de la
influenza fraccionado, cultivado en huevos o células MDCK, o
células Vero o virusomas de la gripe enteros (como describe R.
Gluck; Vaccine, 1992, 10, 915-920) o proteínas
purificadas o recombinantes de los mismos, tales como proteínas HA,
NP, NA, o M, o combinaciones de los mismos), o derivados de
patógenos bacterianos tales como Neisseria spp, incluyendo
N. gonorrhea y N. meningitidis (por ejemplo
polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, proteínas de
unión a la transferrina, proteínas de unión a la lactoferrina,
PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo proteínas M o
fragmentos de las mismas, proteasa C5A, ácidos lipoteicoicos), S.
agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, incluyendo
M. catarrhalis, también conocida como Branhamella
catarrhalis (por ejemplo invasinas y adhesinas de alto y bajo
peso molecular); Bordetella spp, incluyendo B.
pertussis (por ejemplo, toxina de pertussis o pertactina o
derivados de la misma, hemaglutinina finamentosa, adenilato ciclasa,
fimbrias), B. parapertussis y B. bronchiseptica;
Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis (por
ejemplo ESAT6, Antígeno 85A, -B o -C), M. Bovis, M. leprae, M.
avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp,
incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp, incluyendo E.
coli enterotóxica (por ejemplo factores de colonización, toxina
lábil al calor o derivados de la misma, toxina estable al calor o
derivados de la misma), E. coli enterohemorrágica, E.
coli enteropatogénica (por ejemplo toxina como la toxina shiga
o derivados de la misma); Vibrio spp, incluyendo V.
cholera (por ejemplo toxina del cólera o derivados de la
misma); Shigella spp, incluyendo S. sonnei, S.
dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluyendo Y.
enterocolitica (por ejemplo una proteína Yop), Y. pestis, Y.
pesudotuberculosis; Campylobacter spp, incluyendo C.
jejuni (por ejemplo, toxinas, adhesinas e invasinas) y C.
coli; Salmonella spp, incluyendo S. typhy, S. paratyphi, S.
choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluyendo L.
monocytogenes; Helicobacter spp, incluyendo H. pylori
(por ejemplo toxina ureasa, catalasa, vacuolizante); Pseudomonas
spp, incluyendo P.aeruginosa; Staphylococcus spp.,
incluyendo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp.,
incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp.,
incluyendo C. tetani (por ejemplo toxina del tétanos y
derivados de la misma), C. botulinum (por ejemplo toxina
botulínica y derivados de la misma), C. difficile (por
ejemplo toxinas A o B del clostridium y derivados de las mismas);
Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por ejemplo
toxina botulínica y derivados de la misma); Corynebacterium
spp., incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo toxina de
la difteria y derivados de la misma); Borrelia spp.,
incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA,
DbpB), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB),
B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B.
andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii;
Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la
Ehrlichiosis Granulocítica Humana; Rickettsia spp,
incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C.
trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a la
heparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de
unión a la heparina), C. psittaci; Leptospira spp.,
incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo T.
pallidum (por ejemplo las proteínas de la membrana externa
excepcionales), T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivados
de parásitos tales como Plasmodium spp., incluyendo P.
falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T. gondii (por
ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo E.
histolytica; Babesia spp., incluyendo B. microti;
Tripanosoma spp., incluyendo T. cruzi; Giardia spp.,
incluyendo L. major; Pneumocystis spp., incluyendo P.
carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis;
Schisostoma spp., incluyendo S. mansoni, derivados de
la levadura tales como Candida spp., incluyendo C.
albicans; Cryptococcus., incluyendo C. neoformans. Otras
vacunas bacterianas preferidas comprenden antígenos derivados de
Haemophilus spp., incluyendo H. influenzae tipo B (por
ejemplo PRP y conjugados de los mismos), H. influenzae no
tipificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de elevado peso molecular,
P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y péptidos
derivados de fimbrinas (documento US 5.843.464).
En otra realización de la presente invención la
forma farmacéutica del ADN contiene una vacuna de ADN en combinación
con un antígeno sin ADN tal como un antígeno proteína o
polisacárido derivado de un patógeno.
Una de las ventajas de la presente invención es
la capacidad para co-formular el agente del ADN
junto con agentes activos adicionales, una capacidad que ha estado
limitada con otros agentes farmacéuticos de ADN sólidos. Por
ejemplo, la vacuna de ADN también puede comprender un agente para
potenciar la captación del ADN en la célula, un adyuvante u otro
inmunoestimulante para mejorar y/o dirigir la respuesta inmune, y
también puede comprender excipiente(s) farmacéuticamente
aceptable(s).
Por ejemplo, el medio de depósito farmacéutico
sólido puede contener preferiblemente un agente de condensación del
ADN, por ejemplo espermidina o PEI (polietilenimina). Otros
excipientes que se pueden incluir en la formulación incluyen
tampones, aminoácidos, inhibidores de cambio de fase
("envenenadores de cristal") que se pueden añadir para evitar
el cambio de fase del revestimiento durante el procesamiento o
almacenamiento, o inhibidores para evitar reacciones químicas
nocivas durante el procesamiento o almacenamiento tales como los
inhibidores de la reacción de Maillard como aminoácidos.
Un agente adicional preferido para el
co-atrapado dentro del medio de depósito con el ADN
es un inhibidor de ADNasa. Un ejemplo de un inhibidor de ADNasa que
se prefiere es el ácido aurinticarboxílico (ATA, Glasspool, J. y
col., (2000), Molecular Therapy 2:
140-146).
Las vacunas de la presente invención pueden
también incluir de manera ventajosa un adyuvante inmunológicamente
efectivo en solución sólida junto con el ADN. De forma alternativa,
el adyuvante se puede asociar con microperlas distintas a la
microperla revestida con ADN. Los adyuvantes adecuados para las
vacunas de la presente invención comprenden aquellos adyuvantes que
son capaces de potenciar las respuestas del anticuerpo contra el
inmunógeno. Los agentes inmunoestimuladores adecuados incluyen,
pero esta lista no es de ningún modo exhaustiva y no excluye otros
agentes: imidazoquinolinas sintéticas tales como imiquimod
[S-26308, R-837], (Dockrell y
Kinghorn, 2001, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48,
751-755; Harrison y col. Reduction of recurrent
HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein
vaccine, Vaccine 19: 1820-1826, (2001)); y
resiquimod [S-28463, R-848]
(Vasilakos y col. Adjuvant activities of immune response modifier
R-848: Comparison with CpG ODN, Cellular
immunology 204: 64-74 (2000).), bases de Schiff de
carbonilos y aminas que se expresan de forma constitutiva sobre las
superficies de la célula T y célula que presenta el antígeno, tales
como tucaresol (Rhodes, J. y col. Therapeutic potentiation of
the immune system by co-stimulatory
Schiff-base-forming drugs,
Nature 377: 71-75 (1995)), citocina, quimiocina y
moléculas co-estimuladoras en forma de proteína o
péptido, esto incluiría citoquinas
pro-inflamatorias tales como GM-CSF,
IL-1 alfa, IL-1 beta,
TGF-alfa y TGF-beta, inductores de
Th1 tales como interferón gamma, IL-2,
IL-12, IL-15 e
IL-18, inductores de Th2 tales como
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-10 e IL-13 y otras quemoquinas y
genes co-estimuladores tales como
MCP-1, MIP-1 alfa,
MIP-1 beta, RANTES, TCA-3, CD80,
CD86 y CD40L, otros ligandos inmunoestimuladores de fijación como
diana tales como CTLA-4 y
L-selectina, proteínas y péptidos que estimulan la
apoptosis tales como Fas, (49), adyuvantes basados en lípidos
sintéticos, tales como vaxfectina, (Reyes y col, Vaxfectin
enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type
immune responses to plasmid DNA immunization, Vaccine 19:
3778-3786) escualeno,
alfa-tocoferol, polisorbato 80, DOCP y colesterol,
endotoxina, [LPS], Beutler, B., Endotoxin,
Toll-like receptor 4, and the afferent limbo of
innate immunity, Current Opinion in Microbiology 3:
23-30 (2000)); oligo- y
di-nucleótidos CpG, Sato, Y. y col.,
Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective
intradermal gene immunization, Science 273 (5273):
352-354 (1996). Hemmi, H. y col., A
Toll-like receptor recognizes bacterial DNA,
Nature 408: 740-745, (2000) y otros ligandos
potenciales que accionan los receptores Toll-like
para producir citoquinas que inducen Th1, tales como lipoproteínas
Micobacterianas sintéticas, proteína Micobacteriana p19,
peptidoglicano, ácido teicoico y lípido A.
Algunos adyuvantes preferidos para provocar una
respuesta tipo Th1 de forma predominante incluyen, por ejemplo, un
derivado del Lípido A tal como el Lípido A monofosforilado, o
preferiblemente Lípido A monofosforilado
3-de-O-acilado. Los
adyuvantes MPL® están disponibles en Corixa Corporation (Seattle,
WA; véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. Nº 4.436.727; 4.877.611;
4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en
los que el dinucleótido CpG es no metilado) también inducen una
respuesta Th1 de forma predominante. Tales oligonucleótidos se
conocen bien y se describen, por ejemplo, en el documento WO
96/02555, WO 99/33488 y Patente de EE. UU. Nº 6.008.200 y
5.856.462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también se
describen, por ejemplo en Sato y col. Science 273:352, 1996.
Otro adyuvante preferido comprende una saponina, tal como Quil A, o
derivados de la misma, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila
Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escin; Digitonin; o
saponinas Gypsophila o Chenopodium quinoa.
En este aspecto de la presente invención el
adyuvante o agente inmunoestimulador preferido es imiquimod u otras
moléculas relacionadas (tales como resiquimod) como se describe en
la solicitud de patente PCT número WO 94/17043 (cuyos contenidos se
incorporan en la presente memoria descriptiva mediante
referencia).
En una realización de la invención, se
administra/suministra un polinucleótido en forma de ADN
"desnudo", por ejemplo como se describe en Ulmer y col.
Science 259: 1745-1749, 1993 y revisa Cohen,
Science 259: 1691-1692, 1993. La captación
de ADN desnudo se puede aumentar revistiendo el ADN sobre pequeñas
perlas de microperlas, tales como perlas de oro o biodregadables,
que se transportan de forma eficiente en las células; o usando
otros agentes bien conocidos que facilitan la transfección, tales
como Fosfato Cálcico o DEAE dextrano.
La cantidad de ADN expresable en cada
administración de vacuna se selecciona como una cantidad que induce
una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos en
vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de la
construcción específica de ADN que se emplee, sin embargo, se espera
que cada dosis comprenda por lo general 1-1.000
\mug de ADN, preferiblemente 1-500 \mug, más
preferiblemente 1-100 \mug, de los cuales el
intervalo más preferible es de 1 a 50 \mug. Se puede determinar
una cantidad óptima para una vacuna particular por medio de
estudios convencionales que implican la observación de respuestas
inmunes apropiadas en sujetos. Después de una vacuna inicial, los
sujetos pueden recibir una o más inmunizaciones de refuerzo
espaciadas de forma adecuada.
La presente invención también proporciona
dispositivos de liberación balística cargados con formas de
dosificación de ADN de la presente invención.
Las formulaciones de la presente invención se
pueden usar tanto para efectos profilácticos como terapéuticos. Por
consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento
para tratar un mamífero susceptible a o que padece una enfermedad
infecciosa o cáncer, o alergia, o enfermedad autoinmune. En otro
aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna como se
describe en la presente memoria descriptiva para usar en medicina.
La preparación de la vacuna se describe generalmente en New
Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y col.,
University Park Press, Baltimore, Maryland, EE. UU. 1978.
La presente invención se ilustra con, pero no se
limita a, los ejemplos siguientes.
Ejemplo
1
Los plásmidos usados en este estudio se muestran
todos en la Fig. 1. pEGFP-C1 es un vector de
expresión de GFP, (Clontech, Palo Alto, California, EE. UU.).
pGL3CMV es un vector de expresión de luciferasa basado en pGL3
Basic, (Promega Corporation., Madison, Wisconsin, EE. UU.), en el
que el promotor inmediato temprano del CMV acciona la expresión de
la luciferasa.
pVAC1.ova es un plásmido de expresión de
ovalbúmina de pollo, construido por ADNc amplificado por PCR de
ligación que codifica la ovalbúmina de pollo de pUGOVA, en el
vector de expresión pVAC1. pVAC1 es una modificación del vector de
expresión mamífero, pCI, (Promega) en la que el sitio de clonación
múltiple, de EcoRI a Bst ZI, se ha reemplazado por la secuencia
IRES de EMCV flanqueda en 5' por sitios de restricción de enzimas
Nhe I, Rsr II y Xho I únicos y en 3' por Pac I, Asc I y Not I
únicos, amplificados de pGL3Basic, (Promega). El ADN de plásmido
superenrollado, (endotoxina baja), se purificó a gran escala,
aproximadamente 100 mg de rendimiento, hasta una pureza elevada
usando una combinación de lisis alcalina en SDS, ultrafiltración y
cromatografía en columna de intercambio de aniones.
Los plásmidos se resuspendieron en TE, (TrisHCl
10 mM, EDTA 1 mM), pH 8,0 en 1 ug/ul y se determinaron como
superenrollados al >95% tras el análisis por electroforesis en
gel de agarosa.
Los plásmidos se formularon en una diversidad de
soluciones, para agujas de revestimiento, a través de un
procedimiento convencional de precipitación en etanol a gran escala.
El ADN precipitado se volvió a suspender directamente en las
soluciones acuosas de formulación en concentraciones de 0,5 ug/ul a
12 ug/ul, (Véase Capítulo 1, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Sambrook, J. y col., 2ª Edición, 1989, CSH Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU.).
Mezclar la solución que contiene azúcar
(sacarosa o trehalosa entre el 1% y el 40%), plásmido de ADN,
partículas de oro y rellenar en viales de vidrio. Estos viales se
taponan y se cargan parcialmente en un liofilizador. Después, la
temperatura del estante se reduce a -45ºC, llevando al producto en
los viales que se están congelando. Después de dejar que todos los
viales se congelen, el condensador se refrigera hasta una
temperatura por debajo de -60ºC. Después se realiza el secado
primario elevando la temperatura del estante hasta aproximadamente
-30ºC mientras que se aplica un vacío de aproximadamente 100 mT.
Durante el secado primario se sublima el agua de los cristales de
hielo que se forma. Después de que se complete el secado primario,
la temperatura del estante se eleva hasta por encima de la
temperatura ambiente y se aplica el vacío máximo. El secado
secundario elimina cualquier agua estrechamente unida y seca el
polvo para conseguir la estabilidad a largo plazo.
El secado por pulverización es un procedimiento
de deshidratación que utiliza el calor de una corriente de gas
caliente (normalmente aire) para evaporar las gotas dispersas
creadas por atomización de una alimentación de líquido continua.
Los productos en polvo resultantes se secan en unos segundos en
partículas finas. La viabilidad del secado por pulverización para
generar polvos de proteínas terapéuticas se ha demostrado
ampliamente ((Broadhead, J., Rouan, S.K.E., Hau, L y Rhodes, C.T.
1994. J. Pharm. Pharmacol. 46: 458-467.;
Mumenthaler, M., Hsu, C.C., y Pearlman, R. 1994. Pharm. Res. 11:
12-20)). En una aplicación como tal para nuestras
mezclas de formulación, la solución formulada con ADN, partículas de
oro y azúcar se introducirá en un secador por pulverización con una
temperatura de entrada típica que varía entre 50ºC y 150ºC,
típicamente a una velocidad de flujo entre 0,1 y 10 ml/min. El
polvo resultante está seco y se recoge de la cámara de
recogida.
El secado por congelación de pulverización es un
procedimiento en el que la solución que contiene el ADN, partículas
de oro y azúcares se pulveriza sobre bandejas que contienen hielo
seco o nitrógeno líquido. Esto resulta en la congelación instantánea
de las gotas. Las bandejas se cargan después en un liofilizador y
las partículas se secan después por congelación de acuerdo con el
procedimiento descrito anteriormente.
Las formulaciones resultantes de las técnicas
anteriores se pueden usar directamente o después de triturar en
depósitos de liberación balística convencionales, y se puede seguir
la expresión en células diana observando la expresión de la
luciferasa. Las muestras también son estables como se miden a través
del mantenimiento de la estructura
superenrollada.
superenrollada.
Ejemplo
2
Se realizó una comparación entre la estabilidad
del ADN de plásmido de una serie de formulaciones de ADN diferentes,
en la que se variaba o bien la cantidad de azúcar o bien el tipo de
azúcar usado en la formulación. Todos los otros excipientes que
resultaron óptimos previamente para la estabilidad y liberación de
ADN estaban presentes en todas las formulaciones (esto es, TrisHCl
100 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, metionina 10 mM y etanol al 2,9%). Se
compararon las formulaciones para detectar su capacidad de
estabilizar ADN de plásmido superenrollado, después del
revestimiento y liofilización en agujas, tras el almacenamiento
durante hasta un mes a 37ºC, (estudio de la estabilidad acelerada
del ADN). Después el ADN de plásmido (pVAC1.OVA) se eluyó y se
recuperó de forma convencional y se sometió a electroforesis en gel
de agarosa (100V, 100 mA durante 2 horas), en ausencia de agentes
de intercalación (Sambrook, J. y col., arriba). Después, la
integridad del ADN de plásmido eluido se controló después de teñir
con bromuro de etidio y visualización bajo luz UV. El porcentaje de
formas diméricas y monoméricas del plásmido superenrollado y
también cualquier forma linear y circular abierta de estas muestras
se midieron como intensidad de imagen usando el software del
análisis de imagen de Labworks 4.0 del Sistema Bioimaging de
UVP.
UVP.
Los datos se muestran en la Fig 2, como un
gráfico del porcentaje de plásmido superenrollado, (%ccc), tanto
monomérico, (%cccmon), como dimérico, (%cccdim), formas de plásmido;
después del revestimiento y liofilización sobre agujas de punción y
almacenamiento a 37ºC. Las formulaciones de plásmido usadas
contienen cantidades de azúcar variables: Fig 2A: Sacarosa al 5%,
Fig 2B: Sacarosa al 10%, Fig 2C: Sacarosa al 17,5, Fig 2D: Sacarosa
al 40%, Fig 2E: Trehalosa al 40%, Fig 2F: Glucosa al 40%.
Los datos sugieren que todas las formulaciones
que contienen azúcares mantienen un grado elevado de estabilidad
del plásmido, incluso después de almacenar a 37ºC durante hasta un
mes, más del 80% y hasta el 98% del plásmido permanece en forma
superenrollada. Para las formulaciones que contienen niveles de
azúcar del 40% (p/v), el balance entre las formas diméricas y
monoméricas del plásmido permanece relativamente constante, con la
forma monomérica preferida predominando en las formulaciones de
azúcar que varían de trehalosa a sacarosa a glucosa, (Fig 2D, 2E y
2F). Para las formulaciones que contienen concentraciones inferiores
de sacarosa, la forma dimérica tiende a predominar sobre la
monomérica, especialmente tras el almacenamiento prolongado a 37ºC,
(Fig 2A, 2B y 2C). En general, la información concuerda con que
cuanto más elevado es el nivel de azúcar presente en la
formulación, mayor es la estabilidad del ADN de plásmido.
Ejemplo
3
Se prepararon muestras de formulaciones
liofilizadas de sacarosa/ADN que contenían ADN de plásmido
(pVAC1.OVA), (10 mg/ml), en sacarosa al 40% y también se prepararon adicionalmente muestras liofilizadas que contenían TrisHCl 100 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, metionina 10 mM y etanol al 2,9%. Las muestras se dividieron y se sometieron a ciclos de liofilización de 1 hora o de 24 horas. Las muestras se sometieron después a análisis por calorimetría diferencial de barrido, (DSC), para determinar la forma del estado sólido. Esto se realizó sobre una máquina TA Instruments DSC2920 sobre una temperatura que varía entre 25ºC y 300ºC, usando nitrógeno como gas de purga con una velocidad de flujo de 20 ml/min. El tipo de cazoleta de la muestra era de aluminio con orificios y el peso de la muestra se determinó el día del análisis en una balanza Mettler M3.
(pVAC1.OVA), (10 mg/ml), en sacarosa al 40% y también se prepararon adicionalmente muestras liofilizadas que contenían TrisHCl 100 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, metionina 10 mM y etanol al 2,9%. Las muestras se dividieron y se sometieron a ciclos de liofilización de 1 hora o de 24 horas. Las muestras se sometieron después a análisis por calorimetría diferencial de barrido, (DSC), para determinar la forma del estado sólido. Esto se realizó sobre una máquina TA Instruments DSC2920 sobre una temperatura que varía entre 25ºC y 300ºC, usando nitrógeno como gas de purga con una velocidad de flujo de 20 ml/min. El tipo de cazoleta de la muestra era de aluminio con orificios y el peso de la muestra se determinó el día del análisis en una balanza Mettler M3.
Los datos se muestran en la Fig 3. Todas las
muestras contienen ADN de plásmido, (10 mg/ml), en sacarosa al 40%.
Fig 3A y B: las formulaciones también contienen TrisHCl 100 mM pH
8,0, EDTA 1 mM, metionina 10 mM y etanol al 2,9%. Las Fig 3A y C
representan un ciclo de liofilización de 24 horas; Las Fig 3B y D
representan un ciclo de liofilización de 1 hora. La información
sugiere que todas las muestras contienen sacarosa amorfa con
temperaturas de transición al estado vítreo de la sacarosa
observándose a aproximadamente 78ºC, (Fig 3A), 85ºC, (Fig 3B),
74ºC, (Fig 3C) y 63ºC, (Fig 3D), que se ajustan bien a los valores
publicados en la bibliografía. La información sugiere que tanto los
ciclos de liofilización largos como los cortos pueden generar un
cristal de sacarosa amorfo. El cristal amorfo se puede formar en
presencia de concentraciones elevadas de ADN de plásmido y también
en presencia de todos los excipientes descritos. Sin embargo, como
no estaba claro si algún material cristalino estaba presente o no
en las muestras o se había formado durante el propio análisis por
DSC, se analizaron otras muestras por medio de la técnica de la
microscopia de luz polarizada para determinar la naturaleza
amorfa/cristalina de las muestras.
Las muestras liofilizadas de sacarosa/ADN de
plásmido, (\pm excipientes) preparadas para el análisis por DSC,
descrito anteriormente, se sometieron a análisis por microscopia de
luz polarizada. Las muestras de control se prepararon de
simplemente sacarosa al 40%, liofilizada durante ciclos de 1 hora y
24 horas y también se analizaron muestras cristalinas de sacarosa y
los principales excipientes sólidos: metionina, Tris HCl y EDTA.
Esto fue para comparar y observar la aparición de cualquier material
cristalino presente en las formulaciones. El análisis se realizó en
un microscopio de luz polarizada Zeiss STD16-444111
con muestras montadas en aceite de inmersión y cubiertas.
La información se muestra en la Fig 4, en la que
todas las formulaciones contienen ADN de plásmido, (10 mg/ml), en
sacarosa al 40%. Fig. 4A: las formulaciones también contienen
TrisHCl 100 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, metionina 10 mM y etanol al 2,9%.
La Fig 4C: sólo contiene sacarosa al 40% y la Fig 4D: muestra
cristales del excipiente sólido principal. 1AM, 2AM y 3AM
representan un ciclo de liofilización de 24 horas, mientras que 1ST,
2ST y 3ST representan un ciclo de liofilización de 1 hora.
De la Fig. 4C está claro que tanto los ciclos de
liofilización de 1 hora como de 24 horas realizados sobre sacarosa
sola al 40% generan solamente un cristal amorfo como se espera. De
la Fig 4B, la adición de ADN de plásmido (10 mg/ml), a la
formulación de sacarosa al 40%, aunque permite en gran medida la
formación de un cristal amorfo, posibilita la formación parcial de
alguna sacarosa cristalina (las muestras 2AM y 2ST están
constituidas por material amorfo con alguna evidencia de partículas
cristalinas, que podrían ser sacarosa). Sin embargo, de la Fig 4A,
la adición de los excipientes a la formulación de ADN/sacarosa
reduce la cantidad de formulación de partículas cristalinas en
muestras liofilizadas durante 24 horas (1AM, el grueso de la muestra
está constituido por láminas de material amorfo. Hay pocas
partículas cristalinas presentes), y para los ciclos cortos de
liofilización de 1 horas, no existe evidencia de la formación de
partículas cristalinas, simplemente un cristal amorfo. Esto sugiere
que la adición de los excipientes descritos al ADN de plásmido en
sacarosa ayuda no sólo a mejorar la liberación y estabilidad del
ADN de la degeneración sino que también ayuda a preservar el estado
del cristal amorfo tras los ciclos cortos de liofilización.
Ejemplo
4
Para determinar si la naturaleza del
azúcar/poliolpresente en la formulación de ADN de plásmido con
excipientes, como se describe anteriormente, afectaba la capacidad
de tales formulaciones para generar un cristal amorfo tras la
liofilización, se varió el poliol. Se generó, liofilizó y analizó
por microscopia de luz polarizada una serie de formulaciones
similares que diferían sólo en el poliol presente. Esto se realizó
de una forma similar a la descrita en el ejemplo 3, salvo que en
esta ocasión se usó un microscopio de luz polarizada Olympus
BX51.
La información se muestra en la Fig 5, en la que
todas las formulaciones contienen ADN de plásmido liofilizado
(pVAC1.OVA), (10 mg/ml), y TrisHCl 100 mM pH 8,0, EDTA 1 mM,
metionina 10 mM y etanol al 2,9%. Fig 5A, muestra 1: ficoll al 40%
p/v, muestra 2: dextrano al 20% p/v, muestra 3: sacarosa al 40% p/v,
muestra 4: maltotriosa al 20% p/v. Fig 5B, muestra 5: lactosa al
20% p/v, muestra 6: maltosa al 30% p/v, muestra 7: glucosa al 40%
p/v, muestra 8: trehalosa al 40% p/v. Se observa que todas las
muestras descritas y todas las formulaciones analizadas formaron un
cristal amorfo poco o ninguna evidencia de material cristalino
estando presente. Se observa que la formulación descrita como
muestra 2, que contiene dextrano al 20% p/v, mostró
subsiguientemente que había precipitado el ADN de plásmido fuera de
la solución, por análisis de electroforesis en gel de agarosa,
(información no mostrada), y por tanto no sería una formulación
preferida. Esta información demuestra que el ADN de plásmido más
los excipientes descritos se pueden mantener, cuando se liofilizan,
en un estado vítreo amorfo por medio de una diversidad de
polioles/azúcares descritos en la bibliografía, (Hatley, R. &
Blair, J., (1999), Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 7:
11-19.).
Ejemplo
5
El objetivo de este estudio fue liofilizar tres
formulaciones de ADN basadas en azúcar que contienen partículas de
oro. Las formulaciones se formaron como se muestra a
continuación;
- \bullet
- Formulación 1 preparada con Sacarosa al 40%, TrisHCl 100 mM pH 8,0, L-metionina 10 mM y etanol al 2,9%.
- \bullet
- La Formulación 2 contenía Sacarosa al 10%, TrisHCl 100 mM pH8,0, L-metionina 10 mM y etanol al 2,9%.
- \bullet
- La Formulación 3 se preparó con Trehalosa al 40%, TrisHCl 100 mM pH 8,0, L-metionina 10 mM y etanol al 2,9%.
El plásmido de la hepatitis B superenrollado se
formuló en cada una de las tres formulaciones en una concentración
de 1 mg/ml. Las partículas de oro se añadieron a cada una de las
formulaciones en una concentración de 0,5 g por 10 ml de
formulación. Las formulaciones se congelaron por medio de la
adición gota a gota de cada formulación en nitrógeno líquido. Las
perlas congeladas resultantes se transfirieron a viales de 3 ml de
secado por congelación. Los viales se secaron por congelación en un
secador por congelación DW8 Heto Holten, usando el ciclo que se
muestra a continuación.
Las muestras secadas por congelación se
taponaron en vacío. El vacío se liberó y se sacaron los viales del
secador por congelación. Se estableció un estudio de estabilidad
acelerada (a 25ºC) usando formulaciones de ADN secadas por
congelación. El estudio de estabilidad se controló en intervalos
semanales usando electroforesis en gel de agarosa teñido con
bromuro de etidio.
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa
al 0,6% sobre muestras de estabilidad para determinar un cambio en
la conformación de ADN durante el estudio. Cada muestra liofilizada
se reconstituyó en agua destilada y se añadió a su pocillo
respectivo del gel de agarosa usando la combinación de muestra
siguiente, cargando el tampón y el agua destilada. 2 \mul de
muestra + 16 \mul de agua destilada + 2 \mul de tampón de
carga.
Se añadieron 20 \mul de cada muestra al
pocillo respectivo del gel. Las muestras se sometieron a
electroforesis durante toda una noche a 20 Voltios. El gel sometido
a electroforesis se tiñó con bromuro de etidio y se observó bajo
UV. Las muestras de estabilidad se analizaron después del
almacenamiento durante 1 y 3 semanas a 25ºC.
Las fotografías de los geles que contienen las
muestras de una y tres semanas se muestran en las Fig 6 y 7. La
Fig 6: muestra el perfil de ADN en muestras almacenadas a 25ºC
durante una semana (carril 1 de la izquierda): Carril 1
-marcador 1 kilobase; Carril 2 - Muestra secada por congelación
(Formulación 1) a 25ºC después de una semana de almacenamiento;
Carril 3 - Muestra secada por congelación (Formulación 1) a 5ºC
después de una semana de almacenamiento - Control; Carril 4 -
Muestra secada por congelación (Formulación 2) a 25ºC después de
una semana de almacenamiento, Carril 5 - Muestra secada por
congelación (Formulación 2) a 5ºC después de una semana de
almacenamiento; Carril 6 - Muestra secada por congelación
(Formulación 3) a 25ºC después de una semana de almacenamiento;
Carril 7 - Muestra secada por congelación (Formulación 3) a 5ºC
después de una semana de almacenamiento; Carril 8 - Formulación 1
líquida pre-secada por congelación a 5ºC; Carril 9 -
Formulación 2 líquida pre-secada por congelación a
5ºC; Carril 10 - Formulación 3 líquida pre-secada
por congelación a 5ºC; Carril 11 - plásmido no formulado,
GW7000561X (lote A01B30); Carril 12 - Control Negativo secado por
congelación de la Formulación 1 que está constituido por diluyente
de la Formulación 1 + perlas de oro sin ADN de plásmido.
Los resultados mostraron que:
- \bullet
- No se detectó ningún cambio importante durante cualquiera de las tres formulaciones secadas por congelación (a 25ºC) en comparación con los controles a 5ºC. La mayor parte del ADN resultó estar superenrollado aunque también se detectaron cantidades relativamente pequeñas de topoisoformas lineales y en círculo abierto.
- \bullet
- Las formulaciones líquidas pre-secadas por congelación produjeron perfiles de banda similares a las muestras secadas por congelación posteriormente. La cantidad más elevada de fluorescencia detectada en las muestras pre-secadas por congelación se debe probablemente a la concentración más elevada de ADN en éstas.
- \bullet
- No se detectó ninguna diferencia importante en el perfil del ADN entre la formulación y el plásmido no formulado (línea 11).
- \bullet
- Como se espera, no se observaron bandas en el control negativo del carril 12.
La Figura 7 muestra el perfil de ADN de muestras
almacenadas a 25ºC durante 3 semanas con el Carril 1 de la
izquierda: marcador 1 kilobase; Carril 2 - Muestra secada por
congelación (Formulación 1) a 25ºC después de tres semanas de
almacenamiento; Carril 3 - Muestra secada por congelación
(Formulación 1) a 5ºC después de tres semanas de almacenamiento -
Control; Carril 4 - Muestra secada por congelación (Formulación 2) a
25ºC después de tres semanas de almacenamiento; Carril 5 - Muestra
secada por congelación (Formulación 2) a 5ºC después de tres
semanas de almacenamiento; Carril 6 - Muestra secada por congelación
(Formulación 3) a 25ºC después de tres semanas de almacenamiento;
Carril 7 - Muestra secada por congelación (Formulación 3) a 5ºC
después de tres semanas de almacenamiento; Carril 8 - Formulación 1
líquida pre-secada por congelación a 5ºC; Carril 9
- Formulación 2 líquida pre-secada por congelación a
5ºC; Carril 10 - Formulación 3 líquida pre-secada
por congelación a 5ºC; Carril 11 - plásmido no formulado; Carril 12
- Control Negativo secado por congelación de la Formulación 1 que
está constituido por diluyente de la Formulación 1 + perlas de oro
sin ADN de plásmido.
Los resultados mostraron que:
- \bullet
- No se detectó ningún cambio importante en la conformación de ninguna de las tres formulaciones secadas por congelación (a 25ºC) en comparación con los controles a 5ºC. La mayor parte del ADN resultó estar superenrollado aunque también se detectaron pequeñas cantidades de isoformas lineales y en círculo abierto.
- \bullet
- Las formulaciones líquidas pre-secadas por congelación produjeron perfiles de ADN similares a las muestras secadas por congelación posteriormente. La cantidad más elevada de fluorescencia detectada en las muestras pre-secadas por congelación se debe probablemente a la concentración más elevada de ADN en éstas.
En este estudio hemos demostrado que es posible
congelar formulaciones secas de ADN basadas en azúcar/oro sin un
cambio importante en la conformación de ADN. Además, hemos mostrado
que las perlas liofilizadas resultantes estaban estables a 25ºC
durante un periodo de tres semanas.
Claims (24)
1. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN, que tiene un elemento central denso revestido con un
medio de depósito sólido que contiene el agente farmacéutico de
ADN.
2. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 1, que además
comprende un agente estabilizante que inhibe los efectos
degenerativos de los radicales libres.
3. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 2, en la que el
agente estabilizante es uno o ambos de un quelante de iones
metálicos y un secuestrador de radicales libres.
4. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 3, en la que el
agente quelante de iones metálicos se selecciona del grupo que está
constituido por hexafosfato de inositol, tripolifosfato, ácido
succínico y málico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS), Desferal, ácido
dietilentriaminopentaacético (DTPA) y ácido
etilendiaminodiortohidrofenilacético (EDDHA).
5. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 3, en la que el
secuestrador no reductor de radicales libres se selecciona del grupo
constituido por etanol, metionina o glutatión.
6. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 3, en la que el
agente estabilizante que inhibe los efectos degenerativos de los
radicales libres es, (a) solución de etanol tamponada con fosfato
en combinación con metionina o EDTA, (b) EDTA tamponado con Tris en
combinación con metionina o etanol (o combinaciones de metionina y
etanol).
7. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, en la que el medio de depósito sólido es un poliol
amorfo.
8. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 7, en la que el
poliol es un poliol estabilizante.
9. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8, en la que el medio de depósito sólido biodegradable es un
azúcar.
10. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 9, en la que el
azúcar se selecciona de lactosa, glucosa, sacarosa, rafinosa o
trehalosa.
11. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 10 en la que el medio de depósito sólido está en forma de un
vidrio.
12. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 11, en la que el
medio de depósito sólido está en forma de un vidrio de azúcar.
13. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 12, en la que el ADN es ADN de plásmido superenrollado.
14. Forma farmacéutica de un agente
farmacéutico de ADN como se reivindica en la reivindicación 13, en
la que el ADN de plásmido superenrollado está estabilizado de tal
forma que después de almacenamiento a 37ºC durante 4 semanas, más
del 50% del ADN permanece en su forma superenrollada.
15. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 13, en la que el
ADN está estabilizado de tal forma que cuando se libera la
relación de la forma superenrollada de monómero : dímero es del
orden de 0,8 : 1,2.
16. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 15, en la que el agente farmacéutico es una vacuna.
17. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 16, en la que el medio de depósito sólido también comprende un
adyuvante de vacuna, agente que facilita la transfección,
inhibidor de ADNasa o un envenenador de cristal.
18. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 17, en la que el
adyuvante se selecciona del grupo que está constituido por CpG,
imidazoquinolinas sintéticas, tucerasol, citocinas, MPL, QS21, QS7
y emulsiones de aceite en agua.
19. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 1, en la que los
elementos centrales densos son microperlas de un diámetro de
partícula medio entre 0,5 \mum y 10 \mum.
20. Forma farmacéutica de un agente farmacéutico
de ADN como se reivindica en la reivindicación 19, en la que el
elemento central denso es una microperla de oro o de tungsteno.
21. Un procedimiento para la preparación de una
forma farmacéutica de un agente farmacéutico de ADN como se
reivindica en la reivindicación 1, que comprende la preparación de
una solución de agente farmacéutico de ADN, medio de depósito y
agente estabilizante que inhibe los efectos degenerativos de los
radicales libres en un disolvente, seguido del revestimiento de al
menos un elemento central denso con dicha solución, y eliminar el
disolvente para formar un medio de depósito sólido que contiene el
agente farmacéutico y el agente que inhibe los efectos
degenerativos de los radicales libres.
22. Un procedimiento para la preparación de una
forma de dosificación de un agente farmacéutico de ADN como se
reivindica en la reivindicación 21, en el que el medio de depósito
es un azúcar.
23. Un procedimiento para la preparación de una
forma de dosificación de un agente farmacéutico de ADN como se
reivindica en la reivindicación 22, en el que la concentración de
azúcar antes de secar sobre el elemento de soporte varía entre el
20% y el 40% p/v.
24. Un procedimiento para la preparación de una
forma de dosificación de un agente farmacéutico de ADN como se
reivindica en la reivindicación 23, en el que el disolvente se
desmetaliza antes del procedimiento.
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